Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Регуляция секреции внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Егоров, Сергей Николаевич

Актуальность проблемы.

Транспорт внеклеточных белков у эукариотических клеток является направленным, строго регулируемым по времени процессом. Считается, что у всех эукариотов он если не идентичен, то во всяком случае очень похож (Rothman, Orci, 1992). Процесс секреции связан с определенными клеточными структурами (рис. 1), такими как эндоплазматический ретикулум, аппарат Гольджи, секреторные везикулы, что впервые было показано Паладе на примере регулируемой секреции белков клетками панкреатической железы (Green et al., 1963; Palade, 1975). У дрожжей процесс транспорта внеклеточных компонентов к поверхности клетки в целом очень похож на аналогичные процессы у высших эукариот.

Лппарат Гольджи

Регулируемая секреиия Конститутивная секреиия ВШСИЩЕТИ.ЧЕСКИЙ ПУТЬ

Транс

Ранние эндосомы

Поздние эндосомы

Лизосомы

Рисунок 1. Схема транспортных потоков и зндоцитоза между внутриклеточными мембранными структурами и поверхностью эукариотической клетки. (Pryeretal., 1992).

Считается, что существенные различия могут наблюдаться на конечных этапах секреторного пути: от аппарата Гольджи к поверхности. В литературе преобладает мнение, что у дрожжей отсутствует так называемый регулируемый путь транспорта, а присутствует единый, конститутивный транспортный путь, по которому к поверхности клетки направляются все необходимые материалы (Schekman and Novick, 1982). Определенная часть исследователей считает, что у внеклеточных белков дрожжей отсутствует сигнал сортинга и весь транспорт осуществляется "единым потоком" и его регуляция производится только на уровне генома (рис. 2).

Секреторные процессы обеспечивают самые разнообразные клеточные функции, среди которых передача химических сигналов обеспечивающих межклеточное взаимодействие, процессы связанные с обеспечением клетки питательными веществами и, конечно функции, связанные с защитой и размножением.

Рисунок 2. Схема внеклеточного секреторного пути у дрожжей Saccharomyces. cerevisiae по Шекману ( Schekman et at., 1981). ЯМ - ядерная мембрана; Я - ядро; ВАК - вакуоль; ЭПР - эндоплазматический ретикулум; Г - аппарат Гольджи; ЦПМ -цитоплазматическая мембрана; В - везикулы; КС - клеточная стенка; sec- мутации секреторного пути.

Внеклеточные белки дрожжей известны давно, но ранее считалось, что местом их локализации является периплазматическое пространство и клеточная стенка (Oura et at., 1970). Основные этапы секреторного пути внеклеточных белков дрожжей включают: прохождение сквозь мембрану эндоплазматического ретикулума и последующий транспорт в аппарат Гольджи, где происходит окончательная модификация и сортинг белков. Затем, с помощью транспортных везикул белки направляются к цитоплазматической мембране. Наиболее изученными внеклеточными ферментами дрожжей являются кислая фосфатаза (КФ 3,1.3.2) и инвертаза (КФ 3.2.1.26). Кроме того, эти ферменты используются в качестве белков-маркеров секреторных везикул, направляемых к клеточной поверхности. Несмотря на интенсивное изучение процесса секреции у эукариотических организмов, остается много нерешенных вопросов. В том числе влияние внеклеточных факторов на секрецию, различия в терминальной стадии секреции, не изучались свойства кислых фосфатаз, выделенных из среды культивирования. Вопросы, возникшие в связи с выявленной гетерогенностью дрожжевых секреторных везикул (Lupashin et al., 1992; Harsay and Bretscher, 1995) тоже требуют дальнейшего объяснения. Не ясны механизмы, регулирующие транспортные потоки внеклеточных белков. Цель и задачи исследования.

Пытаясь ответить на сформулированные выше вопросы, мы поставили следующие цели в своей работе: изучить возможность секреции внеклеточных белков дрожжей в среду; изучить влияние условий культивирования дрожжей на секрецию; исследовать свойства внеклеточных белков; изучить пространственную организацию внеклеточных кислых фосфатаз; исследовать возможность регуляции транспортных потоков внеклеточных белков дрожжей; исследовать роль внеклеточных белков на примере кислой фосфатазы.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Результаты, полученные в работе, являются оригинальными. Автором выдвинута гипотеза о возможности транспорта внеклеточных белков в среду культивирования. Из полученных результатов следует, что внеклеточные кислые фосфатазы направляются к поверхности клетки различными путями, сходными с теми, что наблюдаются у клеток высших эукариот. Высказана гипотеза о сортинге внеклеточных белков дрожжей. Выявлены механизмы, регулирующие распределение внеклеточных белков по двум альтернативным транспортным потокам. Проведен сравнительный энзиматический анализ всех внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей. Полученные результаты позволяют существенно дополнить и расширить наши представления о секреторном пути внеклеточных белков дрожжей.

В данной работе представлен научный материал, полученный автором на разных биологических системах и, поэтому можно выделить несколько аспектов практического применения данной работы.

Получен в чистом виде ранее неизвестный фермент фосфорного обмена у грибов: трифосфатаза, который занесен в классификацию ферментов под номером 3.6.1.25.

Автором проведены исследования, связанные с возможностью использовать цианобактерии в качестве биологического индикатора м для очистки вод от антропогенного воздействия, вызванного сбросом промышленных отходов, загрязненных тяжелыми металлами и трифосфатом, сотни тысяч тонн которого использовались в металлургической, деревообрабатывающей промышленности и в качестве добавок к моющим средствам.

Впервые использованы криогели для иммобилизации живых клеток дрожжей и получения внеклеточных ферментов на колонках с иммобилизованными клетками. Данная работа была защищена в 1989 году авторским свидетельством № 1505972.

Проведенные исследования по изучению транспортных потоков внеклеточных ферментов у дрожжей несомненно расширили взгляды на данный процесс в целом у эукариот. Полученные данные о механизмах сортировки внеклеточных белков дрожжей на уровне аппарата Гольдки и транспортировка к поверхности клетки функционально разных белков различными транспортными потоками, несомненно могут быть использованы в создании генноинженерных конструкций, обеспечивающих выход в среду нужных в биотехнологическом плане белков. Апробация работы.

Всесоюзная конференция "Проблемы регуляции обмена веществ у микроорганизмов", Пущино, 1972; XI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Алма-Ата, 1975; II Республиканская научно-теоретическая конференция. Ташкент,1978; FEMS International Symposium, Pushchino, 1983; 16-th Meeting of FEBS, Moscow, 1984; Советско-Шведский Симпозиум, Рига, 1985; VII Съезд Всесоюзного микробиологического общества. Алма-Ата, 1985; 3 Всесоюзная конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Кобулети, 1986; V Всесоюзный биохимический съезд. Киев,1986; II Международная школа-конференция молодых ученых социалистических стран, Пущино, 1987; 4 Всесоюзная конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Ташкент, 1988; 2 International Conference "Biochemical Separations", Keszthely, Hungary, 1988; 6 Всесоюзный симпозиум "Инженерная энзимология", Вильнюс, 1988; 1 конференция "Проблемы и перспективы биотехнологии", Братислава, 1989; Всесоюзная конференция "Регуляция микробного метаболизма", Пущино, 1989; 15-th International Specialized Symposium on Yeast. Riga, 1991; Annu. Autumn Meet. Biochem. Soc Biol.Chem., Dusseldorf, Hope-Seyier, 1993, International Specialized Symposium on Yeast, Edinburgh, 1995; International Symposium on Modern Problems of Microbial Biochemistry and Biotechnology. Pushchino, 2000; , international Conference "Biocatalysys-2000", Moscow, 2000; Первый съезд микологов России, Современная микология в России, 2002. FEMS Congress, Slovenia, 2003.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 47 печатных работ.

Содержание работы.

Глава 1. Условия секреции ферментов клетками дрожжей в среду культивирования.

1.1. Влияние источников азота и углерода на секрецию внеклеточных кислых фосфатаз.

К начал у наших работ в литературе существовало устойчивое мнение, что внеклеточные ферменты дрожжей локализованы на периферии клетки и в периплазматическом пространстве (Oura et al., 1970; Van Rijn et al., 1975) ) и практически не попадают во внеклеточную среду. Из наиболее часто используемымых в экспериментах внеклеточных ферментов кислая фосфатаза и инвертаза являлись наиболее изученными ферментами.

В литературе имеется достаточно данных о влиянии состава среды на секрецию белков клетками микроорганизмов. Изучение роли факторов внешней среды в образовании внеклеточной кислой фосфатазы дрожжей было начато нами с исследования влияния некоторых источников азотного и углеродного питания (Семенова и Егоров, 1983.; Семенова и др., 1986). В случае дрожжей Saccharomyces cerevisiae S288C, предоставленных Венковым (Болгария), было установлено, что наибольшее количество фермента образуется на питательных средах с органическими источниками азота: пептоном и дрожжевым экстрактом. При использовании минеральных источников азота активность внеклеточной кислой фосфатазы наблюдалась только в средах с хлоридом аммония (табл. 1).

Таблица 1. Влияние источника азота на внеклеточную активность кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Источник азота: Биомасса (OD440) mE/OD44o пептон 7,2 83, дрожжевой экстракт 8,4 71, глутамат 2,1 0, мочевина 2,8 0, сульфат аммония 6,0 0, хлорид аммония 3,1 9,

Для дрожжей Candida utilis, предоставленных Калебиной (МГУ, Россия), также как и в предыдущем случае, набольшее образование внеклеточной кислой фосфатазы происходило на среде с пептоном (табл. 2). Кроме того практически такой же уровень фермента в расчете на одинаковую оптическую плотность клеток был обнаружен в среде, содержащей хлорид аммония.

Таблица 2. Влияние источника азота на выход в среду кислой фосфатазы дрожжей Candida utilis.

Источники азота: Биомасса (OD440) mE/OD44o пептон 6,7 3, нитрат калия 3,1 1, мочевина 2,0 1, нитрат аммония 3,4 1, сульфат аммония 4,7 1, хлорид аммония 3,3 2,

При использовании других источников азотного питания уровень внеклеточной кислой фосфатазы был примерно равным и составлял менее половины этой величины, полученной на среде с пептоном. Образование физиологически активных соединений микроорганизмами может в значительной мере зависеть от природы источника углеродного питания. В таблицах 3 и 4 представлены результаты влияния источника углерода на выход внеклеточной кислой фосфатазы в процессе роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae S288C (табл. 3) и Candida utilis (табл. 4).

Таблица 3. Влияние источника углерода на выход в среду кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Источник углерода: Биомасса (OD440) тЕ/ OD

D-глюкоза 6,7 39, сахароза 7,6 79,

D-фруктоза 4,1 2,

D-манноза 2,1 4,

D-рамноза 2,2 4,

D-маннит 2,8 7,

D-инозит 4,8 25,

D-сорбит 1,6 0, глицерин 2,4 12, сусло (4° Бал) 6,0 0,

Для культуры клеток S. cerevisiae наилучший рост в сочетании с наибольшим образованием фермента наблюдался на средах с сахарозой и глюкозой. Остальные использованные в этих опытах сахара в меньшей степени поддерживали рост этой культуры и в меньшей степени способствовали накоплению фермента в среде. Из спиртов наиболее благоприятным для роста дрожжей и образования внеклеточной кислой фосфатазы оказался инозит, однако выход биомассы и фермента в среду был ниже, чем при использовании глюкозы или сахарозы. При выращивании клеток дрожжей на сусле, выход фермента в среду не был отмечен.

В случае С. utilis наибольшее количество внеклеточной кислой фосфатазы было обнаружено в средах, содержащих в качестве источника углерода глюкозу и сахарозу. Из использованных в наших опытах спиртов, наиболее пригодным для образования фосфатазы оказался этанол.

Таблица 4. Влияние источника углерода на на выход в среду кислой фосфатазы дрожжей Candida utilis.

Источник углерода. OD440 тЕ/ OD

D-глкжоза 13,0 3, сахароза 11,0 3,

D-рамноза 6,0 0,

D-маннит 2,6 0,

D-инозит 2,2 1,

D-сорбит 2,2 0, глицерин 4,8 1, этанол 10,4 2,

Возможность экскреции кислых фосфатаз показана и для других штаммов дрожжей (табл. 5).

Учитывая широко распространенное явление катаболитной репрессии, мы проверили влияние содержания глюкозы в среде на образование внеклеточной кислой фосфатазы клетками дрожжей. Для S. cerevisiae было установлено, что увеличение концентрации глюкозы до 8% способствует накоплению кислой фосфатазы. При дальнейшем повышении содержания этого сахара происходило снижение уровня внеклеточного фермента. В случае С. utilis увеличение концентрации глюкозы в среде от 0,8% до 6% приводило к снижению содержания кислой фосфатазы на 20%.

Таблица 5. Экскреция кислых фосфатаз в среду культивирования различными штаммами дрожжей.

Дрожжи mE/OD44o (24 часа роста) mE/OD44o (48 часов роста)

Saccharomyces cerevisiae S288C 41,2 52,

Saccaromyces cerevisiae АН 216 3,2 3,

Saccharomyces cerevisiae M 417 1,8 2,

Saccharomyces cerevisiae 4П 219 4,8 4,

Candida utilis 3,0 3,

Из других факторов внешней среды, которые могли бы оказывать влияние на активность внеклеточной кислой фосфатазы, мы проверяли влияние ионов кальция и магния, рН среды и температуру культивирования. Так добавление ионов кальция или магния не оказывало существенного влияния на активность внеклеточной кислой фосфатазы для S. cerevisiae, в то время как для С. utilis увеличение содержания кальция до 0,20 г/л и магния до 0,25 г/л приводило к возрастанию этой величины на 14% и 42% соответственно. рН среды существенно влиял на величину секретируемой активности кислой фосфатазы S. cerevisiae. Наибольшее количество фермента в среде наблюдалось при значении рН 3,9 - 4,6. Для С. uti/is этот интервал возрастал до рН 5,4. Оптимальная температура культивирования для обеих культур составляла 30°С.

1.2. Зависимость секреции внеклеточных кислых фосфатаз от фазы роста.

При изучении динамики секреции внеклеточных кислых фосфатаз клетками дрожжей S. cerevisiae ( Егоров и др., 1989 ) было установлено, что максимальная активность репрессибельной кислой фосфатазы, обнаруживаемой при выращивании клеток дрожжей на среде, лишенной ортофосфата, определялась в конце экспоненциальной фазы роста культуры (рис. 3). Наибольшее количество секретируемой кислой фосфатазы, выращенной на среде с концентрацией ортофосфата 10 тМ, наблюдается в первые часы культивирования клеток (рис. 4). Аналогичная картина была показана при секреции внеклеточной инвертазы в условиях дерепрессии на среде с глицерином в качестве единственного источника

Рисунок 3. Секреция репрессибельной кислой фосфатазы.1 - кривая роста; 2 -активность кислой фосфатазы, ассоциированной с клетками; 3 - активность кислой фосфатазы в культуральной среде; 4 - потребление клетками глюкозы; N -количество дрожжевых клеток; Е - активность кислой фосфатазы

Рисунок 4. Секреция конститутивной кислой фосфатазы.1 - кривая роста; 2 -активность кислой фосфатазы, ассоциированной с клетками; 3 - активность кислой фосфатазы в культуральной среде; 4 - потребление клетками глюкозы; 5 -потребление клетками неорганического фосфата; N - количество дрожжевых клеток; Е - активность кислой фосфатазы углерода. Для дрожжей С. utilis максимальная величина секреции кислых фосфатаз в среду наблюдалась в начале стационарной фазы роста как для клеток, выращенных на среде с высоким содержанием ортофосфата, так и на среде, лишенной ортофосфата. увеличения активности кислой фосфатазы на поверхности клеток в присутствии энзиматического субстрата, свидетельствует о наличии сложных систем регуляции образования кислых фосфатаз.

1.4. Изучение влияния концентрации внеклеточных ферментов дрожжей на их собственное образование.

Изучение механизмов секреции внеклеточных белков кроме несомненного научного интереса может быть использовано и для повышения эффективности промышленного получения некоторых белковых препаратов. Ранее Юркевичем исследовался ауторегуляторный механизм синтеза некоторых гидролаз грибов, таких как а-амилаза, кислая протеиназа и инвертаза ( Юркевич и Козырева, 1967; Юркевич и др. 1973;. Юркевич и Зуева, 1978).

Внеклеточные инвертаза и кислые фосфатазы дрожжей S. cerevisiae очень похожи по своим физико-химическим свойствам и нужно применить достаточно большую изобретательность, чтобы разделить эти ферменты, в случае, когда они вместе присутствуют в растворе. Для решения этой проблемы мы использовали штаммы дрожжей, которые при определенных условиях культивирования секретировали в среду только один из интересующих нас ферментов. Репрессибельную кислую фосфатазу выделяли из среды, лишенной фосфата и содержащей 6% глюкозы, после выращивания дрожжей S. cerevisiae S-288C до стационарной фазы. При этом достигается репрессия биосинтеза инвертазы и значительно упрощается очистка фосфатазы. Были применены следующие этапы очистки: осаждение ацетоном белков из культуральной жидкости, гель-хроматография на колонке с Uitroge! АсА 44 (LKB Швеция), лиофильное высушивание фракций, содержащих фосфатазную активность. В результате был получен сухой препарат кислой фосфатазы с 48% выхода и активностью 3,4 Е/мг. Внеклеточную инвертазу выделяли из культуральной среды дрожжей S. cerevisiae С59-1-981Г-П188, предоставленных Смирновым (Санкт-Петербургский государственный университет, Россия), которые лишены конститутивной фосфатазной активности и на среде с 6 тМ ортофосфата калия секретируют значительно больше инвертазы, чем клетки S. cerevisiae S288C. В условиях репрессии синтеза регулируемой кислой фосфатазы мы получали высокое содержание инвертазы в культуральной среде. Процесс очистки включал в себя получение "ацетонового" осадка, гель-хроматографию препарата на колонке с Ultrogel АсА 44 и лиофильное высушивание фракций, содержащих инвертазную активность. В результате получен сухой препарат инвертазы с выходом фермента 70% и активностью 24 Е/мг. Лиофильно высушенные препараты кислой фосфатазы и инвертазы были использованы в дальнейшей работе по изучению влияния одного фермента на секрецию другого, количество добавляемого фермента определяли по его ферментативной активности. Увеличение концентрации глюкозы 8 среде до 6% повышало секрецию кислой фосфатазы и, в тоже время приводило к снижению инвертазной активности практически до нуля. При замене в среде глюкозы на глицерин было отмечено значительное снижение содержания кислой фосфатазы и накопление внеклеточной инвертазной активности. Таким образом, условия культивирования оптимальные для образования одного фермента, не вполне благоприятны для секреции другого. При постановке опытов подбирались условия способствующие секреции исследуемых ферментов.

Сразу следует подчеркнуть, что как инвертаза, так и фосфатаза являются относительно стабильными ферментами и за время проведения опытов (от 6 до 12 часов) их активность в среде культивирования не изменялась. Эксперименты по влиянию концентрации вносимых в среду ферментов на секрецию проводили по стандартной методике. Клетки дрожжей выращивали до ранней стационарной фазы промывали стерильной средой, переносили в пробирки и инкубировали в соответствующих средах с различными добавками ферментов. Каждый опыт повторяли 5-10 раз, разброс экспериментальных данных представлен на всех графиках. Статистическую обработку результатов проводили с применением регрессионного анализа с использованием ортогональных полиномов. Величины секретируемой активности исследуемых ферментов в данных условиях опыта, характерные для клеток дрожжей в ранней стационарной фазе роста, мы в дальнейшем будем называть функциональной нормой.

Изучение влияние добавленной в среду инвертазы в концентрации близкой к её функциональной норме, на собственную секрецию проводили на дрожжах S. cerevisiae С-59-1-981Г-П188, которые, как было сказано выше, дефицитны по гену конститутивной кислой фосфатазы. Клетки выращивали в среде, содержащей 6 тМ ортофосфата и 0,5% глицерина в качестве источника углерода. В этих условиях культивирования дрожжей невозможен синтез также и репрессибельной кислой фосфатазы.

Регрессионный анализ результатов показал, что добавление в среду инвертазы до концентрации 1 Е/мл вызывает статистически достоверную стимуляцию секреции этого фермента. В этой области концентраций, отклонение экспериментальных точек от прямой, проведенной на рисунке 6 , не отличается от ошибки воспроизводимости.

Дальнейшее повышение содержания инвертазы в среде является пороговым и вызывает резкое снижение секреции фермента. Полученные данные подтверждают теорию профессора В.В.Юркевича об ауторегуляции процесса секреции инвертазы у дрожжей. инвертаза Е/мл

Рисунок 6. Влияние внеклеточной инвертазы на образование инвертазы клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

На рисунке 7А представлены данные о влиянии внеклеточной инвертазы на секрецию репрессибельной кислой фосфатазы. Отличие от предыдущего опыта заключалось в том, что клетки Петергофской линии дрожжей при достижении ими ранней стационарной фазы роста, переносили в среду, лишенную фосфата. В этих условиях происходит дерепрессия синтеза регулируемой кислой фосфатазы. Видно, что при добавлении к среде уже 0,45 Е/мл инвертазы наблюдается существенное снижение секреции кислой фосфатазы, которое остается практически постоянным до концентрации инвертазы 1,25 Е/мл, при этом происходит статистически достоверное увеличение секреции репрессибельной кислой фосфатазы. Зависимость секреции репрессибельной кислой фосфатазы от концентрации внеклеточной инвертазы, значительно превышающей физиологическую норму, представлена на рисунке 7Б. Опыт проводили на среде лишенной фосфата, с 0,5% глюкозой, в качестве источника углерода, используя дрожжи S.cerevisiae S288C. Из представленных результатов

Зависимость секреции инвертазы от количества внеклеточной репрессибельной кислой фосфатазы выясняли на клетках дрожжей S.cerevisiae S288C при культивировании их на среде с 0,5% глицерина, в качестве источника углерода (рисунок 8). В изученном интервале концентраций внеклеточной кислой фосфатазы мы наблюдали линейное увеличение активности секретируемой инвертазы. Отношение дисперсии неадекватности этой линейной модели к дисперсии воспроизводимости равно 2,4 и не превышает критического значения критерия Фишера даже при 5% уровне значимости.

О 0.1 0.2 О.? 0.4 0.Е 0.6 0.7 C-.S 0.

Кислая фосфатаза ЕЛил

Рисунок 8. Влияние кислой фосфатазы на образование инвертазы клетками дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

При исследовании влияния внеклеточной концентрации кислой фосфатазы на собственную секрецию, эффект подавления мы наблюдали при пороговой концентрации фермента равной 30-40 Е/мл, что на порядок превышает физиологическую норму этого фермента в условиях опыта.

Большим соблазном является возможность объяснения феномена взаимной регуляции секреции внеклеточных ферментов наличием в их структуре общих антигенных детерминантов. Для проверки этого предположения мы получили кроличьи политональные антитела к высоко очищенной репрессибельной кислой фосфатазе дрожжей и используя метод двойной диффузии Охтерлони не выявили зон преципитации ни с дрожжевой инвертазой, ни с маннаном клеточной стенки дрожжей (Koch-Light Laboratories, England), в то же время, преципитация с конститутивной кислой фосфатазой и, естественно, с репрессибельной кислой фосфатазой была вполне достоверной. Возможно, что объяснение эффекта взаимной регуляции изученных нами ферментов, учитывая удивительное сходство их субъединичного строения, следует искать при расшифровке механизма прохождения этих гликопротеинов через клеточную стенку дрожжей, а также в том факте, что тип и механизм везикулярного транспорта этих ферментов к клеточной поверхности у дрожжей един.

Таким образом, в представленной работе получены статистически достоверные данные о том, что кроме ранее известного эффекта ауторегуляции процесса секреции внеклеточных ферментов у микроорганизмов, у дрожжей существуют более сложные регуляторные механизмы взаимного влияния секретируемых в среду гликопротеинов (Егоров и др., 2000).

1.5. Взаимосвязь секреции внеклеточных кислых фосфатаз и процесса почкования дрожжевой клетки.

Одним из характерных показателей физиологического состояния культуры дрожжей можно считать процесс почкообразования. По литературным данным формирование почки коррелирует с секреторным процессом внеклеточных белков ( Schekman et al., 1983). Мы также исследовали зависимость между секрецией кислой фосфатазы и процессом почкования (Шнырева и Егоров, 1990). Статистическая обработка полученных результатов показала высокую степень корреляции секреции конститутивной кислой фосфатазы с процессом почкования (табл. 6). Ничего подобного не было обнаружено при секреции кислых фосфатаз в среду, лишенную фосфата. Было показано отсутствие связи между секрецией репрессибельной кислой фосфатазы в среду и процессом почкования (табл. 6).

Таблица S. Коэффициент корреляции между процессом почкования и накоплением кислой фосфатазы на поверхности клеток и в среде культивирования дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Конститутивная кислая фосфатаза Репрессибельная кислая фосфатаза среда поверхность клетки среда поверхность клетки

0,72 0,97 0,21 0,

Выявленная закономерность позволяет предположить наличие для репрессибельной кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae транспортного пути альтернативного основному, постулированному секреторному потоку, направленному в почку. Также можно думать и о различиях в функциональной роли двух типов кислых фосфатаз дрожжей.

Было проведено исследование, связанное с изучением распределения фосфатазной активности между средой культивирования, клеточной стенкой, а также суммарной фракцией растворимых белков периплазматического пространства и внутриклеточного содержимого дрожжей S. cerevisiae.

Таблица 7. Распределение активности конститутивной кислой фосфатазы (%) между клеточными компартментами дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Рост культуры (ч). Растворимая внутриклеточная фракция Клеточная стенка Среда культивирования

В случае конститутивной кислой фосфатазы (табл. 7) отмечено увеличение доли фермента во фракции клеточных стенок, которое достигает 42% в 48-часовой культуре клеток . Для репрессибельной кислой фосфатазы доля фермента остающегося в клеточной стенке постоянна и составляет не более 2-5 % от суммарной активности (табл. 8). Этот факт может подтверждать выдвинутое нами предположение о различной функциональной роли кислых фосфатаз.

Таблица 8. Распределение активности репрессибельной кислой фосфатазы (%) между клеточными компартментами дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Рост культуры (ч). Растворимая внутриклеточная фракция Клеточная стенка Среда культивирования

Так, репрессибельная кислая фосфатаза является внеклеточным ферментом обеспечивающим потребности клетки в фосфате. Накопление конститутивной кислой фосфатазы в клеточной стенке может указывать на преимущественно структурные функции этого гликопротеина.

1.6. Секреция внеклеточных кислых фосфатаз иммобилизованными клетками дрожжей.

При выборе способа иммобилизации мы считали, что для изучения секреции необходимым условием является сохранение неповрежденной клеточной стенки. Иммобилизация химическими способами сопряжена с обработкой клеток реагентами, которые могут влиять на клеточную стенку. Поэтому было принято решение иммобилизовать клетки включением в гель. Использовали криогели, методика получения которых разработана ИНЭОС АН СССР им.А.Н.Несмеянова.

Для иммобилизации дрожжевых клеток в нашей работе были опробованы три различных системы для образования криогелей: полиакриламидный гель (ПААГ), силикагель и поливиниловый спирт (ПВС). Для дальнейших исследований выбран гель, получаемый криоструктурированием ПВС (Рогожин и др., 1989). Была проведена работа по подбору условий иммобилизации клеток S. cerevisiae. Наиболее целесообразным признано замораживание раствора ПВС с клетками при -70° С в течение 5 минут.

Рисунок 9. Поверхность отклика удельной активности кислой фосфатазы в среде на изменение концентрации полимера и плотности иммобилизованной суспензии клеток Saccharomyces cerevisiae.

Постановка полного факторного эксперимента с тремя уровнями двух факторов- концентрации ЛВС и плотности иммобилизуемой суспензии клеток имела целью выяснить влияние этих факторов на эффективность секреции кислых фосфатаз и вымывание клеток из геля в процессе культивирования. По результатам эксперимента сделан вывод о том, что оптимальной для секреции кислых фосфатаз следует считать иммобилизацию суспензии дрожжевых клеток с концентрацией 1,15x1010 клеток/мл в 5%-ный ПВС (рис. 10).

Рисунок 10. Клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae, иммобилизованные в криогеле поливинилового спирта

О состоянии клеток и структуре геля при разных условиях замораживания и различной концентрации ПВС судили по наблюдениям с помощью сканирующего электронного микроскопа. Различий в структуре гелей, замороженных при разных условиях, не обнаружили. Подобранные условия иммобилизации позволяли сохраняли клетки жизнеспособными, по крайней мере, в течение двух недель. При данных условиях культивирования почкование клеток не наблюдалось. Наибольшая секреторная активность как свободных, так и иммобилизованных клеток наблюдалась на среде, содержащей 2% дрожжевой экстракт.

Использование лабораторной проточной установки позволило значительно увеличить выход секретируемого фермента (рис.11). Суммарная активность репрессибельной кислой фосфатазы, секретированной за все время инкубации иммобилизованными клетками дрожжей в колонке, в проточной системе, превышала активность фермента, секретированного тем же количеством свободных клеток, в 3,5 раза.

Рисунок 11. Выход внеклеточной кислой фосфатазы в среду при культивировании иммобилизованных (1) и свободных (2) клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Для некоторых секретируемых ферментов дрожжей показано явление ауторегуляции - подавление секреции фермента, если его концентрация в среде достигает определенного значения. Увеличение выхода фермента при использовании проточной системы, в колонке, может являться следствием удаления секретируемого фермента и иных продуктов метаболизма из среды культивирования.

Глава 2. Трифосфатаза грибов Neurospora crassa.

Обмен фосфата у низших грибов представлен несколькими семействами ферментов. Это кислые фосфатазы, обеспечивающие добычу ортофосфата из разных внешних источников: фосфат пермеазы, обеспечивающие транспорт фосфата через клеточные поверхности; полифосфат киназы, полифосфатазы и щелочные фосфатазы обеспечивающие внутриклеточный циклический обмен фосфата (Parent et al.,1987). Согласованная работа этих ферментов обеспечивает контроль содержания фосфата в клетке и его ассимиляцию.

В настоящее время выявлены разнообразные полифосфатазы грибов, в том числе и дрожжей, причем многие являются специфичными для определенных компартментов клетки (Кулаев и др., 1995). В нашей работе (Егоров и Кулаев, 1976) у мицеллярного гриба N. crassa впервые был выделен и охарактеризован фермент трифосфатаза, катализирующий гидролиз триполифосфата до ортофосфата и пирофосфата при щелочных значениях рН. В результате очистки был получен гомогенный по результатам электрофореза в полиакриламидном геле фермент с удельной активностью 10,3 Е/мг. Активность фермента обнаружена в митохондриях и цитоплазме гриба. Изучены его физико-химические свойства и фермент внесен в классификацию ферментов под номером 3.6.1.25. Его функция в клетке не известна, но можно предположить, что неорганический трифосфат может использоваться, как "высокоэнергетический" источник фосфата. Некоторые результаты, поддерживающие эту точку зрения были получены нами при изучении роста цианобактерий на средах, содержащих различные полифосфаты, как единственный источник фосфата (Егоров и др., 1983). Высказано предположение, что трифосфат, в отличие от других полифосфатов, потребляется клетками непосредственно из среды культивирования.

Глава 3. Изучение внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Ферменты, катализирующие гидролиз моноэфиров ортофосфорной кислоты при кислых значениях рН, принято называть кислыми фосфатазами. Кислые фосфатазы, как правило, обладают широкой субстратной специфичностью и повсеместно распространены в живой природе. Локализация их в клетке - самая разнообразная. Фермент обнаружен в клеточной стенке картофеля и прилегающих к ней структурах (Kruzel and Morawiecka, 1982), в клеточной стенке стафилококка (Malveaux and SanClemente, 1969) и Rhodotorula (Trimble et al., 1981) В мембранных структурах эукариотической клетки, таких как лизосомы ( Himeno et al., 1988), митохондрии (Chen and Chen, 1988), тилакоидные мембраны хлоропластов (Rengasamy et ai„ 1981).

Фермент обнаружен в разных органах высших организмов. В простате (Belfield et al., 1972), в печени ( Lawrence and van Etten, 1981), в мозге (Prus and Wallin, 1983), в селезенке (Нага et al., 1984), в плаценте (Gieselmann et al., 1984), в мышцах (Baxter and Suelter, 1985).

К настоящему времени известны трехмерные структуры кислых фосфатаз некоторых организмов. К примеру, из Escherichia blattae была изолирована неспецифическая кислая фосфатаза, ее ген клонирован, продукт гена очищен, кристаллическая структуру данного фермента определена при разрешении 1,9 А. Фосфат связывающий участок был маркирован сульфатной группой. Фермент является гомогексамером с молекулярной массой 150 «Да. В активный центр фермента входят остатки аминокислот: Lys115, Arg122, Ser148, Gly149, His150, Arg183, His189 и Asp 193. (Ishikawa et al., 2000). Известны трехмерные структуры ферментов, полученных из Aspergillus niger (Kostrewa et al., 1999), пурпурная кислая фосфатаза свиньи (Guddatet al., 1999), простаты человека (Jakob et а!., 2000).

Кислые фосфатазы дрожжей S.cerevisiae, как указывалось выше, представлены двумя формами. Конститутивная кислая фосфатаза (кКФ) синтезируется при высоких концентрациях фосфата в среде, в то время, как репрессибельная кислая фосфатаза (рКФ)- только при дефиците экзогенного фосфата.

Первые работы по изучению кислых фосфатаз пекарских дрожжей относятся к началу 60 годов прошлого века (Suomalainen et al., 1960; Schmidt et al., 1963; Tonino and.Steyn-Parve, 1963).

В регуляции биосинтеза кислых фосфатаз принимает участие около 10 регуляторных генов (Yoshida et al., 1987). Показано подавление синтеза кКФ при синтезе рКФ (Tait-Kamradt et al„ 1986).

Кроме того, следует отметить, что широко используемый в литературе термин "конститутивная кислая фосфатаза" не совсем корректен, так как в настоящее время показана зависимость биосинтеза этого фермента от тиамина ( Nosaka et al., 1989).

Четыре структурных гена (табл. 8) кодируют кислые фосфатазы дрожжей S.cerevisiae: РНОЗ (YBR092C), РН05 (YBR093C), РН010 (YHR215W) и РН011 (YAR071W). Нуклеотидная последовательность РНОЗ, РН05 и РН011 генов определена в лаборатории Хиннена (Meyhack et al., 1982; Bajwa et al., 1984; Hinnen et al., '1987). Последовательность РНОЮ гена (в литературе он иногда фигурирует, как РН012) получена из результатов расшифровки генома дрожжей S.cerevisiae. Все четыре гена кодируют полипептиды, содержащие 467 аминокислотных остатков (а.к.) (табл. 9). Сигнальные пептиды, содержащие по 17 а.к, отщепляются при ко-трансляционной транслокации синтезируемого полипептида в цистерны эндоплазматического ретикулума. При трансляции мРНК дрожжей in vitro, с помощью метода SDS-электрофореза в полиакриламидном геле были определены молекулярные массы полипептидов входящих в состав кислых фосфатаз (Bostian et al., 1980). Для кКФ обнаружен один полипептид: р57.

Таблица 9. Кислые фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Стандартное наименование генов РНОЗ PH05 РНОЮ PH011 РН05 РНОЮ РН

Систематическое наименование генов YBR092C YBR093C YHR215W YAR071W YBR093C YHR215W YAR071W

Генный продукт кКФ рКФ А форма В форма С форма

Хромосомы II II,VIII,I II VIII I

Число аминокислотных остатков

Число участков N-глиикозилирования

MW, kD (ВЭЖХ)

MW, kD (SDS -PAGE) 160-180 130-160 140-180 125-180 125

Полипептиды MW kD (SDS -PAGE)

Pi 3.5-4.3 3.5-4.8 3.5-4.3 4.2-5.0 4.2-5.

Vm тМ/мин*мг (4-НФФ) 0,6 5,1 1,1 0,9 1,

Репрессибельная кислая фосфатаза имеет в своем составе три полипептида: р61, р58 и р56, кодируемые генами РН05 и РНОЮ и РН011 соответственно. Все полипептиды, входящие в состав зрелых внеклеточных кислых фосфатаз, гликозилированы по Л/-типу. Содержание углеводного компонента составляет не менее 50% от молекулярной массы гликопротеина (Kozulic et al., 1984; Riederer and Hinnen, 1991). Такое высокое содержание полисахаридов вызывает известные трудности при работе с ферментами, что сказывалось, в частности, на определении молекулярной массы кислых фосфатаз. В разных лабораториях была выявлена гетерогенность кислых фосфатаз (Boer and Steyn-Parve, 1966; Barbaric et al., 1980), молекулярная масса фермента определялась в диапазоне от нескольких млн. до 150 Kfla.

3.1. Выделение конститутивной и репрессибельных форм внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Внеклеточные кислые фосфатазы дрожжей представляют собой гликопротеины, молекулярная масса которых варьирует в зависимости от видовой принадлежности микроорганизмов. Так например дрожжи Candida albicans, образуют кислую фосфатазу с молекулярной массой 120 кДа (Odds and Hierholzer, 1973), а дрожжи Schizosaccharomyces pombe - фермент с мол. массой 380 «Да, причем активной формой является тетрамер (Dibenedetto and Teller, 1981). конститутивная кислая фосфатаза (0,03 E/mg) репрессибельная кислая фосфатаза (0,05 E/mg) культуральная жидкость ультрафильтрация адсорбционная хроматография на Ultrogel ионообменная хроматография DEAE Toyopearl i ультрафильтрация ультрафильтрация гельфильтрафильтрация UltrogelAcA34 (24E/mg) гельфильтрафильтрация Ultrogel АсА34 (3,7 E/mg)

Рисунок 12. Схема очистки внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Ранее в нескольких работах предпринимались попытки очистки кислых фосфатаз. Фермент выделяли из среды инкубирования протопластов дрожжей ( Boer and Steyn-Parve, 1966; Barbaric et al., 1980). В нашей лаборатории были разработаны условия секреции кислых фосфатаз в среду выращивания целыми клетками дрожжей. Были использованы самые разнообразные подходы для очистки ферментов. В том числе осаждение органическими растворителями (этанолом или ацетоном); фильтрация на мембранных фильтрах; аффинная хроматография на лектинах (Кон-А сефароза); ионообменная и адсорбционная хроматография; гель хроматография; хроматофокусирование и изоэлектрофокусирование. Одна из возможных схем выделения представлена на рисунке 12 и более подробно на примере выделения репрессибельной кислой фосфатазы в таблице 10 (Цупрун и др., 1988).

Таблица 10. Схема выделения и очистки репрессибельной кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Стадия очистки Объем (мл) Белок (мг) Активность (Е) Активность (Е/мг) Выход (%) Степень очистки

1. Культуральная жидкость 4560 31920 1550 0.

2 .Ультрафильтрация 225 911 439 0.48 28 9,

3. ГА-ультрогель 58 12 26 2,20 1,7 44,

4.Ультрафильтрация 1,7 4,4 38 8,50 2,4 174,

5. Гельфильтрация АсА-34 32,5 3,3 62 23,90 4 488,

Введение стадии FPLC ионообменной хроматографии на DEAE-Toyopearl (Япония) позволило отделить инвертазу от кислой фосфатазы. Представленная схема очистки позволяет получать в очищенном виде не только конститутивную и репрессибельную формы кислых фосфатаз, но и инвертазу, которая по своим физико-химическим свойствам очень сходна с кислыми фосфатазами.

3.2. Множественные формы внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей.

Использование SDS-электрофореза в полиакриламидном геле для изучения внеклеточных кислых фосфатаз не дало ожидаемых результатов. При данном методе анализа мы не различали отдельных белковых полос, принадлежащих исследуемому ферменту, что может быть объяснено как гетерогенностью препарата кислых фосфатаз, так и сродством этих гликопротеинов (рис. 13) к матрице геля (рис. 14).

Этим феноменом можно объяснить неточные результаты определения молекулярной массы крупных гликопротеинов типа кислых фосфатаз и инвертаз.

Рисунок 13. Результат электрофореза кислых фосфатаз и инвертазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae в агарозном геле с ConA. 1 - конститутивная кислая фосфатаза; 2 - репрессибельная кислая фосфатаза;3 - инвертаза.

Рисунок 14. Внеклеточные кислые фосфатазы и инвертаза дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Электрофорез в полиакриламидном геле в нативных условиях. 1- репрессибельная кислая фосфатаза. Прокраска на белок; 2-репрессибельная кислая фосфатаза. Прокраска на активность; 3- конститутивная кислая фосфатаза. Прокраска на активность; 4- инвертаза. Прокраска на активность.

Электрофоретические методы исследования мы дополнили изоэлектрофокусированием в гелях.

Рисунок 15. Изофокусирование в агарозном геле кислых фосфатаз и инвертазы . дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Прокраска на активность. 1- инвертаза; 2-конститутивная кислая фосфатаза; 3-рРепрессибельная кислая фосфатаза

В работе использовали агарозные и полиакриламидные гели с иммобилизованными и создаваемыми в процессе работы градиентами рН. Было показано, что все изученные нами внеклеточные гликопротеины дрожжей представлены множественными формами ферментов. На рисунках изображены зимограммы изоэлектрофоретического разделения внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей S. cerevisiae и С. и til is и инвертаз S. cerevisiae (рис. 15 и рис. 16). Диапазон pi для кислых фосфатаз находится в предела 3,5 - 4,3 для конститутивного фермента и 3,5 - 4,8 для репрессибельного (Shnyreva and Egorov, 1988; Shnyreva et ai., 1996). Для изучения полипептидного состава отдельных изоферментов внеклеточной кислой фосфатазы, находящихся в районе рН 4,2-4,8 был применен метод хроматофокусирования.

- J:"ЩЛЯЛМШШШШк

Рисунок 16. Изоформы внеклеточной кислой фосфатазы дрожжей Candida utilis. Прокраска на активность бумажной реплики после препаративного изоэлектрофокусирования в геле Ultrodex.(LKB Швеция).

Рисунок 17. Хроматофокусирование препарата репрессибельной кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae на колонке МопоР в системе FPLC (Pharmacia, Швеция). 1 - значения рН; 2 - профиль элюции.

Получено четыре фракции, различающиеся по изоточкам. Выделенные фракции подвергали процессу дегликозилирования с использованием фермента эндогликозидаза-Н и затем анализировали полипептидный состав и определяли молекулярную массу полипептидов с помощью SDS-электрофореза в полиакриламидном геле. Полипептидный состав фракций различен. Только одна фракций с pl=4,7 содержала один полипептид с массой 58 «Да. В остальных мы обнаружили два или три различных полипептида, входящие в состав внеклеточной кислой фосфатазы (рис. 17).

3.3. Физико-химические свойства внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Ранее нами было показано, что при трансформации клеток дрожжей отдельными структурными генами репрессибельной кислой фосфатазы в среде культивирования накапливались гомомерные формы фермента (рис.18).

Рисунок 18. Гомомерные формы репрессибельной кислой фосфатаза (А, В, С) дрожжей Saccharomyces cerevisiae. SDS- электрофорез в полиакриламидном геле, прокраска на белок (1). Изоэлектрофокусирование в полиакриламидном геле с иммобилинами , прокраска на активность (2).

Все гомомерные формы внеклеточных кислых фосфатаз преципитировали с СопА, являющимся высоко специфичным пектином на маннозные остатки. Следовательно выделенные гомомерные формы кислых фосфатаз являются гликопротеинами (рис. 19).

Фермент, кодируемый РН05 геном, мы назвали А формой, РНОЮ геном - В формой, а РН011 геном - С формой внеклеточных кислых фосфатаз. Минимальная молекулярная масса активных гомомерных молекул ферментов была определена с

Сравнительная термостабильность гомомерных форм представлена на рисунке 20. Видно, что А форма является более стабильным ферментом, чем В и С формы. 50% активности А формы сохранялись при 54 °С , для В формы - при 39 °С, а для С формы - при 36 °С (Shnyreva etal., 1996).

3.4. Субстратная специфичность внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Для определения субстратной специфичности внеклеточных кислых фосфатаз мы использовали 10 субстратов (табл. 12) (Егоров и др., 2000). Были применены широко используемые при исследованиях кислых фосфатаз такие субстраты, как 4-нитрофенилфосфат, |5-глицерофосфат, глюкозо-6-фосфат, АМФ, ЦМФ. Кроме того, мы использовали пирофосфат, АТФ, ГТФ. Для репрессибепьной кислой фосфатазы ранее было показано, что высокоочищенный фермент способен дефосфорилировать не только фосфаты аминокислот, но также фосфорилированные полипептиды и некоторые клеточные белки. Для сравнительного определения протеин-дефосфорилирующей активности различных внеклеточных кислых фосфатаз мы использовали О-фосфо-ОЬтирозин и О-фосфо-БЬ-серин. Из полученных результатов следует, что в целом, обе нативных формы ферментов имеют широкую субстратную специфичность, хотя для всех изученных субстратов Vm для репрессибепьной кислой фосфатазы были практически на порядок выше, чем для конститутивного фермента.

Таблица 12. Субстратная специфичность (Km и Vm) внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Km( mM ) Vm (mM/мин. мг) экспрессируамые гены экспрессируемые гены субстраты РН05 РНОЮ РН011 РНОЗ РН05 РНОЮ РН011 PHOS РНОЮ PHQ11 РНОЗ PHOS РНОЮ РН

4-НФФ 0.20 0.89 0.35 0.47 0.18 5.12 0.64 1.13 0.86 1.

Пиро-Ф 0.24 1.89 0.19 0.10 0.09 3.50 0.29 1.25 1.03 1. р-глицеро-Ф 0.36 1.85 0.60 0.76 0,85 7.88 1.92 1.65 1.41 3.

Глюкозо-6-Ф 0.32 2.20 0.29 0.49 0.97 7.88 1.35 1.61 1.18 4.

АМФ 0.20 2.08 0.29 3.06 151 8.60 0.91 0.96 0.63 0.

ЦМФ 0.77 1.94 0.91 6.58 4.32 7.67 1.82 3.02 0.86 1.

АТФ 0.29 0.19 1.29 0.12 0.21 3.18 0.08 0.19 1.25 2.

ГТФ 0.04 0.03 0.05 1.30 0.01 2.06 0.10 2.71 74.94 0.

Тирозин-Ф 0.11 0.45 0.18 0.05 0.04 12.46 1.74 0.75 3.82 2.

Серин-Ф 0.53 4.42 5.10 0.42 0.21 0.58 0.13 0.58 0.12 0.

Величины отношений kkat/Km (табл. 13) являются более информативными показателями при определении субстратной специфичности ферментов( Фершт, М. Мир, 1990).

Таблица 13. Результаты субстратной специфичности кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae, представленных в виде Vm/Km. субстраты , Vm/Km(1/MHH.Mr) экспрессируемые гены

РНО 5РНОЮ РН011 РНОЗ РН05 РН010 РН

4-НФФ 25.60 0.72 3.23 1.83 7.

Пиро-Ф 14.58 0.15 6.58 10.30 17.

Р-Глицеро-Ф 21.69 1.04 2.75 1.86 3.

Глюкозо-6-Ф 24.63 0.61 5.55 2.41 4.

АМФ 43.00 0.44 3.31 0.21 0.

ЦМФ 9.96 0.94 3.32 0.13 0.

АТФ 10.97 0.42 0.15 10.42 11.

ГТФ 51.50 3.33 54.20 57.65 18.

Тирозин-Ф 113.27 3.87 4.17 76.40 53.

СерингФ 1.09 0.03 0.11 0.29 0.

Отличия в субстратной специфичности показаны для отдельных субъединиц репрессибельной кислой фосфатазы. Так тирозин-фосфат фосфатазная активность нативной репрессибельной кислой фосфатазы определяется активностью субъединиц, кодируемых генами РН010 и РН011, причем в натавном ферменте усиление данной ферментативной активности обусловлено, по-видимому, межсубъединичным взаимодействием. Таким образом, различия в субстратной специфичности гомомерных форм репрессибельной кислой фосфатазы в сочетании с выявленными различиями в рН-оптимумах и термостабильности позволяют высказать гипотезу о различной функциональной роли отдельных субъединиц в составе репрессибельной кислой фосфатазы. Высказанное предположение согласуется с результатами по определению взаимосвязи секреции внеклеточных кислых фосфатаз с процессом почкообразования.

3.5 Возможная роль конститутивной кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

При культивировании дрожжей на жидкой среде обращает на себя внимание сильный разброс в размере клеток некоторых мутантов, дефицитных по гену РНОЗ, кодирующему конститутивную кислую фосфатазу. В таблице 14 представлены размеры клеток дрожжей S. cerevisiae штаммов YMR4, YMR404, YMR407, YMR410, с нарушенными генами РНОЗ и РН05, и лабораторный штамм S 288С с ненарушенной системой фосфатазных генов. При выращивании культур на среде с 10 тМ ортофосфатом, то есть при условиях экспрессии гена РНОЗ, форма и размеры клеток штаммов серии YMR значительно разнятся от клеток штамма S 288С

Таблица 14. Средние размеры клеток штаммов дрожжей Saccharomyces cerevisia, содержащих (S 288С) и дефицитных (YMR4, YMR44, YMR407 и YMR410) по гену конститутивной кислой фосфатазы (РНОЗ).

Штамм Диаметр клетки, мкм Объём клетки, мкм

S288C 9,

YMR4 13,

YMR44 16,

YMR407 15,

Единственным отличием представленных культур является наличие конститутивной кислой фосфатазы у штамма S 288С и отсутствие этого фермента у штаммов серии YMR. После трансформации и отбора клеток дрожжей YMR 4 плазмидой pDP34 GAPFL-PH03, содержащей ген конститутивной кислой фосфатазы, размер клеток, выращенных на среде с 10 тМ ортофосфата не отличались от размеров реперного штамма S288C (рис. 21).

12 14 16 1В 20 а ТА диаметр теток (мкм)

Рисунок 21. Размеры клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae YMR4 (•) и клеток YMR44 (pDp34-GAPFL

РНОЗ) (о)

Данный опыт с достаточной наглядностью демонстрирует роль конститутивной кислой фосфатазы, как необходимого элемента клеточной стенки дрожжей S. cerevisiae. Возможность участия кислой фосфатазы, как структурного элемента клеточной стенки дрожжей, хорошо согласуется с современным взглядом на роль гликопротеинов, участвующих в скреплении полисахаридных тяжей клеточной стенки дрожжей (Kapteyn et а!., 1999; Калебина и Кулаев, 2000).

Глава 4. Структурная организация внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

4.1. Электронно-микроскопическое изучение кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

При электрофорезе в денатурирующих условиях в присутствии SDS-Na репрессибельная кислая фосфатаза движется диффузной зоной, ее молекулярная масса находится в районе 95-165 «Да, что соответствует литературным данным по массе одной субъединицы. Очищенные ферменты исследовались с помощью аналитического ультрацентрифугирования и электронной микроскопии. Препарат репрессибельной кислой фосфатазы способен к агрегации (рис. 22, 23) и представлен дискретными формами седиментирующими с 1,6S; 7,5S и 13,6S.

Рисунок 22.

Репрессибельная кислая фосфатаза дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Электронная микрофотография очищенного препарата фермента.

Большой интерес представляло решение вопроса о минимальной нативной конфигурации кислых фосфатаз. Этот вопрос был решен с помощью электронной микроскопии очищенных препаратов внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей. Минимальная молекулярная организация исследованного нами препарата представляла собой квадрат со стороной равной 11+1 nm (рис. 24) Подобная организация была показана ранее для инвертазы дрожжей S. cerevisiae (Esmon et al., 1987). Четыре белковых области располагаются в углах квадрата, что может указывать на то, что минимальная нативная организация кислых фосфатаз представляет собой тетрамер. Если представить проекцию субъединиц фермента в виде одинаковых сфер, то их диаметр можно оценить, как 5,5+0,5 nm, что соответствует белку с молекулярной массой 125+25 кДа. Подобное расположение проекции субъединиц на плоскость может представлять плоскую фигуру с С4 симметрией, либо тетраэдр с D2 симметрией. В последнем случае один димер расположен относительно другого вдоль второй оси (Шнырева и др., 1993).

Рисунок 23. Репрессибельная кислая фосфатаза, двухмерное изображение (А) и конститутивная кислая фосфатаза трехмерное изображение (Б). Чистые препараты ферментов, осажденные на слюду. Атомно-силовая микроскопия.

Полипептидный состав ферментов, представляющих собой внеклеточную репрессибельную кислую фосфатазу, был исследован нами с помощью SDS-электрофореза дегликозилированных препаратов очищенного фермента (рис. 25). Из денситометрического анализа плотностей двух белковых полос соответствующих дегликозилированиому препарату кислой фосфатазы следует, что основное количество белка представлено полипептидом с молекулярной массой около 60 кДа.

Его количество составляет более 85% и кодирующим его геном является РНО 5. Суммарное количество двух других полипептидов, кодируемых генами РНОЮ и РН011, составляет не более 12% от общего содержания белка (Shnyreva et al., 1996).

50 нм

Рисунок 24. Минимальная форма репрессибельной кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces .cerevisiae. Электронная микрофотография очищенного препарата фермента.

Рисунок 25. Полипептидный состав репрессибельных кислых фосфатаз, выделенных из культуральной среды дрожжей Saccharomyces cerevisiae, штаммов S-288С (1); YMR4 pDP34 GAPFL-РШб, выращенные на среде, лишенной Фн (2); YMR4 pDP34 GAPFL-PH05, выращенные на среде, содержащей Фн (3); YMR4, выращенные на среде, лишенной Фн (4). На фотографии представлены результаты прокраски белков после SDS-электрофореза в градиентном (5-25,5%) полиакриламидном геле препаратов кислых фосфатаз после их обработки ферментом эндогликозидазой-Ф.

Глава 5. Изучение механизма секреции внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

5.1. Получение дрожжевых клонов, содержащих отдельные структурные гены репрессибельной кислой фосфатазы.

5.1.1. Разрушение и клонирование генов РНОЮ и РН011.

В настоящее время не получены мутанты дрожжей, лишенных всех структурных генов кислых фосфатаз, что указывает на исключительную важность этих ферментов в жизнеобеспечении клетки. Мы использовали дрожжи штамма YMR4 с генотипом (а his 11, 3-15 leu2-3, 2-112 canR РН05-РН03::ura3A1). Этот штамм содержал неповрежденные структурные гены РНОЮ и РН011 репрессибельной кислой фосфатазы. ХЬа 1 фрагмент, содержащий URA 3 ген получали из плазмиды pFBY4R и клонировали в Cla 1 сайт плазмиды pBR322-PH011. Этот субклон был обработан рестриктазами EcoR1 и BarnHI. Участок, содержащий ген РН011 с вставкой URA 3 был выделен и им произведена трансформация клеток YMR 4. Получены два типа мутантов, содержащих только один ген либо РНОЮ, либо РН011. Благодаря тому, что- второй Cla 1 сайт находится на разном расстоянии от первого в "upstream" участках генов РНОЮ и РН011, идентифицировать полученные мутантные штаммы можно с помощью метода Southern-гибридизации. Таким образом были получены клоны YMR44 (a his 11, 3-15 leu2-3, 2-112 canR PH05-PH03::ura3Al PH011::шаЗ ) и YMR46 (а his 11, 3-15 leu2-3, 2-112 canR PH05-PH03::ura3A1 РНОЮ::ura3 ). (Shnyreva et al., 1996)

1,5 тпн фрагмент ДНК, содержащий кодирующий участок гена РН05 под GAPFL-промотором (Janes et al., 1990), полученный из плазмиды pDP34- GAPFL-РН05 был встроен в плазмиду р31. Данная конструкция получила название р31- GAPFL-PH05. Затем, с помощью рестриктаз Hindlll и Kpnl кодирующий участок гена РН05 был изъят и вместо него был встроен 3,3kb Hindlll / Kpnl фрагмент из плазмиды pBR322-РНОЮ.

Для встройки гена РН011 в плазмиду pBR322 из плазмиды pDP34- GAPFL-РН05 был вырезан фрагмент Kpnl/Clal , кодирующий ген РН05, и на его место был встроен 2,3kb Hindlli/Clal фрагмент, содержащий ген РН011.

3,5 тпн фрагмент, содержащий GAPFL промотор и кодирующие участки РНОЮ или РН011 генов были вырезаны по Hindlll и Sail сайтам и клонирован по BamHI/Sall участкам рестрикции в плазмиду pDP 34 после затупления липких концов (Shnyreva et al., 1996).

Таким образом, мы могли получать кислые фосфатазы различного полипептидного состава( табл. 15).

Таблица 15. Возможный состав внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей S.cerevisiae.

ШТАММ ЭКСПРЕССИРУЕМЫЕ ГЕНЫ бесфосфатная среда среда с фосфатом

S288C рКФ(РЯ05, PH010, РН 011) кКФ (РНОЗ)

YMR4 РН010,РН

YMR44 РНОЮ

YMR46 РН

YMR4(pD P34-GAP-PH05) РН05,РН010,РН011 РН

YMR4(pDP34-GAP-РН010) РН0Ю,РН011 РНОЮ

YMR4(pDP34-GAP-РН011) РН0Ю,РН011 РН

YMR44(pDP34-GA P-PHOS) РН05,РН010 РН

YMR44(pDP34-GAP-РНОЮ) РНОЮ РНОЮ

YMR44(pDP34-GAP-PHOt 1) РН0Ю,РН011 РН

YMR4(pDP34-GAP-РНОЗ) РНОЗ,РНОЮ,РН011 РНОЗ

YMR44(pDP34-GAP-PHG3) РНОЗ,РНОЮ РНОЗ

YMR46(pDP34-GA Р-РНОЗ) РН03,РН011 РНОЗ

5.2. Разработка метода и выделение секреторных везикул дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Используя подход, предложенный авторами по выделению мембранной фракции клеток дрожжей ( Шабалин и Кулаев, 1989), мы разработали оригинальный метод выделения секреторных везикул, основанный на мягком разрушении протопластов с помощью осмотического шока и разделении везикул при центрифугировании в градиенте плотности Урографина. Все этапы выделения проводили при 4°С, кроме особо оговоренных случаев (Блинникова и др., 2002).

С помощью этого метода были получены везикулы из штамма S. cerevisiae

S288C, выращенного на среде богатой неорганическим фосфатом и на бесфосфатной среде. В результате разделения в градиенте плотности Урографина микросомальной фракции, не осаждающейся при 10 ОООхд, мы получили две фракции везикул (рис. 26). При росте клеток в бесфосфатной среде фракция более плотных везикул (ТВ, удельная плотность 1,14 г/см3) содержала около 65%, а фракция менее плотных (ЛВ, удельная плотность 1,07 г/см3) - около 35% общего белка везикул. При выращивании на среде, богатой неорганическим фосфатом, наблюдали обратную картину: около 70% белка - во фракции ЛВ и около 30% белка - во фракции ТВ.

Рисунок 26. Транспортные везикулы дрожжей Saccharomyces cerevisiae . 1 -разделение везикул в градиенте Урографина. 2 - легкая фракция транспортных ' везикул. 3 - тяжелая фракция транспортных везикул.

На представленных электронных микрофотографиях (рис.26) видно, что два типа везикул отличаются по электронной плотности и виду поверхности и имеют средний диаметр 100-150 нм. Поверхность ТВ-гранулированная, а поверхность ЛВ-гладкая. Диаметр выделенных везикул несколько больше, чем это было показано в литературе на тонких срезах интактных клеток дрожжей (80-100 нм) (Novick et al., 1981).

5.3. Локализация кислых фосфатаз во фракциях секреторных везикул.

Нами была показана высокая степень корреляции между процессом почкообразования и секрецией конститутивной кислой фосфатазы и отсутствие таковой в случае репрессибельной кислой фосфатазы (Шнырева и Егоров ,1990). Авторы предположили, что у дрожжей, также как у высших эукариот, существуют два пути секреции - конститутивный и регулируемый. Некоторые заключения о двух путях секреции кислых фосфатаз высказывали ранее (Schweingruber and Schweingruber, 1982; Schonholzer et a!., 1985). И, хотя, предположение было правильным, эксперименты, лежащие в его основе, не были подтверждены в более поздних исследованиях.

В данном разделе работы мы использовали два подхода. Первый -определение взаимосвязи между процессом почкообразования и секрецией маркерных ферментов в среду. Второй - распределение ферментативной активности между фракциями выделенных секреторных везикул.

Изучение секреции гомомерных форм фосфатаз предприняли для выяснения возможной роли каждой из субъединиц нативной репрессибельной кислой фосфатазы в выборе пути секреции зрелого фермента. Был проведен корреляционный анализ между двумя рядами данных - количеством почек в 1 мл среды и соответствующим ему приростом суммарной внеклеточной активности каждого из трех гомомерных форм ферментов. Высокий коэффициент корреляции между этими рядами данных означает, что суммарный прирост энзиматической активности прямо пропорционален количеству почек в культуре, т.е. секреция фермента происходит по конститутивному пути транспорта через почку. Ранее предполагалось, что все внеклеточные ферменты дрожжей секретируют только по этому пути. Как видно из табл. 8, секреция гомомерной кислой фосфатазы А имеет высокую корреляцию с почкообразованием, т.е. фермент секретирует по конститутивному пути. Секреция гомомерных кислых фосфатаз В и С не коррелировала с почкообразованием. Поскольку секреция репрессибельной кислой фосфатазы также не коррелирует с почкообразованием, можно предположить, что именно наличие в этом гетеромерном ферменте минорных компонентов В и С определяет альтернативный путь его секреции.

Для того чтобы выяснить причины различий в доставке кислых фосфатаз к поверхности клетки, представлялось целесообразным проанализировать их содержание в различных типах секреторных везикул, осуществляющих эту доставку. Везикулы, полученные из клеток, выращенных как на среде с неорганическим фосфатом, так и без него, использовали для измерения фосфатазной активности. В первом случае основная часть активности была сосредоточена в Л-везикулах (конститутивная кислая фосфатаза), а во втором случае - в Т-везикулах (репрессибельная кислая фосфатаза), (табл. 16). Основываясь на этих данных можно предположить, что на секреторном пути существует система сортинга белков: одни из них идут к клеточной поверхности по конститутивному пути, а другие - по пути, отличному от конститутивного.

Для выяснения вопроса, что может определять сортинг различных кислых фосфатаз, были выделены везикулы из штаммов, синтезирующих гомомерные кислые фосфатазы А, В и С. Результаты этого исследования показали, что гомомерная кислая фосфатаза А транспортируется к поверхности клетки преимущественно в Лвезикулах (табл. 16). Это означает, что продукт РН05 гена не обладает способностью выбирать альтернативный путь секреции и не отличается по этому признаку от продукта РНОЗ гена, т.е. конститутивной кислой фосфатазы. Фосфатазы В и С транспортируются преимущественно в Т-везикулах (табл. 16). Поскольку репрессибельная кислая фосфатаза включает продукты экспрессии трех генов и при этом транспортируется в Т-везикулах, можно предположить, что именно минорные компоненты репрессибельной кислой фосфатазы (продукты РНОЮ и/или РН011 генов) отвечают за транспорт нативного фермента в тяжелых везикулах по альтернативному пути.

Таблица 16. Зависимость секреции внеклеточных кислых фосфатаз от процесса почкования клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae.

Штаммы Фн в среде Кислые фосфатазы Коэффициент корреляции активности внеклеточной кислой фосфатазы и процесса почкования клеток % активности кислых фосфатаз в везикулах лёгкие тяжёлые

S288C + кКФ 0,

S288C - рКФ 0,

YMR4pDP34-РН05 А форма 0,

YMR44 - В форма 0,

YMR46 - С форма 0, Таким образом, данные, полученные 8 нашей работе, свидетельствуют о том, что у дрожжей, существуют два пути секреции. Новый метод получения транспортных везикул может служить удобным инструментом для дальнейших исследований механизма сортинга и транспорта секреторных белков.

5.4. Изучение роли PholOp и РН011 р в выборе транспортного пути внеклеточных кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae

Для дрожжевой клетки вопросы сортинга внеклеточных белков окончательно не решены. В предыдущем разделе работы было показано, что секреция в среду двух форм кислых фосфатаз осуществляется разными путями. Так кКФ транспортируется в почку с помощью легкой фракции секреторных везикул, в то время как транспорт рКФ осуществляется тяжелой фракцией секреторных везикул. Нами была показана позитивная роль PholOp и Pho11p в выборе транспортного потока для репрессибельной кислой фосфатазы. Для подтверждения роли PholOp и Pho11p в сортинге нативных внеклеточных фосфатаз была сконструирована система, в которой происходила одновременная экспрессия этих, генов и гена РНОЗ. Для этого промоторная область гена РНОЗ была заменена на промотор дрожжевого фермента глицеральдегид-фосфат-дегидрогеназы. Биосинтез данного фермента не регулируется содержанием ортофосфата в среде, в то время, как экспрессия РН010 и РН011 генов контролируется концентрацией внеклеточного фосфата и осуществляется только при следовых количествах его в среде. Таким образом, контролируя содержание фосфата в среде, можно получать либо гомомерный фермент, содержащий Pho3p, т.е кКФ, либо гетеромерные ферменты состава: Pho3p, PholOp; Pho3p, Pho11p; или Pho3p, PholOp, Pho11p, т.е. ферменты, содержащие одновременно субъединицы кКФ и рКФ.

Ранее было показано, что доставка кислых фосфатаз дрожжей происходит при участии двух различных фракций транспортных везикул. Везикулами легкой фракции кКФ транспортируется в почку, а везикулами тяжелой фракции транспортируется к поверхности клетки рКФ. По выявлению фосфатазной активности во фракциях секреторных везикул, мы судили о транспортировке этих ферментов по тому или иному секреторному пути. Гомомерная форма фермента (Pho3p) транспортировалась легкой фракцией везикул у всех исследованных нами штаммов дрожжей (табл. 17). Составные ферменты, в которых присутствовали полипептиды обеих форм кислых фосфатаз, транспортировались с помощью тяжелых секреторных везикул (табл. 17). Иными словами, выбор транспортного пути конститутивной кислой фосфатазы определялся минорными субъединицами рКФ (PholOp, Pho11p) и осуществлялся тяжелой фракцией транспортных везикул. Таким образом мы считаем, что присутствие PholOp, Pho11p в составе кислых фосфатаз, определяет выбор терминального транспортного пути этих ферментов к поверхности дрожжевой клетки.

• Таблица 17. Распределение активности конститутивной кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae по двум фракциям транспортных везикул, при одновременной экспрессии РН010 и РН011 генов репрессибельной кислой фосфатазы.

Штаммы Экспрессированные гены % активности КФ в секреторных везикулах

Лёгкие Тяжёлые

YMR44 pDP34-GAPFI-РНОЗ РНОЗ, РНОЮ 17.5 82.

YMR46 pDP34-GAPFI-РНОЗ РНОЗ, РН011 13.6 86.

YMR4 pDP34-GAPFI-РНОЗ РНОЗ, РНОЮ, РН011 20.3 79.

YMR46 pDP34-GAPFL-РНОЗ РНОЗ 79.7 20.

YMR4 pDP34-GAPFL-РНОЗ РНОЗ 57.0 43.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Егоров, Сергей Николаевич

Выводы.

1. Все изученные формы кислых фосфатаз экскретируются клетками дрожжей в среду выращивания. Экскреция нативных кислых фосфатаз зависит от состава среды выращивания.

2. Образование внеклеточных кислых фосфатаз зависит от содержания субстрата в среде и регулируется количеством внеклеточной инвертазы.

3. Конечная локализация кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae различна. Конститутивная кислая фосфатаза является компонентом клеточной стенки, а репрессибельная кислая фосфатаза экскретируется в среду

47 культивирования.

4. Иммобилизованные в криогель поливинилового спирта клетки дрожжей Saccharomyces cerevisiae способны значительное увеличить выход репрессибельной кислой фосфатазы в среду.

5. Кислые фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae транспортируются к поверхности клетки различными путями: конститутивная кислая фосфатаза направляется в почку с основным потоком внеклеточных компонентов; внеклеточный транспорт репрессибельной кислой фосфатазы не связан с процессом почкования клеток.

6. Содержание полипептидов, входящих в состав внеклеточной репрессибельной кислой фосфатазы различно. Основная каталитическая субьединица кодируется РН05 геном. Минорные субъединицы кодируются РНОЮ и РН011 генами и их количество не превышает 12% от .суммарного белка репрессибельной кислой фосфатазы.

7. Процесс распределения кислых фосфатаз по двум терминальным потокам внеклеточного секреторного пути определяется наличием минорных субъединичных форм, кодируемых генами РНОЮ и РН011.

Список публикаций по теме диссертации

1. Коношенко Г.И., Умнов A.M., Егоров С.Н., Бобык М.А. (1972)."Компартментализация ферментов полифосфатного обмена у N.crassa". Проблемы регуляции обмена веществ у микроорганизмов. Тезисы докладов всесоюзной конференции. Пущино, стр.71.

2. Умнов A.M., Егоров С.Н., Мансурова С.Э., Кулаев И.С. (1974). "Сравнительная характеристика полифосфатаз N.crassa и некоторых других организмов". Биохимия, 39, 375

3. Егоров С.Н., Кулаев И.С. (1975). "Триполифосфатаза - новый фермент фосфорного обмена", XI Менделеевский съезд по общей и прикладной химии. Тезисы докладов. Алма-Ата. Биохимия, стр. 55.

4. Егоров С.Н., Кулаев И.С. (1976). "Выделение и свойства триполифосфатазы гриба N.crassa". Биохимия, 41, стр. 1958 - 1967.

5. Ермакова С.А., Егоров С.Н., Калебина Т.С. (1978). "О зависимости накопления неорганического пирофосфата и АТФ от возраста культуры дрожжей и условий их выращивания". II Республиканская научно-теоретическая конференция

48 молодых ученых микробиологов. Тезисы докладов, Ташкент, стр.11.

6. Егоров С.Н., Карауш Г.А., Федоров В.Д., Кулаев И.С. (1983). "Рост цианобактерий Anacystis nidulans на средах с неорганическими полифосфатами". Биологические науки, 11, стр. 88-91.

7. Семенова И.Н., Егоров С.Н. (1983). "Секретируемая кислая фосфатаза дрожжей". Научно-теоретическая конференция молодых ученых микробиологов. Тезисы докладов. Ташкент, стр. 107.

8. Egorov S.N., Semenova I.N. (1983). "Infuence of enviromental changes upon the secretion of acid Phosphatase by cells of yeast Saccharomyces cerevisiae". Environmental regulation of microbial metabolism. Abstracts of FEMS International Symposium, Pushchino, p.70.

9. Semenova I.N., Vakhrameeva T.S., Egorov S.N. (1984). "Comparative studies of phosphatases secreted by yeast", Abstracts of 16-th Meeting of FEBS, Moscow, p.183.

10. Семенова И.Н., Егоров С.Н. (1983). "Секретируемые кислые фосфатазы дрожжей", Молодые ученые и основные направления развития современной биологии. Тезисы докладов 14 конференции молодых ученых биологического факультета МГУ. Москва, ч. 2, стр 35-38. (Рукопись депонирована в ВИНИТИ, №150784 ДЕП).

11. Егоров С.Н., Семенова И.Н., Белоусова Л.В., Егоров Н.С. (1985). "Применение иммобилизованных клеток для получения секретируемой кислой фосфатазы дрожжей". VII Съезд Всесоюзного микробиологического общества. Тезисы докладов, Алма-Ата, том 2, стр. 47.

12. Лозинский В.П., Вайнерман Е С., Рогожин С.В., Гавриленко Л.В., Семенова И.Н., Егоров С.Н. (1986). "Иммобилизация клеток Saccharomyces cerevisiae, продуцента кислой фосфатазы, в криогеле поливинилового спирта", Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докладов 3 Всесоюзной конференции, Кобулети, стр. 20.

13. Семенова И.Н., Вахрамеева Т.А., Егоров С.Н. (1986). "Регуляция образования внеклеточной кислой фосфатазы дрожжей Candida utilis". Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докладов 3 Всесоюзной конференции. Кобулети, стр. 20.

14. Егоров С.Н., Семенова И.Н.(1986). "Внеклеточные гликопротеины дрожжей и взаимное влияние на уровни их секреции". V Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы докладов, том 2, Киев, стр. 190.

15. Семенова И.Н., Егоров С.Н., Егоров Н.С. (1986). "Образование секретируемой кислой фосфатазы при росте дрожжей Saccharomyces cerevisiae на различных источниках углеродного и азотного питания", Микробиология, 5, стр. 796

49

799.

16. Егоров С.Н., Садчиков А.П., Авакян Э.А. (1987). "Международный симпозиум Внеклеточные ферменты микроорганизмов", Биологические науки, 9, стр.109-111.

17. Егоров С.Н., Шнырева М.Г. (1987). "Внеклеточная кислая фосфатаза и инвертаза на разных стадиях роста Saccharomyces cerevisiae". Молекулярные основы биотехнологии. Тезисы докладов I! Международной школы-конференции молодых ученых социалистических стран, Пущино, стр.72.

18. Егоров С.Н., Шнырева М.Г. (1988). "Особенности структурной организации внеклеточных ферментов дрожжей Saccharomyces cerevisiae", Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докладов 4 Всесоюзной конференции. Ташкент, стр.68.

19. Цупрун В.Л., Стельмащук В.Я., Шнырева М.Г., Егоров С.Н. (1988). "Электронно-микроскопическое исследование секретируемых гликопротеинов: кислой фосфатазы и инвертазы", XI Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. Звенигород, стр. 48.

20. Shnyreva M.G., Egorov S.N. (1988). "The isoelectric focusing of secretory glycoproteins from yeast Saccharomyces cerevisiae", Biochemical Separations. Abstracts of 2-nd International Conference. Keszthely, Hungary, p. 75-77.

21. Белоусова Л.В., Егоров С.Н. (1988). "Секреция кислой фосфатазы иммобилизованными клетками Saccharomyces cerevisiae", Инженерная энзимология. Тезисы докладов 6 Всесоюзного симпозиума. Вильнюс, стр. 58.

22. Белоусова Л.В., Егоров С.Н. (1988). "Экспрессия кислой фосфатазы клетками дрожжей при экспрессии хромосомных и плазмидных генов", Биосинтез ферментов микроорганизмами. Тезисы докладов 4 Всесоюзной конференции. Ташкент, стр.37.

23. Рогожин С.В., Егоров С.Н., Лозинский В.И., Гавриленко Л.В., Вайнерман Е.С., Семенова И.Н. (1989). "Иммобилизация клеток Saccharomyces cerevisiae в криогель поливинилового спирта с целью получения секретируемой кислой фосфатазы". Авторское свидетельство 4107962/13.

24. Егоров С.Н. (1989). "Сортинг и регуляция секреции ферментов у дрожжей сахаромицетов". Проблемы и перспективы биотехнологии. Тезисы докладов 1 конференции. Братислава, стр. 28.

25. Шнырева М.Г., Егоров С.Н. (1989). "Надмолекулярная организация секретируемых гликопротеинов дрожжей Saccharomyces cerevisiae". Проблемы и перспективы биотехнологии. Тезисы докладов 1 конференции. Братислава, стр. 71.

26. Белоусова Л.В., Егоров С.Н. (1989). "Использование криогелей для

50 иммобилизации клеток, с целью получения секретируемого продукта", Проблемы и перспективы биотехнологии. Тезисы докладов 1 конференции. Братислава, стр. 102.

27. Егоров С.Н., Шнырева М.Г., Егоров Н.С. (1989). "Секреция кислой фосфатазы и инвертазы на разных стадиях роста дрожжей Saccharomyces cerevisiae", Ферменты микроорганизмов. Москва, НПО Медбиоэкономикат, т. 1, стр. 37-48.

28. Белоусова Л.В., Лозинский В.И., Вайнерман Е.С., Рогожин С.В., Егоров С.Н. (1989). "Секреция кислой фосфатазы клетками Saccharomyces cerevisiae при иммобилизации включением в криогели поливинилового спирта", Ферменты микроорганизмов. Москва, НПО Медбиоэкономика, т. 2, стр. 224-232.

29. Егоров С.Н.(1989). "Строение секретируемых ферментов дрожжей сахаромицетов", Регуляция микробного метаболизма. Тезисы докладов Всесоюзной конференции, Пущино, стр.63.

30. Шнырева М.Г. Егоров С.Н. (1990). "О возможности существования различных путей секреции кислой фосфатазы у дрожжей Saccharomyces cerevisiae", Микробиология, 59, стр. 948-958.

31. Shnyreva M.G., Egorov S.N. (1991). "The secretion of acid phosphatases by yeast Saccharomyces cerevisiae", 15-th International specialized symposium on yeast. Riga, p. 125.

32. Шнырева М.Г., Цупрун В.Л., Стельмащук В.Я., Егоров С.Н. (1992). "Анализ четвертичной структуры секретируемой репрессибельной кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae", Биохимия, 57, стр.1110-1118.

33. Shnyreva M.G., Egorov S.N. (1993). "The study of secretory products by expression of individual structural genes of repressible acid phosphatase in Saccharomyces cerevisiae", Abstracts of Annu. Autumn Meet. Biochem. Soc Biol. Chem., Dusseldorf, Hope-Seyler, p.374.

34. Сюй Цинь, С.Н.Егоров. (1995). "Некоторые подходы к выяснению функциональной роли отдельных субъединиц в составе секретируемых кислых фосфатаз дрожжей Saccharomyces cerevisiae". Вестник Московского университета, сер. 16 Биология, №3, 37-40.

35. Al-Nuri Ya.M., Petrova E.V., Shabalin Yu.A., Egorov S.N. (1995). "Some differences in the vesicle transport of constitutive and regulated enzymes of yeast Saccharomyces cerevisiae", International Specialized Symposium on Yeast, Edinburgh, p.8.

36. Shnyreva M.G., Petrova E.V., Egorov S.N., Hinnen A. (1996). "Biochemical properties and excretion behavior of repressible aid posphatases with altered subunit composition", Microbiol. Res., 151, 291-300.

37. Егоров С.Н., Семенова И.Н., Максимов В.Н. (2000). "Взаимное влияние инвертазы и кислой фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae на их секрецию в среду культивирования". Микробиология, 69, 34-37.

38. Egorov S.N. (2000). "Two ways of acid phosphatase secretion". Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology. Abstracts of International Symposium, Pushchino, Russia, p.36.

39. Blinnikova E.I., Meryusshenko F.L., Egorov S.N. (2000). "Secretion of homoolygomeric acid phosphatase", Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology. Abstracts of International Symposium, Pushchino, Russia, p.87.

40. Moroz D.V., Egorov S.N. (2000). "Secretion of yeast constitutive acid phosphatase under mutual expression of РНОЮ and PH011 structural genes of repressible acid phosphatase". Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology. Abstracts of International Symposium, Pushchino, Russia, p.92.

41. Egorov S.N., Petrova E.V., Levashov A.V. (2000). "Homoolygomeric derivatives of yeast Saccharomyces cerevisiae acid phosphatases", Biocatalysys-2000, Abstracts of International Conference, Moscow, Russia, p.23.

42. Егоров C.H., Петрова E.B., Левашов A.B. (2000). "Внеклеточные кислые фосфатазы дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Кинетические свойства. Секреция". Вестник Московского университета, сер.2, Химия, т. 41, №6, стр. 9-11.

43. Егоров С.Н., (2002). "Сортинг внеклеточных белков дрожжей Saccharomyces cerevisiae". Современная микология в России. Первый съезд микологов России Москва, стр. 146.

44. Мирющенко Ф.Л., Блинникова Е.И., Егоров С.Н. (2002). "Изучение функциональной взаимосвязи секреции экзоферментов и почкообразования у дрожжей Saccharomyces cerevisiae". Современная микология в России. Первый съезд микологов России. Москва, стр. 152-153.

45. Блинникова Е.И., Мирющенко Ф.Л., Егоров С.Н. (2002). "Два пути транспорта внеклеточных кислых фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae". Современная микология в России. Первый съезд микологов России. Москва, стр.142.

46. Е.И.Блинникова, Ф.Л.Мирющенко, Ю.А.Шабалин, С.Н.Егоров. (2002), "Везикулярный транспорт внеклеточных кислых фосфатаз у дрожжей Saccharomyces cerevisiae." Биохимия, 67, вып. 4, стр. 580-586. 47. Leibo A.I., Lomonosov A.M., Yaminsky I.V., Egorov S.N. (2003), "The size of yeast Saccharomyces cerevisiae cells depend on presence of the constitutive acid phodphatase." Abstr. of 1-st FEMS Congress, Slovenia, p. 337.