Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение механизма секреции щелочной фосфатазы в среду при ее повышенном синтезе у различных штаммов Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизма секреции щелочной фосфатазы в среду при ее повышенном синтезе у различных штаммов Escherichia coli"

p f b

г й won да

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМА СЕКРЕЦИИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В СРЕДУ ПРИ ЕЕ ПОВЫШЕННОМ СИНТЕЗЕ У РАЗЛИЧНЫХ ШТАММОВ Escherichia coli

специальность оз.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

на правах рукописи

БАДЯКИНА АЛЛА ОЛЕГОВНА

УДК 579. 23' 314: 579-25.5

Пущино - 1994

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук М.А.Несмеянова

Офциальные оппоненты: доктор биологических наук проф. Я.И.Бурьянов кандидат биологических наук А.Б. Циоменко

Ведущее учреждение: Институт биохимии им. А.Баха РАН

Защита состоится " " 994 г. вчас ^¿Агш

на заседании Специализ1фованно1>о совета Д 002.69.01 при институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН, г. Пущино Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Автореферат

Ученый секретарь Специализированного совета, доктор биологических наук

В.М.Вагабов

Актуальность проблемы. Экспрессия на поверхности и секреция в среду белков и других биополимеров определяет патогенность бактерий, клеточно-клеточное узнавание, разложение высокомолекулярных соединений,взаимодействие клеток микроорганизмов .с другими микро-и макроорганизмами. Понимание механизма транслокации белков через клеточную оболочку весьма актуально, т.к. необходимо для решения не только указанных выше фундаментальных проблем клеточной биологии, но также и практических задач современной биотехнологии. Особенно важно решение этой проблемы применительно к грамотрица-тельным бактериям, в частности, Escherichia coll. Эта бактерия имеет сложную оболочку, состоящую из цитоплазматической и внешней мембран, разделенных периплазмой и пептидогликановым слоем. Поэтому, большинство секретируемых белков E.coli локализуется в периплазме и только несколько белковых токсинов выделяется в культуральную жидкость. Понять как преодолевается этими Сежами оболочка E.coli - актуальная фундаметальная проблема. Кроме того, эта бактерия используется в качестве организма хозяина для экспрессии многих чужеродных белков, представляющих интерес для медицины и промышленности, и , таким образом, вывод белков из клеток E.coli в культуральную жидкость является важной задачей биотехнологии.

В связи с этим значительный интерес представляет феномен секреции в культуральную жидкость периплазматических белков E.coli, кодируемых генами в составе плазмид. Обнаруженный недавно лишь для нескольких белков (Morita, et al., 1983; Lazzaroni, et al., 1985; Несмеянова и др., 1990) он позволяет предположить о существенных изменениях, как в биогенезе белков при их повышенном синтезе, так и в структурной организации клеточной оболочки, становящейся проницаемой для периплазматических белков, и представляет, таким образом, удобную модель для изучения указанных процессов, а также механизма секреции белков в культуральную жидкость. Однако, до настоящего времени подробных исследований в этом направлении не проводилось.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение особенностей биогенеза щелочной фосфатазы E.coli, механизма ее секреции в культуральную жидкость и роли оболочки в этом процессе при повышенном синтезе этого фермента, кодируемого phoA геном в составе плазмид. В соответствии с целью были определены следующие задачи исследования:

1) Изучить особенности продукции, локализации и спектра множественных форм щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе.

2) Выделить и охарактеризовать различные формы фермента.

3) Выявить особенности ультраструктурной организации и химического состава оболочки клеток, секретирующих фермент в среду.

Научная новизна работы. Работа является первым комплексным исследованием биогенеза и секреции экзобелков при их повышенном синтезе. Установлено, что при повышенном синтезе периплазматичес-кой щелочной фосфатазы, кодируемой phoA геном в составе мультико-пийных плазмид, происходят существенные изменения в ее биогенезе: образование промежуточных форм фермента, соответствующих различным стадиям его посттрансляционной модификации, и альтернативная локализация фермента. В этих условиях происходит накопление предшественника щелочной фосфатазы, содержащего сигнальный пептид, в виде нерастворимых агрегатов в цитоплазме E.coli. Зрелая щелочная фосфатаза имеет более высокое содержание изоформ i и и, а также растворимых мультимеров, которые локализуются не только в периплазме, но и в культуральной жидкости. С помощью биохимического и электронно-микроскопического анализа оболочки клеток установлено, что механизм секреции фермента в среду зависит от природы штамма и характеризуется специфическими для каждого штамма изменениями в химическом составе и ультраструктурной организации оболочки. У E.coli К802 выявлена секреция щелочной фосфатазы в культуральную жидкость с помощью везикул внешних мембран, которая коррелирует со снижением у секретирующих клеток содержания липопротеина внешних мембран. У E.coli DH1 выделение этого фермента в культуральную жидкость происходит другим путем.

Внеклеточная щелочная фосфатаза, а также предшественник щелочной фосфатазы выделены и очищены до гомогенного состояния из одной и той же культуры и изучены их некоторые свойства.

Научно-практическое значение работы. В работе выявлены закономерности биогенеза и секреции щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе у E.coli, а также особенности химического состава и структурной организации оболочки этой бактерии в условиях секреции периплазматических белков через клеточную оболочку. Это позволяет лучше понять механизмы секреции белков в среду у грам-отрицательных бактерий, отдельные этапы секреторного процесса и его взаимосвязи с биосинтезом Оелка, а также открывает возможность для выработки стратегии вывода белков из клетки в биотехнологических целях.В работе охарактеризованы штаммы-продуценты внеклеточной щелочной фосфатазы и ее предшественника,разработаны методы очистки указанных форм фермента. Таким образом, созданы ос-

новы для получения в больших количествах фермента с целью его ис пользования в генной инженерии и иммуноферментном анализе, а также предшественника щелочной фосфатазы для исследований в области мембранологии.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на международных симпозиумах: "Molecular genetics of bacteria and phages" (Cold Spring Harbor, США, 1991) и "Cellular and molecular biology of phosphate and phoshorylated compounds in microorganisms" (Woods Hole, Massachusetts, США, 1993), на конференции "Биосинтез ферментов микроорганизмами" (Москва, 1993).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано б работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 2-х глав обзора литературы, 3-х глав экспериментальной части, 1 главы обсуждения результатов, выводов и списка литературы (236 ссылок). Работа изложена на 179 страницах, содержит 12 таблиц и 27 рисунков.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Использованные в работе штаты и плазлиды. В работе использовали различные штаммы TS. coli с индуцибельным синтезом щелочной фосфатазы при фосфорном голодании, т.е. с диким типом регуляции экспрессии phoA гена: E.coli К10 (Hfr(P02A)), pit-1, spoTi, relA1, ton A22 T2r; E.coli K802 (hsd R+, hsd M+, gal", met", R^-, Mk+, mcRa(-) merB(-)); E.coli DH1 (F", recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsd R17(R^.-, SupE44, relAi, А.-). Использовали также ука-

занные штаммы, трансформированные векторной плазмидой pBR322 (Bolivar, et al., 1977), а также производными от нее плазмидами рН1-1, pH1-7 и рРНО-1, содержащими регуляторную и структурную область гена phoA (Inouye, et al., 1981). Плазмиды pHl-1 и pHI-7 любезно предоставлены проф. А.Торриани (из Массачусетского технологического института США), рРНО-1 - доктором Зозуль (из ФИБХ РАН). Кроме этого использовали штамм E.coli KS272 (me 1000, leu+, arg+, phoA Pvull) и производный от него мутант KS303 (lpp 5508), дефицитный по липопротеину, любезно предоставленный проф. Дж.Беквитом (Харвардская медицинская школа, США). Условия выращивания. Клетки выращивали на синтетической среде (Nesmeyanova, et al., 1973) до середины логарифмической фазы при 37°С с аэрацией и переносили с разведением 1/20 на среду с низким содержанием ортофосфата (0,01мМ) для дерепрессии щелочной фосфатазы. Фракционирование

клеток и лелбран осуществляли после лизиса клеток с помощью лизо цима и этилендиамина тетраацетата (EDTA) в присутствии сахарозы (Miura, Mizuohima, 1968). Сферопласты разрушали с помощью осмотического шока в сочетании с обработкой ультразвуком. Мембранную фракцию осаждали ультрацентрифугированием при 100 ООО g в течение 60 минут. Внешние и цитоплазжшические лелбраны разделяли путем центрифугирования в ступенчатом градиенте сахарозы (Osborn, et al, 1972). йля разделения белков цитоплазлатической и наружной мембраны использовали метод селективной солюбилизации белков в Тритоне Х-100 (Schnaitman, 1971). Везикулы внешних лелбран из культуральной жидкости выделяли, как описано ранее (Mayrand, Grenier, 1989). Белковый анализ проводили с помощью электрофореза в ПААГ (Laemmli, 1970). Окраску проводили раствором кумасси R-250 (Fairbanks, et al., 1971) и раствором нитрата серебра (Morrissey,

1981). Изоферлентный спектр щелочной фосфатазы изучали, выявляя активность фермента непосредственно в геле после электрофореза белков в неденатурирующих условиях (Davis, 1964) обработкой а-нафтилфосфатом и красителем прочным красным RR (Лойда и др.,

1982). Фосфолипиды анализировали после экстракции (Ames, 1968) с помощью тонкослойной хроматографии. Очистку белков проводили с использованием методов ультрафильтрации, термообработки и хроматографии. Имлуноферлентное выявление щелочной фосфатазы и липо-протеина проводили после электроблотинга белков на нитроцеллюлозу с помощью антител кролика к щелочной фосфатазе и липопротеину внешних мембран E.coli и коньюгата белка а с пероксидазой хрена (Остерман, 1983). Аналитические летоды. Активность щелочной фосфатазы определяли по скорости гидролиза пнитрофенилфосфата. Белок определяли по Лоури (Lowry, et al., 1951). Липидный фосфор определяли, как описано ранее (Gerlach, Deuticke, 1963). Количество липополисахарида оценивали по содержанию КДО (Westphal, Luderitz, 1959). Содержание экзополисахаридов в культуральной среде определяли антроновым методом (Захарова, Косенко, 1982). Исследования морфологиш и особенностей улътраструктурной организации оболочек клеток проводились с помощью электронной микроскопии тонких срезов (Reinolds, 1963), электронно-микроскопической криофрактогра-фии (Фихте и др., 1973) и иммуноцитохимии (Roth, et al., 1978; Carlemalm, et al., 1982).*

* Электронно-микроскопические исследования проведены совместно с Н.Е.Сузиной и В.В.Дмитриевым

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Особенности биогенеза и секреции щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе.

Щелочная фосфатаза E.coli (Е.с. 3.1. 3.1) является секретиру-емым белком этой бактерии. Сопряженный с секрецией биогенез этого фермента включает биосинтез в цитоплазме предшественника бежа, содержащего N-концевой сигнальный пептид (Inouye, et al., 1982). После транслокации предшественника через мембрану, этот пептид отщепляется и зрелая полипептидная цепь освобождается в периплазму (Inouye, Beckwith, 1977). Здесь происходит посттранслокацион-ная протеолитическая модификация полипептидной цепи - отщепление N-концевого аргинина (Nakata,et al., 1987). Одновременно осуществляется димеризация субьединиц с образованием активных макромолекул фермента-метазимов (Schlesinger, Barrett,1965). Метазим I является димером немодифицированных идентичных субьединиц, метазим ш-димером идентичных модифицированных субьединиц, не содержащих аргинин,и метазим ы-гетерологичным димером, содержащим одну субьединицу с N-концевым аргинином и другую - без него. В оптимальных условиях экспрессии щелочной фосфатазы она обнаруживается только в периплазме клетки и преимущественно в виде метазима III.

Исследования, проведенные в настоящей работе, показали, однако, что при экспрессии гена щелочной фосфатазы phoA в составе плазмид, приводящей к повышенному синтезу фермента, его биогенез существенно изменяется.

1.1. Динамика продукции и секреции щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе различными штаммами E.coli.

В настоящей работе в дополнение к изученным ранее штаммам с конститутивным синтезом щелочной фосфатазы (Lazzaroni, et al., 1985; Несмеянова и др.,1990) изучены другие штаммы E.coli с диким типом pho регулона, трансформированные разными плазмидами (табл.1). Подробно изучены штаммы E.coli К802 и E.coli DH1, трансформированные плазмидой рШ-7, т.к. они обладали наибольшей продуктивностью и секретировали в культуральную жидкость до 70-85% от всего синтезированного фермента и без нарушения целостности клеток и их лизиса. Его выделение в культуральную жидкость происходит селективно. Об этом свидетельствует снижение удельной активности фермента в периплазме и увеличение ее в культуральной жидкости в процессе секреции фермента, а также различие в бежо-вом составе указанных фракций (рис.1).

Изучение динамики продукции и секреции щелочной фосфатазы у В.coli К802/рН1-7 показало (рис.?), что в первые 4 часа инкубации клеток параллельно с ростом культуры происходит накопление внутриклеточного фермента, уровень которого в 8-ю раз превышает та-

Таблица 1. Продукция и секреция щелочной фосфатазы в среду различными штаммами E.coli

Штаммы иощая эк- % сек

и плазмиды* спрессия реции

фермента в сре-

(мЕ/мг ДУ

клеточно-

го бежа)

Кю 72 2

К1O/pBR 322 116 2

К1O/pHI-1 490 40

К10/рН1-7 520 50

К802 145 5

K802/pBR322 145 7

К802/рН1-1 3000 60

К802/рН1-7 7300 85

DH1 ¿9 5

DH1/pBR322 63 10

DH1/рН1-7 1140 74

Е/мл

НюА-<

* - здесь и в дальнейшем, кроме специально отмеченных случаев, клетки культивировали в течение 15 часов. Представлены данные, средние из 3-6 независимых экспериментов, для E.coli Vß02/pHI-7 из более, чем 10.

PhoA-

1 2

1 2

Рис.1. Белковый состав культу-ральной среды (1) и периплазмы (2) различных штаммов E.coli. А - E.coli К802/рН1-7; Б -E.coli DH1 /рН1-7. а - иммуноб-лотинг щелочной фосфатазы куль-туральной среды.

Рис.2. Динамика продукции и секреции в среду щелочной фосфатазы клетками E.coli К-802/рН1-7. I - рост культуры, 2 -активность внутриклеточной и 3 - внеклеточной щелочной фосфатазы.

8 10 12 14 время инкубации, ч

ковой у контрольных штаммов (исходных и трансформированных плаз мидой pBR 322, здесь не представлено). После достижения этого максимального уровня содержание фермента внутри клеток начинает падать, и щелочная фосфатаза появляется в культуральной жидкости, где к 15 часам культивирования обнаруживается до 70-85% от всего синтезированного фермента. Такая же динамика обнаружена у E.coli DH1/pHI~7. Таким образом, секреции в среду предшествует накопление повышенного пула щелочной фосфатазы в периплазме клеток.

Так как уже сама селективная секреция в культуральную жидкость является естественной очисткой белка (рис.1), открывается возможность для получения и очистки больших количеств фермента более простым способом, чем это проводилось ранее. Действительно, электрофоретически гомогенный по белку препарат фермента был выделен с помощью ультрафильтрации культуральной жидкости (после удаления клеток) и последующей термообработки.

1.2. Накопление и локализация предшественника щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе у E.coli К 802/рН1-7 и E.coli DH1/pHI-7

В оптимальных условиях экспрессии щелочной фосфатазы, предшественники щелочной фосфатазы (npePhoA), как и предшественники других секреторных белков, не накапливаются. До недавнего времени их удавалось обнаружить только в условиях специфического подавления процессинга или секреции в присутствии анестетиков и протоно-форов (Halegoua, Inouye, 1979; LaedunsKi, et al., 1979 )■ Предшественники некоторых секретируемых белков, например, PhoE (Küsters, et al., 1989), PhoS (Pages, et al.,1984) и OmpA (Freudle, et al., 1986) были обнаружены также в условиях их повышенного синтеза.

При анализе лизатов клеток E.coli, содержащих плазмиду с phoA геном, с помощью иммуноблотинга щелочной фосфатазы был обнаружен предшественник этого фермента, при этом, в клетках E.coli DH1/pHI-7 его содержалось на порядок больше, чем в клетках E.coli К802/рН1-7 (рис.3).

Рис.з. Иммуноблотинг щелочной фосфатазы в жзатах клеток штаммов E.coli. 1 - К802/рН17, 2 - DH1/рН1. (В пробах содержалось равное количество бежа).

1 ........ 2

При фракционировании клеток обоих штаммов преРЬоА выявлялся во фракции суммарных мембран (рис.4(1)). Однако,он не был обнаружен среди белков ни цитоплазм.'3тической,ни внешней мембран (рис.4 (2,3)),а оставался после солюбилизации последних в осадке,который растворялся только в буфере с 8М мочевиной.Это однозначно указывает на преимущественную локализацию преРЬоА в виде нерастворимых агрегатов,по-видимому,цитоплазматического происхождения. После солюбилизации мембранных белков уже достигалась значительная очистка преРИоА, который растворяли после этого в буфере, содержащем 8 М мочевину и доочищали с помощью анионообменной хроматографии на Моноо в системе ррьс в присутствии 8М мочевины (рис.4(5)).

-Г

1 2 3 4 5

Рис.4. Локализация и очистка предшественника щелочной фос-

........„ _. фатазы . 1- суммарные мембра-

прсРШд ш, 2 - экстракт белков цитоплазма тической мембраны, 3-экстракт бежов внешней мембраны, 4 - экстракт осадка , после солюбилизации мембранных бежов, в буфере с 8М мочевиной, 5 - преРЬоА после хроматографии на Моноо в системе ррьс. Электрофорез белков в ю^-ном ПААГ

С помощью обработки агрегатов преР1юА в мембранах или очищенного предшественника лидерной пептидазой в присутствии 0,8-1,6М мочевины было показано его превращение в зрелую форму щелочной фосфатазы и,тем самым,подтверждено,что в агрегатах нахо-дится на-тивный предшественник с отщепляемым сигнальным пептидом (рис.5).

п/шйия VI Рис.5. Действие лидерной пептида-

рм -1 ; ., • ••/д зы и протеиназы К на предшествен-

ник щелочной фосфатазы. 1-5 - об-1 г э II 5 в 7 Щая мембранная фракция,о,6 мг/мл;

6-8 - очищенный прерьоА, 0,06 -+4 + — + - мг/мл; 1р - лидерная пептидаза;

- ва « и а»«а - обработка 1р - 1 ч, 37°С; протеи_______ + назой К - 20 мин, о°С.

1.3. .Изоферментный спектр. Накопление дополнительных форм зрелой щелочной фосфатазы.

Изучение метазимного спектра щелочной фосфатазы при ее повышенном синтезе показало, что в периплазме штаммов-продуцентов внеклеточного фермента увеличивается содержание метазимов I и и и мультимеров фермента по сравнению с периплазмой исходных штаммов. Изоферментный спектр щелочной фосфатазы в культуральной жидкости существенно не отличается от спектра периплазмы (рис.б).

Рис.6. Изоферментный спектр периплазматической (1,2,4,5) и внеклеточной щелочной фосфатазы (3,6) в различных штаммах E.coli. 1 -К802; 2,3 - K802/PHI7; 4 - DH1; 5,6 - DH1 /рН1-7. I, 11,111 - мета зимы; m - мультимеры.

Накопление метазимов I и и может быть результатом ингиСиро-вания отщепления ы-концевого аргинина из-за недостатка периплазматической протеазы, осуществляющей этот процесс, или его ингиби-рования по типу обратной связи конечным продуктом - избыточным количеством метазима III. Образование мультимеров щелочной фосфатазы является, возможно, механизмом снятия такого ингибирования. Показанная в настоящей работе одинаковая чувствительность метазима III и мультимеров к протеиназе К и трипсину (рис.7) подтверждает возможность такого механизма регуляции данного этапа процессинга. Сходство метазимных спектров внеклеточной и периплазматической фосфатазы говорит о том, что это один и тот же фермент, и его протеолитическая модификация происходит в периплазме, после чего фермент выделяется в среду.

А.

Е.

ЯМ

I -

И*

РМ-

- + + + ___

гршкин _ _ _ _ + + +

мулл _ 02 о« вг «г он «г

pH _ м is а о 75 w ао

"г-

I

грот* _ ^

пиюш_ _ _ _ + «•л» _ 02 01 чг Q2 0(1

+ - - -+

«г

/ — "■»- М » Ч®. н» чч ц«

РН - И xs 8а %5 7.5 to

Рис.7.Действие протеиназы К и трипсина на зрелую щелочную фосфа-тазу. А - нативный электрофорез в 7,5%-ном ПААГ; Б - электрофорез в денатурирующих условиях в 10%-ном ПААГ. Периплазматическая фракция штамма E.coli К802/рН1-7, содержащая зрелую щелочную фосфатазу (ю мЕ), обработана протеиназои К и трипсином при различных концентрациях и pH (37°С, зо мин), реакцию останавливали добавлением pmsf (4 мМ), инкубировали зо мин при о с.

Таким образом, повышенный синтез фермента, кодируемого геном в составе плазмид, приводит к накоплению дополнительных форм фермента, соответствующих различным стадиям посттрансляционной модификации .

2. Особенности морфологии и ультраструктурной организации оболочки клеток E.colt, секретирующих щелочную фосфатазу в культу-ральную жидкость.

Клетки E.coli К802/рН1-7 после 4-8 часов культивирования заметно отличаются от контрольных и характеризуются большей по объему периплазмой, множественными локальными зонами контакта между цитоплазматической и наружной мембранами, появлением на полюсах клеток больших скоплений щелочной фосфатазы, локализованной в периплазме, а также крупных сферических экзоклеточных выпячиваний внешней мембраны и свободных везикул (рис.8), также заполненных этим ферментом (как показало цитохимическое выявления щелочной фосфатазы). Везикулы были препаративно выделены и действительно содержали щелочную фосфатазу, некоторые другие периплазменные белки, а также белки наружной мембраны (рис.1 о).

Рис.8. Везикулы внешних мембран клеток E.coli К802/рН1-7, выращенных в условиях биосинтеза и секреции щелочной фос-фатазы через 8 часов культивирования. а,6- тонкие срезы, срезы, ö - цитохимическое выявление щелочной фосфатазы.

Рис.9. Белковый состав субклеточных фракций Е. coll К802/рН1-7 и секреторных везикул. 1 - периплазма, 2 -суммарные мембраны, 3, 4 -везикулы (содержание бежа в про.е ю и 50 мкг, соответственно).

Таким образом, можно заключить, что у клеток E.coli К802, трансформированных плазмидой с геном pho А, секреция в среду осу-щетвляется с помощью везикул внешней мембраны.

Морфология и ультраструктурная организация оболочки клеток E.coli DHI/pHI-7 имеет другие особенности. Так, через 5 часов культивирования клетки существенно не отличаются от контрольных,и характеризуются расширенной периплазмой, заполненной щелочной фосфатазой (как показали иммуно- и цитохимические реакции). После 8 часов культивирования в цитоплазме появляется, а к 15 часам заполняет ее, практически, полностью, гомогенный материал. Согласно электронно-микроскоскопического иммунохимического анализа он проявляет реакцию на щелочную фосфатазу и является, по-видимому, предшественником. С помощью криофрактографии было обнаружено, что плотность распределения внутримембранных частиц (ВМЧ) на поверхности скола цитоплазматической мембраны, обращенной к цитоплазме

(EF) положительно коррелирует с секрецией. Кроме того, на поверхности скола цитоплазматической мембраны этих клеток, обращенной к периплазме (PF) обнаруживаются фрагменты оболочки (клеточной стенки и наружной мембраны) разного размера, которые свидетельствуют об аномальном прохождении скола, и, по-видимому, о наличии зон тесного контакта или особого взаимодействия между цитоплазматической и внешней мембранами. Возможно, это связано с особенностями оболочки клеток В.coli ВН1, которые имеют, в частности, на 1ЕР оповерхности скола наружной мембраны разной протяженности гладкие зоны, чередующиеся с шероховатыми, что нехарактерно для клеточной оболочки других штаммов E.coli. Результаты позволяют предположить, что у этого штамма секреция осуществляется через зоны контакта между цитоплазматической и внешней мембранами.

Таким образом, штаммы E.coli К802/рН1-7_ и E.coli DH1/pHI-7 имеют разные цитоморфологические особенности, и секреция в них, по-видимому, осуществляется с использованием разных механизмов.

3. Особенности химического состава оболочки штатов E.coli, секретирующих щелочную фосфатазу при ее повышенном синтезе в культуральную жидкость.

Для выяснения природы везикул, участвующих в секреции щелочной фосфатазы у E.coli К802/рН1-7 и механизма их формирования, изучен их белковый и фосфолипидный состав, а также содержание липопротеина. Показано, что везикулы, кроме значительного количества щелочной фосфатазы и некоторых других белков периплазмы, содержат белки внешних мембран, в то время как белки цитоплазматической мембраны в везикулах не выявлены (рис:9). Липопротеин не был обнаружен в везикулах (рис.10), но они содержали около половины клеточного липополисахарида. По своему фосфолипидному составу везикулы также соответствуют фракциям внешних мембран (табл.2), что подтверждают электронно-микроскопические исследования о формировании везикул из наружной мембраны (рис.8).

Анализ белкового состава мембран E.coli К802/рН1-7 и E.coli DH1/pHI-7 не выявил существенных различий с таковым контрольных штаммов, за исключением наличия npePhoA, соосаждающегося с мембранами. Сравнение содержания липопротеина показало, что суммарные мембраны клеток E.coli К802/рН1-7 содержали меньше липопротеина, a E.coli DH1/pHI-7 такое же его количество по сравнению с мембранами контрольных штаммов (рис 10).

123466 789

Рис.10 Иммуноблотинг липопротеина в мембранах различных штаммов E.coli. 1,2,4-9 - суммарные мембраны из KS303(lpp-)d). KS272(1рр+)(2), К802(4), K802/pBR 322(5), К802/рН1-7(6), DH1(7), DH1/PBR 322(8), DHl/pHl-7(9); 3 - везикулы, выделенные из культу-ральной жидкости E.coli К802/рН1-7.

Исследование липидного состава оболочки клеток E.coli К802/ pH1-7 и E.coli DH7/pHI-7 в сравнении с контрольными штаммами показало отсутствие специфических изменений в составе нейтральных липидов. Суммарные мембраны штамма E.coli К802/рН1-7 отличаются повышенным содержанием фосфатидной кислоты и увеличенной пропорцией фосфатидилглицерин/кардиолипин (табл.2.), т.е. изменениями, коррелирующими с секрецией белков в периплазму (Богданов и др., 1985). У E.coli DH1/pHI-7 фосфолипидный состав отличается от такового исходного штамма, наоборот, снижением пропорции указанных выше фосфолипидов, аналогично тому, как это было обнаружено ранее для этого же штамма, секретирующего гемолизин в культуральную жидкость (Манувахова, и др., 1990).

Таблица 2

Содержание индивидуальных фосфолипидов и КДО в клетках E.coli K802/pHI-7, E.coli DH1/pHI-7 и производных от них штаммов.

: Содержание фосфолипидов, Содержание КДО,

Штаммы : мкгР1/мг общего липидного фос фора мкМ/мг белка

E.coli клеток

:ЛизоФЭА ФК : КЛ ФГ : ФУА :ФГ/КЛ 8 Ч : 15 ч

К802 10 8 110 67 747 о,ь 0,007 0,005

К802/рН1-7 17 15 71 76 825 1,0 0,032 0,017

Везикулы следы Следы 29 102 8Ь7 3,6 — 0,012

DH1 24 12 81 104 777 1 ,3 - 0,062

DHI/pHI-7 24 10 76 66 823 0,8 — 0,088

ЛизоФЭА - лизофосфатидилэтаноламин, ФК - фосфатидная кислота, КЛ - кардиолипин, ФГ - фосфатидилглицерин, ФЭА - фосфатидилэтано-ламин; КДО - 2-кето-з-дезокси-Б-маннооктоновая кислота. Погрешность определения не превышает для ФГ и лизоФЭА - 5 %, ФЭА -2%, ФГ и КЛ -20%, КДО -10%.

Сравнительный анализ содержания КДО (2-кето-з-дезокси-Б-ман-нооктоновой кислоты) - компонента липополисахарида внешней мембраны в динамике клеточного роста и секреции щелочной фосфатазы (табл.2) не выявил существенных различий между секретирующими в среду и контрольными клетками штамма E.colt DH1. Напротив, в клетках E.colt К802, E.coli K802/pBR322 и E.coli К802/рН1-7 такой анализ выявил корреляцию между секрецией и содержанием КДО и позволил предположить,что секреция в культуральную жидкость происходит координированно с биогенезом липополисахарида, и,в частности, со встраиванием его в участки, обедненные липопротеином и участвующие в формировании везикул. Снижение содержания КДО в E.coli К802/рН1-7 между 8 и 15 часами культивирования, когда происходит интенсивное образование везикул, и отсутствие в последних липо-протеина подтверждает это предположение. В то же время было обнаружено, что выделение экзополисахарида в культуральную жидкость и секреция не являются взаимосвязанными процессами у обоих штаммов.

Таким образом, клетки различных штаммов, секретирующих фермент в среду, отличаются по своему химическому составу от несек-ретирующих клеток, однако, характер изменений зависит от природы штамма.

Подводя итог проведенному исследованию, можно заключить, что повышенный синтез щелочной фосфатазы, кодируемой геном в составе плазмиды, сопряжен с существенными изменениями в его биогенезе, которые приводят к накоплению промежуточных форм фермента, соот-ветствущих различным стадиям посттрансляционной модификации белка. Это является результатом нарушения баланса между синтезом и секрецией, вызванного, по-видимому, известной ограниченностью сайтов транслокации бежа через цитоплазматическую мембрану (ito, et al., 1981). Кроме того, накопление предшественника в цитоплазме в виде агрегатов может быть вызвано отсутствием у бактерий блока трансляции секретируемых бежов, существующего у эукариотов (Walter, Lingappa, 1986). Выявленная при повышенном синтезе секреция обычно периллазматического бежа в культуральную жидкость коррелирует со специфическими для каждого штамма изменениями в структурной организации и химическом составе оболочки, что отражает существование множественных путей секреции бежов в культуральную жидкость у грамотрицательных бактерий. При этом для секреции периплазматических бежов при их повышенном синтезе используются, по-видимому, секреторные пути, предназначенные для естественной секреции внеклеточных бежов.

15

ВЫВОДЫ

1. Экспрессия гена щелочной фосфатазы phok, клонированного в мультикопийные плазмиды, приводит к повышенному синтезу фермента и изменению его биогенеза у штаммов E.coli К802 и E.colt Ш1.

2. Повышенный синтез фермента сопровождается накоплением дополнительных форм фермента, соответствующих различным стадиям его посттрансляционной модификации: предшественника, содержащего не-отщепленный сигнальный пептид, в виде нерастворимых агрегатов,а также не полностью- модифицированного зрелого фермента - метазимов Хин. Указанные особенности биогенеза щелочной фосфатазы не зависят от природы штамма и вызваны ее повышенным синтезом.

3. Повышенный синтез фермента приводит к его секреции не только в периплазму, но и в культуральную жидкость. Показано, что секреция щелочной фосфатазы в среду начинается после достижения максимального уровня внутриклеточного фермента и происходит предпочтительно другим периплазматическим белкам.

4. Разработаны способы очистки внеклеточной щелочной фосфатазы и ее предшественника, которые были использованы для препаративного выделения этих форм фермента.

5. Механизм секреции щелочной фосфатазы в среду зависит от природы штамма. У E.coli К802, трансформированного плазмидой с геном phoA, секреция щелочной фосфатазы в среду осуществляется с помощью везикул внешних мембран, которые не обнаружены у E.colt DH1 в тех же условиях. Секреция у последнего коррелирует, однако, с плотностью распределения внутримембранных частиц.

6. Секреция щелочной фосфатазы в среду сопровождается специфичными для каждого штамма изменениями в химическом составе оболочки. У клеток E.coli К802, трансформированных плазмидой с геном phoA, она коррелирует со снижением содержания в наружной мембране липопротеина.а у клеток E.coli DH1, трансформированных той же плазмидой с изменением пропорции кислых фосфолипидов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Несмеянова М.А., Сузина Н.Е., Цфасман И.М., Бадякина А.О. Секреция периплазматического PhoA- бежа при его сверхсинтезе в среду с помощью везикул внешних мембран. Особенности химического состава везикул и мембран секретирующих клеток Escherichia соИМол. биология, 1991, т.25, с.974-987.

2. Цфасман И.М..Бадякина А.О., Нагорная Н.Е., Несмеянова М.А. Особенности биогенеза щелочной фосфатазы Escherichia coll при ее сверхсинтезе. - Мол. биология, 1993, т.27, с.805-816.

3. Бадякина А.О..Карамышев А.Л.,Цфасман И.М..Несмеянова М.А. Щелочная фосфатаза Escherichia colt (PhoA): особенноссти биогенеза и секреции при ее сверхсинтезе. - Тезизы докладов конференция "Биосинтез ферментов микроорганизмами", Москва, 1993, с.5

4. Nesmeyanova М.А..Suzina N.E..Tsfasman I.М..Badyakina А.О. Secretion of the overproduced PhoA protein in E.COlt phoA+ transformed into the medium by outer membrane vesicles. - Abstr. of Cold Spring Harbor Symposium "Molecular genetics of bacteria and phages", Gold Spring Harbor, New York, New York, 1991, p. 62.

5. Nesmeyanova M.A., Badyakina A.O., Suzina N.E., Tarakhovsky Yu. S., Bogdanov M.V., Tsfasman I.M. Peculiarities of biogenesis and multiple pathways of PhoA secretion into the medium at its oversynthesis by various E.coli strains. - Abstr. of International symposium on cellular and molecular biology of phosphate and phosphorylated compounds in microorganisms, Woods Hole, Massachusetts, 1993, p.104.

6. Nesmeyanova M.A., Karamyshev A.L., Kalinin A.E., Tsfasman I.M., Badyakina A.O., Khmelnitsky M.I., Shlyapnikov M.G., Ksen-zenko V.N. E.coli alkaline phosphatase biogenesis: influence of oversynthesis and amino acid substitutions. In: Cellular and molecular biology of phosphate and phosphorylated compounds in microorganisms. Eds. S.Silver et al. American. Soc. for Microbiol. W.DC., 1994, p.264-269.

27.10.94 г. Эак.бЗЮР. Тир. 130 экз. Уч.-изд.л.-I.О

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН