Зависимость экспрессии гена щелочной фосфатазы Escherichia coli от фосфолипидного состава цитоплазматической мембраны

Анисимова, Елена Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Зависимость экспрессии гена щелочной фосфатазы Escherichia coli от фосфолипидного состава цитоплазматической мембраны
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Зависимость экспрессии гена щелочной фосфатазы Escherichia coli от фосфолипидного состава цитоплазматической мембраны"

На правах рукописи

АНИСИМОВА ЕЛЕНА ВАСИЛЬЕВНА

ЗАВИСИМОСТЬ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ESCHERICHIA COLI ОТ ФОСФОЛИПИДНОГО СОСТАВА ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ

03.00.04-Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Пущино - 2006

Работа выполнена в Путинском государственном университете и Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор |М.А. Несмеянова

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор И.О. Кулаев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

Т.С. Калебина

кандидат биологических наук, A.A. Зимин

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 14 декабря 2006 г. в 9 час 30 мин на заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: г. Пущино Московской области, проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН, с авторефератом - на сайте http://www.ibpm.ru Автореферат разослан "¿2." ноября 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

В. М. Вагабов

2.00& А-

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов экспрессии и секреции белков является важным фундаментальным исследованием, а также необходимым условием для создания научных основ технологии микробиологического производства ферментов.

Транслокация белка из цитоплазмы в специфические компартменты клетки, или секреция, является основой многих процессов: биогенеза и сборки экзобелков и супрамолекулярных структур клеточной оболочки, компарт-ментализации и регуляции метаболизма, а также взаимодействия клеток с окружающей средой. В настоящее время имеются значительные достижения в установлении основ этого процесса, однако, полностью понять его механизм невозможно без учета динамических особенностей структуры мембранных фосфолипидов, без рассмотрения секреции белка как части биогенеза клеточной оболочки, в котором фосфолипиды участвуют в качестве метаболических предшественников ее компонентов. Кроме того, являясь микроокружением мембранных белков и ферментов, и взаимодействуя с ними, фосфолипиды могут регулировать их активность и, таким образом, вовлекаться в такие трансмембранные процессы, как транслокация секретируемых белков и передача сигналов из внешней среды в клетку. В последнее время в литературе появились данные о возможном участии фосфолипидов в регуляции экспрессии ряда генов, при этом выявлен различный эффект модификаций фосфолипидного состава мембран на экспрессию разных генов. Однако вклад индивидуальных фосфолипидов в экспрессию и секрецию белка, а также молекулярный механизм их вовлечения в эти процессы остаются еще малоизученными. У Е. coli фосфолипиды представлены цвиттерионным фосфатидилэтаноламином (ФЭ) - 70% и анионными фосфолипидами (АФЛ): фосфатидилглицерином (ФГ)

- 20%, кардиолипином (KJI) - 1-5 % и фосфатидной кислотой (ФК) - 0,1%. Несмотря на то, что к настоящему времени накоплены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие об участии как АФЛ, так и ФЭ в транслокации белков через цитоплазматическую мембрану, остается неясным

- вносит ли именно ФГ вклад в секрецию или он может быть заменен другим анионным фосфолипидом?

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в установлении роли фосфолипидного состава цитоплазматической мембраны в секреции щелочной фосфатазы (PhoA) и экспрессии ее гена у Е. coli, а также выявление взаимосвязи между секрецией белка и биогенезом клеточной оболочки.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Изучить влияние инактивации гена pgsA, ответственного за синтез фосфатидилглицерина у Е. coli, на секрецию щелочной фосфатазы in vivo и дифференцировать вклад в секрецию фосфатидилглицерина и других анионных фосфолипидов;

2) Исследовать влияние анионных фосфолипидов на биогенез компонентов клеточной оболочки Е. coli и вклад этих фосфолипидов во взаимосвязь секреции белков с биогенезом оболочки;

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

ОЭ 200Catngfl^.

3) Изучить влияние изменений в фосфолипидном составе мембран Е. coli, вызванных мутациями в генах фосфолипидного обмена pgsA и pssA, ответственных за синтез ФГ и ФЭ, соответственно, на экспрессию phoA гена.

Научная новизна работы. В настоящей работе с использованием мутантных штаммов Е. coli получены новые данные in vivo, свидетельствующие об участии анионного фосфолипида фосфатидилглицерина в секреции белков на примере PhoA. Результаты свидетельствуют о корреляции секреции PhoA с содержанием в клетках мутантных штаммов ФГ, а не других анионных фосфолипидов, подтверждая участие в секреции PhoA именно этого фосфолипида. Кроме того, выявлено, что в условиях значительного снижения содержания ФГ подавляется не только секреция PhoA, но и ее биосинтез. С использованием двух подходов - репортерной конструкции и метода РНК-блот-гибридизации получены доказательства зависимости экспрессии гена phoA, регулируемой PhoR-PhoB двухкомпонентной системой сигнальной трансдукции, от фосфолипидного состава мембран Е. coli. Выявлена регуляторная роль фосфолипидов в PhoR-PhoB двухкомпонентной системе трансдукции фосфатного сигнала, которая осуществляется с участием мембранных сенсоров. Изучены особенности биогенеза оболочки у штаммов Е. coli с контролируемым синтезом анионных фосфолипидов. Полученные результаты свидетельствуют о взаимосвязи между секрецией белка и биогенезом клеточной оболочки, а также о вкладе в эту взаимосвязь анионных фосфолипидов мембран.

Научно-практическое значение. Решение поставленных в работе задач вносит новый вклад в понимание механизма участия наиболее динамичного компонента мембран - фосфолипидов, в организации секреторных путей и экспрессии генов у бактерий, что важно для многих областей клеточной биологии, биотехнологии и медицины, в частности для оптимизации повышенной экспрессии секретируемых бактериальных ферментов.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (¿¿^ссылки). Работа изложена на /О? страницах, содержит 1 таблицу и 18 рисунков.

Апробация работы и публикации. Материалы диссертации были представлены на 7-й и 8-й Пущинских конференциях молодых ученых (Пущино, 2003, 2004), XVI зимней молодежной научной школе (Москва, 2004), 1-ом FEMS конгрессе (Словения, 2003), FEBS Special Meeting European Lipidomics Initiative «New concepts in lipidology: from lipidomics to disease» (The Netherlands, 2006), а также на научных конференциях ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН (Пущино, 2002, 2003, 2004, 2005). По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 4 статьи.

Обзор литературы посвящен роли фосфолипидов в секреции белков и экспрессии генов у бактерий.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве модели для решения конкретных задач исследования использовали щелочную фосфатазу К coli - типичный секретируемый белок, биогенез которого хорошо изучен.

Основная стратегия исследования заключалась в использовании штаммов Е. coli с генетически контролируемым содержанием фосфолипидов:

Штаммы HD30 (pesA30::kan) и HL30 (pssA30::kan 1рр2\ с инактивированным геном pgsA, ответственным за синтез ФГ, содержат плазмиду pHD102 с функциональным геном pgsA, репликация которой чувствительна к температуре. Выращивание этих штаммов при различных температурах (30°С и 42°С) позволяет регулировать содержание в них анионных фосфолипидов (Heacock, Dowhan, 1987). Данные штаммы различаются по содержанию липопротеина внешней мембраны.

Штамм HDL11 {pssA::kan, <p(lacOT>-pgsA*) 1рр2) содержит ген pgsA под контролем /асОР промотора, и состав АФЛ в нем зависит от содержания в среде индуктора этого промотора - ИПТГ (Küsters et al., 1991).

Штамм AD93 (pss93::kan recA srl::Tn\0 nadB+) не способен синтезировать фосфатидилэтаноламин в результате мутации в гене pssA, ответственном за синтез предшественника этого фосфолипида. В этом же штамме, содержащем плазмиду pDD72 с клонированным геном pssA, синтез фосфатидил-этаноламина восстанавливается, и его фосфолипидный состав соответствует таковому дикого типа. Для роста штамма AD93 необходимо присутствие в среде двухвалентных катионов (Са2+, Mg2+, Sr2*) в высоких концентрациях (3050 мМ) (DeChavigny et al, 1991).

Для повышенного синтеза PhoA указанные штаммы трансформировали плазмидами pHI-1 или рН1-7 с геном phoA под контролем собственного РРно промотора, которые сконструированы на основе одного и того же вектора pBR322 и несут фрагменты Pstl (6,3 т.п.н.) и Hpal-Xhol (2,8 т.п.н.) соответственно (Inouye et al., 1981).

Плазмида pPHO/YacZ бьгла сконструирована в настоящей работе на основе вектора pBAD/His//acZ («Invitrogen») путем замещения промотора Pbad промотором Ррно по сайтам рестрикции эндонуклеаз Ncol и Sphl.

Синтез PhoA под контролем собственного промотора Ррно индуцировали в условиях фосфорного голодания. Секрецию PhoA оценивали по ее активности в культуре, т.к. PhoA становится энзиматически активной только после транслокации через цитоплазматическую мембрану в периплазму (Boyd et al, 1987), а также по динамике превращения импульсно меченого предшественника PhoA (npePhoA) в зрелую форму за счет отщепления сигнального пептида после транслокации белка (Michaelis et al, 1986). Об эффективности секреции PhoA в культуральную среду судили по ее активности в культуральной среде, освобожденной от клеток центрифугированием.

Иммуноблотинг и иммунопреципитацию щелочной фосфатазы и липо-протеина проводили с помощью стандартных методов с использованием кроличьих антител против денатурированной щелочной фосфатазы и липопротеина, а также конъюгата белка А с пероксидазой хрена.

Активность фосфатазного промотора РРНо изучали с помощью репортерной конструкции. В качестве репортерного белка использовали р-галактозидазу.

Синтез специфической мРНК щелочной фосфатазы оценивали с помощью РНК-блот-гибридизации (нозерн-блот).

Липиды экстрагировали по методу Эймса (Ames, 1968) и разделяли с помощью тонкослойной хроматографии в системе хлороформ : метанол : уксусная кислота : муравьиная кислота : вода (70 : 30 :12 : 4 : 0,6 мл) (v/v). (Fine, Sprecker, 1982).

Активности щелочной фосфатазы и /3-галактозидазы выявляли по скорости гидролиза />-нитрофенилфосфата (Torriani, 1960) и о-нитрофенил-/?-Б-галактопиранозида (Миллер, 1976), соответственно. Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951). Содержание экзополисахаридов в культуральной среде определяли антроновым методом (Захарова, Косенко, 1982). Количество липополисахарида оценивали по содержанию KDO с использованием тиобарбитуровой кислоты (Karkhanis et ai, 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Инактивация гена pgsA приводит к снижению содержания фосфатидилглицерина мембран Е. coli

Для того чтобы установить in vivo влияние фосфатидилглицерина на транслокацию щелочной фосфатазы через цитоплазматическую мембрану, были использованы штаммы Е. coli HD30/pIiD102 и HL30/pHD102, содержание ФГ в которых зависит от наличия плазмиды pHD102. Как видно из таблицы 1, инактивация гена pgsA приводит к существенному снижению содержания ФГ в мембранах и зависит как от условий культивирования, так и от природы штамма. В штаммах HD30/pHD102 и HL30/pHD102 изменение содержания ФГ достигается выращиванием клеток при разных температурах (30°С и 42°С): в клетках штамма HD30/pHD102, выращенных на минеральной среде при 42°С, содержание ФГ в мембранах вследствие элиминации плазмиды pHD102 снижается в 5 раз по сравнению с клетками, выращенными при 30°С, тогда как в штамме HL30/pHD102 его содержание при 42°С уменьшается только в 2,2 раза. Отличие штаммов HD30/pHD102 и HL30/pHD102 состоит в их способности синтезировать компонент внешней мембраны - липопротеин, предшественником которого является ФГ. Штамм HD30/pHD102 содержит липопротеин, и инактивация гена pgsA приводит к более сильному снижению в нем ФГ, чем в штамме HL30/pHD102, не синтезирующем липопротеин.

При этом содержание суммы анионных фосфолипидов изменяется существенно меньше: в штамме ЕГОЗ О/рНЭ 102 - в 2 раза и в штамме НЬ30/рНЕ>102 - в 1,6 раза. Это позволяет дифференцировать вклад индивидуального фосфолипида ФГ и других анионных фосфолипидов в секрецию РЬоА.

Таблица 1. Фосфолнпнднын состав клеток мутантных штаммов Е. coli в зависимости от условий культивирования

Штамм Е. coli Условия культивирования Содержание f юсфолипидов, мол.%

КЛ ФГ ФК ФЭ АФЛ

HD30/pHD102 (pgsA30::kait/pgsA) 30°C 4,3 ±0,9 17,5 ±2,2 1,6 ±0,8 76,6 ±1,5 23,4

42°C 3,6 ±1,3 3,4 ±1,0 4,5 ±1,0 88,5 ±2,3 11,5

HL30/pHD102 (pgsA30::kait Mpp/pgsA) 30°C 5,6 ±0,9 17,9 ±3,2 2,0 ±1,0 74,5 ±2,9 25,5

42°C 4,0 ±1,8 8,0 ±2,4 3,5 ±0,7 84,5 ±3,6 15,5

HDL11 (pgsA::kan, <р(/ясОР-/>£&4) Д Ipp) +ИПТГ 3,9 ±1,3 11,0 ±3,0 1,8 ±0,5 84,0 ±2,0 16,0

-ИПТГ 1,3 ±0,7 0,4 ±0,2 4,7 ±0,7 93,6 ±2,0 6,4

AD93/pDD72 (pssA::kan/pssA) 30°C 1,7 ±0,1 17,7 ±0,4 1,8 ±0,2 78,8 ±1,0 21,2

AD93 (pssA::kan) 37"C 50 mM MgCI2 37,4 ±2,1 58,8 ±1,9 3,8 ±0,4 0,0 100,0

Примечание: KJI - карднолипии, ФГ - фосфатндилглицерни, ФК - фосфатидиая кислота, АФ Л - анионные фосфолнниды (КЛ+ФГ+ФК ), ФЭ - фосфатпдилэтаиоламин.

2. Влияние фосфолипидного состава мембраны на секрецию щелочной фосфатазы Е. coli

2.1. Инактивация геиа pgsA снижает секрецию PhoA через цитоилазматическую мембрану

Выявлена четкая зависимость секреции PhoA от содержания фосфатидилглицерина в мембранах (рис. 1). Показано, что при изменении содержания ФГ с 18% до 3% (в 5 раз) от общего содержания фосфолипидов в штамме HD30/pHD102 секреция PhoA снижается в 9 раз. Однако в штамме HL30/pHD102 при меньшем изменении содержания ФГ - с 18% до 8% (в 2,2 раза) секреция PhoA снижается в меньшей степени - в 2 раза по сравнению с клетками, имеющими нормальный фосфолипидный состав.

2000

0 te U

5 ísoo -

с.

г?

еч j

0 X

1 С

1000 -

500 -

60 мин 120 мни I СО мни 120 мни

HD30/pHD102 HL30/pHD102

Рис. 1. Влияние инактивации гена рцвЛ на секрецию щелочной фосфатазы.

Активность РЬоА анализировали через 60 и 120 минут после индукции РЬоА в условиях полного фосфорного голодания. Пред ставлены средние значения десяти независимых экспериментов.

Время, мин

д npePhoA PhoA

npePhoA -PhoA-

pgsA

ApgsA

5 60 0 0,5

¿Цри*,««*. х» •«*•"-< —

0 0 12 3

0 0 20 19

npePhoA, % 21 19 3 0 0 20 19 19 0 0

Рис. 2. Динамика превращения предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму in vivo в клетках Е. coli HD30/pHD102 (а) н HL30/pHD102 (б). После индукции PhoA в течение 10 мин клетки метили L-[35S] метионином (50 мКи/мл) в течение 1 мин, и через указанные промежутки времени после остановки включения метки добавлением немеченого метионина отбирали пробы клеток, осаждали их 10%-ной ТХУ, иммунопреципитировали PhoA и npePhoA, разделяли их электрофорезом и подвергали радиоавтографии.

Динамика созревания предшественника РЬоА подтверждает выявленную закономерность (рис. 2). В клетках штамма Ш)30/рН0102 с нормальным фосфолипидным составом уже в нулевой точке присутствует только зрелая форма фермента, тогда как при снижении содержания фосфатидилглицерина до 3% предшественник еще присутствует в течение 30 сек после прекращения включения метки, что свидетельствует о снижении скорости секреции РЬоА. Однако в клетках штамма НЬ30/рНБ102 независимо от содержания фосфатидилглицерина скорость созревания предшественника практически одинаковая. Таким образом, секреция РЬоА коррелирует с содержанием ФГ и только значительное его снижение (с 18% до 3%) подавляет секрецию белка.

2.2. При инактивации гена увеличивается секреция РЬоА через внешнюю мембрану в культуральную среду

Ранее было показано (Несмеянова и др., 1991), что при повышенном синтезе щелочной фосфатазы, кодируемой геном в составе мультикопийной плазмиды, белок транслоцируется не только через цитоплазматическую мембрану в периплазму, но и через внешнюю мембрану в культуральную среду. Кроме того, нарушение сбалансированного состава мембран, вызванного отсутствием фосфатидилэтаноламина, также приводило к усилению секреции белка в среду, что коррелировало с изменением состава компонентов внешней мембраны (Бадякина и др., 2003).

Чтобы оценить как обмен и состав фосфолипидов влияет на секрецию и барьерные свойства внешней мембраны, эти процессы изучали в штаммах ЬГО30/рНЕ)102 и НБЫ1, отличающихся по содержанию липопротеина, предшественником которого является фосфатидилглицерин, при разных условиях их культивирования, влияющих на обмен и состав фосфолипидов мембран. В штамме НЕ)30/рНЕ)102 содержание анионных фосфолипидов регулируется температурой культивирования (30°С и 42°С), а в штамме НБЫ 1 - наличием в среде ИПТГ (индуктора /дсОР промотора, под контролем которого находится ген pgsA) (табл. 1). Из рисунка 3 следует, что как при синтезе РЬоА, кодируемой хромосомным геном, так и при повышенном синтезе РЬоА, кодируемой клонированным в плазмиде геном рИоА, снижение содержания АФЛ (у штамма НОЗО/рНБ 102 при 42°С или НОЬ11 в отсутствие ИПТГ) приводит к понижению уровня секреции РЬоА через цитоплазматическую мембрану. У штамма Ш)Ы1 это снижение выражено в меньшей степени, но вполне достоверно. Секреция РЬоА в культуральную среду (рис. 4) имеет противоположную зависимость от содержания анионных фосфолипидов. При их снижении секреция в среду существенно увеличивается, особенно у штамма НОЗО/рНЕ)Ю2 с повышенным синтезом РЬоА. Если при нормальном составе фосфолипидов в среду секретируется не более 10-20% активного фермента, то при дисбалансе фосфолипидного состава - 40-50%.

■ Нормальный фосфолшшдныи состав

I I Пониженное содержание АФЛ

MnJ£]J

15 8 15 8 15 8 15 Время культивирования, ч

HD30/pHD102 HDL11

Рис. 3. Секреция PlioA через цнтоплазматнчсскую мембрану при экспрессии хромосомного (А) и клонированного в плазмндс (Б) гена phoA через 8 и 15 часов культивирования у штаммов Е. coli HD30/pHD102 и HDL11 с нормальным н пониженным содержанием анионных фосфолнпидов. Представлены средние значения четырех независимых экспериментов.

Ш Нормальный ^ — фосфолншщньш состав

I I Пониженное содержание АФЛ

15 8 15 8 15 Время культивирования, ч

HD30/pHD102 HDL11

Рис. 4. Секреция PhoA во внешнюю среду при экспрессии хромосомного (А) и клонированного в плазмндс (Б) гена phoA через 8 и 15 часов культивирования у штаммов Е. coli HD30/pHD102 н IlDLll с нормальным и пониженным содержанием анионных фосфолнпидов. Представлены средние значения четырех независимых экспериментов.

При хромосомном уровне экспрессии РЬоА секреция в среду слабая, но и она увеличивается при дисбалансе фосфолипидного состава мембран. У штамма Ш)Ы 1, не содержащего во внешней мембране липопротеин, эффект дисбаланса фосфолипидного состава выражен в меньшей степени. У этого штамма даже при хромосомном уровне синтеза фермента до 20% РЬоА секретируется в культуральную среду, а при повышенном синтезе РЬоА, кодируемой геном в составе плазмиды, количество секретируемого в среду белка увеличивается до 40-60%. При дисбалансе фосфолипидного состава это количество также увеличивается, но это увеличение выражено слабее, чем у штамма НОЗО/рШЮ2.

3. Изменение содержания анионных фосфолипидов мембран влияет на содержание и биогенез компонентов клеточной оболочки

Важнейшими компонентами внешних мембран Е. соН, ответственными за их барьерные свойства, являются липополисахарид (ЛПС) и липопротеин (ЛП). Анализ показал, что содержание ЛПС в клетках с нормальным фосфолипидным составом увеличивается при повышении синтеза и секреции РЬоА, кодируемой геном в составе плазмиды, особенно у штамма Ш)30/рН0102 (рис. 5). Однако при снижении содержания АФЛ в мембранах содержание ЛПС заметно падает независимо от уровня синтеза РЬоА. Иммуноблотинг липопротеина у штамма ЬЮ30/рЬЮ102 (рис. 6) показал, что его содержание в отличие от содержания ЛПС в клетках с нормальным фосфолипидным составом, наоборот, снижается при повышенном синтезе и секреции РЬоА. При дисбалансе фосфолипидного состава биогенез ЛП еще больше нарушается: снижается содержание в мембранах зрелого ЛП и увеличивается содержание, по-видимому, его предшественника.

Таким образом, секреция РЬоА через цитоплазматическую мембрану может быть сопряжена с биогенезом ЛПС и ЛП. Снижение содержания при дисбалансе фосфолипидного состава как ЛПС, так и ЛП является причиной повышения проницаемости внешней мембраны и, как следствие, секреции РЬоА в культуральную среду. Подтверждением увеличения такой проницаемости является усиление секреции в среду экзополисахаридов (ЭПС) (рис. 7), которая положительно коррелирует с секрецией РЬоА через цитоплазматическую мембрану. При повышенном синтезе РЬоА, кодируемой геном в составе плазмиды, содержание ЭПС увеличивается, особенно, в штамме Ш)Ы1. Снижение содержания анионных фосфолипидов в штамме Ш)30/рН0102 не влияет значительно на секрецию ЭПС, тогда как у ШЛЛ1 она увеличивается в этих условиях. В этом штамме секретируется на два порядка больше ЭПС, чем в НОЗО/рНОЮ2, что возможно связано с отсутствием у него липопротеина.

Полученные результаты свидетельствуют о взаимосвязи между секрецией белка и биогенезом клеточной оболочки и вкладе в эти процессы анионных фосфолипидов как метаболических предшественников этих компонентов.

■ Нормальный фосфолнпнднын состав Ц Пониженное содержание АФЛ

«о

ш &

§ и

1 2

1 2 НГ>Ы1

НОЗО/рШ>Ю2

Рис. 5. Содержание ЛПС в клетках штаммов 1Ш30/р1ГО102 и HDL.11 с нормальным и пониженным содержанием АФЛ при хромосомном уровне синтеза (1) и повышенном синтезе РЬоА (2). Представлены средние значения четырех независимых экспериментов.

Рис. 6. Иммуиоблотинг лнпопротенна в клетках штаммов 1ШЗО/рН0102/рН1-7 (а) и ГГО30/р1№102 (б) с нормальным (1) и пониженным содержанием анионных фосфолипидов (2).

хо и

& &

150.0 "

100.0

50.0

0.4

0.2 0.0

Щ Нормальный фосфоттндаый состав Ц Поннженное содержание АФЛ

1 2 ГО30/рГО102

Рис. 7. Содержание экзополисахаридов в культуральной среде штаммов 1Ш30/р1ГО102 и 1ШЫ1 с нормальным и пониженным содержанием АФЛ при хромосомном уровне синтеза (1) и повышенном синтезе РЬоА (2). Представлены средние значения четырех независимых экспериментов.

4. При инактивации гена р§яА подавляется биосинтез РИоА

Влияние содержания ФГ на биосинтез РЬоА оценивали с помощью иммуноблотинга РЬоА (рис. 8).

HD30/pHD102 HL30/pHD102

PhoA -„ 4

18% ФГ 3%ФГ 18% ФГ 8% ФГ

Рис. 8. Иммуноблотинг щелочной фосфатазы в клетках Е. coll IID30/pHD102 и HL30/pHD102.

В клетках штамма HD30/pHD102, содержащих 3% ФГ, количество PhoA (представленной только в виде зрелой формы) существенно ниже, чем в клетках с нормальным фосфолипидным составом (18% ФГ). В клетках штамма HL30/pHD102 общее количество PhoA (представленной как зрелым белком, так и предшественником) практически не зависит от температуры их выращивания, хотя содержание ФГ снижается с 18% до 8%. Таким образом, снижение содержания фосфатидилглицерина у этого штамма только до 8% от общих фосфолипидов, т.е. при менее выраженном дисбалансе фосфолипидов, не влияет на синтез белка.

5. Инактивация гена рц^А влияет на динамику репрессии щелочной фосфатазы

Как известно, биосинтез РЬоА подвергается строгой метаболической регуляции со стороны экзогенного ортофосфата (Тогпаш, 1960). В присутствии последнего синтез фермента репрессируется, а в образовании репрессора принимает участие мембранный сенсор РЬоЛ (Макто е/ а/., 1994). Можно предположить, что изменения в фосфолипидном составе мембран, в частности, в содержании фосфатидилглицерина, будут влиять на репрессию биосинтеза этого фермента. Мы изучили динамику репрессии РЬоА в клетках штаммов НЕ)30/рН1)102 и НЬЗО/рНОЮ2. Как видно из рисунка 9, репрессия синтеза РЬоА в клетках обоих штаммов с нормальным фосфолипидным составом мембран наступает после некоторого латентного периода (через 5 мин) после < добавления в среду ортофосфата. Однако в клетках этих же штаммов,

имеющих пониженное содержание фосфатидилглицерина, лаг-период репрессии отсутствует, и она наступает сразу после добавления ортофосфата. Таким образом, инактивация гена pgsA, приводящая к снижению содержания фосфатидилглицерина до 3-8%, ускоряет репрессию синтеза РЬоА.

а б

Время, мнн Время, мни

Рис. 9. Влияние инактивации гена pgsA на репрессию щелочной фосфатазы в клетках 1ГО30/р1ГО102 (а) и НЬ30/р1Ш102 (б). Синтез РЬоА индуцировали в течение 30 минут на среде, не содержавшей ортофосфат, затем в часть проб добавляли ортофосфат (1 мМ) для репрессии синтеза фермента и клетки продолжали инкубировать. Представлены средние значения трех независимых экспериментов.

6. Индукция Ррно промотора в зависимости от фосфолипидного состава мембран

При изучении регуляции экспрессии гена рИоА в используемых нами мутантных штаммах важно было исключить процесс секреции РЬоА, поскольку изменения в фосфолипидном составе мембран подавляют секрецию РЬоА через цитоплазматическую мембрану. Поэтому в качестве белка-репортера мы выбрали цитоплазматический белок - /?-галактозидазу, для проявления функциональной активности которого не нужна секреция через цитоплазматическую мембрану или встраивание в нее. Нами была сконструирована плазмида рРНОПас2 путем слияния фрагментов ДНК, несущих регуляторную область гена рИоА и структурную часть гена /?-гапактозидазы (рис. 10).

Об уровне активности Ррно промотора судили по количеству синтезируемой /?-галактозидазы в условиях фосфорного голодания. Из рисунка 11 видно, что активность Ррно промотора существенно подавляется при дисбалансе фосфолипидного состава мембран, вызванного как снижением содержания анионных фосфолипидов, так и отсутствием фосфатидилэтаноламина. При этом не имеет существенного значения, вызван ли этот дисбаланс отсутствием преобладающего фосфолипида Е. соП - ФЭ и содержанием в мембранах только АФЛ или снижением количества АФЛ по сравнению с природным составом.

Spill I

AAGCTGTGCA TGCTATCGTC ACTGCAATGC TTCGCAATAT GGCGCAAAAT GACCAACAGC GGTTGATTGA TCAGGTAGAG GGGGCGCTGT ACGAGGTAAA GCCCGATGCC AGCATTCCTG ACGACGATAC GGAGCTGCTG CGCGATTACG TAAAGAAGTT ATTGAAGC AT CCTCGTCAGT AAAAAGTTAA TCTTTTCAAC

AGlCTGTCATA AAGTTGTCAC] GGCCGAGACT TATAGT CGCT TTGTTTTTAT pho-бокс (-10)

Ncol I

TTTTTAATGT ATTTGTACAT GGAG AAAATA CCATGGAACA SD Met

Sph I

Ncol

pBR322

Рис. 10. Конструирование рспортсрнон плазмнды pPUO/lacZ и нуклсотндная последовательность рсгуляторного района гена рЛо/1 плазмиды рШ-7. /7го-бокс, специфический участок регуляции транскрипции рЛоЛ гена, с которым взаимодействует белок-регулятор PhoB, обозначен рамкой. Область -10 выделена жирным курсивом. Точка инициации транскрипции обозначена стрелкой. Последовательность Шайна-Дальгарно (SD) и инициирующий ATG-кодон (Met) выделены жирным шрифтом. Позиции праймеров для ПЦР подчеркнуты. Расположение pho-бокса, области -10, точки инициации транскрипции мРНК и SD показано по Shinagawa et al., 1987.

18° о ФГ □ 3»оФГ

% 5000

ri W

4000

~ 3000

5 2000

«а. л

1000 -

60 120 Врсмп, М1Ш

р.

■3 14000

80°оФЭ □ 0%ФЭ

«а. л

12000 10000 8000 ■ 6000 ■

4000

2000

60 120 Время, мин

Рис. 11. Влияние дисбаланса фосфолипидного состава мембран, вызванного снижением содержания ФГ (а) и отсутствием ФЭ (б), на активность Ррно промотора в штаммах Е. coli HD30/pHD102, AD93 (-ФЭ) и AD93/pDD72 (+ФЭ).

Представлены средние значения пяти независимых экспериментов.

7. Влияние фосфолипндного состава мембран на синтез м-РНК щелочной фосфатазы.

До настоящего времени отсутствовали прямые доказательства того, что дисбаланс фосфолипндного состава мембран затрагивает транскрипцию phoA гена, кодирующего щелочную фосфатазу. Примененный нами метод РНК-блот-гибридизации позволил оценить уровень синтеза специфической мРНК, синтезированной на гене phoA в зависимости от фосфолипндного состава мембран. На рисунке 12 представлены результаты нозерн-блот-гибридизации, из которых следует, что в штаммах Е. coli AD93/pDD72 и HD30/pHD102 с нормальным фосфолипидным составом в условиях фосфорного голодания синтезируется значительное количество мРНК, гибридизующейся с 32Р-меченным зондом и соответствующей по своему размеру специфической мРНК гена phoA (1460 н.). Однако уровень синтеза мРНК щелочной фосфатазы (phoA-мРНК) в отсутствии фосфатидилэтаноламина или при снижении содержания анионных фосфолипидов мембран существенно снижается.

Активность PhoA, мЕ/мг белка 850 200 960 230 М

-6000 -4000 -3000

-2000 -1500

tal • - -woo

-500

-200

\pssA ApssA\pgsA AD93/pDD72 HD30/pHD102

Рис. 12. Нозерн-блот-гибридизация суммарной РНК (20 мкг/дорожку) штаммов Е. coli с нормальным и нарушенным фосфолипидным составом мембран. phoA-мРНК выявляли по гибридизации с радиоактивно меченым олигонуклеотидом, комплементарным кодирующей области гена щелочной фосфатазы (рис. 13). М - в качестве РНК-маркеров использовали RNA Ladder, High Range ("Fermentas").

1 ТАААСААСТТ АТТбААССАТ ССТССТСАСТ АААААСТТАА ТСТТТТСААС

51 Ав^ТСТСАТА ААеттеТСАС! ввССвАвАСТ ТАТАвТСвСТ ТТ<37ТПТАТ р!ю-бокс (-10)

-20

Мс1 Ьуз 01п Бег ТНг Не А1а Ьеи

101 ТТТТТААТвТ АТТТСТАСАТ ввАвААААТА АА gtg ааа саа ago ао1 а« gca otg

ЗБ

-10 -1 1 ю

А1а Ьеи Ьеи Рго Ьеи Ьеи Р1ю Пи РгоУа1 ТЬг Ьуз А1а Аг£ Ли- Рго а1и Ме1 РгоУа1 Ьеи Ои Аяг 126 gоа о1о На сод На ^ Ш аоо со! gtg аса ааа goo саа аса сса еаа а!а сЫ дЦ с1а ааа аас

20 30

А1В А1а А1а Оп в1у АзрИеТЬг А1а Рго в1у й1у А1а Агв А1£ Ьеи ТЬг в1у Азр 01п—-//-----

183 сер а^ gct саа аас gat а« аЫ gca ссс ggc сдс cgt Ма acg gat cag —//—

450

Ьуз А1а А1а Ьси Ьеи Ьуз 1519 ааа зсс gct ctg ggg ctg ааа ¡аа аа ccgcgcccgg cagtgaattt tcgctgccgg

Рис. 13. Нуклеотидная последовательность промоторного района и структурной части рИоА гена. Рко-бокс обозначен рамкой. Встречными стрелками отмечен терминатор транскрипции. Аминокислотные остатки с -20-го по -1-й обозначают сигнальный пептид щелочной фосфатазы, с 1-го по 450-й - зрелую часть фермента. Подчеркнута последовательность, кодирующая Ы-конец зрелой формы щелочной фосфатазы и соответствующая комплементарной последовательности олигодезоксирибонуклеотида, использованного в качестве гибридизационного зонда (рис. 12).

С этими результатами коррелируют данные фосфатазной активности в использованных штаммах (рис. 12) и данные иммуноблотинга, полученные в настоящей (рис. 8) и в предыдущих работах (М!кЬа1еуа е/ а1, 2001; Головастов е! а!., 2003). Совокупный анализ этих данных подтверждает выдвинутое ранее предположение о том, что влияние фосфолипидного состава мембран на биосинтез РЬоА осуществляется на уровне транскрипции. Блот-гибридизационный анализ РНК и р^Л-мутантов показал, что синтез

транскриптов гена ркоА существенно подавляется при дисбалансе фосфолипидного состава мембран, вызванного как снижением содержания анионного фосфатидилглицерина, так и отсутствием цвиттерионного фосфатидилэтаноламина, несмотря на различия в структуре полярных групп этих фосфолипидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты настоящей работы свидетельствуют в пользу того, что секреция PhoA in vivo в мутантных штаммах Е. coli коррелирует с содержанием анионного фосфатидилглицерина, и только его значительное снижение существенно подавляет секрецию PhoA через цитоплазматическую мембрану. Кроме того, в настоящей работе показано влияние изменения содержания анионных фосфолипидов на секрецию PhoA через внешнюю мембрану Е. coli, что является следствием снижения в ней липопротеина и липополисахарида, определяющих ее барьерные свойства. Полученные результаты свидетельствуют о том, что существует, во-первых, взаимосвязь между секрецией белка через цитоплазматическую мембрану и биогенезом компонентов оболочки (положительная с ЛПС и отрицательная с ЛП); во-вторых, существует взаимосвязь между секрецией белка в среду и нарушением биогенеза компонентов оболочки, ответственных за ее проницаемость; в-третьих, анионные фосфолипиды вносят определенный вклад в это взаимодействие.

Установлено также, что инактивация гена pgsA не только снижает секрецию PhoA через цитоплазматическую мембрану, но и подавляет ее биосинтез при условии значительного снижения фосфатидилглицерина (до 3%).

Показана зависимость экспрессии гена phoA от фосфолипидного состава мембран Е. coli на уровне активности Ррно промотора и синтеза phoA-мРНК. Данные свидетельствуют о том, что радикальные изменения в составе мембранных фосфолипидов даже противоположного характера (в результате pgsA- и /ю&4-мугаций) оказывают одинаковый эффект на транскрипцию гена phoA. По всей видимости, решающую роль во влиянии на экспрессию играет соотношение фосфолипидов и суммарный заряд мембран, а не изменение в содержании индивидуальных фосфолипидов. Проведенный нами анализ литературных данных выявил различный эффект фосфолипидных модификаций на экспрессию разных генов: для одних генов это проявляется в активации (sodA, degP), для других (flhD-flhC оперон) - в репрессии их активности. В настоящей работе выявлено репрессирующее влияние дисбаланса фосфолипидного состава, вызванного снижением содержания в мембранах АФЛ в результате мутации в гене pgsA или полным отсутствием цвиттерионного ФЭ в результате мутации в гене pssA, на экспрессию гена phoA на уровне транскрипции.

Как известно, экспрессия гена phoA регулируется двухкомпонентной системой передачи P¡ сигнала PhoR-PhoB в условиях фосфорного голодания. Она состоит из мембранного сенсора PhoR, акцептирующего внешние сигналы, и цитоплазматического фактора транскрипции PhoB, взаимодействующего с регуляторными элементами ДНК. Возможное объяснение влияния на экспрессию phoA состоит в том, что состав полярных и ацильных групп фосфолипидов, а тем самым и общий заряд мембран, может воздействовать на конформацию и функционирование мембранных сенсоров и, вследствие этого, на передачу сигнала на регулятор транскрипции. В случае щелочной фосфатазы

регулятор транскрипции РЬоВ выступает в роли активатора гена р!юА, но его активность проявляется только после фосфорилирования его мембранным сенсором в ответ на сигнал о недостатке фосфора в среде. По всей видимости, в клетках с нарушенным фосфолипидным составом белок РЬоВ не получает сигнал от мембранного сенсора и не способен передавать его на промотор, что выражается в подавлении синтеза р/гоЛ-транскриптов.

Очевидно, что взаимоотношения между компонентами мембран и регуляторными системами сигнальной трансдукции достаточно сложны и образуют сложную сеть специфических взаимодействий фосфолипидов мембран, сенсоров, регуляторов и разнообразных эффекторов. Мембранные сенсоры находятся в определенном липидном окружении и их активность, а также внутримембранная топология могут зависеть от этого окружения. Вследствие этого фосфолипиды мембран могут быть косвенно вовлечены в регуляцию активности определенных генов за счет их воздействия на функцию мембранных белков.

выводы

1. Выявлено, что инактивация pgsA гена, ответственного за синтез фосфатидилглицерина, приводит к снижению уровня секреции PhoA Е. coli. Впервые in vivo показана взаимосвязь секреции PhoA с содержанием в клетках анионного фосфолипида ФГ, а не других анионных фосфолипидов.

2. При снижении содержания анионных фосфолипидов в мембране наблюдается уменьшение содержания компонентов внешней мембраны -липопротеина и липополисахарида.

3. Изменение состава внешней мембраны является причиной усиления секреции щелочной фосфатазы в среду, свидетельствуя о взаимосвязи секреции белка с биогенезом клеточной оболочки на уровне метаболизма анионных фосфолипидов.

4. Установлено, что при инактивации pgsA и pssA генов, ответственных за синтез ФГ и ФЭ, соответственно, подавляется активность РРНо промотора.

5. Показано, что уровень синтеза мРНК щелочной фосфатазы существенно ингибируется как при снижении содержания анионных фосфолипидов, так и в отсутствии фосфатидилэтаноламина.

6. Изменения состава мембран, вызванные как снижением содержания анионных фосфолипидов, так и отсутствием цвиттерионного фосфатидилэтаноламина, оказывают одинаковый эффект на экспрессию гена phoA несмотря на различие в структуре этих фосфолипидов. Полученные данные свидетельствуют о том, что решающую роль во влиянии на экспрессию гена phoA играет соотношение фосфолипидов и суммарный заряд мембран, а не изменение в содержании отдельных фосфолипидов.

СПИСОК НАУЧНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Головастое В.В., Анисимова Е.В., Несмеянова М.А. Инактивация гена pgsA влияет на биосинтез и секрецию щелочной фосфатазы Escherichia coli. Молекулярная биология, 2003, т.37, №5, с.885-892._

2. Анисимова Е.В., Бадякина А.О., Васильева Н.В., [Несмеянова М.А.| Влияние анионных фосфолипидов мембран на секрецию белка и биогенез оболочки Escherichia coli. Микробиология, 2005, т.74, №2, с. 179-184.

3. Головастов В .В., Красовская Л.А., Анисимова Е.В., Щукин В.Н.,

Несмеянова М.А.| Нарушение сбалансированного фосфолипидного состава

мембран Escherichia coli влияет на активность промотора РРно- Молекулярная биология, 2005, т.39, №2, с.394-402. 4. Красовская Л.А., Анисимова Е.В., Головастов В.В., Кулаев И.С.,

Несмеянова М.А.| Репрессирующее влияние несбалансированного фосфолипидного состава и суммарного заряда мембран Escherichia coli на транскрипцию гена phoA. Доклады Академии Наук, 2006, т.408, №6, с.826-830.

5. Анисимова Е.В., Головастов В.В., Несмеянова М.А. Влияние дисбаланса фосфолипидного состава, вызванного инактивацией гена pgsA, на экспрессию, секрецию и репрессию щелочной фосфатазы Escherichia coli. Сб. тез. VII Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 2003, с.304.

6. Golovastov V.V., Anisimova E.V., Mikhaleva N.I., and Nesmeyanova М.А. Unbalanced membrane phospholipid compositions affect expression and secretion of Escherichia coli alkaline phosphatase. Abstr. of Is' FEMS congress of European microbiologists, Slovenia, 2003, p.330-331.

7. Анисимова E.B., Щукин B.H., Головастов B.B., Несмеянова М.А. Биосинтез и секреция щелочной фосфатазы Escherichia coli зависят от содержания в мембранах анионного фосфолипида фосфатидилглицерина. Сб. тез. XVI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии, Москва, 2004, с.69.

8. Анисимова Е.В., Васильева Н.В., Головастов В.В., Бадякина А.О., Несмеянова М.А. Содержание в мембранах анионных фосфолипидов влияет на секрецию щелочной фосфатазы и биогенез клеточной оболочки Escherichia coli. Сб. тез. VIII международной Пущинской школы-конференции молодых ученых, Пущино, 2004, с.43._

9. Anisimova E.V., Krasovskaya L.A., Golovastov V.V., [Nesmeyanova М.А], Kulaev I.S. Repressive effect of unbalanced phospholipid composition of Escherichia coli membranes on the phoA gene transcription. Abstr. of FEBS Special Meeting European Lipidomics Initiative «New concepts in lipidology: from lipidomics to disease», The Netherlands, 2006.

БЛАГОДАРНОСТИ

£ с бесгднечной благодарностью вспоминаю своего научного ■руководителя и учителя ¿Марину Яртемьевну Несмеянову. 'Благодарю за постоянное внимание к^ моей работе ЗСгоря Степановича 'Кулаева, помощь в освоении методов и совместном проведении ряда экспериментов — (Викгпора (Викторовича Толовастова, Людмилу Ялександровну Красоваую, Дялу Олеговну 'Бадяг^.ну, а такэке Михаила Тригорьевича Шляпникова за синтез олигодезоксирибогуклеотида.

Заказ № 55/11/06 Подписано в печать 03.11.2006 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1,25

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 www.cfr.ru; е-таП: info@cfr.ru

яооб ft -2А&7А

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анисимова, Елена Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1. ФОСФОЛИПИДЫ - ВАЖНЫЕ КОМПОНЕНТЫ БАКТЕРИАЛЬНЫХ МЕМБРАН.

1.1. Структура и свойства фосфолипидов.

1.2. Биосинтез фосфолипидов и его регуляция.

1.3. Участие фосфолипидов в секреции белков.

1.3.1. Взаимосвязь секреции с обменом фосфолипидов.

1.3.2. Доказательства участия фосфолипидов в секреции белков, выявленные с помощью мутантных штаммов.

1.3.3. Взаимодействие фосфолипидов с топогенными последовательностями секретируемого белка.

1.3.4. Влияние фосфолипидов на функционирование компонентов секреторного аппарата.

1.4 Участие фосфолипидов в репликации ДНК.

1.5. Роль фосфолипидов в биогенезе клеточной оболочки.

1.6. Участие фосфолипидов в фолдинге белков.

1.7. Возможное участие фосфолипидов в регуляции экспрессии генов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.

2.2. Среды и условия культивирования.

2.3. Выделение плазмидной ДНК.

2.4. Полимеразная цепная реакция.

2.5. Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК.

2.6. Элиминация плазмиды pDD72 из клеток штамма AD93.

2.7. Выделение суммарной РНК.

2.8. Включение метки в 5'- конец олигонуклеотидного зонда.

2.9. Нозерн-блот-гибридизация.

2.10. Анализ динамики превращения импульсно меченого предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму.

2.11. Анализ синтеза РНК.

2.12. Иммуноферментный анализ щелочной фосфатазы.

2.13. Иммуноферментный анализ липопротеина.

2.14. Анализ фосфолипидного состава мембран.

2.14.1. Экстракция липидов.

2.14.2. Тонкослойная хроматография.

2.14.3. Определение липидного фосфора.

2.15. Электрофорез белков.

2.16. Аналитические методы.

2.16.1. Определение активности щелочной фосфатазы.

2.16.2. Определение активности /?-галактозидазы.

2.16.3. Определение содержания белка.

2.16.4. Определение 2-кето-З-дезокси-О-маннооктоната.

2.16.5. Определение содержания экзополисахаридов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 3. УЧАСТИЕ ФОСФАТИДИЛГЛИЦЕРИНА В СЕКРЕЦИИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ ЧЕРЕЗ ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКУЮ МЕМБРАНУ К COU.

3.1. Инактивация генаpgsA приводит к нарушению фосфолипидного состава мембран Е. coli.

3.2. Инактивация гена pgsA снижает эффективность секреции щелочной фосфатазы через цитоплазматическую мембрану Е. coli.

ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ АНИОННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ ЦИГОПЛАЗМАТИЧЕС-КОЙ МЕМБРАНЫ ECOU НА СЕКРЕЦИЮ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ В КУЛЬТУРАЛЬНУЮ СРЕДУ И НА БИОГЕНЕЗ КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ ОБОЛОЧКИ.

4.1. При инактивации гена pgsA увеличивается секреция щелочной фосфатазы через внешнюю мембрану.

4.2. Изменение содержания анионных фосфолипидов мембран влияет на содержание и биогенез компонентов клеточной оболочки.

ГЛАВА 5. ВЛИЯНИЕ ФОСФОЛИПИДНОГО СОСТАВА МЕМБРАН НА

ЭКСПРЕССИЮ ГЕНА phoA.

5.1. Биосинтез щелочной фосфатазы подавляется при инактивации гена pgsA.

5.2. Инактивация гена pgsA влияет на динамику репрессии синтеза щелочной фосфатазы.

5.3. Экспрессия генов под контролем РРНо промотора подавляется при изменении фосфолипидного состава мембран.

5.4. Влияние фосфолипидного состава мембран на экспрессию гена phoA на уровне транскрипции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Зависимость экспрессии гена щелочной фосфатазы Escherichia coli от фосфолипидного состава цитоплазматической мембраны"

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов секреции и экспрессии белков является важным фундаментальным исследованием, а также необходимым условием для создания научных основ технологии микробиологического производства ферментов. Транслокация белка из цитоплазмы в специфические компартменты клетки, или секреция, • является основой многих процессов: биогенеза и сборки экзобелков и супрамолекулярных структур клеточной оболочки, регуляции метаболизма, а также взаимодействия клеток с окружающей средой. В настоящее время имеются значительные достижения в установлении основ этого процесса, однако, полностью понять его механизм невозможно без учета динамических особенностей структуры и метаболизма мембранных фосфолипидов, без рассмотрения экспрессии генов и секреции белков как части биогенеза клеточной оболочки, в котором фосфолипиды участвуют в качестве метаболических предшественников ее компонентов.

Состояние проблемы. К настоящему времени накоплено много экспериментальных данных, свидетельствующих об участии как анионных . фосфолипидов (Nesmeyanova, Bogdanov, 1989; De Vrije et al., 1990; Kusters et al, 1994; Nesmeyanova et al., 1997; Van Voorst, de Kruijff, 2000), так и цвиттерионного фосфатидилэтаноламина (Cullis, de Kruijff, 1978; Rietveld et al., 1995; Golovastov et al., 2000) в транслокации белков через цитоплазматическую мембрану бактерий. Эти результаты подтверждают гипотезу о важной роли фосфолипидов мембран в секреции белков, впервые высказанную М.А. Несмеяновой (Nesmeyanova, 1982). Показано, что для функционирования белковых компонентов секреторного аппарата требуются анионные фосфолипиды (АФЛ) (Lill et al., 1990; Hendrick, Wickner, 1991). Они также взаимодействуют с положительно заряженным N-концевым участком сигнального пептида предшественников белков при инициации секреции (Nesmeyanova, 1982; Kajava et al., 1991; Phoenix et al., 1993).

Цвиттерионный фосфолипид - фосфатидилэтаноламин участвует в секреторном процессе путем формирования небислойной структуры мембран, которая способствует транслокации белка через мембрану (Rietveld et al, 1995; Mikhaleva et al, 1999; Головастов и др., 2000). Недавно также показано, что этот фосфолипид взаимодействует с N-концевой областью зрелой полипептидной цепи, помогая, как предполагается, ее входу в транслокационный канал (Головастов и др., 2002). Кроме того, было установлено, что дисбаланс фосфолипидов, вызванный отсутствием фосфатидилэтаноламина, влияет не только на секрецию щелочной фосфатазы (PhoA), но и на экспрессию ее гена, контролируемого собственным промотором Ррно (Mikhaleva et al, 2001). Однако вклад индивидуальных классов фосфолипидов в экспрессию генов и секрецию белков, а также молекулярный механизм их вовлечения в эти процессы остаются мало изученными.

Ранее в лаборатории М.А. Несмеяновой были получены первые косвенные доказательства участия анионного фосфатидилглицерина (ФГ) в секреции щелочной фосфатазы Е. coli (Евдокимова, Несмеянова, 1977; Несмеянова, Евдокимова, 1979). Его содержание и обмен увеличивались в процессе секреции белка, и именно он был обнаружен в транслокационном сайте мембран (Богданов и др., 1985а,Ь). Позднее участие ФГ в секреции белков было подтверждено в опытах in vitro (De Vrije et al, 1988; Kusters et al., 1991). Однако прямые доказательства участия этого фосфолипида в секреции белка у бактерий in vivo отсутствуют. Остается неясным вносит ли именно фосфатидилглицерин вклад в секрецию или он может быть заменен другим анионным фосфолипидом?

Цель и задачи исследования. Целью данной работы являлось установление роли индивидуальных классов фосфолипидов мембран в секреции щелочной фосфатазы и экспрессии ее гена у Е. coli, а также выявление взаимосвязи между секрецией белка и биогенезом клеточной оболочки.

В качестве модели для решения конкретных задач исследования использовали щелочную фосфатазу Е. coli - типичный секретируемый белок, биогенез которого хорошо изучен. Биогенез этого белка включает его синтез в цитоплазме в виде предшественника, содержащего на N-конце дополнительную последовательность, называемую сигнальным пептидом; транслокацию предшественника через цитоплазматическую мембрану с использованием Sec-зависимого секреторного пути; процессинг (отщепление сигнального пептида сигнальной пептидазой на внешней стороне цитоплазматической мембраны) и посттранслокационную модификацию в периплазме с образованием активной формы фермента.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Изучить влияние инактивации гена pgsA, ответственного за синтез фосфатидилглицерина у Е. coli, на секрецию PhoA in vivo и дифференцировать вклад в секрецию фосфатидилглицерина и других анионных фосфолипидов;

2) Исследовать влияние состава анионных фосфолипидов цитоплазматической мембраны на биогенез компонентов клеточной оболочки и вклад этих фосфолипидов во взаимосвязь секреции белка с биогенезом оболочки;

3) Изучить влияние изменений в фосфолипидном составе мембран, вызванных мутациями в генах фосфолипидного обмена pgsA и pssA, ответственных за синтез ФГ и ФЭ, соответственно, на экспрессию гена щелочной фосфатазы.

Научная новизна работы. В настоящей работе с использованием мутантных штаммов Е. coli получены новые данные, свидетельствующие об участии in vivo анионного фосфолипида фосфатидилглицерина в экспрессии генов и секреции белков на примере щелочной фосфатазы. Результаты свидетельствуют о корреляции секреции PhoA с содержанием в клетках мутантных штаммов фосфатидилглицерина, а не анионных фосфолипидов в целом, подтверждая участие в секреции PhoA именно этого фосфолипида. Кроме того, выявлено, что в условиях значительного снижения содержания фосфатидилглицерина подавляется не только секреция, но и биосинтез PhoA. Получены доказательства влияния фосфолипидного состава на экспрессию гена phoA, регулируемую PhoR-PhoB двухкомпонентной системой, с использованием созданной нами репортерной конструкции (рРНОllacZ) и метода РНК-блот-гибридизации. Результаты данного исследования позволяют сделать заключение о том, что значительные изменения в составе мембранных фосфолипидов (преобладание фосфатидилэтаноламина в случае pgsA -мутантов и его полное отсутствие в pssA-мутантах), имеют одинаковый эффект на активность РРНо промотора и синтез мРНК гена щелочной фосфатазы.

Изучены особенности биогенеза оболочки у штаммов Е. coli с контролируемым синтезом анионных фосфолипидов. Результаты свидетельствуют в пользу того, что существует, во-первых, взаимосвязь между секрецией PhoA через цитоплазматическую мембрану и биогенезом компонентов оболочки (липопротеина и липополисахарида), во-вторых -между секрецией белка в среду и нарушением биогенеза компонентов оболочки, ответственных за ее проницаемость, в-третьих - фосфолипиды вносят определенный вклад в это взаимодействие.

Научно-практическое значение Решение поставленных в работе задач вносит новый вклад в понимание механизма участия наиболее динамичного компонента мембран - фосфолипидов в экспрессии генов и секреции белков у бактерий, что важно для многих областей клеточной биологии, биотехнологии и медицины, связанных с оптимизацией экспрессии важных секретируемых бактериальных ферментов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Анисимова, Елена Васильевна

ВЫВОДЫ:

1. Выявлено, что инактивация pgsA гена, ответственного за синтез фосфатидилглицерина, приводит к снижению уровня секреции щелочной фосфатазы E.coli. Впервые in vivo показана взаимосвязь секреции щелочной фосфатазы E.coli с содержанием в клетках анионного фосфолипида фосфатидилглицерина, а не других анионных фосфолипидов.

5. Показано, что уровень синтеза мРНК щелочной фосфатазы существенно ингибируется как при снижении содержания фосфатидилглицерина, так и в отсутствии фосфатидилэтаноламина.

6. Изменения состава мембран, вызванные как снижением содержания анионного фосфатидилглицерина, так и отсутствием цвиттерионного фосфатидилэтаноламина оказывают одинаковый эффект на экспрессию гена phoA несмотря на различие в структуре этих фосфолипидов. Полученные данные свидетельствуют о том, что решающую роль в экспрессии гена phoA играет дисбаланс фосфолипидов и суммарный заряд мембран, а не изменение в содержании отдельных фосфолипидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты настоящей работы свидетельствуют в пользу того, что • секреция PhoA в мутантных штаммах Е. coli коррелирует с содержанием анионного фосфатидилглицерина, и только его значительное снижение существенно подавляет секрецию PhoA через цитоплазматическую мембрану. Кроме того, в настоящей работе показано влияние содержания анионных фосфолипидов мембран на секрецию PhoA через внешнюю мембрану Е. coli, что является следствием снижения в ней липопротеина и липополисахарида, определяющих ее барьерные свойства. Полученные результаты свидетельствуют о существовании взаимосвязи между секрецией белка через цитоплазматическую мембрану и биогенезом компонентов оболочки (положительная с ЛПС и отрицательная с ЛП), а также между секрецией белка в среду и нарушением биогенеза компонентов оболочки, . ответственных за ее проницаемость. Очевидно, что анионные фосфолипиды вносят вклад в это взаимодействие в качестве предшественников компонентов клеточной оболочки.

В данной работе нами было установлено, что инактивация гена pgsA не только снижает секрецию PhoA через цитоплазматическую мембрану, но и подавляет ее биосинтез при условии значительного снижения фосфатидилглицерина (до 3%). Мы предположили, что влияние фосфолипидного состава мембран на биосинтез может быть обусловлено его воздействием на экспрессию гена щелочной фосфатазы.

Показана зависимость экспрессии гена phoA от фосфолипидного состава мембран Е. coli на уровне активности РРНо промотора и синтеза phoA-yRUK. Данные свидетельствуют о том, что радикальные изменения в составе мембранных фосфолипидов даже противоположного характера (в результате pgsA- и /ш^-мутаций) оказывают одинаковый эффект на транскрипцию гена phoA. По всей видимости, решающую роль во влиянии на экспрессию играет соотношение фосфолипидов и суммарный заряд мембран, а не изменение в содержании индивидуальных классов фосфолипидов.

Проведенный нами анализ литературных данных выявил различный эффект фосфолипидных модификаций на экспрессию разных генов: для одних генов это проявляется в активации (sodA, degP), для других (flhD-flhC оперон) - в репрессии их активности. В настоящей работе выявлено репрессирующее влияние дисбаланса фосфолипидного состава, вызванного снижением содержания в мембранах АФЛ в результате мутации в гене pgsA или полным отсутствием цвиттерионного ФЭ в результате мутации в гене pssA, на экспрессию гена phoA на уровне транскрипции.

Следует отметить, что все упомянутые выше примеры влияния несбалансированного фосфолипидного состава на экспрессию генов относятся к двухкомпонентным регуляторным системам сигнальной трансдукции. С помощью таких систем бактерии отвечают на изменения в окружающей среде, акцептируя мембранными сенсорами сигналы извне и переводя их в специфические сигналы, которые воспринимаются цитоплазматическими белками регуляторами транскрипции (Alex, Simon, 1994). Механизм передачи сигнала от сенсора состоит в фосфорилировании белка-регулятора сенсором и универсален для разных систем. К таким регуляторным системам относится и система регуляции фосфатного обмена PhoR-PhoB, участвующая в трансдукции Р, сигнала и контролирующая экспрессию генов Pho регулона, в том числе и гена phoA, кодирующего ключевой фермент Pho регулона - щелочную фосфатазу (рис. 18). Она состоит из мембранного сенсора PhoR, акцептирующего внешние сигналы, и цитоплазматического фактора транскрипции PhoB, взаимодействующего с регуляторными элементами ДНК.

В условиях достаточного количества Р, в среде эта молекула диффундирует через ОтрС и OmpF поры внешней мембраны и затем узнается переносчиком неорганического фосфата (Pit), который переносит его через цитоплазматическую мембрану. Однако, сталкиваясь с условиями низкой концентрации фосфата, E.coli и другие микроорганизмы развили периплазма ш mm цитоплазма

S А С В и

Pi н ш теш 1

Рис. 18. Модель регуляции экспрессии генов РЬо-регулона двухкомпонентной системой трансдукции Pi-сигнала (PhoR-PhoB). Экспрессия генов РЬо-регулона Е. coli подвергается как негативному, так и позитивному контролю. Сенсорный белок PhoR участвует в обоих типах контроля, существуя в двух формах - в форме репрессора (PhoRR) и активатора (PhoRA) белка PhoB. Образование PhoRR происходит в условиях избытка неорганического фосфата (Pj) и требует наличия медиатора PhoU и Pst-системы транспорта Pj, состоящей из белков-переносчиков (PstA, PstB, PstC, PstS). В условиях фосфорного голодания при отсутствии насыщения PstS экзогенным фосфатом, конформационные изменения Pst-системы приводят к высвобождению PhoRR из репрессорного комплекса. Далее PhoRA аутофосфорилируется по остатку гистидина и фосфорилирует PhoB за счет переноса фосфатной группы на остаток аспартата белка PhoB. Фосфорилированный PhoB (PhoB-P), связываясь с последовательностью pho-бокса

70 промотора, изменяет конформацию ДНК, способствуя тем самым взаимодействию а -субъединицы РНК-полимеразы с промотором. В результате запускается транскрипция генов Pho-регулона. При избытке Pj в среде экспрессия генов РЬо-регулона репрессируется за счет образования репрессорного комплекса, в состав которого входят белки PhoR, PhoU и все четыре белка-переносчика Pst-системы. Когда Pi связывается с белком PstS, Pst-система претерпевает конформационные изменения, которые передаются белком PhoU на PhoR, что приводит к образованию формы PhoRR. PhoRR может инактивировать PhoB-P путем дефосфорилирования. PhoE - поровый белок наружной мембраны, который облегчает в условиях фосфорного голодания диффузию фосфорсодержащих соединений через наружную мембрану (Wanner, 1994). вспомогательную систему, называемую Pho регулоном, позволяющую им максимально эффективно усваивать фосфор из внешней среды.

Возможное объяснение влияния на экспрессию phoA состоит в том, что состав полярных и ацильных групп фосфолипидов, а тем самым и общий заряд мембран, может воздействовать на конформацию и функционирование мембранных сенсоров и, вследствие этого, на передачу сигнала на регулятор транскрипции. В случае PhoA регулятор транскрипции PhoB выступает в роли активатора гена phoA, но его активность проявляется только после фосфорилирования его мембранным сенсором в ответ на сигнал о недостатке фосфора в среде. По всей видимости, в клетках с нарушенным фосфолипидным составом белок PhoB не получает сигнал от мембранного сенсора и не способен передавать его на промотор, что выражается в подавлении синтеза рйоЛ-транскриптов.

Очевидно, что взаимоотношения между компонентами мембран и регуляторных систем сигнальной трансдукции достаточно сложны и образуют сложную сеть специфических взаимодействий фосфолипидов мембран, сенсоров, регуляторов и разнообразных эффекторов. Мембранные сенсоры находятся в определенном липидном окружении и их активность, а также внутримембранная топология могут зависеть от этого окружения. Вследствие этого фосфолипиды мембран могут быть косвенно вовлечены в регуляцию активности определенных генов за счет их воздействия на функцию мембранных белков.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анисимова, Елена Васильевна, Пущино

1. Бадякина А.О., Корякина Ю.А., Сузина Н.Е., Несмеянова М.А. Изменение фосфолипидного состава мембран Escherichia coli влияет на уровень секреции периплазматической щелочной фосфатазы в среду. -Биохимия, 2003, т.68, с.917- 925.

2. Бадякина А.О., Сузина Н.Е., Дмитриев В.В., Тараховский Ю.С. Цфасман И.М., Несмеянова М.А. Особенности химического состава и структуры оболочки клеток Escherichia coli, секретирующих щелочную фосфатазу в среду. Биохимия, 1995, т.60, с.505-516.

3. Богданов М.В., Сузина Н.Е., Несмеянова М.А. Особенности обмена фосфолипидов и ультраструктурной организации цитоплазматической мембраны Escherichia coli в процессе секреции щелочной фосфатазы. -Биол. мембраны, 1985а, т.2, с.367-375.

4. Богданов М.В., Тараховский Ю.С., Манувахова М.Ш., Гонгадзе Г.М., Несмеянова М.А. Особенности химического состава и структуры оболочки клеток Escherichia coli, секретирующих щелочную фосфатазу в среду. Биол. мембраны, 1989, т.6, с.301-308.

5. Демина Н.Н., Камзолова С.Г. Сенсорно-регуляторные системы бактерий. Успехи современной биологии, 1992, т.112, с.238-251.

6. Головастов В.В., Михалева Н.И., Кадырова Л.Ю., Несмеянова М.А. Основной фосфолипид Escherichia coli фосфатидилэтаноламин -необходим для эффективной продукции и секреции щелочной фосфатазы. - Биохимия, 2000, т.65, №9, с.1295-1304.

7. Головастов В.В., Золов С.Н., Несмеянова М.А. Изучение взаимодействия экспорт-инициирующего домена зрелой щелочной фосфатазы Escherichia coli с фосфолипидами мембран в процессе секреции. Биохимия, 2002, т.67, с. 1182-1190.

8. Головастов В.В., Анисимова Е.В., Несмеянова М.А. Инактивация гена pgsA влияет на биосинтез и секрецию щелочной фосфатазы Escherichia coli. Молекулярная Биология, 2003, т.37, с.885-892.

9. Евдокимова О.А., Несмеянова М.А. Фосфолипидный состав клеток и мембран Escherichia coli в условиях репрессии и дерепрессии биосинтеза щелочной фосфатазы. Биохимия, 1977, т.42, с. 1791-1799.

10. Евдокимова О.А., Несмеянова М.А., Кулаев И.С. Индукция синтеза щелочной фосфатазы у Escherichia coli преинкубацией при пониженной температуре. Биохимия, 1978, т.43, с.1680-1687.

11. Захарова И.Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов, Наукова Думка, Киев, 1982, с.37-38.

12. Землянухина О.А., Колычева В.В., Несмеянова М.А. Влияние . липотропных агентов спиртов на биосинтез и репрессию секретируемой щелочной фосфатазы у Escherichia coli. Биохимия, 1981, т.46, с.92-99.

13. Золов С.Н., Михалева Н.И., Калинин А.Е., Несмеянова М.А. Взаимодействие npePhoA с фосфолипидами in vivo и in vitro в зависимости от заряда N-конца сигнального пептида и содержания вмембранах анионных фосфолипидов. Биохимия, 2002, т.61, с. 10511060.

14. Калинин А.Е., Карамышев А.Л., Несмеянова М.А. Нарушение процессинга щелочной фосфатазы, как следствие единичных замен аминокислот, влияет на состав и обмен фосфолипидов клеток Escherichia coli. Биохимия, 1996, т.61, с.104- ИЗ.

15. Калинин А.Е., Михалева Н.И., Карамышев А.Л., Карамышева З.Н., Несмеянова М.А. Взаимодействие предшественников мутантных щелочных фосфатаз с фосфолипидами мембран in vivo и in vitro. -Биохимия, 1999, т.64, с.1214-1223.

16. Лойда 3., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. М.: Мир, 1982,272 с.

17. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии. М.: Мир, 1984,480 с.

18. Милейковская Е., Жанг М., Доухан В. Роль кардиолипина в энергозапасающих мембранах. Биохимия, 2005, т.70, с.191-196.

19. Миллер, Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976, • 436 с.

20. Несмеянова М.А., Богданов М.В., Колот М.Н., Землянухина О.А., Кулаев И.С. Взаимодействие щелочной фосфатазы с кислыми фосфолипидами клеток Escherichia coli и искусственных мембран. -Биохимия, 1982, т.47, с.671-677.

21. Несмеянова М.А., Евдокимова О.А. Фосфолипиды Escherichia coli и активность щелочной фосфатазы. Биохимия, 1979, т.44, с.1512-1520.

22. Несмеянова М.А., Сузина Н.Е., Цфасман И.М., Бадякина А.О. Секреция периплазматического PhoA-белка при его сверхсинтезе в среду с помощью везикул внешних мембран. Мол. биология, 1991, т.25, с.974-987.

23. Ahn Т., Kim Н. Effects of nonlamellar lipids on the ATPase activity of SecA bound to model membranes. J. Biol. Chem., 1998, v.273, p.21692-21698.

24. Ahn Т., Kim J.-S., Lee B.-C., Yun C.-H. Effects of lipids on the interaction of SecA with model membranes. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2001, v.395, p.14-20.

25. Aiba H., Adhya S., de Crombrugghe B. Evidence for two functional gal promoters in intact Esherichia coli. J. Biol. Chem., 1981, v. 256, №22, p.l 1905-11910.

26. Alex L., Simon M. Protein histidine kinases and signal transduction in prokaryotes and eukaryotes. Trends Genet., 1994, v. 10, p.l33-138.

27. Ames G.F., Spudish E., Nicaido H. Lipids membrane of Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structure and metabolism. J. Bacterid., 1968, v.95, p.833-843.

28. Asai, Y., Y. Katayose, C. Hikita, A. Ohta, and I. Shibuya. Suppression of the lethal effect of acidic-phospholipid deficiency by defective formation of the major outer membrane lipoprotein in Escherichia coli. J. Bacterid. 1989, v.171, p.6867-6869.

29. Audet A., Cole R., Proulx P. Polyglycerophosphatide metabolism in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1975, v.380, p.414-420.

30. Beacham I.R., Taylor N.S., Youell M. Enzyme secretion in Escherichia coli: synthesis of alkaline phosphatase and acid hexose phosphatase in the absence of phospholipid synthesis. J. Bacteriol., 1976, v. 128, p.522-527.

31. Benach J., Chou Y.-T., Fak J.J., Itkin A., Nicolae D.D., Smith P.C., Wittrock G., Floyd D.L., Golsaz C.M., Gierasch L.M., Hunt J.F.

32. Phospholipid-induced monomerization and signal-peptide-induced oligomerization of SecA. J. Biol. Chem., 2003, v.278, p.3628-3638.

33. Benson S., Silnavy T.J. Information within the mature LamB protein necessary for localization to the outer membrane of Escherichia coli K12. -Cell, 1983, v.32, p.1325-1335.

34. Blobel G. Intracellular protein topogenesis. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1980, v.77, p.1496-1500.

35. Bogdanov M., Dowhan W. Phosphatidylethanolamine is required for in vivo function of the membrane-associated lactose permease of Escherichia coli. -J. Biol. Chem., 1995, v.270, p.732-739.

36. Bogdanov M., Dowhan W. Phospholipid-assisted protein refolding: phosphatidylethanolamine is required at the late step of the conformational maturation of the polytopic membrane protein lactose permease. The EMBO J., 1998, v.17, p.5255-5264.

37. Bogdanov M., Dowhan W. Lipid-assisted folding. J. Biol. Chem., 1999, v.274, p.36827-36830.

38. Bogdanov M., Heacock P.N., Dowhan W. A polytopic membrane protein displays a reversible topology dependent on membrane lipid composition. -The EMBO J., 2002, v.21, p.2107-2116.

39. Bogdanov M., Sun J., Kaback H.R., Dowhan W. A phospholipid acts as a chaperone in assembly of membrane transport protein. J. Biol. Chem., 1996, v.271, p.11615-11618.

40. Bogdanov M., Umeda M., Dowhan W. Phospholipid-assisted refolding of an integral membrane protein. Minimum structural features for phosphatidylethanolamine to act as a molecular chaperone. J. Biol. Chem., 1999, v.274, p.12339-12345.

41. Boyd D., Beckwith J. The role of charged amino acids in the localization of secreted and membrane proteins. Cell, 1990, v.62, p.1031-1033.

42. Braun V. Covalent lipoprotein from the outer membrane of E. coli. -Biochim. Biophys. Acta, 1975, v.415, p.335-377.

43. Breukink E., Demel R.A., De Korte-Kool G., de Kruijff B. SecA insertion into phospholipids is stimulated by negatively charged lipids and inhibited by ATP: a monolayer study. Biochemistry, 1992, v.31, p.l 119-1124.

44. Cashman J.S., Webster R.E. Effect of cessation of phospholipid synthesis on the synthesis of a specific membrane-associated bacteriophage protein in E.coli.- J. Bacterid., 1977, v.129, p.1245-1249.

45. Castuma, С. E., E. Crooke, and A. Kornberg. Fluid membranes with acidic domains activate DnaA, the initiator protein of replication in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1993, v.268, p.24665-24668.

46. Chalvardjian A., Rudnicki E. Determination of lipid phosphorous in the nanomolar range. Anal. Biochem., 1970, v.36, p.225-226.

47. Chang C.N., Inouye H., Model P., Beckwith J. Processing of alkaline phosphatase precursor to the mature enzyme by on Escherichia coli inner membrane preparation. J. Bacterid., 1980, v.142, p.726-728.

48. Cronan J.E.Jr. Thermal regulation of the membrane lipid composition of Escherichia coli. Evidence for the direct control of fatty acid synthesis. J. Biol. Chem., 1975, v.250, p.7074-7077.

49. Cronan J.E.Jr., Vagelos P. R. Metabolism and function of the membrane phospholipids of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v.265, • p.25-60.

50. Cronan J.E.Jr. Phospholipid modifications in bacteria. Curr. Opinion in Microbiol., 2002, v.5, p.202-205.

51. Crook E., Castuma C.E., Kornberg A. The chromosome origin of Escherichia coli stabilizes DnaA protein during rejuvenation by phospholipids. J. Biol. Chem., 1992, v.267, p. 16779-16782.

52. Davis R.I. Disk electrophoresis. II. Method and application to human serum proteins. Annu. N. Y. Acad. Sci., 1964, v.121, p.404-427.

53. DeChavigny A., Heacock P. N., Dowhan W. Sequence and inactivation of the pss gene of Escherichia coli. Phosphatidylethanolamine may not be essential for cell viability. J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.5323-5332.

54. De Cock H., Brandenburg K., Wiese A., Hoist 0., Seydel U. Non-lamellar structure and negative charges of lipopolysaccharides required for efficient folding of outer membrane protein PhoE of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1999, v.274, p.5114-5119.

55. De Cock H., Tommassen J. Lipopolysaccharides and divalent cations are involved in the formation of an assembly-competent intermediate of outer-membrane protein PhoE of Escherichia col. The EMBO J., 1996, v. 15, p.5567-5593.

56. De Kruijff B. Polymorphic regulation of membrane lipid composition. -Nature, 1987,v.329, p.587-588.

57. De Kruijff B. Lipid polymorphism and biomembrane function. Curr. Opin. Chem. Biol., 1997, v.l, p.564-569.

58. De Vrije G.J., Batenburg A.M., Killian J.A., de Kruijff B. Lipid involvement in protein translocation in Escherichia coli. Mol. Microbiol., 1990, v.4, p.143-150.

59. De Vrije Т., de Swart R.L., Dowhan W., Tommassen J., de Kruijff B. Phosphatidilglycerol is involved in protein translocation across Escherichia coli inner membranes. Nature (London), 1988, v.334, p. 173-175.

60. Donohue-Rolfe A.M., Schaechter M. Translocation of phospholipids from the inner to the outer membrane of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1980, v.77, p.1867-1871.

61. Dowhan W. Molecular basis for membrane phospholipid diversity: why are there so many lipids? Annu. Rev. Biochem., 1997, v.66, p.l99-232.

62. Dowhan W. Genetic analysis of lipid-protein interactions in Escherichia coli membranes. Biochim. Biophys. Acta, 1998, v. 13 76, p.455-466.

63. Driessen A.J.M., Fekkes P., van der Wolk J.P.M. The Sec system. Current Opinion in Microbiol., 1998, v. 1, p.216-222.

64. Driessen A.J.M., Manting E.H., van der Does C. The structural basis of protein targeting and translocation in bacteria. Nature Structural Biology, 2001, v.8, p.492-498.

65. Driessen A.J.M., Wickner W. Solubilization and functional reconstitution of • the protein-translocation enzymes of Escherichia coli Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1990, v.87, p.3107-3111.

66. Economou A. Bacterial secretome: the assembly manual and operating instructions. Mol. Membrane Biology, 2002, v.19, p.l59-169.

67. Economou A., Pogliano J.A., Beckwith J., Oliver D.B., Wickner W. SecA membrane cycling at SecYEG is driven by distinct ATP binding and hydrolysis events and is regulated by SecD and SecF. Cell, 1995, v.83, p.l 171-1181.

68. Economou A., Wickner W. SecA promotes preprotein translocation by undergoing ATP-driven cycles of membrane insertion and deinsertion. -Cell, 1994, v.78,p.835-843.

69. Emr S.D., Hanley-Way S., Silhavy T.J. Suppressor mutations that restore export of a protein with a defective signal sequence. Cell, 1981, v.23, p.79-88.

70. Emr S.D., Hedgpeth J., Clemet J.-M., Silhavy T.J., Hornung M. Sequence analysis of mutations that prevent export of lambda receptor, an

71. Escherichia coli outer membrane protein. Nature (London), 1980, v.285, p.82-85.

72. Emr S.D., Silhavy T.J. Importance of secondary structure in the signal peptide for protein export. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, v.80, p.4599-4603.

73. Fralick J.A., Lark K.G. Evidence for the involvement of unsaturated fatty acids in initiating chromosome replication in Escherichia coli. J. Mol. Biol., 1973, v.80, p.459-475.

74. Fine J.B., Sprecker H. Unidimensional thin-layer chromatography of phospholipids on boric acid-impregnated plates. J. Lipid Res., 1982, v.23, p.660-663.

75. Freudl R., Schwarz H., Stierhof Y.D., Gamon K., Hindennach I., Henning U. An outer membrane protein (OmpA) of Escherichia coli K-12 undergoes a conformational change during export. J. Biol. Chem., 1986, v.261, p.l 1355-11361.

76. Garner, J., and E. Crooke. Membrane regulation of the chromosomal replication activity of E. coli DnaA requires a discrete site on the protein. ' EMBOJ., 1996, v.15, p.2313-2321.

77. Gierasch L.M. Signal sequences. Biochemistry, 1989, v.28, p.923-930.

78. Hasin M., Kennedy E.P. Role of phosphatidylethanolamine in the biosynthesis of pyrophosphoethnolamine residues in the lipopolysaccharide of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1982, v.257, p. 12475-12477.

79. Hayashi S., Wu H.C. Lipoproteins in bacteria. J. Bioenerg. Biomembr., 1990, v.22, p.451-471

80. Hayashi S., Wu H.C. Accumulation of prolipoprotein in Escherichia coli mutants defective in protein secretion. J. Bacterid., 1985, v. 161, p.949-954.

81. Heacock P.N, Dowhan W. Construction of a lethal mutation in synthesis of . the major acidic phospholipids Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1987, v.262, p.13044-13049.

82. Heide Т. Van der, Poolman B. Osmoregulated ABC-transport system of Lactococcus lactis senses water stress via changes in the physical state of the membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, v.97, p.7102-7106.

83. Hendrick J.P., Wickner W. SecA protein needs both acidic phospholipids and SecY/E protein for functional, high-affinity binding to the Escherichia coli plasma membrane. J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.24596-24600.

84. Hoch F. L. Cardiolipins and biomembrane functions. Biochim. Biophys. Acta, 1992, v.1113, p.71-133.

85. Hokin M.R., Hokin L.E. Dynamic aspects of phospholipids during protein secretion. In: Metabolism and physiological significance of lipids (Dawson R.M.C. and Rhodes D.W., eds.) Wiley, N.Y., 1964, p.423-434.

86. Horiuchi Т., Maki H., Sekiguchi M. Rnase H-defective mutants of Escherichia coli: a possible discriminatory role of Rnase H in initiation of DNA replication. Mol. Gen. Genet., 1984, v.195, p.17-22.

87. Huijbregts R.P., de Kroon A.I., de Kruijff B. Rapid transmembrane movement of C6-NBD-labeled phospholipids across the inner membrane of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1996, v.1280, p.41-50.

88. Huijbregts R.P., de Kroon A.I., de Kruijff B. Topology and transport of membrane lipids in bacteria. Biochim. Biophys. Acta, 2000, v. 1469, p.43-61.

89. Huijbregts R.P., de Kroon A.I., Killian J.A., de Kruijff B. Transbilayer ' movement of phospholipids in biogenic membranes. Biochemistry, 2004, v.43, p.2673-2681.

90. Inouye H., Beckwith J. Synthesis and processing of alkaline phosphatase precursor in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977, v.74, p. 1440-1444.

91. Inoue K., Matsuzaki H., Matsumoto K., Shibuya I. Unbalanced membrane phospholipid compositions affect transcriptional expression of certain regulatory genes in Escherichia coli. J. Bacteriol., 1997, v. 179, p.2872-2878.

92. Inouye H., Michaelis S., Wright A., Beckwith J. Cloning and restriction mapping of alkaline phosphatase structural gene (phoA) of Escherichia coli -and generation of deletion mutant in vitro. J. Bacterid., 1981, v.146, p.668-675.

93. Izui K. A lipid requirement for induction of alkaline phosphatase, one of periplasmic enzymes, in Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, v.45, p.1506-1512.

94. Iuchi S., Lin E.C.C. Signal transduction in the Arc system for control of operons encoding aerobic respiratory enzymes. In: Two-component signal transduction (Hoch J.A., Silhavy T.J, eds.), Amer. Soc. Microbiol., Washington, 1995, p.223-232.

95. Jacob F., Brenner S., Cuzin F. On the regulation of DNA replication in bacteria. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1963, v.28, p.329-348.

96. Jackson B.J., Bohin J.-P., Kennedy E.P. Biosynthesis of membrane-derived oligosaccharides: characterization of mdoB mutants defective phosphoglycerol transferase I activity. J. Bacterid., 1984, v.160, p.967-981.

97. Kajava A.V., Bogdanov M.V., Nesmeyanova M.A. Stereochemical analysis of interaction of signal peptide with phospholipids at the initiation of protein translocation across the membrane. J. Biomol. Struct. & Dynamics, 1991, v.9, p.143-157.

98. Kamitani S., Akiyama Y., Ito K. Identification and characterization of an Escherichia coli gene required for the formation of correctly folded alkaline phosphatase, a periplasmic enzyme. The EMBO J., 1992, v.l 1, p.57-62.

99. Karkhanis Y.D., Zeltner J.Y., Jackson J J., Carlo D.J. A new and improved microassay to determine 2-keto-3-deoxyoctonate in lipopolysaccharide of gram-negative bacteria. Anal. Biochem., 1978, v.85, p.595-601.

100. Keller R.C., Killian J.A., de Kruijff, B. Anionic phospholipids are essential for alpha-helix formation of the signal peptide of prePhoE upon interaction with phospholipid vesicles. Biochemistry, 1992, v.31, p. 1672-1677.

101. Kikuchi, S., I. Shibuya, and K. Matsumoto. Viability of an Escherichia coli pgsA null mutant lacking detectable phosphatidylglycerol and cardiolipin. -J. Bacterid., 2000, v. 182, p.371-376.

102. Killian J.A., de Jong A.M., Bijvelt J., Verkleij A.J., de Kruijff B. Induction of non-bilayer lipid structures by functional signal peptides. The EMBO J., 1990, v.9, p.815-819.

103. Kitamura E., Nakayma Y., Matsuzaki H., Matsumoto K., Shibuya I. Acidic- ' phospholipid deficiency represses the flagellar master operon through a novel regulatory region in Escherichia coli. Biosci. Biothechnol. Biochem., 1994, v.58, p.2305-2307.

104. Kito M., Ishinaga M., Wishihara M., Kato M., Sawada S., Hata T. Metabolism of the phosphatidyl glycerol molecular species in Escherichia coli. Eur. J. Biochem., 1975, v.54, p.55-63.

105. Kogoma Т., Skarstad К., Boye E., von Meyenburg K., Steen H.B. RecA protein acts at the initiation of stable DNA replication in rnh mutants of Escherichia coli K-12. J. Bacterid., 1985, v. 163, p.439-444.

106. Kol M.A., van Dalen A., de Kroon A.I., de Kruijff B. Translocation of phospholipids is facilitated by a subset of membrane-spanning proteins of the bacterial cytoplasmic membrane. J. Biol. Chem., 2003, v.278, p.24586-24593.

107. Kontinen V.P., Tokuda H. Overexpression of phosphatidylglycerophosphate syntase restores protein translocation in a secG deletion mutant of Escherichia coli at low temperature. FEBS Lett., 1995, v.364, p.157-160.

108. Kornberg R.D., McConnell H.M. Inside-outside transitions of phospholipids in vesicle membranes. Biochemistry, 1971, v. 10, p.l 111-1120.

109. Kusters R., Breukink E., Gallusser A., Kuhn A., de Kruijff B. A dual role for phosphatidylglycerol in protein translocation across Escherichia coli inner membrane. J. Biol. Chem., 1994, v.269, p.1560-1563.

110. Kusters R., Dowhan W., de Kruijff B. Negatively charged phospholipids restore prePhoE translocation across phosphatidylglycerol-depleted Escherichia coli inner membrane vesicles. J. Biol. Chem., 1991, v.266, p.8659-8662.

111. Laemmli U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, v.227, p.680-685.

112. Lazzaroni, J.C., Atlan, D. and Portalier, R.C. Excretion of alkaline phosphatase by Escherichia coli K12 pho constitutive mutants transformed with plasmids carrying the alkaline phosphatase structural gene. J. Bacteriol., 1985, v.164, p.1376-1380.

113. Lazzaroni JC, Fognini-Lefebvre N, Portalier R. Cloning of the excC and excD genes involved in the release of periplasmic proteins by E. coli К12. -Mol. Gen. Genet., 1989, v.218, p.460-464.

114. Lazzaroni, J.-C., Portalier R. The excC gene of E. coli K-12 required for cell envelope integrity encodes the peptidoglycan-associated lipoprotein (Pal). -Mol. Microbiol., 1992, v.6, p.735-742.

115. Leenhouts J.M., van den Wijngaard P.W., de Kroon A.I., de KruijfF B. Anionic phospholipids can mediate membrane insertion of the anionic part of a bound peptide. FEBS Lett., 1995, v.370, p. 189-192.

116. Lill R., Dowhan W., Wickner W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell, 1990, v.60, p.271-280.

117. Lindblom G., Rilfors L. Nonlamellar phases formed by membrane lipids. -Adv. Colloid Interface Sci., 1992, v.41, p.101-125.

118. Liu X., Ferenci T. Regulation of porin-mediated outer membrane permeability by nutrient limitation in Escherichia coli. J. Bacteriology, 1998, v.180, p.3917-3922.

119. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall RJ. Protein measurement with the Folin-phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v.l93, p.265-275.

120. Lugtenberg B. Van Alphen L. Molecular architecture and functioning of the outer membrane of Escherichia coli and other gram-negative bacteria. Biochim. Biophys. Acta, 1983, v.737, p.51-115.

121. Makino K., Amemura M., Kim S.-K., Nakata A. In: Phosphate in Microorganisms: Cellular and Molecular Biology. (Torriani-Gorini A., Yagil E., Silver S., eds.), Amer. Soc. Microbiol., Washington, D.C., 1994, p. 5-12.

122. Makise, M., Mima, S., Tsuchiya, Т., and Mizushima, T. Identification of amino acids involved in the functional interaction between DnaA protein and acidic phospholipids. J. Biol. Chem., 2000, v.275, p.4513-4518.

123. Michaelis S., Inouye H., Oliver D., Beckwith J. Mutations that alter the • signal sequence of alkaline phosphatase in Escherichia coli. J. Bacteriol., 1983, v.154, p.366-374.

124. Mikhaleva N.I., Santini C-Lise, Giordano G., Nesmeyanova M.A., Wu L.-F. Requirement for phospholipids of the translocation of the trimethylamine N-oxide reductase through the Tat pathway in Escherichia coli. FEBS Lett., 1999, v.463, p.331-335.

125. Miller K.J. and Kennedy E.P. Transfer of phosphoethanolamine residues from phosphoethanolamine to the membrane-derived oligosaccharides in Escherichia coli.-J. Bacterid., 1987, v. 169, p.682-686.

126. Mileykovskaya E., Dowhan W. The Cpx two-component signal transduction pathway is activated in Escherichia coli mutant strains lacking phosphatidylethanolamine. J. Bacterid., 1997, v.179, p.1029-1034.

127. Mileykovskaya E., Dowhan W. Visualization of phospholipid domains in Escherichia coli by using the cardiolipin-specific fluorescent dyelO-N-nonyl acridine orange. J. Bacterid., 2000, v. 182, p.1172-1175.

128. Miyazaki C., Kuroda M., Ohta A., Shibuya I. Genetic manipulation of membrane phospholipid composition in Escherichia coli: pgsA mutants defective in phosphatidylglycerol synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1985, v.82, p.7530-7534.

129. Morein S., Andersson A., Rilfors L., Lindblom G. Wild-type Escherichia coli cells regulate the membrane lipid composition in a "window" between gel and non-lamellar structures. J. Biol. Chem., 1996, v.271, p.6801-6809.

130. Mori H., Ito K. The Sec protein-translocation pathway. TRENDS in Microbiol., 2001, v.9, p.494-500.

131. Mug-Opstalten D., Witholt B. Preferential release of new outer membrane fragments by exponentially growing Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1978, v.508, p.287-295.

132. Nakata A., Shinagawa H., Rothman F. Molecular mechanism of isozyme formation of alkaline phosphatase in Escherichia coli. In: Phosphate metabolism and cellular regulation in microorganisms (Torriani-Gorini A.,

133. Rothman F., Silver S., Wright A. and Yagil E., eds.), Amer. Soc. Microbiol., Washington, D.C., 1987, p.139-141.

134. Nesmeyanova M.A. On the possible participitation of acid phospholipids in the translocation of secreted proteins through the bacterial cytoplasmic membrane. FEBSLett., 1982, v.142, p.189-193.

135. Nesmeyanova M.A., Bogdanov M.V. Participation of acid phospholipids in protein translocation across the bacterial cytoplasmic membrane. FEBS Lett., 1989, v.257, p.203-207.

136. Nesmeyanova, M.A., Kalinin, A.E., Karamishev, A.L., Mikhaleva, N.I., and Krupyanko, V.I. Overproduction, secretion, isolation and properties of recombinant alkaline phosphatase encoded in Escherichia coli. Proc. Biochem, 1996, v.32, p. 1-7.

137. Newman, G., and Crooke, E. DnaA, the initiator of Escherichia coli chromosomal replication, is located at the cell membrane. J. Bacterid., 2000, v. 182, p.2604-2610.

138. Nikaido H. Biosynthesis and assembly of lipopolisaccharide and the outer membrane layer of gram-negative cell wall. In: Bacterial membranes and walls (Leive L., ed.), N.Y., Dekker, 1973, p. 131-208.

139. Nikaido H., Vaara M. Molecular basis of bacterial outer membrane permeability. Microbiol. Rev., 1985, v.49, p.l-32.

140. Nishino Т., Kitamura E., Matsuzaki H., Nishijima S., Matsumoto K., Shibyua I. Flagellar formation depends on membrane acidic phospholipids in Escherichia coli. Biosci. Biothechnol. Biochem., 1993, v.57, p.l805-1808.

141. Nishijima S., Asami Y., Uetake N., Yamagoe S., Ohta A., Shibuya I. Disruption of the Escherichia coli els gene responsible for cardiolipin synthesis.- J. Bacterid., 1988, v.l70, p.775-780.

142. Nishiyama K., Mizushima S., Tokuda H. A novel membrane protein involved in protein translocation across the cytoplasmic membrane of Escherichia coli. The EMBO J., 1993, v.12, p.3409-3415.

143. Norris V., Fralick J., Danchin A. A SeqA hyperstructure and its interactions direct the replication and sequestration of DNA. Mol. Microbiol., 2000, v.37, p.696-702.

144. Ogawa Т., Pickett G.G., Kogoma Т., Kornberg A. Rnase H confers specificity in the -dependent initiation of replication at the unique origin of the Escherichia coli chromosome in vivo and in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, v.81, p. 1040-1044.

145. Or E., Navon A., Rapoport T. Dissociation of the dimeric SecA ATPase during protein translocation across the bacterial membrane. The EMBO J., 2002, v.21, p.4470-4479.

146. Pages, J.M., Anba, J. & Lazdunski, C. Conditions leading to secretion of a normally periplasmic protein in E. coli. Journal of Bacteriology, 1987, v.l 69, p.1386-1390.

147. Parkinson J.S. Genetic approaches for signaling pathways and proteins. In: Two-components signal transduction (Hoch J.A., Silhavy T.J., eds.), Amer. Soc. Microbiol., Washington, D.C., 1995, p.9-23.

148. Pratt L.A., Silhavy T.J. Porin regulon of Escherichia coli. In: Two-component signal transduction (Hoch J.A., Silhavy T.J., eds.), Amer. Soc. Microbiol., Washington, D.C., 1995, p.105-126.

149. Pugsley A.P. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Microbiol. Rev., 1993, v.57, p.50-108.

150. Raetz C.R.H. Enzymology, genetics, and regulation of membrane phospholipid synthesis in Escherichia coli. Microbiol. Rev., 1978, v.42, p.614-659.

151. Raetz C.R., Dowhan W. Biosynthesis and function of phospholipids in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1990, v.265, p. 1235-1238.

152. Raetz C.R., Whitfield C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu. Rev. Biochem., 2002, v.71, p.635-700.

153. Rietveld A.G., Chupin V.V., Koorengevel M.C., Wienk H.L., Dowhan W., de Kruijff B. Regulation of lipid polymorphism is essential for the viability of phosphatidylethanolamine-deficient Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1994, v.269, p.28670-28675.

154. Rietveld A.G., Killian J.A., Dowhan W., de Kruijff B. Polymorphic regulation of membrane phospholipid composition in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1993, v.268, p. 12427-12433.

155. Rietveld A.G., Koorengevel M.C., de Kruijff B. Non-bilayer lipids are required for efficient protein transport across the plasma membrane of Escherichia coli. The EMBO J., 1995, v.14, p.5506-5513.

156. Rilfors L., Lindblom G., Wieslander A., Christiansson A. In: Membrane fluidity (Kates M. and Manson L.A., eds.), Plenum, London, 1984, p.205-245.

157. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989, v. 1-3, p. 1626.

158. Sambrook J., Russel D.W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 3rd ed. ' Cold Spring Harbor Lab. Press, N.Y., 2001, v.l, ch. 7.

159. Sankaran K., Wu H.C. Lipid modification of bacterial prolipoprotein: transfer of diacylglycerol moiety from phosphatidylglycerol. J. Biol. Chem., 1994, v.269, p.19701-19706.

160. Schneider J.E., Reinhold V., Rumley M.K., Kennedy E.P. Structural studies of the membrane-derived oligosaccharides of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1979, v.254, p.l 0135-10138.

161. Schulman H., Kennedy E.P. Relation of turnover of membrane phospholipids to synthesis of membrane-derived oligosaccharides of Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1977, v. 252, p.4250-4255.

162. Shi W., Bogdanov M., Dowhan W., Zusman D. The pss and psd genes are • required for motility and chemotaxis in Escherichia coli. J. Bacterid., 1993, v.l75,p.7711-7714.

163. Sekimizu K., Bramhill В., Kornberg A. Sequential early stages in the in vitro initiation of replication at the origin of the Escherichia coli chromosome. J. Biol. Chem., 1988, v.263, p.7124-7130.

164. Sekimizu, Kornberg A. Cardiolipin activation of dnaA protein, the initiation protein of replication in Escherichia coli J. Biol. Chem., 1988, v.263, p.7131-7135.

165. Shibuya I. Metabolic regulations and biological functions of phospholipids in Escherichia coli. Prog. Lipid Res., 1992, v.31, p.245-299.

166. Skorko-Glonek J., Lipinska В., Krzewski K., Zolese G., Bertoli E., Tanfani F. HtrA heat shock protease interacts with phospholipid membranes and undergoes conformational changes. J. Biol. Chem., 1997, v.272, p.8974-8982.

167. Suzuki M., Нага H., and Matsumoto K. Envelope Disorder of Escherichia coli Cells Lacking Phosphatidylglycerol J. Bacterid., 2002, v.l84, p.5418-5425.

168. Suzuki I., Los D.A., Kanesaki Y., Mikami K., Murata., N. The pathway for perception and trunsduction of low-temperature signals in Synechocystis. -EMBO J., 2000, v.l9, p.1327-1334.

169. Suzuki H., Nishiyama K.-I., Tokuda H. Increases in anionic phospholipids contents specifically restore protein translocation in a cold-sensitive secA or secG null mutant. J. Biol. Chem., 1999, v.274, p.31020-31024.

170. Tommassen J., de Vrije Т., de Cock H., Bosch D., de Kruijff B. Involvement of membrane lipids in protein export in Escherichia coli. J. Cell Sci. Suppl., 1989, v.l 1, p.73-83.

171. Torriani A.M. Influence of inorganic phosphate in the formation of phosphatase by Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1960, v.38, p.460-466.

172. Torriani A.M. Alkaline phosphatase from Escherichia coli. In: Procedures in nucleic acid research (Cantoni G.L. and Davis R., eds.), Harper and Row, Publishers, N.Y., 1966, p.224-234.

173. Torriani-Gorini A. Introduction: the pho regulon of Escherichia coli. In: Phosphate Metabolism and Cellular Regulation in Microorganisms (Torriani-Gorini A., Yagil E., Silver S., eds.), Amer. Soc. Microbiol., Washington, D.C., 1994, p.1-4.

174. Ulbrandt N.D., London E., Oliver D.B. Deep penetration of a portion of Escherichia coli SecA protein into model membranes is promoted by anionic phospholipids and by partial unfolding. J. Biol. Chem., 1992, v.267, p.15184-15192.

175. Van den Brink-van der Laan E., Dalbey R.E., Demel R.A., Killian J.A., de Kruijff B. Effect of non-bilayer lipids on membrane binding and insertion of the catalytic domain of leader peptidase. Biochemistry, 2001, v.40, p.9677-9684.

176. Van der Does C., Swaving J., van Klompenburg W., Driessen A.J.M. Non-bilayer lipids stimulate the activity of the reconstituted bacterial protein translocase. J. Biol. Chem., 2000, v.275, p.2472-2478.

177. Van Klompenburg W., Paetzel M., de Jong J.M., Dalbey R.E., Demel R.A., von Heijne G., Kruijff B. Phosphatidylethanolamine mediates insertion of the catalytic domain of leader peptidase in membranes. FEBS Lett., 1998, v.431, p.75-79.

178. Van Voorst F., de Kruijff B. Role of lipids in the translocation of proteins across membranes. Biochem. J., 2000, v.347, p.601-612.

179. Wang H.-W., Chen Y., Yang H., Chen X., Duan M.-X., Tai P.C., Sui S.-F. Ring-like pore structures of SecA: Implication for bacterial proteinconduc-ting channels. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2003, v. 100, p.4221-4226.

180. Westphal 0., Luderitz Z. The formation of 2-keto-3-deoxyheptonic acid in . extracts of Escherichia coli B. J. Biol. Chem., 1959, v.234, p.705-709.

181. Zhang W.-Y., Inouye M., Wu H.C. Neither lipid modification nor processing of prolipoprotein is essential for the formation of murein bound lipoprotein in Escherichia coli. J. Biol. Chem., 1992, v.267, p. 19631-19635.

182. Yakushi, Т., Т. Tajima, S. Matsuyama, and H. Tokuda. Lethality of the covalent linkage between mislocalized major outer membrane lipoprotein and the peptidoglycan of Escherichia coli. J. Bacteriol., 1997, v. 179, p.2857-2862.

183. Yamada M., Makino K., Amemura M., Shinagawa H., Nakata A. Regulation of the phosphate regulon of Escherichia coli: analysis of mutant phoB and phoR genes causing different phenotypes. J. Bacteriol., 1989, v.171, p.5601-5606.

184. Yung B.Y., Kornberg A. Membraneattachment activates dnaA protein, the initiation protein of chromosome replication in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, v.85, p.7202-7205.

185. Xia W., Dowhan W. In vivo evidence for the involvement of anionic phospholipids in initiation of DNA replication in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v.92, p.783-787.

186. Wu H.C., Tokunaga M., Tokunaga H., Hayashi S., and Giam C.-Z. Posttranslational modification and processing of membrane lipoproteins in bacteria.-J. Cell Biochem., 1983, v.22, p.l61-171.

187. Wood J.M. Osmosensing by bacteria: signals and membrane-based sensors. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1999, v.63, p.230-262.

Информация о работе

Анисимова, Елена Васильевна
кандидата биологических наук
Пущино, 2006
ВАК 03.00.04

Диссертация

Зависимость экспрессии гена щелочной фосфатазы Escherichia coli от фосфолипидного состава цитоплазматической мембраны - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Зависимость экспрессии гена щелочной фосфатазы Escherichia coli от фосфолипидного состава цитоплазматической мембраны - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы