Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Участие анионных фосфолипидов цитоплазматической мембраны в секреции щелочной фосфатазы Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Калинин, Андрей Евгеньевич, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ

, ИМ. Г.К. СКРЯБИНА

На правах рукописи

УДК 575.224: 576.382: 577.217

КАЛИНИН АНДРЕЙ ЕВГЕНЬЕВИЧ

УЧАСТИЕ АНИОННЫХ ФОСФОЛИПИДОВ Ц ИГО IIЛ A3 MATH Ч ЕС КО Й МЕМБРАНЫ В СЕКРЕЦИИ ЩЕЛОЧНОЙ

ФОСФАТАЗЫ Escherichia coli

специальность 03.00.04 - биохимия

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, проф. М. А. Несмеянова

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.....................................................................................6

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................9

ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ

СЕКРЕТОРНОГО ПРОЦЕССА У БАКТЕРИЙ...........................9

1.1. Секреторный аппарат Е. coli.....................................................10

1.1.1. Цитоплазматические факторы секреции.............................10

1.1.2. Транслокационная АТФ-аза белок SecA............................13

1.1.3. Мембранная часть транслокационного аппарата..................14

1.1.4. Сигнальные пептидазы...................................................19

1.1.5. Каталитический цикл транслоказы белков-предшественников..............................................20

1.2. Особенности первичной структуры секретируемых белков.............23

1.2.1. Сигнальные последовательности.....................................23

1.2.2. Особенности структуры зрелой части

экспортируемых белков................................................25

ГЛАВА 2. УЧАСТИЕ ФОСФОЛИПИДОВ В СЕКРЕЦИИ БЕЖА...............27

2.1. Взаимосвязь секреции белка с составом и метаболизмом фосфолипидов....................................................................27

2.2. Участие анионных фосфолипидов в формировании сайта связывания и транслокации белка............................................29

2.3. Взаимодействие фосфолипидов с сигнальными последовательностями...........................................................29

2.4. Абсолютная необходимость анионных фосфолипидов для эффективной транслокации белка in vivo и in vitro.......................31

2.5. Участие анионных фосфолипидов в функционировании белковых компонентов секреторного аппарата........................................33

2.6. Необходимость непосредственного взаимодействия сигнальных последовательностей с анионными фосфолипидами.....................34

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ......................................................36

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................................36

ЗЛ. Бактериальные штаммы, бактериофаги и плазмиды......................36

3.2. Среды и условия культивирования..........................................36

3.3. Ферменты и реактивы...........................................................37

3.4. Методы работы с ДНК..........................................................37

3.5. Олигонуклеотиднаправленный мутагенез..................................38

3.6. Субклеточное фракционирование............................................39

3.7. Определение скорости превращения предшественника щелочной фосфатазы в зрелую форму in vivo..........................................40

3.8. Анализ состава и обмена фосфолипидов....................................41

3.9. Анализ интенсивности переноса глицерофосфата из фосфатидилглицерина на арбутин...........................................42

3.10. Выделение предшественников природной и мутантных форм щелочной фосфатазы...........................................................42

3.11. Приготовление липосом......................................................43

3.12. Взаимодействие предшественников природной и мутантных

форм щелочной фосфатазы с липосомами............*.....................43

3.13. Аналитические методы........................................................44

3.14. Стереохимический анализ....................................................44

ГЛАВА 4. ПОЛУЧЕНИЕ МУТАНТНЫХ ФОРМ ЩЕЛОЧНОЙ

ФОСФАТАЗЫ И ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ИХ СЕКРЕЦИИ.....................................................................45

4.1. Введение направленных мутаций в ген щелочной фосфатазы.........45

4.2. Изучение транслокации мутантных форм щелочной фосфатазы

через цитоплазматическую мембрану.......................................47

4.2.1. Замены заряженных аминокислот в N-концевом домене

зрелой полипептидной цепи PhoA не влияют на эффективность ее транслокации через мембрану.................50

4.2.2. Замены положительно заряженной аминокислоты

в N-концевом домене сигнального пептида prePhoA снижают эффективность секреции...................................52

4.2.3. Замены аминокислот вблизи места отщепления сигнального пептида приводят к полному ингибированию созревания prePhoA и его заякориванию в цитоплазматической мембране...................................................................53

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ БЕЛОК-ЛИПИДНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В ПРОЦЕССЕ ТРАНСЛОКАЦИИ prePhoA ЧЕРЕЗ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ МЕМБРАНЫ IN VIVO И IN VITRO.............55

5.1. Секреция мутантных prePhoA с отщепляемым сигнальным пептидом не влияет на состав и обмен фосфолипидов...................56

5.2. "Заякоривание" мутантных prePhoA в цитоплазматической мембране сопровождается накоплением анионных фосфолипидов

и усилением их обмена...........................................................58

5.3. Положительно заряженный аминокислотный остаток

в N-концевом домене сигнального пептида prePhoA участвует во взаимодействии с анионными фосфолипидами in vivo................61

5.4. Положительный заряд N-концевого домена сигнального пептида необходим для эффективного взаимодействия prePhoA

с модельными фосфолипидными мембранами in vitro...................67

5.5. Наличие положительно заряженного аминокислотного остатка в N-концевом домене сигнального пептида повышает стабильность предполагаемого комплекса "СП - анионный фосфолипид"............69

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНОЕ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ............................73

ВЫВОДЫ.......................................................................................79

ЛИТЕРАТУРА.................................................................................80

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ - аденозинтрифосфат АФЛ - анионные фосфолипиды КЛ - кардиолипин ФГ - фосфатидилглицерин ФК - фосфатидная кислота ФЭА - фосфатидилэтаноламин СП - сигнальный пептид ДДС-Na - додецилсульфат натрия ДТТ - дитиотреитол Х-Р - 5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат Трис - трис-(оксиметил)-аминометан ТХУ - трихлоруксусная кислота ЭДТА - этилендиаминтетраацетат А (А1а) - аланин Е (Glu) - глутаминовая кислота K(Lys) -лизин Р (Pro) - пролин Q (Gin) - глутамин R (Arg) - аргинин

С1ССР - карбонил-цианид-ж-хлорфенилгидразон IPTG - изопропил-р-В-тиогалактопиранозид PhoA - зрелая форма щелочной фосфатазы Escherichia coli PrePhoA - предшественник щелочной фосфатазы

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Многие белки, синтезируемые в цитоплазме бактерий, для осуществления своих функций должны транслоцироваться через цитоплазматическую мембрану и занять определенное место в клеточной оболочке бактериальной клетки. В оболочке локализуются белки, участвующие в гидролизе, транспорте и катаболизме питательных веществ, в генерации энергии и анаболических процессах. Секреция или экспорт белков лежит в основе биогенеза надмолекулярных клеточных структур и осуществлении взаимодействия клетки с окружающей средой. Таким образом, без выяснения молекулярного механизма секреции белков невозможно решить многие проблемы клеточной биологии и биотехнологии.

Состояние проблемы. Интенсивные исследования секреции белков у бактерий в течение последних 10-15 лет позволили охарактеризовать основные этапы этого процесса. Белки, предназначенные для экспорта из цитоплазмы, синтезируются в виде предшественников, содержащих экспортные сигналы или сигнальные последовательности, отщепляемые после завершения транслокации. Именно в сигнальных последовательностях содержится информация о взаимодействии с мембраной и компонентами секреторного аппарата, осуществляющего перенос гидрофильной молекулы белка через гидрофобную мембрану. Секреторный аппарат Escherichia coli состоит из семи Sec белков (см. Wickner, Leonard, 1996). Этапы, осуществляемые секреторным аппаратом, включают в себя узнавание белков, предназначенных для экспорта, направление их к мембране и последующую транслокацию через нее.

В то же время, установить точный молекулярный механизм секреции белков нельзя без выяснения роли мембранных фосфолипидов, определяющих барьерные свойства биологических мембран. С другой стороны, структурная, метаболическая и механическая динамичность фосфолипидов может способствовать транслокации белка через мембрану.

На основе данных о корреляции секреции белка с изменениями состава и обмена фосфолипидов (Евдокимова, Несмеянова, 1977; Землянухина и др., 1981), в нашей лаборатории была впервые предложена модель вовлечения фосфолипидов в этот процесс (Nesmeyanova, 1982). Модель предусматривала прямое взаимодействие белков-предшественников с анионными фосфолипидами с участием положительно заряженных аминокислот N-конца сигнального пептида и зрелой полипептидной цепи. В настоящее время показано, что анионные фосфолипиды, составляющие всего 20% фосфолипидов мембран, абсолютно необходимы для встраивания сигнальных пептидов в модельные липидные мембраны (Demel et al., 1990), эффективной транслокации белка в мембранные везикулы in vitro (Küsters et al., 1991; Küsters et al., 1994) и функционирования отдельных компонентов секреторной машины (Lill et al., 1990). Однако, до сих пор не было получено доказательств непосредственного взаимодействия сехретируемого белка с анионными фосфолипидами in vivo.

Целью данной работы было изучение роли положительно заряженных аминокислотных остатков щелочной фосфатазы E.coli в транслокации этого белка через мембрану и во взаимодействии с анионными фосфолипидами. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1) получить мутантные формы щелочной фосфатазы с заменами положительно заряженных аминокислот, предположительно участвующих во взаимодействии с анионными фосфолипидами;

2) изучить влияние этих замен на эффективность транслокации белка in vivo;

3) изучить особенности взаимодействия мутантных белков с фосфолипидами in vivo и in vitro;

4) провести стереохимический анализ взаимодействия сигнального пептида природной щелочной фосфатазы и ее мутантных форм с анионными фосфолипидами.

Научная новизна работы: Впервые показано прямое взаимодействие секретируемого белка с анионными фосфолипидами в живой бактериальной клетке в процессе транслокации белка через цитоплазматическую мембрану. Более того, обнаружено, что изменения структуры белка или фосфолипидов, нарушающие это взаимодействие, приводят как к снижению эффективности транслокации белка через мембрану in vivo, так и к снижению эффективности встраивания сигнальной последовательности в модельные фосфолипидные мембраны in vitro. Совокупность полученных в работе данных позволяет с большой долей уверенности утверждать, что роль положительно заряженного аминокислотного остатка в N-концевом домене сигнального пептида заключается в обеспечении стабильности комплекса "сигнальный пептид - анионный фосфолипид", необходимой для эффективной инициации секреции белка.

Научно-практическое значение работы: Научно-практическое значение работы состоит в том, что в ней получены результаты, углубляющие понимание механизма секреции белков у бактерий. Выявленные в работе закономерности могут использоваться в качестве теоретических основ для разработки путей оптимизации секреции гомологичных и гетерологичных белков клетками микроорганизмов, широко применяемой для получения полипептидов, необходимых в медицине и народном хозяйстве.

Научно-методическое значение работы заключается в том, что в ней применен новый способ получения мутантных форм щелочной фосфатазы E.coli. Для этого разработан простой метод введения мутаций в ген phoA, позволяющий избежать этап гибридизации с меченным мутагенным олигонуклеотидом и вести прямой отбор мутантных клонов по окраске на чашке с субстратом щелочной фосфатазы. Кроме того, предложен новый удобный способ сравнительной оценки содержания фосфатидилглицерина в цитоплазматической мембране E.coli.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. ОСНОВНЫЕ ПРИНЦИПЫ ОРГАНИЗАЦИИ СЕКРЕТОРНОГО ПРОЦЕССА У БАКТЕРИЙ

Одним из центральных процессов жизнедеятельности бактериальной клетки является секреция белков в различные клеточные компартменты. В грам-отрицательных бактериях белки должны экспортироваться в три основных компартмента клеточной оболочки: цитоплазматическую мембрану, периплазматическое пространство и внешнюю мембрану. Начальные стадии экспорта всех белков, а именно - встраивание в и перенос через цитоплазматическую мембрану, происходят по общему механизму. Этот процесс оказался консервативным среди бактериальных видов, причем грам-положительные бактерии и архебактерии применяют одинаковый клеточный аппарат для секреции белков. Более того, основным компонентам экспортной машины, локализованным в цитоплазматической мембране бактерий, соответствуют гомологи в эукариотических клетках. От дрожжей Saccharomyces cerevisae до микросом поджелудочной железы собаки, транслокационный аппарат в мембране эндоплазматического ретикулума включает гомологи, по крайней мере, двух компонентов секреторной машины прокариот (Hartmann et al, 1994). Секреторный аппарат Escherichia coli включает цитоплазматические шаперонины: белки SecB, GroEL/ES, DnaK и другие, мембранный комплекс SecY/E/G/D/F/YajC, транслокационную АТФ-азу белок SecA и анионные фосфолипиды (Wickner, Leonard, 1996).

Экспорт белков включает в себя следующие основные этапы. Белки, предназначенные для клеточной оболочки, синтезируются с экспортными сигналами или сигнальными последовательностями (СП). В случае периплазматических белков или белков внешней мембраны, эти сигнальные последовательности расположены на N-конце и отщепляются от белка во время транслокации через цитоплазматическую мембрану. В случае белков цитоплазматической мембраны, эти сигналы обычно не отщепляются. У этого класса белков сигнальные последовательности могут располагаться на N-конце

или внутри белка и могут служить одновременно и экспортными сигналами и мембранными доменами в "собранном" белке. Сигнальные последовательности узнаются внутри клетки экспортным аппаратом. Это узнавание происходит еще до завершения трансляции белка, хотя транслокация через мембрану не полностью сопряжена с трансляцией. По-видимому, экспорт белка начинается только после синтеза значительной части полипептидной цепи (Randall, 1983). Более того, в некоторых случаях транслокацию белка можно наблюдать после завершения его трансляции и освобождения из рибосомы (Lee, Beckwith, 1986). Этот посттрансляционный экспорт наблюдается при каких-либо нарушениях экспорта, например, при снижении эффективности сигнальной последовательности из-за мутации. В противоположность этому, секреция белка в эукариотических клетках тесно сопряжена с трансляцией.

1.1. Секреторный аппарат E.coli.

Этапы, осуществляемые секреторным аппаратом, включают в себя узнавание белков, предназначенных для экспорта, направление их к мембране и последующую транслокацию через нее. Экспортный аппарат E.coli (табл. 1) был охарактеризован, в основном, благодаря генетическим исследованиям, а его функционирование изучалось с помощью комбинации генетических и биохимических подходов, а также при реконструкции процесса секреции in vitro (Bieker et al, 1990; Schatz, Beckwith, 1990; Wickner et cd., 1991).

1.1.1. Цитоплазматические факторы секреции.

SecB. Белок SecB, функционирующий в виде тетрамера (Watanabe, Blobel, 1989b), необходим для поддержания транслокационно-компетентной "развернутой" конформации некоторых секретируемых белков (Kumamoto, Beckwith, 1985). Показано, что SecB взаимодействует с заряженными участками белка-предшественника, благодаря чему наружу экспонируются гидрофобные участки белка (Randall, 1992; Topping, Randall, 1994). Вторая

11

Таблица 1

Генетические локусы, вовлеченные в экспорт белков у Е.сой

Ген (расположение) Белок, размер, субклеточная локализация Существенность Количество молекул белка в клетке*

secA (2.5 мин) SecA, 102 кДа, периферический цитоплазматической мембраны, цитоплазма Да 2500-5000

secB (81 мин) SecB, 16.6 кДа, цитоплазма Нет -

secY-prlA (72 мин) SecY, 49 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Да 300-600

secE (89 мин) SecE, 13.6 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Да 200-400

secD (9.5 мин) SecD, 67 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Нет 7-30

secF (9.5 мин) SecF, 35 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Нет 7-30

secG (69 мин) SecG (р12, полоса 1), 11.4 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Нет

ïfs 4.5 S РНК, цитоплазма Нет -

ffh Fifa, 48 кДа, цитоплазма Нет -

ftsY FtsY, 48 кДа, цитоплазма Нет •

lepB (55.5 мин) Lep, 36 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Да -

IspA (0.5 мин) Lsp, 18 кДа, интегральный цитоплазматической мембраны Да -

*Г1о Driessen. 1994

предполагаемая функция БесВ заключается в направлении белков к мембране, где расположена так называемая АТФ-зависимая транслоказа (см. ниже) (НоЙзс1ш11е г1 а1., 1994). Определенно известно, что при отсутствии БесВ даже развернутый предшественник мальтозосвязывающего белка экспортируется значительно менее эффективно, чем в его присутствии (СоШег, ВаэзГогс!, 1989).

Секреция щелочной фосфатазы (РЬоА), которая обычно не зависит от БесВ, может, при определенных условиях, становиться БесВ-зависимой. Так, например, при низкой температуре (Кшика\уа а1., 1989) или при секреции

щелочной фосфатазы, лишенной сигнального пептида, в prlA мутантах (Derman et al., 1993), отсутствие SecB существенно лимитирует транслокацию этого фермента. В этих условиях, по-видимому, PhoA сворачивается в цитоплазме более интенсивно из-за низкой темпе�