Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение роли первичной структуры сигнального пептида в секреции щелочной фосфатазы Escherichia coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Изучение роли первичной структуры сигнального пептида в секреции щелочной фосфатазы Escherichia coli"



На правах рукописи

УДК 575.224: 576.382: 577.217

КАРАМЫШЕВА ЗЕМФИРА НИКОЛАЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ СИГНАЛЬНОГО ПЕПТИДА В СЕКРЕЦИИ ЩЕЛОЧНОЙ ФОСФАТАЗЫ Escherichia coli

специальность 03.00.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов РАН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор М.А. Несмеянова кандидат биологических наук В.Н. Ксензенко

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Н.И. Матвиенко доктор биологических наук, профессор В.М. Степанов

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится 1997 Г- в

на заседании диссертационного совета Д 053.05.70

при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, лабораторный корпус А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке. Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь ^

диссертационного совета, кандидат химических наук , В.Н. Каграманов

Актуальность проблемы. Многие белки, синтезируемые в цитоплазме ктерий, секретируются за пределы плазматической мембраны. Несмотря на ачительные успехи в понимании молекулярных основ белкового топогенеза, ханизм переноса гидрофильных молекул секретируемых белков через црофобный липидный бислой мембран остается еще во многом неясным, льшинство секретируемых белков синтезируется в виде предшественников, держащих на N-конце сигнальный пептид, необходимый для транслокации яка через мембрану. При отсутствии строгой гомологии в аминокислотных следовательностях сигнальные пептиды имеют ряд общих черт и содержат ложительно заряженный N-концевой домен, центральную гидрофобную сть и более полярную С-концевую область. В то время как решающая роль црофобной части сигнального пептида в транслокации белка через мембрану статочно хорошо изучена, о роли N-концевого домена известно значительно ныне. Наличие положительно заряженных остатков в указанном домене гнального пептида является важным для транслокации липопротеина (Inouye al., 1982), OmpA (Tanji et al., 1991) и OmpF-Lpp (Sasaki et al., 1990).), но существенным для белка PhoE (Bosch et al., 1989). Таким образом, вопрос о обходимости положительного заряда этого домена остается до сих пор крьггым.

С-концевая область сигнального пептида особенно интересна из-за ее влечения в специфическое взаимодействие с сигнальной пептидазой, уществляющей процессинг. С помощью статистического анализа инокислотных последовательностей сигнальных пептидов про- и эукариотов шо установлено, что в -3 и -1 положениях встречаются только небольшие йтральные аминокислотные остатки (правило "-3, -1"). Изучение мутантных кретируемых белков с единичными аминокислотными заменами идетельствовало о важности этих положений в созревании белка. Подробное учение влияния аминокислотных замен в С-концевом домене сигнального птида на процессинг проведено только у двух белков: мальтозосвязывающего лка (МБР) и белка оболочки фага М13 (Fikes et al., 1990; Shen et al., 1991; ircocy-Gallagher et al., 1994). Несмотря на то, что в целом работа по МВР «тверждала правило "-3, -Г', детальный анализ процессинга был щественно затруднен наличием альтернативного сайта отщепления гнального пептида. Кроме того, результаты по изучению мутаций в белке юлочки фага М13 указывали на то, что детерминантами специфичности

лидерной пептидазы могут быть не только аминокислотные остатки положен» -1, -3, но и Pro, находящийся на границе гидрофобного и С-концевог доменов. До сих пор остаются дискуссионными вопросы о размере областа вовлеченной во взаимодействие с лидерной пептидазой, о том, насколько важн природа аминокислотных остатков в положениях -1, -3 и вне этих позиций да процессинга.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение влияня аминокислотных замен в N- и С- концевых доменах сигнального пептид; щелочной фосфатазы Е. coli на секрецию и процессинг этого белка. ] соответствии с целью были определены следующие задачи исследования:

1) С помощью амбер-супрессорного мутагенеза получить широкий набо| мутантных белков с заменами аминокислот в N- и С- концевых домена; сигнального пептида щелочной фосфатазы.

2) -Изучить эффективность транслокации через цитоплазматическук мембрану мутантных белков с заменами положительно заряженного лизина N-концевого домена сигнального пептида щелочной фосфатазы на нейтральные у отрицательно заряженные аминокислотные остатки.

3) Провести систематическое изучение влияния аминокислотных замен расположенных в положениях -5, -4, -3, -2, -1 сигнального пептида щелочной фосфатазы, на процессинг этого белка.

Научная новизна работы. Применение амбер-супрессорного мутагенеза, основанного на подстановке аминокислот амбер-супрессорными тРНК в позицию соответствующую амбер-мутации в гене phoA, позволило получить большой набор новых мутантных форм щелочной фосфатазы Е. coli. В работе детально изучено влияние аминокислотных замен, расположенных в N- и С-концевых доменах сигнального пептида, на секрецию и процессинг этого белка. Показано, что эффективность транслокации щелочной фосфатазы через мембрану определяется природой аминокислоты в -20 положении N-концевого домена сигнального пептида. Проведенный стереохимический анализ комплекса "сигнальный пептид-фосфолипид" позволяет предположить, что эффективность секреции обеспечивается стабильностью комплекса, образуемого при инициации секреции. Анализ влияния аминокислотных замен, расположенных в С-концевом домене сигнального пептида, свидетельствует о важной роли структуры указанной области и представляет новое экспериментальное подтверждение правила "-3, -1". В настоящей работе 2

сазано, что для эффективного процессинга белка необходима определенная уктура аминокислотных остатков вне позиций -3 и -1.

Научно-практическое значение работы. Полученные в работе данные о [янии аминокислотных замен в N- и С- концевых доменах сигнального ггида щелочной фосфатазы на процессинг и секрецию этого фермента ширяют наше представление о механизме важнейшего клеточного процесса ;екреции белков. Несмотря на то, что настоящая работа относится к здаментальным исследованиям, использование амбер-супрессорного агенеза для получения мутантных белков может иметь также практическое чение. Этот подход особенно эффективен для быстрого скрининга большого ичества аминокислотных замен в экспериментах по белковой инженерии, дменение амбер-супрессорного метода для изучения секреции белков [ественно расширяет границы его использования. Кроме того, в последнее мя все большее значение приобретает проблема вывода из клетки белков, дставляющих интерес для биотехнологии. В связи с этим данные о влиянии шокислотных замен на секрецию могут быть использованы при струировании векторных систем, позволяющих секретировать из клетки евые белки.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на сдународной конференции "Molecular genetics of bacteria and phages" (Cold ing Harbor, 1995), на 23-ей конференции FEBS (Basel, 1995), на (дународной школе "Molecular dynamics of biomembranes" (Cargese, France, 5), на конференции. "Биосинтез и деградация микробных полимеров, адаментальные и прикладные аспекты" (Пущино, 1995), на международной ференции посвященной памяти A.A. Баева (Москва, 1996), на симпозиуме >tein transport and stability" (Berlin, 1996), на Втором съезде Биохимического гества РАН (Москва, 1997), на 17-ом Интернациональном Конгрессе по ■химии и Молекулярной биологии (San Francisco, USA, 1997) и на научных ференциях Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН щино, 1995, 1996).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора ;ратуры, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и ска литературы (202 ссылки). Работа изложена на 118 страницах, содержит 4 гицы и 26 рисунков.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Для введения амбер-мутаций в ген щелочной фосфатазы Е. coli iphoA использовали олигонуклеотиднаправленный мутагенез (Sambrook et al., 1989 Для увеличения выхода мутантных клонов применен принцип селекцт основанный на элиминации цепи ДНК, несущей две амбер-мутации в гена фага М13тр8, после трансформации в бессупрессорный штамм Е. coli (Kramei Fritz, 1987; Goff et al., 1987). Отбор мутантных клонов осуществляли с помощы гибридизации с 5'-32Р-меченным мутагенным олигонуклеотидом (Zoller, Smitl 1983). Наличие мутаций в гене phoA подтверждали секвенированием ДН] (Sanger et al., 1977; Sambrook et al., 1989). Для получения мутантных щелочны фосфатаз плазмиду, содержащую ген phoA с амбер-мутацией, вводили штаммы Е. coli, продуцирующие амбер-супрессорные тРНК и имеющи делецшо гена phoA. Для экспрессии щелочной фосфатазы использовал] синтетическую среду (Torriani, 1966).

Определение скорости превращения предшественника щелочно] фосфатазы в зрелую форму (процессинга) проводили с помощью импульснаг мечения белков in vivo с последующей иммунопреципитацией, электрофорезо? и радиоавтографией по описанному ранее методу (Michaelis et al., 1986 Карамишев и др., 19946) с модификациями. Денситометрию радиоавтографе проводили на лазерном денситометре "UltroScan" ("Pharmacia LKB") и го площади пиков (с учетом количества метионинов) рассчитывали относительно количество зрелой щелочной фосфатазы и ее предшественника.

Субклеточное фракционирование (Manoil, Beckwith, 1986) и протеазнук обработку (Akiyama, Ito, 1989; Jain et al., 1994) проводили, как описано ранее.

Определение изоформ щелочной фосфатазы проводили путем выявление активной щелочной фосфатазы непосредственно в геле после электрофорез; белков в неденатурирующих условиях обработкой а-нафтилфосфатом i красителем прочным красным (Лойда и др., 1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Введение аминокислотных замен в щелочную фосфатазу Е. coli с помощью амбер-супрессорных тРНК

Для получения широкого набора мутантных белков вместо лассического" сайт-направленного мутагенеза был применен амбер-пгрессорный метод, который включает а) введение амбер-мутаций с помощью игонуклеотиднаправленного мутагенеза в соответствующие положения гена уточной фосфатазы (phoA) и б) экспрессию мутантных генов в штаммах Е. 7, содержащих гены амбер-супрессорных тРНК. В бессупрессорном штамме coli амбер-мутация в гене phoA приводит к преждевременной терминации знсляции, тогда как в" штаммах, содержащих амбер-супрессоры, нтезируются мутантные белки. В настоящей работе для введения инокислотных замен были использованы как "классические" амбер-¡рессоры, гены которых имеют хромосомную локализацию, так и кусственные амбер-супрессоры, клонированные в плазмидном векторе leina et al., 1990). Применение указанного метода позволило получить 65 гантных белков с заменами аминокислот в N- и С-концевых доменах гнального пептида щелочной фосфатазы (рис. 1).

Д Сайт продессинга

-5-4 -з -2 -1 1+1 Lys Gin Se r Th г lleAla Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr| | Va I Thr Lys Ala Arg Thr Lys Gin Ser Thr lleAla Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr P ro | | Th r Lys Ala Arg Thr . Lys Gin Ser Thr lleAla Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Va I [__|Lys Ala Arg Thr : Lys Gin Ser Thr lleAla Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Val Thr| | AI a Arg Thr Lys Gin Ser Thr lleAla Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Va I Thr Lys | |Arg Th r

Аминокислоты, подставляемые амбер-супрессорными тРНК : ф

|Lys| |Phe| |Gly| |His| |Pro| |Cys| |Ala| |Glu| |Tyr| |Ser| |Gln| |Leu| -'

Б

-20

: I I Gin Ser Thr lleAla Leu Ala Leu Leu Pro Leu Leu Phe Thr Pro Va I Th r Lys Ala Arg Thr

L Аминокислоты, подставляемые амбер-супрессорными тРНК : ]Lys[ |Pho[ [Gly| |Н is| |Pro| |Cys| |Ala| |Glu| |Tyr|

1с. 1. Схема замен аминокислот в области сайта продессинга (А) и 1Ч-концевом мене сигнального пептида щелочной фосфатазы (Б).

2. Положительно заряженный лизин N-концевого домена сигнального пептида определяет эффективность секреции щелочной фосфатазы

Транслокация щелочной фосфатазы через цитоплазматическую мембран Е. coli является важным этапом биогенеза белка. Она сопровождаете лроцессингом - отщеплением сигнального пептида и превращение] предшественника в зрелую полипептидную цепь. На следующем этап биогенеза происходит сборка активных макромолекул фермента nyrei димеризации его субъединиц и образования дисульфидных связей, которы осуществляются в периплазме только после полного завершения транслокаци белка через цитоплазматическую мембрану. Таким образом, щелочна фосфатаза Е. coli приобретает ферментативную активность только в периплазм после пересечения цитоплазматической мембраны (Boyd et al., 1987). Наличи фосфатазной активности у продуцентов мутантных щелочных фосфатаз заменами аминокислот в N-концевом домене сигнального пептид свидетельствует о том, что все мутантные белки способны к транслокации чере мембрану и формированию активной молекулы фермента в периплазме Эксперименты с импульсным мечением белка in vivo с последующа иммунопреципитацией и электрофоретическим разделением предшественника j зрелой формы показали, что замена Lys(-20) на Glu, Ala, Plie, Pro, Gly и Су снижала скорость созревания белка, в то время как введение His и Туг н оказывало существенного влияния (рис. 2).

Для выяснения причины снижения скорости созревания белков, а и: может быть две - снижение скорости транслокации, либо ухудшен» отщепления сигнального пептида лвдерной пептидазой, была изучен; локализация импульсно-меченных предшественников мутантных белков i помощью протеазной обработки и субклеточного фракционирования (рис. 3). I случае нарушения процессинга, происходящего с наружной сторонь цитоплазматической мембраны, следовало ожидать обнаружен» предшественников белков в периплазме или цитоплазматической мембране, i случае нарушения транслокации - з цитоплазме. Известно, что предшественнш щелочной фосфатазы, находящийся в цитоплазме, чувствителен к протеолиз; (Li et al., 1988; Akiyama, Ito, 1989; Chou, Kendall, 1990), в то время Kai пересекший цитоплазматическую мембрану предшественник мутантног щелочной фосфатазы с неотщепляемым сигнальным пептидом в результат« изменений в сайте процессинга, так же как и зрелая форма, устойчив к

>теолизу (Jaúl et al., 1994). Мы обнаружили, что предшественники всех гантных щелочных фосфатаз чувствительны к нротеиназе К, чю щетельствует об их цитоплазматической локализации (рис. 3 А). "3го было же подтверждено и результатами субклеточного фракционирования. 1' [естве примера на рис. 3 Б представлены результаты субклеточного жционирования для штаммов Е. coli, продуцирующих белок дикого типа и ;ок с Ala в -20 положении. Таким образом, получены доказательства влияния [ен аминокислот в N-концевом домене сигнального пептида щелочной :фатазы на транслокацию указанного белка через мембрану.

Зрелый белок, %

100-, г—1 —II—1|—

50 - '

0 -1 —П—Л— —II—II— —II—II—II—II— —II—II—II—II—

_ ,_picPlioA

,0.1 1.0 5.0 60.0, |0.t 1 0 5.0 60 0||0.1 1.0 5 0 óOJ^fU^I.O SO 60.0,,0.1 1.0 5Л1600.

Su- Туг Ala Glu Pro

Зрелый белок, % 100

50

0

т ^ __piePhoA

[0.1 10 5.0 60.0,,0.1 10 50 60.0,0 1 1.0 5 0 бО.О^О.! 1.0 5.0 60.0 р 1 1.0 5.0 60.0,

His Cys Phe Gly Lys

. 2. Созревание мутантных щелочных фосфатаз с заменами аминокислот в Раневом домене сигнального пептида in vivo. Белки метили (3-S]mcthohhhom в :ние 60 сек, включение метки останавливали добавлением нерадиоактивного ионина с последующей инкубацией в течение 0,1, 1,0, 5,0, 60,0 мин (время >ано на рисунке). Образцы подвергали иммунопреципитации, анализировали строфорезом в 10 % ПААГ с последующей радиоавтографией и денси-етрией. Бессупрессорный штамм Е. coli (Su-) использовали как контроль.

Lys His Glu Pro Tyr Cys Pile Gly Ala

i-¡i-¡i-и-и-Ii-Ii-Ii Ii I

prcPhoA—, . PlioA-'

Протеиназа К , +. + _+ + +_+.+- + и CHAPS -++ + ++ +

Lys(-20) Ala(-20)

1 2 3 4 1 2 3 4

Рис. 3. Локализация предшественников мутантных щелочных фосфатаз с заменами аминокислот в N-концевом ломене сигнального пептида. А - Обработка мутантных щелочных фосфатаз протеиназой К. Б - Субклеточное фракционирование штаммов Е. coli, продуцирующих щелочную фосфатазу дикого типа |Lys(-20)| и мутантный белок с Ala в -20 положении. 1 - целые клетки; 2 - периплазматическая, 3 - цитоплазматическая, 4 - мембранная фракции. После иммунолрецилитации с антителами против щелочной фосфатазы образцы анализировали электрофорезом в 10% ПААГ с последующей радиоавтографией. *

Согласно предложенной ранее модели секреции положительно заряженный И-конец сигнального пептида может взаимодействовать с анионными фосфолипидами при инициации транслокации белка через цитоплазматическую мембрану (№$теуапоуа, 1982; Ыевтеуапоуа, Вов<1апоу, 1989). С помощью стереохиммческого анализа показана возможность образования комплекса "сигнальный пептид-фосфолипид" за счет водородных связей между пептидными группами сигнального пептида и атомами кислорода фосфатной и карбонильной групп липида (КаЗа\а й а1., 1991). В настоящей работе проведен стереохимический анализ комплекса "сигнальный пептид-фосфолипид" для мутантных белков, а также для белка дикого типа (рис. 4). Ьу$(-20) сигнального пептида белка дикого типа может взаимодействовать с

трицательно заряженной фосфатной группой липидной молекулы, например юсфатидилглицеролом, и стабилизировать водородные связи в комплексе сигнальный пептид-фосфолипид" за счет электростатического взаимодействия, лализ комплексов "сигнальный пептид-фосфолипид" с Туг(-20) и His(-20) оказывает, что эти остатки способны образовывать дополнительные одородные связи с полярной головкой липидной молекулы и благодаря этому омпенсировать отсутствие электростатического взаимодействия. Замены -ys(-20) на Ala, Gly, Glu, Plie и Pro элиминируют благоприятное пектростатическое взаимодействие и не добавляют новых водородных связей, 'ти комплексы имеют более низкую стабильность, чем комплекс с белком икого типа, и возможно с этим связано снижение скорости секреции.

Lys(-20,

His(-20)

Рис. 4. Стереохимкческая модель комплекса "сигнальный пептид-фосфатидилглицерол" для белка дикого типа (А) и мутантных белков с His (Б), Туг (В) и Ala (Г) в -20 положении. Пептидная цепь N-конца сигнального пептида отмечена серым цветом, а фосфатадилглицерол - черным. R-группы аминокислотных остатков, за исключением остатка в -20 положении, а также атомы водорода не указаны. Атомы углерода отмечены черным цветом, кислорода - белым, азота - серым. Водородные связи между пептидными группами и полярной головкой фосфати-дилглицерола обозначены тонкими прерывистыми линиями, а ионные пары между положительно заряженным аминокислотным остатком в -20 положении и отрицательно заряженной фосфатной группой обозначены толстыми прерывистыми линиями.

Ранее предполагалось, что положительно заряженные аминокислотные остатки сигнального пептида требуются для взаимодействия сигнального пептида с белковыми компонентами секреторного аппарата клетки, например белком SecA (Akita et al., 1990). Мы предполагаем, что белок SecA способен катализировать образование комплекса "сигнальный-пептид-фосфолипид" и стабилизировать его. Указанный белок вполне подходит для этой роли, так как его функция зависит от анионных фосфолипидов (Lill et al., 1990) и он может взаимодействовать с сигнальным пептидом (Akita et al., 1990).

3. Природа аминокислотных остатков С-концевого домена сигнального пептида щелочной фосфатазы важна для процессинга

Анализ созревания мутантных белков с заменами аминокислот в С-концевом домене сигнального пептида в первую очередь свидетельствует о том, что наиболее критическими для процессинга являются положения -1 и -3 (рис. 5, 6). Введение Phe, Туг, Lys, Glu, Gin, His в указанные положения, а также Leu в -I и Pro в -3 положение приводит к полному нарушению процессинга. Полученные результаты является новым экспериментальным подтверждением правила "-3, -1", выведенным Вон Хейном (von Heijne, 1983, 1984) на основании статистического анализа аминокислотных последовательностей сигнальных пептидов. Интересно отметить, что несмотря на то, что Gin и Cys встречаются в -1 положении эукариотических сигнальных пептидов (von Heijne, 1983; Watson, 1984), введение этих аминокислотных остатков в -1 положение сигнального пептида щелочной фосфатазы Е. coli приводило к полному или существенному нарушению процессинга, соответственно. Из 12 проверенных аминокислотных остатков в -1 положении только Ala обеспечивал быстрый процессинг Эти данные свидетельствуют в пользу более высокой консервативности прокариотических последовательностей в области "-3, -1" по сравнению с эукариотическими и указывают на то, что взаимодействие лидерной пептидазы с сайтом отщепления сигнального пептида происходит более эффективно при наличии в положении -1 аланина. Следует отметить, что именно эта аминокислота чаще других присутствует в положении -1 многих секретируемых белков (von Heijne, 1983, 1984; Watson, 1984).

В настоящей работе установлено, что помимо высокой консервативности -3 и -1 положений для эффективного процессинга необходима определенная

Аминокислота г Ala

РЬе

Gly

Cys

Lys

His

Glu

Pro

Туг

Leu

Gin

Ser

Положение аминокислотной замены -1 -2 -3 -4 -5

-И-8-1(-Ц---,

0.1 1 5 60 0,1 I 5 6И(М 1 5 60 0 1 I 5 (Л 6,1 1 5 {,0 -— мин

. picPhoA —PlwA

i pí'cPlioA

F-PlioA

_ «nicPiioA

г а — —V-—1чк>А

PiCÍ'uoA --PÍHIA

„LnrcPhoA -Г PI и'Л

L ¡не ÏMuvV • г-1ЧюЛ

urcPlioA -PlioA

.pu-PlHíA

pa-Ph^A -—P'niA

nicPh^A -—Pí:oA

1 pu-PhoA -t--PhnA

iiicPhaA "iii)A

®ис. 5. Созревание мутантных щелочных фосфатаз с заменами аминокислот в С-юнцевом домене сигнального пептида. Белки метили [358]метионином в течение 60 :ек, включение метки останавливали добавлением нерадиоактивного метионина с юследующей инкубацией в течение 0,1, 1,0, 5,0, 60,0 мин (время указано на шсунке). Образцы подвергали иммунопрецилитации и анализировали лектрофорезом в 10 % ПААГ с последующей радиоавтографией.

mm

Зрелый белок, % юо i

20

Jl

Ala Ser Gly Plie Туг Glu Lys Leu Gin His Cys Pro

Аминокислота в положении -1

Зрелый белок, %

100 i

AI» Ser Gly í'he Tyr Glu lys Leu Gln His Cys Pro Аминокислота в положении -3

Зрелый белок, % юо

и

AU Ser Gly Pbe Tyr Glu Lys Leu Gin His Cys Pro Аминокислота в положении -2

Зрелый белок, % юо

Ab Ser Gly Pbe Tyr Glu Lys Leu Glu Hb Cys Pro Аминокислота в положении -4

Зрелый белок, loo

AU Ser Gly Phc Туг Glu Lys Leu Gin His Cys Pro

Аминокислота в положении -5

Рис. 6. Влияние аминокислотных замен в С-концевом домене сигнального пептида на созревание белка. Представлено относительное содержание зрелой формы щелочной фосфатазы после 0,5; 1,0; 5,0; 60,0 мин процессинга соответственно для каждого мугантного белка (в %).

структура всей области от -1 до -5. В подавляющем большинстве случаев быстрое созревание белка происходило при наличии в -2 положении аминокислотных остатков с большими R-группами (Phe, Glu, Gin, Lys, Туг, Leu и His). Следует отметить, что статистическим анализом аминокислотных последовательностей также были выявлены преимущественно большие аминокислотные остатки в положении -2 (von Heijne, 1983). Вполне вероятно, что наличие больших аминокислотных остатков требуется для правильной ориентации сайта процессинга, при когорой R-группы аминокислот в положениях -1 и -3 ориентированы во внутреннее пространство активного центра лидерной пептидазы, а R-группа аминокислоты (-2) имеет внешнее расположение. Результаты анализа созревания мутантных белков с заменами аминокислот в -5 положении позволяют предположить, что для эффективного процессинга требуется наличие аминокислотного остатка среднего размера в указанном положении. В то время как введение Plie, Leu, Туг, His (большие) и Ala, Gly (маленькие) снижает скорость созревания, замены же на Glu, Gin, Cys 12

i Ser не оказывают существенного влияния. Размер аминокислотного остатка в 5 положении может быть важен для комплементарного связывания с лидерной 1ептидазой. Замены аминокислот в -4 положении были менее существенны для фоцессинга. Небольшое снижение его скорости наблюдалось только для ¡елков с Gly(-4) и Lys(-4).

Для доказательства того, что влияние аминокислотных замен на юзревание белка обусловлено нарушением отщепления сигнального пептида [идерной пептидазой был проведен анализ изоферментых спектров мутантных цепочных фосфатаз (рис. 7). Известно, что зрелая щелочная фосфатаза Снаруживается с помощью электрофореза в неденатурирующих условиях и жраски геля по ферментативной активности в виде трех изоформ (Nakata et al., 987), а транслоцированный предшественник с неотщепленным сигнальным гептидом - в виде высокомолекулярных форм (Nesmeyanova et al., 1994). ^транслоциро ванный предшественник щелочной фосфатазы в этих условиях ie выявляется вследствие отсутствия у него ферментативной активности. В истоящей работе мутантные щелочные фосфатазы с полным нарушением озревания были выявлены в виде характерных для транслоцированного

^т-^^счГсчГсм ín uT úT uT з 2

о «л <u э со o w <u ra <n t- r-i o

t_>»jc<i>rHt->>x:"—i >» :>> ra x: .—i

Q- O Q. _1 < Q. O o. < _l I— > O. o

» и

Ü

j^k

"wwjjP

4

Hr II ^III

'ис. 7. Изоферментные спектры мутантных щелочных фосфатаз.

, II, III - изоформы белка дикого типа PhoA(wt); m - мультимеры этого белка, лнтролями служили неспособный к транслокации белок с заменой А1а(-13) на ilu (Michaelis et al., 1986) и непроцессирующийся предшественник с заменой Ja(-l) на Val, транслокация которого через. цитоплазматическую мембрану ыла доказана ранее (Nesmeyanova et al., 1994). Активность фермента выявляли «посредственно в геле после электрофореза в неденатурирующих условиях.

предшественника форм. В качестве примера на рис. 7 приведены изоферментные спектры белков с Phe(-l) и Leu(-l). Изоферментные спектры мугантных щелочных фосфатаз с Pro(-l), Cys(-l), А1а(-2), Рго(-2), Cys(-2), Phe(-5), Lys(-5), Туг(-5), для которых было характерно замедленное созревание белка, содержат как изоформы зрелого белка, так и формы, характерные для транслоцированного предшественника. Это свидетельствует о том, что непроцессированный предшественник и этих мугантных белков транслоцирован через цитоплазматическую мембрану. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что нарушение созревания мугантных белков обусловлено влиянием аминокислотных замен на отщепление сигнального пептида лидерной пептидазой.

ВЫВОДЫ

1. Получено 65 мутантных щелочных фосфатаз Е. coli с заменами аминокислот в -20, -5, -4, -3, -2, -1 положениях сигнального пептида. Для введения аминокислотных замен применен метод, заключающийся в экспрессии генов щелочной фосфатазы с соответствующими амбер-мутациями в штаммах Е. coli, продуцирующих различные амбер-супрессорные тРНК.

2. Показано, что положительно заряженный лизин N-концевого домена сигнального пептида щелочной фосфатазы определяет высокую эффективность секреции. Замены Lys(-20) на Glu, Ala, Phe, Pro, Gly и Cys приводят к снижению скорости транслокации белка через мембрану. His и Тут способны компенсировать отсутствие Lys и их введение не оказывает существенного влияния на эффективность секреции. На основании стереохимического анализа комплекса "сигнальный пептид-фосфолипид" сделано предположение, что эффективность секреции обеспечивается стабильностью этого комплекса.

3. Большинство аминокислотных замен в положениях -3 и -1 сигнального пептида приводит к блоку процессинга, свидетельствуя о консервативности аминокислот в этих положениях. Таким образом, получено новое экспериментальное подтверждение правила "-3, -1".

4. Показано, что эффективность процессинга щелочной фосфатазы зависит от природы аминокислотных остатков вне положений -3, -1. Замены Рго(-5) на Lys, Phe, Тут или Leu, а также Lys(-2) на Ala, Cys или Pro приводят к снижению скорости отщепления сигнального пептида.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Карамышева З.Н., Карамышев A.JL, Ксензенко В.Н., Несмеянова М.А. Анализ влияния замен Lys(-20) в сигнальном пептиде щелочной фосфатазы на секрецию этого фермента. - Биохимия, 1996, т. 61, с. 745-754.

2. Карамышева З.Н., Карамышев А.Л., Ксензенко В.Н., Шляпников М.Г., Каява А.В., Несмеянова М.А. Изучение биогенеза и секреции щелочной фосфатазы и ее мутантных форм у Escherichia coli. IV. Замены аминокислот в С-концевом домене сигнального пептида щелочной фосфатазы влияют на эффективность процессинга этого белка. - Молекуляр. биология, 1997, т. 31, с. 917-923.

3. Nesmeyanova М.А., Karamyshev A.L., Karamysheva Z.N., Kalinin A.E., Ksenzenko V.N., Kajava A.V. Positively charged lysine at the N-terminus of the signal peptide of the Escherichia coli alkaline phosphatase provides the secretion efficiency md is involved in the interaction with anionic phospholipids. - FEBS Lett., 1997, v. 103, p. 203-207.

I. Карамышева 3.H., Карамышев А.Л., Ксензенко B.H., Несмеянова М.А. Изучение процессинга щелочной фосфатазы Е. coli с помощью амбер-:упрессорного мутагенеза. - Тезисы • конференции "Биосинтез и деградация шкробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты", Пущино, 995, с.24.

. Калинин А.Е., Карамышев А.Л., Карамышева З.Н., Крупянко В.И., Гесмеянова. М.А. Секреция и функционирование мутантных щелочных юсфатаз Escherichia coli. - Тезисы конференции "Биосинтез и деградация мкробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты", Пущино, 995, с.23.

. Карамышев А.Л., Карамышева З.Н., Ксензенко В.Н., Калинин А.Е., Каява .В., Несмеянова М.А. Процессинг щелочной фосфатазы Е. coli: Роль ервичной структуры участка отщепления сигнального пептида. - Тезисы торого съезда Биохимического общества РАН, Москва, 1997, с. 320-321.

Karamysheva Z.N., Karamyshev A.L., Kalinin А.Е., Ksenzenko V.N., esmeyanova MA Amino acid substitutions in the signal peptide cleavage site of scherichia coli alkaline phosphatase: influence on processing. - Abstr. of 23rd leeting of the Federation of European Biochemical Societies, Basel, 1995, P55.8. Karamyshev A.L., Kalinin A.E., Karamysheva Z.N., Rrupyanko B.I., Nesmeyanova [.A. Secretion and function of mutant alkaline phosphatases in E. coli. - Abstr. of

23rd Meeting of the Federation of European Biochemical Societies, Basel, 1995, P55.6.

9. Karamyshev A.L., Karamysheva • Z.N., Kalinin A.E., Ksenzenko V.N., Nesmeyanova M.A. Effect of amino acid substitutions in the processing site of alkaline phosphatase on maturation of this protein. - In: Molecular dynamics of bioniembranes, NATO Advanced Study Institute, FEBS Advanced Course, Cargese (Corse), France, 1995.

10. Karamyshev A.L., Karamysheva Z.N., Kalinin A.E., Ksenzenko V.N., Nesmeyanova M.A. Amber-suppressor mutagenesis of Escherichia coli alkaline phosphatase and protein processing analysis. - Abstr. of Cold Spring Harbor Meeting "Molecular genetics of bacteria and phages", Cold Spring Harbor, New York, 1995, p.131.

11. Karamysheva Z.N., Karamyshev A.L., Ksenzenko V.N., Nesmeyanova M.A. Introduction of amino acid substitutions into E. coli alkaline phosphatase by amber-suppressor tRNAs and study of mutant proteins processing. - Abstr. of Bayev memorial conference, Moscow, 1996, p.264.

12. Kalinin A.E., Karamysheva Z.N., Karamyshev A.L., Krupyanko V.I., Nesmeyanova M.A. Biogenesis and some catalytical properties of mutant alkaline phosphatases of E. coli. - Abstr. of Bayev memorial conference, Moscow, 1996, p.263.

13. Nesmeyanova M.A., Karamyshev A.L., Karamysheva Z.N., Kalinin A.E., Suzina N.E., Kajava A.V. Role of primary structure of protein N-terminal domains and membrane anionic phospholipids in E. coli alkaline phosphatase (PhoA) secretion. -Abstr. of 1st Cell Biology Symposium of the MDC on "Protein transport and stability", Berlin, 1996, p.92.

14. Kajava A.V., Karamyshev A.L., Karamysheva Z.N., Ksenzenko V.N., Kalinin A.E., Nesmeyanova M.A. Effect of amino acid substitutions in the signal peptide cleavage region on the processing of R. coli alkaline phosphatase. - Abstr. of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, USA, 1997, B-124.

Научное издание Автореферат Карамыиевой З.Н.

Налоговая льгота - общероссийский классификатор продукции ОК-0О5-93,т.2; 953000 - книги, брогаюры.

12.09.97 г. Зак.7659Р. Тир.100 экз. Усл.печ.л. 1,0

Отпечатано на ротапринте в ОНТИ ПНЦ РАН