Щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена и свойства рекомбинантного белка

Юрченко, Юлия Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена и свойства рекомбинантного белка
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена и свойства рекомбинантного белка"

На правахрукописи

ЮРЧЕНКО ЮЛИЯ ВАЛЕРЬЕВНА

Щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена и свойства рекомбинантного белка

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена в лаборатории выделения и очистки биологически активных соединений Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Соболев Александр Юрьевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Хмель Инесса Александровна

доктор биологических наук, профессор Честухина Галина Георгиевна

Ведущая организация:

Институт микробиологии РАН

Защита состоится « >^^^-^2005 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

В. И. Щербакова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

В настоящее время большой интерес представляют ферменты экстремофилов -микроорганизмов, живущих в экстремальных условиях. Интерес к этим ферментам обусловлен двумя причинами. Во-первых, выяснение конкретных молекулярных механизмов, обеспечивающих повышенную стабильность к разным критическим факторам внешней среды, является актуальной задачей современной энзимологии и белковой инженерии, так как в будущем позволит направленно создавать химерные белки с заданными свойствами. Во-вторых, такие стабильные ферменты, устойчивые к критическим условиям, крайне важны для решения целого ряда практических задач. В связи с этим особого внимания заслуживают термостабильные ферменты из термофильных микроорганизмов. В качестве такой модели нами была выбрана термостабильная щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber 132-4K. Следует отметить, что щелочная фосфатаза привлекательна не только в качестве модели при изучении механизмов, обуславливающих термостабильность, но и широким применением в молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологии и клинической диагностике, где особенно велика потребность в стабильных ферментах. Все вышесказанное определяет актуальность работы по клонированию, экспрессии и характеристике щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4K.

Цель работы

Целью данной работы является клонирование и экспрессия в клетках Escherichia coli гена щелочной фосфатазы термофильной бактерии Meiothermus ruber, установление нуклеотидной последовательности гена, выделение и очистка рекомбинантного белка и определение его основных физико-химических и биохимических характеристик.

Научная новизна

Впервые клонирован и экспрессирован в клетках Escherichia coli ген щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4K. Установлена нуклеотидная последовательность клонированного гена, рекомбинантный белок выделен и очищен до электрофоретически гомогенного состояния. Щелочная фосфатаза Meiothermus ruber 132-4K представляет собой термостабильный фермент с рядом свойств, общих для большинства бактериальных щелочных фосфатаз. Аминокислотная последовательность щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4K показывает высокую степень гомологии по отношению к аминокислотным

последовательностям щелочных фосфатаз родственных бактерий Thermus sp. и Thermus caldophilus и демонстрирует консерватизм аминокислотных остатков, вовлеченных в формирование активного центра фермента. В то же время, фермент из Meiothermus ruber 132-4К обладает радом таких уникальных черт, как узкий рабочий интервал рН, строгая зависимость активности от наличия экзогенного Mg2+ и устойчивость к тиол-восстанавливающим агентам - 2-меркаптоэтанолу и дитиотреитолу.

Практическая значимость

Новая термостабильная щелочная фосфатаза Meiothermus ruber 132-4K может быть использована в генной инженерии для дефосфорилирования 5'-концов нуклеиновых кислот, в молекулярной биологии и диагностике в качестве компонента нерадиоактивных систем детекции, в методе ELISA, а также в качестве репортерного гена. Кроме того, фермент может быть использован в качестве модели при изучении термостабильных белков.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы были представлены на отчетной конференции Института молекулярной генетики РАН (Москва, 2001), на XIV зимней международной молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), на 2-ой конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), на XXVI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2004), на заседании Ученого совета Института молекулярной генетики РАН (Москва, 2004), на заседании секции молекулярной биологии Ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетика» (Москва, 2004).

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзоралитературы, материалов иметодов исследования, результатови обсуждения, заключения выводов

и списка литературы (^/источник_). Работа иллюстрирована рисунками, содержит 2

схемы и 10 таблиц.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1. Клонирование гена щелочной фосфатазы М. ruber

Для получения полноразмерного гена были клонированы фрагменты гена щелочной фосфатазы, чтобы затем использовать их в качестве зонда. Фрагменты были получены с помощью ПЦР. Для дизайна праймеров были использованы данные GenBank Nucleotide Sequence Databases и пакет программ BioEdit (Hall, 1999). Были сравнены аминокислотные последовательности пяти бактериальных щелочных фосфатаз из Escherichia coli, E. fergusonii, Bacillus subtilis, Thermotoga maritime и Thermus sp. На основе этих последовательностей была сконструирована пара вырожденных праймеров API и АР2 к двум участкам гена, кодирующим наиболее консервативные районы аминокислотной последовательности вблизи Thrl55 и Glu322 (здесь и далее нумерация аминокислотных остатков соответствует нумерации, принятой для аминокислотной последовательности зрелой щелочной фосфатазы Е. coli).

Рис, 1. Результаты электрофоретического разделения продуктов ПЦР-амплификации геномной ДНК М. ruber 132-4К, М. ruber 40 и Е. coli с использованием вырожденных праймеров к фрагменту гена щелочной фосфатазы API и АР2. Ml - маркер УЕсо9\\, М2 - маркер pUC19/MspI.

Рис. 2. Саузерн-гибридизация геномной ДНК М ruber 132-4K, М ruber 40 и Е colt, обработанной рестриктазами BamHI, HmdUl и PstI, с радиоактивно меченым зондом на основе клонированного фрагмента щелочной фосфатазы М ruber 132-4K

Были подобраны условия амплификации, и проведена ПЦР с использованием в качестве матрицы геномной ДНК М ruber 132-4K, М ruber 40 и £ coh (рис 1) Два ПЦР-фрагмента, полученные при использовании геномной ДНК М ruber 132-4K и М ruber 40 в качестве матрицы, соответствующие теоретически рассчитанному размеру в 378 пни отсутствующие при амплификации только с одним из праймеров, были выделены, клонированы и секвенированы При сравнении клонированных фрагментов между собой была выявлена высокая степень гомологии как их нуклеотидных (80%), так и предсказанных аминокислотных (90%) последовательностей Степень гомологии их нуклеотидных и предсказанных аминокислотных последовательностей с последовательностями щелочных фосфатаз родственных Т sp и Т caldophilus также была высока (около 71 и 74% для нуклеотидных и аминокислотных последовательностей соответственно) Таким образом, были клонированы фрагменты геномной ДНК М ruber 132-4K и М ruber 40, являющиеся частью гена щелочной фосфатазы

ПЦР-фрагмент, полученный на геномной ДНК М ruber 132-4K, был использован в качестве зонда при Саузерн-гибридизации с препаратами геномной ДНК М ruber 132-4K, М ruber 40 и Е coh, обработанными тремя различными рестриктазами (рис 2) Во всех случаях четкий гибридизационный сигнал был связан с единственным рестрикционным фрагментом В выбранных нами жестких условиях гибридизации с геномной ДНК Е coh не наблюдалось Наиболее сильные сигналы были обнаружены в случае гибридизации зонда с геномной ДНК М ruber 132-4K, обработанной рестриктазами BamHI и Psti, и с геномной ДНК М ruber 40, обработанной рестриктазами Лг^Ш-фрагмент геномной ДНК М ruber 40

размером около 2,5 т п н был исключен из дальнейшего рассмотрения в силу небольшой

ПЦР-юнд

Pstl NdeI tfsal Ncol Rsal SacI Xhol Smal Xhol BglllRsal Smal A/ml -500 0 500 1000 1500 2000 п.и.

«- -4-

-► -►

-► —

-►

Рис. 3. Рестрикционная карта Pstl-Kpnl-фратета геномной ДНК М. ruber 132-4K, содержащего полноразмерный ген щелочной фосфатазы, и стратегия секвенирования гена.

вероятности нахождения в нем полноразмерного гена щелочной фосфатазы. Остальные фрагменты, дающие сильный гибридизационный сигнал, были отобраны и клонированы. Полученные клоны были проанализированы, при гибридизации их плазмидной ДНК с зондом четкий сигнал наблюдали только для двух оказавшихся идентичными плазмид, содержащих fttl-фрагмент геномной ДНК М. ruber 132-4K размером 4,5 т.п.н. После детального рестрикционного картирования этот фрагмент был минимизирован до Pstl-Kpnl-фрагмента длиной 2,5 т.п.н. (рис. 3), включающего полноразмерный ген щелочной фосфатазы М. ruber 132-4K (далее М. ruber) вместе с 5'- и З'-регуляторными областями. Полученный фрагмент был разбит на несколько участков, каждый из которых был субклонирован для проведения секвенирования.

2. Нуклеотидная последовательность гена щелочной фосфатазы М. ruber Нуклеотидная последовательность клонированного гена щелочной фосфатазы М. ruber и соответствующая ей предсказанная аминокислотная последовательность были депонированы в банке данных GenBank (Асс. No AY157731). В нуклеотидной последовательности имеется открытая рамка считывания длиной 1509 п.н., кодирующая полипептид из 503 аминокислотных остатков, рассчитанный молекулярный вес которого составляет 54229 Да. Инициирующему кодону АТС предшествует последовательность, соответствующая потенциальному сайту связывания рибосомы (5'-GGAG-3') и близкая к канонической последовательности Шайна-Дальгарно (Shine and Dalgarno, 1975). Обнаружить

в 5'-фланкирующей области клонированного гена последовательности, схожие с последовательностями, присутствующими в - 10 и -35 районах промоторов Е. coli (Becker and Hengge-Aronis, 2001) не удалось; также не удалось обнаружить гомологию нуклеотидной последовательности в этой области с последовательностями щелочных фосфатаз Т. caldophilus и Т. sp. За терминирующим кодоном UAA следует высокостабильная шпилька, которая, по-видимому, может служить терминатором транскрипции. Содержание G + С в гене составляет 65,6%, что является характерным для разных представителей близкородственного рода Thermus. В клонированном гене встречается 51 из 61 смыслового кодона, причем предпочтение в выборе кодонов, за редким исключением, совпадает с предпочтением в генах щелочных фосфатаз Т. caldophilus и Т. sp.

Первые 26 N-концевых аминокислотных остатков, по-видимому, образуют сигнальную последовательность, типичную для периплазматических белков, с предполагаемым местом отщепления между А1а26 и Gln27. Эта последовательность характеризуется наличием заряженных аминокислотных остатков вблизи N-конца, гидрофобной центральной части и аминокислотного остатка с небольшой боковой цепью на С-конце (Kreil, 1981). Сигнальные пептиды щелочных фосфатаз Е. coli и В. Subtilis (изоформа III) состоят, соответственно, из 21 и 32 аминокислотных остатков (Chang et ah, 1986; Hulett et al, 1991), а щелочные фосфатазы из родственных Т. caldophilus и Т. sp. имеют сигнальные последовательности длиной 27 аминокислотных остатков (Park et al, 1999). Таким образом, предсказанный зрелый белок состоит из 477 аминокислотных остатков с молекулярным весом 51693 Да.

3. Сравнение аминокислотных последовательностей щелочной фосфатазы М.

ruber и других бактериальных щелочных фосфатаз

На рис. 4 представлено множественное выравнивание аминокислотных последовательностей предшественников некоторых бактериальных щелочных фосфатаз. Была определена степень гомологии предсказанной аминокислотной последовательности щелочной фосфатазы М. ruber с последовательностями щелочных фосфатаз термофильных микроорганизмов Т. sp., T. caldophilus и Pyrococcus abyssi, а также с последовательностями щелочных фосфатаз В. subtilis (изоформа IV) и Е. coli. Показано, что степень гомологии между аминокислотной последовательностью щелочной фосфатазы М. ruber и последовательностями щелочных фосфатаз родственных Т. sp. и Т. caldophilus достаточно высока. Число идентичных аминокислотных остатков и консервативных замен в щелочных фосфатазах М. ruber и Т. sp. составляет соответственно 64 и 75%, а в щелочных фосфатазах М. ruber и Т. caldophilus - 64 и 76%. Гомология аминокислотной последовательности

Рис. 4. Сравнение аминокислотных последовательностей предшественников щелочной фосфатазы из Е. соН(Есо),М. гиЪег(Мги), Т. ер. (Тяр), Т. саЫорЫ1и$(Тса) ,Р. аЬуаг (РаЪ) иВ. subtilis (изоформа IV) (Bsu). Указаны прямые лиганды ионов металлов аминокислотные остатки, являющиеся непрямыми лигандами ионов металлов или необходимые для связывания фосфата ( ^ ), и сайт фосфорилирования (*). Идентичные аминокислотные остатки и консервативные замены, встречающиеся по крайней мере в 50% выравниваемых последовательностей, выделены соответственно темным и серым фоном.

щелочной фосфатазы гипертермофильной архебактерии P. abyssi с последовательностью щелочной фосфатазы М. ruber так же низка, как и с последовательностями щелочных фосфатаз рода Thermus. Аминокислотная последовательность щелочной фосфатазы М. ruber, так же как и опубликованная ранее последовательность щелочной фосфатазы Т. caldophilus, в целом, мало сходны с последовательностями щелочных фосфатаз В. subtilis (изоформа IV) и Е. coli. Так, в щелочных фосфатазах М. ruber и В. subtilis число идентичных аминокислотных остатков и консервативных замен составляет соответственно всего лишь 25 и 41%, а в щелочных фосфатазах М. ruber и Е. coli - 23 и 34%. Тем не менее, наблюдается высокая степень идентичности последовательностей вблизи аминокислотных остатков, важных для катализа. Так, аминокислотный остаток Serl02, который вовлечен в формирование фосфосеринового интермедиата в щелочной фосфатазе Е. coli, сохранен в белке из М. ruber (рис. 4).

Известно, что остатки His331, His412, Asp327 и Asp51, Asp369, His370 участвуют в координации ионов ZnI2+ и ZnII2+ соответственно, а остатки Asp51, Glu322, Thrl55 участвуют в координации иона Mg2+ в щелочной фосфатазе Е. coli (Kim and Wyckoff, 1991). Все эти лиганды металлов полностью сохранены в щелочной фосфатазе М. ruber (рис. 4), так же как и в большинстве других бактериальных щелочных фосфатаз. Остаток Aspl53, который является непрямым лигандом иона Mg2+, и остаток Lys328, который важен для связывания фосфата в щелочной фосфатазе Е. coli (Kim and Wyckoff, 1991), в белке из М. ruber заменены на остаток гистидина (рис. 4). Сходные аминокислотные замены имеются в термостабильных щелочных фосфатазах Г. sp., Т. caldophilus и P. abyssi, а также в щелочных фосфатазах млекопитающих (Murphy et al., 1995).

4. Биосинтез рекомбинантпой щелочной фосфатазы М. ruber в клетках Е. coli

При культивировании клеток Е. coli BL21(DE3), содержащих рекомбинантную плазмиду рМгиАР2 с геном предшесвенника щелочной фосфатазы М. ruber под контролем сильного промотора фага 11, наблюдалась сверхэкспрессия гена, в результате чего рекомбинантный белок составлял более 50% от общего белка клетки. Однако почти весь рекомбинантный белок находился в нерастворимой фракции в виде телец включения (рис. 5, дорожка 8). Активность рекомбинантной щелочной фосфатазы, обнаруженная в растворимом клеточном экстракте и составившая 0,5 Ед на мг общего белка, не могла быть отнесена на счет собственной щелочной фосфатазы штамма-хозяина, так как фосфатазная активность, присущая клеткам Е. coli BL21(DE3), трансформированным вектором рЕТ-22Ь, составляла менее 5% от активности, детектируемой при трансформации рекомбинантной плазмидой рМгиАР2. Обнаружить активный рекомбинантный белок в периплазме не удалось

- при сравнении тотального растворимого экстракта и выделенной параллельно периплазматической фракции активность фермента в последней составила менее 10% от активности в тотальном экстракте и может быть объяснена попаданием фермента из цитоплазматической фракции в процессе выделения. Отсутствие активного фермента в периплазме не было неожиданным, так как предсказанная лидерная последовательность клонированной щелочной фосфатазы сильно отличается от сигнальной последовательности секретируемой щелочной фосфатазы Е. coli и может не узнаваться сигнальной пептидазой последней.

Рис. 5. Экспрессия гена рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber в клетках Е. coli BL21(DE3). Результаты электрофореза в 7,5% SDS-ПААГ. Наличие индуктора синтеза белка или его отсутствие отмечены сверху знаками " + " или "-" соответственно. Дорожки: М - маркеры молекулярных весов; 1-4 - растворимые экстракты; 5-8 - осадки, растворенные в буфере В, содержащем 8 М мочевину. 1, 3, 5, 7 - клетки Е. coli BL21(DE3), трансформированные вектором рЕТ22-Ь; 2, 4, б, 8 - клетки Е. coli BL21(DE3), трансформированные рекомбинантной плазмидой pMruAP2.

Для предотвращения агрегации белка в тельца включения были отработаны различные условия выращивания культур. Все эксперименты имели своей целью или непосредственное снижение скорости синтеза белка, или обеспечение правильного сворачивания и укладки белка путем введения в культуральную среду или клетку-хозяина дополнительных факторов. Использование как альтернативного штамма-хозяина Е. coli HMS174(DE3), так и бедной культуральной среды (М9+казаминовые кислоты) не принесло ожидаемого результата. Последовательное уменьшение концентрации индуктора (ИПТГ) с 500 до 10 мкМ не приводило к снижению уровня синтеза рекомбинантного белка. При всех значениях концентрации индуктора происходило формирование телец включения, причем их количество (так же как и количество активного белка в растворимых фракциях) не зависело от концентрации ИПТГ.

Во многих случаях эффективным методом предотвращения агрегации рекомбинантного белка в тельца включения является понижение температуры роста клеток (Schein and Noteborn, 1988). Очевидно, что это связано с уменьшением скорости синтеза

белка вследствие замедления роста клеток. Однако в нашем случае уменьшение температуры роста до 20°С привело лишь к значительному снижению количества общего рекомбинантного белка в клетках, не решая проблемы его агрегации в тельца включения.

В настоящее время к различным методам экспрессии рекомбинантных белков добавился новый подход - шаперон-зависимое сворачивание белка (Machida et ah, 1998; Thomas et al, 1997). Семейство белков шаперонов hsp60, к которому принадлежат шапероны GroEL и GroES, использованные в нашей работе, является наиболее изученным и охарактеризованным к настоящему моменту (Cole, 1996). В наших условиях совместная экспрессия рекомбинантного белка с шаперонами GroESL в клетках Е. coli BL21(DE3) и HMS174(DE3) не приводила к предотвращению агрегации. Возможной причиной неэффективности данного подхода может служить высокая скорость синтеза целевого белка, не позволяющая последнему образовывать комплекс с GroEL.

Рис. 6. Стратегия создания экспрессионных конструкций, содержащих ген щелочной фосфатазы М. ruber без предполагаемой лидерной последовательности (схема дана без учета реального соотношения размеров фрагментов гена). Изогнутыми стрелками указаны праймеры A?-NdeVA?-Ncol и А?-ВатН1. Положение ПЦР-фрагмента гена (или его части), полученного с помощью указанных праймеров на плазмидной ДНК рМгиАР2 и использованного при создании экспрессионных конструкций серии 2a-2d, отмечено штриховкой.

Был разработан ряд экспрессионных конструкций, содержащих фрагмент гена щелочной фосфатазы, лишенного предсказанной лидерной последовательности, под контролем промотора фага Т7 (рис. 6). При культивировании клеток Е. coli BL21(DE3), содержащих эти рекомбинантные плазмиды, во всех случаях опять наблюдалась сверхэкспрессия гена, приводящая к агрегации белка в тельца включения. Небольшое количество активного рекомбинантного фермента было обнаружено только в одном растворимом клеточном экстракте, полученном из культуры клеток, трансформированных плазмидой рМгиАР2а, содержащей ген щелочной фосфатазы без гипотетической лидерной последовательности.

Добавление в культуральную среду ионов Mg2+ и Zn2+, присутствующих в активных центрах большинства бактериальных щелочных фосфатаз, было обусловлено возможностью их участия в процессе правильного сворачивания и укладки белка (фолдинга). В ряде случаев выход растворимых рекомбинантных металлоферментов может быть существенно увеличен путем повышения концентрации соответствующих ионов металлов в ферментационной среде (Proudfoot et al, 1996). Однако в данном случае процесс фолдинга рекомбинантного белка, по всей видимости, или происходит слишком быстро, или не может быть скорректирован добавлением в культуральную среду этих металлов.

Замена гипотетической лидерной последовательности на лидерную последовательность pelB (плазмида рМшАР2с), вопреки ожиданиям, не приводила к экспорту активного белка в периплазму. Использование экспрессионной конструкции pMruAP2b, в которой эта последовательность гена щелочной фосфатазы была заменена на N-концевую последовательность His-Tag, содержащую 6 аминокислотных остатков гистидина, делало теоретически возможным иммобилизацию телец включения на колонке с Ni-NTA-агарозой в денатурирующих условиях и их последующую ренатурацию снижающимся градиентом концентраций мочевины от 8 М до 0. Тем не менее, варьируя условия посадки, ренатурации и элюции белка, не удалось снять с колонки белок в форме растворимого активного фермента. Аналогично, не удалось ренатурировать тельца включения, полученные ранее при работе с экспрессионной конструкцией pMruAP2, содержащей полноразмерный ген щелочной фосфатазы М. ruber, используя метод диализа как при 4°С, так и при 60°С.

Еще одним подходом, использованным для решения проблемы агрегации рекомбинантного белка в тельца включения, было создание экспрессионной конструкции pMruAP2d (рис. 6), включающей ген, кодирующий глутатион S-трансферазу (GST) под контролем tac промотора, слитый по ходу транскрипции (с сохранением рамки считывания) с геном щелочной фосфатазы М. ruber без гипотетической лидерной последовательности. В результате присоединения таких белков как глутатион S-трансфераза или мальтоза-

связывающий белок (МВР) к N-концу интересующего белка растворимость гибридного белка может быть существенно повышена (Cole, 1996; Oswald et ah, 1994). К тому же, такие белки могут быть легко очищены методом аффинной хроматографии. Тем не менее, при культивировании клеток Е. coli HB101, содержащих рекомбинантную плазмиду pMruAP2d, происходила агрегация гибридного белка в тельца включения, и обнаружить активную щелочную фосфатазу в растворимом экстракте нам также не удалось.

Одна из причин, препятствующих экспрессии щелочной фосфатазы М. ruber в клетках Е. coli в растворимой активной форме, может состоять в том, что сворачивание и укладка белка с образованием каталитически активной конформации требует преодоления высокого энергетического барьера. В естественных условиях при температуре, близкой к температурному оптимуму роста микроорганизма (около 60°С), величина этого барьера оказывается существенно ниже, чем тогда, когда белок синтезируется при температуре культивирования Е. coli37°С.

Еще одной причиной может быть различие в тиол-дисульфидных окислительно-восстановительных потенциалах внутренней среды клеток М. ruber и Е. coli. Зрелая форма щелочной фосфатазы содержит одну SH-группу в расчете на субъединицу, и хотя вопрос о вовлеченности этой группы в межсубъединичные взаимодействия остается открытым, однако можно представить ситуацию, в которой образование межмолекулярных дисульфидных связей будет опережать фолдинг вновь синтезируемой полипептидной цепи в активную конформацию, вызывая тем самым образование агрегатов белка в форме телец включения.

Для того чтобы избежать сверхэкспрессии гена, которая также может быть одной из причин образования телец включения вследствие того, что процесс фолдинга "не поспевает" за процессом синтеза белка, полноразмерный ген, кодирующий предшественник щелочной фосфатазы вместе с сигнальной последовательностью, был вставлен в вектор pACYC184 под транскрипционный контроль слабого промотора гена устойчивости к тетрациклину. В этом случае при культивировании клеток Е. coli HB101, содержащих рекомбинантную плазмиду рМгаАРЗ, образования телец включения не происходило, весь рекомбинантный белок находился в растворимом экстракте, причем, как и ранее, обнаружить активный фермент в периплазме не удалось. На примере щелочной фосфатазы из Е. coli известно, что наличие сигнального пептида не оказывает существенного влияния на каталитические свойства фермента (Крупянко и соавт., 1981). Использование этой экспрессионной конструкции позволило нам наработать, выделить и очистить рекомбинантный белок в количестве, достаточном для определения основных биохимических характеристик.

5. Выделение и очистка рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber Разработанная схема очистки рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber из клеток Е. coli HB101, трансформированных плазмидой рМгиАРЗ, основана на комбинации методов, наиболее часто используемых при выделении термостабильных щелочных фосфатаз, как нативных, таге и рекомбинантных (Dong and Zeikus, 1997; Kim et al, 1997; Mori et al., 1999; Zappa et al., 2001). Предлагаемая схема включает прогрев с целью денатурации посторонних белков (температурную инкубацию), фракционирование сульфатом аммония, две последовательные анионообменные хроматографии и концентрирующий диализ. В табл. 1 и на рис. 7 представлены, соответственно, ход очистки рекомбинантной щелочной фосфатазы и результаты электрофореза в 10% SDS-ПААГ белковых препаратов, полученных на различных этапах выделения фермента.

Относительная термостабилыюсть рекомбинантного белка (см. ниже) позволила использовать на первоначальном этапе выделения температурную инкубацию, что привело к удалению значительного количества нецелевого белка при небольшой потере общей активности (рис. 7, дорожка 2 по сравнению с дорожкой 1). Выход белка составил 87,1%, степень очистки - 6,6.

Для дальнейшей очистки и концентрации целевого белка было проведено фракционирование сульфатом аммония (рис. 7, дорожка 3). Большая часть рекомбинантного белка выпадала в осадок при концентрации соли от 40 до 60% от насыщения. После диализа выход белка составил 55,3%, а степень очистки - 10,1.

Таблица 1. Очистка рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber

Общий Активность Выход, Степень

Стадия очистки белок, Общая, Удельная, % очистки

мг Ед Ед/мг

Грубый лизат 623,2 343,6 0,55 100 1,0

Прогрев (75оС, 30 мин) 82,5 299,3 3,63 87,1 6,6

Фракционирование 34,2 190,0 5,56 55,3 10,1

(NH4)2SO4 (40-60%)

ДЭАЭ-целлюлоза, рН 8,3 5,9 114,1 19,34 33,2 35,2

ДЭАЭ-целлюлоза, рН 8,6 2,7 64,3 23,82 18,7 43,3

Рис. 7. Очистка рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber. Результаты электрофореза в 10% SDS-ПААГ. Дорожки: М - маркеры молекулярных весов; 1 - грубый лизат; 2 -препарат белка после температурной инкубации; 3 - препарат белка после фракционирования (NH4)2SO4 и диализа; 4 - препарат белка после анионо-обменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе (рН 8,3); 5 - препарат белка после анионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе (рН 8,6), высаливания (NH4)2SC4 и концентрирующего диализа; б - тельца включения, солюбилизированные в буфере В, содержащем 8 М мочевину, полученные при культивировании клеток Е. coli BL21(DE3), несущих плазмиду рМгаАР2.

Способность большинства белков полученного диализата (но не рекомбинантной щелочной фосфатазы) связываться с ДЭАЭ-целлюлозой при рН 8,3 позволила повысить степень очистки целевого белка в результате первой анионообменной хроматографии до 35,2, удалив значительную часть примесных белков (рис. 7, дорожка 4). Большая часть активного фермента была собрана в процессе изократической элюции. Выход белка составил 33,2%. Аналогичная стадия была успешно использована в ходе выделения нативной щелочной фосфатазы Т. caldophilus (Kim et al, 1997).

С целью сорбции целевого белка на ДЭАЭ-целлюлозе величина рН рабочего буфера была повышена до 8,6. В этих условиях большая часть наносимого на колонку рекомбинантного белка связывалась с сорбентом. Элюцию осуществляли линейным градиентом 0-0,5 М NaCl в рабочем буфере, при этом элюция целевого белка происходила в интервале 0,1-0,15 М NaCl.

Для концентрирования препарата после второй анионообменной хроматографии, позволившей очистить щелочную фосфатазу от большинства оставшихся примесей, использовали высаливание сульфатом аммония. На заключительном этапе очистки был проведен концентрирующий диализ, что позволило убрать сульфат аммония, перевести фермент в удобный для хранения буфер и дополнительно сконцентрировать препарат.

Таким образом, разработанная процедура очистки позволила получить электрофоретически гомогенный препарат рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber (рис. 7, дорожка 5) с выходом 18,7% и степенью очистки 43,3.

6. Биохимические характеристики рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber

Предварительно нами была проведена характеризация рекомбинантного фермента, используя грубый лизат, полученный при культивировании клеток Е. coli BL21(DE3), несущих плазмиду рМгаАР2 (Yurchenko et al, 2003; Юрченко и соавт., 2003). Это было возможно благодаря тому, что в супернатанте после отделения телец включения оставалась значительная активность рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber (0,5 Ед на мг общего белка), которая более чем в 20 раз была выше активности собственной щелочной фосфатазы клеток-хозяев. После получения очищенного рекомбинантного фермента основные свойства и биохимические характеристики белка были уточнены. За небольшими исключениями, отмеченными ниже, они совпадают с результатами, полученными ранее.

6.1. Влияние рН и температуры на активность щелочной фосфатазы М. ruber, термостабильность фермента, субстратная специфичность и величина К, для 4НФФ

Наибольшая ферментативная активность рекомбинантной щелочной фосфатазы наблюдается при рН 11,0-11,5 (рис. 8а). Следовательно, щелочная фосфатаза М. ruber, так же как и термостабильные щелочные фосфатазы Т. caldophilus и P. abyssi, обладает оптимумом рН, сдвинутым в сильно щелочную область. Щелочные фосфатазы млекопитающих обладают более высоким оптимумом рН по сравнению с ферментом из Е.

Рис. 8. Свойства рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber. a - Зависимость активности щелочной фосфатазы от рН. Использовали 100 мМ Трис-HCl буфер в интервале рН 7,5-9,0, и 100 мМ глицин-NaOH буфер в интервале рН 9,5-12,5. За 100% принимали активность при рН 11,0. б - Зависимость активности щелочной фосфатазы от температуры. За 100% принимали активность при 60°С.

coli, что связывают с заменой аминокислотных остатков Aspl53 и Lys328 на остатки гистидина (Murphy et ah, 1995). Можно думать, что аналогичные замены также ответственны за сдвиг оптимума рН в более щелочную область у щелочных фосфатаз М. ruber, Т. caldophilus и P. abyssi. Щелочная фосфатаза М. ruber сохраняет не менее 30% от максимальной активности в интервале рН от 10,5 до 12,5. При рН 10,0 остаточная активность составляет только 10% от максимальной, а при значениях рН ниже 9,5 фермент практически полностью не активен. Эта особенность является уникальной для фермента из М. ruber, так как другие термостабильные щелочные фосфатазы сохраняют от 10 до 20% от своей максимальной активности при рН от 7,0 до 9,0.

На рис. 8б показана зависимость активности щелочной фосфатазы М. ruber от температуры. Температурный оптимум наблюдается при 60°С. Поскольку М. ruber принадлежит к роду Meiothermus, который характеризуется более низкой по сравнению с родом Thermus оптимальной температурой роста, то этот результат является ожидаемым и соответствует опубликованным ранее данным (Егорова и Логинова, 1984). В температурном интервале от 50 до 70°С активность фермента составляет не менее 50% от максимальной активности, при 37°С щелочная фосфатаза М. ruber показывает только 30% от максимальной активности.

Термостабильность фермента определяли, измеряя его остаточную активность через определенные интервалы времени после инкубации при различных температурах в присутствии 2 мМ MgCl2. На рис. 9 приведены кривые термостабильности для очищенного фермента и охарактеризованного ранее грубого лизата. Из рисунка видно, что в случае очищенного белка наблюдается значительное уменьшение термостабильности фермента, особенно при 60°С. Кроме того, следует отметить более резкое падение активности очищенного фермента в первые 2 ч инкубации по сравнению с грубым лизатом (например, при 80°С). Очищенная щелочная фосфатаза М. ruber сохраняет 20 и 7% первоначальной активности после 6 ч инкубации при 60 и 70°С соответственно, в то время как в случае грубого лизата эти цифры составляли 50 и 20%. Приведенные данные говорят о том, что полученный фермент не может быть отнесен к высоко термостабильным ферментам. Тем не менее, он все-таки более стабилен чем, например, щелочная фосфатаза из термофильной бактерии В. stearothermophilus, которая полностью инактивируется после 6 ч инкубации при 60°С (Mori et al, 1999). Незначительная активация очищенного фермента в начале 1 ч инкубации при 60°С может быть вызвана достижением оптимальных условий для создания каталитически более активной конформации. Подобный эффект был отмечен ранее для щелочной фосфатазы Т. caldophilus во время инкубации фермента при 80°С (Kim et al, 1997). Инкубация при 80°С в течение 3 ч приводит к полной инактивации щелочной фосфатазы М.

ruber как в случае очищенного фермента, так и грубого лизата, в то время как фермент из Т. caldophilus сохраняет 80% активности после 12 ч инкубации при той же температуре (Kim et al, 1997), а фермент из гипертермофильного микроорганизма P. abyssi сохраняет 80% активности после 36 ч инкубации при 90°С (Zappa et al., 2001).

Время инкубации, мин

Рис. 9. Температурная стабильность рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber. Раствор фермента инкубировали при указанных температурах в 50 мМ Трис-HCl буфере, рН 7,8, содержащем 2 мМ MgCl2. Кривые для грубого лизата и очищенного фермента показаны закрытыми и открытыми символами соответственно. За 100% принимали активность в начальный момент времени.

Наблюдаемое падение термостабильности очищенного фермента по сравнению с охарактеризованным ранее грубым лизатом может быть связано с утратой в процессе очистки каких-либо факторов, стабилизирующих фермент и изначально присутствующих в грубом лизате. В пользу этого предположения говорит и тот факт, что в процессе очистки на стадии инкубации при 75°С в течение 30 мин активность грубого лизата снизилась всего лишь на 13% (табл. 1).

Была изучена гидролитическая активность щелочной фосфатазы М. ruber по отношению к различным субстратам (табл. 2). Фермент гидролизует ряд фосфорилированных соединений, проявляя наибольшую активность в отношении 4НФФ, как

и большинство других щелочных фосфатаз. Высокая гидролитическая активность показана также в отношении МАОРИ, ВС1Р и Бти-б-Р. Ферменты из других источников также способны гидролизовать разнообразные фосфорилированные субстраты, проявляя различные предпочтения.

Таблица 2. Субстратная специфичность щелочной фосфатазы М. ruber

Субстрат Относительная активность*, %

4НФФ 100

АТР 49

dATP 45

NADPH 82

Fru-6-P 71

BCIP 78

* За 100% принимали активность щелочной фосфатазы при использовании в качестве

субстрата 4НФФ.

Константу Михаэлиса определяли по графику Лайнуивера-Бэрка. При оптимальных значениях рН и температуры Кт для субстрата 4НФФ составляет 0,039 мМ (ранее для грубого лизата была определена как 0,055 мМ).

6.2. Влияние ионов металлов на активность щелочной фосфатазы М. ruber

Поскольку известные щелочные фосфатазы являются металлоферментами, было исследовано влияние ионов металлов на активность изучаемого нами фермента (табл. 3). Его характерной особенностью является небольшая активность в отсутствие ионов металлов (только 11 % от максимальной активности). Для работы щелочной фосфатазы М. ruber строго необходимы ионы Mg2+. Активность зависит от концентрации Mg2+, и наибольшая активность наблюдается в присутствии 2-5 мМ Mg2+. Это может свидетельствовать о наличии в щелочной фосфатазе М. ruber сайта связывания магния, который насыщается по мере добавления экзогенного Mg2+. Как показано ниже (табл. 4), добавление хелатирующего агента ЭДТА подавляет активность фермента. При замене Mg2+ на ионы других металлов активность фермента составляет от 6 до 11% от максимальной активности, не превышая, таким образом, активность, измеряемую в отсутствие ионов металлов. В присутствии только ионов Со2+ активность щелочной фосфатазы достигает 21% от максимальной, проявляющейся в присутствии ионов Mg+. В отличие от фермента из М. ruber, другие термостабильные щелочные фосфатазы могут быть также активированы Мп2+ или Zn2+. Для

большинства щелочных фосфатаз ион Zn2+ является необходимым металлом, напрямую вовлеченным в механизм катализа (Kim and Wyckoff, 1989). В случае щелочной фосфатазы М. ruber добавление экзогенного Zn2+ не оказывает практически никакого действия на каталитическую активность. Такие же результаты получены и в опытах с ферментом из В. stearothermophilus (Mori et al., 1999). Однако при добавлении Zn2+ в реакционную смесь, уже содержащую 2 мМ Mg2+, активность щелочной фосфатазы М. ruber снижается на 70%. Ранее показано, что Zn2+ оказывает ингибирующий эффект на нативную щелочную фосфатазу из родственной бактерии Т. caldophilus (Kim et al., 1997), а также на активированный магнием мутантный вариант щелочной фосфатазы Е. coli (D153H) (Murphy et al., 1993). Этот факт, вероятно, объясняется тем, что в результате замены аминокислотного остатка Aspl53 на остаток гистидина происходит изменение конформации сайта связывания Mg2+, что ведет к предпочтительному связыванию сайтом цинка. Таким образом, добавление ионов Zn2+ может вызывать вытеснение магния цинком в сайте связывания металла, что, в свою очередь, может приводить к частичной или полной инактивации фермента. Следует отметить, что для охарактеризованной ранее в грубом лизате щелочной фосфатазы М. ruber зависимость активности фермента от наличия ионов Mg2+ была абсолютной. Тот факт, что добавление экзогенного Mg2+ являлось абсолютно необходимым для достижения ферментом максимальной активности, может означать, что в выделенном рекомбинантном белке все три сайта связывания металлов были заняты цинком, как это ранее предполагали в случае щелочной фосфатазы млекопитающих и дрожжей (Murphy et al., 1993). В случае очищенного фермента небольшая активность (11%), наблюдаемая даже в отсутствие ионов металлов, может быть связана с тем, что в сайте связывания магния у этого фермента не происходит полного вытеснения магния цинком. С другой стороны, возможно, это вызвано тем, что для

Таблица 3. Влияние ионов металлов на активность щелочной фосфатазы М. ruber

Ион металла Относительная активность*, %

100

MgJ++Zn2+ 30

Mn2t 6

Zn2+ 10

Ca2+ 11

Co2+ 21

Ni2+ 9

Без металлов И

За 100% принимали активность щелочной фосфатазы в присутствии Mgr .

синтеза рекомбинантного фермента в последнем случае была использована конструкция, не приводящая как раньше к сверхэкспрессии гена, что могло способствовать более корректному фолдингу белка и, как следствие, заполнению по меньшей мере части сайтов связывания металлов "правильными" ионами металлов.

6.3. Влияние химических агентов на активность щелочной фосфатазы М. ruber

В табл. 4 приведены данные о влиянии ряда химических соединений на активность щелочной фосфатазы М. ruber. 1% SDS полностью инактивирует фермент. Ванадат, известный как классический ингибитор щелочных фосфатаз, также практически полностью инактивирует щелочную фосфатазу М. ruber. Эти результаты согласуются с данными для других бактериальных щелочных фосфатаз (Zappa et al., 2001). Неорганический фосфат в концентрации 10 мМ является ингибитором щелочной фосфатазы М. ruber, уменьшая ее активность на 68% по сравнению с контролем. Ионы МоО42- и WO42-, которые могут являться структурными аналогами фосфата, оказывают слабое влияние на активность щелочной фосфатазы. Присутствие 2 М мочевины несколько снижает активность фермента. Устойчивость к воздействию денатурирующих агентов характерна для термостабильных ферментов и может быть использована для повышения растворимости таких рекомбинантных белков. Тиол-восстанавливающие агенты 2-меркаптоэтанол и дитиотреитол оказывают незначительный эффект на активность щелочной фосфатазы М, ruber, в отличие от щелочной фосфатазы Т. caldophilus, которая активируется 1 мМ дитиотреитолом в 3 раза (Kim et al., 1997), и щелочной фосфатазы P. abyssi, которая в тех же условиях инактивируется практически полностью (Zappa et al., 2001). Такие результаты могут быть связаны с тем, что тиол-дисульфидный обмен вовлечен в поддержание активной конформации фермента. В щелочных фосфатазах М. ruber, Т. caldophilus и P. abyssi присутствует только один остаток цистеина на мономер. Однако во всех трех белках он расположен в разных местах полипептидной цепи, что может указывать на его различную роль в образовании и поддержании третичной (или четвертичной) структуры щелочной фосфатазы из различных источников. ЭДТА оказывает сильное ингибирующее действие на щелочную фосфатазу М. ruber, что является ожидаемым результатом для металлофермента. Неполная инактивация фермента может быть связана с ограниченной доступностью связанных в активном центре фермента ионов металлов для хелатирующего агента.

Таблица 4. Влияние химических агентов на активность щелочной фосфатазы М. ruber

Соединение Концентрация Относительная активность*, %

Без добавок 100

SDS 1% 0

Ка2Мо04 1 мМ 96

10 мМ 92

Na2W04 1 мМ 90

10 мМ 72

NaV03 1 мМ 16

10 мМ 4

Na2HP04 1 мМ 63

10 мМ 32

Мочевина 2М 64

4M 33

2-Меркаптоэтанол 2 мМ 103

10 мМ 62

Дитиотреитол 1 мМ 98

ЭДТА 2мМ 28

5 мМ 12

* За 100% принимали активность щелочной фосфатазы в отсутствие добавленных соединений.

6.4. Дефосфорилирование 5'-концов ДНК с помощью щелочной фосфатазы М.

ruber

Так как для дефосфорилирования 5'-концов нуклеиновых кислот в молекулярной биологии традиционно применяются щелочные фосфатазы, представляло интерес продемонстрировать возможность использования для этих целей рекомбинантной щелочной фосфатазы H.ruber.

На рис. 10 приведены результаты анализа продуктов дефосфорилирования и лигирования методом электрофореза в 1% агарозном геле. Можно видеть, что как в случае использования коммерческого препарата CIAP, так и в случае рекомбинантной щелочной фосфатазы не наблюдается лигирования дефосфорилированной линеаризованной плазмиды (рис. 10, дорожки 1 и 2 соответственно), в то время как плазмида, которая не была дефосфорилирована, лигируется полностью (рис. 10, дорожка 3).

Несмотря на то, что было выделено и охарактеризовано большое количество щелочных фосфатаз, на практике в молекулярной биологии используются только коммерческие препараты из Е. coli и кишечника теленка (CIAP). Недавно было продемонстрировано эффективное дефосфорилирование 5'-концов ДНК с помощью рекомбинантной щелочной фосфатазы P. abyssi (Zappa et al., 2001). Настоящий эксперимент показывает возможность использования для этих целей рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber, как одно из применений полученного фермента.

Рис. 10. Дефосфорилирование ДНК. Результаты электрофореза в 1% агарозном геле. В качестве субстрата использована плазмида pUC19, линеаризованная рестриктазой EcoRI. Дорожки: М - маркер молекулярных весов УЕсоЧМ", 1 - плазмида после обработки щелочной фосфатазой из кишечника теленка и лигазной реакции; 2 - плазмида после обработки рекомбинантной щелочной фос-фатазой М. ruber и лигазной реакции; 3 - не обработанная щелочной фосфа-тазой плазмида после лигазной реакции; 4 - линеаризованная EcoRl плазмида; 5 - ковалентно замкнутая плазмида.

выводы

1. Клонирован ген щелочной фосфатазы термофильной бактерии Meiothermus ruber 132-4К и определена его полная нуклеотидная последовательность. Открытая рамка считывания состоит из 1509 п.н. ATG-кодону предшествует сайт связывания рибосомы, последовательность которого близка к канонической. За терминирующим кодоном UAA следует высокостабильная шпилька, которая может служить терминатором транскрипции.

2. Проведен анализ предсказанной аминокислотной последовательности щелочной . фосфатазы М. ruber 132-4K. Полная аминокислотная последовательность белка состоит из 503 аминокислотных остатков, его рассчитанный молекулярный вес составляет 54229 Да. Первые 26 аминокислотных остатков формируют гипотетический сигнальный пептид, таким образом предсказанный зрелый белок состоит из 477 аминокислотных остатков с рассчитанным молекулярным весом 51693 Да.

3. Выявлен высокий консерватизм аминокислотных остатков, важных для катализа и вовлеченных в формирование активного центра фермента. Обнаружена высокая степень гомологии аминокислотной последовательности щелочной фосфатазы М. ruber 132-4К по отношению к аминокислотным последовательностям щелочных фосфатаз родственных бактерий Thermus sp. и Т. caldophilus: число идентичных аминокислотных остатков составляет 64%, число консервативных замен составляет около 75%.

4. Разработан и проанализирован ряд экспрессионных конструкций, отобрана конструкция, позволяющая осуществлять биосинтез рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber 132-4K в клетках Escherichia coli.

5. Разработана процедура очистки, и получен электрофоретически чистый препарат рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber 132-4K с удельной активностью около 24 Ед/мг.

6. Охарактеризованы биохимические свойства очищенного рекомбинантного белка. Щелочная фосфатаза из М. ruber 132-4K является металлоферментом, и ее активность зависит от наличия ионов металла (предпочтительно, магния) в реакционной среде. Оптимальные для активности фермента значение рН и температура составляют соответственно 11,0-11,5 и 60°С. Исследована температурная стабильность фермента. Определены величина Кт по отношению к 4НФФ (0,039 мМ) и субстратная специфичность фермента. Проведен ингибиторный анализ активности рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber 132-4K: сильный ингибирующий эффект оказывают SDS, ванадат натрия и хелатор металлов ЭДТА.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. J.V.Yurchenko, AV.Budilov, S.M.Deyev, I.S.Khromov, A.Y.Sobolev. Cloning of an alkaline phosphatase gene from the moderately thermophilic bacterium Meiothermus ruber and characterization of the recombinant enzyme. Molecular Genetics and Genomics. (2003). 270: 87-93.

2. Ю.В.Юрченко, И.С.Хромов, А.В.Будилов, СМ.Деев, А.Ю.Соболев. Термостабильная щелочная фосфатаза бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена, экспрессия в клетках Escherichia coli и биохимическая характеристика рекомбинантного белка. Молекулярная биология. (2003). 37(6): 989-998.

3. Ю.В.Юрченко, А.Ю. Соболев. Использование ПЦР с вырожденными праймерами для

клонирования гена щелочной фосфатазы термофильной бактерии Thermits ruber. Тез. докл. и сообщ. XIV зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», 11-15 февраля 2002 г., Москва, с. 10.

4. Ю.В.Юрченко, А.Ю.Соболев. Клонирование гена щелочной фосфатазы термофильной бактерии Meiothermus ruber и предварительная характеристика рекомбинантного белка. «Актуальные проблемы генетики». Материалы 2-ой конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И.Вавилова. Москва. 20-21 февраля, 2003 г. Изд-во ТСХА. Т. 2, с. 203.

5. Ю.В. Юрченко, А.Ю.Соболев. Термостабильная щелочная фосфатаза бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена, экспрессия в клетках Escherichia coli и биохимическая характеристика рекомбинантного белка. Тез. докл. и стенд, сообщ. XVI зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", 9-12 февраля 2004 г., Москва, с. 100.

Принято к исполнению 21/12/2004 Исполнено 23/12/2004

Заказ № 520 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www.autoreferat.ru

OA i

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Юрченко, Юлия Валерьевна

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Щелочная фосфатаза микроорганизмов и высших организмов

1.1.1. Распространение и локализация

1.1.2. Структура щелочной фосфатазы

1.1.3. Механизм ферментативного действия

1.1.4. Свойства щелочной фосфатазы

1.1.5. Механизм регуляции экспрессии (на примере Е. coli)

1.2. Ферменты термофильных микроорганизмов

1.2.1. Термофильные микроорганизмы

1.2.2. Физико-химические особенности ферментов термофильных 23 микроорганизмов

1.2.3. Термостабильные щелочные фосфатазы

1.3. Практическое применение щелочных фосфатаз

1.3.1. Использование щелочных фосфатаз для получения 33 ферментативных конъюгатов в методе ELISA

1.3.2. Применение щелочных фосфатаз в генной инженерии, 34 молекулярной биологии и диагностике

1.3.3. Использование щелочных фосфатаз в качестве репортерного 37 гена

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Культивирование штаммов микроорганизмов

2.2. Клонирование фрагмента гена щелочной фосфатазы М. ruber

2.3. Клонирование полноразмерного гена щелочной фосфатазы М. 41 ruber

2.4. Конструирование плазмид для экспрессии гена щелочной 42 фосфатазы М. ruber в клетках Е. coli

2.5. Выделение и очистка рекомбинантных щелочных фосфатаз М. 45 ruber

2.6. Определение активности щелочной фосфатазы М. ruber

2.7. Определение оптимума pH и температуры и термостабильности 48 щелочной фосфатазы М. ruber

2.8. Изучение влияния ионов металлов и химических агентов на 48 активность щелочной фосфатазы М. ruber

2.9. Определение субстратной специфичности щелочной фосфатазы 49 М. ruber

2.10. Дефосфорилирование 5' -концов ДНК

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Клонирование гена щелочной фосфатазы М. ruber

3.1.1. Клонирование ПЦР-фрагментов гена

3.1.2. Клонирование полноразмерного гена

3.2. Нуклеотидная последовательность гена щелочной фосфатазы М. 55 ruber

3.3. Сравнение аминокислотных последовательностей щелочной 59 фосфатазы М. ruber и других бактериальных щелочных фосфатаз

3.4. Биосинтез рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber в 61 клетках Е. coli

3.5. Выделение и очистка рекомбинантной щелочной фосфатазы М. 67 ruber

3.6. Биохимические характеристики рекомбинантной щелочной 69 фосфатазы М. ruber

3.6.1. Влияние pH и температуры на активность щелочной 70 фосфатазы М. ruber, термостабильность фермента, субстратная специфичность и величина Кт для 4НФФ

3.6.2. Влияние ионов металлов на активность щелочной фосфатазы 74 М. ruber

3.6.3. Влияние химических агентов на активность щелочной 76 фосфатазы М. ruber

3.6.4. Дефосфорилирование 5'-концов ДНК с помощью щелочной 77 фосфатазы М. ruber

Введение Диссертация по биологии, на тему "Щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена и свойства рекомбинантного белка"

Актуальность работы

В настоящее время большой интерес представляют ферменты экстремофилов - микроорганизмов, живущих в экстремальных условиях. Интерес к этим ферментам обусловлен двумя причинами. Во-первых, выяснение конкретных молекулярных механизмов, обеспечивающих повышенную стабильность к разным критическим факторам внешней среды, является актуальной задачей современной энзимологии и белковой инженерии, так как в будущем позволит направленно создавать химерные белки с заданными свойствами. Во-вторых, такие стабильные ферменты, устойчивые к критическим условиям, крайне важны для решения целого ряда практических задач. В связи с этим особого внимания заслуживают термостабильные ферменты из термофильных микроорганизмов. В качестве такой модели нами была выбрана термостабильная щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber 132-4К. Следует отметить, что щелочная фосфатаза привлекательна не только в качестве модели при изучении механизмов, обуславливающих термостабильность, но и широким применением в молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологии и клинической диагностике, где особенно велика потребность в стабильных ферментах. Все вышесказанное определяет актуальность работы по клонированию, экспрессии и характеристике щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4К.

Цель работы

Научная новизна

Впервые клонирован и экспрессирован в клетках Escherichia coli ген щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4К. Установлена нуклеотидная последовательность клонированного гена, рекомбинантный белок выделен и очищен до электрофоретически гомогенного состояния. Щелочная фосфатаза Meiothermus ruber 132-4К представляет собой термостабильный фермент с рядом свойств, общих для большинства бактериальных щелочных фосфатаз. Аминокислотная последовательность щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4К показывает высокую степень гомологии по отношению к аминокислотным последовательностям щелочных фосфатаз родственных бактерий Thermus sp. и Thermus caldophilus и демонстрирует консерватизм аминокислотных остатков, вовлеченных в формирование активного центра фермента. В то же время, фермент из Meiothermus ruber 132-4К обладает рядом таких уникальных черт, как узкий рабочий интервал pH, строгая зависимость активности от наличия экзогенного Mg2+ и устойчивость к тиол-восстанавливающим агентам - 2-меркаптоэтанолу и дитиотреитолу.

Практическая значимость

Новая термостабильная щелочная фосфатаза Meiothermus ruber 132-4К может быть использована в генной инженерии для дефосфорилирования 5'-концов нуклеиновых кислот, в молекулярной биологии и диагностике в качестве компонента нерадиоактивных систем детекции, в методе ELISA, а также в качестве репортерного гена. Кроме того, фермент может быть использован в качестве модели при изучении термостабильных белков.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Юрченко, Юлия Валерьевна

ВЫВОДЫ

2. Проведен анализ предсказанной аминокислотной последовательности щелочной фосфатазы М. ruber 132-4К. Полная аминокислотная последовательность белка состоит из 503 аминокислотных остатков, его рассчитанный молекулярный вес составляет 54229 Да. Первые 26 аминокислотных остатков формируют гипотетический сигнальный пептид, таким образом предсказанный зрелый белок состоит из 477 аминокислотных остатков с рассчитанным молекулярным весом 51693 Да.

5. Разработана процедура очистки, и получен электрофоретически чистый препарат рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber 132-4К с удельной активностью около 24 Ед/мг.

6. Охарактеризованы биохимические свойства очищенного рекомбинантного белка. Щелочная фосфатаза из М. ruber 132-4К является металлоферментом, и ее активность зависит от наличия ионов металла (предпочтительно, магния) в реакционной среде. Оптимальные для активности фермента значение рН и температура составляют, соответственно, 11,0-11,5 и 60°С. Исследована температурная стабильность фермента. Определены величина Кт по отношению к 4НФФ (0,039 мМ) и субстратная специфичность фермента. Проведен ингибиторный анализ активности рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber 132-4К: сильный ингибирующий эффект оказывают SDS, ванадат натрия и хелатор металлов ЭДТА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе мы столкнулись с проблемой получения высокого уровня биосинтеза активной растворимой рекомбинантной щелочной фосфатазы в гетерологичной экспрессионной системе. Предпринятые нами многочисленные попытки, которые, в частности, включали изменение условий культивирования, использование альтернативного штамма-хозяина, разнообразных конструкций, коэкспрессию совместно с шаперонами GroESL, не привели к увеличению выхода активного растворимого белка. В то же время при использовании некоторых разработанных нами конструкций уровень биосинтеза белка щелочной фосфатазы в виде телец включения был очень высок и мог достигать около 50% от общего клеточного белка.

По нашему мнению, эта проблема может носить достаточно универсальный характер, в частности при решении биотехнологических задач, связанных с экспрессией гетерологичных генов. Мы полагаем, что в случае щелочной фосфатазы М. ruber данная проблема имеет два аспекта. Первый аспект связан с наработкой в гетерологичной клетке-хозяине потенциально токсичных или летальных продуктов. Второй аспект связан со сворачиванием (фолдингом) белка в не свойственном ему окружении в условиях, весьма далеких от нативных, и влиянием на этот процесс дополнительных факторов, таких, например, как ионы металлов.

Очевидно, что для любой клетки наличие фермента, способного катализировать реакцию отщепления неорганического фосфата от широкого круга жизненно важных для клетки соединений, таких как moho-, олиго- и полинуклеотиды, макроэргические соединения типа АТФ, фосфосахара и т.д., может представлять не просто серьезную опасность, но попросту быть летальным. В связи с этим в ходе эволюции у организмов, обладающих щелочной фосфатазой, должен был выработаться механизм самозащиты. Например, у Е. coli экспрессия гена щелочной фосфатазы строго контролируется: pho-регулон, в состав которого входит около 30 генов, обеспечивает репрессию синтеза щелочной фосфатазы, когда в среде имеется достаточное количество неорганического фосфата (см. раздел Обзор литературы, п. 1.1.5). Клетки Е. coli вряд ли регулярно испытывают фосфатное голодание, однако когда такое случается, происходит индукция биосинтеза щелочной фосфатазы, причем уровень экспрессии может быть очень высоким: щелочная фосфатаза может составлять до 5-10% от общего клеточного белка (Reid and Wilson, 1971). Очевидно, что еще одной мерой самозащиты может являться синтез белка в виде профермента с последующей его секрецией в периплазматическое пространство. Однако вопрос о том, является ли щелочная фосфатаза активной внутри клеточной цитоплазмы в виде белка-предшественника или ее активность приурочена исключительно к периплазматическому пространству, по-видимому, нельзя считать окончательно решенным: имеются сведения о том, что каталитические свойства предшественника щелочной фосфатазы мало чем отличаются от свойств зрелого белка (Крупянко и соавт., 1981).

Хотя во многих случаях локализация щелочной фосфатазы в клетке не является точно выясненной, наличие у большинства щелочных фосфатаз гипотетических сигнальных последовательностей указывает на то, что щелочная фосфатаза синтезируется в виде белка-предшественника и затем подвергается секреции. Сигнальные последовательности щелочных фосфатаз из различных источников демонстрируют высокую степень дивергенции (DuBose and Yartl, 1990; см. также рис. 12 в разделе Результаты и обсуждение). Тем не менее, во всех случаях, в том числе и в случае щелочной фосфатазы из М. ruber, сохраняется единый принцип структурной организации сигнального пептида: центральная гидрофобная область фланкирована заряженным N-концом и полярным С-концом. Ранее было показано, что центральная область сигнальной последовательности щелочной фосфатазы Е. coli может быть удлинена или замещена другой при условии, что заменяющие остатки являются высоко гидрофобными (Kendall et al., 1986). Также была продемонстрирована высокая толерантность последовательности зрелого белка в отношении инсерций и делеций на ее N-конце: слитые белки, содержавшие делецию первых тринадцати N-концевых остатков последовательности зрелой щелочной фосфатазы или инсерцию 150 аминокислотных остатков, функционировали сходным с щелочной фосфатазой дикого типа образом (Hoffman and Wright, 1985). С учетом изложенного выше, создавая экспрессионную конструкцию, содержавшую полноразмерный ген щелочной фосфатазы М. ruber, мы надеялись, что ее собственная сигнальная последовательность сможет функционировать в клетках Е. coli, эффективно направляя секрецию белка в периплазму. Наша надежда, однако, не оправдалась. Важно отметить, что попытка заменить собственную сигнальную последовательность на специфичную для клеток штамма-хозяина Е. coli лидерную последовательность pelB также не увенчалась успехом.

В связи с этим мы полагаем, что ведущая роль в том, что синтезированная в клетках Е. coli рекомбинантная щелочная фосфатаза М. ruber образовывала тельца включения вместо того, чтобы оставаться в растворимом виде или секретироваться в периплазму, принадлежит процессу фолдинга и возможному влиянию на него дополнительных факторов. По-видимому, процесс фолдинга щелочной фосфатазы М. ruber имеет высокий энергетический барьер, преодолеть который при нормальной температуре роста данного микроорганизма, составляющей 56°С, оказывается существенно легче, чем при температуре культивирования Е. coli. Дополнительные факторы также могут влиять на процесс фолдинга. В частности, известно, что ионы металлов способствуют правильному фолдингу металлоферментов (Proudfoot et al., 1996). В случае щелочной фосфатазы М. ruber, также являющейся металлоферментом, добавление экзогенных магния и цинка в культуральную среду не привело к желаемому результату. Таким образом, возможно, что именно термодинамическому фактору принадлежит решающая роль в том, что синтезируемая щелочная фосфатаза агрегирует в тельца включения. В данном контексте весьма симптоматично, что, несмотря на то, что имеется несколько публикаций, посвященных клонированию генов щелочной фосфатазы из представителей рода Thermus (Yuan et al., 1998; Park et al., 1999), родственных M. ruber, получение рекомбинантного фермента путем экспрессии в гетерологичной системе до настоящего времени, насколько нам известно, в литературе описано не было.

Известно, что ген щелочной фосфатазы присутствует в геномах эволюционно далеко отстоящих друг от друга организмов. Сравнение последовательностей щелочной фосфатазы из организмов, принадлежащих к различным таксонам, показывает, что в ходе эволюции фермент претерпел множество изменений (Murphy et al., 1995). Например, первичная последовательность щелочной фосфатазы из плаценты человека проявляет лишь около 10% сходства с последовательностью фермента из Е. coli (Le Du et al.,

2001). В то же время организация активного центра и лиганды, принимающие участие в координации ионов металлов, являются высоко консервативными, так что архитектура фермента в целом сохраняется.

В связи с тем, что в данной работе нам удалось впервые определить нуклеотидную последовательность гена щелочной фосфатазы из представителя термофильных бактерий рода Meiothermus и соответствующую ей аминокислотную последовательность, нам представлялось целесообразным сопоставить филогенетическое положение этого белка по отношению к щелочным фосфатазам из ряда других организмов (бактерий, архебактерий, грибов, млекопитающих).

Как видно из представленного на рис. 18 филогенетического древа, в связи с удаленным эволюционным положением организмов, выбранных для анализа, в единый кластер надежно объединяются только щелочные фосфатазы из видов одного рода, как например Е. coli и Е. fergusonii, а также Т. caldophilus, Т. thermophilics и Т. sp. Любопытно, что плацентарная щелочная фосфатаза человека оказывается филогенетически ближе к щелочной фосфатазе из кишечника теленка, чем к неспецифической тканевой щелочной фосфатазе человека.

Щелочная фосфатаза М. ruber образует единую группу со щелочными фосфатазами 3 видов рода Thermus. Примечательно, что щелочная фосфатаза вида Deinococcus radiodurans, которого согласно современной систематике вместе с родом Thermus относят к единому классу Deinococci (Wheeler et al., 2000), оказывается филогенетически далеко отстоящей от щелочных фосфатаз рода Thermus и Meiothermus. Щелочная фосфатаза D. radiodurans оказывается филогенетически более тесно связанной со щелочной фосфатазой млекопитающих, чем с бактериальными щелочными фосфатазами.

Известно, что микроорганизмы, относящиеся к наиболее рано дивергировавшим линиям эволюции, такие как Т. maritima и D. radiodurans, также содержат связанные родством гомологи гена щелочной фосфатазы, что может свидетельствовать о том, что этот ген возник на самых ранних этапах эволюции бактерий. При этом, не будучи жизненно необходимым, ген встречается практически среди всех таксонов живых организмов, от бактерий до человека. Возможно, такая персистентность гена может быть обусловлена эволюционными преимуществами, которые обеспечивало его наличие.

Saccharomyces cerevisiae

Deinococcus radiodurans Human non-specific Calf intestine

999 Human placental

642

100C

756

354 Escherichia coli 1000 Escherichia fergusonii

Meiothermus ruber

1000

Thermus species 1000

Thermus thermophilus

944

Thermus caldophilus

-Bacillus subtilis

703

-Pyrococcus abyssi

749

- Thermotoga maritima o.i

Рис. 18. Филогенетическое древо щелочных фосфатаз из 14 видов прокариотических и эукариотических организмов. Филогенетический анализ проводили при помощи программы ClustalW, свободно доступной на сайте http://spiral.genes.nig.ac.ip/homology/clustalw.shtml. в основе которой лежит алгоритм объединения соседей (Neighbor Joining) (Saitou and Nei, 1987). При проведении анализа использовали параметры, установленные по умолчанию: использована коррекция по методу Кимуры, позиции с пропусками игнорируются, количество бутстрэп-выборок равно 1000. Для построения филогенетического древа использовали программу TreeView (Page, 1996). Шкала в левом нижнем углу соответствует 0,1 аминокислотной замене на сайт. Устойчивость построенного древа определяли методом бутстрэпинга. Цифры у точки дихотомического ветвления показывают, сколько раз виды объединялись вместе в выборке из 1 ООО бутстрэп-древ.

Щелочные фосфатазы вместе с фосфоглицератмутазами (не зависимыми от кофактора 2, 3-дифосфоглицерата), фосфопентозомутазами и сульфатазами входят в суперсемейство щелочной фосфатазы, объединяющее металлоферменты, у которых ключевая роль в катализе принадлежит фосфосериновому интремедиату (Galperin et al., 1998). Также важно отметить отдаленную эволюционную взаимосвязь щелочных фосфатаз с фосфодиэстеразами и нуклеотидпирофосфатазами. В литературе имеются сообщения о том, что щелочная фосфатаза Е. coli обладает фосфодиэстеразной и сульфатазной активностями (O'Brien and Herschlag, 2001), что служит дополнительным указанием на существование функциональной взаимосвязи между фосфатазами, фосфодиэстеразами и сульфатазами. Каталитическая «неразборчивость» щелочной фосфатазы могла обеспечивать селективное преимущество и тем самым способствовать дивергентной эволюции через дупликацию гена.

Таким образом, семейство щелочной фосфатазы, объединяющее в себе ферменты-гомологи из организмов, относящихся практически ко всем царствам живого (за исключением вирусов), обеспечивает уникальные возможности для исследования механизмов катализа и стабилизации вторичной, третичной и четвертичной структур белка в различных условиях (в частности, в диапазоне температур от 0 до 100°С), для установления взаимосвязи между структурной организацией фермента и его функциональными характеристиками, а также для исследования закономерностей молекулярной эволюции генов и кодируемых ими белков, что может иметь важное значение для реконструкции филогенеза и понимания молекулярных механизмов изменчивости и популяционнного разнообразия. В связи с этим дальнейшее изучение новых представителей этого семейства продолжает оставаться актуальной задачей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Юрченко, Юлия Валерьевна, Москва

1. Иммуноферментный анализ. / Под ред. Нго Т.Г., Ленхоффа Г. М.: Мир, 1988.

2. Вилкинсон Д. // Принципы и методы диагностической энзимологии. М.: Медицина, 1981. С. 154-169, 355-384,387-393, 464-478, 540-542.

3. Глик Б., Пастернак Д. // Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002. С. 179-203.

4. Дзантиев Б.В., Гаврилова Е.М., Егоров A.M. // Введение в прикладную энзимологию. Иммобилизированные ферменты. / Под ред. Березина И.В., Мартинека K.M.: Изд-во МГУ, 1982, С. 343-352.

5. Егорова Л.А., Логинова Л.Г. (1984). Отбор культуры, образующей щелочную фосфатазу у термофильных бактерий рода Thermus. Микробиология. Т. 53, вып. 2, 242-245.

6. Зуева H.H., Далев П.Г., Лазарова Д.Л. (1993). Свойства, получение и практическое применение щелочной фосфатазы. Биохимия. Т.58, вып. 7, 1009-1023.

7. Квеситадзе Г.И. // Ферменты микроорганизмов, живущих в экстремальных условиях. М.: Наука, 1990. С. 11-16,20-27.

8. Крупянко В.И., Колот М.Н., Несмеянова М.А. (1981). Сравнительное изучение свойств периплазматической и мембраносвязанной щелочной фосфатазы Е. coli. Биохимия. Т.46, вып. 7, 1249-1257.

9. Логинова Л.Г. // Биология термофильных микроорганизмов. М.: Наука, 1986. С. 5-22.

10. Логинова Л.Г., Егорова Л.А. (1975). Облигатно-термофильные бактерии Thermus ruber в гидротермах Камчатки. Микробиология. Т. 44, вып. 4, 661665.

11. И. Логинова Л.Г, Храпцова Г.И., Богданова Т.Н., Егорова Л.А., Серегина Л.М. (1978). Термофильные бактерии Thermus ruber, продуцирующие ярко-оранжевый пигмент. Микробиология. Т.47, вып. 3, 561-562.

12. Мецлер Д. // Биохимия. М.: Мир, 1981. Т. 2. С. 118-119.

13. Спиро Т.Г. // Неорганическая биохимия. Т. 1. / Под ред. Эпхгорна Г.М.: Мир, 1978. С. 633-644, 656.

14. Хьюз М. // Неорганическая химия биологических процессов. М.: Мир, 1983. С. 28, 74-79.

15. Шарипова М.Р., Балабан Н.П., Марданова A.M., Нехотяева Н.В., Дементьев A.A., Вершинина O.A., Гарусов A.B., Лещинская И.Б. (1998). Получение и характеристика секретируемой щелочной фосфатазы Bacillus intermedius. Биохимия. Т. 63, вып. 10,1385-1390.

16. Adams M.W., Kelly R.M. (1994). Thermostability and thermoactivity of enzymes from hyperthermophilic Archaea. Bioorg. Med. Chem. 2,659-667.

17. Amemura, M., Shinagawa, H., Makino, K., Otsuji, N. & Nakata, A. (1982). Cloning of and complementation tests with alkaline phosphatase regulatory genes (phoS and phoT) of Escherichia coli. J. Bacteriol. 152,692-701.

18. Argos P., Rossman M.G., Grau U.M., Zuber H., Frank G., Tratschin J.D. (1979). Thermal stability and protein structure. Biochemistry. 18, 5698-5703.

19. Bauer K., Struyve M., Bosch D., Benz R., Tommassen J. (1989). One single lysine residue is responsible for the special interaction between polyphosphate and the outer membrane porin PhoE of E. coli. J. Biol. Chem. 264, 1639316398.

20. Becker G., Hengge-Aronis R. (2001). What makes an Escherichia coli promoter os dependent? Role of the —13/—14 nucleotide promoter positions and region 2.5 of os. Mol. Microbiol. 39, 1153-1165.

21. Baykov A.A., Evtushenko O.A., Avaeva S.M. (1988). A malachite green procedure for orthophosphate determination and its use in alkaline phosphatase-based enzyme immunoassay. Anal. Biochem. 171, 266-270.

22. Bradford M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Boichem. 72,248-254.

23. Bradshaw R.A., Cancedda F., Ericsson L.H., Neumann P.A., Piccoli S.P., Schlesinger M.J., Shriefer K., Walsh K.A. (1981). Amino acid sequence of

24. Escherichia coli alkaline phosphatase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 78, 34733477.

25. Braig K., Otwinowski Z., Hegde R., Boisvert D.C., Joachimiak A., Horwich A.L., Sigler P.B. (1994). The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. Nature. 371, 578-586.

26. Burley S.K., Petsko G.A. (1985). Aromatic-aromatic interaction: a mechanism of protein structure stabilization. Science. 229,23-28.

27. Chang A.C.Y., Cohen S.N. (1978). Construction and characterization of amplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P15A cryptic miniplasmid. J. Bacteriol. 134, 1141-1156.

28. Chang C.N., Kuang W.-J., Chen E.Y. (1986). Nucleotide sequence of the alkaline phosphatase gene of Escherichia coli. Gene. 44, 121-125.

29. Chen H., Leder P. (1999). A new signal sequence trap using alkaline phosphatase as a reporter. Nucleic Acids Res. 27,1219-1222.

30. Cole P.A. (1996). Chaperone-assisted protein expression. Structure. 4,239-242.

31. Coleman J.E. (1992). Structure and mechanism of alkaline phosphatase. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 21,441-483.

32. Cowan D.A., Daniel R.M. (1982). Purification and some properties of an extracellular protease (caldolysin) from an extreme thermophile. Biochim. Biophys. Acta. 705, 293-305.

33. Cupo P., El-Deiry W., Whitney P.L., Awad W.M. (1980). Stabilization of proteins by guanidination. J. Biol. Chem. 255, 10828-10833.

34. Dong G., Zeikus J.G. (1997). Purification and characterization of alkaline phosphatase from Thermotoga neapolitana. Enzyme Microb. Technol. 21, 335— 340.

35. DuBose R.F., Yartl D.L. (1990). The molecular evolution of bacterial alkaline phosphatase: correlating variation among enteric bacteria to experimental manipulations of the protein. Mol. Biol. Evol. 7(6), 547-577.

36. Ehle H., Bublitz R., Horn A. (1985a). Intralumenal alkaline phosphatase of the calf intestine. Biomed. Biochim. Acta. 44,223-233.

37. Ehle H., Muller E., Horn A. (1985b). Alkaline phosphatase of the calf intestine hydrolyzes phospholipids. FEBS Letters. 183,413-416.

38. Facchiano A.M., Colonna G., Ragone R. (1998). Helix stabilizing factors and stabilization of thermophilic proteins: an X-ray based study. Protein Eng. 11, 753-760.

39. Ferreira A.M., Wait R., Nobre M.F., Costa M.S. (1999). Characterization of glycolipids from Meiothermus spp. Microbiology. 145, 1191-1199.

40. Fischer F., Zillig W., Stetter K.O., Schreiber G. (1983). Chemolithoautotrophic metabolism of anaerobic extremely thermophilic archaebacteria. Nature. 10, 511-513.

41. Galperin M.Y., Bairoch A., Koonin E.V. (1998). A superfamily of metalloenzymes unifies phosphopentomutase and cofactor-independent phosphoglycerate mutase with alkaline phosphatases and sulfatases. Protein Sci. 7,1829-1835.

42. Gettins P., Coleman J.E. (1983). 31P nuclear magnetic resonance of phosphoenzyme intermediates of alkaline phosphatase. J. Biol. Chem. 258, 408416.

43. Gettins P., Coleman J.E. (1984). Zn(II)-u3Cd(II) and Zn(II)-Mg(II) hybrids of alkaline phosphatase. 3IP and 113Cd NMR. J. Biol. Chem. 259,4991-4997.

44. Gettins P., Metzler M., Coleman J.E. (1985). Alkaline phosphatase. 31P NMR probes of the mechanism. J. Biol. Chem. 260,2875-2883.

45. Haney P.J., Stees M., Konisky J. (1999). Analysis of thermal stabilizing interactions in mesophilic and thermophilic adenylate kinases from the genus Methanococcus. J. Biol. Chem. 274,28453-28458.

46. Hendrix R.W. (1979). Purification and properties of GroE, a host protein involved in bacteriophage assembly. J. Mol. Biol. 129,375-392.

47. Hoffer S.M., Tommassen J. (2001). The phosphate-binding protein of Escherichia coli is not essential for Pj-regulated expression of the pho regulon. J. Bacteriol. 183,5768-5771.

48. Hoffman S.C., Wright A. (1985). Fusions of secreted proteins to alkaline phosphatase: an approach for studying protein secretion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 5107-5 111.

49. Holmes M.A., Matthews B.W. (1982). Structure of thermolysin refined at 1.6 A resolution. J. Mol Biol 160, 623-639.

50. Holtz K.M., Kantrowitz E.R. (1999). The mechanism of the alkaline phosphatase reaction: insights from NMR, crystallography and site specific mutagenesis. FEBS Lett. 462, 7-11.

51. Hulett F.M., Kim E.C., Bookstein C., Kapp N.V., Edwards C.W., Wyckoff H.W. (1991). Bacillus subtilis alkaline phosphatases III and IV. J. Biol Chem. 266, 1077-1084.

52. Hull W.E., Halford S.E., Gutfreund H., Sykes B.D. (1976). 31P nuclear magnetic resonance study of alkaline phosphatase: The role of inorganic phosphate in limiting the enzyme turnover rate at alkaline pH. Biochemistry, 15,1547-1561.

53. Ikai A. (1980). Thermostability and aliphatic index of globular proteins. J. Biochem. (Tokyo). 88,1895-1898.

54. Imanaka T., Atomi H. (2002). Catalyzing "hot" reactions: enzymes from hyperthermophilic Archaea. Chem Rec. 2,149-163.

55. Jablonski E., Moomaw E.W., Tullis R.H., Ruth J.L. (1986). Preparation of oligodeoxynucleotide-alkaline phosphatase conjugates and their use as hybridization probes. Nucleic Acids Res. 14, 6115-6128.

56. Jaenicke R. (1981). Enzymes under extremes of physical conditions. Annu. Rev. Biophys. Bioeng. 10, 1-67.

57. Janeway C.M.L., Xu X., Murphy J.E., Chaidaroglou A., Kantrowitz E.R. (1993). Magnesium in the active site of Escherichia coli alkaline phosphatase isimportant for both structural stabilization and catalysis. Biochemistry. 32, 16011609.

58. Ji C.N., Jiang T., Chen M.Q., Sheng X.Y., Mao Y.M. (2001). Purification, crystallization and preliminary X-ray studies of thermostable alkaline phosphatase from Thermus sp. 3041. Acta Cryst. D57, 614-615.

59. Karshikoff A., Ladenstein R. (1998). Proteins from thermophilic and mesophilic organisms essentially do not differ in packing. Protein Eng. 11, 867-872.

60. Kendall D.A., Bock S.C., Kaiser E.T. (1986). Idealization of the hydrophobic segment of the alkaline phosphatase signal peptide. Nature. 321, 706-709

61. Khatkhatay M.I., Desai M. (1999). A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J. Immunoassay. 20,151-183.

62. Kim Y.J., Park T.S., Kim H.K., Kwon S.T. (1997). Purification and characterization of a thermostable alkaline phosphatase produced by Thermus caldophilus GK24. J. Biochem. Mol. Biol. 30, 262-268.

63. Kim E.E., Wyckoff H.W. (1989). Structure of alkaline phosphatases. Clinic. Chim. Acta. 186,175-187.

64. Kim E.E., Wyckoff H.W. (1991). Reaction mechanism of alkaline phosphatase based on crystal structures. J. Mol Biol 218,449-464.

65. Klevan L., Gebeyehu G. (1990). Biotinylated nucleotides for labeling and detecting DNA. Methods Enzymol. 184, 561-577.

66. Kojoh K., Matsuzawa H., Wakagi T. (1999). Zinc and N-terminal extra stretch of the ferredoxin from a thermoacidophilic archaeon stabilize the molecule at high temperature. Eur. J. Biochem. 264, 85-91.

67. Kreil G. (1981). Transfer of proteins across membranes. Annu. Rev. Biochem. 50,317-348.

68. Laemmli U.K. (1970). Cleavage of the structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685.

69. Lazdunski M., Petitclerc C., Chappelet D., Lazdunski C. (1971). Flipflop mechanisms in enzymology. A model: the alkaline phosphatase of E. coli. Europ. J. Biochem., 20, 124-139.

70. Le Du M.H., Stigbrand T., Taussing M.J., Menez A., Stura E.A. (2001). Crystal structure of alkaline phosphatase from human placenta at 1.8Ä resolution. J. Biol. Chem. 276, 9158-9165.

71. Machida S.Yu.Y., Singh S.P., Kim J.-D., Hayashi K., Kawata Y. (1998). Overproduction of ß-glucosidase in active form by an Escherichia coli system coexpressing the chaperonin GroEL/ES. FEMS Microbiol. Lett. 159,41-46.

72. Makino K., Shinagawa H., Amemura M., Kimura S., Nakata A., Ishihama A.1988). Regulation of the phosphate regulon of Escherichia coli. Activation of pstS transcription by PhoB protein in vitro. J. Mol. Biol. 203, 85-95.

73. Makino K., Shinagawa H., Amemura M., Kawamoto T., Yamada M., Nakata A.1989). Signal transduction in the phosphate regulon of Escherichia coli involves phosphotransfer between PhoR and PhoB proteins. J. Mol. Biol. 210, 551-559.

74. Makino K., Amemura M., Kim S., Nakata A., Shinagawa H. (1993). Role of the a70 subunit of RNA polymerase in transcriptional activation by activator protein PhoB in Escherichia coli. Genes Dev. 7, 149-160.

75. Marmur J. (1961). A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms. J. Mol. Biol. 3, 208-218.

76. Martinez M.B., Schendel F.J., Flickinger M.C., Nelsestuen G.L. (1992). Kinetic properties of enzyme populations in vivo: alkaline phosphatase of the Escherichia coli periplasm. Biochemistry. 31, 11500-11509.

77. Matsumura M., Signor G, Matthews B.W. (1989). Substantial increase of protein stability by multiple disulphide bonds. Nature. 342,291-293.

78. Mori S., Okamoto M., Nishibori M., Ichimura M., Sakiyama J., Endo H. (1999). Purification and characterization of alkaline phosphatase from Bacillus stearothermophilus. Biotechnol. Appl. Biochem. 29, 235-239.

79. Moss D.W. (1992). Perspectives in alkaline phosphatase research. Clin. Chem. 38/12,2486-2492.

80. Murphy J.E., Kantrowitz E.R. (1994). Why are mammalian alkaline phosphatases much more active than bacterial alkaline phosphatases? Mol. Microbiol. 12,351-357.

81. Murphy J.E., Xu X., Kantrowitz E.R. (1993). Conversion of a magnesium binding site into a zinc binding site by a single amino acid substitution in Escherichia coli alkaline phosphatase. J. Biol. Chem. 268,21497-21500.

82. Murphy J.E., Tibbitts T.T., Kantrowitz E.R. (1995). Mutations at positions 153 and 328 in Escherichia coli alkaline phosphatase provide insight towards the structure and function of mammalian and yeast alkaline phosphatases. J. Mol. Biol. 253,604-617.

83. Nickerson D.A., Kaiser R., Lappin S., Stewart J., Hood L., Landegren U. (1990). Automated DNA diagnostic using an ELISA-based oligonucleotide ligation assay. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 87, 8923-8927.

84. O'Brien P.J., Herschlag D. (2001). Functional interrelationships in the alkaline phosphatase superfamily: phosphodiesterase activity of Escherichia coli alkaline phosphatase. Biochemistry. 40 (19), 5691-5699.

85. Oshima T. In Enzyme engineering, Broun G.B. et al. (eds.), N. Y.: L.: Plenum Press. 1978. Vol. 4,41-46.

86. Oshima T. (1982). A pentaamine is present in an extreme thermophile. J. Biol. Chem. 257, 9914-9914.

87. Oswald T., Wende W., Pingoud A., Rinas U. (1994). Comparison of N-terminal affinity fusion domains: effect on expression level and product heterogeneity of recombinant restriction endonuclease EcoRV. Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 73-77.

88. Otvos J.D., Alger J.R., Coleman J.E., Armitage I.M. (1979). 31P NMR of alkaline phosphatase. Saturation transfer and metal phosphorus coupling. J. Biol. Chem. 254,1778-1780.

89. Pace C.N. (1992). Contribution of the hydrophobic effect to globular protein stability. J. Mol. Biol. 226,29-35.

90. Page R.D.M. (1996). TREEVIEW: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput. Appl. Biosci. 12, 357-358.

91. Pantazaki A.A., Karagiorgas A.A., Liakopoulou-Kyriakides M., Kyriakidis D.A. (1998). Hyperalkaline and thermostable phosphatase in Thermus thermophilics. Appl. Biochem. Biotechnol. 75, 249-259.

92. Park T., Lee J.H., Kim H.K., Hoe H.S., Kwon S.T. (1999). Nucleotide sequence of the gene for alkaline phosphatase of Thermus caldophilus GK24 and characteristics of the deduced primary structure of the enzyme. FEMS Microbiol. Letters. 180,133-139.

93. Proudfoot A.E.I., Goffin L., Payton M.A., Wells T.N.C., Bernard A.R. (1996). In vivo and in vitro folding of a recombinant metalloenzyme, phosphomannose isomerase. Biochem. J. 318, 437—442.

94. Rao N.N., Wang E., Yashphe J., Torriani A. (1986). Nucleotide pool in pho regulon mutants and alkaline phosphatase synthesis in Escherichia coli. J. Bacterial. 166, 205-211.

95. Reid T.W., Wilson I.B. Escherichia coli alkaline phosphatase. In The Enzymes, P.D. Boyer (ed.), 3rd ed., Academic Press, New York. 1971. Vol. 4,373-415.

96. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. 1989.

97. Saiki R.K., Walsh P.S., Levenson C.H., Elich H.A. (1989). Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence-specific oligonucleotide probes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86,6230-6234.

98. Saitou N., Nei M. (1987). The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol. Biol. Evol. 4 (4), 406-425.

99. Schein C.H., Notebora M.H.M. (1988). Formation of soluble recombinant proteins in Escherichia coli is favored by lower growth temperature. Bio/Technology. 6,291-294.

100. Scholten M., Janssen R., Bogaarts C., van Strien J., Tommassen J. (1995). The pho regulon of Shigella flexneri. Mol. Microbiol. 15, 247-254.

101. Shine J., Dalgarno L. (1975). Determination of cistron specificity in bacterial ribosomes. Nature. 254,34-38.

102. Stec B., Holtz K.M., Kantrowitz E.R. (2000). A revised mechanism for the alkaline phosphatase reaction involving three metal ions. J. Mol. Biol. 299, 1303-1311.

103. Steed P.M., Wanner B.L. (1993). Use of the rep technique for allele replacement to construct mutants with deletions of the pstSCAB-phoU operon: evidence of a new role for the PhoU protein in the phosphate regulon. J. Bacteriol. 175, 67976809.

104. Tanner J.J., Hecht R.M., Krause K.L. (1996). Determinants of enzyme thermostability observed in the molecular structure of Thermus aquaticus D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase at 2.5 A resolution. Biochemistry. 35,2597-2609.

105. Thomas J.G., Ayling A., Baneyx F. (1997). Molecular chaperones, folding catalysts, and the recovery of active recombinant proteins from E. coli. Appl. Biochem. Biotechnol. 66, 197-238.

106. Tommassen J., de Geus P., Lugtenberg B., Hackett J., Reeves P. (1982). Regulation of the pho regulon of Escherichia coli K-12. Cloning of the regulatory genes phoB and phoR and identification of their gene products. J. Mol. Biol. 157,265-274.

107. Torriani A. (1990). From cell membrane to nucleotides: the phosphate regulon in Escherichia coli. Bioessays. 12, 371-376.

108. Vieille C., Zeikus G.J. (2001). Hyperthermophilic enzymes: sources, uses, and molecular mechanisms for thermostability. Microbiol Mol Biol Rev. 65, 1—43.

109. Walker J.E., Wonacott A.J., Harris J.I. (1980). Heat stability of a tetrameric enzyme, D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Eur. J. Biochem. 108, 581-586.

110. Wang C., Eufemi M., Turano C., Giartosio A. (1996). Influence of the carbohydrate moiety on the stability of glycoproteins. Biochemistry. 35, 72297307.

111. Wanner B.L., Latterell P. (1980). Mutants affecting alkaline phosphatase expression: evidence for multiple positive effectors for the phosphate regulon in E. coli. Genetics. 96, 353-366.

112. Wheeler D.L., Chappey C., Lash A.E., Leipe D.D., Madden T.L., Schuler G.D., Tatusova T.A., Rapp B.A. (2000). Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Res. 28 (1), 10-14.

113. Willsky G.R., Bennett R.L., Malamy M.H. (1973). Inorganic phosphate transport in Escherichia coli: involvement of two genes which play a role in alkaline phosphatase regulation. J. Bacteriol. 113, 529-539.

114. Willsky G.R, Malamy M.H. (1976). Control of the synthesis of alkaline phosphatase and the phosphate-binding protein in Escherichia coli. J. Bacteriol. 127, 595-609.

115. Xu X., Kantrowitz E.R. (1991). A water-mediated salt link in the catalytic site of Escherichia coli alkaline phosphatase may influence activity. Biochemistry. 30,7789-7796.

116. Yang T.T., Sinai P., Kitts P.A., Kain S.R. (1997). Quantification of gene expression with a secreted alkaline phosphatase reporter system. Biotechniques. 23,1110-1114.

117. Yazynin S., Lange H., Mokros T., Deyev S., Lemke H. (1999). A new phagemid vector for positive selection of recombinants based on conditionally lethal barnase gene. FEBS Lett. 452, 351-354.

118. Yeh M.F., Trela J.M. (1976). Purification and characterization of a repressible alkaline phosphatase from Thermus aquaticus. J. Biol. Chem. 251,3134-3139.

119. Yuan Y.Z., Sheng X.Y., Lu H.Y., Tong S., Mao Y.M. (1998). Thermostable alkaline phosphatase from Thermus sp. FD3041: cloning of the gene and expression in E. coli. Yi Chuan Xue Bao. 25,375-380. (in Japanese).

120. Zappa S., Rolland J.L., Flament D., Gueguen Y., Boudrant J., Dietrich J. (2001). Characterization of a highly thermostable alkaline phosphatase from the euryarchaeon Pyrococcus abyssi. Appl. Environ. Microbiol. 67,4504-4511.

121. Zeikus J.G., Wolfe R.S. (1972). Methanobacterium thermoautotrophicus sp. nov., an anaerobic, autotrophic, extreme thermophile. J. Bacteriol. 109, 707715.

Информация о работе

Юрченко, Юлия Валерьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2005
ВАК 03.00.03

Диссертация

Щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber: клонирование гена и свойства рекомбинантного белка - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы