Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

β-пропеллерная фитаза Bacillus ginsengihumi: клонирование гена, очистка белка, свойства фермента

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "β-пропеллерная фитаза Bacillus ginsengihumi: клонирование гена, очистка белка, свойства фермента"

На правах рукописи

АХМЕТОВА АЛИНА ИЛЬДУСОВНА

р-ПРОПЕЛЛЕРНАЯ ФИТАЗА BACILLUS GINSENGIHUMI: КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА, ОЧИСТКА БЕЛКА, СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА

03.02.03 -микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

005542687

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

5 ДЕК ¿U13

Казань-2013

005542687

Работа выполнена в лаборатории биосинтеза и биоинженерии ферментов кафедры микробиологии Института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Научный руководитель: д.б.н. проф. Шарипова Маргарита Рашидовна

Официальные оппоненты: д.б.н. Дегтярева Ирина Александровна,

Государственное научное учреждение Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения Россельхозакадемии, заведующий лабораторией

к.б.н. Куликов Сергей Николаевич,

Федеральное бюджетное учреждение науки «Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии»

Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник

Ведущая организация: Государственное научное учреждение Татарский

Научно-исследовательский институт сельского

хозяйства Российской академии сельскохозяйственных наук, г.Казань

Защита диссертации состоится «26» декабря 2013г. в 13.00 ч на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при ФГАОУВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет» по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, главное здание, аудитория №211.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского Казанского (Приволжского) федерального университета по адресу: 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, 35.

Автореферат разослан «Л'» ноября 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

3. И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Значительную долю в рационах моногастричных животных занимают пшеница, ячмень, рожь и другие зерновые культуры, обладающие не только питательными, но и отрицательными свойствами (Tran J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2010). В злаках, бобовых и семенах масличных культур содержится фитиновая кислота, которая связывает фосфор и делает корма на 70-80% недоступными для переваривания животными. Это ограничивает использование перечисленных культур в кормлении и, особенно, при разработке высоко - концентрированных рационов для интенсивного выращивания животных и птицы (Ramesh A., Indian J. Microbiol, 2011). Фитиновая кислота - это специфическое химическое соединение шестиатомного спирта инозитола, по гидроксильным радикалам которого связано 6 остатков фосфорной кислоты (Kumar V., World J. Microbiol. Biotechnol., 2013). Остатки фосфорной кислоты химически активны и связывают ионы металлов — кальций, натрий, калий, цинк, медь. Фитиновая кислота также взаимодействует с остатками аминокислот, переводя их в недоступное для растений и бактерий состояние. Соли фитиновой кислоты -фитаты - составляют почти 50% от общего органического фосфора и более 80% от общего фосфора в кормах растительного происхождения (Ramesh A., Indian J. Microbiol, 2011).

Переводить фитаты в доступное состояние путем высвобождения фосфатов способны бактерии. Они щдролизуют эти соединения с помощью ферментов - фитаз (Coban Н., Bioprocess Biosyst Eng., 2013). Это особая группа фосфомоноэстераз, способных гидролизовать фитат на более доступные фосфатсодержащие соединения. Фитазы практически не вырабатываются в пищеварительном тракте свиней, птицы и других животных с однокамерным желудком (Jorquera М., FEMS Microbiol Ecol., 2012). Как правило, в условиях низкой активности или полного отсутствия фитаз фитиновый фосфор и связанные с ним полезные питательные вещества, проходят желудочно-кишечный тракт транзитом (George Т., FEMS Microbiol Ecol., 2009).

Существует острая необходимость в разработке новых наукоемких биотехнологий, основанных на использовании бактериальных ферментов, которые могут служить кормовыми добавками для утилизации фитатов. Поэтому вопросы, связанные с поиском микроорганизмов-продуцентов фитат-гидролизующих ферментов, получением этих белков, изучением структуры и свойств микробных фитаз, а также созданием на их основе новых биотехнологий являются актуальным и направлены на решение этой проблемы.

Цель работы - изоляция и характеристика штаммов бацилл обладающих фитат-гидролизующей активностью, клонирование гена фитазы, очистка белка и изучение его свойств.

Основные задачи исследования:

1. Поиск и выделение грамположительных микроорганизмов, обладающих фитат-гидролизующей активностью, из образцов почв республики Татарстан.

2. Клонирование и секвенирование гена фитазы штамма изолята, получение рекомбинантного штамма с высокой активностью фермента.

3. Разработка метода выделения и очистки фитазы В.&юепф]хит1 М2.11, установление первичной структуры и свойств фермента.

4. Определение токсичности и биологических свойств В^т$еп&кит1 М2.11 - продуцента фитазы.

Научная новизна

Впервые из образцов почв республики Татарстан изолирован штамм B.ginsengihumi M2.ll с высокой фитат-гидролизующей активностью, клонирован ген фермента и установлена его последовательность. Получен эффективный вектор экспрессии с геном фитазы B.g¡nseng¡humi M2.ll и рекомбинантный штамм, позволяющий получать белок в препаратных количествах. Разработан метод очистки бациллярной фитазы, включающий аффинную, ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию. Установлена первичная структура фитазы В^Шеп^китЬ M2.ll. Фермент принадлежит к классу р-пропеллерных фосфатаз с молекулярной массой 41 кДа, изоэлектрической точкой р1 4.8.Полученные данные о свойствах фермента пополняют знания о Р-пропеллерных фитазах бацилл.

Практическая значимость результатов

Выделенный из образцов почв республики Татарстан штамм В^теп^Ъитх M2.ll обладает фитат-гидролитической активностью, не токсичен и оказывает стимулирующее влияние на рост и развитие картофеля и может быть использован в сельском хозяйстве как биоудобрение, стимулирующее рост и развитие растений, а также в качестве кормовой добавки в животноводстведля повышения продуктивности. Разработанный метод очистки фитазы B.ginsengihumi M2.ll может служить основой для его использования в биотехнологии растений и сельском хозяйстве.

Связь работы с научными программами.

Работа выполнена в соответствии с планом НИР Казанского (Приволжского) федерального университета (№ ГОс. регистрации 01:02.00

104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования выполнены при поддержке грантов для молодых ученых от Академии наук республики Татарстан №13-20/Г-2010 и №13-24/2011, грантовГерманской службы академических обменов DAAD по программе «Евгений Завойский» № А/10/85937 и № А/12/71727,гранта РФФИ 12-08-00942а, Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» 2009-2013 гг.: ГК № П344, ГК № П406, ГК № П323, ГК № 815, ГК № 1053, соглашения №14.132.21 Л786 и 14.А18.21.0575. Положения, выносимые на защиту:

1. Изолирован и идентифицирован новый продуцент фитазы B.ginsengihumi M2.ll, ген фермента клонирован и секвенирован, белок очищен, классифицирован как p-пропеллерная фосфатаза, изучены энзиматические свойства фермента.

2. Штамм B.ginsengihumi М2.11— продуцент фитазы - не токсичен в отношении растений и стимулирует их рост и развитие.

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на международных научных конференциях: IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» Казань, 2009), научно-практическая конференция биохимиков, посвященная памяти профессора В.Г.Винтера «История и достижения Казанской биохимической школы» Казань, 2009), XIII annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2009" "Biology: Expansion of Borders" (Казань, 2009), XIII annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2009" "Biology: Expansion of Borders" Эскишехир, Турция, 2010), на российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010), XV annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2011", (Базель, Швейцария, 2011), "Students, Masters and PhD Students III Annual International Scientific Conference in Biology" dedicated to the Academician Peter Kometiani (Тбилиси, Грузия, 2011), XIX Международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2012), XVI annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2012" (Szeged, Hungary, 2012), открытом конкурсе научных работ студентов и аспирантов им. Н.И. Лобачевского (Казань, 2012), международном конкурсе 2012 года «Russia Graduate competition for Alltech's Young Scientist Award», III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012), XX Международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов

и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2013), IV Российский симпозиум «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), Federation of European Biochemical Societies CONGRESS 2013 "Mechanisms in Biology" (FEBS) (Санкт-Петербург, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 28 научных работ, в том числеб статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертации, 1 учебно-методическое пособие.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю д.б.н., профессору кафедры микробиологии М.Р. Шариповой за постановку проблемы, внимательное отношение к работе и обсуждение полученных результатов; к.б.н., доц. A.M. Мардановой и к.б.н., с.н.с. Н.П. Балабан за постоянные консультации и обсуждение результатов; профессору Удо Хайнеманну за научные консультации по фитазам микроорганизмов, а также за возможность проведения исследований на базе Института Молекулярной Медицины Макса Дельбрука г. Берлин, Германия; профессору Фикреттину Шахину за сотрудничество и возможность проведения экспериментов по утилизации труднодоступных соединений в лаборатории университета Йедитепе г. Стамбул, Турция. Автор выражает искреннюю благодарность заведующей кафедрой микробиологии Казанского федерального университета д.б.н., профессору, академику АН РТ О.Н. Ильинской и всем сотрудникам кафедры за всестороннюю помощь и поддержку.

Структура и объём диссертации. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследований, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Работа изложена на 105 страницах машинописного текста, содержит 9 таблиц и 45 рисунков. Библиография содержит 84 наименований российских и зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Отбор и скрининг почвенных образцов. Отбор образцов почв проводили на различных территориях республики Татарстан в сентябре 2009: государственного унитарного предприятия агрокомбината «Майский» г. Казань, Казанского совхоза «Тепличный», лесной зоны д. Агерзе Азнакаевского района, приусадебного хозяйства с. Нижний Услон, придворовой зоны Казанского (Приволжского) федерального университета. Учет микроорганизмов проводили методом посева на среду PSM с фитатом натрия в качестве единственного источника фосфора.

Питательные среды и условия культивирования. Селекцию фитат-гидролизующих штаммов микроорганизмов проводили на фитат-содержащей среде PSM (Phytase Screening Medium) (Sasirekha, Euro. J. Exp. Bio., 2012).Культивирование бактерий проводили на среде LB (Sambrook and Russell,

6

2001). Для индукции эспрессии гена фитазы рекомбинантного штамма использовали среду на основе насыщенного бульона ТВ (Terrific Broth) (Geerlof A., Helmholtz Center Munich Protocols, 2010), а также использовали коммерческую экспресс-среду ТВ (Overnight Express Instant ТВ Medium, Novagen) (Scheich С., Nucleic Acids Res., 2007). Для изучения влияния бактерий на рост растений использовали соевую агаризованную среду на основе триптона TS A (Tryptic Soy Agar) (Leavitt J., The NY J. Dentist., 1955).

Штаммы бактерий и плазмиды. В работе использовали штаммы: Е. coli XLI-Blue, Е. coli DH5a, E.coli Rosseta 2 (DE3) T1R; плазмиды: pTZ57R/T; pQlinkU, pQLinkG и pET-46 (c His-tag). Штамм Xanthomonas sp. Xav5 использовали в тесте на определение токсичности в качестве контрольного фитопатогенного микроорганизма.

Микробиологическая система идентификации (Microbial Identification System,Version 6.2) Родовую принадлежность микроорганизмов определяли с помощью системы микробной идентификации на основе газохроматографического анализа метиловых эфиров жирных кислот клеточной мембраны бактерии. 20 часовую культуру бактерий собирали с агаризованной среды LB и помещали в пробирку. Выделяли фракцию эфиров для анализа как описано в методике (MIS Operating Manual, Version 6.2, 2012) Фракции помещали в хроматографические колонки и устанавливали в анализатор (Agilent GC 78900 Series).

Идентификацию микроорганизмов проводили на основе анализа последовательности гена 16S рРНК с использованием стандартных праймеров: 27F (5' GAGTTTGATCCTGGCTCAG 3') и 1525R (5' ACGGTTACCTTGTTACGACTT 3').

Активность фитазы определяли по количеству высвободившегося фосфора при гидролизе фитатанатрия по методу Грайнера (Greiner R., Can.J. Microbiol, 2007). За единицу активности принимали количество фермента, гидролизукяцего в условиях эксперимента 1 мМ субстрата за 1 мин.

Выделение ДНК из клеток бацилл проводили с помощью реактивов «GeneJet Genomic DNA Purification Kit», «GeneJET Plasmid Miniprep Kit» («Fermentas») согласно прилагаемому протоколу.

Клонирование гена phyBg в плазмиду pET-LIC проводили с помощью праймеров, содержащих комплиментарные нуклеотиды для отжига, старт -, стоп-кодоны и последовательности, кодирующие His-tag на N-конце. Амплификат гена фитазы клонировали в вектор рЕТ-46ЫС, который трансформировали в компетентные клетки E.coliDH5a. Анализ рекомбинантных плазмид проводили с помощью ферментов рестрикции BamHl

и Notl, ПЦР-реакции. Вектор pET-LIC/Phy трансформировали в коммерческий штамм-реципиент E.coli Rosseta 2 (DE3) T1R. Трансформанты выращивали на селективной среде ТВ с хлорамфениколом и карбоницилином (100 мг/мл).

Рестрикционпое картирование ДНК проводили набором рестриктаз фирмы «Fermentas» в течение 2 ч при 37°С в условиях, рекомендованных производителем.

Лигировапие ДНК проводили при температуре 4°С в течение ночи в 30 мкл реакционной смеси, содержащей 3 мкл лигазного буфера и 5 ед. акт. лигазы Т4 («Сибэнзим») на 1 мкг ДНК.

Трансформацию клеток E.coli плазмндной ДНК проводили как описано в работе (Sambrook et al., 1989).

Выделение ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью набора реактивов "Gel Extraction kit" (Fermentas).

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в термоциклере «MJ mini» производства фирмы «BioRad» (США) с использованием Pfii-полимеразы и Taq-полимерэзы фирмы «Сибэнзим», как описано (Sambrook J., Molecular Cloning, 1989).

Электрофорез проводили в горизонтальном агарозном геле (1%).

Иммуноблоттинг. Клетки рекомбинантного штамма разрушали с помощью ультразвука (20-50 кГц). Лизаты разделяли в SDS-ПААГ как описано в (Sambrook J., MolecularCloning, 2001). Western blot проводили как описано в методике (Sambrook J., MolecularCloning, 2001).

СеквенированиеДНК осуществляли в фирме «Синтол», г.Москва.

Выделение и очистку белка проводили из клеток рекомбинантного штамма E.coli Rosseta pET-LIC/Phy, разрушенных с помощью френч-прессав буфере, содержащем 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, протеиназу, 1 мг/мл (Fermentas) и ДНКазу, 1 мг/мл (Fermentas). Для очистки использовали аффинную хроматографию на основе Ni-гранул в 25 мМ Трис-HCl буфере, рН 8.0, хроматографию на Q - Sepharose в 25 мМ Трис-HCl, рН 8.0буфере и гель-фильтрацию белка на колонке Sephadex G200, уравновешенной 10 мМ Hepes буфером, рН7.5 с добавлением 5 мМ СаС12. Степень чистоты препаратов и молекулярную массу определяли методом электрофореза в 12.5%-ном ПААГ в присутствии SDS по методу Лаэммли (Laemmli U., Nature, 1970).

Белок определяли спектрофотометрически, считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует A2go = 1 оптической единице (опт. ед.) в кювете толщиной 1 см, а также по методу Брэдфорда (Bradford М., Analyt. Biochem, 1976).

рН-оптимум и рН-стабильность

рН-Оптимум фермента определяли по гидролизу фитата натрия в 0.1М натрий ацетатном буфере, рН 5.0- 5.5, 0.1М трис-малатном буфере, рН 6.0- 7.0 и в 0.1 М трис-HCl буфере рН 7.5 - 9.0. Для определения рН-стабильности фермент предварительно инкубировали в 0.1М буфере при рН 5.0- 9.0 в течение 24 ч при комнатной температуре и определяли активность.

Температурный оптимум и термостабильность

Температурный оптимум определяли по гидролизу фитата натрия в 0.1 М натрий ацетатном буфере рН4.5, инкубируя реакционную смесь при температурах 4, 17, 25, 30, 37, 42, 50, 60, 70, 80, 95°С. При изучении термостабильности растворы фермента предварительно инкубировали 40 мин при температурах от 4° до 95°С и затем определяли активность фитазы.

Влияние ионов металлов на активность фитазы

Для изучения влияния ионов двухвалентных металлов на активность фитазы использовали соли: MgCl2> СоС12, ZnCl2, СаС12, MnS04, FeS04 и CuS04 в конечной концентрации 2 мМ. К ферментному раствору добавляли растворы солей двухвалентных металлов и выдерживали при комнатной температуре в течение 30 мин, затем определяли активность фермента по гидролизу фитата натрия и выражали в процентах относительно контроля. Контролем (100%) служил уровень активности фермента в отсутствие ионов металлов.

Субстратную специфичность фитазы определяли по гидролизу фосфорилированных субстратов в концентрации ЗмМ: фитат натрия, нитрофенилфосфат, глицерофосфат, глюкозо-6-фосфат, аденозинтрифосфата (АТФ).

Масс-спекгрометрический анализ (MALDI-TOF).

Ферментобрабатывали трипсином по методике, изложенной на сайте (http://www.bioc.uzh.ch'). Пептиды различной молекулярной массы идентифицировали на масс-спектрометре Vision 2000 TOF («Thermo Bioanalysis», Великобритания). Данные обрабатывали с помощью программ PeptideMassFingerprint (http://www.matrixscience.com.) и PeptideMass (http://cn.expasv.org). Изоэлектрическую точку фермента определяли с использованием ресурса http://web.expasy.org/protparam/.

Геноинформатика

Выравнивание последовательностей проводили с использованием алгоритмов BLAST: пакета программ, представленных на сервере NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)H биоинформационного портала ExPASy (http://www.expasy.org).

последовательностям генов фитаз A.ficuum (AN AF537344.1) и A.awamori (AN DQ 192035.1) на 92%.

3. Амплификация гена фитазы и подбор оптимальный условий для полимеразной цепной реакции

На основании высокой гомологии генов мы сконструировали праймеры для клонирования гена фитазы В .ginsengihumi M2.ll. Для этого использовали последовательность гена фитазы B.subtilis 168 (ANNC000964.3). Праймеры NCBI-dir и NCBI-rev подобрали с помощью программы Primer BLAST на сервере NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.aov/), другая пара праймеров ORF-dir и ORF-rev ограничивала полную рамку считывания гена. С помощью 2-х пар праймеров проводили амплификацию гена фитазы с ДНК В.ginsengihumi М2.11. Размер ПЦР-продукта с применением обоих пар праймеров соответствовал 1149 п.н. и представлял амплификат гена фитазы В.ginsengihumi M2.ll. При оптимизации условий ПЦР выяснили, что при температуре отжига 58°Си применении праймеров ORF-dir и ORF-rev специфичность отжига увеличивалась (рис. 4).

Рис.4. Электрофорез амплификата гена фитазы с геномной ДНК В.ginsengihumi M2.ll. 1. - ПЦР-продукт, полученный при использовании праймеров NCBI- dir/ NCBI-rev, 2. - ПЦР-продукт, полученный при использовании праймеров ORF-dir/ ORF-rev, М - маркеры.

Таким образом, на основании высокой гомологии генов фитазу бацилл мы сконструировали праймеры и амплифицировали ген фитазы В.ginsengihumi M2.ll.

Продукт амплификации очищали и секвенировали (рис. 5). Установленная последовательность нуклеотидов амплификата гена фитазы В.ginsengihumi M2.ll, полученного с помощью праймеров, ограничивающих ORF, начиналась со старт - кодона ATG и заканчивалась стоп — кодоном TAG. Выравнивание последовательности с последовательностью гена B.subtilis 168

После трансформации вектора рЕТ-ЫС/Рку в реципиентный штамм Е.соП ОН5а из рекомбинантного штамма выделяли плазмиды и анализировали их на присутствие вставки (рис. 7).

Рис.7. Электрофорез ПЦР-продуктов, полученных с рекомбинантной плазмиды. М - маркер; 1-8 - амплификаты, полученные с использованием праймеров к гену phy Phy-LIC fw/rev.

ПЦР-анализ с праймерами к гену фитазы B.ginsengihumi M2.ll подтвердил наличие вставки в векторе экспрессии. Секвенирование вставки также показало присутствие гена фитазы в векторе. Вектор pET-LIC/Phy трансформировали в коммерческий беспротеазный штамм Escherichia coli Rosseta 2 (DE3) T1R, несущий ген устойчивости к хлорамфениколу. Трансформанты выращивали на специализированной обогащенной среде культивирования ТВ с антибиотиками хлорамфениколом и карбоницилином. На 24-ый ч роста отбирали клетки, разрушали с помощью френч-пресса и анализировали лизаты на SDS-ПААГ — электрофорезе (рис. 8). Проводили анализ продуктов экспрессии с помощью иммуноблотинга с антителами к His-tag.

Рис.8. Электрофорез (А) и иммуноблоттинг (Б)клеточных лизатов рекомбинантного штамма E.coU Rosseta pET-LIC/Phy на 24 ч роста. М -маркеры, 1—10 - белковые продукты.

штамма, молекулярная масса белка, определенная по данным электрофореза, составила 41 кДа.

8ерЬас1ех 0200: 1 — А28о, 2 - активность фермента; Б - БОБ-ПААТ -электрофорез фитазы после хроматографии на 8ер1шс1ех 0200: маркеры молекулярных масс (1), фракция белка после всех стадий очистки (2).

6. Определение первичной структуры фитазы

Первичную структуру очищенной фитазы B.ginsengihumi M2.ll устанавливали с помощью метода МАЬОЬТОР-масс-спектрометрии (рис. 10). Установлено, что аминокислотная последовательность фитазы полностью соответствует последовательности, конвертированной из последовательности нуклеотидов секвенированного нами гена фитазы B.ginsengihumi M2.ll. Последовательность аминокислот фитазы включала 371 а.о., что соответствовало молекулярной массе белка 41 кДа и подтвердило данные, полученные с помощью БОБ-электрофореза. Изоэлектрическая точка фитазы В^тве^Ишт1 M2.ll, установленная на основании структуры белка, составила р14.8.

Анализ первичной структуры фитазы B.ginsengihumi M2.ll показал наличие в молекуле белка шести консервативных сайтов связывания с кальцием, три из которых оказывают влияние на термостабильность фермента (Са1,Са2, СаЗ) и три определяют каталитическую активность белка (Са4, Са5, Саб).

картофель. В качестве контроля использовали раствор без добавления штамма-изолята(рис. 16А).

Рис.16. Модельный эксперимент с картофелем. А - контрольный образец, Б - опытный образец под воздействием штамма B.ginsengihumi М2.11.

Растения, обработанные B.ginsengihumi М2.11,отличались от контрольных растений высотой стебля (18±2 против 13±2 мм) и большей биомассой (5.6±0.5 против 2.8±0.5 г). Обработка семян суспензией В.&пзеп&кшт M2.ll приводила к повышению из всхожести. Таким образом, бактериальный штамм положительно влияет на рост и развитие картофеля.

Определяли токсичность выделенного нами штамма бактерии B.ginsengihumi M2.ll. Заражали листья модельного растения №соНапа 1аЪасит клетками бацилл и фитопатогенных бактерий Xanth.om.onas .•¡р. Хау5 в качестве положительного контроля (рис. 17). ХапЬкотопаэ .чр. Хау5 паразитирует на листьях табака и после инъекции внутрь листа развивается инфекционный процесс. В случае, если растение способно отразить влияние посторонней микрофлоры, штамм считается не токсичным.

Рис.17. Инфицирование листьев Шсойапа 1аЪасит штаммами микроорганизмов (А) - введение микроорганизмов в ткань листа; (Б) - листья, инфицированные ХаМкотопая эр. Хау5; (В) - листья, инфицированные М2.11.

Установлено, что растительные клетки табака противостояли действию В^1тещ1}гит1 M2.ll, в отличие от клеток ХаЫкотопая яр. Хау5, которые вызывали некрозы ткани. Таким образом, штамм B.ginsengihumi M2.ll, продуцент фитазы, после инъекции в растительную ткань не проявлял

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ахметова А.И. Выделение и характеристика новой фитазы бацилл / А.И. Ахметова, Ч. Нямсурен, Н.П. Балабан, М.Р. Шарипова // Биоорганическая химия. - 2013. - Т.39, № 4. - С.430-436. (перечень ВАК) - автора - 0.2 пл.

2. Ахметова А.И. Влияние клеточной магнетизации на рост и физиологические функции бацилл / А.И. Ахметова, Е.О. Михайлова, Р.Ф. Фахруллин, М.Р. Шарипова // Вестник Казанского технологического университета. - 2013. - №19. - С.203-207. (перечень ВАК) автора-0.1 пл.

3. Тойменцева A.A. Штаммы Bacillus pumilus с инактивированными генами внеклеточных сериновых протеиназ / A.A. Тойменцева, А.И. Ахметова, М.Р. Каримова, Ч. Нямсурэн, Ю.О. Пономарева, Е.И. Шагимарданова, A.A. Ризванов, М.Р. Шарипова // Микробиология. - 2013. - Т.82, №1. - С.59. (перечень ВАК) автора - 0.2 пл.

4. Ахметова А.И. Фитазы как основа новых микробных технологий в кормлении животных / А.И. Ахметова, А.Д.Мухаметзянова, М.Р. Шарипова // Учен. зап. Казан, унта. Сер. Естеств. науки. - 2012. - Т. 154, кн. 2, - С. 103-110. (перечень ВАК) автора - 0.2 пл.

5. Мухаметзянова А. Д. Микроорганизмы как продуценты фитаз / А.Д. Мухаметзянова, А.И. Ахметова, М.Р. Шарипова // Микробиология. - 2012. - Т. 81, № 3. - С.1-10. (перечень ВАК) автора - 0.2 пл.

6. Шарипова М. Р. Новое филогенетическое положение штамма Bacillus intermedius 3-19 / М.Р. Шарипова, A.A. Тойменцева, А.Р. Сабирова, А.Д. Мухаметзянова, А.И. Ахметова, A.M. Марданова, Н.П. Балабан // Микробиология. - 2011. Т.80, №3. - С.424-426. (перечень ВАК) автора - 0.1 пл.

7. Мухаметзянова А.Д. Изоляция и идентификация продуцентов фитаз, выделенных и образцов почв Республики Татарстан / АД. Мухаметзянова, А.И. Ахметова, М.Р. Шарипова // Казанская наука. - 2010. - №12. - С.24-28. (перечень ВАК) автора - 0.1 пл.

8. Мухаметзянова А.Д. Фитаза микроорганизмов как основа новых биоудобрений для улучшения роста растений / А.Д. Мухаметзянова, А.И. Ахметова, М.Р.Шарипова // Казанская наука. - 2010. - №1. - С. 11-13. (перечень ВАК) автора - 0.1 пл.

9. Akhmetova A. Phytase of Bacillus sp. M2.11: clonning, expression and purification / A. Akhmetova, M. Sharipova H FEBS Journal. - 2013. - V. 280. Suppl. 1. - P. 609.

10. Chuluuntsetseg N. Development of transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a root-specific phytase of microbial origin / N. Chuluuntsetseg, L. Valeeva, A. Akhmetova, A. Suleymanova, N. Balaban, E. Shakirov, M. Sharipova // FEBS Journal - 2013. - V. 280, Suppl. l.-P. 602.

11. Ахметова А.И. Лигазо-независимое клонирование. Учебно-методическое пособие / А.И. Ахметова, М.Р. Шарипова. - Казань: Казанский (Приволжский) федеральный университет, 2013. - 14с.

12. Ахметова А.И. Выделение и очистка новой фитазы бацилл / А.И.Ахметова, М.Р. Шарипова // Материалы VI Российского Симпозиума «Белки и Пептиды». Уфа: 2013. -С. 257.

13. Ахметова А.И. Получение рекомбинантного штамма Escherichia coli, способного к гиперпродукции фитазы бацилл // Материалы XX Международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», секция «Биоинженерия и биоинформатика». Москва: 2013. - С.1-2.

Подписано в печать 25.11.2013. Форм. бум. 60x84 1/16. Печ. л. 1,5. Тираж 100. Заказ №2511/1. Отпечатано с готового оригинал - макета в типографии «Вестфалика» (ИП Колесов В.Н.) 420111, г. Казань, ул. Московская, 22. Тел.: 292-98-92 e-mail: westfalika@inbox.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ахметова, Алина Ильдусовна, Казань

Министерство образования и науки Российской Федерации

Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КАЗАНСКИЙ (ПРИВОЛЖСКИЙ) ФЕДЕРАЛЬНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

04201455178

АХМЕТОВА АЛИНА ИЛЬДУСОВНА

Р-ПРОПЕЛЛЕРНАЯ ФИТ A3 А BACILLUS GINSENGIHUMI: КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНА, ОЧИСТКА БЕЛКА, СВОЙСТВА

ФЕРМЕНТА

03.02.03 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель доктор биологических наук профессор М.Р.Шарипова

Казань-2013

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 9

1. Фитаты и их распространение 9

2. Микробные фитазы, классификация и свойства \}

3. Генная инженерия фитаз

4. Биотехнологическое применение фитаз 23 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 28

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 29

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 29

1. Отбор и скрининг почвенных образцов 29

2. Среды и условия культивирования бактерий 29

3. Штаммы бактерий и плазмиды 31

4. Идентификация штамма на основе МК-анализа 31

5. Идентификация микроорганизмов на основе анализа

16Б рРНК 33

6. Определение фитазной активности 33

7. Выделение ДНК из клеток бацилл 34

8. Выделение плазмидной ДНК 34

9. Конструирование плазмид с геном фитазы В.

35

ginsengihumi М2.11

9.1 КлонированиеphyBg в плазмиду рТ25711/Т 35

9.2 КлонированиеphyBg в плазмиду рОЬткН, р()ПпкО 35

9.3 Клонирование phyBg в плазмиду рЕТ-46 Ек/ЫС 35

10. Рестрикционное картирование ДНК 36

11. Лигирование ДНК 37

12. Трансформация клеток Е. соИ плазмидной ДНК 37

13. Выделение ДНК из агарозного геля 37

14. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) 38

15. Электрофорез 39

16. Иммуноблоттинг 39

17. Получение рекомбинантного штамма Е. coli с геном 39 фитазы В. ginsengihumi М2.11

18. Методы очистки и выделения белка 40

19. Определение локализации фермента 41

20. Электрофорез в ПААГ 42

21. Определение белка 43

22. pH-оптимум и pH-стабильность 43

23. Температурный оптимум и термостабильность 43

24. Влияние ионов металлов на активность фермента 43

25. Субстратная специфичность фермента 44

26. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF) 44

27. Секвенирование и геноинформатика 44

28. Тест на стимуляцию роста растений 45

29. Иммобилизация наноматериалов на поверхности 45 клеток

30. Тест на токсичность, инфильтрация листьев растения 46

31. Математическая обработка результатов 46 РЕЗУЛЬТАТЫ 47

1. Выделение изолятов фитат-гидролизующих бактерий и 47 их характеристика

2. Идентификация изолятов 48

3. Геноинформационный анализ генов фитаз 52

4. Амплификация гена фитазы, подбор оптимальных 54 условий ПЦР и секвенирование

5. Подбор системы экспрессии и клонирование гена 57 фитазы В. ginsengihumi М2.11

6. Получение рекомбинантного штамма Е. coli, несущего 62 ген фитазы В. ginsengihumi М2.11

7. Разработка метода очистки фитазы В. ginsengihumi 64

M2.ll

8. Определение первичной структуры фитазы В. 68 ginsengihumi М2.11

9. рН-оптимум и рН-стабильность фитазы 71

10. Температурный оптимум и термостабильность фитазы 71

11. Влияние ионов двухвалентнных металлов на 72 активность фитазы

12. Субстратная специфичность фитазы 73

13. Влияние В. ginsengihumi М2.11 на рост картофеля 73

14. Влияние магнитных частиц на клетки В. ginsengihumi 74

M2.ll

15. Определение токсичности В. ginsengihumi М2.11 78 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 81 ВЫВОДЫ 93 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 94 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 96

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Значительную долю в рационах моногастричных животных занимают пшеница, ячмень, рожь и другие зерновые культуры, обладающие не только питательными, но и отрицательными свойствами (Tran et al., 2010). В злаках, бобовых и семенах масличных культур содержится фитиновая кислота, которая связывает фосфор и делает корма на 70-80% недоступными для переваривания животными. Это ограничивает использование перечисленных культур в кормлении и, особенно, при разработке высококонцентрированных рационов для интенсивного выращивания животных и птицы (Ramesh et al., 2011). Фитиновая кислота - это специфическое химическое соединение шестиатомного спирта инозитола, по гидроксильным радикалам которого связано 6 остатков фосфорной кислоты (Kumar et al., 2013). Остатки фосфорной кислоты химически активны и связывают ионы металлов - кальций, натрий, калий, цинк, медь. Фитиновая кислота также взаимодействует с остатками аминокислот, переводя их в недоступное для растений и бактерий состояние. Соли фитиновой кислоты -фитаты - составляют почти 50% от общего органического фосфора и более 80% от общего фосфора в кормах растительного происхождения (Ramesh et al., 2011).

Переводить фитаты в доступное состояние путем высвобождения фосфатов способны бактерии. Они гидролизуют эти соединения с помощью ферментов -фитаз (Coban, Demirci, 2013). Это особая группа фосфомоноэстераз, способных гидролизовать фитат на более доступные фосфатсодержащие соединения. Фитазы практически не вырабатываются в пищеварительном тракте свиней, птицы и других животных с однокамерным желудком (Jorquera et al., 2012). Как правило, в условиях низкой активности или полного отсутствия фитаз фитиновый фосфор и связанные с ним полезные питательные вещества, проходят желудочно-кишечный тракт транзитом (George et al., 2009).

Существует острая необходимость в разработке новых наукоемких биотехнологий, основанных на использовании бактериальных ферментов, которые могут служить кормовыми добавками для утилизации фитатов. Поэтому вопросы, связанные с поиском микроорганизмов-продуцентов фитат-

гидролизующих ферментов, получением этих белков, изучением структуры, свойств микробных фитаз, а также созданием на их основе новых биотехнологий являются актуальным и направлены на решение этой проблемы.

Целью исследования явилась изоляция и характеристика штаммов бацилл, обладающих фитат-гидролизующей активностью, клонирование гена фитазы, очистка белка и изучение его свойств.

В работе решались следующие задачи:

1. Поиск и выделение грамположительных микроорганизмов, обладающих фитат-гидролизующей активностью, из образцов почв Республики Татарстан.

2. Клонирование и секвенирование гена фитазы штамма изолята, получение рекомбинантного штамма с высокой активностью фермента.

3. Разработка метода выделения и очистки фитазы В. ginsengihumi М2.11, установление первичной структуры и свойств фермента.

4. Определение токсичности и биологических свойств В. ginsengihumi М2.11 - продуцента фитазы.

Научная новизна. Впервые из образцов почв Республики Татарстан изолирован штамм В. ginsengihumi M2.ll с высокой фитат-гидролизующей активностью, клонирован ген фермента и установлена его нуклеотидная последовательность. Получен эффективный вектор экспрессии с геном фитазы В. ginsengihumi M2.ll и рекомбинантный штамм, позволяющий получать белок в препаратных количествах. Разработан метод очистки бациллярной фитазы, включающий аффинную, ионообменную хроматографию и гель-фильтрацию. Установлена первичная структура фитазы В. ginsengihumi M2.ll. Фермент принадлежит к классу (3-пропеллерных фосфатаз с молекулярной массой 41 кДа, изоэлектрической точкой р1 4.8. Полученные данные о свойствах фермента пополняют знания о (3-пропеллерных фитазах бацилл.

Теоретическая и практическая значимость работы. Выделенный из образца почв Республики Татарстан штамм В. ginsengihumi М2.11 обладает фитат-гидролитической активностью, не токсичен и оказывает стимулирующее влияние

на рост и развитие картофеля и может быть использован в сельском хозяйстве как биоудобрение, стимулирующее рост и развитие растений, а также в качестве кормовой добавки в животноводстве для повышения продуктивности. Разработанный метод очистки фитазы В. ginsengihumi M2.ll может служить основой для его использования в биотехнологии растений и сельском хозяйстве.

Положения, выносимые на защиту:

1. Изолирован и идентифицирован новый продуцент фитазы В.

ginsengihumi M2.ll, ген фермента клонирован и секвенирован, белок очищен, классифицирован как p-пропеллерная фосфатаза, изучены энзиматические свойства фермента.

2. Штамм В. ginsengihumi М2.11- продуцент фитазы - не токсичен в отношении растений и стимулирует их рост и развитие.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на международных научных конференциях: IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» Казань, 2009), Научно-практической конференции биохимиков, посвященной памяти профессора В.Г.Винтера «История и достижения Казанской биохимической школы» Казань, 2009), XIII annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2009" "Biology: Expansion of Borders" (Казань, 2009), XIII annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2009" "Biology: Expansion of Borders" Эскишехир, Турция, 2010), Российской школе молодых ученых «Актуальные проблемы современной биохимии и молекулярной биологии» (Казань, 2010), XV annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2011", (Базель, Швейцария, 2011), "Students, Masters and PhD Students III Annual International Scientific Conference in Biology" dedicated to the Academician Peter Kometiani (Тбилиси, Грузия, 2011), XIX Международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2012), XVI annual Symposium for Biology Students of Europe "SymBioSE 2012" (Szeged, Hungary, 2012), Открытом конкурсе научных работ студентов и аспирантов им. Н.И. Лобачевского (Казань, 2012), международном конкурсе 2012 года «Russia Graduate competition for Alltech's

Young Scientist Award», III Международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012), XX Международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2013), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), Конгрессе Федерации европейских биохимических обществ 2013 "Биологические механизмы" (FEBS) (Санкт-Петербург, 2013).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Фитаты и их распространение

Фосфор является важным элементом, недостаток которого в почве отражается на производстве сельскохозяйственных культур. Низкая биодоступность фосфора в почве за счет образования нерастворимых соединений - фитатов является важной научно-практической проблемой. Фитаты составляют около 50% от общего органического фосфора в почве и до 80% от общего фосфора в кормах растительного происхождения (таблица 1) (КашезИ а1., 2011).

Таблица 1

Общее количество фосфора и фосфора, входящего в состав фитата, в составе кормов для домашней птицы (11аутс1гап е1 а!., 1994).

Корма Общее количество фосфора, % Фосфор в составе нерастворимых фитатов, % % от общего фосфора

Сорго 3.01 2.18 72.6

Рожь 3.05 1.95 63.9

Пшено 3.07 2.19 71.6

Ячмень 3.21 1.96 61.0

Овес 3.60 2.10 59.0

Кукуруза 2.62 1.88 71.6

Соя 6.49 3.88 59.9

Рапс 9.60 6.34 66.0

Канола 9.72 6.45 66.4

Хлопок 10.02 7.72 77.1

Пшеничные отруби 10.96 8.36 76.3

Рисовые отруби 17.82 14.17 79.5

На этапе прорастания семян растения активируют собственную фитазу для освобождения фосфатов. Однако в зрелом зерне активность фитазы сравнительно

низкая. Растительные фитазы характеризуются высокой термолабильностью, даже непродолжительное нагревание полностью инактивирует эти ферменты (ВоЬп е1 а1., 2008). Поэтому фосфор семян, используемых в качестве кормов, недоступен для животных. Животные корма на основе зерновых злаков, бобовых и семян масличных культур содержат соли фитиновой кислоты, которые переводят фосфор в недоступное состояние. Это ограничивает использование перечисленных культур в кормлении и особенно при разработке рационов для интенсивного выращивания животных и птицы.

Фитиновая кислота - это органическое соединение шестиатомного спирта инозитола, гидроксильные группы которого связаны с шестью остатками фосфорной кислоты. Все известные фитазы подразделяют на две большие группы: фитазы микроорганизмов - 3-фитазы, которые высвобождают фосфор в СЗ положении в инозитольном кольце, и фитазы растений, 6-фитазы, которые высвобождают фосфор в С6 положении (Лаутс1гап е1 а1., 1994; ОИ е1 а\., 2004) (рисунок 1).

Рисунок 1 - Структура фитиновой кислоты, стрелками указаны атомы углерода СЗ и С6, от которых начинают высвобождаться остатки фосфорной кислоты.

Фитиновая кислота обладает хелатирующими свойствами и активно связывает катионы металлов (медь, марганец, цинк, железо, кальций), а также остатки аминокислот, белков, углеводов, с образованием нерастворимых

О

он но-р-он но-¿-о о

ОН НО-Р-ОН

II

О

комплексных соединений, неспособных к усвоению в организме животных (Angel et al., 2002).

В эпителиальных клетках корней растений обнаружена слабая фитазная активность, фермент не секретируется в ризосферу, поэтому растения не способны самостоятельно получать фосфор из фитатов почвы (Bohn et al., 2008).

Жвачные животные разрушают фитат с помощью фитазы, продуцируемой микрофлорой рубца. Неорганический фосфор, который высвобождается при гидролизе фитата, используется как микрофлорой, так и организмом хозяина. В отличие от жвачных, моногастричные свиньи, рыбы и птицы, не способны метаболизировать фитиновую кислоту в связи с отсутствием фитазы в желудочно-кишечном тракте. Чтобы удовлетворить пищевые потребности этих животных в фосфоре, в корма добавляют неорганические фосфаты. Это увеличивает стоимость кормов.

Мировая популяция домашнего скота насчитывает около 4 биллионов животных, производящих до 500 миллионов навоза ежегодно (Graham et al., 2003). Такое количество животных считается востребованным для потребностей человечества. Фитазы не вырабатываются в пищеварительном тракте домашних животных с однокамерным желудком. В условиях полного отсутствия фитаз фитаты вместе с нерастворимым комплексом полезных питательных веществ проходят желудочно-кишечный тракт этих организмов транзитом (Lim et al., 2007). Эти условия снижают доступность фосфора зерновых кормов, а также связанных с фитатом минералов. Экспериментально установлено, что микробные фитазы в симбиотических растениях и животных играют главную роль в минерализации органического фосфора (Zhang et al., 201 lb).

2. Микробные фитазы, классификация и свойства

Фитазы микроорганизмов - это особая группа ферментов фосфатаз, обладающих способностью катализировать последовательный гидролиз фитатов на менее фосфорилированные производные инозитола с высвобождением

неорганического фосфата (Wyss et al., 1999(a); Oh et al., 2004; Farhat-Khemakhem et al., 2012) (рисунок 2).

Рисунок 2 - Схема расщепления фитата фитазой (Zenq et al., 2011).

Микробные фитазы играют стратегическую роль в процессе освобождения неорганических фосфатов из нерастворимых комплексов и являются критическими белками для жизни многих организмов (Jorquera et al, 2012). Добавление фитаз к кормам способствует освобождению фосфата, что приводит к полноценному усвоению пищи и, в целом, благоприятно влияет на окружающую среду (Tran et al., 2010). Поэтому микробные фитазы являются перспективными объектами для сельскохозяйственной биотехнологии. Фитат-гидролизующие белки выделены из разных видов бактерий, дрожжей и грибов (Vohra, Satyanarayana, 2003).

На основании биохимических свойств микробные фитазы подразделены на кислые и щелочные (Oh et al., 2004). Многие фитазы бактерий, грибов и растений относятся к кислым фосфатазам (Van Etten et al., 1991). Выравнивание последовательностей аминокислотных остатков показало, что ферменты этого класса имеют консервативный мотив активного сайта, RHGXRXP, являющийся уникальным для этого класса белков (Van Etten et al., 1991). Идентификация консервативного гистидина в консенсусной последовательности позволила

Фитат

X и Фосфаты

отнести ферменты к классу гистидиновых кислых фосфатаз. Эти ферменты обладают широкой субстратной специфичностью и гидролизуют не связанный с металлами фитат, продуцируя инозитол монофосфаты в качестве конечного продукта реакции, которая при значениях рН ниже 6.0 (Oh et al., 2004). В отличие он них, щелочные фитазы проявляют строгую субстратную специфичность к кальций содержащим фитатным комплексам и в качестве конечного продукта производят инозитол 3-фосфаты (Oh et al., 2004). Щелочные фитазы также широко распространены в природе (Liu et al., 1998).

Рассматривают четыре класса фосфатаз, способных расщеплять фитаты: гистидиновые кислые фосфатазы (НАР), p-пропеллерные фосфатазы (ВРР), цистеиновые фосфатазы (CP), пурпурные кислые фосфатазы (PAP) (Mullaney et al., 2007; Jorquera et al., 2011). Фитазы, продуцируемые бациллами, относятся к классу |3-пропеллерных фосфатаз. В отличие от гистидиновых кислых фосфатаз бациллярные фитазы не имеют гомологии в аминокислотной последовательности ни с одной из групп известных фосфатаз. У бациллярных фитаз отсутствуют консервативные участки активного центра, характерные для гистидиновых кислых фосфатаз (RHGXRXP и HD) (Mullaney et al., 2007). Этот класс белков получил название благодаря молекулярной структуре, которая преимущественно состоит из Р-структур и напоминает шестилопастной пропеллер (Greiner et al., 2007а) (рисунок 3).

Рисунок 3 - Структура Р-пропеллерного белка. А - расположение Р-структур в молекуле белка, Б - конформационная структура белка (Рап^каг е1 а1., 2012).

В настоящее время фитазы выделены из различных видов бактерий, дрожжей и грибов (Ashima V., Satyanarayana Т., 2003). Эти белки обнаружены у таких бактерий как Pseudomonas sp., Bacillus sp., Raoultella sp., Esherichia coli, Citrobacter braakii, Enterobacter и анаэробных бактерий из рубца животных, особенно в Selenomonas ruminantium, Megasphaera elsdenii, Prevotella sp., Mitsuokella multiacidus, и M. jalaludinii, а также у молочнокислых бактерий и у некоторых дро