Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химические и биохимические свойства фитазы почвенных микроорганизмов

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические и биохимические свойства фитазы почвенных микроорганизмов"

АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН ИНСТИТУТ БИОХИМИИ

ОД

На правах рукописи УДК 577.153.3.:631.46.:577.150.3.:577.150.5.

ТИЛЛАЕВА Зебо Ербековна

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИ , СВОЙСТВА ФИТЛЗЫ ПОЧВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

03.00.04 — Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент — 1998

Работа выполнена на кафедре биохимии биолого-почвеНного факультета ТашГУ им. Мирзо Улугбека.

Научный руководитель: к. б. п., доц. Р. П. Игамназаров.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, член корреспондент АН РУз, Ибрагимов А. П. доктор биологических наук, профессор Бабаев Т. А.

Ведущая организация: Институт биоорганической химии

АН РУз.

Защита диссертации состоится ¿^¿/^^^-^^ 1998 г.

в час. на заседании Специализированного совета

Д 015.10.01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук при Институте биохимии АН РУз но адресу: 700143, Ташкент, пр. Хт, Абдулла-ева, 50.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии АН РУз.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук У. УСМАНОВА.

1. 0ВДИ1 ХАРАКГЕРКСГПКА РАЕОТО

Актуальность проблемы. Природный шестиатомный циклический спирт - мио-инозит хорошо изученное органическое соединение, выделенное из мышечной ткани еще в середине прошлого века. В последние годи наблюдается резкое возрастание интереса к мио-инозиту и егоссроизводным. Такой интерес обусловлен присутствием этого спирта в составе сложных фосфорсодержащих липи-дов и фосфолипидных комплексов, принимающих участие в образовании структуры и функционировании биологических мембран (Собзго-уе, 1980). Имеются данные о связи нарушений метаболизма мио-иноэита, его производных и возникающими вследствие этого патологическими явлениями, в том числе злокачественного роста, сахарного диабета, гипертонической болезни и т.д. Выяснение механизма участия мио-инозита в возникновении и развитии этих и других патологических нарушений занимает важное место в биохимических и физиологических исследованиях.

Природные производные мяо-инозита являются компонентами многих метаболически важных ферментных и сигнальных систем; они нашли применение в медицинской практике, пищевой промкшленности и в некоторых процессах современной промышленной технологии.

Поиск путей получения биологически активного мио-иноэита и его производных представлйет большой научно-практический интерес. Одним из перспективных направлений в этой области является использование промышленных отходов (пшеничные и рисовые отруби, отходы хлопковой промышленности, содержащие большое количество фитина - фосфат замещенного инозитола). Путем ферментативного гидролиза фитинсодержащих отходов промышленности можно получать биологически активное мио-инозит и его производные. В связи с этим представляется необходимым поиск доступных источников ферментов, метаболизирующих фитин.

Цель работа - выявить среди микроорганизмов высокогкМюктип-ных продуцентов фитазы, разработать условия пыделения и очистки фермента, изучить его биохимические характеристики.

Для достижения поставленной цели предстояло р'чштъ следующие задачи:

- изучить различные почвенны,* микроорглчшзми к.-.к !т гнци ■

т

агьные продуценты фитазы;

- выделить и охарактеризовать микроорганизмы, обладающие г; '.более высокой фитазной активностью;

- разработать методы выделения и очистки фитазы из культура и,ной среды соответствующих микроорганизмов-продуцентов;

- изучить физико-химические и биохимические свойства фитазы, ее чувствительность к активаторам и ингибиторам.

Научная новизна. В результате проведенной работы впервые из сероземных почв Узбекистана выделены 26 фитинрастворяющих микроорганизмов, среди которых Bacterium sp. обладает наиболее высокой фитазной активностью. Разработан метод выделения и очистки фитазы из культуральной жидкости Bacterium sp. в элект-рофоретически гомогенном состоянии, щюв^ено детальное исследование физико-химических свойств и кинетических характеристик очищенного препарата данного фермента.

Практическая значимость работы. Предложенная в работе методика выделения гомогенного препарата фитазы из Bacterium sp. молет быть использована в биотехнологических целях. На основе представленной информации о физико-химических свойствах фермента возможно дальнейшее усовершенствование метода выделения, очистки и получения значительных количеств препарата этого фермента для научных и прикладных целей.

Публикации и апробация работ». Основные материалы диссертации были доложены на научных конференциях "Согоемешше проблемы общей физиологии и биофизики" (Ташкент, 1993); '"Современные проблемы биологии и экологии" (Талкент,1995); "Структура и функции биологических мембран" (Ташкент, 1995); 2 и 3 конференциях биохимиков (Ташкент, 1993, 1996); 2-Республикански научной конференции молодых ученых и студентов, посвященной СбО-ле-тию со дня ровдения Амнра Темура (Ташкент, 1990); "Влияние физико-химических факторов на метаболические процессы opi онкзма" (Андижан, 1997).

По Terse диссертационной работы опубликогано 11 работ.

Структура и '¿бьем работа. Диссертации: ¡чзл работа состоит из mv,".c"i:ei, обзора литературы, материала!! и методов исследования, р- ¡.уц.тахов и их обеуг-деннл, юлюдзг- п сиискз литературы.

о ...

Работа изложена на '137 стр. машинописного текста, иллюстрирована 27 рисунками, 7 таблицами. Список цитированной литературы включает 131 наименования, из них 74 иностранной литератур».

Автор выражает искреннюю признательность профессору М.Н.Валиханову за ценные консультации и помощь при проведении экспериментов.

.?„. ИУГЕРНАЛ! И истода ИССЛЕЕОВАШЙ

Для выделения фитин-разлагающих микроорганизмов из сероземных почв Узбекистана использовали метод, предложенный В.Ф.Павловой и Т.С.Самойловой (1981).

Для установления фитин-растворяющей способности микроорганизмов, их выращивали на плотной глюкозо-аспарагиновой среде следующего состава: 1 л водопроводной воды, 10 г глюкозы, 1 г аспарагина, 0,2 г MgS04, 0,2 г K2SO4, 0,02%. кукурузного экстракта, 20 г агара, рН 7. В эту среду вносили препарат переосажденного фитата кальций-магния, с целью выявления микробных колоний, окруженных зонами растворения фитата.

О дефосфорилировании фитата судили по накоплению ортсх}ос-фата в культуральной жидкости. Ферментацию вели на установке для выращивания микроорганизмов, термос?ированной при 2?°С. Суспензию микроорганизмов центрифугировали на центрифуге FC-6 при 5000 g в течении 30 мин. с охлаждением. В супернатанте определяли количество ортофосфата, белка и фитазной активности через каждые 24 часа.

Активность «ртгази определяли по ранее описанному методу (Игамназаров, 1988).

Белок определяли по методу Lowry et al. (1951) или с.пект-рофотометрически при 280 нм (в случае хроматографии белков).

Ортофосфат определяли по методу Тауски и Шора.

• Внеклеточную фитазу получали из 1сультуральног жидкости микроорганизма Bacterium sp., выращенного в срод'', описанной ранее (Павлова, Самойлова, 197G). 3-суточпуп культуру микроорганизмов центрифугировали при 5000 р в течении 80 мин. при -Г'С. Надос/эдочную жидкость лиофильно высушивали, растворили а минимальном объеме из расчета 10 мг/м.ч О,И М ацетатного буФ-рл рИ

f,4 и ступенчато осаждали сульфатом аммония. Осадок образовался t лько при 20 и 80%-насыщении, осадок при 80% насыщении обладал Ф» >.ааной активностью.

Гель-фильтрацию проводили на колонке 2x62 см, заполненной се^щексом (3-100 и уравновешенной 0,05 М натрий-ацетатным буфером рН 5,0. Ионообменную хроматографию проводили на ДОАЭ-целлюлозе в ¿5 Ш трис-HCl буфере (рН 7,2). Фракции элюировали в линейном градиенте NaCl (0-0,6 М). Электрофорез препарата фитазы в ПААГе вели в щелочной буферной смеси рН 8,3, 7,5% гель с использованием прибора и реактивов фирмы "Реанал" (Венгрия), гель окрашивали раствором Кумасси голубым. г

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И I2X ОБСУВДВВЕ

-3.1. Выделение фитин-растворяющих микроорганизмов из почвы •

Микроорганизмы играют важную роль в метаболизме почвенных фосфорорганических соединений, среди которых фитин составляет значительную часть. Нами в связи с этим были получены чистые культуры микроорганизмов, наиболее эффективно влияющих на метаболизм фитина. Микроорганизмы выделяли методом накопительных культур (Павлова, Самойлова, 1975) и удобным тем, что при его использовании идет накопление только тех микроорганизмов, которые используют фитин как источник углерода и энергии.

Фитин-разлагающие микроорганизмы были выделены из верхнего слоя (5-20 см) сероземов Узбекистана, используемых под хлопчатника. Среди выделенных и идентифицированных микроорганизмов 31% составляли грибы рода PeniciIlium, 16% - грибы рода Aspergillus, 9% - грибы рода Fusarium, остальные 34% - бактерии и акти-номицеты (таблица 1). В выделенных микроорганизмах проверяли способность к растворению фитина в твердой глюкозо-аспарагшю-г-ой среде с фитатом Ca-Mg, а также способность к дефосфолирова-н;го фитина (г. жидкой среде). О способности микроорганизмов к растворению фитптл глльций-магния судили по зонам просветления в мутней' фитшспсм СЛге,

Как с.Л''-лует иг- тгОлицы 1, все выделенные микроорганизмы „-и г т<->;: спой мере спссобностмп растворять фитин.

1 столица 1

Микроорганизмы из сероземные почв Узбекистана, растворяющие и расщепляющие фитин

N | |зона растворения |количество орто-

| Название микроорганизма |в фитиновой куль-|Фосфата в фитино-| |туральной среде |вой жидкой среде

J____I---L

' — » ---- 1. Bacterium sp. + (• + + + +

S. Agrobecterium tumifaciens + + + + + -

3. Bacillus lactimorlus + _ _ + - -

4. Lactobacillus lactus acidi + - - + +

5. Actinomyces albus ^ - - + - -

6. A.elephantis primi gerne - - + - -

7. Streptococcus apis Massen + t- - + (- -

ß. Streptococcus inulanaceus - - f -

9. A Worn la sp. + + -- f + -

10. Aspergillus niger + + -- h t- -

11. Aspergillus clavatus t- + - + - -

12. Aspergillus tumigatus + - - i - -

13. Aspergillus terreus Than + + - r - -

14. Pénicillium inplicatum - - I- - -

15. Pénicillium luteo-virida + + - 1 f -

16. Pénicillium sp. >• t- . ■» ■ ^

17. P. inplicatum Biourge + + - + - -

18. Penicil h um verruculogum + + - 1- + -

19. Pénicillium ochro-chlorou + + - I- - -

20. Pénicillium vermiculatum + - i- -

21. Pénicillium nigricans + + < ^ + -

22. Pénicillium lilicanum + + - + + -

23. Penici Ilium cyancum + + - f -

24. Fusarium sohmi + f - i . -

25. Fusarium sp. + л ^ + t- -

25. Rcxlaspotidium inflvutomini tum i i -

,1'r"'■'>': in Oanwia, i + - среди; a, i ■■■ b if!

Ч ткие зоны просветления наблюдались в случае грибов Pemcilli->t 'isp.. Pénicillium nigricans, Fusarium sp., Agrobacterium tu-Fiaclens, Bacterium sp. У 8 микроорганизмов» особенно у бактерии и актиномицетов, появляется довольно слабо выраженное кольцо г.округ колоний. 13 микроорганизмов, в основном - грибы, занимают промежуточное положение.

Среди выделенных нами фитин-разлагающих микроорганизмов Bacterium sp. проявлял наиболее высокую фитазн;д> активность (рис.1). Количество ортофосфата (рис.1, кривая 1) увеличивалось максимально на Б сутки культивирования (42,4 мкг/'мл). Однако уже на 7 день это количество составляло лишь 21,7 мкг/мл. Со-

о

держание бедка (рис.1, кривая 2) резко возрастаю и на 5 сутки составляло 150 мкг/мл. Фитазная активность (рнс.1, кривая 3) появлялась лишь на 2 сутки культивирования и затем резко нарастала до 300 ME с последующим ее уменьшением.

В целом, параметры содержания ортофосфата, бе.иса и фпгаз-1юй активности в культуралыюй среде микроорганизмов представляют собой, очевидно, достаточно сбалансированную и отрегулированную систему, которой присуща внутренняя динамика. Увеличение белга в культуралыюй<,среде отражает общее увеличение биосинтезов, в том числе и фермента фитазы, это, в свою очередь, приводит к освобождению ортофосфата из фитинового кольца и его дальнейшей утилизации.

3.2. Очистка фитазы из культуралыюй жидкости Bacterium sp.

По данным ряда авторов (Самойлова, 1975; Муромцев и др., 1985), расщепление фитина носит двуфазный характер. При этом различают (а) неферментативное растворение фитина в результате подкислення среды и (б) его ферментативное дефосфорилирование.

Для исключения первого механизма мы выращивали Bacterium sp. в водорастворимой фитат-натриевой среде, в которой фнтазная активность достигает максимума уже на 3-й день культивирования (рис.2), причем она была в 1,6 раз выше, чем в среде с кислото-растворимнм фитатом Ca-Mg, где активность достигала максимума лишь на 4-5 дни выращивания. В связи с этим в дальнейших экспериментах нами была использована именно среда с. фитатсм натрия.

Активность, ME

г з л

Время, сутки

-гео

Рис. 1. Изменение количества ортофосфага (1), белка (2) и фитазной активности (3) н культ)ралыюй среде с фигатом Ca-Mg в процессе роста Bacterium sp.

МКГ.'МЛ

белок

фосфор

-i.S

40

Активнссть, ME

- 509

11.5

2 3 4

время, сутки

1.0

Рис. 2. Изменение количества орюфосфата (1), белка (2) и фитазной активности (3) в культуральной среде с фитагом натрия в процессе роста Bacterium sp.

Для выделения белка, обладающего фитазной активностью, сна'"'.та проводили диск-электрофорез в ПААГе с целью оценки белков >. о спектра культуральной жидкости. Согласно, полученным данным, на электрофореграмме культуральной жидкости присутствует 7 белковых полос разной интенсивности.

Ход очистки и выделения фитазы из культуральной жидкости Bacterium ^р. представлены в таблице 2.

Таблица 2.

Очистка внеклеточной фитазы из Bacterium sp.

1 1 1 1 1 |фитазн. белок|специф Г" степ.° 1 выход |

| N1 Порядок очистки |акт-ть, мг |активн. очист % 1

1 1 1 1 1 (А) 1 | мЕ 1 (раз)

1 1 | 1.|Безклеточный супернатант 1 130820,0 1 4600| 6,7 - 100 |

I 2.|Диализ 126520,2 2040| 13 2 86 1

| 3.|Фракционирование 1 1

I |сульфатом аммония 111048,0 179| 62 9,2 36 |

| 4.|Гель-фильтрация 3-^00 | 9755,2 22,4| 435,5 65 31,6 |

| 5.|Ионообменная хромато- 1 1

I |графия на ДЭАЭЦ | 3988,0 | 4,8| 830,8 124 1 12,9 | 1

Как следует из данных, представленных в таблице 2, диализ препарата (10 мг/мл), лиофильно высушенного и растворенного в ацетатном буфере, приводит к 2-кратной очистке. Это может быть следствием удаления аминокислот в процессе диализа и ионов ор-тофосфата, являющихся ингибитором фитазы. При последующем фракционировании сульфатом аммония при насыщении 80% выпадает осадок, обладающий фитазной активностью. На этой стадии достигается 9,2-кратная очистка исследуемого фермента.

3 Очистка фитазы в 65 раз отмечается после гель-фильтрации на сефадексе 6-100." Среди полученных при этом 4 фракций только вторая обладала фитазной активностью. Эту фракцию диализовали против дистиллированной воды и наносили на колонку с ДЭАЭ-цел-лпиозои. уравновешенную 25 мМ трис-НС1 буфером (рН 7,2). При

элюировании в линейном градиенте 0-0,6 М НаС1 также были выявлены 4 пика, причем фитаэная активность была представлена целиком в третьем из них (0,21-0,24 М градиент NaCl). ,

Таким образом, с использованием описанной выше процедуры внеклеточная фитаза из культуральной жидкости Bacterium sp. г.ы-делена и очищена в конечном итоге в 124 раза с выходом 12,9%. Полученный препарй? является электрофоретически гомогенным, и его относительная электрофоретическая подвижность равна 0,32.

3.3. Физико-химические и биохимические свойства фитазы иа культуральной жидкости Bacterium sp.

С использованием электрофоретически гомогенного препарата фитазы из культуральной жидкости E'scterium sp. в последующих экспериментах нами были исследованы физико-химические и биохимические свойства этого фермента.

Молекулярная масса фитазы. Молекулярная масса выделенного и очищенного нами препарата фитазы бала определена методом гель-фильтрации на сефадексе G-100. Согласно полученнкм результатам, фитаза из культуральной жидкости Bacterium sp. имеет молекулярную массу 62±0,3 kDa (рис.3). По данным литературы, молекулярные массы фитаз из различных объектов лежат • в пределах 32,4-100 kDa, и, как можно видеть, исследованный нами препарат фермента имеет молекулярную массу, соответствующую примерно середине этого диапазона.

Аминокислотный состав фитази. В препарате фитазы, очищенной до электрофоретически гомогенного состояния, исследовали аминокислотный состав с помощью анализатора Т-339.

Согласно полученным данным, исследованная фитаза состоит из 574 аминокислот, что вполне согласуется с определенной нши молекулярной массой этого фермента. Из общего числа аминокислотных остатков 21,1 % составляют отрицательно заряженный ал-партат, глутамат и его амиды; 17,06 % - положительно заряженные лизин, аргинин и гистидин; 61,84% - нейтральные аминокислоты; 8,7% - ароматические аминокислоты. В составе фитазы в относительно большом количестве содержатся глицин (62), амиды аспар-тата и глутамата (68), лейцин (47), треонин (46) и калин (45

о:татков). Среди других аминокислот незначительное количество с '"тавляют триптофан (5), метионин (4) и пролин (6 остатков).

Таким образом, фитаза, выделенная из культуральной жидкости Bacterium sp. и очищенная до электрофоретически гомогенного состояния, является слабоотрицательно заряженным белком.

Влияние температуры и условий хранения на активность фита-вн. Изучение влияния температуры на фитазную активность показало , что с повышением температуры активность резко возрастает, достигая максимума в области 50-60°С. Дальнейшее повышение температуры приводит к резкому уменьшению фитаэной активности, очевидно, связанному с денатурацией белка.

Выделенный нами препарат фитазы проявляет сравнительно хорошую устойчивость при хранении. Так, определение стабильности фермента, хранившегося при 10-12°С в течение 8 дней в ацетатном буфере показывает, что sa исследованный период времени удельная активность фермента постепенно снижается. Необходимо отметить и гот факт, что в первые 3 дня хранения активность фитазы снижается незначительно, однако в дальнейшем наблюдается более резкое снижение ее удельной активности, которая на 8 день составляет 49% от исходной.«Исходя из вышеизложенного, фитазу из Bacterium sp. в последующем хранили в сухом виде в морозильной камере холодильника, и в этих условиях препарат даже при длительном хранении практически не терял активности.

Исследование рН-зависимости активности фитгзы. Влияние рН среды на фитазную активность было исследовано нами сначала в широком диапазоне значений рН (рН 1-8). рН-оптимум для фитазы из Bacterium sp. находится в интервале рН 5,0-5,5, т.е. этот фермент активен в слабокислой. При дальнейшем исследовании в интервале рН 4,8-6,2 максимальная активность наблюдалась при рН 5,4. Уменьшение или повышение рН среды от этого значения сказывалось отрицательно на активности фермента.

Кинетика гидролиза субстрата фитазо:1. В другой серии экспериментов нами в ферментативном препарате была определена вре-мепная зависимость образования продукта реакции (ортофосфата) в присутствии фитата натрия. Образование ортофосфата - продукта реакции на первом этапе происходит линейно, и только после 30 мин. инкубации реакция достигает максимума. Из полученных дан-

них следует, что между временем инкубации ферментного препарата и образованием продукта реакции в инкубационной среде существует связь, характерная для ферментативных реакций 1 порядка.

Полученные нами данные по исследованию зависимости активности фермента от концентрации субстрата свидетельствуют о том, что фермент достигает максимальной активности при концентрациях субстрата порядка 1 мМ. Повшение его концентрации до 2 мМ и более приводит к ингибированию фитазы. Такая картина наблюдалась и другими авторами'(Maiti, Biswas, 1979), которые в случае фитазы из Phaseolus vulgaris предполагали присутствие двух точек прикрепления между ферментом и субстратом.

При преобразовании полученных нами данных в координаты двойных обратных величин по Лайнуиверу-Берку (рис. 4), значение Кщ для фитазы из культуральной жидкости Bacterium sp. равняется 0,42 мМ фитина, а величина Vmax - 0,71 мкг Р/мин.

Проведенное нами исследование субстратной специфичности фитазы из культуральной жидкости Bacterium sp. позволило выявить ее достаточно строгую специфичность по отношению к фита-там. Как показывают полученные данные, исследованная фитаза расщепляет соли фитиновой кислоты с различной интенсивностью. Так, дефос-форилирование кислоторастворимой соли фитата Ca-Mg составляет 74,2% по отношению водорастворимой соли натрия фитиновой кислоты. Щелочерастворимые со.чи фитиновой кислоты (фитат алюминия и фитат железа) дефосфорилируется в одинаковой степени с интенсивностью, составляющей соответственно 30,2% и 29,2% от удельной активности по отнощению к фитату натрия. Исследованная нами фитаза не гидролизовала пирофоофат, триполкфосфат, пара- нитрофенилфосфат, АТФ ни при рН 5,1, оптимальном для фитазы, ни при рН 7,2, который оптимален для неспецифических фосфатаз.

Нз литературных данных вполне однозначно следует вывод о строгой специфичности фитая из различных объектов по отношению к натриевой и кальциевой соли фитиновой кислоты и к различным стериохимическим изомерам инозитолгексафссфатз (Powar, Jagan-nathan, 1967; Нага, Ebina, 1985; Kim, Eskin, 1987).

Действие активаторов и ингибиторов активности фчтазы. В специальной серии экспериментов нгмп было исследсвс-.чо действие ряда катионов и анионов фосфата на активность фитазы из fr/льту-

г < с •

МП*

1/V

Кя1 = 0,42 ыМ

Vmax = 0,71 ыкг/мин^,/

/

"Т —>— т "" 4 1 1М

1/S

Рис. 3. Калибровочный график дня определения молекулярной массы фитазы из культуральной жидкости Bacterium sp.

Маркеры:

1 - цитохром с ( 13 кДа)

2 - рибонуклеаэа (13,6 кДа)

3 - химотрипсин (24 кДа)

4 - пепсин (35 кДа)

5 - яичный альбумин (45 кДа)

6 - бычий альбумин (67 кДа)

7 - фшаза (62 ± 0,3 кДа)

Рис. 4. Зависимость активности фитазы от концентрации субстрата в координатах Лайнуивера-Берка. (У словия: ацетатный буфер рН 5,4; температура 50° С; время инкубации 30 мин; субстрат - фитат На 0,1-3 мМ)

»

а

Рис. 5. График Диксона инги-бируюшего дейсшия Си1', Со1* и FcJ' на активность фитазы из Bacterium sp.

Коицсигркши мМ

ральной жидкости Bacterium sp. Известно, что ионы Са^ в определенных концентрациях стимулируют активность многих фитаэ (Power, Jagannathan, 1967; Maiti, Biswas, 1979; Нага et al., 1985; Jossef et al., 1987; Kim, Eskin, 1987). Достаточно много данных представлено в литературе и относительно действия ряда анионов на активность фитаэ.

Из полученных нами данных, следует, что Са2+ и Mg2+ при концентрациях 0,5-1,0 мМ является активаторами фитазы. Ионы Са2+ активирует фитазу примерно на 60%, а магния - на 35%. Дальнейшее повышение концентрации этих ионов ингибирует фитазу, что объясняется выпадением фитата в осадок в виде нерастворимой соли металла (Maiti, Biswas, 1979). Na+ фактически не влиял на фитазную активность. С другой стороны, ряд ионов оказывал инги-бирующее действие на активность исследованной нами фитазы. Так, в присутствии 2 мМ Си2+ активность фитазы составляет 8% от исходной активности. При действии Со2+ и Fe3+ в таких же концентрациях активность фитазы составляет соответственно 19 и 29% от исходной активности фермента.

Нами было изучено также действие продуктов гидролиза на активность фитазы, в частности анионов РОд2-. Результаты экспериментов показали, что повышение концентрации Этого иона до 2 мМ приводит к ингибированию фермента, при котором активность фитазы составляет 83% от исходной.

На рис.5 приведены данные зависимости 1/V от концентрации ионов Си2+, Со2+ и Fe3+ в инкубационной среде. На основании этих графиков по тангенсу угла наклона нами были вычислены константы ингибирования активности фитазы этими ионами:

Ki Fs = 0,040; Hi со = 0,067; Hi cu = 0,093 мМ фитина

Можно предполагать в связи с этим, что обнаруженная конкуренция проявляется в замещении ионами-ингибиторами ионов Caz+, обеспечивающих взаимодействие между субстратом и ферментом. С другой стороны, вполне вероятным представляется и другая возможность - избыток фитина связывает ионы Си2+, Со2+ и Fe3+, снижая их эффективную концентрацию, способную влиять на активность фитазы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Подводя итог, следует отметить, что выделенная и изученная в настоящей работе внеклеточная фитаза из Bacterium sp. является термостабильным ферментом, активным при кислых значениях рН. По этим параметрам исследованный нами фермент близок фитазам, полученным из различных объектов. Исследованная нами фитаза из культуральной жидкости Bacterium sp. проявляет также выраженную специфичность по отношению к фитатам.

Сопоставление свойств фитазы, описанной в настоящей работе, и препаратов этого фермента, выделенных из других объектов, обобщены нами в таблице 3. На основании приведенного материала можно заключить, что в целом фитазы максимально активны при слабо кислых значениях рН (2,2-5,6). Общим свойством изученных препаратов фитазы является термостабильность - фитаза максимально активна при температуре 40-70°С. По данным различных авторов, молекулярная масса фитазы находится в относительно широком диапазоне значений: 32,4-100 KDa, также широко варьируют приведенные в литературе значения Нщ этого фермента в отношении фитата как субстрата - от 0,018 до 6,7 мМ.

Ионы Са2+ в случае фитазы из культуральной жидкости Bacte-riurn sp., как и во всех других известных случаях универсально действовали как активатор фитазы, тогда как в случае растительных фитаз действовал как активатор, а в случае микробиологических фитаз - как ингибитор. Таким же двояким действием обладает и Мп2+, с той лишь разницей, что в случае ¿sp.fJavipes Mn2+ влияет активирующе. В наших экспериментах с фитазой их культуральной жидкости Bacterium sp. ионы Mg2+ при концентрации 0,5-1,0 мМ стимулировали активность этого фермента, однако при дальнейшем увеличении концентрации этого иона обнаруживался незначительный ингибирующий эффект.

Анионы фторида, арсената, цитрата, а также катионы Zn2+, Со2* и Fe3* являются ингибиторами описанных в литературе препаратов фитаз. Исследованная нами фитаза снижает свою активность в присутствии ионов Си2+, Со2+ и Fe3+. При этом ионы Си2+ и Co2t ингибировали активность фитазы конкурентно по отношению к

14

Сравнительная характеристика фитазы из культуральной. жидкости Bacterium sp. и фитаз из других источников

Таблица 3

Источник фермента

рН-оптимум

темпер, опт.,ЬС

Мол.мае. itDa

Km» мМ

акти- ! пнгиб. ватор | Kj.wM

очистка с использованием

примечание

автор

1.

¡3

!

i

4

Aurobacter 4-5 aerofjenes! Bacillus subtillis

I

| Asp.fia-J vi pes

. i Asp. ! t'lcuum

Bacterium sp.

5,6

5,5

2,5

5,5

5-5,5 5,0

5,4

45-50

37,5 70

58 60

55-60

815-100

62

13,4

0,6ii

0,42

осаддонке зтанодом

Ca

2л,Ca, bin, К

1,25

0,024 0,129 !

0,040 ;

Ca

Ca, Mg

Mg.bin, Fe,Zn, Co

арсенат фторид

Mg

фторид

Fe, Cos Cu,P0 -

расщепляет и глицёро-фосфат

0-100.КЩ

G-100, декстран

SP-трисакрил Ы, РВЕ 94

Zetap-lOOSP ИЕ2В, ДЭАЭ-трисакрил

(NH4)2S04, G-100, ДЭАЗЦ

ингибируется фитатом <2ыМ

гликопротеин 10% углевод

ингибируется фитатом <2ыМ

ингибируется фитатом <2мМ строго сне цифична S

Gravies et al., 1966

Powar,Jcgannat-han, 1967

Joussef, 1987

Shich et al.,

1966 Irving,Cosgrove, 1972, 1974

Ullaii, Gibson, 1987

Ullah, 1988

Тиллаева, Игз-лназгрсв, 1997

N

It

U

субстрату, тогда как ионы Fe3+ действовали неконкурентно.

Некоторые фитазы, в том числе и исследованная нами, ингибируются избытком субстрата и продуктами гидролиза. В частности, препараты фитазы из фасоли и гриба Asp.ficuum ингибируются концентрациями фитата выше 2 мМ, фитаза из /îerobacter aerogenes ингибируется только при уровне субстрата, превышающем 0,3 М. Фитаза из пшеницы и сои ингибируются ортофосфатом, при этом Ki составляет 0,3 и 0,018 мМ соответственно. В наших экспериментах при изучении действия ионов ортофосфата как продуктов гидролиза на активность бактериальной фитазы было установлено, что повышение концентрации этого иона до 2 мМ приводит к ингибированию активности фермента до уровня 83% от исходной.

У растительных фитаз, в частности из редьки, тыквы и пшеницы имеются две изоформы данного фермента, различающиеся по ряду признаков (pH-оптимум, активаторы, Ки и т.д.). Фитаза как вид ферментов в основном является строго специфичным ферментом в отиосении субстрата, исключая фитазы из фасоли и Aerobacter aerogenes, которые расщепляют и другие фосфаты. В случае фитазы из кулътуральной жидкости ßacterlum sp. продемонстрирована еы-сокая избирательность фермента по отношению к субстрату.

В различных лабораториях препараты фитазы были очищены до весьма высокой степени (гомогенность в условиях диск-электрофореза в ДДОПААГе) в основном с использованием осаздения сульфатом аммония, гель-хроматографии на сефадексах, ионообменной хроматографии на ДЭАЭ- или КМ-целлюлозе и SP-трисакриле. Использованный нами метод выделения и очистки данного фермента из почвенных микроорганизмов сравнительно прост, хорошо воспроизводим и позволяет быстро и эффективно получить значительные количества высокоактивного npenapivra фитазы. Все это создает перспективу для использования данного фермента как в биотехнологических целях, так и в биохимических исследованиях.

ВЫВОДЫ

1. Из сероземных почв Узбекистана выделены 26 фитин-раст-воряющих микроорганизмов, среди которых Poní ci Шит sp., Pénicillium nigricans и [lactarium vf>. пбл'уьччт ipnxemioñ фи

10

тин-разлагающей способностью. Среди исследованных микроорганизмов Bacterium sp. проявляет наиболее высокую фитазную активность, которая на 4 день культивирования составляет 300 ME.

2. Из культуралыюй жидкости Bacterium sp. методами высаливания сульфатом аммония, гель-хроматографии на сефадексе 0-100 и ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе выделена фитаза с очисткой в 124 раза и выходом 12%. По результатам электрофореза в ПААГе, очищенная фитаза является электрофорети-чески гомогенной.

3. Определен аминокислотный состав элегарофоретически гомогенного препарата фитазы. Фермент содержит 674 остатков аминокислот и является Слабоотрицательно заряженным белком.

4. Изучены физико-химические и биохимические свойства электрофоретически гомогенной фитазы, которая является термостабильным белком при температуре до 60°С и активна при кислых значениях рН (рН 5,4). Концентрация субстрата выше 2 иМ ингиби-рует фитазу. Молекулярная масса фитазы составляет 62 кДа, Ifa -0,42 мМ, Vmax ~ 0,71 мкг-мин~1-мг белка-1.

5. Ионы Са2+ и Mg2+ являются активаторами фитазы из куль-туральной жидкости Bacterium sp.: Са2+ в концентрации 0,5 мМ стимулирует активность фермента на 60%, a Mgz+ на 35%. Ионы Cu2+, Со2+, Fe3+ и РО42" являются ингибиторами этого фермента, активность фитазы в присутствии 2 мМ этих ионов составляет соответственно 8, 19, 29, 83% от исходной активности фитазы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Умарова Г.Б., Кариибоева З.Е*., Игамназаров Р.П., Векна-заров Б.О., Валихонов М.Н. Турли хил тупрокларнинг фитаза фаол-лиги ва унга баъзи таи^! омилларнинг таъсири./'Узб.биол.журн. -1996,- N3.- С.12-16.

2. Умарова Г.В., Каршибаева З.Е., Игамназаров Р.II., Вали-ханов М.Н. 0 возможной роли внеклеточных фитаз микроооганизчов в дефосфорилировании фитина почч./'*Уэб.биол.журн. -1997,- II ?.. С.18-21.

"Караибаева - девичья фамилия Тиллаегой

3. Каршибаева 3., Игамназаров Р.П., Валиханов М.Н. Некоторые свойства фитазы грибов рода Penicillium.//Тез.докл.науч.конференции "Современные проблемы общей физиологии и биофизики".- 1093.- С.70.

4. Каршибаева 3. Биохимические особенности фитаз грибов рода Penicillium.//Тез.докладов 2-научной конференции биохимиков.- 1993.- С.188.

5. Каршибаева З.Е., УмароваГ.Б., Игамназаров Р.П., Вали-ханов М.Н. Свойства ба.терпи Bacterium sp., дефосфоршшрующих фитин.■¿Тез.докл.науч.конференции "Современные проблемы биологии и экологии".- 1995.- С.55.

6. УмароваГ.Б., Каршибаева З.Е., Игамназаров Р.П. Микроорганизмы почвы, участвующие в дефосфорилировании солей фитиновой кислоты. // Тез. докл.науч. конференции "Современные проблемы биологии и экологии".- 1995.- С.161.

7. Игамназаров Р.П., УмароваГ.Б., 1>аршибоева З.Е., Авлаев О.У., ^амбариддино^а Ш. Турли типга мансуб тупрокларнлнг фитаза фаоллиги. ¿"'Биология ва экологиянинг хозирги замом ыуаммолари" шший конференция маърузаларининг тезислари.- 1995.- .140 б.

8. Валиханов М.Н., Игамназаров Р.П., УмароваГ.Б., Каршибаева З.Е. Некоторые свойства фитазы бактерии Bacterium sp.

¿Тез.дат.науч. конференции "Структура и функции биологических ые»йра]|".- 1995.- С.59.

9. Каршибаева З.Е., Игамназаров P.II., Валихонов М.Н. Выделение и свойства внеклеточной фитазы из Bacterium sp. ААмир Те-ыурнинг 660 йидлигига багишланган Ёш олимлар ва талабаларнинг П-Республика Илмий конференция тезислари туплами.- 1996.- С.6.

10. Каршибаева З.Е., Игамназаров Р.П., Валиханов М.Н. Внеклеточная фитаза из Bacterium sp. и ее свойства. 3-конференция биохимиков Узбекистана. Тезисы докладов.- 1996.- С.149.

11. Игамназаров Р.П., Валихонов М.!!., Каршибаева 3. Е., Умарова Г.Б. Роль микроорганизмов в дефосфорилировании фитина в почвах.//Международная научная конференция "Влияние физико-химических факторов на метаболические процессы организма". АнДУ. -19»?.- С. 88.

1В

29ЩАЧЛ ИАЗМУН

ТИМАЕВА Зебо Ёрбековиа Тупро^ микроорганизмлари фитазасининг физико-химиявий ва биохимиявий ху'сусиятлари

Узбекистан буз-тупро^ларидан фитинга таъснр зтувчи 26 хил микроорганизмлар ажратиб олиниб, улар ичида Bacterium sp. щори фитаза фаоллигига эга эканлиги аник^ланган. Уибу бактериядан фитаза ферментини сульфат аммоний ёрдамида чуктириш, гель-хрсма-тогрфия (Q-100) ва ион алмашинув хроматографияси (ДЭАЭ-целлюлоза) ёрдамида тозаланган; полиакриламид гелидаги диск-электрофорез ёрдамида текширилганда фитаза гомоген ^олатда тозаланганли-ги маълум булган. Тозаланган ферментнинг хусусиятларини ургании шуни курсатадики, Bacterium sp. фитазаси термостабил фермент булиб, 60°С хароратда юкорл фаолликка эга; унинг рН-оптимуми 5,4 булиб, кучсиз нордон мудитда уз фаоллигини намоён килади. Унинг молекуляр огирлиги 62 KDa, Кщ - 0,42 мМ, Vmax - 0,71 мкг-мин-1 • мг оксил~г эканлиги топилган. Урганилган фитаза фитат-лгрга нисбатан специфик б>*либ, долган субстратларга мутлацо таъснр этмаиди. Субстрат - фитин 2 мМ Еа ундан щори концентра-цияда фитаза фаоллигининг камайитаига сабаб б^лган. Bacterium ср. фитазасига турли ионларшшг тдоснркни урганиш натижзсида Са™*, (И^""1" - активатор, Fe3+, Со2+, Cuz+ ва ТО2- - ингибитор эканлиги аникланган.

PHYSICO-CHEMICAL AND BIOCHEMICAL PROPERTIES CF PHYTASE FROM SOIL MICROORGANISMS Tillaeva Zebo Rrb?kovna

26 phytin deccmposing microorganisms were isolated from the grey soils of Uzbekistan. Bacterium sp. had the most phytase activity - 300 MU after 4 days of culturing. The isolated phyta^f from cultural liquid was purified 124-fold with 12%-yield by sulfate ammonium precipitation, G-100 sefadex gel-chroiratograp-hy, DEAE-cellulose ion-exchange chromatography. The purified phytase is homogeneity as indicated by PAAG electrophoresis. The enzyme is the protein with the weak negative charge and contains 574 cminoacid residue:-.

Studying of physico-chemical and biochemical properties of electrophoretic homogeneous of the phytase showed that this en-' zyme is termostable protein at the temperature 60°C and has activity at acid pH (pH 5,4). The phytase was inhibited by substrate concentration above 2 M. The enzyme has molecular mass 62 kDa, Km - 0,42 mM, Vmax " 0,71 mg-n>in-1'mg protein"1. Ca2+ and Mgi'+ ions were activators of phytase from Bacterium sp. cultural liquid: Ca2+ 0,5 mM stimulates of enzyme activity on 60%, Mg2+ on 35%. Cu2+ Co2+, Fe3+' and P042- were ingibitors of this enzyme. Under 2 irt.l of these ions inicial activity were 8, 19, 29, 83%, recpectively.

Соискатель:

Подписано к печати 23.С3.98. Формат бумаги 60x84 1/16. Объем 1 п.л. Тираж 60 экз. Заказ 162

Отпечатано на ротапринте в типографии ТашГУ.