Поиск, клонирование и экспрессия генов бактериальных фитаз

Зинин, Николай Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск, клонирование и экспрессия генов бактериальных фитаз
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Поиск, клонирование и экспрессия генов бактериальных фитаз"

На правах рукописи

Зинин Николай Владимирович

ПОИСК, КЛОНИРОВАНИЕ И ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ФИТАЗ

03.00.15.-Генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА-2004

Работа выполнена в лаборатории ВКПМ Федерального государственного унитарного предприятия "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП «ГосНИИгенетика»)

Научный руководитель:

Доктор биологических наук С. П. Синеокий

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор И. А. Хмель Кандидат химических наук С. А. Тюрин

Ведущая организация:

Институт Общей Генетики РАН

Защита состоится « 26 » октября 2004 г. в 1400 часов на заседании диссертационного совета Д217.013.01 ФГУП «ГосНИИгенетика» (117545, Москва, 1-ый Дорожный проезд, дом 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИгенетика» Автореферат разослан « » сентября 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Кандидат биологических наук В. И. Щербакова.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Фитат (мио-инозитол гексакисфосфат) является преобладающей формой накопления фосфора в зерне, семенах масличных и бобовых [Reddy 1982]. Животные с однокамерным желудком не способны усваивать фитатный фосфор из-за отсутствия или низкого уровня фитазной активности в гастроэнтеральном тракте животных [Bitar et al., 1972]. Кроме того, фитаты уменьшают доступность белков и микроэлементов в кормах. Не усвоенные фитаты, попадая в почву и водоемы, вызывают загрязнение окружающей среды.

Ферменты фитазы отщепляют фосфатные группы от фитатов и с успехом используются в животноводстве в качестве кормовой добавки, значительно повышая усвояемость фосфора.

С развитием соевой промышленности доля рыбной муки в кормопроизводстве уменьшается, в то время как доля кормов растительного происхождения возрастает, и, следовательно, возрастает потребность кормопроизводства в пищевых добавках, содержащих фитазы.

Для практического использования препараты фитаз должны быть устойчивы к высушиванию и действию высоких температур в процессе приготовления комбикормов, а также приспособлены к действию в среде желудка животных (наличие активности при низких значениях рН и устойчивость к протеолитическим ферментам). Все известные фитазы имеют разные технологические характеристики, причем у каждого фермента есть свои преимущества и недостатки. В настоящее время требуются новые, более совершенные фитазы.

По данным литературы известно около 40 различных фитаз, которые относятся к трем семействам ферментов, имеющих разные типы строения молекул и активного центра. Большинство известных фитаз принадлежат к семейству кислых гистидиновых фосфатаз [Oh et al., 2004]. У всех аминокислотных последовательностей семейства есть консервативный мотив, содержащий остаток гистидина, который участвует в нуклеофильной атаке на отщепляемую фосфатную группу [van Etten et al., 1982]. В семействе кислых гистидиновых фосфатаз была выделена группа грибных фитаз [Ehrlich 1994 et al., Mitchell et al., 1997]. Фитазы из этой группы имеют хорошие технологические характеристики и используются для практических целей. Общим недостатком грибных фитаз является невысокая удельная активность. Бактериальные фитазы имеют более высокую удельную активность. Самая высокая удельная активность из всех изученных фитаз у фитазы АррА Е. coli - около 2000 ед/мг белка - [Golovan et al., 2000]. Недостатком бактериальных фитаз является низкая термостабильность. Методы белковой инженерии позволяют повысить термостабильности белков [Garrett et al., 2004, Lehmann et al., 2002]. Для реализации этих методов требуется изучение ряда гомологичных аминокислотных последовательностей. Эффективность методов возрастает при увеличении количества изученных гомологичных последовательностей, поэтому поиск новых последовательностей является актуальной задачей. Наибольший интерес ттг^я пякилгп ппггупггя ттреяг.тяиггяют

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 БИБЛИОТЕКА | СПе 09

ляижм I

фитазы, имеющие гомологию к фитазе АррА Е. coli, поэтому в данной работе был предпринят поиск именно таких последовательностей.

Цели и задачи работы: Данная работа посвящена поиску и изучению новых бактериальных фитаз, перспективных для применения в животноводстве.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Поиск и изучение бактериальных фитаз, имеющих промышленно ценные свойства.

2. Клонирование генов фитаз, имеющих наиболее перспективные технологические характеристики.

3. Филогенетический анализ аминокислотных последовательностей обнаруженных фитаз. Вычисление «консенсусной» последовательности, на основе полученного ряда гомологичных последовательностей фитаз.

4. Сверхэкспрессия клонированных генов фитаз в бактериальных и дрожжевых системах и изучение их свойств.

Научная новизна. Впервые проведен скрининг продуцентов внутриклеточных фитаз среди грамотрицательных бактерий, выделенных из почвы и компоста. Внутриклеточные фитазы обнаружены у представителей нескольких видов из семейства Enterobactenaceae и рода Pseudomonas. Также изучены внутриклеточные фитазы у 200 различных штаммов Е. coli, выделенных из разных источников. Проведено сравнение свойств новых фитаз с уже известными фитазами. Фитаза из Citrobacter freundii, обнаруженная в ходе проведения данной работы, имеет более высокую удельную активность по сравнению с фитазами, известными в литературе.

Гены внутриклеточных фитаз из О. proteus, С. freundii и Е. cloaceae были клонированы. Их нуклеотидные последовательности были расшифрованы и отправлены в ГенБанк (NCBI). Было показано, что нуклеотидные последовательности генов, кодирующих новые фитазы, не имеют гомологии с известными генами. Однако их аминокислотные последовательности имеют гомологию с последовательностями других известных бактериальных фитаз. Вместе они формируют отдельную группу «бактериальных фитаз» в семействе кислых гистидиновых фосфатаз. В данной работе показано, что добавление новых членов значительно расширяет группу «бактериальных фитаз» и подтверждает обособленность этой группы от группы «грибных фитаз». Проведен сравнительный анализ аминокислотных последовательностей бактериальных и грибных фитаз.

На основе аминокислотных последовательностей бактериальных фитаз была вычислена «консенсусная» последовательность. «Консенсусный» белок имеет большую термостабильность, чем его предшественники.

Определено, что фитазы из Obesumbactermm proteus и С. freundii обладают высоким сродством к фитату, в то время как первоначально описанная фитаза из Enterobacter cloaceae является глюкозо-1-фосфатазой. Кроме того, в хромосоме О. proteus обнаружен ген phyX, нуклеотидная последовательность которого гомологична последовательности гена аррА Е. coli. Ген phyX кодирует белок, функция которого неизвестна. Определено, что отсутствие фитазной активности у белка PhyX связано со строением С-концевой части белка. При замене короткой С-

концевой части PhyX на С-концевую часть АррА у PhyX появляется фитазная активность.

Для последовательностей клонированных фитаз были предсказаны структуры молекул и определено положение аминокислотных остатков активного центра. Были определены сайты отщепления сигнальных пептидов, что дает возможность проведения корректной экспрессии зрелой части фермента в гетерогенных системах.

В данной работе показана возможность экспрессии генов бактериальных фитаз в дрожжах и секреции зрелых белков с использованием сигнальных пептидов дрожжей.

Практическая значимость. Фитазы используются в животноводстве в качестве ферментой добавки, улучшающей качество кормов. Предпочтение отдается фитазам, имеющим лучшие характеристики. Фитазы, обнаруженные в данной работе, не только не уступают по своим характеристикам уже известным фитазам, но и превосходят их по таким показателям, как, например, удельная активность фермента.

Аминокислотные последовательности фитаз, обнаруженных в данной работе, составляют единую группу с фитазой Е. coli. Расширение арсенала бактериальных фитаз, гомологичных между собой, дает возможность создания на их базе более совершенных ферментов при помощи методов белковой инженерии, таких как «DNA shuffling» [Stemmer et al., 1994], метода «консенсусной последовательности» [Lehmann 2002], а также сайт-направленного мутагенеза [Lehmann et al., 2001].

Для продукции промышленных ферментов необходимо создание высокоэффективных продуцентов. В данной работе осуществлена экспрессия фитаз в бактериальных и дрожжевых системах, позволяющая нарабатывать ферменты в большом количестве.

Апробация. Результаты настоящей работы докладывались на заседании Секции генетики микроорганизмов Ученого Совета ФГУП «ГосНИИгенетика» 27 мая 2004 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 тезиса конференций и 2 статьи.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения и заключения. Диссертационная работа изложена на 120 страницах, включает 21 рисунок и 10 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Среды и условия культивирования

Выделение штаммов Е. coli из природных образцов проводили на среде Эндо. Штаммы остальных видов бактерий выделяли при помощи среды ФС следующего состава (г/л): 10 - экстракт казеина, 10 - экстракт пшеничных отрубей, 0,4 - MgS04*7H20, 2.0 CaCh, 0.4 - (N114)2804, значение pH среды доводили до 6,8 при помощи NaOH.

Для выращивания культур бактерий использовали среду LB (г/л): 10 - триптон, 5 -дрожжевой экстракт, 5 -NaCl. Для выращивания культур дрожжей использовали среду YPD (г/л): 15 - пептон, 10 - дрожжевой экстракт, 5 - глюкоза и среду YNB (DIFCO). Выращивание культур бактерий проводили при температуре 37°С (£. coli) и 30°С (остальные виды бактерий), выращивание культур дрожжей проводили при температуре 28°С.

Штаммы и плазмиды

Штаммы и плазмиды были получены из коллекции ВКПМ. Для определения внутриклеточной фитазной активности использовано 50 коллекционных штаммов грамотрицательных бактерий, способных к росту на среде LB , 200 природных штаммов К coli, выделенных из образцов фекалий травоядных животных. Для определения секретируемой фитазной активности использовано 120 коллекционных штаммов грамотрицательных и грамположительных бактерий, способных к росту на среде ФС, 1400 изолятов бактерий из 85 разных образцов почвы и компоста. В работе использованы генетически маркированные штаммы и их производные: Е. coli: XL1 Blue, BL21 (DE3), DH5a, C600; дрожжи: Klueveromyces lactis (игаЗ).

В работе использованы следующие плазмиды и их производные:

pSP72, pST76-C, pET22b+, pPIC9, pKLac, pScer.

Приготовление образцов фитаз

Получение очищенных образцов фитаз проводилось в два этапа: на первом этапе осаждали большую часть посторонних белков при низких значениях рН: к образцам грубых экстрактов добавляли равный объем буфера 0.5 М глицин-HCl (рН 2.0-3.0). После инкубации в течение 30 мин при 30°С выпавшие белки удаляли центрифугированием. На втором этапе ферменты очищали при помощи высокоскоростной жидкостной хроматографии (ВСЖХ). Образцы для хроматографии были приготовлены с помощью диализа против буфера (50mM Tris-HCl, рН 7.0, 1М NaCl) в течение 12 часов и нанесены на колонку Superdex 75-HR, уравновешенную при помощи того же буфера. От солей буфера образцы фитаз были очищены диализом против воды в течение 12 часов.

Определение фитазной активности

Фитазную активность определяли по накоплению в реакционной смеси свободного фосфат-иона, детектируемого методом Фиске-Субарроу [Fiske et al, 1925]. Реакционная смесь содержала 120 мкл 0.5 М буфера, 50 мкл образца фермента фитазы, 0.2 % фитата Na и Н2О до конечного объема 0.6 мл. Инкубацию проводили 30 мин при 37°С и

останавливали реакцию добавлением 0.15 мл 10% трихлоруксусной кислоты. Фосфомолибденовый реагент (0.25 М молибдата аммония в 4% растворе H2SO4) добавляли в количестве 0.75 мл. Активность измеряли при помощи фотоэлектроколориметра (ФЭКа) при длине волны 670 нм. единица активности (ед) соответствует высвобождению 1 ЦМОЛЬ фосфата за 1 мин.

Гибридизация ДНК с радиоактивным зондом

Радиоактивный зонд, меченный dAT3JP, названный Ъ-аррА, готовили по протоколу, прилагаемому к киту HexaLabel DNA Labeling Kit#K0611 (Fermentas). Матрицей для зонда служили 100 нг ДНК фрагмента кодирующей области гена аррА К coli размером 1.2 тин, полученной при помощи ПЦР-амплификации. Амшшфицированный фрагмент ДНК был очищен при помощи «DNA extraction KIT» (Fermentas).

Для поиска генов, гомологичных аррА, хромосомную ДНК фрагментировали различными рестриктазами и разделяли полученную смесь электрофорезом в агарозном геле. ДНК переносили на нейлоновые фильтры методом Саузерн-блоттинга и проводили гибридизацию ДНК на фильтре с зондом

Все операции с ДНК проводили согласно протоколам [Sambrook 1989].

Отбор клонов, имеющих внутриклеточную фитазную активность

В данной работе разработан чашечный метод определения фитазной активности Колонии трансформантов Е. coli выращивали на чашке в течение суток при 37°С. Затем сверху заливали верхний слой с мутной взвесью фитата кальция (ВС-Ф) следующего состава: 1% агарозы, 1% Na фитата и 0.5% СаСЬ, 0.2 М Na ацетат-уксусной кислоты рН 5.0. Верхний слой был сначала расплавлен (5 мин при 100°С), затем охлажден перед заливкой до 42°С. Хотя клетки колоний продуцировали внутриклеточные фитазы, часть клеток разрушалась и внутриклеточные ферменты могли свободно диффундировать в агарозный гель вокруг колонии. Чем больше фитазы выделялось вокруг колонии, тем быстрее появлялась зона просветления в верхнем слое. Если клетки колонии несли мультикопийную плазмиду, содержащую ген фитазы, то зона просветления появлялась уже через 1-6 часов (если ген фитазы на плазмиде отсутствовал, то зона просветления появлялась только через двое суток за счет экспрессии гена аррА хромосомы Е. coli). Таким образом можно было различить «активные» клоны. Эти клоны извлекали петлей прямо из-под верхнего слоя. На одной чашке диаметром 10 см тестировали до 1000 колоний.

Конструирование геномной библиотеки и отбор клонов с искомой вставкой

Хромосома штамма О. proteus B6898 была частично разрезана эндонуклеазой Mphl43I. Фрагменты ДНК размером около 3-6 тин были вырезаны из агарозного геля после электрофореза и очищены при помощи «DNA extraction Kit» (Fementas). Полученная таким образом смесь фрагментов ДНК была лигирована с ДНК вектора разрезанной эндонуклеазой BamHI, и трансформирована в Е coli XL1 (Blue). Плазмиды, в которых были фрагменты ДНК, содержащие ген фитазы, были названы pUC-OPl. Трансформанты тестировали на фитазную активность при помощи верхнего слоя ВС-Ф.

По идентичной схеме были сконструированы геномные библиотеки штаммов О. proteus B6897, С. freundii B4090 и Е cloaceae B2254. Плазмиды, в которых были

фрагменты ДНК, кодирующие гены фитазы из хромосомы этих штаммов, были названы pUC-OP2, pUC-CFl, pUC-EC, соответственно.

Конструирование плазмид для экспрессии генов фитаз

Для экспрессии в Е. coli была проведена ПЦР-амплификация фрагментов ДНК, соответствующих ORF генов фитаз, следующих штаммов: О. proteus B6798, С. freundii В4090 и Е. coli W3350. Амшшфицированные фрагменты ДНК были разрезаны и лигированы с ДНК вектора рЕТ22Ь+. Полученные плазмиды названы рЕТ-ОР, pET-CF и рЕТ-ЕС, соответственно. Эти плазмиды были трансформированы в штамм К coli BL21(DE3).

Для экспрессии в P. pastoris была проведена ПЦР-амплификация фрагментов ДНК, соответствующих кодирующей части ORF генов фитаз следующих штаммов: О. proteus В6798 С. freundii В4090 и Е coli W335O. Амплифицированные фрагменты ДНК были разрезаны и лигированы с ДНК вектора рР1С9. Полученные плазмиды названы рР1С-ОР, pPIC-CF и pPIC-EC, соответственно. Эти плазмиды были разрезаны эндонуклеазой Bglll и трансформированы в штамм P. pastoris GS115 согласно протоколу Kit #28662 (Invitrogen). Экспрессия генов фитаз из С. freundii и К coli в P. pastoris была проведена с использованием последовательности промотора глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAP) из P. pastoris [Waterham et al., 1996]. Экспрессия гена фитазы аррА из штамма Е. coli W3350 была проведена в дрожжах S. cerevisiae и К. lactis.

Определение N-конпевой аминокислотной последовательности белка

Образцы для секвенирования концевой части белка были приготовлены следующим образом: образцы очищенных фитаз нанесли на SDS-PAGE гель, провели электрофорез, затем перенесли белки фитазы из полоски при помощи электроблотинга на мембрану |

иммобулон-Р.Секвенирование проводили с использованием вырезанных полосок i

иммубулона-Р по Эдману с помощью Applied Biosystems Procise cLC instrument.

Анализ аминокислотных последовательностей

Положение сигнального пептида было предсказано с использованием программы SignalP [http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/]. Молекулярная масса последовательностей зрелых белков определена с использованием программы PeptideMass [http://cn.expasy.org/tools/peptide-mass.html]. Поиск гомологичных последовательностей проведен с помощью программы BLAST [http://www.ncbi.nhn.nih gov/BLAST/]. Множественное выравнивание белковых последовательностей было проведено с помощью ClustalW [http://www.ebi.ac.uk/clustalw/]. Филогенетический анализ гомологичных последовательностей проведен при помощи различных программ (SeqBoot, Protdist, Protpars, Neighbor, Consense), входящих в PHYLYP (Phylogeny Inference Package) version 3.6b [Felsestein et al., 1989]. Эволюционное дерево было нарисовано с помощью программы TreeView software version 1.6.6 [http://taxonomy.zoology.gla.za]. Последовательности вторичных структур белков определены при помощи программы SOPHMA [http://npsa-

pbil.ibcp.fr]

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Поиск новых фитаз, продуцируемых бактериями 1.1. Поиск секретируемых фитаз бактерий

Бактерии выделяли из почвы методом обогащения с использованием среды ФС. Культуры бактерий выращивали до поздней стационарной фазы. Среди исследованных 1400 природных изолятов внеклеточная фитазная активность выявлена в культуральной жидкости у 39 штаммов. Все эти штаммы по результатам определения отнесены к роду Bacillus. Активность фитаз была измерена при разных значениях рН (3.0, 4.5, 5.5, 7.0) при 37 °С. Оказалось, что фитазы всех этих штаммов имеют активность при «нейтральных» значениях рН. У 13 штаммов фитазы были активны при рН 5.5-7.0, тогда как у остальных 28 штаммов фитазы имели еще более узкий рН-профиль активности (рН 6.5-7.5). Ни один из штаммов не проявлял какой-либо значимой фитазной активности при рН ниже 5.5. Фитаза штамма В6162 проявила наибольшую активность при рН 7.0, однако активность этой фитазы значительно падала при рН ниже 6.0. Наиболее широкий профиль активности оказался у фитазы штамма В6155. Эта фитаза проявляла активность в диапазоне рН 4.57.5. Кроме того, у фитаз была изучена термостабильность, т.е. способность выдерживать кратковременное действие высоких температур. Активность изучаемых фитаз сохранялась на уровне 20-60% после инкубации при 60 °С в течение 30 мин.

Из представителей 62 видов коллекционных штаммов бактерий только у 13 была обнаружена внеклеточная фитазная активность. Оказалось, что все штаммы, секретирующие фитазы, принадлежат к одному роду бактерий - Bacillus: шесть штаммов В. subtilis В321, В661, В662, В1611, В1794, В1795, пять штаммов В. amyloliquefaciens В1323, В4812, В4814, В5207, В5628, а также штаммы В. brevis 5167 и В. psychrosaccharofyticus В 5311. У большинства штаммов активность наблюдалась только при рН 7.0, и только у трех штаммов В. subtilis B321, В. amyloliquefaciens B1323 и В5628 активность наблюдалась при рН 5,5-7. У представителей других родов бактерий секреция фитаз не обнаружена.

1.2. Поиск внутриклеточных фитаз у грамотрицательных бактерий

Активность фитаз определялась в лизате бактерий, выращенных на среде LB до поздней стационарной фазы роста. Всего было проверено 58 штаммов из 40 видов бактерий, принадлежащих к 21 роду. У большинства исследованных бактерий внутриклеточная фитазная активность отсутствовала. Исключение составили представители нескольких видов бактерий: Obesumbacterium proteus, Citrobacterfreundii, Enterobacter cloaceae. Все эти виды родственны К coli, т. к. входят в одно семейство -Enterobacteriaceae. В их клеточных лизатах были обнаружены фитазы, активные при низких значениях рН, как и у Е. coli. Кроме того, фитазы, активные при нейтральных рН,

были обнаружены у представителей Pseudomonas aentginosa и P. aurantiaca. Уровень активности и другие свойства внутриклеточных фитаз, обнаруженных в данной работе, отражены в Табл. 1.

Таблица 1. Фитазная активность в лизатах грамотрицательных бактерий

Бактерия Фитазная активность (ед/г общего белка грубого экстракта) при различных значениях рН Хмп; С T„.°C

рН4.5 рНб.О рН6.5 рН7.0 рН7.5

Obesumbacterium Proteus В5477 215 55 - - 60 55

Citrobacter freundii В 3638 310 70 - - - 55 60

Citrobacter freundii, B4090 290 70 - - - 55 60

Enterobacter cloaceae В 2256 49 - - - - 50 55

Pseudomonas aeruginosa B1705 - 43 87 55 - 50 55

Pseudomonas аигапИасаШ\Ъ5 - 25 32 35 24 50 55

* - активность отсутствует.

Тот, температура, при которой достигается максимально высокая активность при рН 4.5. Тин, минимальная температура, воздействие которой в течение 30 минут на образец при рН 7.0 инактивирует фитазу.

Как показали результаты скрининга, внутриклеточные фитазы встречаются среди представителей исследованных бактерий редко. Для оценки встречаемости и разнообразия свойств у фитаз представителей одного вида мы исследовали фитазную активность у двухсот штаммов К coli, преобладающих в образцах фекалий 13 видов различных травоядных животных. Фитазная активность обнаружена абсолютно у всех исследуемых изолятов К coli, однако ее уровни у разных штаммов были различными: 0.1-0.5 ед/мг общего белка. Корреляции между уровнем активности изолированных штаммов и источником выделения не было обнаружено, т.е. из каждого животного были выделены штаммы с высокой и низкой активностью. Чтобы оценить, насколько фитазы различаются по свойствам, мы измерили активность у образцов фитаз при разных значениях рН (3.0, 4.5, 6.0, 7.0), а также проверили устойчивость к кратковременному нагреву (30 мин, 60°С, рН 7.0). У всех двухсот исследуемых образцов оптимум активности наблюдался при рН 4.5, активность резко уменьшалась при рН 6.0, и ни один штамм не проявлял активности при рН 7.0 Также не обнаружено различий в устойчивости к нагреванию (данные не показаны). Поскольку все фитазы из природных изолятов К coli не различаются по свойствам, то существует большая вероятность, что последовательности всех этих фитаз практически не отличаются от последовательностей уже известных фитаз К coli. Таким образом, более перспективными в отношении обнаружения генов новых фитаз являются штаммы других видов семейства Enterobacteriaceae.

2. Клонирование гена phyX, имеющего сходство с аррА Е. соН, но кодирующего фермент с неизвестной функцией

2.1. Поиск генов, гомологичных аррА, у бактерий, синтезирующих внутриклеточные фитазы

Гены, гомологичные аррА Е. СО Ii, могут присутствовать в хромосомах родственных ей энтеробактерий. Мы провели гибризационный анализ хромосом родственных Е. coli бактерий. Зондом для гибридизации служил 32Р-меченный фрагмент ДНК, названный Z-аррА и представляющий собой кодирующую часть гена аррА из Е. coli. Гибридизацию проводили с ДНК хромосом исследуемых штаммов, фрагментированных эндонуклеазой EcoRI. Высокая интенсивность свечения была обнаружена у фрагментов размером 5.5 тпн из хромосом штаммов О. proteus B5477 и В6897, а также в контроле у фрагмента 15 тпн хромосомы Е. coli W3350 (Рис. 1), а у хромосом других штаммов, обладающих внутриклеточной фитазной активностью, гибридизация с зондом полностью отсутствовала. Следовательно, в хромосомах штаммов О. proteus B5477 и В6897 имеются гены, гомологичные гену аррА Е. coli, а у С. freurtdii В4090 и Е. cloaceae B2256 в хромосомах таких генов нет.

Рис. 1 Саузерн-гибридизация с использованием в качестве зонда меченного 32Р-ДНК гена аррА. а. Рестрикционное картирование фрагментов хромосомы О. proteus: Линии 1 ДНК маркер, Fermentas , kit #М067567б, видно слабое неспецифическое свечения некоторых фрагментов маркера, 2, 3,4 ДНК хромосомы О. proteus, обработанная Sail, Pstl+Sall, Pstl, соответственно, б. Хромосомы различных штаммов, фрагментированные Pstl: 1 О. proteus В5477, 2 C.freundii В4090, Линия 3 К cloaceae В2256, 4 О. proteus В9896, 5 О. proteus В6898, 6 ДНК маркер, Fermentas , kit #М067567б, 7 О. proteus В6897, 8 Е. coli С-600. Цифрами около полосок ДНК обозначен размер фрагментов в тпн.

Прежде чем клонировать обнаруженные гены, мы провели рестрикционное картирование хромосомы О. proteus B5477 с использованием различных эндонуклеаз, в

том числе Sail, с последующей гибридизацией с радиоактивным зондом Z-appA (Рис. 1). Интенсивность свечения Sail-фрагментов различается примерно в три раза, так же как и у Sail-фрагментов хромосомы Е. соН. Следовательно, положение Sail сайта идентично в обоих генах, phyXи аррА (Рис. 1) Для проверки наличия генаphyX у других независимо выделенных штаммов использовали штаммы О. proteus B6896, В6897 и В6897, выделенные независимо различными исследователями. Фитазная активность обнаружена только у трех штаммов О. proteus B5477, В6897, В6898. Хромосомы всех четырех штаммов были разрезаны эндонуклеазой Pstl и проверены на наличие гомологичного аррА фрагмента методом гибридизации, как описано выше Только в штаммах О. proteus В 5477 и В6897 обнаружены Pstl-фрагменты одинакового размера 5.5 тпн, содержащие гены, гомологичные аррА, а в хромосоме оставшихся двух штаммов О, proteus В-6896 и В6898 гены, гомологичные аррА, отсутствуют. Поскольку штамм О. proteus B6898 имеет фитазную активность, то его фитаза кодируется генами, отличными от phyX. Также вероятно, что у штаммов О. proteus B5477 и В6897 фитазная активность определяется какими-то другими генами, отличными отрhуХи аррА.

2.2. Выделение и секвенирование фрагмента из хромосомы О. proteus, содержащего ген pbyX

Для отбора плазмид, содержащих phyX, сконструирован штамм Е. соН, у которого в хромосоме последовательность аррА отсутствует полностью, чтобы не мешал эффект гибридизации зонда с геном аррА из хромосомы клонов Е. соН, несущих плазмиды библиотеки. Делеция аррА была создана путем рекомбинантного обмена аррА на ген устойчивости к канамицину. Делеция аррА была перенесена в штамм С600, который мы назвали СбООаррА. Фитазная активность СбООаррА была измерена и оказалась равна 0.04 ед/мг белка, что на порядок ниже активности исходного штамма С600. Остаточная активность определяется, вероятно, фосфатазой Agp E. coli у которой имеется слабая фитазная активность. Pstl-фрагмент хромосомы О. proteus B5477 размером 5.5 тпн, содержащий ген phyX, был клонирован в полинкер pUC19. Полученная плазмида, названная была трансформирована в штамм СбООаррА. Фитазная активность

у трансформированного штамма не увеличилась после трансформацииp\JC-phyX5.5. Это говорит о том, что, вероятно, ген phyX кодирует фермент, не имеющий фитазной активности. Мы расшифровали нуклеотидную последовательность всего клонированного фрагмента плазмиды liVC-phyXS.i. Ген phyX располагается примерно посередине фрагмента в 5.5 тпн (Рис. 2).

Рис. 2. Генетические карты фрагмента из PhyX5.5 и фрагмента хромосомы Е. coli, содержащего ген аррА. Гомологичные участки выделены пунктирной рамкой.

В этом фрагменте гену phyX предшествуют гены, гомологичные генам аррС и аррВ оперона аррС-аррА Е. coli. Последовательность расположения генов клонированного фрагмента полностью идентична расположению генов в опероне аррС-аррА. Однако в клонированном фрагменте в аррС-аррА опероне не хватает начала - промоторного участка оперона с небольшой частью первого гена оперона и конца оперона - небольшой конечной части последнего гена с терминаторного участка оперона. Непосредственно за геном phyX следует последовательность IS5 элемента. Мобильные элементы могут входить в состав транспозонов, которые способны переносить фрагменты ДНК как внутри хромосомы хозяина, так и между разными видами бактерий. Непосредственная близость мобильного элемента IS5 с последовательностью практически идентичного фрагмента аррС-аррА оперона из хромосомы Е. coli свидетельствует о том, что на каком-то этапе эволюции этот фрагмент мог быть перенесен в хромосому О. proteus при помощи транспозона. IS5 элемент может являться следом, оставшимся от этого переноса.

Для изучения свойств PhyX мы провели экспрессию ркуХ в Е. coli BL21 (DE3), используя его нуклеотидную последовательность, включающую 12 С-концевых аминокислот. Фитазная активность у полученных образцов отсутствовала, т.е. не отличалась от контрольных образцов, несущих плазмиды без последовательности phyX. Также не наблюдалось никакой фосфатазной активности у образцов при использовании различных фосфорилированных соединений в качестве субстрата. Это говорит о том, что ген phyX не кодирует ни активную фитазу, ни фосфатазу. Его функция остается неизвестной.

Различие в строении последовательностей РЬуХ и АррА заключается, во-первых, в С-концевых частях белков РЬуХ и АррА, а во-вторых, в несовпадении нескольких аминокислотных остатков внутри последовательностей белков. Мы поменяли С-концевую часть РЬуХ из 12 аминокислот на ее аналог из 69 аминокислот из белка АррА, заменив нуклеотидную последовательность тъваркуХ, начиная с 1013 н.п. (по сайту Sacl), на ее концевую часть гена аррА, начиная с того же места, 1013 н.п. Для сравнения свойств этих двух практически идентичных белков РЬуХ-ЛррЛ и АррА мы провели экспрессию кодирующих их генов в такой же экспрессионной системе, как и для гена phyX. Активности белков измеряли также после индукции клонированного белка. Образцы обоих белков имели одинаковую фитазную активность. Также идентичны были профили активности в зависимости от рН. Различия в 8-ми аминокислотных остатках не являются причиной исчезновения фитазной активности у РЬуХ и не влияют на свойства фитазы. Таким образом, причиной ее исчезновения оказывается изменение С-кондевой последовательности РЬуХ. У белка АррА остатки из этой последовательности в 69 аминокислот находятся на большом расстоянии от реакционного центра. Она никак не контактирует ни с молекулой субстрата, ни с другими аминокислотами фермента, взаимодействующими с субстратом (Рис. 3).

Рис. 3. Пространственная структура фитазы АррА К coli, DKQ1 (PDB NCBI). На схеме видна молекула фитата в области активного центра. Светлым цветом обозначена С-концевая часть молекулы фитазы, аминокислотные остатки 363-432.

Однако в ее состав входит остаток Cys408, образующий в нормальной молекуле АррА дисульфидную связь с Cysl33. Потеря дисульфидной связи между такими далекими участками молекулы может существенно повлиять на структуру всей молекулы. Таким образом, изменение, в общем, небольшой С-концевой части у АррА приводит к изменению пространственной структуры всего белка PhyX, утрате фитазной активности и

может способствовать появлению у него новых функций, пока еще остающихся неизвестными. Тем не менее, этот пример является яркой демонстрацией важности всех доменов белка, даже отдаленных от активного центра.

В хромосоме еще одного штамма О. proteus B6897 также имеется аналогичный участок, содержащий генphyX. Появление генаphyXв хромосоме О. proteus произошло, вероятно, на каком-то этапе эволюции посредством переноса фрагмента оперона аррС-аррА из хромосомы Е. coli в хромосому одного из штаммов вида О. proteus, который был предком штаммов О. proteus В5477 и В6897. Поскольку ген phyX не определяет фитазной активности бактерии О. proteus, то, очевидно, существует другой ген, который кодирует «активную» фитазу у штаммов О, proteus B5477, В6897 и В-6898 По результатам гибридизации аррА и хромосом штаммов О. proteus, содержащих phyA, ген, кодирующий фитазу, не имеет гомологии с последовательностью гена аррА,.

3. Клонирование генов, кодирующих внутриклеточные фитазы

бактерий

Нуклеотидные последовательности генов, кодирующих фитазы энтеробактерий, и гена фитазы аррА К coli не имеют гомологии, следовательно, невозможно клонировать гены фитаз с помощью отбора по гибридизации с радиоактивным аррА-зощом. Для того чтобы осуществить клонирование генов этих фитаз мы разработали метод отбора клонов по фитазной активности. Метод основан на том, что если на мультикопийной плазмиде клона содержится ген активной внутриклеточной фитазы, то такие клоны можно отобрать по зоне просветления мутной суспензии фитата кальция вокруг колонии, которая образуется за счет гидролиза фитата, при частичном лизисе клеток колонии, вырабатывающих большое количество фермента.

Для создания геномной библиотеки были отобраны штаммы О. proteus B5477, В6897 и С. freundii B3638, имеющие максимальную фитазную активность. Фитазная активность была обнаружена у нескольких из 10000 клонов библиотеки. Эти клоны содержали клонированные фрагменты ДНК хромосомы размером от 4 до 8 тпн. Чтобы сравнить уровень активности для каждого клона, было проведено измерение активности в образцах, полученных из стационарных культур клеток, разрушенных ультразвуком. Оказалось, что фитазная активность у всех клонов была около 3 ед/мг белка и значительных отклонений не наблюдалось. Это значение примерно в 30 раз больше, чем активность у исходных штаммов. Индукция лактозой не привела к увеличению фитазной активности у полученных клонов. Это говорит о том, что уровень транскрипции клонированных генов фитаз связан не с промотором lad в векторе pUC19, который индуцируется лактозой, а с собственными промоторами генов фитаз.

Для секвенирования были выбраны клоны, несущие плазмиды с наименьшим размером вставки, и секвенировали полученные фрагменты. Секвенированные нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов депонированы в ГенБанке

под номерами AY378096 (О. proteus B5477), AY425982 (О. proteus B6897) и AY390262 (С. freundii B3638).

У штаммов Е. cloaceae уровень фитазной активности (около 0.03 ед/мг) намного ниже, чем у штаммов Е. coli, О. proteus и С. freundii. Для создания геномной библиотеки была использована хромосома Е. cloaceae B2256 штамма. Фитазная активность была обнаружена у 4 из 10000 клонов геномной библиотеки. Зоны просветления у активных клонов были значительно меньше, чем ранее полученные в библиотеках С. freundii и О. proteus. Фитазная активность у всех клонов была измерена и оказалась около 1 ед/мг белка. Это значение превышает активность штамма Е. coli XL1 Blue всего в 3-4 раза. Секвенс гена фитазы размером 1.3 тан депонирован в ГенБанке под номером AJ783768. Ген, который соответствует этой ORF, мы назвали phoA. Идентичность PhoA и Agp Ecoli очень высокая - 93%. Гены PhoA и Agp встречаются и у некоторых других грамотрицательных бактерий, таких как Shigella flexneri, Salmonella typMmurium, Salmonella enterica. Мы измерили активность фермента PhoA из Е. cloaceae с использованием нескольких субстратов и сравнили со специфичностью Agp из Е. coli. (табл 4-4). Доминирование фосфатазной активности PhoA E. cloaceae над фитазной свидетельствует о том, что этот фермент является фосфатазой.

4. Анализ аминокислотных последовательностей клонированных

генов

При поиске гомологов аминокислотных последовательностей клонированных генов фитаз обнаружено еще несколько последовательностей. Все последовательности оказались бактериального происхождения. Мы провели множественное выравнивание гомологичных последовательностей с помощью программы СЬМа^ (Рис. 4).

------»'AIX,IfFLiLLI?LrPKS4JT4£SEPELKLESVVIVSraevjAPTKAT-QLMQD 53

------tlSTFIIPLLFl SLJ.CGSF5 r^^EEQHGMKLERVVIVSRflG'/RAPTKFT-PIHKO 53

---------KPL*FI«WimSraET£PSGYQLEKWILSraGraAPTrOT-QTMRD 50

---------iJFZ,A VTAaS/iirrASlÄSETVPSGYQliEKWILSMCWRAPTKMT-QTMRD 50

r&'.TE^EVFLSGI.VI.'T.SCUinrraPVAftEPSGYTLERWILSBHSraSPTKQI-QLMUD 59 M3v.yL4:-"rLC4LTLILC:n^'JlPIAIPPAGyiLERVVILSBHGraSPTKC?I-QLMND 59 -----№4?i.^.»«^JCA-/Lb'S>g^J0TVPEGYaLQQVmMSBHGLiaPLAHSGSVLEQ 55

ЛГУ .>QETPEGYQLEQVLIMSRHHLBAPLAHHGSVLEQ 55 -raLP6C4^XAZ,bbI.0IfbVPbTP«'.TDATPDTLEKVVILKHaGVKAPMSSP-ERLGR 58

-----------I.'PbSLPlM'vTUUSa^SlEILEKWILSMGVHSPMSSP-EBLEE 48

----yPaiL»aGl»lRl.t'IACiiJ.PLLiiLH£bbAM)WalEKVVELSllHGIRPPi;tGtlREAIEA 56

----ПРАВ >*QGLLPLE"IftCALt LIJ\LHSAAAERYQLEKVVELSRHGIRPP1AGNNEEI IA 56

-----yFPCFVRLfi.sFFLyGLyCLQAHAASADGYVLDKVVQV5RBGVBPPTO—TPKLAK 53

---Ц. STLIbVAGtALGVCLALPSVAAPLDTTGLRLDKWLVMRHGIRPPTJD—TAKLQR 55

VTPDAWPTIIPVKLGWLTPRGGELIAYLGHYQRQRLVADGLLTKKGÄPQPGQVAIISDVDE 113 VTPDQWPQWDVPLGWLTPRGGELVSELGQYQRLWFTSKGLLNNQTBPSPGQVAVIADTDQ 113 VTPHAWPE»PVKLGYITPRGEHLV5LMGGFYRQKF(!Q1GILSKGr|pTANDVYVWADVD<! 110 VTPNTWPEWPVEXGYIT^RGEHIASLMGGFYRQKFQQLGILSKDrIpTANDVYVWADVDQ 110 vtpdkwpowpvkagyltprgaelvtlmggfygdyfrsi.gllaag-|paeggvyaoadidq 118 vipdkwpmpvkagyltprgaelvtlmggfygdyfrsogilsag-Ipvdgsvyaoadvdq 118

STPKKWPEWDVPGGQLTTKGGVLEVYMGHYMREWLAEQGMVKSGEHPPPDTVYAYANSLQ 115 STPKQWPEWEVPGGQLTTKGGVLEVYMGHYHREWLAQQGMVKTGESPAADSVYAYANSLQ 115

YSLHPWPHFGVPAGKLTANGAOLERLFGDYYRAHYTALGLUIGDGillQA---YYWANP.TQ 115

ASARPWPRFEVPAGHLTARGETLVAFMGDYYRRHYAAQGLLKPGDBASV---YAWAHVTQ Ю 5

atgrpwtewtthdgeltghgyaawskgreegqhyrolgiloag-Iptaes IYVRASPLQ 115 ATGRPWTEWTTHDGELTGHGYAAWNKGREEGQHYRQLGLLQAG-||PTAESI YVRASPLQ 115

Ypestis Yentero EcoliAgp

Xaxonopodis

Caulobacter

Kpneumoniae

Rterrigena

Peyringael

Psyringae2

u w u

ECQliAppA

Ypestis Yentero

ШШВ^Ш

Xaxonopodis

Caulobacter

^pneumoniae

Rterrigena

psyringael

Psyringae2

w «

EcolxAp;

Ypestis Yentero EcoliAgp

Xaxonopodis

Caulobacter

Kpneumoniae

Rterrigena

Psyringael

Psyringae2

IADFTGHRQTAFRELERVlllFPQSm, IELYTQRYQSSFRTLEHVLNFSQSET IDQLNQHYRPALALMSSVLNFPKSTY 1AQLNQHYRPALALMSNVLNFPTSAY LDTVSQRYAKPFAQMGDVLHFAASPY LSDLSQRYAKPFAQMGEVLNFAASPY

----KLQITDSYOLLEKIVNYKDSPA

----QLTESYKLLEQMTNYADSPSPS

-QAWNATQSD-----ALDTLEHILLG

-TAWSASHNQ-----EAEOIDALLMO

LAQRRQALAP------TIQLLKQAV'

LAQRRQALEP------TIQLLKVAV-

VAGAQAP.YQD------AQQQLRKVI -

VDAARERFAA—-PLLAMQQLAGtfPTN

LNREKQDES SLTQALPSELKVSADN—VSLTG 228 KTTEKS-TK TLPEALPSELKVTPDN—VSLPG 227 QQHS-ADQT DLAQAMPSKLSIKDNGHKVALDG 226 QQHS-AEOT HFAEVMPSXLSIKDbGHlEVALBG 226 KSLQOQGKT DFAHFAAHEVNVNKEGTKVTLSG 235 KSLQRNGKT DFATFTANEIKVNEEGTKVSLSG 235

KEKQ----dsLVDGKKTFSAKYME—PGVSG 220

KEKKVJSLADAKDTFSADYEKEPGVSGPLKVGN 220 --ACRpjpAQAAPGKLRLTTVPAGLDDAGPLDG 228 -DKGifpPPSAPGKRRVFDAKPGFVDVGELSG 215

----QADKPjPIFDKTWRVEQSKSGKTTEISG 216

----QADKPjgPIFDMTPWQVEQSKSGKTTSISG 216

----NGISAÍAYTDAEPBQIAODDDGRIANVKG 214

-----GFKT|AiSKDQPWAX,KEEKAGVTKGI.SG 220

avslasmltxifllqqaq—gmpepgwgritdshqwntllslhhaqfyli.qrtpevarsr 286 awslsstlteifllqeaq—gmpqvawgritgekewrdllslhnaqfollqrtpevarsr 285 avglsstlaeiflleyaq—gmpdaamgkhseqdwnailtlhnaofdlmsrtpyiakhn 284 AVgLSSTIAEIFLLEHAQ—gmpnaawgkihsbqdwmtlltlhnaqfdlmsrtpyiakhn 284 pla1sítlgzifi.LQNAQ—ampevawqrikgaehwvsllslhnaqfnlmaktpyiarhk 293 plalsstlgeifllqnsq—ampdvamhrj.sgeenwvsllslhhaqfdlmaktpyiarhk 293 plkvgsslvdaftlqyyegfpmdqvahgeiksdqqwkvlsklkngyqdslftspevarnv 280 vgnslvdaftlqyyegfpadqvawgeiktdqqwrvlsklkijgyqdslftstevaqhv 280 paaaasgitbslimgwadgqdfaalgmqgld-eatllrvfaphqaefalrlraptvama 287 peafasgvtisblmawadgrdfaglgwksld-eealtrsfflh(¡aefdlrx.rtpyvartl 274

-lsvmammvetlrlgwsenlplsqlawgkiaqasqitallpliiTenydlsndvlytaqkr 275

-l8vmahmvetlrlg»senlplsqlawgkiaqas0itallplbtehyplsmdvlyta0kr 275 -lstqtnlgbtfrleyseglpldffvafgqgrsaqqvsqltaltkakydfindgpyiasrg 273 PbSVGAAMSÏTFRMaYAEGlPLDQVAFGEGRTAAEVSRlMAlRSGKYALSNHVPÏIAQRG 280

ATPLLDLIMAALTPHPSQK-QAYGVT-LPTSVIiFIAGHDTMLANIiGGAlELN-WTLPG-Q 343 ATPLLDMICTALLTKGTTE-MRYGIK-LPV3LLFIAGHDTWLAHLSGAIDLN-WSLPG-Q 342 GTPLLQTIVSAINS0PSSR-ELPELS-ADHKI1FPAGHDTMIANIAGMFGMS-WALPG-Q 341 GTPLLQTIVSAI1JSQTSPR-ELPELS-AD1ÍKILFLAGHDT11IANIAGMLGLS-WTLPG-Q 341 GTPLLQQIDTALTLQIiDAQGQKLPIS-AQNRVLFLGGHDTMIANXAGMLGAD-WQLPE-Q 351 GTPLLQQIDTAlVbQRDAQGQTLPLS-PQTKlLFLGGHDTÎIIAMIAGMLGAS-WQLPQ-Q 351

AKPLVSYIDKALVTDRTSA----------PKITVLVGBDSKIAS1LTALDFKPYQLHD-Q 330

AKPLVKYIDKTLVTEQAKA----------PKITLLVGHDSNIASLLTALDFKPYQLHD-Q 330

STPLAARLtiATLQQGNDAHAEADAIG-GDARLWVSGHDGTLTLIiAGMFDLH-WQLPGYQ 345

AGHLADRLAATLRDG------AAAIGPVDARLVIIAGHDGTLASLGGLLRME-WTLPGYQ 327

GSVLLNAMLDGVKP----------EANPHVRWLLLVAHDTUIAMVRTLMNFS-WQMGYS 324

GSILLNAMLQGVEE----------GARPDVRWLLLVAHDTNIAMVRTLMNFS-WOLPGYS 324

GSQIMNQISLALKQGTPLTTNDPLGMPPDAPFTLLVAHDTHISYiRTLLGFR-WTIiGDYL 332 ASOibGQILLALQP-------TSVGSPPGSKWLAYVGSDSNIAQIiRTLLGFD-WKIAEYP 332

Psyringael Psynngae2

EGNIPPVGSLQFERYKQVATGRYFLRVAFEAQSLEQIRQLTPLTVEQPPLHADMRGAEGC 392 ENDAAPGGTIVFERWANDRTGAQFVSVAY»'AQSLDQLRNL5----GEPPYQVQYP---GC 386

EcollAgp Eclpaceae

Xaxonopodis Caalobacter Kpneumoniae

EcoliAppA Cfreundit Opioteusl Oproteus2 Ypestis

Yentero

Rterrigena Psyringael Psyrmgae2

EERNAQGMCSLAGFTQIVMEARIPACALHOCK —

EEKNSÇGMCSLKSFSRLIKEIRVPECAVTE-----

DDQTAEGYCPLDTFTRLAKQNELVECQ--------

DDQTAEGYCPLDTFTRLAKQNELAECQ--------

ENNGDDKLCELDTFQKKVAKVIEPACHI-------

ENEGDNKLCQLETFQKKVAOVIEPACHI-------

P-IDADGFCPMDKFDSVLNEAVK------------

P-VDANGFÇPVDKFHAVKNÎÎAAK------------

STATPAYDCPLPQFARIVQAALDPLALDH------

GTATPAFDCRiEOFETVVS.GATRP.DG---------

RQTDVGTLCPFQAAITALGQRIDRPSTPAVAMVLP RQTDVGTLÇPFQAAITAbGQRIDRSSTPAVAMVLP VDTSVGRLCPLA1ALQRLDQNIDR--TALTSYHYP AG—EQLCPLNGFVADMEKRIDRSATEVQHYDNP

436 433 423 428 441 441 413

413 435

414 421 421 428 420

Рис. 4. Множественное выравнивание аминокислотных последовательностей клонированных генов фитаз и их гомологов. На рисунке выделены: остатки цистеина С, остатки активного центра жирным шрифтом и сверху значком U, консервативный мотив RHGVRAP подчеркнут. Сигнальные пептиды выделены серым цветом. Обозначения -названия штаммов и номера последовательностей в ГенБанке:

EcoliAppA - Е. coli CFT073, АЕО16758; Cfreundii - C.freundii B4090, AY390262; Oproteusl -О. proteus B6798, AY378096; Oproteus2 О. proteus B6797, AY425982;

Ypestis - Y. pestis KIM, AEO13783; Yentero - Y. enterocolitica, последовательность не депонирована в ГепБакке, информация предоставлена М. Гельфандом (ГосПИИгенетика); EcoliAgp - Е. coli 0157 Н7 EDL933, АЕ005294; Ccrescentus - Caulobacter crescentus CB15, АЕ005727; Xaxonopodis -Xanthomonas axonopodis pv. citri str. 306, AE011713; Kpneumoniae - Klebsiellapneumoniae, AY091638; Rterrigena - Raoultella terrigena, AJ575300; Psyringael -Pseudomonas syringae, предполагаемая фосфатаза-1, AY156083. Psyringae2 - Pseudomonas syringae pv. syringae B728a, предполагаемая фосфотаза-2, ААВР020004, Ecloaceae -Enterobacter cloaceae ВКПМ В2256 AJ783768.

Последовательности выровненных белков имеют примерно одинаковую длину 412436 аминокислотных остатков. На протяжении всей длины последовательности имеют участки, консервативные в разной степени. У последовательностей PhyA-Cl C.freundii и АррА совпадают все 15 остатков активного центра. Значения удельной активности PhyA-С1 и АррА по отношению к фитату самые высокие - 3000 и 1500 ед/мг белка (описано ниже). У последовательностей PhyA-01, PhyA-02 О. proteus различается только один остаток активного центра (Glu у PhyA-01,2 вместо Ser АррА в 212 положении). Удельная активность PhyA-01 значительно меньше - около 300 ед/мг белка. Однако сродство PhyA-01 к фитату значительно выше, чем к другим фосфорилированным соединениям. У более широкоспецифичных фитаз из P. syringae и К. terrigena значения удельной активности выше - 700 и 400 ед/мг белка [Cho et al., 2003, Greiner et al., 1997]. У этих последовательностей в соответствующем Ser212 положении находится именно этот остаток, у них есть различия в трех других остатках активного центра. Вероятно, остаток Ser212 активного центра оказывает большое влияние на значение удельной активности по отношению к фитату.

Наряду с аминокислотными остатками активного центра консервативными являются цистеиновые остатки. Из восьми цистеиновых остатков шесть абсолютно консервативны для всех выровненных последовательностей (Рис. 4) - это говорит о наличии по крайней

мере трех аналогичных дисульфидных связей у всех ферментов этой группы. Поскольку при низких значениях рН дисульфидные связи не разрушаются, они могут способствовать сохранению пространственной структуры белка и, следовательно, препятствовать денатурации. Так, при очень низких значениях рН (2.0-3.0) внутримолекулярные ионные связи молекул белков разрушаются, и многие растворимые белки денатурируют и выпадают в осадок, в то время как белки фитаз сохраняются в неизмененном виде. Высокая кислотоустойчивость фитаз энтеробактерий может оказаться полезной при использовании в кормопроизводстве, поскольку эти фитазы устойчивы в кислой среде желудка животных.

Для того чтобы нагляднее оценить степень эволюционного родства последовательностей бактериальных фитаз, было построено филогенетическое дерево (Рис. 5). Последовательности белков фитаз образовали две отдельно расположенные ветви. Самая большая ветвь дерева образована последовательностями всех клонированных нами фитаз: С. freundii и О. proteus и Е. coli, и последовательностями предполагаемых фитаз из Y. pestis. и Y. enterocolitica. Две последние кластеризуется на дереве вместе с последовательностями ферментов, функционально являющимися истинными фитазами. Учитывая положение на дереве, а также идентичность оснований активного центра, можно предположить, что белки из Y, pestis и Y. enterocolitica также функционально являются истинными фитазами.

Рис. 5. Филогенетическое дерево последовательностей клонированных генов фитаз и их гомологов. В узлах дерева поставлены значения поддержки. Полоска масштаба отражает замену 1 из 10 аминокислотных остатков. Обозначения последовательностей такие же, как на Рис. 4. Клонированные в нашей работе последовательности выделены стрелками.

Добавление новых последовательностей гомологичных бактериальных фитаз дает возможность более точно вычислить «консенсусную» последовательность для группы бактериальных фитаз. Мы вычислили две консенсусные последовательности Консенсус-С

на основе последовательностей PhyA-Cl С. freundii (Рис. 6), оставив не вычисляемые остатки из фитазы С. freundii (поскольку фитаза именно этой бактерии имеет самую высокую удельную активность, при этом удельная активность консенсуса вероятно получится выше). Для исследования свойств искусственных фитаз нужно синтезировать их гены, что планируется сделать в последующих работах.

mstfixîu)lffsllcgsfsihaeeqngyklekwilsmg\n^aptkftqimqdvtpdqtoewpvklgwltprggelvslmggyyrqwfrs

lgll^gtcptpgqvwiadvüqrtrktgeafiagiapgcgicivhhqkdem<tdplfnpvkagvcsldtaqvkqaveeraggpiaqy

TQRYQSAFRIiI^NVLNFSQSPYCKTTEKSDTKCTIAEALPSEIJ<VTPDNVSLSGALSLSSTLTEIFLLCiWAQ(3ÎPQVAWGKITSEQQ

WRDIiSLHNA2n)LLQRTYYi™«R&TPIiDMIDm

GGELWERWRRTSDOTKWVQVSFVYQTLDQLi^TPLTI£KPMSW^

Рис. 6. Консенсус-последовательность, вычисленная для группы бактериальных фитаз.

5. Экспрессия генов фитаз

Уровень продукции внутриклеточных фитаз у исходных штаммов, обнаруженных в результате скрининга, очень низок - около 0.2-0.3 ед/мг общего белка. Клонирование и последующее секвенирование генов фитаз дает возможность провести экспрессию фитаз со значительным увеличением продукции ферментов для последующего изучения их свойств.

5.1. Экспрессия фитаз в Е. coli BL21 (DE3)

Экспрессия фитаз из трех штаммов бактерий Е. coli W3350, О. proteus B6897 и С. freundii B4090 была проведена по единой схеме для каждой фитазы: кодирующая область гена фитазы с собственным сигнальным пептидом была субклонирована в вектор непосредственно после промотора Т7. Транскрипция фитазы в данной системе индуцируется при помощи лактозы или IPTG, поскольку в данном векторе транскрипция Т7 промотора репрессирована 1ас-оператором. Уровень экспрессии фитаз с использованием в качестве индуктора IPTG оказался ниже, чем с лактозой, приблизительно в 3 раза. Клетки, с накопленной в них фитазой, собирали и разрушали ультразвуком.

Таблица 2. ^ Этапы очистки фитазы PhvA О. proteus и АррА Е. coli

Препарат Этапы Общее Общая Удельная Потери Степень

очистки Количество белка, мг активность образца ед активность (ед/мг белка) белка, % очистки

Е. coli, Лизат 12.9 220 17.1 - 1

АррА Осаждение при рН 2.0 5.4 198 36.7 10 2.1

ВСЖХ 0.23 192 834.8 14 48.8

О. Лизат 15.6 150 9.6 - 1

proteus, г- Осаждение 4.1 135 32.9 10 3.8

PhyA при рН 3.0

ВСЖХ 0.7 126 180 16 22.3

Процедура очистки белков состояла из двух стадий с использованием процедуры закисления грубого клеточного экстракта и гель-фильтрации в режиме ВСЖХ и позволила получить высокоочищенные препараты как АррА Е. coli, так и PhyA-01 (Табл. 2). В очищенных образцах активность ферментов была 180 и 830 для ед/мг белка АррА Е coli и PhyA-01, соответственно (Табл. 2). Последняя цифра примерно в два раза ниже удельной активности (1590 ед/мг белка) фитазы Е. coli из штамма Е coli ATCC 33965 при измерении концентрации белка таким же методом [Gollvan et al., 2000]. Эта разница может быть обусловлена недостаточной полнотой очистки фитаз в нашей работе. В этом случае значение удельной активности PhyA-01, вероятно, также занижено и ее реальное значение пропорционально составляет 350 ед/мг белка, если учитывать, что процедура очистки PhyA-01 также не полная.

Концентрация фитазы из С. freundii была оценена приблизительно, с помощью сравнения интенсивности окраски полос белков фитаз, полученных с использованием SDS-PAGE электрофореза (Рис. 7).

Рис. 7. 8Б8-РЛОЕ образцов фитаз, определение удельной активности. Линия 1, 3 и 5 -неочищенные образцы фитаз РЬуЛ-С1, РЬуЛ-01 и АррА, соответственно. Линии 2, 4, 6 влияние подкисления (при рН 2-3) на образец предыдущей линии.

На гель нанесены образцы фитаз, имеющих одинаковые значения активности фермента. Интенсивность полоски фитазы PhyA-01 примерно в 5 раз выше, чем полоски АррА. Это согласуется с данными, полученными при очистке белков. Аналогично, интенсивность полоски PhyA-Cl примерно в два раза меньше, чем у полоски фитазы АррА. Следовательно, удельная активность фитазы PhyA-Cl составляет около 3000 ед/мг белка.

Свойства очищенных ферментов АррА К coli, PhyA О. proteus и PhyA С. freundii отображены на Рис. 8. Кроме того ферменты проявляли высокую устойчивость к воздействию различных рН. При инкубации в 0.2 М буферных растворах рН 1.5-8.0 и после инкубации в течение 24 часов при 37°С не было обнаружено каких-либо изменений в активности фермента (данные не показаны).

2,0 3,0 4,0 5,0 рн 6,0 7,0 8,0

Рис 8. Свойства фитаз при экспрессии в Е. coli. Зависимость фитазной активности (а) от рН, (б) от температуры, (с) остаточной фитазной активности (по сравнению с необработанной фитазой, активность которой принята за 100%) от рН, при которых проводилась обработка образцов фитаз при температуре 60°С в течение 30 мин.

Фитазы обладают способностью расщеплять не только фитат, но и другие фосфорилированные соединения. Мы измерили скорость высвобождения фосфата с использованием различных субстратов (Табл. 3)

Таблица 3. Субстратная специфичность фитаз энтеробактерий.

Субстрат Удельная активность, % (за 100% принята активность по отношению к фитату )

АррА£. coli PhyA-Ol О. Proteus PhyA-Cl С. freundii PhoAE. cloacea*

Фитат 100 100 100 8

Глюкозо-1 -фосфат 0.3 0.4 0.4 100

Глюкозо-б-фосфат 0.4 2.1 0.5 92

рибозо-5-фосфат 2.4 5.5 0.8 43

фрукгозо-1 -фосфат 1.1 1.5 1.8 82

pNPP 12.3 0.4 2.1 32

*- за 100% принята активность по отношению к глюкозо-1-фосфату

У фитаз из С. freundii, О. proteus и К coli скорость расщепления фитата значительно превосходит скорость расщепления других фосфорилированных соединений. Таким образом, исследуемые ферменты являются истинными фитазами. Специфичность к фитату

у данных бактериальных фитаз выше, а в ряде случаев значительно выше специфичности других известных фитаз грибов и бактерий [Oh et al., 2004].

5.2. Экспрессия фитаз в дрожжах

Экспрессия белков с использованием штаммов Е coli используется в основном в лабораторных условиях. В промышленности более широкое применение находят системы экспрессии белков в дрожжах. Мы провели экспрессию одного и того же белка фитазы АррА Е. coli W335O в трех различных видах дрожжей: S. cerevisiae, P. pastoris и К. lactis. Для секреции ферментов мы использовали сигнальный пептид альфа-амилазы из S. cerevisiae. Сочетание этого лидерного пептида и зрелых частей последовательности фитазы оказлось эффективным во всех системах: ферменты успешно секретировались. Во всех случаях активность белка, остающегося внутри клеток, не превышала 10% от внеклеточной активности (данные не показаны).

Самый высокий уровень экспрессии фитазы (35 ед/мл в культуральной жидкости) был достигнут в дрожжах P. pastoris (Табл. 4).

Таблица 4. Уровень активности фитазы при экспрессии в различных системах, (ед/мл)

Источник фитазы Реципиент

Е. coli* Р. pastoris S. cerevisiaea К. lactis

Е. coli 30 35 15 3

0. proteus 25 5 - -

C.freundii 25 40 - -

Е. cloacae 3 - - -

- активность не определялась

* Значения активности для данного реципиента даны в ед/мг

Несмотря на большую копийность гена в данных системах по сравнению с интегративной системой Р. pastoris, продукция фермента была меньше при использовании качестве хозяина S. ceгevisiae и намного слабее в К. 1асШ (Табл. 4). Свойства рекомбинантных ферментов практически не зависели от выбора реципиента (Рис. 9.)

Рис 9. Свойства фитазы АррА Е. coli, при экспрессии в различных дрожжевых системах. Зависимость фитазной активности (а) от рН, (б) от температуры

Также мы провели экспрессию генов фитаз из С. А-вынёп и О. рго1вш в Р. раь1оп8. с использованием сигнального пептида альфа амилазы из Л еегеутае для секреции ферментов. (Рис. 10)

6,0 7,0 рн

Рис. 10. Свойства рекомбинантных фитаз при экспрессии в Р pastoris. Зависимость фитазной активности (а) от рН, (б) от температуры, (с) остаточной фитазной активности (по сравнению с необработанной фитазой, активность которой принята за 100%) от рН, при которых проводилась обработка образцов фитаз при температуре 60°С в течение 30 мин.

Во всех случаях активность белка, остающегося внутри клеток, не превышала 10% от внеклеточной активности (данные не показаны). При сравнении полученных данных с аналогичными характеристиками рекомбинантных фитаз, синтезированных в К coli (Рис. 8), можно заметить небольшие различия. Например, у фитазы С. freundii при экспрессии в P. pastoris практически отсутствует «яма» на кривой зависимости активности от рН по сравнению с аналогичной кривой при экспрессии в К coli. В целом, различия не существенны и не влияют на промышленную ценность ферментов.

выводы

1. Проведен скрининг представителей 110 видов бактерий, выделенных из почвы и компоста, с целью выявления фитазной активности. Секретируемые фитазы были обнаружены у бацилл, а внутриклеточные у энтеробактерий и бактерий рода Pseudomonas. Фитазы энтеробактерий по своим свойствам оказались перспективными для использования в кормопроизводстве. Обнаруженные фитазы не только не уступают известным фитазам по характеристикам, но и превосходят их по такому показателю, как удельная активность ферментов.

2. Гены фитаз из нескольких штаммов энтеробактерий О. proteus, С. fremdii и Е. cloaceae были клонированы и секвенированы. Ближайшими

гомологами этих фитаз является фитаза АррА из Е. coli и несколько других известных бактериальных фитаз. На основе анализа гомологичных аминокислотных последовательностей бактериальных фитаз была вычислена «консенсусная» последовательность.

3. В хромосоме нескольких независимых штаммов О. proteus обнаружен ген phyX, кодирующий белок, который отличается от АррА только С-концевым фрагментом и не обладает фитазной активностью. На основе функционального анализа PhyX и АррА сделан вывод о существенности С-концевого фрагмента АррА для фитазной активности и о возможной дополнительной ферментативной активности АррА, сохраняющейся после замены С-концевого фрагмента.

4. Осуществлена экспрессия генов фитаз аррА Е. coli, phyA О. proteus и phyA С. freundii в бактериальных и дрожжевых системах. Свойства рекомбинантых ферментов остались практически неизменными по сравнению с нативными ферментами, однако уровни продукции рекомбинантных белков были различными. Наибольший уровень продукции достигнут при экспрессии гена фитазы phyA С. freundii в дрожжах P. pastoris. Таким образом, созданные штаммы-продуценты перспективны для получения препаратов фитаз, улучшающих качество кормов.

Результаты диссертации изложены в следующих публикациях:

1. Зинин Н.В., Самсонов Вик. В,. Самсонов Вал .В,. Борщевская Л.Н,. Каниковская А.А,. Гудима М.Ю. и Синеокий СП. Фитазная активность некоторых групп бактерий. Биотехнология, 2003, №2, стр. 3-10.

2. Зинин Н.В. и Синеокий СП. 2-ой Московский Международный Конгресс Материалы конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». 2003.10-14 Ноября. Москва. "Максима". Часть 1. стр. 294.

3. Zinin NV, Serkina AV, Gelfand MS, Shevelev AB, Sineoky SP. Gene cloning, expression and characterization of novel phytase from Obesumbacterium proteus. FEMS Microbiol Lett. 2004 Jul 15. 236 (2) pp. 283-90.

Принято к исполнению 14/09/2004 Исполнено 16/09/2004

Заказ № 317 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 747-64-70 (095)318-40-68 www autoreferat.ru

w i ^ з 4 а

РНБ Русский фонд

2QQ5-4 1252Q

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зинин, Николай Владимирович

L ВВЕДЕНИЕ

П. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Значение фитаз для кормопроизводства.

2. Источники фитаз.

2.1. Скрининг фитаз у микроорганизмов.

2.2. Фитазы грибного происхождения.

2.2.1. Фитаза PhyA Asprergillus niger.

2.2.2. Фитазы из A. terreus и базидиомицетов.

2.2.3. Термостабильная фитаза Asprergillus fumigatus.

2.2.4. Дрожжевые фитазы.

2.3. Бактериальные фитазы.

2.3.1. Фитаза АррА Е. coli.

2.3.2. Фитазы бактерий родов Klebsiella и Citrobacter.

2.3.3. Фитазы бацилл.

3. Филогенетическая классификация фитаз.

4. Различные механизмы действия фитаз из разных белковых семейств.

4.1. Фитазы семейства кислых гистидиновых фосфатаз.

4.2. Бациллярные щелочные фитазы.

4.3. Фитазы семейства пурпурных кислых фосфатаз.

5. Биохимические свойства фитаз и их промышленно важные характеристики.

6. Изменение свойств белков при помощи методов белковой инженерии.

6.1. Принципы рационального конструирования белков.

6.2. Методы «направленной эволюции».

6.3. Концепция «консенсусной» последовательности.

6.4. Изменение рНпрофиля белков.

7. Экспрессия фитаз в различных системах.

7.1. Экспрессия фитаз в бактериях.

7.2. Экспрессия фитаз в дрожжах.

7.3. Экспрессия фитаз в грибах.

OL МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Среды и условия культивирования.

2. Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды.

3. Приготовление образцов фитаз.

4. Свойства ферментов.

5. Конструирование штаммов К coli с делецией аррА.

6. Гибридизация ДНК с радиоактивным зондом и изоляция фрагмента ДНК, содержащего ген phyX, гомологичный гену аррА.

7. Отбор клонов, имеющих внутриклеточную фитазную активность.

8. Конструирование геномной библиотека и отбор клонов с искомой вставкой.

9. Конструирование плазмид для экспрессии генов фитаз.

10. Определение N-концевой аминокислотной последовательности белка.

11. Анализ аминокислотных последовательностей.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Поиск новых фитаз, продуцируемых бактериями.

1.1. Поиск секретируемых фитаз бактерий.

1.1.1. Поиск фитаз у природных изолятов.

1.1.2. Поиск фитаз у коллекционных штаммов.

1.2. Поиск внутриклеточных фитаз у грамотрицательных бактерий.

1.2.1. Поиск внутриклеточных фитаз у коллекционных штаммов.

1.2.2. Исследование фитаз у представителей природных популяций Е. coli.

2. Клонирование гена phyX, имеющего сходство с аррА Е. сои, но кодирующего фермент с неизвестной функцией.

2.1. Поиск генов, гомологичных аррА у бактерий синтезирующих внутриклеточные фитазы.

2.1.1. Поиск гомологичных генов с использованием ПЦР.

2.1.2. Поиск гомологичных генов с использованием метода гибридизации.

2.1.3. Рестрию(ионного анализ фрагмента хромосомы О. proteus В5477, содержащих phyX.

2.1.4. Исследование других штаммов О. proteus на наличие гена phyX.

2.3. Изоляция и секвенирование фрагмента из хромосомы О. proteus, содержащего ген phyX.

2.3.1 Создание мутанта с полной делецией в хромосоме гена аррА для отбора гомологичных аррА генов.

2.3.2. Изоляция гена phyX с неизвестной функцией, гомологичного аррА Е. coli, из хромосомы О. proteus.

2.3.3. Последовательность фрагмента, содержащего ген phyX.

2.3.4. Экспрессия гена ркуХъ Е. coli.

2.3.5. Замена концевой короткой С-концевой части PhyX приводит к воссозданию фитазной активности.

3. Клонирование генов, кодирующих внутриклеточные фитазы бактерий.

3.1. Изоляция, характеризация и экспрессия гена из бактерии Obesumbacterium proteus.

3.1.1. Отбор клонов с фитазной активностью из геномной библиотеки.

3.1.2. Анализ последовательности клонированного фрагмента.

3.1.3. Изоляция генов фитаз из других штаммов О. proteus.

3.2. Изоляция гена фитазы из бактерии Citrobacter freundii.

3.2.1. Отбор клонов с фитазной активностью из геномной библиотеки.

3.2.2. Анализ последовательности клонированного фрагмента.

3.2.3. Изоляция гена фитазы из штамма С. freundii В3638.

3.3. Изоляция гена фитазы из бактерии К cloaceae.

3.3.1. Отбор клонов с фитазной активностью из геномной библиотеки.

4. Анализ аминокислотных последовательностей клонированных генов.

4.1. Выравнивание последовательностей бежов-гомологов.

4.1.1. Консервативность аминокислотных остатков активного центра.

4.1.2. Консервативность дисульфидных связей.

4.1.3. Сигнальные пептиды.

4.1.4. Вторичная структура.

4.1.5. Филогенетическое дерево.

4.2. Вычисление «консенсусных» последовательностей на основе имеющихся последовательностей фитаз.

5. Экспрессия генов фитаз.

5.1. Экспресиия фитаз в Е. coli BL21 (DE3).

5.1.1. Описание системы.

5.1.2. Определение удельной активности ферментов.

5.1.3.Изучение свойств ферментов.

5.1.4. Субстратная специфичность ферментов.

5.2. Экспрессия фитаз в дрожжах.

5.2.1. Экспрессия АррА Е. coli в различных дрожжевых системах.

5.2.2. Экспрессия фитаз С. freundii и О. proteus в P. pastoris.

5.2.3. Свойства рекомбинантных фитаз из P. pastoris.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск, клонирование и экспрессия генов бактериальных фитаз"

Актуальность темы

Фитат (мио-инозитол гексакисфосфат) является преобладающей формой накопления фосфора в зерне, семенах масличных и бобовых [133]. Животные с однокамерным желудком не способны усваивать фитатный фосфор из-за отсутствия или низкого уровня фитазной активности в гастроэнтеральном тракте животных [14]. Кроме того, фитаты уменьшают доступность белков и микроэлементов в кормах. Не усвоенные фитаты, попадая в почву и водоемы, вызывают загрязнение окружающей среды [66].

Для практического использования препараты фитаз должны быть устойчивы к высушиванию и действию высоких температур в процессе приготовления комбикормов, а также приспособлены к действию в среде желудка животных (наличие активности при низких значениях рН и устойчивость к протеолитическим ферментам) [66]. Все известные фитазы имеют разные технологические характеристики, причем у каждого фермента есть свои преимущества и недостатки. В настоящее время требуются новые, более совершенные фитазы.

2000 ед/мг белка - [51]. Недостатком бактериальных фитаз является низкая термостабильность. Методы белковой инженерии позволяют повысить термостабильности белков [48, 86]. Для реализации этих методов требуется изучение ряда гомологичных аминокислотных последовательностей. Эффективность методов возрастает при увеличении количества изученных гомологичных последовательностей, поэтому поиск новых последовательностей является актуальной задачей. Наибольший интерес для данного подхода представляют фитазы, имеющие гомологию к фитазе АррА Е. coli, поэтому в данной работе был предпринят поиск именно таких последовательностей.

Цели и задачи работы

Данная работа посвящена поиску и изучению новых бактериальных фитаз, перспективных для применения в животноводстве.

В связи с этим ставились следующие задачи:

1. Поиск и изучение бактериальных фитаз, имеющих промышленно ценные свойства.

2. Клонирование генов фитаз, имеющих наиболее перспективные технологические характеристики.

4. Сверхэкспрессия клонированных генов фитаз в бактериальных и дрожжевых системах и изучение их свойств.

Научная новизна

Впервые проведен скрининг продуцентов внутриклеточных фитаз среди грамотрицательных бактерий, выделенных из почвы и компоста. Внутриклеточные фитазы обнаружены у представителей нескольких видов из семейства Enterobacteriaceae и рода Pseudomonas. Также изучены внутриклеточные фитазы у 200 различных штаммов Е. coli, выделенных из разных источников. Проведено сравнение свойств новых фитаз с уже известными фитазами. Фитаза из Citrobacter freundii, обнаруженная в ходе проведения данной работы, имеет более высокую удельную активность по сравнению с фитазами, известными в литературе.

Определено, что фитазы из Obesumbacterium proteus и С. freundii обладают высоким сродством к фитату, в то время как первоначально описанная фитаза из Enterobacter cloaceae является глюкозо-1-фосфатазой. Кроме того, в хромосоме О. proteus обнаружен ген phyX, нуклеотидная последовательность которого гомологична последовательности гена аррА Е. coli. Ген phyX кодирует белок, функция которого неизвестна. Определено, что отсутствие фитазной активности у белка PhyX связано со строением С-концевой части белка. При замене короткой С-концевой части PhyX на С-концевую часть АррА у PhyX появляется фитазная активность.

Практическая значимость

Фитазы используются в животноводстве в качестве ферментой добавки, улучшающей качество кормов. Предпочтение отдается фитазам, имеющим лучшие характеристики. Фитазы, обнаруженные в данной работе, не только не уступают по своим характеристикам уже известным фитазам, но и превосходят их по таким показателям, как, например, удельная активность фермента.

Аминокислотные последовательности фитаз, обнаруженных в данной работе, составляют единую группу с фитазой Е. coli. Расширение арсенала бактериальных фитаз, гомологичных между собой, дает возможность создания на их базе более совершенных ферментов при помощи методов белковой инженерии, таких как «DNA shuffling» [157], метода «консенсусной последовательности» [86], а также сайт-направленного мутагенеза [29].

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Зинин, Николай Владимирович

VI. выводы

2. Гены фитаз из нескольких штаммов энтеробактерий О. proteus, С. freundii и Е. cloaceae были клонированы и секвенированы. Ближайшими гомологами этих фитаз является фитаза АррА из Е. coli и несколько других известных бактериальных фитаз. На основе анализа гомологичных аминокислотных последовательностей бактериальных фитаз была вычислена «консенсусная» последовательность.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведен поиск внутриклеточных и секретируемых фитаз у коллекционных штаммов и природных изолятов из почвы. Фитазную активность измеряли при разных значениях рН от 2.0 до 8.0. Проведен скрининг представителей 40 видов коллекционных штаммов и 200 природных изолятов Е. coli на наличие внутриклеточных фитаз в образцах клеток, разрушенных ультразвуком. Поиск секретируемых фитаз проводили у представителей 60 видов коллекционных штаммов и 1400 изолятов из почвы.

Внутриклеточные фитазы обнаружены у представителей трех видов энтеробактерий: О. proteus, С. freundii и Е. cloaceae, а также у двух видов рода Pseudomonas: P. aeruginosa и P. aurantiaca. Значение рН-оптимума у фитаз энтеробактерий было около 4.0-5.0, а у фитаз бактерий рода Pseudomonas около 6.0-7.0. У всех 200 образцов Е. coli обнаружено наличие фитазной активности, однако имелись различия в уровне фитазной активности (в несколько раз) у различных штаммов Е. coli.

Секретируемые фитазы были обнаружены у бактерий разных видов рода Bacillus. Все бациллярные фитазы имели значение рН-оптимума около 6.5-7.5. Количество бактериальных видов, представители которых продуцировали фитазы (как внутриклеточные, так и секретируемые) составляло около 5% от всех штаммов почвенных бактерий, исследованных в данной работе.

Наиболее перспективными для применения в кормопроизводстве являются фитазы, имеющие низкие значения рН-оптимум. Среди всех фитаз, обнаруженных в данной работе при скрининге, этому условию соответствуют только внутриклеточные фитазы энтеробактерий, поэтому мы продолжили изучение этих фитаз и их генов.

У двух штаммов О. proteus мы обнаружили ген (который мы назвали phyX), нуклеотидная последовательность которого гомологична последовательности гена фитазы аррА Е. coli. Этот результат был получен при помощи гибридизации с меченной ДНК гена аррА Е. coli. Мы клонировали и секвенировали фрагмент ДНК из хромосомы О. proteus, содержащий ген phyX. Аминокислотные последовательности PhyX и АррА оказались гомологичны по всей протяженности, за исключением С-концевых участков, длиной 70 и 12 аминокислотных остатков, соответственно. Гомологичные участки последовательностей PhyX и АррА различаются всего 8-ю из 350-ти аминокислотных остатков. Ген аррА Е. coli локализован в составе оперона аррС-аррА, состоящего из трех генов [35]. В хромосоме О. proteus имеется фрагмент (содержащий ген phyX), последовательность которого гомологична серединной части последовательности оперона аррС-аррА (с идентичностью 97%). Начало гена аррС и конец гена аррА в этом фрагменте отсутствуют. Вероятно, этот фрагмент когда-то был перенесен в хромосому О. proteus из хромосомы Е. coli. Наличие данного фрагмента обнаружено у двух различных независимо выделенных штаммах О. proteus. Мы провели экспрессию гена phyX в Е. coli. Оказалось, что фитазная активность у белка PhyX отсутствует. При замене С-концевого участка PhyX на С-концевой участок от АррА у PhyX появлялась фитазная активность. Хотя С-концевая часть PhyX расположена в пространстве в стороне от активного центра, она оказалась важной для каталитической функции фермента. Функция фермента PhyX у организма-хозяина осталась неизвестной. Таким образом, мы выяснили, что фитазная активность культуры О. proteus связана с геном, нуклеотидная последовательность которого не гомологична последовательности гена аррА Е. coli.

Для клонирования генов внутриклеточных фитаз из О. proteus и других энтеробактерий мы разработали метод отбора клонов из геномной библиотеки, содержащих ген фитазы на мультикопийных плазмидах, по фитазной активности (описано в разделе «материалы и методы». С помощью этого метода мы клонировали гены фитаз из представителей штаммов О. proteus, С. freundii и Е. cloaceae.

При поиске гомологов клонированных фитаз в ГенБанке мы нашли несколько аминокислотных последовательностей. Для изучения сходства последовательностей клонированных фитаз и их гомологов было проведено множественное выравнивание и построено филогенетическое дерево. Аминокислотные последовательности имеющие гомологию, продуцируются грам-отрицательными бактериям, причем подавляющие большинство (7 из 10) бактериями семейства Enterobacteriaceae. Ближайшими гомологами фитаз из О. proteus и С. freundii является фитаза аррА Е. coli и предполагаемая фосфатаза из Y. pestis (со значениями идентичности аминокислотных последовательностей около 50-70%). Учитывая высокое сходство аминокислотных последовательностей предполагаемой фосфатазы PhyA из Y. pestis с фитазами АррА Е. coli, PhyA О. proteus и phyA С. freundii мы предположили, что белок PhyA из Y. pestis также является фитазой. Ближайшим гомологом фитазы из Е. cloaceae является фосфатаза Agp из Е. coli (значения идентичности их аминокислотных последовательностей около 90%). Другие последовательности бактериальных фитаз из ГенБанка имеют меньшее сходство с последовательностями фитаз из О. proteus, С. freundii и Е. cloaceae и Y. pestis. Аминокислотные последовательности грибные фитазы семейства кислых гистидиновых фосфатаз не имеют гомологии с последовательностями бактериальных фитазами по всей протяженности, за исключением участков RHGXRXP и HD, содержащих аминокислотные остатки активного центра.

У аминокислотных последовательностей бактериальных фитаз совпадают положения аминокислотных остатков активного центра и остатков цистеина, образующих дисульфидные связи. Высокое сходство наблюдается у элементов вторичных структур фитаз. Возможно, трехмерные структуры белков также схожи. Аминокислотные остатки каталитического сайта активного центра совпадают у всех последовательностей бактериальных фитаз, в то время как некоторые остатки субстрат-связывающего центра различаются. У последовательностей фитаз наблюдается корреляция между составом аминокислотных остатков субстрат-связывающего центра и субстратной специфичностью ферментов. На основе гомологии аминокислотных последовательностей и строения активного центра мы выделили из семейства кислых гистидиновых фосфатаз отдельную группу бактериальных фитаз, в которую не входят последовательности грибных фитаз.

Количество гомологичных аминокислотных последовательностей бактериальных фитаз (с учетом генов новых фитаз, клонированных в данной работе) оказалось достаточным для вычисления последовательности «консенсуса» . По данным работы [90], «консенсусные» ферменты имеют свойства, похожие на свойства своих ближайших гомологов, но при этом имеюь более высокую термостабильность.

Гомология аминокислотных последовательностей свойственна только последовательностям зрелых белков, в то время как сигнальные пептиды не имеют друг с другом никакого сходства даже по длине. Полученные данные о расположении N-концевой части зрелых фитаз являются необходимой предпосылкой для разработки гетерологичных систем экспрессии ферментов, в том числе в дрожжах, поскольку создание таких систем требует точного сочленения гетерологичного лидерного пептида со зрелым белком либо аккуратного удаления всей последовательности лидерного пептида без захвата части зрелого фермента.

Чтобы показать потенциальную возможность создания промышленных продуцентов на базе фитаз, мы провели экспрессию клонированных генов фитаз в бактериальных и дрожжевых системах и изучили свойства рекомбинантных белков. При экспрессии в Е. coli свойства фитаз из О. proteus, С. freundii и Е. coli, такие как рН профиль, субстратная специфичность и термостабильность похожи. Основные различия свойств ферментов связаны с их удельной активностью. Удельная активность фитазы О. proteus и С. freundii была около 300 и 3000 ед/мг, соответственно, в то время как у фитазы Е. coli это величина составляет около 1500 ед/мг [51]. Вообще у других известных фитаз, используемых в промышленности, показатель удельной активности значительно ниже - не более 200 ед/мг. Сродство к фитату по сравнению с другими фосфорилированными соединениями у фитаз Е. coliQ, О. proteus и С. freundii выше в десятки и сотни раз в отличие от всех других известных фитаз, у которых специфичность к фитату значительно меньше 0- Сами энтеробактерии обитают в разных отделов кишечника животных, в которых кислотность среды (рН 7.0-8.0) и рН-оптимум работы фитаз (2.5-5.5) не совпадают, следовательно в условиях обитания энтеробактерий их фитазы не активны. Функция фитаз для самих энтеробактерий остается неизвестной. Тем не менее, активность фитаз именно при низких рН требуется в сельском хозяйстве при добавлении препаратов фитаз в корма животным, у которых в желудке рН обычно колеблется в интервале 2-6 ().

При экспрессии в дрожжевых системах фитазы эффективно секретировались при использовании сигнального петида альфа-амилазы из S. cerevisiae. Свойства рекомбинантых ферментов при экспрессии в различных дрожжах остались неизменными по сравнению с нативными ферментами. В зависимости от выбора реципиента и фитазы мы получили разные уровни продуцируемых ферментов. Наибольший уровень продукции фитаз был достигнут при экспрессии PhyA из С. freundii в дрожжах Р. ф pastoris (40 ед/мл культуральной жидкости).

Таким образом, информация об аминокислотные последовательности новых фитаз может использоваться для изучения механизма работы ферментов и создания более стабильной «консенсусной» фитазы. На основе генов клонированных фитаз созданы продуценты, перспективные для применения в кормопроизводстве.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зинин, Николай Владимирович, Москва

1. Лиссицкая Т.Б., В.Г. Шмелева, Г.С. Вардоян, В.И. Яковлев Скрининг микроорганизмов, продуцирующих фитазы. Микология и Фитопатология. 1999. Т. 33. № 6. С. 402-405.

2. Семенова Л.Э., Е. Накамура, Е.С. Морозова, Л.Н. Лаврова, Ю.П. Винецкий Грибные фитазы из природных и коллекционных образцов. Биотехнология, 1998, №5, С. 1224.

3. Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, and D. J. Lipman. 1990. Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215:403-410.

4. Arnold FH (Guest Ed): Evolutionary protein design. Adv Protein Chem 2001, 55:1-438.

5. Atia FA, Waibel PE, Hermes I, Carlson CW, Walser MM. Effect of dietary phosphorus, calcium, and phytase on performance of growing turkeys. Poult Sci. 2000 Feb;79(2):231-9.

6. Atlung T, Brondsted L. Role of the transcriptional activator AppY in regulation of the сух аррА operon of Escherichia coli by anaerobiosis, phosphate starvation, and growth phase. J Bacterid. 1994 Sep;176(17):5414-22.

7. Augspurger N1, Webel DM, Lei XG, Baker DH. Efficacy of an E. coli phytase expressed in yeast for releasing phytate-bound phosphorus in young chicks and pigs. J Anim Sci. 2003 Feb;81(2):474-83.

8. Bae HD, Yanke LJ, Cheng KJ, Selinger LB. A novel staining method for detecting phytase activity. J Microbiol Methods. 1999 Dec;39(l): 17-22.

9. Barrientos L, Scott JJ, Murthy PP. Specificity of hydrolysis of phytic acid by alkaline phytase from lily pollen. Plant PhysioL 1994 Dec; 106(4): 1489-95.

10. Bei XL, Chen Z, Yang L, Liao L, Wang XZ, Jiang ZY. Overexpression of artificial synthetic gene of Aspergillus niger NRRL3135 phytase in Pichia pastoris. Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. 2001 May;17(3):254-8. Chinese.

11. Berka RM, Rey MW, Brown KM, Byun T, Klotz AV. Molecular characterization and expression of a phytase gene from the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus. Appl Environ Microbiol. 1998 Nov;64(ll):4423-7.

12. Biswas BB, Ghosh В, Majumder AL. myo-Inositol polyphosphates and their role in cellular metabolism. A proposed cycle involving glucose-6-phosphate and myo-inositol phosphates. Subcell Biochem. 1984;10:237-80. Review.

13. Bitar, K., and J. G. Reinhold. 1972. Phytase and alkaline phosphatase activities in intestinal mucosae of rat, chicken, calf, and maa Biochim. Biophys. Acta 268:442-452.

14. Bogar B, Szakacs G, Linden JC, Pandey A, Tengerdy RP. Optimization of phytase production by solid substrate fermentation. J Ind Microbiol Biotechnol. 2003 Mar,30(3): 183-9. Epub 2003 Feb 27.

15. Bogar B, Szakacs G, Pandey A, Abdulhameed S, Linden JC, Tengerdy RP. Production of phytase by Mucor racemosus in solid-state fermentation. Biotechnol Prog. 2003 Mar-Apr; 19(2):312-9.

16. Boling-Frankenbach SD, Peter CM, Douglas MW, Snow JL, Parsons CM, Baker DH. Efficacy of phytase for increasing protein efficiency ratio values of feed ingredients. Poult ScL 2001 Nov;80(ll): 1578-84.

17. Bradford, M. M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein binding. Anal. Biochem. 72:248-254.

18. Casey A, Walsh G. Purification and characterization of extracellular phytase from Aspergillus niger ATCC 9142. Bioresour Technol. 2003 Jan;86(2): 183-8.

19. Chatterjee S, Sankaranarayanan R, Sonti RV. PhyA, a secreted protein of Xanthomonas oryzae pv. oryzae, is required for optimum virulence and growth on phytic acid as a sole phosphate source. MolPlant Microbe Interact. 2003 Nov;16(ll):973-82.

20. Cho JS, Lee CW, Kang SH, Lee JC, Bok JD, Moon YS, Lee HG, Kim SC, Choi YJ. Purification and characterization of a phytase from Pseudomonas syringae MOK1. Curr Microbiol. 2003 Oct;47(4):290-4.

21. Choi YM, Suh HJ, Kim JM. Purification and properties of extracellular phytase from Bacillus sp. KHU-10. J Protein Chem. 2001 May;20(4):287-92.

22. Coco WM, Levinson WE, Crist MJ, Hektor HJ, Darzins A, Pienkos PT,. Squires CH, Monticello DJ: DNA shuffling method for generating highly recombined genes and evolved enzymes. Nat Biotechnol 2001,19:354-359.

23. Cooper JR, Go wing HS. A method for estimating phosphate in the presence of phytate and its application to the determination of phytase. Anal Biochem. 1983 Jul 15;132(2):285-7.

24. Cottrill MA, Golovan SP, Phillips JP, Forsberg CW. Inositol phosphatase activity of the Escherichia coli agp-encoded acid glucose-1-phosphatase. Can J Microbiol. 2002 Sep;48(9):801-9.

25. Cromwell GL, Coffey RD, Monegue HJ, Randolph JH. Efficacy of low-activity, microbial phytase in improving the bioavailability of phosphorus in corn-soybean meal diets for pigs. J Anim Sci. 1995 Feb;73(2):449-56.

26. Dalboge H, Borchert TV (Guest Eds): Protein engineering of enzymes. Biochim Biophys Acta 2000, 1543:203-455.30. van Dijck PWM Chymosin and phytase, made by genetic engeneering. 1999. J. Biotechnol. 67.77-80.

27. D'Silva CG, Bae HD, Yanke LJ, Cheng KJ, Selinger LB. Localization of phytase in Selenomonas ruminantium and Mitsuokella multiacidus by transmission electron microscopy. Can J Microbiol. 2000 Apr;46(4):391-5.

28. Dassa J, Marck C, Boquet PL. The complete nucleotide sequence of the Escherichia coli gene appA reveals significant homology between pH 2.5 acid phosphatase and glucose-1-phosphatase. J Bacteriol. 1990 Sep; 172(9):5497-500.

29. Dassa E, Boquet PL. Identification of the gene appA for the acid phosphatase (pH optimum 2.5) of Escherichia coll Mol Gen Genet. 1985;200(l):68-73.

30. Dassa E, Cahu M, Desjoyaux-Cherel B, Boquet PL. The acid phosphatase with optimum pH of 2.5 of Escherichia coli. Physiological and Biochemical study. J Biol Chem. 1982 Jun 25;257(12):6669-76.

31. Dassa E, Tetu C, Boquet PL. Identification of the acid phosphatase (optimum pH 2.5) of Escherichia coll FEBS Lett. 1980 May 5;113(2):275-8.

32. Dvorakova J, Kopecky J, Havlicek V, Kren V. Formation of myo-inositol phosphates by Aspergillus niger 3-phytase. Folia Microbiol (Praha). 2000;45(2): 128-32.

33. Dvorakova J, Volfova O, Kopecky J. Characterization of phytase produced by Aspergillus niger. Folia Microbiol (Praha). 1997;42(4):349-52.

34. Dvorakova J. Phytase: sources, preparation and exploitation. Folia Microbiol (Praha). 1998;43(4):323-38.

35. Ehrlich КС, Montalbano BG, Mullaney EJ, Dischinger HC Jr, Ullah AH. An acid phosphatase from Aspergillus ficuum has homology to Penicillium chrysogenum PhoA. Biochem Biophys Res Commun. 1994 Oct 14;204(l):63-8.

36. Ehrlich КС, Montalbano BG, Mullaney EJ, Dischinger HC Jr, Ullah AH. Identification and cloning of a second phytase gene (phyB) from Aspergillus niger (ficuum). Biochem Biophys Res Commun. 1993 Aug 31;195(l):53-7.

37. Engelen AJ, van der Heeft FC, Randsdorp PH, Smit EL. Simple and rapid determination of phytase activity. J AOAC Int. 1994 May-Jun;77(3):760-4.

38. Engelen AJ, van der Heeft FC, Randsdorp PH, Somers WA, Schaefer J, van der Vat BJ. Determination of phytase activity in feed by a colorimetric enzymatic method: collaborative interlaboratory study. J AOAC Int. 2001 May-Jun;84(3):629-33.

39. Felsestein, J. 1989. PHYLIP: phylogeny inference package (version 3.6) Cladistics 5:164166.

40. Fersht A Enzyme structure and mechanizm. 1985, 2-nd ed. W.H. Freeman and Company. N.Y.

41. Fiske, С. M., and SubbaRow, Y. T. 1925. The colometric determination of phosphorus. J. Biol. Chem. 66:375-400.

42. Ghareib M. Biosynthesis, purification and some properties of extracellular phytase from Aspergillus carneus. Acta Microbiol Hung. 1990;37(2): 159-64.

43. Gibson DM, Ullah AH. Purification and characterization of phytase from cotyledons of germinating soybean seeds. Arch Biochem Biophys. 1988 Feb 1;260(2):503-13.

44. Golovan S, Wang G, Zhang J, Forsberg CW. Characterization and overproduction of the Escherichia coli appA encoded bifunctional enzyme that exhibits both phytase and acid phosphatase activities. Can J Microbiol. 2000 Jan;46(l):59-71.

45. Van Gorcom, Robert F. M., Van Hartingsveldt, Willem, Van Paridon, Petrus A., Veenstra; Annemarie E., Rudolf G. M., Gerardus С. M. Cloning and expression of phytase from aspergillus. United States Patent 5,436,156. 1995, July.

46. Gordon RW, Roland DA Sr. Influence of supplemental phytase on calcium and phosphorus utilization in laying hens. Poult Sci. 1998 Feb;77(2):290-4.

47. Greaves MP, Anderson G, Webley DM. The hydrolysis of inositol phosphates by Aerobacter aerogenes. Biochim Biophys Acta. 1967 Mar 15;132(2):412-8.

48. Greiner R, Carlsson N, Alminger ML. Stereospecificity of myo-inositol hexakisphosphate dephosphorylation by a phytate-degrading enzyme of Escherichia coli. J Biotechnol. 2001 Nov 17;84(l):53-62.

49. Greiner R, Farouk A, Alminger ML, Carlsson NG. The pathway of dephosphorylation of myo-inositol hexakisphosphate by phytate-degrading enzymes of different Bacillus spp. Can J Microbiol. 2002 Nov;48(ll):986-94.

50. Greiner R, Haller E, Konietzny U, Jany KD. Purification and characterization of a phytase from Klebsiella terrigena. Arch Biochem Biophys. 1997 May 15;341(2):201-6.

51. Greiner R, Konietzny U, Jany KD. Purification and characterization of two phytases from Escherichia coli. Arch Biochem Biophys. 1993 May 15;303(1):107-13.

52. Greiner R, Muzquiz M, Burbano C, Cuadrado C, Pedrosa MM, Goyoaga C. Purification and characterization of a phytate-degrading enzyme from germinated faba beans (Vicia faba Var. Alameda). J Agric Food Chem. 2001 May;49(5):2234-40.

53. Greiner R. Purification and characterization of three phytases from germinated lupine seeds (Lupinus albus var. amiga). J Agric Food Chem. 2002 Nov 6;50(23):6858-64.

54. Ha NC, Kim YO, Oh TK, Oh ВН. Preliminary X-ray crystallographic analysis of a novel phytase from a Bacillus amyloliquefaciens strain. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.1999 Mar;55 ( Pt 3):691-3.

55. Ha NC, Oh ВС, Shin S, Kim HJ, Oh TK, Kim YO, Choi KY, Oh ВН. Crystal structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states. Nat Struct Biol.2000 Feb;7(2): 147-53.

56. Han Y, Lei XG. Role of glycosylation in the functional expression of an Aspergillus niger phytase (phyA) in Pichia pastoris. Arch Biochem Biophys. 1999 Apr l;364(l):83-90.

57. Han Y, Wilson DB, Lei XG. Expression of an Aspergillus niger phytase gene (phyA) in Saccharomyces cerevisiae. Appl Environ Microbiol. 1999 May;65(5): 1915-8.

58. Haney PJ, Badger JH, Buldak GL, Reich CI, Woese CR, Olsen GJ: Thermal adaptation analyzed by comparison of protein sequences from mesophilic and extremely thermophilic Methanococcus species. Proc Natl Acad Sci USA 1999,96:3578-3583.

59. Harland, B.F., and E. R. Morris. 1995 Phytate: A good or bad food component? Nutr. Res. 15:73-754.

60. Hatzack F, Rasmussen SK. High-performance thin-layer chromatography method for inositol phosphate analysis. J Chromatogr В Biomed Sci Appl. 1999 Dec 24;736(1-2):221-9.

61. He Z, Griffin TS, Honeycutt CW. Enzymatic hydrolysis of organic phosphorus in swine manure and soil. J Environ Qual. 2004 Jan-Feb;33(l):367-72.

62. Hegeman CE, Grabau EA. A novel phytase with sequence similarity to purple acid phosphatases is expressed in cotyledons of germinating soybean seedlings. Plant Physiol. 2001 Aug; 126(4): 1598-608.

63. Igbasan FA, Manner K, Miksch G, Borriss R, Farouk A, Simon O. Comparative studies on the in vitro properties of phytases from various microbial origins. Arch Tierernahr. 2000;53(4):353-73.

64. Jermutus L, Tessier M, Pasamontes L, van Loon AP, Lehmann M. Structure-based chimeric enzymes as an alternative to directed enzyme evolution: phytase as a test case. J Biotechnol. 2001 Jan 23;85(l):15-24.

65. Jia Z, Golovan S, Ye Q, Forsberg CW. Purification, crystallization and preliminary X-ray analysis of the Escherichia coli phytase. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1998 Jul 1;54 ( Pt 4):647-9.

66. Johnson K, Barrientos LG, Le L, Murthy PP. Application of two-dimensional total correlation spectroscopy for structure determination of individual inositol phosphates in a mixture. Anal Biochem. 1995 Nov 1;231(2):421-31.

67. Jongbloed AW, Lenis NP, Mroz Z. Impact of nutrition on reduction of environmental pollution by pigs: an overview of recent research. Vet Q. 1997 Sep; 19(3): 130-4.

68. Kerovuo J, Lauraeus M, Nurminen P, Kalkkinen N, Apajalahti J. Isolation, characterization, molecular gene cloning, and sequencing of a novel phytase from Bacillus subtilis. Appl Environ Microbiol 1998 Jun;64(6):2079-85.

69. Kerovuo J, Rouvinen J, Hatzack F. Analysis of myo-inositol hexakisphosphate hydrolysis by Bacillus phytase: indication of a novel reaction mechanism. Biochem J. 2000 Dec 15;352 Pt 3:623-8.

70. Kerovuo J, Tynkkynen S. Expression of Bacillus subtilis phytase in LactoBacillus plant arum 755. Lett Appl Microbiol. 2000 Apr;30(4):325-9.

71. Kikuchi M, Ohnishi K, Harayama S: Novel family shuffling methods for the in vitro evolution of enzymes. Gene 1999, 236:159-167.

72. Kim HW, Kim YO, Lee JH, Kim KK, Kim YJ. Isolation and characterization of a phytase with improved properties from Citrobacter braakii. Biotechnol Lett. 2003 Aug;25(15):1231-4.

73. Kim YO, Lee JK, Kim HK, Yu JH, Oh TK. Cloning of the thermostable phytase gene (phy) from Bacillus sp. DS11 and its overexpression in Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett. 1998 May 1;162(1):185-91.

74. Kimura, M. 1980. A simple method for estimating evolutionary rates of base substitution through comparative studies of nucleotide sequence. J. Mol. Biol. 16:111-120.

75. Kostrewa D, Gruninger-Leitch F, D'Arcy A, Broger C, Mitchell D, van Loon AP. Crystal structure of phytase from Aspergillus ficuum at 2.5 A resolution. Nat Struct Biol. 1997 Mar;4(3): 185-90.

76. Kumar S, Tsai CJ, Nussinov R: Factors enhancing protein thermostability. Protein Eng 2000,13:179-191.

77. Laboure AM, Gagnon J, Lescure AM. Purification and characterization of a phytase (myo-inositol-hexakisphosphate phosphohydrolase) accumulated in maize (Zea mays) seedlings during germination. Biochem J. 1993 Oct 15;295 (Pt 2):413-9.

78. Lambrechts, U. К., H. Boze, G. Moulin, and P. Galzy. 1992. Utilization of phytate by some yeast. Biotechnol. Lett. 14:64-66.

79. Lan GQ, Abdullah N, Jalaludin S, Ho YW. Optimization of carbon and nitrogen sources for phytase production by Mitsuokella jalaludinii, a new rumen bacterial species. Lett Appl Microbiol. 2002;35(2): 157-61.

80. Lehmann M, Kostrewa D, Wyss M, Brugger R, D'Arcy A, Pasamontes L, van Loon AP. From DNA sequence to improved functionality: using protein sequence comparisons to rapidly design a thermostable consensus phytase. Protein Eng. 2000 Jan;13(l):49-57.

81. Lehmann M, Loch C, Middendorf A, Studer D, Lassen SF, Pasamontes L, van Loon AP, Wyss M. The consensus concept for thermostability engineering of proteins: further proof of concept. Protein Eng. 2002 May; 15(5):403-11.

82. Lehmann M, Lopez-Ulibarri R, Loch C, Viarouge C, Wyss M, van Loon AP. Exchanging the active site between phytases for altering the functional properties of the enzyme. Protein Sci. 2000 Oct;9( 10): 1866-72.

83. Lehmann M, Pasamontes L, Lassen SF, Wyss M. The consensus concept for thermostability engineering of proteins. Biochim Biophys Acta. 2000 Dec 29;1543(2):408-415.

84. Lei X, Ku PK, Miller ER, Ullrey DE, Yokoyama MT. Supplemental microbial phytase improves bioavailability of dietary zinc to weanling pigs. J Nutr. 1993 Jun;123(6):l 117-23.

85. Lei XG, Porres JM. Phytase enzymology, applications, and biotechnology. Biotechnol Lett. 2003 Nov;25(21): 1787-94.

86. Lei XG, Stahl CH. Biotechnological development of effective phytases for mineral nutrition and environmental protectioa Appl Microbiol Biotechnol. 2001 Nov;57(4):474-81.

87. Lim D, Golovan S, Forsberg CW, Jia Z. Crystal structures of Escherichia coli phytase and its complex with phytate. Nat Struct Biol. 2000 Feb;7(2):108-13.

88. Lowry, О. H., N. J. Rosenbrough, A. L. Farr, and R. J. Randall. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193:265-275.

89. Malakauskas SM, Mayo SL: Design, structure and stability of a hyperthermophilic protein variant. Nat Struct Biol 1998,5:470-475.

90. Martin JA, Murphy RA, Power RF. Cloning and expression of fungal phytases in genetically modified strains of Aspergillus awamori. J Ind Microbiol Biotechnol. 2003 Sep;30(9):568-76. Epub 2003 Aug 28.

91. Maugenest S, Martinez I, Lescure AM. Cloning and characterization of a cDNA encoding a maize seedling phytase. Biochem J. 1997 Mar 1;322 (Pt 2):511-7.

92. Miksch G, Kleist S, Friehs K, Flaschel E. Overexpression of the phytase from Escherichia coli and its extracellular production in bioreactors. Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Sep;59(6):685-94. Epub 2002 Jul 17.

93. Miller, J.H. 1972 Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y

94. Mroz Z, Jongbloed AW, Kemme PA. Apparent digestibility and retention of nutrients bound to phytate complexes as influenced by microbial phytase and feeding regimen in pigs. J Anim Sci. 1994 Jan;72(l): 126-32.

95. Mullaney EJ, Daly CB, Kim T, Porres JM, Lei XG, Sethumadhavan K, Ullah AH. Site-directed mutagenesis of Aspergillus niger NRRL 3135 phytase at residue 300 to enhance catalysis at pH 4.0. Biochem Biophys Res Commun. 2002 Oct 4;297(4): 1016-20.

96. Mullaney EJ, Daly CB, Sethumadhavan K, Rodriquez E, Lei XG, Ullah AH. Phytase activity in Aspergillus fumigatus isolates. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Sep 7;275(3):759-63.

97. Mullaney EJ, Daly CB, Ullah AH. Advances in phytase research. Adv Appl Microbiol. 2000;47:157-99.

98. Mullaney EJ, Ullah AH. Conservation of the active site motif in Aspergillus niger (ficuum) pH 6.0 optimum acid phosphatase and kidney bean purple acid phosphatase. Biochem Biophys Res Commun. 1998 Feb 13;243(2):471-3.

99. Mullaney EJ, Ullah AH. Identification of a histidine acid phosphatase (phyA)-like gene in Arabidopsis thaliana. Biochem Biophys Res Commun. 1998 Oct 9;251(l):252-5.

100. Mullaney EJ, Ullah AH. The term phytase comprises several different classes of enzymes. Biochem Biophys Res Commun. 2003 Dec 5;312(l):179-84.

101. Nagashima T, Tange T, Anazawa H. Dephosphorylation of phytate by using the Aspergillus niger phytase with a high affinity for phytate. Appl Environ Microbiol. 1999 Oct;65(10):4682-4.

102. Nakamura Y, Fukuhara H, Sano K. Secreted phytase activities of yeasts. Biosci Biotechnol Biochem. 2000 Apr;64(4):841-4.9

103. Nakamura Takeshi, Suzuki Tadashi, Tokuda Junko, Kato Nobuo, Sakai Yasuyoshi, Mochizuki Daisuke, Takahashi Hitoshi Method for producing phytase. 2000, October. United States Patent 6140077.

104. Nielsen, H„ J. Eengelbrecht, S. Brunak, and G. von Heijne. 1997. Identification of prokaryotic and eukaryotic signal peptides and prediction of their cleavage sites. Protein Eng. 10:1-6.

105. Nikolova PV, Henckel J, Lane DP, Fersht AR: Semirational design of active tumor suppressor p53 DNA binding domain with enhanced stability. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95:14675-14680.

106. Oh ВС, Chang BS, Park KH, Ha NC, Kim HK, Oh BH, Oh TK. Calcium-dependent catalytic activity of a novel phytase from Bacillus amyloliquefaciens DS11. Biochemistry. 2001 Aug 14;40(32):9669-76.

107. Oh ВС, Choi WC, Park S, Kim YO, Oh TK. Biochemical properties and substrate specificities of alkaline and histidine acid phytases. Appl Microbiol Biotechnol. 2004 Jan;63(4):362-72. Epub 2003 Oct 28.

108. Ohage E, Steipe B: Intrabody construction and expression. I. The critical role of VL domain stability. J Mol Biol 1999,291:1119-1128. Biotechnol 1993, 28:55-68.

109. Ohage EC, Graml W, Walter MM, Steinbacher S, Steipe B: -Turn propensities as Ф paradigms for the analysis of structural motifs to engineer protein stability. Protein Sci1997,6:233-241.

110. Ohta Y, Ikeda K, Ueda S. Production of phosphatase by Aspergillus awamori var. kawachii in a low phosphate medium. Appl Microbiol. 1968 Jul;16(7):973-80.

111. Ostanin, К., E. H. Harms, P. E. Stevis, R. Kuciel, M.-M. Zhou, and R. L. van Etten. 1992 Overexpression, site-directed mutagenesis, and mechanism of Esherichia coli acid phosphatase. J. Biol. Chem. 267:22830-22836.

112. Page, R. D. 1996. TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput. Appl. Biosci. 12:357-358

113. Pallauf J, Rimbach G. Nutritional significance of phytic acid and phytase. Arch Tierernahr. 1997;50(4):301-19.

114. Pandey A, Szakacs G, Soccol CR, Rodriguez-Leon JA, Soccol VT. Production, purification and properties of microbial phytases. Bioresour Technol. 2001 May;77(3):203-14.

115. Pasamontes L, Haiker M, Henriquez-Huecas M, Mitchell DB, van Loon AP. Cloning of the phytases from Emericella nidulans and the thermophilic fungus Talaromyces thermophilus. Biochim Biophys Acta. 1997 Sep 12;1353(3):217-23.

116. Pasamontes L, Haiker M, Wyss M, Tessier M, van Loon AP. Gene cloning, purification, and characterization of a heat-stable phytase from the fungus Aspergillus fumigatus. Appl Environ Microbiol. 1997 May;63(5): 1696-700.

117. Peng RH, Xiong AS, Li X, Fan HQ, Yao QH, Guo MJ, Zhang SL. High expression of a heat-stable phytase in Pichia pastoris Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 2002 Nov;34(6):725-30. Chinese.

118. Perl D, Muller U, Heinemann U, Schmid FX: Two exposed amino acid residues confer thermostability on a cold shock protein. Nat Struct Biol 2000,7:380-383.

119. Phillipy BQ, Mullaney EJ Expression of an Aspergillus niger phytase (phyA) in E. coli. 1997. J. Agric.Food Chem. 45(8), 3337-42.

120. Posfai G, Kolisnychenko V, Bereczki Z, Blattner FR. Markerless gene replacement in Escherichia coli stimulated by a double-strand break in the chromosome.Nucleic Acids Res. 1999 Nov 15;27(22):4409-15.

121. Powar VK, Jagannathan V. Phytase from Bacillus subtilis. Indian J Biochem. 1967 Sep;4(3): 184-5.

122. Powar VK, Jagannathan V. Purification and properties of phytate-specific phosphatase from Bacillus subtilis. J Bacteriol. 1982 Sep;151(3): 1102-8.

123. Raboy V, Gerbasi P. Genetics of myo-inositol phosphate synthesis and accumulation. Subcell Biochem. 1996;26:257-85.

124. Priest FG, Somerville HJ, Cole JA, Hough JS. The taxonomic position of Obesumbacterium proteus, a common brewery contaminant. J Gen Microbiol. 1973 Apr;75(2):295-307.

125. Reddy NR, Sathe SK, Salunkhe DK. Phytates in legumes and cereals. Adv Food Res. 1982;28:1-92.

126. Richardson AE, Hadobas PA. Soil isolates of Pseudomonas spp. that utilize inositol phosphates. Can J Microbiol. 1997 Jun;43(6):509-16.

127. Rodriguez E, Han Y, Lei XG. Cloning, sequencing, and expression of an Escherichia coli acid phosphatase/phytase gene (appAl) isolated from pig colon. Biochem Biophys Res Commun. 1999 Apr 2;257(1): 117-23.

128. Rodriguez E, Mullaney EJ, Lei XG. Expression of the Aspergillus fiimigatus phytase gene in Pichia pastoris and characterization of the recombinant enzyme. Biochem Biophys Res Commun. 2000 Feb 16;268(2):373-8.

129. Rodriguez E, Porres JM, Han Y, Lei XG. Different sensitivity of recombinant Aspergillus niger phytase (r-PhyA) and Escherichia coli pH 2.5 acid phosphatase (r-AppA) to trypsin and pepsin in vitro. Arch Biochem Biophys. 1999 May 15;365(2):262-7.

130. Rodriguez E, Wood ZA, Karplus PA, Lei XG. Site-directed mutagenesis improves catalytic efficiency and thermostability of Escherichia coli pH 2.5 acid phosphatase/phytase expressed in Pichia pastoris. Arch Biochem Biophys. 2000 Oct 1;382(1):105-12.

131. Sabu A, Sarita S, Pandey A, Bogar B, Szakacs G, Soccol CR. Solid-state fermentation for production of phytase by Rhizopus oligosporus. Appl Biochem Biotechnol. 2002 Jul-Dec; 102-103(1 -6):251-60.

132. Sano K, Fukuhara H and Nakamura Y Phytase of the yeast Arxula adenivivoras. Biotechnol. Lett. 1999. 21, 33-38.

133. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y.

134. Sandberg AS, Andersson H. Effect of dietary phytase on the digestion of phytate in the stomach and small intestine of humans. J Nutr. 1988 Apr;l 18(4):469-73.

135. Sandberg AS, Hulthen LR, Turk M. Dietary Aspergillus niger phytase increases iron absorption in humans. J Nutr. 1996 Feb; 126(2):476-80.

136. Shah V, Parekh LJ. Phytase from Klebsiella Sp. No. PG-2: purification and properties. Indian J Biochem Biophys. 1990 Apr;27(2):98-102.

137. Shieh TR, Ware JH. Survey of microorganism for the production of extracellular phytase. Appl Microbiol. 1968 Sep; 16(9): 1348-51.

138. Shin S, Ha NC, Oh ВС, Oh TK, Oh ВН. Enzyme mechanism and catalytic property of beta propeller phytase. Structure (Camb). 2001 Sep;9(9):851-8.

139. Song JK, Rhee JS: Simultaneous enhancement of thermostability and catalytic activity of phospholipase A1 by evolutionary molecular engineering. Appl Environ Microbiol 2000,66:890-894.

140. Spector S, Wang A, Carp SA, Robblee J, Hendsch ZS, Fairman R, Tidor B, Raleigh DP: Rational modification of protein stability by the mutation of charged surface residues. Biochemistry 2000,39:872-879.

141. Sriprapundh D, Vieille C, Zeikus JG: Molecular determinants of xylose isomerase thermal stability and activity: analysis of thermozymes by site-directed mutagenesis. Protein Eng 2000, 13:259-265.

142. Stahl CH, Wilson DB, Lei XG. Comparison of extracellular Escherichia coli AppA phytases expressed in Streptomyces lividans and Pichia pastoris. Biotechnol Lett. 2003 May;25( 10):827-31.

143. Steipe B, Schiller B, Pluckthun A, Steinbacher S: Sequence statistics reliably predict stabilizing mutations in a protein domain. J Mol Biol 1994,240:188-192.

144. Steipe B: Evolutionary approaches to protein engineering. Curr Top Microbiol Immunol 1999, 243:55-86.

145. Stemmer WPC: DNA shuffling by random fragmentation and reassembly: in vitro recombination for molecular evolutioa Proc Natl Acad Sci USA 1994, 91:10747-10751.

146. Stemmer WPC: Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature 1994, 370:389-391.

147. Sweeten J. M. 1992. Livestock and poultry waste management: a national overview, p.4-15. In J. D. Blake and W. Magette (ed.), National livestock, poultry and aquaculture waste management. Amer. Agric. Eng., St. Joseph, Minnesota.

148. Tijskens LM, Greiner R, Biekman ES, Konietzny U. Modeling the effect of temperature and pH on activity of enzymes: the case of phytases. Biotechnol Bioeng. 2001 Feb 5 ;72(3):323-30.

149. Tomschy A, Brugger R, Lehmann M, Svendsen A, Vogel K, Kostrewa D, Lassen SF, Burger D, Kronenberger A, van Loon AP, Pasamontes L, Wyss M. Engineering of phytase for improved activity at low pH. Appl Environ Microbiol. 2002 Apr;68(4): 1907-13.

150. Tomschy A, Tessier M, Wyss M, Brugger R, Broger C, Schnoebelen L, van Loon AP, Pasamontes L. Optimization of the catalytic properties of Aspergillus fumigatus phytase based on the three-dimensional structure. Protein ScL 2000 Jul;9(7): 1304-11.

151. Tomschy A, Wyss M, Kostrewa D, Vogel K, Tessier M, Hofer S, Burgin H, Kronenberger A, Remy R, van Loon AP, Pasamontes L. Active site residue 297 of

152. Aspergillus niger phytase critically affects the catalytic properties. FEBS Lett. 2000 Apr 28;472(2-3): 169-72.

153. Tseng YH, Fang TJ, Tseng SM. Isolation and characterization of a novel phytase from Penicillium simplicissimum. Folia Microbiol (Praha). 2000;45(2):121-7.

154. Туе AJ, Siu FK, Leung TY, Lim BL. Molecular cloning and the biochemical characterization of two novel phytases from B. subtilis 168 and B. licheniformis. Appl Microbiol Biotechnol. 2002 Jul;59(2-3): 190-7. Epub 2002 Jun 08.

155. Ullah AH, Dischinger HC Jr. Identification of residues involved in active-site formation in Aspergillus ficuum phytase. Ann N Y Acad Sci. 1992 Nov 30;672:45-51.

156. Ullah AH, Gibson DM. Extracellular phytase (E.C. 3.1.3.8) from Aspergillus ficuum NRRL 3135: purification and characterization. Prep Biochem. 1987;17(1):63-91.

157. Ullah AH, Sethumadhavan K, Lei XG, Mullaney EJ. Biochemical characterization of cloned Aspergillus fumigatus phytase (phyA). Biochem Biophys Res Commun. 2000 Aug 28;275(2):279-85.

158. Vohra A. and T. Satyanarayana. 2002 Purification and characterization of a thermostable and acid-stable phytase. World Journal of Microbiology & Biotechnology 18: 687-691.

159. Vohra A, Satyanarayana T. Phytases: microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications. Crit Rev Biotechnol. 2003;23(l):29-60.

160. Volfova O, Dvorakova J, Hanzlikova A, Jandera A. Phytase from Aspergillus niger. Folia Microbiol (Praha). 1994;39(6):481-4.

161. Wang XY, Meng FG, Zhou HM. The role of disulfide bonds in the conformational stability and catalytic activity of phytase. Biochem Cell Biol. 2004 Apr;82(2):329-34.

162. Waterham HR, Digan ME, Koutz PJ, Lair SV, Cregg JM. Isolation of the Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene and regulation and use of its promoter. Gene. 1997 Feb 20;186(l):37-44.

163. Wintrode PL, Arnold FH: Temperature adaptation of enzymes: lessons from laboratory evolution. Adv Protein Chem 2001,55:161-225.

164. Xiong AS, Peng RH, Li X, Fan HQ, Yao QH, Guo MJ, Zhang SL. Influence of signal peptide sequences on the expression of heterogeneous proteins in Pichia pastoris Sheng Wu Hua Xue Yu Sheng Wu Wu Li Xue Bao (Shanghai). 2003 Feb;35(2): 154-60. Chinese.

165. Yan F, Kersey JH, Waldroup PW. Phosphorus requirements of broiler chicks three to six weeks of age as influenced by phytase supplementation. Poult ScL 2001 Apr;80(4):455-9.

166. Yanich-Perron, C., Y. Vieira, and J. Messing. 1985. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33:103-119.

167. Yanke LJ, Bae HD, Selinger LB, Cheng KJ. Phytase activity of anaerobic ruminal bacteria. Microbiology. 1998 Jun;144 (Pt 6): 1565-73.

168. Yao B, Zhang CY Wang JH Fan JL Recombinant Pichia pastoris over-expression bioactive phytase. 1998. Science in China. 41(3), 330-336.

169. Zamudio M, Gonzalez A, Bastarrachea F. Regulation of Raoultella terrigena comb.nov. phytase expression. Can J Microbiol. 2002 Jan;48(l):71-81.

170. Zamudio M, Gonzalez A, Medina JA. LactoBacillus plantarum phytase activity is due to non-specific acid phosphatase. Lett Appl Microbiol. 2001 Mar;32(3):181-4.

Информация о работе

Зинин, Николай Владимирович
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.15

Диссертация

Поиск, клонирование и экспрессия генов бактериальных фитаз - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Поиск, клонирование и экспрессия генов бактериальных фитаз ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Поиск, клонирование и экспрессия генов бактериальных фитаз"

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Зинин, Николай Владимирович

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск, клонирование и экспрессия генов бактериальных фитаз"

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Зинин, Николай Владимирович

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Зинин, Николай Владимирович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Поиск, клонирование и экспрессия генов бактериальных фитаз
ВАК РФ 03.00.15, Генетика