Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование и клонирование искусственных генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины Рифт

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Конструирование и клонирование искусственных генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины Рифт"

На правах рукописи

Иматдинов Ильназ Рамисович

Конструирование и клонирование искусственных генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины Рифт

03.01.06 Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 03.02.02 Вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

27 НОЯ 2014

005555861

Вольгинский - 2014

005555861

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхоз-академии).

Научный руководитель:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник, профессор (ПТУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Балышева Вера Ивановна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

заместитель директора ФГБНУ ВНИТИБП, Еремец

профессор Владимир Иванович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник,

профессор кафедры радиобиологии и вирусологии Ярыгина

имени академиков А.Д. Белова и В.Н. Сюрина Елена Игоревна

(ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (ФГБНУ ВИЭВ).

Защита диссертации состоится «30» «декабря» 2014 г. в «1400» часов на заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601125, Владимирская обл., Петушинский р-н., пос. Вольгинский, ул. Академика Бакулова, строение 1. Тел.: (4922) 37 92 51.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан «14» ноября 2014 г. и размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии vvww.vniivvim.ru и на официальном сайте ВАК России wwvv.vak2.ed.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, . Балашова

кандидат биологических наук ¿¿^ Елена Елексеевна

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы

Лихорадка долины Рифт (ЛДР, энзоотический гепатит, Rift Valley Fever, RVF) - преимущественно остропротекающее вирусное трансмиссивное зооантропонозное заболевание. Характеризуется лихорадкой, геморрагическим диатезом, поражением центральной нервной системы, некротическим гепатитом и гастроэнтеритом. Восприимчивы овцы, козы, крупный рогатый скот, лошади, антилопы, обезьяны, а также люди [14].

Эндемичными по ЛДР регионами являются территории Северной Африки и к югу от Сахары, но недавние вспышки в Саудовской Аравии и Йемене указывают на выход болезни за пределы африканского континента, что вызывает серьезные опасения относительно ее возможного распространения в Азию и Европу [13].

Пересечение ЛДР международных и географических границ с последующими взрывными вспышками в ранее благополучных регионах [13], с высокими показателями заболеваемости и смертности при эпизоотиях и эпидемиях подчеркивает важность разработки современных высокотехнологичных диагностикумов и безопасных вакцинных препаратов для применения в ветеринарии и здравоохранении [8, 10]. В настоящее время приоритетным направлением разработки средств специфической защиты от ЛДР является конструирование генно-инженерных вакцин и разработка технологии их применения [9, 12]. Перспективность применения генно-инженерных конструкций, экспрессирующих гликопротеины Gn и Gc, для формирования противовирусного иммунитета были показаны рядом исследователей, разрабатывающих рекомбинантные вакцины против ЛДР [10, 11], вакцины на основе альфавирусных репликонов [3, 6], а также ДНК-вакцины [2, 5, 7, 12]. В то же время, в Российской Федерации такие исследования не проводили. Поэтому наша работа, направленная на разработку генно-инженерных конструкций, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины Рифт, является актуальной и своевременной.

1.2 Степень разработанности проблемы

Приоритетным направлением в области контроля и профилактики ЛДР являются исследования, направленные на разработку вакцинных и диагностических препаратов с использованием генной инженерии. В работах S. Murakami, A. LaBeaud, N. Lagerqvist, J. Kortekaas и ряда других исследователей показана значимость глико-протеинов Gc и Gn в формировании противовирусного иммунитета при иммуниза-

ции мышей рекомбинантными плазмидами или вирусными векторами, кодирующими данные белки [2, 3, 7-11, 14]. В результате проведенных исследований представлены экспериментальные образцы генно-инженерных вакцин, обеспечивающих защиту у экспериментальных животных. В то же время в Российской Федерации подобных исследований не проводилось.

1.3 Цель и задачи исследований

Целью данной работы является получение генно-инженерных конструкций, перспективных для разработки диагностических и вакцинных препаратов против лихорадки долины Рифт.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- подобрать специфические олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие участки, кодирующие гликопротеины Оп и Ос, нуклеопротеин N и оптимизировать условия проведения ПЦР;

- клонировать амплифицированные нуклеотидные последовательности, кодирующие Оп, вс и N. в плазмидном векторе рЛ2Т1.2;

- Провести сравнительный и филогенетический анализы вируса ЛДР штамм «1974-ВНИИВВиМ»;

- получить продуцент рекомбинантного нуклеопротеина N и провести хрома-тографическую очистку препаративных количеств белка;

- клонировать нуклеотидные последовательности, кодирующие полноразмерные гликопротеины Оп и Ос, в эукариотических экспрессирующих векторах и изучить их иммуногенные свойства;

- сконструировать и клонировать искусственный ген, кодирующий полиэпи-топный полипептид, состоящий из аминокислотных последовательностей антигенных детерминант иммунодоминантных белков вируса ЛДР в эукариотических экспрессирующих векторах и изучить их иммуногенные свойства.

1.4 Научная новизна результатов исследований

Впервые в Российской Федерации подобраны праймеры для амплификации полноразмерных генов, кодирующих иммунодоминантные белки вп, вс и 14; определены их нуклеотидные последовательности для вируса ЛДР штамм «1974-ВНИИВВиМ».

Впервые получена библиотека генов вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ», представляющая собой рекомбинантные плазмиды, несущие нуклео-тидные последовательности, кодирующие иммунодоминантные белки: гликопроте-ины Оп и вс и нуклеопротеин N.

Получен прокариотический продуцент рекомбинантного нуклеопротеина N вируса ЛДР.

Определены и депонированы в ОепВапк полные нуклеотидные последовательности, кодирующие гликопротеины Оп (КР876008), вс (КР876009) и нуклеопротеин N (КР876010) вируса ЛДР штамм «1974-ВНИИВВиМ».

Впервые в Российской Федерации получены рекомбинантные плазмиды, несущие полноразмерные гены гликопротеинов Оп и вс без сигнальной (рСЬпеоЛЗп и рС1-пео/Ос) и с сигнальной последовательностью (рЬЮ/Р/Оп и рЬЮ/Р/Ос), иммунизация которыми индуцирует синтез вируснейтрализующих антител у экспериментальных животных (мышей).

Впервые сконструирован искусственный ген, кодирующий полиэпитопный полипептид «873», состоящий из аминокислотных последовательностей антигенных детерминант иимунодоминантных белков вируса ЛДР. Получены рекомбинантные плазмиды, содержащие гены, кодирующие полиэпитопный полипептид «873», иммунизация которыми вызывает синтез вируснейтрализующих антител в более высоких титрах (1:16-1:32) по сравнению с конструкциями, кодирующими полноразмерные гены гликопротеинов Оп и Ос (1:8-1:16).

1.5 Теоретическая и практическая значимость работы

Получена библиотека генов вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ», пригодная в качестве источников генов при конструировании генно-инженерных вакцин и диагностических препаратов.

Получен продуцент рекомбинантного нуклеопротеина >1, позволяющий получать белок в препаративных количествах.

Получены экспрессирующие конструкции, пригодные для разработки ДНК-вакцин, получения моноспецифических сывороток и гибридом моноклональных антител.

Разработаны «Методические положения по хроматографической очистке рекомбинантного нуклеопротеина N вируса лихорадки долины Рифт (ЛДР)», утвер-

жденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхоза-кадемии A.M. Смирновым 25.11.2013.

1.6 Степень достоверности и апробация работы

Статистический анализ результатов исследований проводили согласно рекомендациям Лакина Г.Ф. с использованием программ «R» 3.1.1 и Microsoft Office Excel 2013 [1].

Результаты исследований, выполненных по теме диссертации, представлены, заслушаны и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхо-закадемии в 2012-2014гг., на II Международной научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине» ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (г. Покров, 2012 г.); Международной научно - практической конференции «Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения» «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина (г. Ульяновск, 2012 г.); Научно - практической конференции «Научные основы производства и обеспечения качества биологических препаратов для АПК» ГНУ ВНИТИБП (г. Щелково, 2013 г.), Научной конференции «Молодежные инновации в науке XXI века» Финансовый университет при Правительстве РФ (г. Владимир, 2014 г.), Международной молодежной биотехнологической школе «Биотехнология: от бактериофагов до вакцин» (г. Барнаул, 2014 г.), Международной научно-практической конференции «Биотехнология и качество жизни» (г. Москва, 2014 г.), VIII Международном конгрессе «Epizone» (г. Копенгаген, Дания, 2014 г.).

1.7 Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 научных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации.

1.8 Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 161 страницах машинописного текста, иллюстрирована 8 таблицами и 42 рисунками. Список литературы включает 275 источников, из которых 267 - иностранные.

1.9 Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту

1. Сконструированные искусственные гены в составе экспрессирующих векторов обеспечивают синтез гликопротеинов Gn и Ge вируса ЛДР in vitro и in vivo, и при иммунизации индуцируют гуморальный иммунный ответ у мышей.

2. Продуцент Е. coli pET32b/Np/9b, экспрессирующий рекомбинагггный нук-леопротеин N вируса ЛДР, пригодный для выявления антител к вирусу ЛДР.

3. Искусственный ген, кодирующий полиэпитопный химерный белок «S73», состоящий из аминокислотных последовательностей антигенных детерминант им-мунодоминантных белков вируса ЛДР, пригоден для конструирования рекомби-нантных и ДНК-вакцин против ЛДР.

4. Библиотека генов вируса ЛДР штамм «1974-ВНИИВВиМ» пригодна в качестве источника специфических нуклеотидных последовательностей, кодирующих иммунодоминантные белки вируса ЛДР, для разработки генно-инженерных вакцин и диагностикумов.

1.10 Личный вклад автора в выполнение работы

Диссертационная работа выполнена автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лабораторий: Биохимии (к.б.н. Казакова A.C., д.б.н. профессор А.Д. Середа), Биотехнологии (д.б.н. профессор С.Г. Юрков, к.б.н. О.В. Капустина, к.б.н. В.В. Дмитренко), Молекулярной вирусологии (к.б.н. И.А. Титов, к.б.н. A.C. Малоголовкин, аспирант К.А. Мима), Диагностики (д.в.н. профессор В.В. Куринов), НЭО (к.в.н. С.П. Живодеров) Автор выражает признательность сотруднику ФГБУН ИБХ им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН д.х.н. Е.А. Марквичева и ФГБУ «ВНИИЗЖ» д.б.н. H.H. Власовой. Исследования проведены в лаборатории Биотехнологии и Биохимии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы

2.1.1 Вирус

В работе использовали полученный из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии производственный вакцинный штамм «1974-ВНИИВВиМ» вируса ЛДР с инфекционной активностью 6,5 lg ТЦД50/СМ3.

2.1.2 Штаммы микроорганизмов и плазмидные векторы

Штаммы Escherichia coli: DH5a (Promega, США), XLl-Blue (Agilent Technologies, США) и KRX (Promega, США).

Плазмидные векторы pJET1.2 (Thermo Scientific), pET32b (Novagen, США), pCI-neo (Promega, США), phMGFP (Promega, США).

2.1.3 Культуры клеток

Перевиваемые культуры клеток: почки свиньи (ПСГК-60), почки сайги (ПС), почки африканской зеленой мартышки (CV-1). Культуры клеток получали в лаборатории «Биотехнологии» ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.1.4 Животные

Аутбредные белые мыши 4-6 недельного возраста, и суточные мышата-сосуны получены из сектора подготовки подопытных животных ГНУ ВНИИВВиМ. Ин-бредные мыши линии BALB/C 4 недельного возраста получены из питомника «Пу-щино».

2.2 Результаты собственных исследований

2.2.1 Конструирование библиотеки полноразмерных генов, кодирующих иммунодоминантные белки Gn, Gc и N вируса лихорадки долины Рифт

Создание библиотеки нуклеотидных последовательностей позволяет обезопасить и стандартизировать исследования, связанные с манипуляциями с геномом вируса, исключая или мииимизируя работы непосредственно с геномом и/или самим возбудителем.

2.2.1.1 Культивирование вируса ЛДР

Для клонирования нуклеотидных последовательностей, кодирующих иимуно-доминантные белки вируса ЛДР, требовалось получить полноразмерные копии кДНК с вирусного РНК генома. Первым этапом являлось культивирование вируса для наработки препаративных количеств вирусной геномной РНК, а также для получения очищенного концентрированного антигена для постановки ТФ ИФА. С целью определения наиболее эффективной системы для культивирования, оценивали накопление вируса в перевиваемых линиях клеток CV-1, ПС, ПСГК-60 и в организме новорожденных мышей.

Установлено, что количественный выход (250-500 нг) и качество кДНК было выше в случае выделения РНК TRIzoI с последующей постановкой обратной транскрипции с применением M-MLV-ревертазы на свежей матрице, выделенной из инфицированного с множественностью заражения 0,001 ТЦД50/КЛ вируссодержащим материалом монослоя клеток ПС при развитии цитопатических изменений порядка 50-60 %.

2.2.1.2 Расчет праймеров

В связи с отсутствием данных по полногеномному секвенированию штамма «1974-ВНИИВВиМ», в качестве мишеней для расчета праймеров были выбраны нуклеотидные последовательности М и S сегментов генома вируса ЛДР штамма Smithburn (GeneBank DQ380193.1 и DQ380157.1, соответственно).

При подборе праймеров соблюдали аутентичность аминокислотной последовательности открытой рамки считывания рекомбинантных белков с белками вирусного происхождения после необходимого процессинга предшественников. В прай-меры, фланкирующие гликопротеины Gn и Gc, включены сайты рестрикции Sali и EcoRI, в праймеры Np — StuI и Sali. Данные сайты рестрикции позволяют переклонировать нуклеотидные вставки в необходимые прокариотические и эукариотиче-ские экспрессирующие вектора (таблица 1).

Таблица 1 - Последовательности специфических праймеров для амплификации полноразмерных копий генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса ЛДР_

название и включенный сайт рестрикции нуклеотидная последовательность * длина, H. фланкируемый участок

F-Gn EcoRI 5'-CTCGAATTCATGCCTCATCTCAGAAACAGACCA-3' 33 М сегмент 474 ... 2067 п.н. размер: 1626 п.н.

R-Cn Sali 5'-CCGGTCGACTTATGATGCATATGAGACAATCAA-3' 33

F-Gc EcoRI 5'-CGCGAATTCATGTGTTCAGAACTAATTCAGGCA-3' 33 М сегмент 2079 ... 3474 п.н. размер: 1428 п.н.

R-Cc Sali 5'-CCGGTCGACTTACTTAAGAGGCCCTCCAAACCA-3' 33

F-Np Sali 5'-CCCGTCGACTTAGGCTGCTGTCTTGTAA-3' 28 Б сегмент 908 ... 1637 п.н. размер: 757 п.н.

R-Np StuI 5'-CCGAGGCCTAATGGACAACTATCAAGAG-3' 28

Примечание: «*» - сайт рестрикции в последовательности указан подчеркиванием

2.2.1.3 Оптимизация условий ПЦР

Оптимизацию ПЦР проводили по температурно-временному профилю реакции (градиент температур от 50 до 60 °С с шагом в 1 ± 0,1 °С) и количеству компонентов реакции. В ходе оптимизации были подобраны следующие условия для амплификации генов, кодирующих гликопротеины Gn и Gc: 95 °С - 3 мин, 24 цикла: 95 °С - 30 сек, 57 "С - 25 сек, 72 °С - 200 сек; достройка: 72 °С - 6 мин. Для амплификации гена нуклеопротеина: 95 °С - 3 мин, 24 цикла: 95 °С - 30 сек, 55 °С - 25 сек, 72 °С - 90 сек; достройка: 72 °С - 5 мин. Элсктрофореграмма разделения амплико-нов генов при постановке ПЦР в оптимальных условиях представлена на рисунке 1.

Рисунок 1 - Электрофореграмма разделения ПЦР-продуктов: М - маркер молекулярной массы GeneRuler DNA Ladders lkb; 1 и 4 трек - ампликоны Gn (1626 п.н.), 2 и 5 трек - ампликоны Np (757 п.н.), 3 и 6 - ампликоны Gc (1428 п.н.). С 1 по 3 трек — ПЦР с использованием Pfu-полимеразы, с 4 по 6 - с использованием Taq-полимеразы

Отсутствие шмер и минорных полос позволяют провести клонирование ам-пликонов без этапа электрофоретического фракцирования с последующим выделением из агарозного геля.

2.2.1.4 Клонирование ампликонов генов в плазмидном векторе

Полученные в ПЦР последовательности ДНК были субклонированы в составе плазмидного вектора pJET1.2. Первичный скрининг рекомбинантов выполнен методом контрселекции на среде с ампициллином. Для дальнейшего скрининга выделенные плазмиды использовали в качестве матриц для постановки аналитической ПЦР со специфическими праймерами.

По результатам рестрикционного и ПЦР анализов были отобраны следующие клоны в качестве библиотеки генов вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ»: pJET1.2/Gn/l, pJET1.2/Gc/l, pJET1.2/Np/3, схемы которых представлены на рисунке 2.

Рисунок 2 - Схемы рекомбинантных плазмид, входящих в состав библиотеки генов вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ»

В результате получена библиотека полноразмерных генов, кодирующих им-мунодоминантные белки Оп, Ос и N вируса ЛДР. Впервые определены и депониро-

ваны в GenBank полные нуклеотидные последовательности генов, кодирующих гли-копротеин Gn (GenBank KF876008.1), гликопротеин Gc (GenBank KF876009.1) и нуклеопротеина N (GenBank KF876010.1) производственного вакцинного штамма «1974-ВНИИВВиМ» вируса ЛДР.

2.2.2 Филогенетическая характеристика вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ»

Для проведения сравнительного и филогенетического анализов и построения дендрограмм использовали нуклеотидные последовательности, полученные при се-квенировании библиотеки генов, и сиквенсы ряда вирулентных и вакцинных штаммов (последовательности взяты из GenBank).

Сравнительный анализ первичной структуры амплифицированных фрагментов ДНК показал, что большая часть замен в нуклеотидных последовательностях генов вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ» являются синонимичными и не приводят к изменению первичных аминокислотных последовательностей. Установлено, что по всем 3 анализируемым участкам штамм «1974-ВНИИВВиМ» близок к штаммам Smithburn и Entebbe. Филогенетический анализ проводили по методу максимального правдоподобия на основе модели Тамура-Ней. Данные о филогенетическом родстве штаммов вируса ЛДР представлены на рисунке 3, 4 и 5.

o.oos strain 1974-VNtlWiM, nucleocapsid protein N

- RVFV strain Entebbe, segment S

- RVFV strain Kenya 9800523. segment S

strain ZH-54S, segment S 0-018 0rT<SvFV strain MP-12. segment S

Рисунок 3 - Филогенетическое древо, построенное на основе анализа полной нуклеотидной последовательности гена нуклеопротеина N вируса ЛДР (метод максимального правдоподобия)

о.ооз | 0 002 RVFV «train 1974-VNIIWiM, glycoprotein Gn

I-:-RVFV strain Smithburn, segment M

?VFV strain Entebbe, segment M o.ois

-RVFV «train Kenya 9800523, segment M

strain ZM-548, segment M '' RVFV strain MP-12. segment M

Рисунок 4 - Филогенетическое древо, построенное на основе анализа нуклеотидной последовательности, кодирующей гликопротеин вп вируса ЛДР (метод максимального правдоподобия)

0.001.

RVFV strain 1974-VNIIWiM, glycoprotein Gc

0.01У

RVFV strain Smrthbum, segment M

-RVFV strain Entebbe, segment M

-RVFV strain Kenya 9800523. segment M

o.oos

o.oia

o.oos

strain ^4-548, segment M

0.012

—1RVFV strain MP-12, segment M

0 005

Рисунок 5 - Филогенетическое древо, построенное на основе анализа нуклео-тидной последовательности, кодирующей гликопротеин Gc вируса ЛДР (метод максимального правдоподобия)

Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей 3 участков S и М сегментов показывает высокую степень гомологии со штаммами Smithburn и Entebbe, позволяя выделить их в отдельный кластер. Установлено низкое, по сравнению с другими атгенуированными штаммами, количество значимых аминокислотных замен в антигенных компонентах вируса ЛДР, тем самым выбор штамма «1974-ВНИИВВиМ» в качестве источника генов иммунодоминантных белков является обоснованным.

2.2.3.1 Клонирование полноразмерных генов, кодирующих гликопротеи-ны Gn и Gc в составе плазмидных векторов для экспрессии в эукариотических системах

Для получения вектора экспрессии из исходной плазмиды phMGFP удалили ген hMGFP. Для этого плазмиду phMGFP рестрицировали эндонуклеазами Nhel и Xbal. Продукты рестрикции подвергали электрофоретическому фракцированию, ДНК фрагменты размером ~3995 п.н. (линеаризованная плазмида phMGFP(AMGFP), в дальнейшем именуемая phRVF) были выделены из агарозного геля набором GeneJET Gel Extraction Kit. Для достройки липких концов применяли фрагмент Кле-нова.

Для включение нуклеотидного контекста Козак вокруг старт-кодона рассчитаны прямые праймеры, фланкирующие гены гликопротеинов, с соответствующими нуклеотидными заменами, реализующими консенсусную последовательность Козак в составе открытой рамки считывания. Для наработки ампликонов, содержащих открытые рамки считывания гликопротеинов Gn и Gc с нуклеотидным контекстом Козак, были поставлены ПЦР с применением Pfu-полимеразы на плазмидах pJET1.2/Gn/l и pJET1.2/Gc/I. ПЦР-продукты подвергали электрофоретическому фракцированию в 1,0 % агарозном геле в течение 40 минут. Ампликоны, молекуляр-

ные массы которых равны -1630 п.н. (Gn) и -1429 п.н. (Gc) очищены от агарозного геля с использованием набора GeneJET Gel Extraction Kit. Клонирование проводили по тупым концам с предварительно подготовленным вектором phRVF. Первичный скрининг рекомбинантов выполнен методом контрселекции на SOB-агаре с ампициллином. Из 20 исследованных в ПЦР клонов phRVF/Gn ампликоны заданного размера (-1600 н.п.) были в 8 пробах. Из 20 исследованных клонов phRVF/Gc ампликоны заданного размера (-1400 н.п.) были в 13 пробах. Выделенные плазмиды были рестрицированы эндонуклеазой Hindlll, сайт рестрикции которой имеется в промоторной части плазмиды и в клонируемых нуклеотидных вставках (Gn и Gc), позволяя тем самым подтвердить специфичность и определить ориентацию вставки.

По результатам рестрикционного и ПЦР анализов для дальнейшей работы были отобраны клоны phRVF/Gn/7 и phRVF/Gc/5. Сиквенс показал полное соответствие нуклеотидных вставок с теоретически ожидаемыми, с сохранением рамок считывания и включением последовательности Козак в область старт-кодона.

2.2.3.2 Конструирование рекомбинантных плазмид plmatl/Gn и plmatl/Gc

Для изучения влияния лидирующей сигнальной последовательности на индукцию антител при экспрессии целевого белка, нуклеотидные последовательности, кодирующие гликопротеины Gn и Gc, были клонированы в составе плазмидного вектора plraatl, представляющая собой рассмотренный ранее вектор phRVF, в котором имеется открытая рамка считывания, кодирующая сигнальный пептид белка слияния F парагриппа человека 1 (HPIV-1), с включенным сайтом рестрикции Xhol в спейсерной части для ненаправленного клонирования.

Для клонирования нуклеотидных вставок, кодирующих гликопротеины Gn и Gc, были рассчитаны праймеры, фланкирующие соответствующие гены с включенными сайтами рестрикции Xhol. Для наработки нуклеотидных последовательностей с фланкирующими сайтами рестрикции Xhol были поставлены ПЦР с использованием Pfu-полимеразы на плазмидах pJET1.2/Gn/l и pJET1.2/Gc/l.

В результате последующего скрининга отобраны плазмиды с прямыми ориен-тациями вставок: plmatl/Gn/l и pImatl/Gc/4, несущих последовательности, кодирующие гликопротеин Gn и Gc, соответственно (рисунок 6).

Рисунок 6 - Схемы рекомбинантных плазмид plmatl/Gn и plmatl/Gc: под контролем усиленного энхансером цитомегаловирусного промотора (CMV enhancer/promoter) с соблюдением консенсусной последовательности Козак (Kozak) располагается открытая рамка считывания, представленная лидирующим сигнальным пептидом (Signal), в спейсерный регион (Spacer) которой произведена вставка соответствующей нуклеотидной последовательности Gc или Gn

2.2.3.3 Микрокапсулирование плазмидной ДНК

Нами, совместно с сотрудниками института ИБХ РАН им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, были получены микрокапсулированные формы плазмидной ДНК, что, как предполагалось, позволит экранировать нуклеиновые кислоты от действия внеклеточных нуклеаз, а также повысить эффективность доставки ДНК в цитозоль клеток.

Капсулирование проводили эквимолярных количеств рекомбинантных плазмид (Gn+Gc), формируя два препарата: 1) содержащие плазмиды, кодирующие открытую рамку считывания полипептидов Gn и Gc (phRVF/Gn/7 + phRVF/Gc/5) и 2) содержащие плазмиды, кодирующие открытую рамку считывания гликопротеи-нов с лидирующей сигнальной последовательностью (plmatl/Gn/l + pImatl/Gc/4). Мультислойные оболочки капсул формировали путем поочередного наслоения DEAE-декстрана и DEAE-каррагинана на частицы СаСОз с сорбированной плазмидной ДНК, с последующим растворением ядра 0,1 М ЭДТА.

2.2.3.4 Иммунизация мышей рекомбинантными плазмидами phRVF/Gn+phRVF/Gc и plmatl/Gn+pImatl/Gc в составе микрокапсул и в изотоническом буфере

Для оценки иммуногенности полученных рекомбинантных плазмид и их мик-рокапсулированных форм использовали белых лабораторных мышей линии BALB/c, из которых были сформированы экспериментальные и контрольные группы по 10 голов в каждой. У контрольных и опытных групп отбирали кровь на 14, 21 и 28 сутки после введения. Результаты расчета титра специфических антител в сыворотках крови мышей в ИФА приведены в таблице 2.

Таблица 2 - Титр аитител в сыворотках крови мышей, иммунизированных

микрокапсулами и рекомбинантными плазмидами

№ группы вводимый препарат количество мышей в группе титр антител в ИФА титр в РН

14 сутки 21 супси 28 сутки 28 сутки

I изотонический раствор phRVF/Gn/7 (50 мкг) + phRVF/Gc/5 (50 мкг) 100 мкл 10 1:401:80 1:4001:600 1:8001:1000 1:4-1:8

II изотонический раствор plmatl/Gn/l (50 мкг) + pImatl/Gc/4 (50 мкг) 100 мкл 10 - 1:2001:400 1:4001:600 1:4-1:8

III микрокапсулы |phRVF/Gn/7+ phRVF/Gc/5] 10 1:401:80 1:6001:800 1:10001:1200 1:8-1:16

IV микрокапсулы [pImatl/Gn/l+ pImatl/Gc/4] 10 1:401:80 1:4001:600 1:8001:1000 1:8-1:16

V Микрокапсулы, не содержащие ДНК 5 - - - -

VI 100 мкл ЗФР 5 - - - -

Примечание: «-» - специфических антител не выявлено

Как видно из результатов, приведенных в таблице 2, титр вирусспецифиче-ских антител у мышей в экспериментальных группах достигает до 1:400-1:1200 на 28 день после введения, в зависимости от вводимого препарата.

В составе микрокапсул рекомбинантные плазмиды были более стабильны и эффективнее индуцировали гуморальный иммунный ответ.

Исходя из результатов по II группе, возможно предположить, что экспресси-руемые белки благодаря сигнальным последовательностям и имеющимся трансмембранным регионам концентрировались в комплексе Гольджи, где становились малодоступны для презентации иммунной системе. Высокие средние титры по первой группе можно объяснить тем, что транслируемые полипептиды нерастворимых антигенов, не имея сигнальных последовательностей и, как следствие, неправильно свернувшихся, убиквитинилируются и подвергаются атаке протеолитических ферментов и/или направляются в протеасомную систему деградации с последующим процессингом антигена. Тем самым, антиген более эффективно презентируется иммунной системе.

2.2.4.1 Получение продуцента рекомбинантного нуклеопротеина N вируса

ЛДР

В качестве прокариотического экспрессионного вектора выбрали плазмиду рЕТ32Ь. Исходный вектор рЕТ32Ь рестрицировали эндонуклеазами EcoRV и Sali, источником специфической вставки выступила плазмида из библиотеки генов вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ» pJET1.2/Np/3 обработанная эндонуклеазами StuI и Sali. Подготовленные компоненты лигировали и реакционной смесью трансформировали клетки Е. coli штамма KRX по методике, предложенной Hanahan. Первичный скрининг рекомбинантов выполнен методом контрселекции на SOB-arape с ампициллином. Методами ПЦР (специфические праймеры F-Np и R-Np) выполняли отбор положительных клонов. Для дальнейшей работы отобран клон, соответствующий плазмиде pET32b/Np/9b. Специфичность нуклеотидной последовательности и корректность открытой рамки считывания подтверждены перекрывающимся секве-нированием.

2.2.4.2 Индукция экспрессии и хроматографическая очистка рекомбинантного нуклеопротеина N

Для наработки бактериальной культуры продуцента расплодку клона pET32b/Np/9b высевали в SOB среду с ампициллином (50 мкг/см3), с добавлением в качестве индуктора экспрессии 20 % раствор L-рамнозы в отношении 1:200 к жидкой среде с последующем инкубированием на термошейкере при 37 ± 0,5 °С 16 часов. Затем бактериальную культуру осаждали центрифугированием, и лизировали на ультразвуковом дезинтеграторе. После лизат продуцента осветляли центрифугированием и пропускали через фильтр 0,45 мкм.

В качестве хелатообразующего сорбента использовали сефарозу с фиксированными ионами Ni2+. Очистка рекомбинантного нуклеопротеина N проходила в несколько стадий: уравновешивание системы, сорбция рекомбинантного белка, промывка сорбента в хроматографической колонке и элюция рекомбинантного белка 500 мМ раствором имидазола. Оценку степени очистки препарата рекомбинантного нуклеопротеина N вируса ЛДР проводили в белковом SDS-PAGE электрофорезе по Laemmli в 10 % полиакриламидном геле (рисунок 7). После окраски и отмывки геля проводили оценку степени очистки рекомбинантного белка. Молекулярная масса рекомбинантного нуклеопротеина N вируса ЛДР, составляла ~ 45,7 кДа, что соответствует расчетным данным.

Рисунок 7 - Электрофореграммы лизатов клеток продуцента рЕТ32ЬЛМр/9Ь и хроматографически очищенных препаратов рекомбинантного нуклеопротеина N вируса ЛДР

1 и 4 - лизат клеток продуцента рЕТ32Ь/Ыр/9Ь до индукции по 5 и 10 мкл; 2 и 5 - лизат клеток продуцента рЕТ32Ь/Мр/9Ь после индукции Ь-рамнозой по 5 и 10 мкл; 3 и 6 - препараты рекомбинантного нуклеопротеина N по 5 и 10 мкл, соответственно

В результате получен прокариотический продуцент рекомбинантного нуклеопротеина N вируса ЛДР. С использованием белкового электрофореза показана экспрессия рекомбинантного белка, молекулярная масса которого равна расчетной молекулярной массе рекомбинантного нуклеопротеина N.

2.2.5.1 Конструирование и клонирование искусственного гена, кодирующего иолиэпитопный полипептид, состоящий из аминокислотных последовательностей антигенных детерминант иимунодоминантных белков

Исходя из полученных результатов по иммунизации рекомбинантными плаз-мидами, кодирующими гликопротеины вп и вс, можно сделать вывод о сравнительно низком (по сравнению с живыми вирус-вакцинами) уровне экспрессии целевого белка. В связи с этим оптимизируя структуру антигена, исключая из состава белка «малозначимые» для иммунной системы участки (трансмембранные регионы, внутриклеточные домены, интеины, сигнальные пептиды и т.д.) теоретически возможно получить при данном уровне экспрессии более эффективный иммунный ответ.

На основании биоинформатического анализа иммунодоминантных белков вируса ЛДР, локализованы антигенные детерминанты, содержащие прогнозируемые СТЬ- и В- клеточные эпитопы и НЬА-мотивы. В нуклеотидной последовательности, кодирующей гликопротеин вп, выделены 3 участка в 192, 291 и 153 п.н., в последо-

вательности, кодирующей гликопротеин Gc - один участок в 216 п.н., и нуклеопро-теина N - в 134 и 149 п.н.

2.2.5.2 Моделирование de novo, анализ и выбор варианта химерного поли-эпитопного белка

Для формирования химерного полиэпитопного белка выбранные участки использовали для de novo конструирования вариантов с чередованиями последовательностей, наличием и отсутствием спейсерных регионов, а также вариантов с точечным направленным мутагенезом аминокислот в первичной последовательности полипептида. Выбор конечного варианта осуществлялся исходя из конформацион-ной доступности известных эпитопов и доступности потенциальных сайтов протео-литического расщепления.

По результатам моделирования, анализа структуры, расположения эпитопов и потенциальных сайтов протеолигического расщепления, был выбран вариант химерного белка «S73», обеспечивающий наибольшую конформационную доступность эпитопов. В варианте «S73» выбранные иммунсгенные участки образуют аминокислотную последовательность полиэпитопного полипептида в следующем порядке: n-Np_Ept2 - Gn Eptl - Gn Ept2 - Gc Eptl - Gn_Ept3 - Np_Eptl-c, без искусственных спейсерных участков между ними. 3D модель химерного белка варианта «S73» представлена на рисунке 8.

Рисунок 8 - 3D модель химерного полиэпитопного белка варианта «S73», верхний ряд — ribbon модель с указанием a-спиралей и [3-складок, нижний ряд - molecular surface

2.2.5.3 Конструирование и клонирование искусственного гена, кодирующего полиэпитопный полипептид «S73»

Для сборки искусственного гена были рассчитаны праймеры, фланкирующие нуклеотидные последовательности, кодирующие выбранные антигенные детерминанты иимунодоминантных белков. В качестве матриц использовали плазмиды из библиотеки генов вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ». Сборку из амплифици-рованных ДНК-фрагментов проводили по методу, предложенному Gibson в модификации. Амплификацию нуклеотидных последовательностей, кодирующих соответствующие детерминанты, проводили в ПЦР с использованием высокоточной Pfu-полимеразы. Концевые адаптеры полученных ДНК-фрагментов отжигались согласно этапам сборки, с последующей амплификацией в ПЦР, электрофоретическим фракционированием и выделением ПЦР-продуктов заданного размера для следующего этапа сборки.

После поэтапной сборки нуклеотидная последовательность, кодирующая полиэпитопный полипептид, клонирована в составе плазмиды рШТ1.2 согласно рекомендациям производителя. Скрининг рекомбинантов проводили в аналитической ПЦР со специфическими праймерами F-Np_Ept2 и R-Np_Eptl, с отбором клонов, молекулярные массы ампликонов которых соответствовали -1100 п.н. Для дальнейшей работы отобрали клон pJETl.2/1-8/2, именуемый в дальнейшем pJET1.2/S73. Секвенирование плазмиды pJET1.2/S73 показало аутентичность нуклеотидной последовательности с теоретически ожидаемой. Длина вставки с включенными сайтами рестрикции Xhol и StuI составила 1099 п.н., кодируемый белок - 363 аминокислоты.

2.2.5.4 Клонирование искусственного гена, кодирующего полиэпитопный полипептид «S73» в составе экспрессирующих эукариотических векторов

Для реализации стратегии иммунизации полиэпитопным антигеном необходимо, чтобы синтезируемый на рибосомах белок транспортировался в нужные ком-партменты клетки (эндоплазматический ретикулум и/или аппарат Гольджи для по-стгрансляционной модификации) и затем на наружную мембрану или во внеклеточную среду.

Источником специфической вставки, кодирующей полипептид «S73», для всех векторов выступала плазмида pJET1.2/S73. Так как специфическая вставка фланкирована сайтами рестрикции Xhol, плазмиду обрабатывали рестриктазой Xhol. ДНК-

фрагменты размером -1100 п.н. были выделены из агарозного геля после электро-форетического фракцирования продуктов рестрикции в 1,0 % агарозном геле в течение 45 минут.

Задачу первичного транспорта и внутриклеточного сортинга экспрессируемо-го белка выполняет N-концевая сигнальная последовательность белка слияния F парагриппа человека 1 (HPIV-1) в рассмотренном ранее плазмидном векторе plmatl.

Одним из экспрессирующих плазмидных векторов, реализующих внутриклеточный транспорт, является плазмида plmat2. Данный вектор является модификацией плазмиды plmatl, в которой в открытой рамке считывания помимо сигнальной последовательности белка F парагриппа человека 1, имеются аминокислотные последовательности, отвечающие за заякоривание белков в клеточной мембране.

Для получения линеаризованных векторов, плазмиды plmatl и plmat2 рестри-цировали эндонуклеазой Xhol при 37 ± 0,5 °С 16 часов. Для предотвращения само-лигирования в реакционную смесь вносили 1 е.а. щелочной фосфатазы. Продукты рестрикции подвергали электрофоретическому фракцированию в 1,0 % агарозном геле в течение 1 часа. ДНК фрагменты очищали от агарозного геля набором GeneJET Gel Extraction Kit.

Для презентации антигена посредством убиквитин-зависимой системы деградации белков, проведено клонирование нуклеотидной последовательности, кодирующей полипептид «S73», в экспрессирующий вектор pImat3UBB76A. Данный вектор основан на плазмиде phRVF с включенной рамкой считывания, кодирующей убиквитин В человека с аминокислотной заменой в 76 позиции на аргинин. Клонирование проводили по сайту рестрикции Smal/Xmal, располагающийся в нуклеотидной последовательности, кодирующей С-концевую часть убиквитина, тем самым формируя гибридный полипептид в одной рамке считывания.

Исходный вектор pImat3UBB76A линеаризовали посредством обработки плазмиды рестриктазой Smal. Для предотвращения самолигирования в реакционную смесь вносили 1 е.а. щелочной фосфатазы. После электрофореза в 1,2 % агарозном геле в течение 1 часа, ДНК-фрагменты, молекулярная масса которых равна -4250 п.н., выделяли из агарозного геля.

Лигирование подготовленных компонентов проводили в течение 10 минут при комнатной температуре, соотношение вектор/вставка было 1:3. Лигазными смесями трансформировали клетки Е. coli штамма DH5a. Отбор клонов со специфической

вставкой в прямой ориентации выполняли методом рестрикционного анализа (эндо-нуклеаза НтсШ1).

Для работы отобраны клоны: р1та11/873/3 (р1таП/873), р1та12/Я73/1 (р1та12/873) и р1та13иВВ76А/873/1 (р1та13иВВ76А/873), схемы плазмид представлены на рисунке 9.

Рисунок 9 - Схемы рекомбинантных плазмид р1таИ/873, р1та12/873 и р1та13иВВ76А/873

2.2.5.5 Изучение иммуногенной активности рекомбинантных плазмид р1таШ873, р1та!2/873 и р1та13иВВ76А/873

Для оценки иммуногенноста плазмид использовали белых лабораторных мышей, из которых были сформированы экспериментальные и контрольные группы по 10 голов в каждой. У мышей контрольных и опытных групп отбирали пробы крови на 14,21 и 28 сутки после введения.

Вируснейтрализующую активность сывороток крови мышей определяли в реакции нейтрализации в культуре клеток ПС против 100 ТЦД50, определение титра вирусспецифических антител в сыворотках крови проводили методом непрямого ТФ-ИФА (таблица 3).

Как видно из результатов, представленных в таблице 3, титр вирусспецифических антител у мышей экспериментальных групп возрастает до 1:400-1:1600 на 28 день после введения, в зависимости от вводимого препарата.

Группы I и II показывают уровни вирусспецифических антител выше, нежели группы, иммунизированные плазмидами, кодирующими полноразмерные гликопро-теины вп и вс. Данное обстоятельство можно объяснить оптимизацией искусственного гена (исключение редких кодонов, отсутствие вторичных структур в последовательности ДНК/РНК и т.д.), а также успешным биоинформатическим анализом по поиску антигенных детерминант. Стоит обратить внимание, что наибольший титр антител в крови иммунизированных мышей наблюдали при иммунизации плазмидой

р1пШ2/873, кодирующей химерный белок с трансмембранными регионами, тем самым возможно предположить, что сенсибилизированный на клеточной стенке антиген эффективно презентировался для индукции гуморального иммунного ответа.

Таблица 3 - Титр вирусспецифических антител в сыворотках крови мышей, иммунизированных рекомбинантными плазмидами рГтаи/373, рГта12/873 и Р1пШЗиВВ76А/873___

№ группы вводимый препарат количество мышей в группе титр антител в ИФА титр в РН

14 сутки 21 сутки 28 сутки 28 сутки

I изотонический раствор р1таШ873 (100 мкг) + 100 мкл 10 1:4001:600 1:8001:1000 1:10001:1200 1:8-1:16

II изотонический раствор р1шаа/873 (100 мкг) + 100 мкл 10 1:4001:600 1:10001:1200 1:14001:1600 1:16-1:1:32

III изотонический раствор р1та13иВВ76А/873 (100 мкг) + 100 мкл 10 1:401:80 1:4001:600 1:2001:400 1:8

IV 100 мкл ЗФР 10 - - - -

Примечание: «-» - специфических антител не выявлено

Анализируя результаты по III группе, можно предположить, что благодаря целостности рамки считывания, экспрессия целевого белка n-UBB76A-S73-c была приблизительно на уровне с другими группами, но презентация антигена шла по пути клеточного иммунитета (за счет MHC-I). Данный вывод требует более детального изучения, в том числе клеточного иммунитета подопытных животных, и оценка уровня экспрессии в ПЦР в реальном времени.

3 ВЫВОДЫ

1. Подобраны праймеры и режимы амплификации для участков генома, кодирующих гликопротеины Gn и Gc и нуклеопротеин N.

2. Определены нуклеотидные последовательности, кодирующие гликопротеины Gn, Gc и нуклеопротеин N, вируса ЛДР штамм «1974-ВНИИВВиМ», проведенный сравнительный и филогенетический анализы показывают высокую степень гомологии со штаммами Smithburn и Entebbe, позволяя выделить их в отдельный кластер.

3. Получена библиотека полноразмерных генов, кодирующих иммунодоминантные белки Оп, ве и N вируса лихорадки долины Рифт, для создания вакцинных и диагностических препаратов на основе рекомбинантных технологий.

4. Получен продуцент рЕТ32Ь/Ыр/9Ь рекомбинантного нуклеопротеина N вируса ЛДР и разработана методика его хроматографической очистки для наработки препаративных количеств белка.

5. Сконструированы рекомбинантные плазмиды без лидирующей сигнальной аминокислотной последовательности (рЬКУР/Оп и рЫ1УРЛЗс) и с сигнальной последовательностью (рГшаИ/Оп и р1таиЛЗс), иммунизация которыми индуцирует у мышей синтез вирусспецифических антител на 28 сутки в титрах 1:800-1:1000 и 1:400-1:600, соответственно.

6. Сконструирован и клонирован искусственный ген, кодирующий полиэпитопный белок «873», состоящий из аминокислотных последовательностей антигенных детерминант гликопротеинов вп и в с, и нуклеопротеина N.

7. Гуморальный иммунный ответ мышей при иммунизации экспрессирующими конструкциями, кодирующими полиэпитопный белок «873», характеризуется выработкой вируснейтрализующих антител в титрах 1:8-1:32 для рекомбинантных плазмид р1та11/873 (с лидирующей сигнальной последовательностью) и р1та12/873 (с И- и С-концевыми трансмембранными регионами).

8. Оптимизация экспрессирующих конструкций и введение консенсусной последовательности Козак в область старт-кодона, с последующей доставкой плазмид-ной ДНК в составе микрокапсул, позволяет усилить гуморальный иммунный ответ более чем в 10 раз.

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомбинантный нуклеопротеин N вируса ЛДР рекомендуется для использования в диагностических исследованиях при определении вирусспецифических антител в сыворотках крови инфицированных или иммунизированных вирусом ЛДР животных.

Библиотека генов вируса ЛДР штамма «1974-ВНИИВВиМ» и экспрессирую-щие конструкции рекомендуются для разработки рекомбинантных и ДНК-вакцин.

«Методические положения по хроматографической очистке рекомбинантного нуклеопротеина N вируса лихорадки долины Рифт (ЛДР)», утвержденные акаде-

миком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии A.M.

Смирновым 25.11.2013.

5 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М: Высшая школа, 1980. - 352 с.

2. A DNA vaccine encoding ubiquitinated Rift Valley fever virus nucleoprotein provides consistent immunity and protects IFNAR -/- mice upon lethal virus challenge / Boshra H. [et al.] // Vaccine. - 2011. - V. 29, №. 27. - P. 4469-4475.

3. An alphavirus replicon-derived candidate vaccine against Rift Valley fever virus / Heise M. T. [et al.] // Epidemiology and infection - 2009. - V. 137, №. 09. - P. 1309-1318.

4. Bouloy, M. Reverse genetics technology for Rift Valley fever virus: current and future applications for the development of therapeutics and vaccines / Bouloy, M. Flick R. //Antiviral research. - 2009. - V. 84, №. 2. - P. 101-118.

5. Characterisation of immune responses and protective efficacy in mice after immunisation with Rift Valley Fever virus cDNA constructs / Lagerqvist N. [et al.] // Virology journal. - 2009. - V. 6, №. 1. - P. 6.

6. Comparative analysis of the alphavirus-based vectors expressing Rift Valley fever virus glycoproteins / Gorchakov R. [et al.] // Virology. - 2007. - V. 366, №. 1. - P. 212-225.

7. Immunogenicity of combination DNA vaccines for Rift Valley fever virus, tick-borne encephalitis virus, Hantaan virus, and Crimean Congo hemorrhagic fever virus / Spik K. et al. // Vaccine. - 2006. - V. 24, №. 21. -P. 4657-4666.

8. Kortekaas, J. One Health approach to Rift Valley fever vaccine development / Kortekaas J. // Antiviral research. - 2014. - V. 106. - P. 24-32.

9. La Beaud, A. D. Advances in Rift Valley fever research: insights for disease prevention / La Beaud, A. D., Kazura J. W., King С. H. // Current opinion in infectious diseases. - 2010. - V. 23, №. 5. - P. 403.

10. Rift Valley Fever Vaccine Development, Progress and Constraints / Kortekaas J. [et al.] // Emerging infectious diseases. - 2011. - V. 17, №. 9. - P. el-el2.

11. Rift Valley fever virus (Bunyaviridae: Phlebovirus): an update on pathogenesis, molecular epidemiology, vectors, diagnostics and prevention / Pepin M. [et al.] // Veterinary research. - 2010. - V. 41, №. 6. - P. 61.

12. Rift valley fever: recent insights into pathogenesis and prevention / Boshra H. [et al.] //Journal of virology. - 2011. - V. 85, №. 13. - P. 6098-6105.

13. Rift Valley fever-a threat for Europe? / Chevalier V. [et al.] // Euro surveillance. - 2010. - P. 30-40.

14. Schmaljohn, C.S. Bunyaviridae. / Schmaljohn C.S., Nichol S.T. // Fields Virol. 5th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins.- 2007. - P. 1741-1789.

6 СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Балышева, В.И. Антигенная активность инактивированного вируса лихорадки долины Рифт / Балышева В.И., Капустина О.В., Закутский Н.И., Иматдинов И.Р. // Ветеринарная'медицина. - Харьюв. - 2012. - № 96. - С. 143-145.

2. Балышева, В.И. Изучение иммунного ответа при иммунизации мышей рекомбинантными плазмидами, включенными в биодеградируемые микрокапсулы / Белов С.Ю., Власова H.H., Капустина О.В., Селина O.E., Иматдинов И.Р., Маркви-чева Е.А. // Биотехнология. - 2013. — №5. - С. 71-77.

3. Балышева, В.И. Лихорадка долины Рифт. Характеристика болезни и принципы конструирования вакцин / Балышева В.И., Капустина О.В., Иматдинов И.Р. // Биотехнологические решения для продовольственной и экологической безопасности: тезисы докл. Междунар. конф. - СПб. -2013. - С. 11-12.

4. Иматдинов, И.Р. Библиотека генов, кодирующих иммунодоминантные белки вируса лихорадки долины рифт штамма «1974-ВНИИВВиМ» / Иматдинов И.Р. Казакова A.C., Прилепская Е.П., Балышева В.И. // Актуальные вопросы контроля инфекционных болезней животных: материалы Международной научно -практической конференции, посвященной 55 - летаю ВНИИВВиМ. - Покров, 2013. -С.154- 159.

5. Иматдинов, И.Р. Клонирование полноразмерных копий кДНК генов вируса лихорадки долины Рифт / Иматдинов И.Р., Прилипов А.Г., Капустина О.В., Власова H.H. // Научно-теоретический журнал. Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. - Ульяновск. - 2012. - №4 (20). - С. 43-48.

6. Иматдинов, И.Р. Конструирование вектора для экспрессии гликопроте-ина Gn вируса лихорадки долины Рифт in vitro / Иматдинов И.Р., Власова H.H., Капустина О.В., Балышева В.И. // Научные основы производства и обеспечения каче-

ства биологических препаратов для АПК. Под ред. А.Я. Самуйленко и др. Материалы междунар. науч.-практ. конф. — Щелково. - 2012. - С.119-125.

7. Иматдипов, И.Р. Конструирование плазмид, содержащих гены, кодирующие протективные белки вируса лихорадки долины Рифт / Иматдинов, И.Р., Южук Т.Э., Балышева В.И. //Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных: материалы всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 22-24 мая 2012/ под ред. профессора А.Н. Куличенко. - Ставрополь: ООО "Экспо-Медиа", - 2012. - С.40-41.

8. Иматдинов, И.Р. Лихорадка долины Рифт: различные аспекты ДНК -вакцинации// Аграрная наука и образование на современном этапе развития: опыт, проблемы и пути их решения / Иматдинов, И.Р, Власова Н.Н., Капустина О.В., Балышева В.И. // Материалы IV Междунар. науч.- практ. конф. Т.1. - Ульяновск: ФГБОУ ВПО «Ульяновская ГСХА им. П.А.Столыпина, - 2012. - С. 189-197.

9. Иматдинов, И.Р. Получение полноразмерных копий КДНК генов вируса лихорадки долины Рифт / Иматдинов, И.Р., Варенцова А.А., Балышева В.И. // Актуальные проблемы инфекционной патологии в ветеринарной медицине: материалы II конференции молодых ученых. - Покров. - 2012. - С. 135-139.

10. Капустина, О.В. Использование генно-инженерных конструкций в технологии получения моноклональных антител / Капустина О.В., Власова Н.Н., Балышева В.И., Пономарев В.Н., Сидлик М.В., Першин А.С., Иматдинов И.Р. // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2014. - № 1. - С. 45-49. - Биб-лиогр.: С. 48-49.

11. Selina, О. Biodegradable microcapsules/nanoparticles with entrapped DNA plasmid for development of new DNA vaccines / Selina O., Goryachaya A., Kulikov P., Balysheva V., Vlasova N., Imatdinov I., Shtilman M., Markvicheva E. // 4-th Russian-Hellenic Symposium with International Participation and Young Scientist's School "Biomaterials and Bionanomaterials: Recent Advances and Safety-Toxicology Issues" (Hera-klion, Crete-Greece, 5-12 May 2013), Proceedings, P. 30.

12. Zaitseva, E. Entrapment of DNA plasmids into modified poly(N-vinylpyrrolidone) nanoparticles for development of DNA-vaccines / Zaitseva E., Markvicheva E., Selina O., Kulikov P., Balysheva V., Imatdinov I., Goryachaya A., Shtilman M. // XXI International Conference on Bioencapsulation (Berlin, Germany, Aug 28-30, 2013), Proceedings. - 2013. - P. 250-251.

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБТС (ABTS) — 2,2'-азино-ди[3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота]

ВНИИВВиМ — Всероссийский НИИ ветеринарной вирусологии и микробиологии

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ЗФР - забуференный физиологический раствор

кДа — килодальтон

кДНК — комплементарная ДНК

ЛДР - лихорадка долины Рифт

м.м. - молекулярная масса

мРНК - матричная РНК

п.н. (bp) - пара нуклеотидов (base pairs)

ПС — перевиваемая линия клеток почки сайги

ПСГК — 60 - перевиваемая линия клеток почки свиньи

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РН - реакция нейтрализации

РНК — рибонуклеиновая кислота

ТФ ИФА — твердофазный иммуноферментный анализ

ТЦД - тканевая цитопатическая доза

ФБР - фосфатный буферный раствор

ФБР-Т - ФБР с добавлением 0,05% Твин-20

ЦПД — цитопатогенное действие

ЦТЛ (CTL) — цитотоксические Т-лимфоциты

CV — 1 - перевиваемая линия клеток почки африканской зеленной мартышки

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, пос. Вольгинский Владимирской области. Тираж 85 экз.