Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики цитомегаловирусной инфекции

Суслопаров, Иван Михайлович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики цитомегаловирусной инфекции
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики цитомегаловирусной инфекции"

На правах рукописи

Суслопаров Иван Михайлович

РАЗРАБОТКА РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2006

Работа выполнена в ФГУН Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора Минздравсоцразвития России.

Научный руководитель

кандидат биологических наук Суслопаров М.А.

Официальные оппоненты

доктор биологических наук Беклемишев А.Б. доктор биологических наук, профессор Василенко С.К.

Ведущая организация

НИИ молекулярной биологии и биофизики (НИИМББ) СО РАМН

(Новосибирск).

Защита состоится « 7 » апреля 2006 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета при Государственном научном центре вирусологии и биотехнологии «Вектор» по адресу: ГНЦ ВБ «Вектор, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (8-383) 336-74-28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного центра вирусолопга и биотехнологии «Вектор».

Автореферат разослан « 3 » марта 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Малыгин Э.Г.

аооь'А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Герпесвирусные инфекции занимают одно из первых мест среди хронических инфекций человека по: распространенности, сложности диагностики и лечения. Клинические симптомы этих инфекций перекрываются с множеством других заболеваний, поэтому, большое значение имеет разработка диагностических систем, позволяющих дифференцировать инфекционный агент. Сложность иммунодиагностики этих вирусов обусловлена значительным серологическим сходством не только внутри семейства, но и с другими вирусами (например ВИЧ).

Цитомегаловирус вызывает различные формы инфекции - субклиническую, хроническую и острую. Цитомегаловирусная инфекция может вызывать как системные заболевания (мононуклеоз, генерализованная цитомегалия), так и поражение отдельных органов (печень, легкие, головной мозг, сердце, мочеполовые органы и др.).

Многочисленные исследования ряда авторов показали возможность передачи вируса «по вертикали», т.е. трансплацентарное проникновение ЦМВ в плод (внутриутробная инфекция), приводящее к формированию тяжелых пороков развития. Внутриутробная инфекция ЦМВ поражает 0,5 - 5% всех новорожденных. Частота передачи вируса плоду, при первичной инфекции, во время беременности составляет 15 - 50%. В настоящее время установлено, что одной из главных причин врожденных уродств и поздних выкидышей является вирусоносительство или цитомегаловирусная инфекция у беременных женщин, как клинически выраженная, так и скрытопротекаемая.

Известно, что антитела к ЦМВ появляются значительно раньше клинических проявлений болезней ассоциированных с этой инфекцией. Концентрация антител коррелирует с тяжестью протекания заболевания. До проведения нашего исследования, для выявления антител к ЦМВ в крови пациентов, в России использовался твердофазный иммуноферментный анализ

(ИФА) на основе нативных антигенов ЦМВ. Анализ состояния проблем в

1РОС. НАЦИОНАЛЬЪЛЯ

Библиотека \

С П«*еИр,г л* :

области разработок способов выявления антител к ЦМВ в сыворотках больных показал, что актуальным и принципиально важным является выбор и поиск высокоспецифичных антигенов ЦМВ, в том числе и полученных генно-инженерным способом. Именно этой проблеме и посвящена настоящая работа, в которой предполагалось оценить пригодность рекомбинантных антигенов, содержащих аминокислотные последовательности иммунодоминантных областей белков ЦМВ для создания высокоэффективных тест-систем диагностики ЦМВ - инфекции. Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось получение и сравнительное исследование первичных структур и антигенных свойств некоторых рекомбинантных и нативных белков ЦМВ человека для последующей разработки способов диагностики цитомегаловирусной инфекции, основанных на ИФА, ПЦР и методе прямого иммунофлуоресцентного анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• На основе компьютерного анализа аминокислотных последовательностей белков р52, рр65 и рр150 цитомегаловируса человека выявить в их структуре гипотетические антигенные детерминанты;

• Получить методом ПЦР последовательности ДНК, кодирующие иммунодоминантные фрагменты вирусных белков р52, рр65 и рр 150;

• Сконструировать штаммы Е coli, обеспечивающие стабильную экспрессию рекомбинантных белков гр52, грр65 и грр150, содержащих в своем составе аминокислотные последовательности иммунодоминантных областей антигенов р52, рр65 и рр150 ЦМВ соответственно;

• Изучить антигенные свойства полученных рекомбинантных белков методом ИФА и оценить их пригодность для серодиагностики цитомегаловирусных инфекций;

• Осуществить выбор и тестирование олигонуклеотндов-праймеров для специфического выявления ДНК ЦМВ в клинических образцах с помощью ПЦР и оптимизировать условия реакции;

• Получить меченые моноспецифические сыворотки к рекомбинантным белкам грр65 и грр150 и изучить возможность их использования для выявления антигенов ЦМВ.

Научная новизна

В настоящей работе проведена комплексная оценка иммунодоминантных районов структурных белков рр150, р52 и рр65 цитомегаловируса человека. С помощью компьютерного анализа в выбранных иммунодоминантных районах белков-антигенов выявлены потенциальные антигенные детерминанты, являющиеся специфичными для ЦМВ и перспективными для использования в виде рекомбинантных аналогов в серодиагностике ЦМВ - инфекций.

Сконструирован бактериальный экспрессирующий вектор, кодирующий последовательность из шести гистидинов на С-конце целевого рекомбинантного белка, которая является мишенью для аффинной очистки на металлохелатных сорбентах.

Продемонстрирована перспективность использования полученных в данной работе рекомбинантных белков гр52, грр65 и грр150 в качестве специфических антигенов для выявления антител к ЦМВ методом ИФА.

Показано, что меченые моноспецифические кроличьи антисыворотки, полученные к рекомбинантным белкам грр150 и грр65, позволяют с помощью иммунофлуоресцентного анализа диагностировать острую стадию ЦМВ инфекции.

Олигонуклеотидные праймеры, подобранные к участку гена ЦЬ55, кодирующему Ы-концевой район гликопротеина В ЦМВ, пригодны для специфического выявления геномных ДНК различных штаммов и клинических изолятов цитомегаловируса человека методом ПЦР.

Практическая значимость работы

В настоящее время в диагностике латентных вирусных инфекций в России главное место принадлежит иммуноферментному анализу (ИФА) (ввиду его общедоступности). Следует отметать, что сертифицировано лишь ограниченное количество отечественных ИФА тест-систем для выявления антител к цитомегаловирусу, а импортные тест-системы имеют очень высокую стоимость. Поэтому практическая ценность данного исследования заключается, прежде всего, в получении рекомбинантных анггигенов, пригодных для разработки на их основе более дешевых отечественных диагностических систем, не уступающих импортным аналогам.

Сконструированные в данной работе рекомбинантные антигены в настоящее время используются такими отечественными производителями диагностических наборов, как ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ЗАО «Медико-биологический союз» (Новосибирск) и ЗАО «Имди» (Новосибирск) (Суслопаров МА, 2000; Суслопаров ИМ, 2005; Ивченко СН, 2005). Разработана, сконструирована и утверждена в ГИСК им. JI.A. Тарасевича стандартная панель сывороток для определения антител класса G к цитомегаловирусу человека (Ивченко СН, 2004).

Олигонуклеотидые праймеры, подобранные к участку гена UL55, кодирующему N-концевой район gB ЦМВ, могут быть использованы для создания диагностических ПЦР тест-систем, а также для типирования изолятов цитомегаловируса по генотипам gB. Положения выносимые на защиту

1. Плазмидная конструкция, включающая фрагмент гена UL32 ЦМВ, обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка грр150, содержащего иммунодоминантную область главного матричного фосфопротеина рр150 ЦМВ.

2. Плазмидная конструкция, включающая фрагмент гена UL44 ЦМВ, обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка гр52, содержащего иммунодоминантную область ДНК-связывакмцего белка р52 ЦМВ.

3. Плазмидная конструкция, включающая фрагмент гена UL83 ЦМВ, обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка грр65, содержащего иммунодоминантную область тегументного фосфопротеина ррб5 ЦМВ.

4. Использование рекомбинантных белков ф52, грр65 и грр150 в ИФА, позволяет выявлять антитела, специфичные к цитомегаловирусу человека.

5. Флуоресцентные антисыворотки к рекомбинантным белкам грр65 и грр150 позволяют детектировать цитомегаловирус в клинических образцах с помощью иммунофлуоресцентного анализа in situ.

6. Олигонуклеогидные праймеры к гену UL55, используемые в системе ПЦР, позволяют обнаруживать геномные ДНК различных штаммов и клинических изолятов цитомегаловируса человека.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: «The 22nd International Herpesvirus Workshop», Август 1997 г., La Jolla, California, США; «Юбилейная конференция, посвященная 30-летию журнала Молекулярная биология» Декабрь 1997 г., Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардга РАН, Москва; Advanced Research Workshop «Assessment of Sponsored Biological Research in Russia for the New Millennium», Сентябрь 1999 г., Новосибирск; «Генодиагностика инфекционных болезней», Октябрь 2005 г., Новосибирская обл., санаторий «Сосновка».

По материалам исследований опубликовано 6 тезисов, 6 статей в реферируемых научных журналах и получено 3 патента Российской Федерации. Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 132 страницах, содержит 12 таблиц и 42 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы» и «результаты и обсуждение», «заключение», выводов, списка литературы, приложений. Список литературы включает в себя 202 источника, из них 180 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Теоретический анализ иммуиодоминантных белков ЦМВ

Анализ данных литературы по антигенному спектру белков ЦМВ показал, что среди вирусных антигенов белки рр150, р52 и рр65 являются наиболее перспективными кандидатами для создания на их основе рекомбинантных антигенов. Основанием для такого заключения послужили следующие факты: во-первых, на выше названные антигены в организме человека индуцируется синтез антител с высокими титрами при разных формах течения инфекции, причём эти антитела выявляются, практически, у всех больных; во-вторых, эти антигены в нативной форме, в отличие от гликопротеинов, имеют минимальный уровень перекрестных серологических реакций с антигенами других видов герпесвирусов; в-третьих, в мире накоплен значительный опыт использования различных вариантов этих рекомбинантных белков и олигопептидов на основе их последовательностей в качестве антигенов для создания иммуноферментных диагностических тест-систем, который целесообразно было бы учитывать в нашей работе.

В связи с выше изложенным, все наше внимание было сосредоточено на получении рекомбинантных антигенов на основе белков рр150, р52 и рр65 ЦМВ. Первоочередной задачей нашего исследования стало проведение теоретического анализа аминокислотных последовательностей этих белков с помощью компьютерного моделирования с целью выявления в них потенциальных иммуиодоминантных областей, строго специфичных для ЦМВ. Последующее получение рекомбинантных форм иммуиодоминантных областей, исследуемых антигенов методами генной инженерии, исследование их антигенных свойств на сыворотках лиц с заболеваниями, вызванными ЦМВ и другими видами герпесвирусов человека, и, наконец, оценка диагностической значимости таких рекомбинантных антигенов, представляется, на наш взгляд, наиболее рациональным подходом в конструировании чувствительных и высоко специфичных систем для серодиагностики инфекций, вызываемых ЦМВ.

Главный матричный фосфопротеин рр150

Далее по тексту такие рекомбинантные полипептиды будут нами обозначаться, как грА, т.е. рекомбинантный белок содержащий в своем составе иммунодоминантные области определённого вирусного полипептида (рА).

Компьютерный анализ первичной структуры белка позволил определить локализацию иммунодоминантных областей специфичных для ЦМВ и перспективных для создания на их основе рекомбинантного аналога антигена рр150. Обнаружены три гипотетических антигенных детерминанты, которые отмечены на рисунке 1. Сравнение аминокислотных последовательностей белка рр150 ЦМВ с гомологичным белком рЮО (ННУ-6) показало, что эти антигенные области расположены в негомологичных районах белка. Для клонирования, с целью получения рекомбинантного белка грр150 нами была выбрана нуклеотидная последовательность гена ЦЬ32, кодирующая гидрофильную область 369-760 а.о. (1176 п.о.) белка.

ДНК-связывающий белок р52

Следующим кандидатом для создания рекомбинантного антигена выбрали -ДНК-связывающий белок р52.

Локализацию линейных антигенных детерминант осуществляли в аминокислотной последовательности, полученной из базы данных в^БвРКОТ

Рисунок 1. Профили распределения а-спиральных (Alpha) и р-складчатых (Beta) структур, изгибов полипептидной молекулы (Turn), зарядов (+ -) и гидрофобных областей (Hydro) белка ppl 50. Прямоугольниками темного цвета отмечены вероятные области формирования ядер антигенных эпитопов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках).

(Release 42.0). Анализ вторичной структуры белка позволил определить три наиболее вероятные области формирования линейных антигенных эпитопов. При этом во внимание принимались особенности вторичной структуры (ß-складчатость окружения, отсутствие явных изгибов полипептидной цепи в гидрофильных петлях и наличие гидрофобного окружения), заряд аминокислот и гидрофильные свойства (на рисунке 2, красным помечены максимально гидрофильные участки).

Рисунок 2. Профили распределения а-спиральных (Alpha) и ß-складчатых (Beta) структур, изгибов полипептидной молекулы (Tum), зарядов (+ -) и гидрофобных областей (Hydro) белка р52. Прямоугольниками темного цвета отмечены вероятные области формирования ядер антигенных эпитопов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках).

Были выявлены: гипотетические антигенные детерминанты, ядра эпитопов, трансмембранный домен, сайты адгезии и участок связывания ДНК, а также построена модель конформации белка р52 (рисунок 3).

Таким образом, выяснилось, что лишь два из трех гипотетических эпитопов способны с наибольшей вероятностью быть антигенными детерминантами, т.к. один эпитоп расположен в зоне трансмембранного и ДНК-связывающего домена. Эти данные хорошо согласуются с данными других авторов по локализации антигенно-важных областей белка р52.

«WWao.

.j хп-мало..,' I 4.«.

Рисунок 3. Гипотетическая структура конформации белка р52 на ядерной мембране Agi, Ag2 и Ag3 - гипотетические антигенные эпитопы. NGS - сайт гликозилирования. RGD -сайт адгсши. Спиралевидной линией обозначен трансмембранный участок. Gl - G5 -гидрофобные участки белка состоящие из глициновых повторов

Для получения рекомбинантного антигена гр52 было решено клонировать область гена, кодирующую гидрофильную часть белка с 200 по 341 а.о. (ДНК-фрагмент 731 п.о.), и содержащую два антигенных эпитопа в своем составе. Выбранная область не содержит гомологий с гомологами ДНК-связывающего белка других типов герпесвирусов. Матричный белок тегументарр65

Белок рр65 (белок тегумента вириона, ген UL83) был выбран как следующий кандидат для создания рекомбинантного антигена. Поскольку этот белок считают «маркером патогенности», который индуцирует синтез специфических антител на ранних стадиях продуктивной инфекции.

Для поиска гомологов белка рр65 ЦМВ среди известных белков, и, соответственно, предсказания возможных серологических перекрестов с ними, была построена база данных образов белков, гомологичных рр65. Поиск гомологов рр65 в системе PROF_PAT 1.3 (Bachinsky AG, 2000) выявил одиннадцать аминокислотных последовательностей белков из банка Swiss-Prot: ЦМВ штамм AD-169 и Tovrne, Chimpanzee ЦМВ, Cercopithecine герпесвирус 8, Baboon ЦМВ, Rhesus ЦМВ, Tupaia герпесвирус, Guinea pig ЦМВ, Rat ЦМВ, HHV-6, Mouse ЦМВ (распределены в последовательности уменьшения гомологии). Степень гомологии при этом бралась - 15%. При увеличении

критерия гомологии до 75% в банке образов остаются только гомологи ррб5 ЦМВ для его штаммов.

Компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка рр65 ЦМВ выявил наиболее гидрофильные области и с учетом особенностей вторичной структуры, распределения зарядов и гидрофобности были предсказаны три потенциальные антигенные детерминанты (рисунок 4).

Исходя из полученных данных, область гена белка рр65, кодирующая гидрофильную часть этого белка, с 231 по 551 а.о. и, содержащая все предполагаемые антигенные эпитопы, предсказанных компьютерным анализом, была выбрана нами для амплификации методом ПЦР и последующего клонирования в клетках Е. coli в составе экспрессирующих векторов.

Полученные нами результаты теоретического анализа антигенов рр150, р52 и рр65 ЦМВ позволили перейти к решению следующих задач — разработке стратегии получения методами генной инженерии рекомбинантных антигенов, содержащих аминокислотные последовательности иммунодоминантных областей этих антигенов, исследованию их антигенных свойств на сыворотках лиц с заболеваниями, вызванными ЦМВ и другими видами герпесвирусов человека, и, определению диагностической ценности рекомбинантных полипептидов.

7—э гипотетических детерминант указаны в сносках).

Рисунок 4. Профили распределения а-спиральных (Alpha) и Р-складчатых (Beta) структур,изгибов полипептидной молекулы (Tum), зарядов (+ -) и гидрофобных областей (Hydro) белка рр65. Прямоугольниками темного цвета отмечены вероятные области формирования ядер антигенных эпитопов (последовательности

Клонирование и экспрессия выбранных генов

Выбранные в результате теоретического анализа аминокислотные последовательности иммунодоминантных областей белков ЦМВ послужили базисом для создания соответствующих им рекомбинантных антигенов. Фрагменты гена, кодирующие эти последовательности, клонировали в составе экспрессирующих генно-инженерных конструкций - плазмидных векторов в клетках JE. coli.

Были получены две плазмиды, экспрессирующие в клетках Е. coli рекомбинантные белки грр150 и гр52, слитые с ß-галактозидазой (рисунок 5).

Р(IAO JVM)

/ Г*

PUR290-DB-HIS

6037 bp

P(BLA>—

Bate-gal-LP

Рисунок 5. Физические карты плазмид pUR290-LP и pUR290-DB, обеспечивающих биосинтез в клетках Е coli рекомбинантных антигенов rpplSO и гр52 ЦМВ слитых с ß-галактозидазой.

Для получения чистых форм рекомбинантных белков (не слитых с ß-галактозидазой) клонированные фрагменты переклонировали в составе экспрессирующих плазмидных векторов серии pQE30 (Qiagen, Германия). Эти конструкции (pQE-UL44HCMV(rp52) и pQE-UL32HCMV(rppl50)) обеспечивали биосинтез чистых форм белков в Е. coli, т.е. рекомбинантных полипептидов, содержащих иммунодоминантные области белков р52 и рр150 ЦМВ (рисунок 6).

Т5 prcmotarilac operator >1спмп| / T5 tranutptioii stat - Mkim—--e"N*

SN«-08

API ^ík

рОЕЗО-ОВ HCMV

4106 bp

........^^ Cd

CdE1(od)

Рисунок 6. Физические карты рекомбияантных плазмид pQE-UL32HCMV и pQE-UL44HCMV, обеспечивающих биосинтез рекомбинантяых антигенов гр52 и грр150 ЦМВ в клетках Е. coli

Полученные плазмидные конструкции использовались для получения штаммов Е. coli - продуцентов, синтезирующих рекомбинантные антигены ЦМВ. На рисунке 7 приведена картина электрофоретического разделения в SDS-ПААГ аффинно-очищенных белков и клеточных лизатов клонов Е coli после индукции IPTG, которые были трансформированы плазмидами pUR290-LP, pUR290-DB, pQE-UL44HCMV и pQE-UL32HCMV.

Рисунок 7. Электрофореграмма исследуемых фракций белков. Электрофорез проводили в 10% SDS-ПААГ по Лэмли.

• Дорожки 1 -6: Клеточный лизат бактериального пгтамма-продудента рекомбинантных антигенов.

• Дорожки 1,4: Белковый маркер (Sigma)

• Дорожки 2,3: Слитые с ß-галактозидаэой белки rpplSO и ip52 соответственно.

• Дорожки 5,6: Чистые формы белков rppl 50 и гр52.

• Дорожки 8,9: Хроматографически очищенные белки грр150 и ip52.

• Дорожка 7: Контроль бактериальных белков.

Получив аффинно-очшценные препараты рекомбинантных гр52 и rppl 50 (как отдельно, так и в комбинациях 1:1, 1:3 и 1:5) мы проводили исследование их антигенных свойств и диагностического потенциала методом

123456789

иммуноферментного анализа на сыворотках пациентов. Используя панель ЦМВ-положительных и отрицательных сывороток фирмы «АВВОТ» (США), методами иммуноферментного анализа было показано, что добавление гр52 к грр150 повышало специфичность по панели сывороток суммарного антигена, как к IgG ЦМВ, так и к IgM ЦМВ.

Из 48 ЦМВ-положительных сывороток реагировали со смесью грр150-гр52 все 48, в отличие от 42 сывороток, реагировавших только на грр150 и из 38 ЦМВ-отрицательных сывороток не реагируют со смесью грр150-гр52 все 38, в отличие от 5 из них реагировавших с грр150. Отношение средних арифметических ОП (единицы оптической плотности в реакции ИФА) положительных и отрицательных сывороток позволяет оценить степень абсолютной чувствительности антигена. Чем выше это отношение, тем выше чувствительность. Абсолютная чувствительность к IgG ЦМВ и IgM ЦМВ приведена в Таблице 1.

Таблица 1. Определение абсолютной чувствительности смесей белков грр150:гр52, как

антигенов к и ^М ЦМВ.

ОП для /я<7 Аг-11.1 Аг-2 1:0 -АгЛЗ,:!} Аг-4 3:1 Аг-S 0:1

Среднее арифметическое значение отрицательных сывороток 201 142 193 146

Среднее квадратическое отклонение 75 65 Ь •••З*-'"- 61 53

Ошибка репрезентативности 23 20 18 16

Среднее арифметическое значение положительных сывороток 860 609 Шй 948 490

Среднее квадратическое отклонение 428 279 . 309 - 451 245

Ошибка репрезентативности И 50 -л'55 * 81 44

Ойрщевдеч^Лних полвжителъныК' и отрицательны* сывороток ' * V'kSff: > Л ' 4.91, 3.36;,

ОП для 1цМ Аг-11:1 Аг-2 10 Аг-4 3:1 Аг-S 0:1

Среднее арифметическое значение ОП отрицательных сывороток 311 373 216 185

Среднее квадратическое отклонение 107 133 61 54

Ошибка репрезентативности 21 26 12 10

Среднее арифметическое значение ОП положительных сывороток 635 737 ' ' i , v1 457 384

Среднее квадратическое отклонение 137 143 82 128 147

Ошибка репрезентативности 34 36 20 32 37

Отношение средних положительных, 'А 375. > Д.67 i С '' У w 2-11 2.07

Таблица 2. Оценка степени варьирования выборок для положительных и отрицательных

сывороток при достоверности 99%.

Для выборки положительных и отрицательных сывороток по ДО

Соотношение по белку антигенов грр150 и гр52 Аг-11 1 Аг-21:0 Аг-43,1 Аг-11:1

Среднее арифметическое значение ОП отрицательных сывороток 201 142 193 146

Доверительный интервал среднего арифметического значения ОП отрицательных сывороток ±167.73 ±145.04 Н 35.29 ±118.46

Среднее арифметическое значение ОП положительных сывороток 860 609 Л , 951, 948 490

Доверительный интервал среднего арифметического значения ОП положительных сывороток ±874.87 ±569.18 * 34630.74. ±919.81 ±499.37

Для выборки положительных и отрицательных сывороток по 1дМ

Соотношение по белку антигенов грр150 и гр52 Аг-11 1 Аг-210 чз 'Ж* '/--3 Аг-4 3 1 Аг-11:1

Среднее арифметическое значение ОП отрицательных сывороток 311 373 216 185

Доверительный интервал среднего арифметического значения ОП отрицательных сывороток ±218.30 ±271 81 ±124.46 ±110.91

Среднее арифметическое значение ОП положительных сывороток 635 737 457 384

Доверительный интервал среднего арифметического значения ОП положительных сывороток ±291.59 ±304.85 /V 'л?* ±273.40 ±313.57

Из таблицы 1 видно, что максимальной чувствительностью в ИФА обладает смесь белков грр150 и гр52 в соотношении по белку 5:1. Уровень специфичности оценивался по достоверности различия выборок данных по ОП для положительных и отрицательных сывороток (таблица 2) с помощью статистического ^критерия (критерия Стъюдента). Самой высокой специфичностью при уровне достоверности 99% обладала смесь белков грр150:гр52 в соотношении 5:1.

Таким образом, установлено, что белки реагируют с поликлональными антителами класса и 1{>М сывороток пациентов с заболеваниями,

вызванными ЦМВ. Проведен сравнительный анализ антигенных свойств рекомбинантных белков грр150 и гр52 с использованием панели сывороток к

ЦМВ фирмы ABBOT. На основании полученных данных можно сделать вывод о возможности использования смеси рекомбинантных белков гр52 и грр150 для серодиагностики ЦМВ-специфичных IgM и IgG. Однако, следует отметить ряд выявленных недостатков: некоторую неоднородность результатов, связанную с особенностями сорбции чистых форм белков, а также сравнительно низкий выход рекомбинантных белков.

Использование сочетания рекомбинантных гр52 и грр150 улучшило ситуацию с выявлением IgG и особенно IgM ЦМВ, однако, в некоторых случаях такая смесь оказалась малоэффективной. Поэтому наши дальнейшие усилия были направлены на получение рекомбинантного грр65, который считают «маркером патогенности», который индуцирует синтез специфических антител на ранних стадиях продуктивной инфекции.

Выбранный участок гена UL83, кодирующий гидрофильную часть этого белка с 231 по 551 а.о., и содержащий все предполагаемые антигенные эпитопы белка рр65, клонировали в клетках E.coli в составе экспрессирующего бактериального вектора pUR290-6*his (рисунок 8). Для этого, с целью получения высокоочищенных рекомбинантных антигенов была сконструирована плазмида для интеграции чужеродных генов в рамку считывания (pUR290-

Рисунок 8. Физическая карта плазмиды PUL83HCMV.

б'Ыв), которая заканчивалась последовательностью, кодирующей полигистидиновый тракт. Наличие на С-конце рекомбинантного белка «мишени» из 6-ти гистидиновых остатков позволяет использовать для его очистки металлохелатные сорбенты и получать уровень очистки 90-95%. Наличие в нашей конструкции на С-

конце б-Иэ, в отличие от коммерческих конструкций, в которых

полигистидиновый тракт чаще

расположен на Ы-конце при выделении на металлохелатной смоле достоверно подтверждало полную экспрессию гена, кодирующего рекомбинантный белок.

Были получены клоны Е. соН, содержащие плазмиду со вставкой гена ЦЬ83 рЮЗНСМУ, продуцирующие рекомбинантный химерный белок при индукции

На рисунке 9 приведена картина электрофоретического разделения в SDS-ПААГ белков из клеточных лизатов клонов Е. coli. На этом же рисунке представлен, аффинно-очищеный химерный белок, синтезирующийся в клетках, трансформированных плазмидой pUL83HCMV.

Параллельно были получены аналогичные плазмидные конструкции с фрагментами генов UL32 и UL44, ранее клонированных в pQE и кодирующих иммунодоминантные участки белков рр150 и р52 соответственно. Уменьшение размеров фрагмента ß-галактозидазы осуществляли делецией этого гена по сайту рестриктазы EcoRV и Нра\ соответственно для UL32 и UL44 (рисунок

IPTG.

10).

М 1 2 3 М

Рисунок 9. Электрофореграмма исследуемых фракций

лизатов клеток E.Coli пггамм-продуцента

рекомбииантного грр65. Электрофорез проводили в 10%

SDS-ПААГ по Лэмли.

Дорожка 1 - лизат клеток после индукции.

Дорожка 2 - хроматографически очищенный

рекомбинантный белок.

Дорожка 3 - лизат клеток без индукции.

Дорожки М - маркер молекулярного веса в кДа

(Pharmacia, США).

Рисунок 10. Физические картьгплазмид pUL32HCMV и pUL44HCMV, обеспечивающих биосинтез рекомбннантных антигенов ip52 и tppl 50 ЦМВ в клетках Е coli

Чтобы окончательно убедиться в том, что варианты наших антигенов с фрагментом ß-галактозидазы («химерные») эффективнее в ИФА (за счет лучшей сорбции на полистироле) по сравнению с «чистыми» формами рекомбинантных белков мы сравнивали эти две формы рекомбинантного грр150, как наиболее реагирующего с сыворотками от пациентов с ЦМВ инфекцией. В таблице 3 приведены данные сравнения двух форм грр150 («химерной» и «чистой») на аттестованной панели. Из приведенных данных очевидно, что чувствительность и специфичность нашей «химерной» формы выше «чистой» формы антигена грр150. Эти результаты убеждают в необходимости создания новых рекомбинантных антигенов по разработанной нами стратегии.

В итоге были получены три штамма-продуцента Е. coli, продуцирующие рекомбинантные антигены ЦМВ. На рисунке 11 приведены результаты электрофоретического разделения в SDS-ПААГ аффинно-очищенных химерных белков грр150, гр52 и грр65, синтезирующихся в клетках, трансформированных плазмидами: pUL32HCMV, pUL44HCMV и pUL83HCMV.

Таблица 3. Результаты сравнительного испытания двух форм грр150 в ИФА на панели

сывороток содержащих специфические к ЦМВ.

№ сыворотки грр150 (Fusion) ОП/ОП Крит. rpplSO ОП/ОПкрит. Аттестация сыворотки

1 0,112 0,626 0,123 0,769 OTP

2 0,110 0,615 0,143 0,894 OTP

3 0,076 0,425 0,086 0,538 OTP

4 0,147 0,821 0,106 0,663 OTP

5 0,118 0,659 0,149 0,931 OTP

6 0,160 0,894 0,115 0,719 OTP

7 0,143 0,799 0,173 1,081 OTP

8 0,117 0,654 0,146 0,913 OTP

9 0,069 0,385 0,126 0,788 OTP

10 0,096 0,536 0,097 0,606 OTP

11 0,101 0,564 0,051 0,319 OTP

12 0,098 0,547 0,034 0,213 OTP

13 0,127 0,709 0,017 0,106 OTP

14 0,115 0,642 0,013 0,081 OTP

15 0,111 0,620 0,019 0,119 OTP

16 0,122 0,682 0,049 0,306 ото

17 " 1,659 Л-: 9,268 9,663 . под

' 18- ■ -1' К623 ; 9,067 11,656 пол v.;

. 19 , - , 2,108 ; 11,777 9,363 ■ ..г

20 '' -2 12,235 12,750 Л"

- 21 9,536 штмь* 9,638 Л Щр!.; •

22 ' 2,30г. 1 12,855 tr.-mw 12,500 пел "

23 11,911 mmm * 10,338 „.-«Й&г!'

24 ,- г IShfitJ» 10,475 9,113 .ти..,. .

' > 25 f-, 1;294••'••"" 7,229 8,119 ноя * '

: • 26' V ^ tm-ш 6,899 ЙрЯЙЙ!!!^ 8,525 „ ■UwS?^

,27 2,726 1,663 ■ ПОЯ "" <"

28 " 0,714 ' •..':.< 3,989 3,463 ' ' ' ..f,.-.

29 :" 1,826 '; 10,201 6,238 ВДЛ

30 • " 1,356 7,575 г-щт* 4,106 пая

31, 0,880. „- 4,916 J f, «35?.. 2,231 - воя .

32 4,497 ■ ©,¿92 :• 5,575 пол , :

33 ■ ■v1,283'Ш5 7,168 5,606 ЩЬ

34 6,832 6,306 " .. WW ;:

35 ' " 6,966 m-mw'-^ 4,219 ИОЛ

36 2,832 3,994 ' , ков'4

ОПкрит, 0,179 ч

Примечание: жирным шрифтом выделены данные для «серой» зоны.

Статистический анализ полученных данных показал:

Специфичность по панели = (1Ч/16)*100%:

С (для грр150- (осимерный») = (15/16)*100% = 93,75%, С (для грр150- «чистый») = (12/16)* 100% = 75%.

Чувствительность по панели = (Р/20)*100%:

Ч (для грр150- «химерный») = (20/20)* 100% = 100%, Ч (для грр150- «чистый») = (19/20)* 100% = 95%.

Рисунок 11. Электрофореграмма фракций хроматографически очищенных рекомбинантных белков-антигенов ЦМВ. Электрофорез проводили в 10% SDS-ПААГ по Лэмли.

Дорожки: 1 - грр150; 2- грр65 и 3- ip52.

Дорожка М - маркер молекулярного веса в кДа (Pharmacia,

США).

Для оценки антигенных свойств, полученных рекомбинантных белков грр65 и грр150, использовали, разработанную нами и аттестованную ГИСК (им. Л.А. Тарасевича) панель положительных и отрицательных по ЦМВ маркерам (таблица 4) сывороток.

Методом ИФА было показано, что сам по себе рекомбинантный грр65 не мог являться достаточным критерием как антиген для выявления антител, специфичных к ЦМВ, но в дополнении с рекомбинантным антигеном грр150 значительно увеличивал чувствительность выявления таких сывороток. Отношение средних арифметических ОП положительных и отрицательных сывороток позволяет оценить степень абсолютной чувствительности антигена. Чем выше это отношение, тем выше чувствительность. Из таблицы 4 видно, что смесь белков грр150-грр65 имеет более высокий показатель этого отношения, а значит и большую чувствительность. Уровень специфичности оценивали по количеству выявляемых сывороток в стандартной панели. Он показал такое же значение как, для грр150, так и смеси грр150-грр65, т.е. все отрицательные сыворотки остались отрицательными, а положительные остались положительными.

Зная, что антитела к рр65 чаще всего появляются именно при острой фазе инфекции, мы провели анализ (таблица 5) сывороток больных, перенесших трансплантацию почки, методом ИФА, используя антигены грр150, грр52 и грр65 на присутствие ЦМВ - специфичных 1§М и методом ПЦР.

Таблица 4. Данные ОП в ИФА по панели аттестованных сывороток для ЦМВ.

Панель Отрицательные сыворотки Положительные сыворотки

АГ 1рр150 грр65 грр150-грр65 грр150 грр65 грр150-грр65

1 2 3 4 _ 5 6 7

1 0.350 0.160 0.411 2.255 0.162 2.658

2 0.447 0.217 0.434 1.586 0.342 1.848

3 0.169 0.133 0.215 1.600 0.217 1.792

4 0.254 0.131 0.289 2.094 0.193 2.383

5 0.517 0.158 0.442 0.952 0 276 0.972

6 0.376 0.201 0.388 1.394 0.487 1.764

7 0.263 0.167 0.306 1.996 0.228 2.183

0.226 0.104 0.345 1.491 0.622 1.645

9 0.302 0.136 0.317 1.778 0.503 2.064

10 0.212 0.115 0.357 1.131 0.269 1.291

11 0.136 0.125 0.166 2.212 0.253 2.301

12 0.260 0.126 0.261 0.732 0.186 0.807

13 0.389 0.133 0.270 0.651 0.162 0.804

14 0.359 0.138 0.261 1.172 0.195 1.208

15 0.158 0.133 0.308 0.671 0.204 0.753

16 0.281 0.179 0.271 1.132 0.262 1.167

17 0.679 0.188 0.702

18 1.359 0.538 1.473

19 0.832 0.238 1.017

20 1.238 0.336 1.713

21 0.721 0.235 0.848

Среднее значение 0,294 "■$.147' 0.315 **Ж:

Квадратичное отклонение 0.11 0.03 0.08 0.528 0.134 0.601

Отношения средних, положительных и отрицательных грр150 1рр150-1рр65 4.487 ±0.24 4.745 ± 0.21

При использовании для анализа только грр150 выявлены пять положительных сывороток, однако, при проведении анализа с добавлением гр52 и грр65 количество таких сывороток увеличилось до семи. Из этих результатов видно, что серодиагностика острой инфекции не может быть сделана с применением лишь только одного из антигенов (грр150, гр52 или грр65). Очевидно, что при разных течениях заболевания в острой фазе у разных пациентов присутствуют в крови антитела к каждому из трех этих белков, но с разными титрами. Поэтому только совместное использование всех трех белков в качестве антигенов в ИФА позволит эффективно выявлять характерные для разных фаз инфекции ЦМВ - специфичные антитела.

Таблица 5. Результаты обследования пациентов, перенесших трансплантацию почки. Наличие вируса определяли методом ПЦР, используя специфические к геному ЦМВ праймеры; грр150, гр52, грр65 и грр150/грр65/1р52 - ИФА, где в качестве антигена использовали соответствующий рекомбинантный белок; Культ. АГ - ИФА, где антигеном

служил нативный вирус (ЦМВ АЛ-169).

ПЦР грр150 гр52 грр65 грр150/грр65/гр52 Культ. АГ

1 +++ + +/- п*Зк{-:%»'•<«'4: -

2 - - - - - -

3 ++ +/- ++ '•?"■'. •f'/иЩ'л:, '«Л +/-

4 +/- - - +/-

5 + - + -

6 - - - - - -

7 - - - - ■ -

8 - - - - - -

9 - +/- + +/- in -

10 + - -н- ++ •vli'ii - «-Mf»»**,**?, +/-

11 - - - - - -

12 ++ -т - - Л,? *' ^ Т'* * f -

13 - - - - - -

14 - - - - - -

15 +/- - +/- - - -

Разработка генетического маркера

Из прямых методов определения присутствия инфекции ЦМВ отдельное место занимает метод ПЦР. Существует несколько стратегий использования этого метода в диагностике ЦМВ: простое определение присутствия ДНК ЦМВ в различных тканях или жидкостях человека, количественное определение ДНК и определение присутствия РНК транскриптов в инфицированных тканях. Принцип ПЦР используется и при гибридизационном определении ДНК ЦМВ in situ и в новом подходе в диагностике - биочипе.

При выборе генетического маркера ЦМВ наше внимание было сфокусировано на гене UL55, кодирующем белок gB, который по результатам анализа имеющихся в литературе данных, представлялся нам наиболее вероятным кандидатом на эту роль.

Гликопротеин В является функционально важным белком для репликации вируса, и потому не может бьггь делегирован или модифицирован в жизнеспособном вирусе. Отсюда следует, что ген UL55 является претендентом на роль генетического маркёра ЦМВ и, по-видимому, может служить

специфической мишенью для обнаружения геномных ДНК ЦМВ методом ПЦР. В последние годы ряд исследователей показал, что штаммы цитомегаловируса можно классифицировать по генотипам белка gB. Изменчивость генотипов gB позволяет подразделить все известные последовательности этого гена на четыре группы. Показано, что аминокислотная последовательность gB имеет три вариабельных участка: в N-концевой части белка (47-204 п.н. в кодирующей последовательности гена UL55, если за 1 брать начало инициирующего кодона), район сайта протеолитического расщепления (1319-1620 п.н.) и С-концевая область (2075-2390 п.н.). Эти три вариабельные области могут рекомбинировать между собой в штаммах при смешанной инфекции, тем самым, давая новые варианты белка, где эти три вариабельных участка относятся к разным генотипам. Наряду с вариабельными участками, в этом белке имеются и высоко консервативные области, которые постоянны для всех известных штаммов и изолятов цитомегаловируса человека.

Для подбора праймеров, специфичных для гена UL55 ЦМВ, с помощью компьютерной программы Alignment Service (v.4.1) было проанализировано 70 нуклеотидных последовательностей, кодирующих N-конец gB, разных штаммов, изолятов и ДНК ЦМВ клинических образцов, взятых из базы данных GeneBank. Сравнение аминокислотных последовательностей гликопротеинов gB разных штаммов и изолятов цитомегаловируса, позволило нам выявить консервативные участки этого белка. Районы гена gB, кодирующие эти участки, являются, на наш взгляд, наиболее приемлемыми для выбора праймеров, которые можно было бы использовать для специфического обнаружения геномных ДНК ЦМВ методом ПЦР. Выбранные нами участки для подбора праймеров находились по краям вариабельной области и были одинаковыми для всех 70 изученных последовательностей. Сравнение нуклеотидных последовательностей между штаммами ЦМВ выбранного фрагмента гена UL55 показывает высокий уровень внутривидовой изменчивости для вариабельной области этого участка. На рисунке 12 представлено сравнение 19-ти максимально вариабельных по гену UL55 нуклеотидных последовательностей, выбранных нами консервативных

участков праймирования. Такая же картина складывается для всех 70 проанализированных последовательностей.

1 47 201 249

АР1 69 ат5аАтсслсс*тсте<;твсстаст*стстссаттддсстст5гат АдсейайетдтстдсАдсле1леестсА*стдеоасАтотвстбеедб

С128А.....................................Т.................................Т...................в.

С178А ......................................Т...............С......................................в.

С194А...........................т.....................................................е.

С325А .......................................................С......................................<3.

С327А.................................Т..............С.................................б.

С336А .......................................Т.......................................Т..............в.

С338А ......................................Т.......................................Т..............5.

С354А ..............................................................................Т..............(3.

С359А ................................................Т............................................С.

С076А ...........................................................................Т.............в.

С082А......................................Т...............С.....................................в.

ТОШЕ............................Т...............С....................................С.

5510 ................................Т..............С......................................в.

Ь.Я......................................Т...............С......................................Б.

р.м ...............................т...................................................г.

Б.К .....................................................................Т..............Б.

й.А.......................................Т...............С.....................................в.

А.в.............................................Т.............................................

Рисунок 12. Множественное сравнение нуклеотидных последовательностей выбранного фрагмента гена иЬ55 основных штаммов и изолятов ЦМВ. Точками обозначены нуклеотиды, аналогичные верхней последовательности штамма АШ69. Подчеркнуты комплементарные праймерами районы.

Олигонуклеотиды-праймеры, комплементарные соответствующим консервативным участкам гена ЦЬ55 мы использовали для выявления ДНК ЦМВ.

5' СААТССАССАТСТССТСССТССТА 3' (позиция 4-27 п.н.) 5' АССАСАТСТСССТАСТТСАОССТАСТС 3' (комплементарная позиция 218 — 244 п.н.).

Для отработки ПЦР использовали ДНК, выделенную из зараженной ЦМВ (штамм АО-169) культуры клеток Ь68. Для достижения максимальной чувствительности ПЦР опытным путем определяли температуру отжига и варьировали время полимеризации, а также количество циклов (от 30 до 40). Было показано, что температура отжига может варьировать в пределах от 57 °С до 65 °С без существенного изменения интенсивности ПЦР-сигнала. На рисунке 13 показана электрофореграмма продуктов (244 п.н.) полимеразной цепной реакции ДНК цитомегаловируса при градиенте температуры отжига 57-65°С. Количество циклов амплификации варьировало от 30 до 45.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 М 12 13 14 15 16 17 М 19 20

500 400 300 200

1000

244 п н.

Рисунок 13. Электрофореграмма амплифицируемого фрагмента ДНК ЦМВ в 2% агарганом геле.

Дорожки 1-10: градиент температуры отжига 57° - 65° С; дорожки М: маркер 100 - 1500 п.н. (СибЭнзим, Новосибирск); дорожки 12- 17 ПЦР ДНК герпесвирусов: ВПГ-1,2 (штаммы Ш1 и Ш, АТСС, соответственно), ВЗВ (штамм ЕШеп, АТСС), ЕБВ (штамм АТСС), ЦМВ (штамм АО-169, АТСС), ННУ-6 (штамм 729, АТСС); дорожки 19-20- электрофоре! продуктов ПЦР- исследования клинических образцов.

На этом же рисунке показаны результаты ПЦР, полученные при исследовании 2-х клинических образцов на присутствие ДНК ЦМВ (дорожки 19, 20). Аналогичная картина наблюдалась во всех ПЦР-исследованиях клинического материала. Эти праймеры использовали и для ПЦР, где в качестве матрицы использовали ДНК герпесвирусов (коллекция лаборатории герпесвирусов ГНЦ ВБ «Вектор»): ВПГ-1,2 (штаммы № и Мв, АТСС, соответственно), ВЗВ (штамм ЕШеп, АТСС), ЕБВ (штамм Пар, АТСС), ННУ-6 (штамм Ъ29, АТСС) и ДНК человека. Специфической реакции с этими образцами ДНК не наблюдалось.

Полученные данные по выявлению ДНК ЦМВ достаточно убедительно показывают, что данная пара праймеров высоко специфична и может быть использована в диагностике и для типирования (с помощью секвенирования) штаммов и изолятов ЦМВ. Подобранные нами праймеры позволяют, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения реакции, быстро и

надежно определять наличие ДНК цитомегаловируса в образцах и не дают перекрестных реакций с близкородственными видами. Выявление «маркеров патогенности»

(Получение поликлональных антисывороток для иммунофлуоресцентного метода диагностики цитомегаловируса)

В современно клинике, из-за неоднозначности и сложности диагностики инфекции вызываемой ЦМВ, диагноз острой инфекции, при положительном серологическом ответе, ставится при наличии трех показателей:

- наличие вируса в исследуемом образце, установленное с помощью его выделения на культуре клеток;

- выявление ДНК цитомегаловируса в исследуемом образце;

- наличие антигенемии рр65.

Присутствие рр65 антигена в лейкоцитах выявляют чаще всего с помощью меченных моноклональных антител к этому белку на поверхности периферических лейкоцитов. Некоторые исследователи называют этот антиген лейкоцитарным антигеном или маркером патогенности.

Этот подход к диагностике острой ЦМВ инфекции появился в последние пять лет. И приобрел большую популярность в клинике, как четкий и быстрый метод, коррелирующий с острой стадией развития инфекции.

Необходимость тестировать продуктивную инфекцию ЦМВ в органах и тканях (для нужд трансплантологии) появилась давно. Мы не остались в стороне от этого подхода. Для этого нами были получены гипериммунные кроличьи антисыворотки к рекомбинантным белкам грр150 и грр65. Антисыворотки метили ФИТЦ и проводили иммуногистохимический анализ на препаратах клеток, зараженных ЦМВ с первого по десятый день от момента заражения. Специфическое свечение наблюдали, начиная с 5-х суток (рисунок 14). Максимальное свечение наблюдалось на 7-е сутки. В дальнейшем происходило разрушение монослоя за счет цитопатического действия ЦМВ. Контрольные препараты с незараженным монослоем после обработки флуоресцентными антисыворотками специфического свечения не показывали.

Рисунок 14. Флуорограмма культуры клеток Ь-68, зараженной ЦМВ, штамм АБ169 (увеличение 1х 200). Препараты обработаны флуоресцентной антисывороткой к рекомбинантному белку грр150 (А) и грр65 (Б) ЦМВ (7-е сутки после заражения).

К сожалению, у нас не было возможности диагностировать острую цитомегалию на клинических образцах, полученных от пациентов с продуктивной инфекцией ЦМВ. Однако была проведена работа по выявлению связи инфекции ЦМВ с атеросклерозом у больных с ишемической болезнью сердца, подвергавшихся аортокоронарному шунтированию.

Была выбрана группа пациентов с ишемической болезнью сердца и выраженным атеросклерозом коронарных сосудов. Всем пациентам группы была проведена хирургическая операция аортокоронарного шунтирования, во время которой у всех больных выявлены обширные атеросклеротические повреждения сосудов сердца. Во время операции у всех пациентов брали поврежденные атеросклеротическими бляшками и неповрежденные фрагменты коронарных сосудов, аорты и прилежащих тканей.

Рисунок 15. Флуорограмма фрагмента ушка правого предсердия (увеличение 1х 100). Препарат обработан флуоресцентной антисывороткой к рекомбинантному белку грр150 цитомегаловируса человека. 1-свечение указывает на присутствие антигена ЦМВ в стенке мелкого сосуда; 2-мелкий сосуд без специфического свечения.

Анализ "in situ" биопсийного материала показал, что после обработки срезов полученными нами мечеными антисыворотками, практически во всех пробах наблюдается специфическое свечение. Почти во всех биопсийных образцах было выявлено специфическое свечение в стенках мелких сосудов и vasa vasorum (рисунок 15). И всегда специфическое свечение было связано с тканями атеросклеротических бляшек (рисунок 16), а иногда и с участками неповрежденных атеросклерозом тканей.

Рисунок 16. Флуорограмма фрагмента маммарной артерии, пораженной атеросклеротическим процессом (увеличение 1х 100) Препарат обработан флуоресцентной антисывороткой к рекомбинантному белку грр65 цитомегаловируса человека 1-свечение в этой области интимы указывает на присутствие антигена грр65 цитомегаловируса; 2- область интимы, в которой не выявляется цитомегаловирусный антиген; 3- средний слой стенки артерии.

При этом антисыворотка к грр65 показывала более значительный уровень свечения. Это является дополнительным доказательством продуктивной формы ЦМВ инфекции в тканях сердца, потому что подавляющее число авторов считает белок грр65 «маркером патогенности», т.е. его появление в ткани связывают с продуктивной формой цитомегаловирусной инфекции. Таким образом, мы создали третий необходимый компонент в диагностике острой цитомегалии.

выводы

1. Сконструирован плазмидный вектор, включающий фрагмент гена UL32 ЦМВ, и показано, что он обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка грр150, содержащего иммунодоминантную область главного матричного фосфопротеина рр150 ЦМВ.

2. Сконструирован плазмидный вектор, включающий фрагмент гена UL44 ЦМВ, и показано, что он обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка гр52, содержащего иммунодоминантную область ДНК-связывающего белка р52 ЦМВ.

3. Сконструирован плазмидный вектор, включающий фрагмент гена UL83 ЦМВ, и показано, что он обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка грр65, содержащего иммунодоминантную область фосфопротеина рр65 тегумента ЦМВ.

4. Получены рекомбинантные полипептиды гр52, грр65 и грр150, и показано, что они могут быть использованы для иммуноферментного выявления в исследуемых сыворотках крови антител, специфичных к цитомегаловирусу человека.

5. Получены флуоресцентные моноспецифические кроличьи антисыворотки к рекомбинантным белкам грр65 и грр150 и показана возможность их использования для диагностики ЦМВ инфекции с помощью иммунофлуоресцентного анализа in situ.

6. Олигонуклеотидные праймеры, подобранные к участку гена UL55, кодирующему N-концевой район гликопротеина В ЦМВ, позволяют выявлять геномную ДНК цитомегаловируса человека методом ПЦР.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Плясунов ИВ, Бахтина ММ, Сафронов ПФ,

Гришаев МП, Блинов ВМ, Иванышна ПО. Получение рекомбинантного

антигена белка р52 цитомегаловируса человека (HCMV). Мол генетика

микробгюл и вирусол 2000; 4: 24-29.

2. Суслопаров ИМ, Суслопаров МА, Махова НМ, Загоруйко ПО, Носкова НВ. Выявление ДНК цитомегаловируса человека (Human cytomegalovirus) с помощью ПЦР. Биотехнология 2004; 6: 76-82.

3. Ивченко СН, Суслопаров ИМ, Масьгчева ВИ, Суслопаров МА, Мезенцев АН. Конструирование жидкой панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к цитомегаловирусу человека. Вестник РАМН2004;8:37-39.

4. Суслопаров ИМ, Суслопаров МА, Ивченко СН, Гришаев МП, Смердова МА, Косова ЕЮ, Блинов ВМ, Сараев ДВ, Махова НМ, Носкова НВ. Конструирование рекомбинантного антигена рр65 цитомегаловируса человека и исследование его иммунохимических свойств. Мол генетика микробиол и вирусол 2005; 2: 28-32.

5. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Махова НМ, Омигов ВВ, Литасова ЕЕ, Леган MB, Слайковская ЛЕ, Мироненко СП, Чернявский AM, Лукьянчикова НЛ. Исследование маркеров герпесвирусных инфекций при ишемической болезни сердца (ИБС). Мол генетика микробиол и вирусол 2005; 4: 36-40.

6. Ивченко СН, Суслопаров ИМ, Масычева ВИ, Суслопаров МА, Лосев MB. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека. Сибирский медицинский журнал 2005; 2(20): 53-55.

ПАТЕНТЫ РФ

1. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Плясунов ИВ. Фрагмент гена UL44 цитомегаловируса человека, кодирующий иммунодоминантную часть ДНК-связывающего белка р52(1СР36), и рекомбинантная плазмидная ДНК pUL44HCMV, обеспечивающая экспрессию фрагмента гена UL44 цитомегаловируса человека в клетках бактерий Е. coli. Патент РФ №2151800, БИ №18,27.06.2000.

2. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ. Рекомбинантная плазмидная ДНК pUL83HCMV, обеспечивающая экспрессию в клетках бактерий E.coli рекомбинантного белка, содержащего иммунодоминантную часть фосфопротеина рр65 HCMV и фрагмент бета-галактозидазы. Патент РФ N° 2218408, БИ№ 34, 10.12.2003.

3. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Махова НМ, Плясунов ИВ, Бахтина ММ. Синтетические олигонуклеотиды - праймеры, используемые для выявления ДНК цитомегаловируса человека. Патент РФ № 2164945, БИ№ 10,10.04.2001.

УЧАСТИЕ В КОНФЕРЕНЦИЯХ

1. Sousloparov I. М., Sousloparov М. A., Plyasunov I. V., Blinov V. М. "PCR-mediated cloning and sequensing of UL44-gene's fragment encoding the imiminedominant region of the pp52 human cytomegalovirus", Abstract, The 22nd International Herpesvirus Workshop, Program & Abstracts, August, 1997, La Jolla, California.

2. Sousloparov M. A., Sousloparov I. M., Plyasunov I. V., Blinov V. M. "Elaboration and receipt of recombinant antigens of the human cytomegalovirus", Abstract, The 22nd International Herpesvirus Workshop, Program & Abstracts, August, 1997, La Jolla, California.

3. Юбилейная конференция, посвященная 30-летию журнала "Молекулярная биология" ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ ЦИТОМЕГАЛОВИРУСА ЧЕЛОВЕКА (HCMV). 17-19 декабря 1997г., Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН, Москва.

4. Advanced Research Workshop «Assessment of Sponsored Biological Research in Russia for the New Millennium», September 2-4,1999, Posters:

• MA. Sousloparov, I. M. Sousloparov, N. M. Makhova, M. M. Bakhtina, L. E. Slaykovskaya, P. M. Larionov, M. Karaskov, E. E. Litasova «Investigation of herpesviruses role in pathogenesis of atherosclerosis at ischemic disease of

• M. A. Sousloparov, I. M. Sousloparov, M. M. Bakhtina, I. V. Plyasunov, N. M. г Makhova «Development the recombinant antigenes and PCR- diagnostics of human herpesviruses» 5. Суслопаров M.A., Суслопаров И.М. «Генетические маркеры герпесвирусов человека». Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней», Новосибирская обл., санаторий «Сосновка», 25-27 октября 2005 г.

heart»

Подписано в печать03.03.2006 Формат 60x841/16 Петл.2

Заказ №28 Бумага офсетная, 80 гр/м' Тираж 100

Отпечатано на полиграфическом участке издательского отдела Института катализа им Г.К. Борескова СО РАН 630090, Новосибирск, пр. Академика Лаврентьева, 5

2.00С ft

•-489Î

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суслопаров, Иван Михайлович

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. История открытия цитомегаловируса.

1.2. Эпидемиология цитомегаловирусной инфекции.

1.2.1. Распространение возраст и демография.

1.2.2. Пути передачи.

1.3. Этиология ЦМВ.

1.3.1. Структура вириона, вирусные белки.

1.3.2. Структура генома ЦМВ.

1.3.3. Иммунный ответ на цитомегаловирусную инфекцию.

1.4. Патогенез цитомегаловирусной инфекции.

1.5. Диагностика цитомегаловирусной инфекции и антигены ЦМВ.

1.5.1. Лабораторная диагностика.

1.5.2. Генетические маркеры ЦМВ.

1.5.3. Серодиагностика цитомегаловирусной инфекции.

1.5.3.1. ИФА тест-системы.

1.5.3.2. Антигены ЦМВ.

Глава 2. Материалы и методы.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Теоретический анализ.

3.1.1. Теоретический анализ иммунодоминантных белков ЦМВ.

3.1.1.1. Главный матричный фосфопротеин рр 150.

3.1.1.2. ДНК-связывающий белок р52.

3.1.1.3. Матричный белок тегумента рр65.

3.1.2. Разработка генетического маркера на основе гена иЬ55 ЦМВ.

3.2. Клонирование и экспрессия выбранных генов.

3.3. Разработка генетического маркера.

3.4. Выявление «маркеров патогенности».

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики цитомегаловирусной инфекции"

Актуальность исследования

Цитомегаловирус вызывает различные формы инфекции - субклиническую, хроническую и острую. Цитомегаловирусная инфекция может вызывать, как системные заболевания (мононуклеоз, генерализованная цитомегалия), так и поражение отдельных органов (печень, легкие, головной мозг, сердце, мочеполовые органы и др.).

Многочисленные исследования ряда авторов показали возможность передачи вируса «по вертикали», т.е. трансплацентарное проникновение ЦМВ в плод (внутриутробная инфекция), приводящее к формированию тяжелых пороков развития. Внутриутробная инфекция ЦМВ поражает 0,5 - 5% всех новорожденных (Schopfer К, 1978). Частота передачи вируса плоду, при первичной инфекции, во время беременности составляет 15 -50%. В настоящее время установлено, что одной из главных причин врожденных уродств и поздних выкидышей является вирусоносительство или цитомегаловирусная инфекция у беременных женщин, как клинически выраженная, так и скрытопротекаемая (Pass RF, 1999).

Известно, что антитела к цитомегаловирусу появляются значительно раньше клинических проявлений болезней ассоциированных с цитомегаловирусной инфекцией.

Концентрация антител коррелирует с тяжестью протекания заболевания. До проведения нашего исследования, для выявления антител к ЦМВ в крови пациентов, в России использовался твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) на основе нативных антигенов ЦМВ. Анализ состояния проблем в области разработок способов выявления антител к ЦМВ в сыворотках больных показал, что актуальным и принципиально важным является выбор и поиск высокоспецифичных антигенов ЦМВ, в том числе полученных генно-ииженерным способом. Именно этой проблеме и посвящена настоящая работа, в которой предполагалось оценить пригодность рекомбинантных антигенов, содержащих аминокислотные последовательности иммунодоминантных областей белков ЦМВ для создания высокоэффективных тест-систем диагностики ЦМВ - инфекции.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы являлось получение и сравнительное исследование первичных структур и антигенных свойств некоторых рекомбинантных и нативных белков цитомегаловируса человека для последующей разработки способов диагностики цитомегаловирусной инфекции, основанных на ИФА, ПЦР и методе прямого иммунофлуоресцентного анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

• Сконструировать штаммы E.coli, обеспечивающие стабильную экспрессию рекомбинантных белков гр52, грр65 и грр150, содержащих в своем составе аминокислотные последовательности иммунодоминантных областей антигенов р52, рр65 и рр150 ЦМВ соответственно;

• Осуществить выбор и тестирование олигонуклеотидов-праймеров для специфического выявления ДНК ЦМВ в клинических образцах с помощью ПЦР и оптимизировать условия реакции;

Научная новизна

Сконструирован бактериальный экспрессирующий вектор, кодирующий последовательность из шести гистидипов на С-копце целевого рекомбипаптпого белка, которая является мишенью для аффинной очистки на металлохелатных сорбентах.

Показано, что меченые моноспецифические кроличьи аптисыворотки, полученные к рекомбинантным белкам грр150 и грр65, позволяют с помощью иммунофлуоресцентного анализа диагностировать острую стадию ЦМВ инфекции.

Олигонуклеотидпые праймеры, подобранные к участку гена UL55, кодирующему N-концевой район гликопротеина В ЦМВ, пригодны для специфического выявления геномных ДНК различных штаммов и клинических изолятов цитомегаловируса человека методом ПЦР.

Практическая ценность работы

В настоящее время в диагностике латентных вирусных инфекций в России главное место принадлежит иммуноферментиому анализу (ИФА), ввиду его общедоступности. Следует отметить, что сертифицировано лишь ограниченное количество отечественных ИФА тест-систем для выявления антител к цитомегаловирусу, а импортные тест-системы имеют очень высокую стоимость. Поэтому практическая ценность данного исследования заключается, прежде всего, в получении рекомбинантных антигенов, пригодных для разработки на их основе более дешевых отечественных диагностических систем, не уступающих импортным аналогам.

Сконструированные в данной работе рекомбинантные антигены в настоящее время используются такими отечественными производителями диагностических наборов, как ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ЗАО «Медико-биологический союз» (Новосибирск) и ЗАО «Имди» (Новосибирск) (Суслопаров МА, 2000; Суслопаров ИМ, 2005; Ивченко СН, 2005). Разработана, сконструирована и утверждена в ГИСК им. J1.A. Тарасевича стандартная панель сывороток для определения антител класса G к цитомегаловирусу человека (Ивченко СН, 2004).

Олигонуклеотидые праймеры, подобранные к участку гена UL55, кодирующему N-концевой район гликопротеина В ЦМВ, могут быть использованы для создания диагностических ПЦР тест-систем, а также для типирования изолятов цитомегаловируса по генотипам gB.

Положения, выносимые на защиту

4. Использование рекомбинантных белков гр52, грр65 и грр150 в ИФА позволяет выявлять антитела, специфичные к цитомегаловирусу человека.

5. Флуоресцентные антисыворотки к рекомбинантным белкам грр65 и rppl 50 позволяют детектировать цитомегаловирус в клинических образцах с помощью иммунофлуоресцентпого анализа in situ.

6. Олигонуклеотидные праймеры к гену UL55, используемые в системе ПЦР, позволяют обнаруживать геномные ДНК различных штаммов и клинических изолятов цитомегаловируса человека.

Конкретное участие автора в получении результатов

Автор принимал личное участие в проведении всех экспериментальных и теоретических исследований, приведенных в диссертации. Кроме того, автор участвовал в совместных работах по иммуноферментному анализу сывороток пациентов с сотрудниками других институтов и производственных фирм.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях и симпозиумах:

1. Sousloparov I. М., Sousloparov М. A., Plyasunov I. V., Blinov V. М. "PCR-mediated cloning and sequensing of UL44-gene's fragment encoding the immunedominant region of the pp52 human cytomegalovirus", Abstract, The 22nd International Herpesvirus Workshop, Program & Abstracts, August, 1997, La Jolla, California.

4. Advanced Research Workshop «Assessment of Sponsored Biological Research in Russia for the New Millennium», September 2-4,1999, Posters:

• M. A. Sousloparov, I. M. Sousloparov, N. M. Makhova, M. M. Bakhtina, L. E. Slaykovskaya, P. M. Larionov, M. Karaskov, E. E. Litasova «Investigation of herpesviruses role in pathogenesis of atherosclerosis at ischemic disease of heart»

• M. A. Sousloparov, I. M. Sousloparov, M. M. Bakhtina, I. V. Plyasunov, N. M. Makhova «Development the recombinant antigenes and PCR- diagnostics of human herpesviruses»

5. Суслопаров M.A., Суслопаров И.М. «Генетические маркеры герпесвирусов человека». Российская научно-практическая конференция «Генодиагностика инфекционных болезней», Новосибирская обл., санаторий «Сосновка», 25-27 октября 2005 г.

По материалам исследований опубликовано 6 статей в реферируемых научных журналах:

1. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Плясунов ИВ, Бахтина ММ, Сафропов ПФ, Гришаев МП, Блинов ВМ, Иванькина ТЮ. Получение рекомбинантного антигена белка р52 цитомегаловируса человека (HCMV). Мол генетика микробиол и вирусол 2000; 4: 24-29.

2. Суслопаров ИМ, Суслопаров МА, Махова НМ, Загоруйко ТЮ, Носкова НВ. Выявление ДНК цитомегаловируса человека (Human cytomegalovirus) с помощью ПЦР. Биотехнология 2004; 6: 76-82.

3. Ивченко СН, Суслопаров ИМ, Масычева ВИ, Суслопаров МА, Мезенцев АН. Конструирование жидкой панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к цитомегаловирусу человека. Вестник Российской академии медицинских наук 2004; 8: 37-39.

Получено 3 патента Российской Федерации:

1. Суслопаров MA, Суслопаров ИМ, Плясунов ИВ. Фрагмент гена UL44 цитомегаловируса человека, кодирующий иммунодомипантную часть ДНК-связывающего белка р52(1СР36), и рекомбинантная плазмидная ДНК pUL44HCMV, обеспечивающая экспрессию фрагмента гена UL44 цитомегаловируса человека в клетках бактерий Escherichia coli. Патент РФ №2151800, БИ №18,27.06.2000.

Работа выполнялась в 1995-2005 г.г. в рамках ряда научно-исследовательских и научно-технических программ ГНЦ ВБ "Вектор". Все экспериментальные работы проводились в рамках научно-исследовательских проектов, утвержденных Этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор» (IRB 00001360):

1) «Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики герпесвирусов» (утвержден 03.06.2003),

2) «Клинико-диагностические особенности течения генитальиой герпетической инфекции в Новосибирске» (утвержден 19.03.2003).

На разных этапах выполнения работы в ней принимали участие сотрудники ГНЦ ВБ «Вектор»: М.А. Суслопаров, С.Н. Ивченко, Н.М. Махова, И.В. Плясунов, М.М. Бахтина, П.Ф. Сафронов, В.М. Блинов. А.А Гуськов и другие, а также врач дерматовенеролог МСЧ 168 Т.Ю Загоруйко. В работе также принимали участие сотрудники производственных фирм: ЗАО «Вектор-Бест»- М.П. Гришаев, М.А. Смердова, Е.Ю. Косова, ЗАО «Медикобиологический союз»- О.Н. Надточий, ЗАО «Имди»- В.Г. Майданюк. Сотрудники НИИ патологии кровообращения им. Академика E.H. Мешалкина: Литасова Е.Е., Леган М.В., Слайковская Л.Е., Мироненко С.П., Чернявский A.M., Лукьянчикова Н.Л. Всем, принимавшим участие в данной работе, автор выражает искреннюю признательность. Автор благодарит всех своих коллег, принимавших участие в работе.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 134 страницах, содержит 12 таблиц и 42 рисунка. Состоит из введения, обзора литературы, глав «материалы и методы» и «результаты и обсуждение», «заключение», выводов, списка литературы, приложений. Список литературы включает в себя 208 источников, из них 185 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Суслопаров, Иван Михайлович

Выводы

1. Сконструирован плазмидный вектор, включающий фрагмент гена UL32 ЦМВ, и показано, что он обеспечивает биосинтез в клетках Е. coli рекомбинантного белка грр150, содержащего иммуподоминантную область главного матричного фосфопротеина рр150 ЦМВ.

4. Получены рекомбинантные полипептиды гр52, грр65 и грр150 и показано, что они могут быть использованы для иммуноферментного выявления в исследуемых сыворотках крови антител, специфичных к цитомегаловирусу человека.

5. Получены флуоресцентные моноспецифические кроличьи аитисыворотки к рекомбинантным белкам грр65 и rppl 50 и показана возможность их использования для диагностики ЦМВ инфекции с помощью иммунофлуоресцентного анализа in situ.

6. Олигопуклеотидные праймеры, подобранные к участку гена UL55, кодирующему N-концевой район гликопротеина В ЦМВ, позволяют выявлять геномную ДНК цитомегаловируса человека методом ПЦР.

Заключение

В России последнее десятилетие наблюдается рост числа заболеваний вызывающих иммунодефицит. В связи с этим увеличивается необходимость качественной и удобной диагностики оппортунистических инфекций связанных с иммунодефицитом. Такая диагностика полезна для улучшения качества современного акушерства где есть необходимость в уменьшении числа мертворожденных детей и врожденных патологий плода одной из причин которых, является инфекция ЦМВ. Иммунофермептная диагностика становится востребованной в области трансплантологии, в связи с ростом количества трансплантаций в современных клиииках. Поэтому диагностика цитомегаловирусной инфекции становится все актуальнее.

В ходе получения новых знаний о цитомегаловирусной инфекции и появления более тонких и точных методов, диагностика последнее десятилетие тоже активно эволюционировала. Стало ясно, что использование для ИФА анализа нативных антигенов приводит к неоднозначности, и потому должно быть заменено или дополнено более специфичными антигенами. Получение таких антигенов на основе рекомбинантных технологий приобретает все большую популярность среди исследователей. Серологическая диагностика не может являться достаточным критерием оценки инфекционного процесса, и потому, ИФА анализ необходимо дополнить другими прямыми методами выявления патогена и его форм в организме, такими как ПЦР-анализ и другими прямыми методами обнаружения антигенов вируса.

В результате проделанной работы, на основе анализа литературы, был осуществлен выбор белков ЦМВ, видоспецифичных и обладающих выраженными антигенными свойствами для создания на их основе рекомбинантных антигенов. Проведен анализ антигенной структуры этих белков и выбраны участки генов, кодирующие их антигенные детерминанты. Проведено клонирование и получение штаммов-продуцентов Е.СоИ рекомбинантных антигенов ЦМВ. С помощью ИФА, используя референс панели сывороток и образцы от больных с разными формами заболевания, были изучены антигенные свойства полученных рекомбинантных белков. Показано, что созданная комбинация антигенов способна выявлять ЦМВ специфические IgG и IgM в сыворотках крови пациентов с уровнем чувствительности и специфичности 95-99%. Разработан метод иммунофлуоресцентного анализа in situ диагностики острой стадии ЦМВ инфекции с помощью меченных флуоресцентных антисывороток к рекомбинантным антигенам ppl 50 и рр65. Разработаны олигонуклеотиды-праймеры для ПЦР диагностики геномной ДНК цитомегаловируса.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суслопаров, Иван Михайлович, Кольцово

1. Гловер ДМ (под ред). Клонирование ДНК Методы. Мир. 1988; 140-174.

2. Гловер ДМ (под ред). Новое в клонировании ДНК -Методы. Мир. 1989; 138-170.

3. Дейвис КМ (под ред). Анализ генома. Методы. Мир. 1990: 176-190.

4. Ивченко СН, Суслопаров ИМ, Масычева ВИ, Суслопаров МА, Лосев MB. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека. Сибирский медицинский эюурнал 2005; 2(20): 53-55.

5. Ивченко СН, Суслопаров ИМ, Масычева ВИ, Суслопаров МА, Мезенцев АН. Конструирование жидкой панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к цитомегаловирусу человека. Вестник Российской академии медицинских наук 2004; 8: 37-39.

6. Каражас НВ. Цитомегаловирусная инфекция современная диагностика. Клиническая лабораторная диагностика 1998; Т.2: 16-17.

7. Максам А, Гилберт У. Метод определения последовательности ДНК (секвенирования) после введения метки в конец молекулы и расщепления ее по основаниям. Молекуляр Биология 1986; 20(3): 581-638.

8. Максютов A3, Загребельный СН. Антигенные детерминанты белков. Гуморальный иммунный ответ. Молекулярная биология 1993; 27(5): 980-991.

9. Маниатис Т, Фрич Э, Сэмбрук Дж. Молекуляр. клонирование. М.: Мир. 1984: 280-282.

10. Мейхи БМ (под ред). Вирусология Методы. Мир. 1988: 287-295.

11. Носков ФС. Метод флюоресцирующих антител. Иммунологическая диагностика вирусных инфекций. Медицина. 1985: 250-281.

12. Остерман JIA. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование. Наука. 1981:136.

13. Суслопаров ИМ, Суслопаров МА, Махова НМ, Загоруйко ТЮ, Носкова НВ. Выявление ДНК цитомегаловируса человека (Human cytomegalovirus) с помощью ПЦР. Биотехнология 2004; 6: 76-82.

14. Суслопаров МА, Белавин ПА, Крендельщиков АВ, Бедристов АИ, Бахтина ММ и др. Клонирование и определение первичной структуры генов белков IE2 и РР150 цитомегаловируса человека. Мол генетика микробиол и вирусол 1996; 1: 32- 35.

15. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Махова НМ, Омигов ВВ, Литасова ЕЕ, Леган MB, Слайковская ЛЕ, Мироненко СП, Чернявский AM, Лукьянчикова НЛ.

16. Исследование маркеров герпесвирусных инфекций при ишемической болезни сердца (ИБС). Мол генетика микробиол и вирусол 2005; 4: 36-40.

17. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Махова НМ, Плясунов ИВ, Бахтина ММ. Синтетические олигонуклеотиды праймеры, используемые для выявления ДНК цитомегаловируса человека. Патент РФ № 2164945, БИ№ 10, 10.04.2001 г.

18. Суслопаров МА, Суслопаров ИМ, Плясунов ИВ, Бахтина ММ, Сафронов ПФ, Гришаев МП, Блинов ВМ, Иванькина ТЮ. Получение рекомбинантного антигена белка р52 цитомегаловируса человека (HCMV). Мол генетика микробиол и вирусол 2000; 4: 24-29.

19. Фисенко АП, Комолов ИС. Современные способы обнаружения цитомегаловирусной инфекции у человека. Биотехнология 1996; Т.5: 3-10.

20. Adler SP, Finney JW, Manganello AM, Best AM. Prevention of child-to-mother transmission of cytomegalovirus by changing behaviors: A randomized controlled trial. Pediatr Infect Dis J1996; 15:240-246.

21. Altschuh D, Dubs MC, Weiss E, Zeder-Lutz G, Van Regenmortel MH. Determination of kinetic constants for the interaction between a monoclonal antibody and peptides using surface plasmon resonance. Biochemistry 1992; 31(27): 6298-6304.

22. Arens M. Methods for Subtyping and Molecular Comparison of Human Viral Genomes. Clin Microbiol Reviews 1999; 12(4): 612-626.

23. Arnon R. Synthetic peptides as the basis for vaccine design. Mol Immunol 1991; 28(3): 209-215.

24. Atassi MZ. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. EurJBiochem 1984; 145(1): 1-20.

25. Awasthi S, Isler JA, Alwine JC. Analysis of splice variants of the immediate-early 1 region of human cytomegalovirus. J Virol 2004; 78(15): 8191-200.

26. Bachinsky AG, Frolov AS, Naumochkin AN, Nizolenko LP, Yarigin AA. PROF PAT 1.3: updated database of patterns used to detect local similarities. Bioinformatics 2000; 16(4): 358-66.

27. Beninga J, Kropff B, Mach M. Comparative analysis of fourteen individual human cytomegalovirus proteins for helper T cell response. J Gen Virol 1995; 76: 153- 160.

28. Berzofsky JA. Intrinsic and extrinsic factors in protein antigenic structure. Science 1985; 229(4717): 932-940.

29. Bhella D, Rixon FJ, Dargan DJ. Cryomicroscopy of human cytomegalovirus virions reveals more densely packed genomic DNA than in herpes simplex virus type 1 .J Mol Biol 2000;295:155-161.

30. Birnboim HC, Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant Plasmid DNA. Nucleic Acids Res 1979; 7(6): 1513-23.

31. Bodaghi B, Dal Monte P, Picard L, Bessia C, Michelson S. Human cytomegalovirus protein pp65 (ppUL83) plays a role in inhibition of host cell protein synthesis. Scand J Infect Dis 1995; Suppl 99: 41-42.

32. Boeckh M, Bowden RA, Goodrich JM, et al. Cytomegalovirus antigen detection in peripheral blood leukocytes after allogeneic marrow transplantation. Blood 1992; 80: 1358-1364.

33. Boeckmann B, Bairoch A, Apweiler R, Blatter MC, Estreicher A, Gasteiger E, Martin MJ, Michoud K, O'Donovan C, Phan I, Pilbout S, Schneider M. The SWISS-PROT protein knowledgebase and its supplement TrEMBL in 2003. Nucleic Acids Res 2003; 31(1): 365-70.

34. Boppana SB, Fowler KB, Britt WJ, et al. Symptomatic congenital cytomegalovirus infection in infants born to mothers with preexisting immunity to cytomegalovirus. Pediatrics 1999;104:55-60.

35. Britt WJ, Vugler LG. Oligomerization of the human cytomegalovirus major envelope glycoprotein complex gB (gp55-l 16). J Virol 1992; 66(11): 6747-54.43.

Информация о работе

Суслопаров, Иван Михайлович
кандидата биологических наук
Кольцово, 2006
ВАК 03.00.03

Диссертация

Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики цитомегаловирусной инфекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы