Разработка стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к цитомегаловирусу человека

Ивченко, Светлана Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разработка стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к цитомегаловирусу человека
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к цитомегаловирусу человека"

На правах рукописи

□□3456018

Ивченко Светлана Николаевна

РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНОЙ ПАНЕЛИ СЫВОРОТОК, СОДЕРЖАЩИХ И НЕ СОДЕРЖАЩИХ \дв К ЦИТОМЕГАЛОВИРУСУ ЧЕЛОВЕКА

03.00.23. -биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ ДИСССЕРТАЦИИ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцове - 2008

003456018

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Михаил Александрович Суслопаров

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Юрий Серафимович Аликин

кандидат биологических наук Софья Викторовна Павлова

Ведущая организация

НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Защита состоится «19» декабря 2008 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д.208.020.01 при ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел. (383) 336-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

74-28.

Ученый секретарь диссертационного совета

Л.И. Карпенко

Введение Актуальность работы

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) имеет различные формы - латентную, субклиническую, острую и хроническую. ЦМВИ приводит как к системным заболеваниям (мононуклеоз, генерализованная цитомегалия), так и к поражению отдельных органов (печень, легкие, головной мозг и др.). Этой инфекцией страдает 0,5 -5% всех новорожденных. Частота передачи вируса плоду при первичной инфекции женщин во время беременности составляет 15 - 50%. В настоящее время установлено, что одной из главных причин врожденных уродств, поздних выкидышей и дефективных новорожденных является внутриутробная ЦМВИ у беременных женщин.

Характерной особенностью для цитомегаловируса (ЦМВ) является способность долго сохраняться и, возможно, репродуцироваться в лейкоцитах циркулирующей крови внешне здоровых людей, в виде как клинически выраженной, так и скрыто протекаемой инфекции или вирусоносительства.

Известно, что антитела к цитомегаловирусу появляются значительно раньше клинических проявлений болезней, ассоциированных с цитомегалией. Концентрация антител коррелирует с тяжестью протекания заболевания. В настоящее время для выявления антител к ЦМВ широко используется твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА), который является одним из наиболее распространенных в нашей стране и за рубежом эффективных методов диагностики различных инфекционных заболеваний человека. Использование различных антигенов в тест-системах разных производителей приводит к тому, что результаты ИФА сывороток больных отличаются на 20-30% при определении специфических антител. Для определения достоверности результатов ИФА, как положительных, так и отрицательных, получаемых с помощью определенной тест-системы, используют различные контрольные панели сывороток.

Для контроля специфичности и чувствительности иммуноферменгных тест-систем используют стандартные панели сывороток. Существуют два вида стандартных панелей - лиофилизированные и жидкие. Наибольшей популярностью в настоящее время пользуются лиофилизированные панели сывороток, поскольку они обладают рядом преимуществ: длительный срок хранения, способность сохранять свойства при перепаде температур. До проведения наших исследований отечественные контрольные панели сывороток к ЦМВ, в Российской Федерации отсутствовали. Поэтому настоящая работа посвящена созданию стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ЦМВ (СП). В качестве основного метода отбора сывороток, разработали

лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы, с применением рекомбинаитных белков: рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы являются комплексные исследования по разработке методологии создания стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса в к цитомегаловирусу, для контроля достоверности результатов ИФА, получаемых с помощью коммерческих тест-систем.

Для выполнения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать оптимальные методы отбора положительных и отрицательных образцов панели сывороток.

2. Разработать технологию изготовления панели сывороток, включающую оптимальные условия консервации, стабилизации, стерилизации образцов сывороток.

3. Создать жидкую и лиофилизированную панели сывороток, содержащих и не содержащих ^О к цитомегаловирусу, соответствующие по стабильности требованиям ВОЗ.

4. Провести всесторонние лабораторные испытания созданной лиофилизированной панели сывороток, разработать проект научно-технической документации и провести государственные испытания и аттестацию в качестве ОСО в ГИСКе им. Л.А. Тарасевича.

Научная новизна и практическая ценность работы

1. Разработан метод отбора образцов для конструирования стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ЦМВ. Впервые в России для отбора сывороток были использованы рекомбинантные аналоги антигенов ЦМВ (рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65).

2. Разработан лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы для определения ДО к цитомегаловирусу человека на основе трех рекомбинаитных антигенов ЦМВ рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65.

3. Выбраны и всесторонне охарактеризованы 36 сывороток для формирования стандартных панелей сывороток, содержащих и не содержащих антитела ^С к ЦМВ.

4. Отработана технология получения жидкой панели сывороток, по своей стабильности соответствующая требованиям ВОЗ к биологическим препаратам.

5. Разработана технология получения лиофилизированной стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела IgG к ЦМВ. Данная панель прошла, государственные испытания и является первой в РФ зарегистрированной стандартной панелью, используемой в качестве отраслевого стандартного образца. Было выпущено 3 серии стандартной панели.

Рабата выполнена в 1999-2005 гг. в ГНЦ ВБ «Вектор» и ЗАО «Медико-Биологический Союз». Все экспериментальные исследования проводились в рамках научно-исследовательского проекта, утвержденного Этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор» (№ IRB 00001360): «Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики герпесвирусов» (утвержден 03.06.2003).

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 154 страницах, содержит 35 таблиц, 21 рисунок. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов, списка литературы, приложений. Список литературы включает в себя 165 источников, из них 127 иностранных.

Результаты и обсуждение Разработка метода отбора сывороток для создания панели образцов, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу человека Основной целью данной работы было создание стандартной панели сывороток, содержащей и не содержащей антитела класса G к цитомегаловирусу человека, для оценки качества иммуноферментных тест-систем.

На первом этапе работы был проведен выбор критериев отбора сывороток для панели. Основным инструментом отбора сывороток для стандартной панели может быть тест-система, обладающая высокой чувствительностью (Ч) и специфичностью (С) при выявлении специфических антител. Поэтому первой задачей нашего исследования стала разработка метода - собственного лабораторного варианта иммуноферментной тест-системы, на основе рекомбинантных антигенов, выявляющей специфические к цитомегаловирусу иммуноглобулины класса G в сыворотках больных.

Исследование антигенных свойств рекомбинантных аналогов белков рр150,

р52 н рр65 цитомегяловнруса человека В основу разрабатываемого метода отбора сывороток был. положен твердофазный непрямой ИФА, с использованием полистирольных планшетов, сенсибилизированных рекомбинантными аналогами антигенов ЦМВ.

В соответствии с литературными данными для этой цели были изучены, рекомбинантные аналоги главного матричного фосфопротеина pplSO и ДНК-

связывающего белка р52 цитомегаловируса, рек-рр150 и рек-р52, соответственно. А также, белок рр65 (рек-рр65), который считают «маркером патогенное!и», и который индуцирует синтез специфических антител на ранних стадиях продуктивной инфекции.

На рисунке 1 приведена картина 8П8-ПААГ электрофоретического разделения аффинно-очищенных химерных белков рек-рр65, рек-рр150 и рек-р52, которые использовались в данной работе

М 1 2 3 М

Рисунок 1. Анализ хроматографически очищенных

рекомбинантных белков ЦМВ в 10% SDS-ПААГ:

1-рек-рр150 (112кДа); 2-рек-рр65 (65-67кДа) и 3-рек-р52 (46,ЗкДа).

М-набор белков-маркеров молекулярного веса в кДа (Pharmacia,

США).

Для оценки антигенных свойств полученных рекомбинантных белков рек-рр65, рек-рр150 и рек-р52 использовали рабочую панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу человека (РП).

Для исследования был получен рекомбинантный антиген, аналог ДНК-связывающего белка р52 цитомегаловируса, рек-р52. При сорбции одного рек-р52 4=80%, четыре положительных сыворотки из двадцати показывали отрицательный результат. Применение смеси рекомбинантных белков рек-р52 и рек-рр150 показывает 4=94%. Использование смеси рекомбинантных белков (рек-р52 и с рек-рр150) в ИФА повышало чувегвительность при выявлении IgG, однако в некоторых случаях этот иммуносорбент оказался малоэффективным. Поэтому стала очевидной необходимость поиска других антигенов для повышения диагностических свойств.

Применение в ИФА рекомбинантного рр65 позволяет выявлять антитела, индуцированные на ранней стадии цитомегалии, а в смеси с рек-рр150 значительно увеличивает чувствительность и специфичность выявления таких сывороток. Для одного рек-рр150 С=95,7%, а для смеси рек-рр150-рек-рр65 С=96,3%.

Совместное использование антигенов, взаимно дополняющих друг друга, позволяет значительно повысить эффективность ИФА для выявления антител к ЦМВ. При использовании в качестве иммуносорбента в тест-системе смеси трех антигенов: рек-рр150 и смеси антигенов: рек-рр150+рек-рр65+рек-р52, получили Ч=(98-100)% и С={98-100)%.

Следующей задачей был выбор оптимального соотношения антигенов для использования в ИФА, которое позволит «увеличить «расстояние»» между положительными и отрицательными сыворотками.

Для этого были использованы положительные сыворотки из РП, которые имели наиболее низкие значения оптической плотности (ОП) и отрицательные с ОП, близкой к значению ОПкрит.

В таблице 1 собраны результаты ИФА наиболее «проблемных» сывороток для тест-систем Российских производителей. Сравнивая полученные значения можно сказать, что использование рекомбинантного рек-рр150 для выявления ^С ведет к повышению специфичности теста. Нативные антигены выявляют пять сывороток как ложноотрицателыше из восьми, тогда как рек-рр150 имеет ложный результат только в трех сыворотках. Использование смеси рек-рр150 с рек-рр65 и рек-р52 в качестве антигена в ИФА позволяет повысить чувствительность серодиагностики. Соотношение значений ОП «проблемных» положительных к отрицательным сывороткам имело более высокое значение 11,58 (таблица 1).

Таким образом, нами впервые в ИФА для определения иммуноглобулинов класса в к ЦМВ была использована смесь одновременно трех (рек-рр150, рек-рр65, рек-р52) рекомбинантных антигенов для сорбции на иммуносорбенте.

Чтобы использовать иммуноферментный набор реагентов, как основной инструмент для отбора сывороток, необходима также стабильность получаемых результатов ОП от серии к серии. Поэтому мы создали лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы.

Оптимизация условий иммуноферментного анализа

За основу была принята традиционная схема непрямого ИФА для выявления антител. Прежде всего, подобрали такое разведение сыворотки больных с ЦМВИ, при котором бы регистрировалось максимальное значение отношения сигаал/фон. В опытах

Таблица 1

Результаты ОП в ИФА наиболее «проблемных» сывороток из РП с использованием разных антигенов для сорбции на иммуносорбенте

№ сыворотки антиген

вирусный рр 150 вирусный рр 150 (лизат) рек-рр150 рек-р52 рек-рр65 смесь рек-рр150 и рек-р52 (3:1) смесь рек-рр150ирек-р65 (3:1) смесь рек-рр65 и рек-р52 (1:1) смесь рек-рр150, рек-рр65 и рек-р52 (3:1:1)

отрицательные

1 6 '■:■,>;■■■' 8 ; :;;•■■■ 9 у;:^;-. 10

0,167 0,204 0,130 0,161 0,143 0,166 0,143 0,164 0,111

2 ■. . 0,214 0,222 0.084 0,105 0,118 0,086 0,118 0,111 0,080

0,134 0,144 0,043 0,107 0,106 0,129 0,106 0,102 0.074

0,310 0,312 0,084 0,155 ,.■/: 0,141 0.140 0,133 0,142 : 0,095

0,164 .г 0,151 0,092 0,158 0,116 0,158 0,110 0,135 0Р96

10 0,227 0,276 0,131 0,222 0,180 0,191 0,155 0,196 0,124

11 0,216 0,229 0,147 0,184 , 0,178 0,155 0,163 0,162 0,145 -

12 0,174 0,!45 0,090 0,220 0,209 0,200 0,137 0,201 0,131

среднее значение отрицат. 0,201 0,202 0,100 0,164 0,149 0,153 0,133 0,152 0,107

средне квадратичное оталонение отрицат. 0,054 0,064 0,034 0,044 0,037 0,036 0,021 0,036 0,025

положительные

25 1,817 1,999 1,193 0,804 1,229 1,222 1,146 0,904 1,954

26 1,166 1,574 1,159 0,628 0,969 0,800 1,147 0,845 1,653

Продолжение Таблицы 1

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10

27 0,964 1,256 0,245 0,984 0,436 1,312 0,541 0,621 1,225

28 0,349 0,887 0,558 0,189 0,294 0,604 0,504 0,241 1,329

29 0,525 0,921 0,335 0,490 0,888 0,342 0,766 0,641 1,146

30 1,124 1,182 0,679 одзз 0,796 0,756 0,820 0,387 1,001

31 0,804 0,423 0,798 0,832 0,446 0,842 0,674 0,674 . 1,147

32 0,502 0,645 0,788 0,357 0,605 0,543 0,783 0,700 1,276

33 0,510 0,418 0,503 0,652 0,733 0,601 0,704 0,736 0,969

34 0,704 0,293 1,066 0,600 0,422 1,010 0,901 0,569 0,820

35 1,375 1,631 1,225 0Д36 0,286 0,914 1,000 0,237 1,832

36 0,474 ■ 0,321 0,301 0,187 0,551 0,265 0,497 0,412 0,513

ОПкрит 0,238 0,223 0,148 0,210 0,202 0,211 0,186 0,199 0,189

среднее значение положит. 0,860 0,963 0,738 0,516 0,638 0,768 0,790 0,581 1,239

стандартное отклонение положит. 0,424 0,547 0,344 0,265 0,278 0,307 0,217 0,209 0,397

отношение средних положит, к средним отрицат. 4,28 4,77 7,37 3,15 4,28 5,01 5,94 3,83 11,58

это отношение оказалось максимальным при разведении сывороток 1:100 (рисунок 2), и поэтому в дальнейших исследованиях для выявления к ЦМВ антигену сыворотки тестировали именно в этом разведении. ИА

О 100 200 300 400 500 600 700 800 900

Кратность разведения сывороток

Рисунок 2. Влияние разведения сывороток больных ЦМВ на величину отношения опыт/контроль при определении IgG к ЦМВ.

Подбор концентрации рекомбинантных антигенов для сорбции на планшетах осуществляли перекрестным титрованием антигенов и методом послойной сорбции в диапазоне концентраций от 1 до 10 мкг/мл. Оптимальные экспериментальные значения выявления антител класса G были получены при совместном использовании трех антигенов: рек-рр150/рек-р52/рек-рр65=3/1/1,5, соответственно, обеспечивающее коэффициент серопозитивности Кп = 4,3.

Для определения стабильности сорбированных антигенов при хранении полистироловые планшеты сенсибилизировали комбинацией исследуемых рекомбинантных антигенов рек-рр150, рек-р52, рек-рр65 при 4°С в течение 18 часов без применения стабилизирующих препаратов, после чего удаляли жидкость из лунок и высушивали. Затем планшеты герметично упаковывали и хранили в темном месте при 4°С и в термостате при +37°С. Активность сорбированного антигена определялась тестированием сывороток из РП в ИФА в разведениях 1:100, при ОП X = 450 нм (ОП450). Анализ проводили в одинаковых условиях через равные интервалы времени.

На рисунках 3, 4 представлена зависимость индекса активности от времени хранения образцов. На основании полученных данных можно сказать, что активность сорбированных рекомбинантных антигенов при хранении планшетов при 37°С снижается постепенно и уменьшается более чем на 30% только к концу второго месяца. При хранении сорбированных планшетов при 4°С активность снижается постепенно и по

истечении 18 месяцев «падает» на 40%, что свидетельствует о высоком качестве выбранных антигенов и стабильности иммуносорбента.

ИА

- рр150 -рр52 -рр65

- смесь АГ

Срок хранения, недель

Рисунок 3. Изменения индекса активности средних значений положительных (сплошная линия) и отрицательных (пунктир) сывороток в условиях хранения при температуре +37'С планшетов, сенсибилизированных отдельными антигенами ЦМВ и смесью антигенов рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65.

,„ НА К*, рр150

-К+, р52 -К+. рр65

—^ -о- К», смесь

oao-.-o-.-o-.

О 10 20 30 40 50 60 70 ВО

Срок хранения, недель

Рисунок 4. Изменения индекса активности средних значений положительных (сплошная линия) и отрицательных (пунктир) сывороток в условиях хранения при температуре +4°С планшетов, сорбированных отдельными антигенами ЦМВ и смесью антигенов рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65.

При создании набора по определению антител ^О к ЦМВ в сыворотке крови человека эмпирически определены оптимальные условия проведения каждой стадии анализа (Кср>3): температурный режим, временной интервал, концентрация основных компонентов, состав соответствующих буферных растворов.

Оценка качества лабораторной модели иммуиоферментной тест-системы

Основными показателями качества иммуноферментных тест-систем являются:

■чувствительность,

■специфичность,

•воспроизводимость.

Для оценки диагностической эффективности были изготовлены несколько экспериментальных серий лабораторной модели создаваемой тест-системы. Оценивали качество полученной системы на РП. По результатам исследования получилось: воспроизводимость-99,17%, 4=99%, С=98%, это хороший результат, соответствующий мировым стандартам.

Сравнение лабораторного варианта тест-системы «ЦMB-lgG-ДC», предназначенной для выявления антител класса в к ЦМВ с коммерческой тест-системой «Вектор-ЦМВ-1§С-стрип» (производство «Вектор-Бест»), показало, что при исследовании 20 положительных сывороток РП, все 20 образцов дали положительный ответ в обеих тест-системах. Из 16 отрицательных образцов только одна сыворотка № 8 попала в «серую зону», на тест-системе «Векгор-ЦМВ-^О-стрип» таких было 4: №№ 1, 6, 12,14. Отношение среднего значения положительных сывороток к среднему значению отрицательных на разработанной тест-системе равно 17,01, тогда как отношение в тест-системе «Вектор-ЦМВ-^О-стрип»-16,01.

Диагностическая эффективность тест-системы «ЦМВ-^О-ДС», рассчитанная по общему показателю совпадения результатов с тест-системой «Вектор-ЦМВ-^О-стрип», составляет 98,1%.

Важно отметить, что при изготовлении лабораторной модели тест - системы был использован белок рек-рр65, рекомбинантный аналог белка рр65 ЦМВ, который относится к предранним белкам цитомегаловируса, что повышает чувствительность тест - системы при анализе сывороток на ранних сроках заболевания. Также значения ОП в представляемой тест-системе можно экстраполировать, как полуколичественное определение титра антител к ЦМВ в сыворотке: Титр антител=ОП45о/ОПкрит.хЮО.

Пример для сыворотки №30: 0,359/0,147x100=2,44x100=244, итак титр антител 1:244. В экспериментальном анализе значение определяется как 1:200 (таблица 2).

Срок годности лабораторной модели тест-системы 12 месяцев со дня выпуска Это удобно для потребителя и позволяет использовать тест-систему в течение длительного срока. Данные о стабильности 3 серий после хранения в течение 12 месяцев по результатам ИФА на положительных и отрицательных сыворотках при температуре 2-8°С представлены на рисунках 5 и 6. Из данных:

-при хранении диагностических тест-систем при 2-8 °С в течение 12 месяцев уровень сигналов снижается в среднем на 5 - 10 % от исходных;

-при термодеградации тест-систем при 37°С в течение 30 дней уровень сигналов снижается в среднем на 15%;

-при хранении тест-системы с «перепадами» температур -уровень сигналов снижается в среднем на 20%.

При этом чувствительность и специфичность во всех сериях после хранения при различных режимах не меняется. Это характеризует высокую стабильность тест-системы при хранении и транспортировке к потребителю (испытание с «перепадами» температур).

Таблица 2

Данные положительной РП на тест-системе «ЦМВ-1кО-ДС».

№ сыворотки Серия № 03, ОП43о титр антител

17 2,509 1600

18 1,238 800

19 0,712 400

20 0,499 200

21 0,769 400

22 0,894 600

23 0,827 400

24 0,867 400

25 0,741 400

26 0,500 300

27 0,454 200

28 0,449 200

29 0,427 200

30 0,406 200

31 0,516 200

32 0,681 400

33 0,835 400

34 0,941 600

35 0,751 400

36 0,989 600

ОПкрит. 0,165

Предлагаемая комплектация тест-системы удобна в использовании, постоянная воспроизводимость результатов в наборах одной серии, высокий уровень чувствительности и специфичности тест-системы, цветовая гамма растворов снижает вероятность ошибки оператора при постановке. Это подтверждается данными исследования на сыворотках, содержащих и не содержащих антитела к цитомегаловирусу.

Таким образом, разработана лабораторная модель иммуноферментной тест-системы для выявления специфичных к цитомегаловирусу Данная лабораторная модель тест-системы в дальнейшей работе стала основным методом отбора при создании стандартной панели сывороток, выявляющих антитела класса О к цитомегаловирусу.

исходные 12 месяцев После 30 перепад данные 1=4'С дней при температур 37'С

Рисунок 5. Данные стабильности лабораторной модели тест-системы «ЦМВ-^й-ДС» (серии № 03, 04, 05). Средние значения ОП450 отрицательных сывороток РП от условий хранения.

0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

Рисунок 6. Данные стабильности лабораторной модели тест-системы «ЦМВ-^в-ДС» (серии № 03, 04, 05). Средние значения ОП450 положительных сывороток РП от условий хранения.

Разработка стандартной панели сывороток для оценки качества

иммуноферментных тест-систем, выявляющих антитела класса в к цнтомсгаловирусу человека при диагностике ЦМВ - инфекции

В лабораторной службе стандартные панели сывороток используют для оценки качества анализа, количество сывороток в панели не менее двадцати четырех от разных людей. К началу наших исследований в России были созданы стандартные панели сывороток для определения антител к инфекциям: ВИЧ, вируса гепатита А, вируса

исходные 12 месяцев После 30 перепад данные 1=4'С дней при температур 37С

гепатита С и хламидийной инфекции. Они отличались по количеству сывороток, методу отбора сывороток, способу изготовления. Положительные образцы перечисленных выше панелей состояли из пула (смесь) отрицательных сывороток и положительного образца добавляемого в различной концентрации.

Главным методом в нашей работе для отбора сывороток была разработанная нами лабораторная модель тест-системы для выявления к ЦМВ.

Анализ данных всех используемых в России панелей выявил, что образцы сывороток (плазмы), входящие в стандартную панель, должны отвечать следующим требованиям:

1. Инфекционная безопасность.

2. Физико-химические и биохимические показатели в пределах физиологической нормы.

3. Наличие охарактеризованных положительных и отрицательных образцов несколькими надежными методами или тест-системами.

4. Положительные образцы - охарактеризованы по содержанию (титру) антител к диагностически значимым антигенам ЦМВ (рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65).

5. Число образцов панели должно быть достаточным для обеспечения надежной оценки качества тест-системы.

6. Сохранять стабильность при хранении в течение 2 лет при температуре от 2°С до 8°С.

Формирование панели сывороток, предназначенной для контроля качества тест-систем, выявляющих 1йС антитела к цитомегаловирусу

Основными показателями качества тест систем, предназначенных для выявления антител, являются их чувствительность и специфичность. Анализ сравнительных испытаний коммерческих диагностических иммуноферментных тест-систем для выявления антител класса в к ЦМВ, выпускаемых в России, выявил, что самые высокие показатели 4=82% и С=80% были у тест-системы «ЦМВ-скрин» (ООО «Биосервис»). В данной системе в качестве иммуносорбента используется вирусный антиген. В двух других системах применяют рекомбинантные антигены. Полученные данные 4=71% и С=75% («Вектор-ЦМВ-^О-стрип», ЗАО «Вектор-Бест»), и 4=53% и С=50% («ЦМВ -ЗАО «ИмДи») свидетельствуют о низком качестве выпускаемых тест-систем, и требуют создания стандарта качества. Для иммуноферментного анализа это панели сывороток, отвечающие определенным требованиям.

Для создания панели было исследовано 2340 сывороток от разных больных и доноров. Сыворотки готовили сразу после забора крови и хранили до использования при -18°С.

На первом этапе отбирали образцы не содержащие антител и/или антигенов к вирусам гепатита С, гепатита В, иммунодефицита 1/2, герпеса 1,2 типа, а также к возбудителям сифилиса и хламидиоза.

На втором этапе отобранные сыворотки предварительно исследовали в ИФА на наличие антител к ЦМВ, при использовании собственного лабораторного варианта тест-системы для определения IgG к ЦМВ («IJMB-IgG-ДС»), Для позитивной части панели отбирали сыворотки, показывающие ОП не ниже 0,5 o.e., а для негативной части панели с сигналом не выше 0,15 o.e.

На третьем этапе проводили исследование биохимических характеристик сывороток, отобранных в ходе 2-го этапа. Образцы, имеющие указанные показатели вне физиологической нормы, отбраковывали.

На четвертом этапе отобранные образцы повторно исследовали на наличие антител к ЦМВ (в двух аттестованных тест-системах от разных производителей) и на наличие ДНК ЦМВ методом ПЦР. А также определяли «индекс авидности» положительных образцов. Таким образом, были отобраны 36 образцов.

Позитивная часть панели содержит образцы с разными титрами антител к ЦМВ. В их числе есть образцы, дающие в ИФА минимальный сигнал (ОП близкое к значению ОПкрит, до 0,300), разный титр антител (от 1:200 до 1:6400), средние значения индекса авидности (от 18 до 68), что важно,.при оценке чувствительности тест-систем. Тест-системы, имеющие низкую чувствительность, не смогут выявить сыворотки в ИФА с низким значением оптической плотности. Образцы панели имеют разный титр антител к цитомегаловирусу, это позволяет использовать панель для контроля воспроизводимости результатов тест-систем. Чтобы выявлять тест-системы, показывающие низкую специфичность, некоторые отрицательные сыворотки имеют значения ОП в ИФА, близкое к значению ОПкрит (сыворотки №№ 6, 8, 13, 15). Сыворотки, результаты которых приближены к значению ОПкрит., способствуют повышению качества тест-систем, так как при аттестации в ИФА образцы панели должны иметь заявленные в «Инструкции» значения.

Для удобства использования панели в лабораторной практике, она была сформирована так, чтобы количество образцов было кратно восьми (т.е. точно укладывается на определенное число 8-ячеистых стрипов). Таким образом, была получена панель из 36 образцов, содержащая 20 позитивных и 16 негативных сывороток.

Вариант размещения образцов панели на планшете испытываемой тест-системы представлен на рисунке 7.

к+ ЛИ ли ЛИ М» ль> ,М » •■ М17 М17 М 25 М25 Л Ь 33

к+ М2 Л* 2 Л*} мн лив М16 М1г ЛИ1 М26 М26 М34

к- мз мз М3 ми МП МИ М19 М19 Лi27 М27 ЛЬ 33

к- М4 М4 ЛЬ 4 ди М12 Щ12 М20 М 20 М 2» М23 М36

к- м$ М5 М5 ЛИЗ М13 М13 М21 Л121 Л} 29 М29 МЗЗ

ККг М( Мб Мб ми М14 М14 М22 .1» 22 мзв МЗО М34

ККг л¡т М7 М7 лиз М1* МП М23 ЛЬ 23 ЛЬ 31 ЛЬ 31 М 35

ККг мг М* М» МИ ЛИ6 мм М24 24 М32 Л! 32 ЛЬ 36

Рисунок 7. Размещение образцов панели в планшете для иммунологических реакций.

Разработка жидкой панели сывороток для оценки качества тест-систем, выявляющих иммуноглобулины класса в к цитомегаловирусу человека

Иногда в лабораторной практике необходимо использовать жидкие панели сывороток. Одним из способов поддержания сывороток в нативном состоянии является введение в них стабилизирующего раствора, который обеспечивает стабильность величин титров антител и постоянство биохимического состава сыворотки.

Стабилизатор должен обеспечить стабильность панели сывороток при температуре хранения 2-8°С в течение всего срока годности. Для этого исследовали традиционные добавки: сопи, альбумины, полиэтиленгликоль, глицерин и другие вещества, используемые для стабилизации белковых систем. Добавки вводили в положительные сыворотки, которые имели оптическую плотность 1,0 - 1,5. Проводили тест ускоренной термодеградации при 37°С. За исходное значение приняли значение индекса активности сыворотки с добавлением какого-либо консерванта, которая хранилась при температуре 4°С.

Проведя литературный и экспериментальный анализ, в качестве компонентов стабилизирующего раствора выбрали: сорбит, ЭДГА, хлорид калия и пептон. В качестве консерванта использовали мертиолят натрия. Из этих компонентов были созданы стабилизирующие растворы с разной концентрацией добавок. Всего было исследовано более десяти многокомпонентных растворов. Из них были отобраны пять растворов, которые позволяли сохранить серологическую активность сыворотки не менее недели при 37°С после добавления стабилизатора Далее провели скрининг выбранных стабилизаторов с целью оценки их пригодности для жидких панелей сывороток. Критерием отбора было сохранение исходного титра антител к ЦМВ и комплекса

биохимических показателей. Положительные образцы, с добавлением испытываемых растворов, подвергли реакции термодеградации в течение 30 дней при температуре 37°С.

На основании полученных данных в качестве стабилизатора был отобран раствор, который более всего отвечал предъявляемым требованиям Соотношение стабилизатора и сыворотки составляет 1:100.

Далее во все сыворотки панели был добавлен выбранный стабилизирующий раствор, состоящий из 5% сорбита, 2,5% пептона, 10% мертиолят натрия, 1% хлорида калия и 10 мМ ЭДТА. После чего определялся уровень сигнала в ИФА (рисунок 8). Полученные данные свидетельствуют о стабилизации сывороток в течение продолжительного периода времени, около года при температуре от 2°С до 8°С.

В соответствии с рекомендациями ВОЗ проведена оценка срока годности панели методом «ускоренного старения». Обработка данных показала, что исследуемая жидкая панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к цитомегаловирусу может храниться в течение одного года при температуре от 2°С до 8°С (Рисунок 8). В течение всего срока ускоренного хранения жидкая панель сывороток сохраняла свои параметры. Значения оптической плотности при «ускоренном старении» понижается в среднем на 1015%, после 2 месяцев при 37°С и 1 недели при 60"С, что соответствует одному году при температуре от 2°С до 8°С.

Рисунок 8. Зависимость изменения ОП,50 образцов панели с добавлением стабилизатора №3 от времени хранения при температуре 37°С.

Разработка лиофилизированной панели сывороток для оценки качества тест-систем, выявляющих иммуноглобулины класса в к цитомегаловирусу человека

Согласно требованиям ВОЗ, биологические стандарты должны сохранять свои специфические характеристики в течение не менее 2 лет при температуре хранения 4°С. Наиболее приемлемой, для России, по требованиям ГИСК, представляется лиофильно высушенная форма препарата.

Проведя литературный и экспериментальный анализ, для лиофилыюй панели сывороток, мы использовали эмпирически подобранный стабилизатор, содержащий: 5% сахарозы, 6% пептона, 1% ЫаС1 и 0,1% мертиолята натрия в 0,01 М фосфатном буферном растворе, рН 7,2-7,4. Стабилизатор добавляли к образцам в количестве 20% (по объему). Перед лиофилизацией, для придания высушенному препарату повышенной рыхлости и растворимости, образцы разводили 1:1 дистиллированной водой. Подготовленные таким образом образцы панели разливали по 400 мкл в стеклянные флаконы и одновременно лиофилизировали, на установке Т0-50, после чего флаконы были укупорены под вакуумом.

Полученные лиофилизированные сыворотки были аттестованы по физико-химическим параметрам. Величина относительной погрешности массы сухого препарата во флаконах составила 1,6%, остаточная влажность - менее 1%. Все флаконы были герметичны. Полученные характеристики соответствовали нормативам ВОЗ для стандартных образцов биопрепаратов. Оценку активности образцов панели после лиофилизации проводили на различных иммуноферментных тест-системах отечественного и зарубежного производства. Результаты оценки приведены в таблицах 3 и 4. Оценка показала, что лиофилизация не оказала заметного влияния на специфическую и неспецифическую активность образцов.

Исследование стабильности специфических свойств сухих образцов панели после различных сроков хранения образцов при различных температурах и расчетную оценку срока годности лиофилизированной панели выполняли согласно «Методическим рекомендациям для определения стабильности Отраслевых Стандартных Образцов (ОСО) и других международных иммунологических биопрепаратов ускоренным методом». При исследовании стабильности специфических свойств образцов панели оценивали степень изменения иммунологического сигнала (значение ОП) в ИФА после различных сроков хранения образцов при повышенных температурах, по сравнению с сигналом в ИФА аналогичных образцов, хранившихся при 4°С. Такие исследования часто называют тестами ускоренной термодеградации при повышенных температурах.

По 5 лиофильно высушенных панелей сывороток, которые хранились при +4°С, были поставлены на ускоренное старение при температуре +37°С, +45°С, +60°С. Через определенные промежутки времени (1 день, 7 дней, 30 дней, 2 и 3 месяца), очередные панели изымались из термостата и хранились при 4°С до завершения теста. Исследование специфической активности всех образцов проводилось одновременно с помощью лабораторного варианта разработанной ИФА тест-системы для выявления ¡¿О к ЦМВ. Результаты исследований приведены на рисунках 9 и 10. Как видно хранение при 4°С в

течение 60 и более суток не изменяет среднее значение ОП в ИФА. Хранение при более высоких температурах, особенно при 45°С и 60°С вызывает заметное снижение средних значений ОП положительных образцов, а у негативных сывороток вызывает повышение средних значений ОП на 0,01-0,02 единиц. На основании полученных данных проведен расчет срока годности панели. Стандартную панель предполагается хранить при температуре 4°С.

Таблица 3

Результаты аттестации негативных образцов панели после лиофилизации в ИФА.

№ образцов в панели BeKTO-IJMB-JgG-cTpHn ЦМВ-скрин CMV-JgG-Elisa PKS medas, 115/QPKS

ОП45о Кп ОПАпшв-ОПкАг ОП450

1 0,118 0,56 0,126 0,174

2 0,118 0,56 0,126 0,174

3 0,085 0,40 0,097 0,167

4 0,097 0,46 0,147 0,137

5 0,084 0,40 0,061 0,172

6 0,068 0,32 0,127 0,147

7 0,128 0,60 0,081 0,140

8 0,089 0,42 0,043 0,133

9 0,068 0,32 0,127 0,147

10 0,092 0,43 0,097 0,117

11 0,097 0,46 0,147 0,137

12 0,081 0,38 0,094 0,149

13 0,067 0,32 0,107 0,143

14 0,050 0,24 0,176 0,143

15 0,093 0,44 0,099 0,200

16 0,115 0,54 0,015 0,125

ОП крит. 0,212 1,00 0,200 0,250, серая зона 0,1790,250

Примечание. ОПагимв- оптическая плотность в лунках с антигеном, ОП,аг-опгическая плотность в лунках без антигена Аи - величина, полученная

графически, с помощью инструкции к набору.

В качестве повышенных температур были взяты температуры +37°С, +45°С,

+60°С. Результаты изменения активности сывороток после хранения при разных

температурах, вычисленные из трех повторов, после хранения при разных температурах.

При определении срока хранения стандартной панели условием стабильности считается

предельное изменение активности сывороток панели не более чем на 1% от исходной

величины. Согласно полученным данным, теоретический срок годности стандартной

лиофилизированной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к

цитомегаловирусу серии 001, составляет примерно 3 года при хранении от 2°С до 8°С.

Данная панель была аттестована в феврале 2002 года. Периодические проверки образцов

в течение всего срока наблюдения (до настоящего времени) не показали заметного

снижения специфической активности. На протяжении всего срока использования (в течение 3,5 лет) уровень антител в сыворотках остался неизменным. Таким образом,

реальный срок годности препарата уже превысил расчетный.

Таблица 4

Результаты аттестации позитивных образцов панели после лиофилизации в ИФА.

№№ образцов в панели Векто-ЦМВ-^О-стрип ЦМВ-скрин СМУ-^О-Е^аР!« теаая, 115/0 РКБ

ОП450 Кп ОПагцмв-ОПк,г ОП450

17 >3,0 >14,15 2,264 2,740

18 1,865 8,80 0,927 2,218

19 2,829 13,34 0,909 2,465

20 1,639 7,73 0,878 2,208

21 2,690 12,69 0,755 2,247

22 2,960 13,96 1,259 2,531

23 >3,0 >14,15 0,701 2,174

24 >3,0 >14,15 1,684 2,666

25 2,456 11,58 0,626 1,797

26 2,190 10,33 0,658 2,277

27 0,598 2,82 0,813 2,239

28 1,960 9,25 0,883 2,150

29 0,268 1,26 0,657 1,518

30 2,790 13,16 0,967 2,482

31 2,717 12,82 1,422 2,433

32 2,600 12,26 1,077 2,109

33 0,512 2,42 1,325 2,587

34 2,408 11,36 1,342 2,590

35 2,983 14,07 0,970 2,558

36 2,779 13,11 0,632 1,865

ОП крит. 0,212 1,00 0,200 0,250, серая зона 0,1790,250

Примечание. ОГ1Агцм«- оптическая плотность в лунках с антигеном, ОП,аг- оптическая плотность в лунках без антигена Аи/мл, И/мл - величины, полученные графически, с помощью инструкции к набору.

Объем регидратированных образцов панели (200 мкл) позволяет выполнять

несколько контрольных определений, поэтому важно, чтобы растворенные образцы сохраняли исходную активность не менее месяца. Результаты сравнительной оценки сигнала отдельных регидратированных образцов панели, хранившихся при -20°С, +4°С и +37°С показали, что существенных изменений специфической активности образцов за 4 недели хранения при 37°С не происходит. Все различия ОП в соответствующих образцах не превышают погрешности при регистрации сигнала. Результаты проведенных

исследований позволяют сделать заключение о хорошей стабильности панелей, как в сухой форме, так и после их растворения, удовлетворяющей требованиям, предъявляемым к стандартным биологическим препаратам.

сп„

Рисунок 9. Динамика изменения среднего арифметического оптической плотности лиофилизированных негативных образцов панели от времени хоанения пои оазличных •гемпеоатуоах.

СП®

КотчвсгаолкЯ

-•-4С -0-37С -«-45С -О-60С

Рисунок 10. Динамиха изменения среднего арифметического оптической плотности лиофилизированных позитивных образцов панели от времени хранения при различных температурах.

При аттестации панели с 2000г по 2004г проводилась совместная работа с ГИСК. Испытания панели проводили с использованием продаваемых в России коммерческих тест-систем. Сопоставляли результаты до и после аттестации ОСО. Среднее значение зависимой переменной коэффициента серопозитивности тест-системы «Вектор-ЦМВ-IgG-стрип» увеличился с 8,01 до 10,45. Две положительные сыворотки панели №27 и №28 выявлялись как отрицательные, №2, №7, № 35 и № 36 были в «серой зоне». Для данной системы 4=80%, С=87,5%. После использования стандартной панели, для оценки качества выпускаемых тест-систем, новые серии набора определяли верные результаты, показывая 4=99% и С=99,5% на стандартной панели сывороток, серии 001. На панель разработаны и утверждены: паспорт и инструкция по применению.

Панель прошла Государственные испытания в качестве стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к ЦМВ. Стандартная панель внесена в Реестр национальных стандартных образцов РФ под номером: ОСО 4228-360-01.

После выпуска первой серии референс-панели заметно улучшилось качество продаваемых в РФ диагностических иммуноферментных тест-систем для определения антител класса G к ЦМВ. Так как, производители данных диагностических наборов стали оценивать качество, выпускаемой продукции, используя отраслевой стандарт. Расхождения результатов между разными производителями снизилось до 5%.

Выводы

1. Разработан лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы для выявления IgG к ЦМВ на основе рекомбинантных антигенов цигомегаловируса рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65 с чувствительностью 98% и специфичностью 99%, который стал основным методом отбора сывороток для создания панели образцов, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу человека.

2. Создана технология изготовления контрольных панелей сывороток, содержащих и не содержащих антитела к цитомегаловирусу.

3. Разработана жидкая панель сывороток, содержащих и не содержащих IgG к цитомегаловирусу, сохраняющая специфические свойства и стабильность в течение года при температуре от 2°С до 8°С.

4. Разработанная лиофилизированная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к цитомегаловирусу, сохраняющая специфические

свойства в течение 2 лет и стабильность при температуре от 2°С до 8°С, аттестована как отраслевой стандарт ОСО № 42-28-360-01.

Публикации по теме диссертации

1. Ивченко С. Н., Суслопаров И. М., Масычева В. И., Суслопаров М. А., Мезенцев А.Н. Конструирование жидкой панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к цитомегаловирусу человека// Вестник Российской академии медицинских наук. -2004. - №8. - стр.37-39.

2. Ивченко С.Н., Суслопаров И.М., Масычева В.И., Суслопаров М.А., Лосев М.В. Разработка иммуноферменгной тест-системы для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека// Сибирский медицинский журнал. - 2005. - №2, том 20. - стр. 53-55.

3. Суслопаров И. М., Суслопаров М. А., Ивченко С. Н., Гришаев М. П., Смердова М. А., Косова Е Ю., Блинов В. М., Сараев Д. В., Махова Н. М., Носкова Н. В. Конструирование рекомбинантного антигена рр65 цитомегаловируса человека и исследование его иммунохимических свойств// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2005. - № 2. - стр. 28-32.

4. Ivchenko S.N., Masycheva V.I., Susloparov М.А., Losev М.В. Approaches to the construction of standard serum panel with and without antibodies to cytomegalovirus// IV ISTC SCIENTIFIC ADVISORY COMMITTEE SEMINAR ON «BASIC SCIENCE IN ISTC ACTIVITIES». - Novosibirsk-2001. - p. 150.

5. Ivchenko S.N., Masycheva V.I., Susloparov M.A., Losev M.B. The use of the cytomegalovirus recombinant proteins for testing sera with and without antibodies to cytomegalovirus// IV ISTC SCIENTIFIC ADVISORY COMMITTEE SEMINAR ON «BASIC SCIENCE IN ISTC ACTIVITIES». - Novosibirsk.-2001.-p. 151.

6. Ивченко C.H., Масычева В.И., Суслопаров M.A., Воробьева М.С., Лосев М.В., Федосов С.А. . Подходы к созданию стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к цитомегаловирусу, в жидком виде// Новые информационные технологии в медицине и экологии, IT + МЕ'2002. -Гурзуф, 2002. - стр.200-201.

Ивченко Светлана Николаевна

РАЗРАБОТКА СТАНДАРТНОЙ ПАНЕЛИ СЫВОРОТОК, СОДЕРЖАЩИХ И НЕ СОДЕРЖАЩИХ Г^О К ЦИТОМЕГАЛОВИРУСУ ЧЕЛОВЕКА

Автореф. дисс. на соискание учёной степени кандидата биологических наук. Подписано в печать 11.11.2008. Захаэ№!01. Формат 60x90/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Типография Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Ивченко, Светлана Николаевна

Список использованных сокращений.

1. Введение.б

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1. Цитомегаловирусная инфекция.

2.1Л. Цитомегаловирус и ареал его распространения (эпидемиологические аспекты).

2.1.2. Этиология и патогенез первичной цитомегаловирусной инфекции.

2.1.3. Вторичные инфекции, развивающиеся на фоне ЦМВИ.

2.2. Диагностика цитомегаловирусной инфекции.

2.2.1. Антигены цитомегаловируса и их использование в диагностике.

2.2.2. Виды и эффективность диагностики цитомегаловирусной инфекции.

2.2.3. Тест - системы для определения специфичных иммуноглобулинов к цитомегаловирусу.

2.3. Разработка сывороточных панелей.

2.3.1. Стандартные сывороточные панели, существующие в мире.

2.3.2. Биохимические характеристики сывороток для создания стандартных панелей.

2.3.3. Критерии отбора сывороток для стандартной панели.

2.3.4. Стабилизирующие растворы.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Материалы.

3.2. Методы.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1 Выбор метода отбора сывороток для создания панели образцов, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу человека.

4.1.1 Исследование антигенных свойств рекомбинантных аналогов белков рр150, р52 и рр65 цитомегаловируса человека.

4.1.2 Подбор концентрации рекомбинантных антигенов для сорбции.

4.1.3 Оптимизация условий анализа иммуноферментного.

4.1.4 Оценка качества лабораторной модели иммуноферментной тест-системы.

4.2 Разработка стандартной панели сывороток для оценки качества иммуноферментных тест-систем, выявляющих антитела класса G к цитомегаловирусу человека при диагностике ЦМВ - инфекции.

4.2.1 Требования к панелям и входящим в их состав образцам.

4.2.2 Формирование панели сывороток, предназначенной для контроля качества тест-систем, выявляющих IgG антитела к цитомегаловирусу.

4.2.3 Разработка жидкой панели сывороток для оценки качества тест-систем, выявляющих иммуноглобулины класса G к цитомегаловирусу человека.

4.2.3.1 Выбор способа стабилизации жидких образцов панели.

4.2.3.2 Оценка стабилизирующих эффектов ультрафильтрации и консервации.

4.2.3.3 Изучение стабилизирующих эффектов облучения электронами.

4.2.3.4 Изучение стабилизирующих эффектов консервантов и стабилизаторов.

4.2.3.5 Исследование стабильности жидкой панели при хранении.

4.2.4 Разработка лиофилизированной панели сывороток для оценки качества тест-систем, выявляющих иммуноглобулины класса G к цитомегаловирусу человека.

4.2.4.1 Отработка способа получения лиофилизированных образцов.

4.2.4.2 Исследование стабильности лиофилизированной панели при хранении.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к цитомегаловирусу человека"

Актуальность темы

Среди многообразия вирусных инфекционных заболеваний цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ) занимает одно из первых мест по распространенности и сложности диагностики. Антитела к цитомегаловирусу человека выявляются у 60-80% взрослого населения, а в некоторых регионах - до 99%.

Цитомегаловирусная инфекция (ЦМВИ, цитомегалия) имеет различные формы -латентную, субклиническую, острую и хроническую. ЦМВИ приводит как к системным заболеваниям (мононуклеоз, генерализованная цитомегалия), так и к поражению отдельных органов (печень, легкие, головной мозг, сердце, половые органы и др.). Этой инфекцией страдает 0,5 — 5% всех новорожденных. Частота передачи вируса плоду при первичной инфекции женщин во время беременности составляет 15 - 50%. В настоящее время установлено, что одной из главных причин врожденных уродств, поздних выкидышей и дефективных новорожденных является внутриутробная цитомегаловирусная инфекция у беременных женщин.

Для контроля специфичности и чувствительности иммуноферментных тест-систем используют стандартные панели сывороток. Существуют два вида стандартных панелей - лиофилизированные и жидкие. Наибольшей популярностью в настоящее время пользуются лиофилизированные панели сывороток, поскольку они обладают рядом преимуществ: длительный срок хранения, способность сохранять свойства при перепаде температур. До проведения наших исследований отечественные контрольные панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ЦМВ, в Российской Федерации отсутствовали. Поэтому настоящая работа посвящена созданию стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к ЦМВ. В качестве основного метода отбора сывороток, разработали лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы, с применением рекомбинантных белков: рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы являются комплексные исследования по разработке методологии создания стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу, для контроля достоверности результатов ИФА, получаемых с помощью коммерческих тест-систем.

Для выполнения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Разработать оптимальные методы отбора положительных и отрицательных образцов панели сывороток.

3. Создать жидкую и лиофилизированную панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к цитомегаловирусу, соответствующие по стабильности требованиям ВОЗ [4].

Научная новизна и практическая ценность работы

2. Разработан лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы для определения IgG к цитомегаловирусу человека на основе трех рекомбинантных антигенов ЦМВ рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65.

3. Выбраны и всесторонне охарактеризованы 36 сывороток для формирования стандартных панелей сывороток, содержащих и не содержащих антитела IgG к ЦМВ.

4. Отработана технология получения жидкой панели сывороток, по своей стабильности соответствующая требованиям ВОЗ [4] к биологическим препаратам.

Работа выполнена в 1999-2005 гг. в рамках Государственного контракта с Министерством науки технологий Российской Федерации на 2000 год от 14 января 2000 года № ГНТД/ГК-029 (00)-П ГНЦ ВБ «Вектор» и ЗАО «Медико-Биологический Союз». Все экспериментальные исследования проводились в рамках научно-исследовательского проекта, утвержденного Этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор» (№ IRB 00001360): «Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики герпесвирусов» (утвержден 03.06.2003).

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработан лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы для выявления IgG к ЦМВ на основе рекомбинантных антигенов цитомегаловируса рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65 с чувствительностью 98% и специфичностью 99%, как основной метод отбора сывороток для создания панели образцов, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу человека.

2. Технология изготовления жидких и лиофилизированных панелей сывороток, содержащих и не содержащих IgG к цитомегаловирусу.

3. Жидкая панель сывороток, содержащих и не содержащих IgG к цитомегаловирусу.

4. Лиофилизированная панель сывороток, содержащих и не содержащих IgG к ЦМВ - отраслевой стандарт ОСО № 42-28-360-01.

Конкретное участие автора в получении результатов

Автор принимал участие во всех экспериментальных и теоретических исследованиях, приведенных в диссертации. Кроме того, автор участвовал в работах совместно с сотрудниками ГИСК им. JI.A. Тарасевича, ЗАО «Медико-биологический союз» и института ядерной физики СО РАН.

Апробация работы и публикации

Материалы диссертации были представлены на следующих конференциях:

1. Ivchenko S.N., Masycheva V.I., Susloparov М.А., Losev M.B. Approaches to the construction of standard serum panel with and without antibodies to cytomegalovirus// IV ISTC SCIENTIFIC ADVISORY COMMITTEE SEMINAR ON «BASIC SCIENCE IN ISTC ACTIVITIES». - Novosibirsk, 2001. - page 150.

2. Ivchenko S.N., Masycheva V.I., Susloparov M.A., Losev M.B. The use of the cytomegalovirus recombinant proteins for testing sera with and without antibodies to cytomegalovirus// IV ISTC SCIENTIFIC ADVISORY COMMITTEE SEMINAR ON «BASIC SCIENCE IN ISTC ACTIVITIES». - Novosibirsk, 2001. - page 151.

3. Ивченко C.H., Масычева В.И., Суслопаров M.A., Воробьева М.С., Лосев М.В., Федосов С.А. Подходы к созданию стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к цитомегаловирусу, в жидком виде// «Новые информационные технологии в медицине и экологии», IT + МЕ'200. -Гурзуф, 2002. - стр.200-201.

По материалам исследований опубликовано 3 статьи:

1. Суслопаров И. М., Суслопаров М. А., Ивченко С. Н., Гришаев М. П., Смердова М. А., Косова Е.Ю., Блинов В. М., Сараев Д. В., Махова Н. М., Носкова Н. В. Конструирование рекомбинантного антигена рр65 цитомегаловируса человека и исследование его иммунохимических свойств// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2005. - № 2. - стр. 28-32.

2. Ивченко С. Н., Суслопаров И. М., Масычева В. И., Суслопаров М. А., Мезенцев А.Н. Конструирование жидкой панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к цитомегаловирусу человека// Вестник Российской академии медицинских наук. — 2004. - №8. - стр.37-39.

3.' Ивченко С.Н., Суслопаров И.М., Масычева В.И., Суслопаров М.А., Лосев М.В. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека// Сибирский медицинский журнал. - 2005. - №2(том 20). - стр. 53-55.

На разных этапах выполнения работы в ней принимали участие сотрудники ГНЦ ВБ «Вектор»: В.И. Масычева, М.А. Суслопаров, И.М. Суслопаров, А.Н. Канев, а также сотрудники ГИСК им Л.А.Тарасевича: И.П. Ладыженская, В.Г. Петухов, сотрудники производственной фирмы: ЗАО «Медико-биологический союз» - О.Н. Надточий, А.Н. Мезенцев, О.Г. Васенева, И.В. Валеева.

Всем, принимавшим участие в данной работе, автор выражает искреннюю признательность.

Искреннюю благодарность автор приносит генеральному директору ЗАО «Медико-биологический союз» М.В. Лосеву и заведующему лабораторией 14 ИЯФ СО РАН Ауслендеру В.Л.

Особую благодарность автор выражает М.С. Воробьевой, профессору, доктору медицинских наук, член корреспонденту РАЕН, руководителю лаборатории ГИСК им. Л.А.Тарасевича МЗ и CP РФ.

Автор сердечно благодарит всех своих коллег, принимавших участие в работе.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 154 страницах, содержит 35 таблиц, 21 рисунок. Состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждений, выводов, списка литературы, приложений. Список литературы включает в себя 165 источников, из них 127 иностранных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Ивченко, Светлана Николаевна

Выводы

1. Разработан лабораторный вариант иммуноферментной тест-системы для выявления IgG к ЦМВ на основе рекомбинантных антигенов цитомегаловируса рек-рр 150, рек-р52 и рек-рр65 с чувствительностью 98% и специфичностью 99%, который стал основным методом отбора сывороток для создания панели образцов, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу человека.

4. Разработанная лиофилизированная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела к цитомегаловирусу, сохраняющая специфические свойства в течение 2 лет и стабильность при температуре от 2°С до 8°С, аттестована как отраслевой стандарт ОСО № 42-28-360-01.

5. Заключение

В России в последнее десятилетие наблюдается рост числа заболеваний вызывающих иммунодефицит. В этой связи возникает необходимость качественной и удобной диагностики оппортунистических инфекций связанных с иммунодефицитом. Такая диагностика полезна для улучшения качества современного акушерства, актуальной задачей которого является уменьшение числа мертворожденных детей и врожденных патологий плода, вызываемых ЦМВИ. Иммуноферментная диагностика вирусных заболеваний становится востребованной в области трансплантологии, в связи с ростом количества трансплантаций в современной клинике. Поэтому диагностика цитомегаловирусной инфекции становится все актуальнее.

В ходе полученных новых знаний о цитомегаловирусной инфекции и появления более тонких и точных методов, диагностика последнее десятилетие тоже активно эволюционировала. Стало ясно, что использование для ИФА нативных антигенов приводит к неоднозначности результатов, и должно быть заменено или дополнено более специфичными антигенами, так как метод должен достоверно отличать позитивные сыворотки от негативных. Поэтому применение рекомбинантных белков приобретает все большую популярность среди исследователей.

В результате проделанной работы были исследованы взаимодействия рекомбинантных антигенов с рабочей панелью сывороток: рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65 [25, 26, 27, 28, 32, 33] цитомегаловируса, показана возможность использования в ИФА этих рекомбинантных антигенов для отбора сывороток, содержащих и не содержащих антитела к цитомегаловирусу. Создана на основе рекомбинантных антигенов лабораторная модель иммуноферментной тест-системы для определения антител к ЦМВ, «UMB-IgG-AC».

Используя эту лабораторную модель тест-системы, как метод отбора сывороток для стандартной панели, аттестовали 36 сывороток для формирования панели. Подобран стабилизирующий раствор и сконструирована панель сывороток (жидкая форма), сохраняющая свои специфические свойства и стабильность при температуре от 2°С до 8°С не менее одного года. Создана стандартная панель (лиофилизированная), которая внесена в Реестр национальных стандартных образцов РФ под номером: ОСО 42-28-360-01 и стала первой в России стандартной панелью, используемой для оценки чувствительности и специфичности иммуноферментных тест-систем, выявляющих антитела класса IgG к ЦМВ. Выпущено три серии отраслевого стандарта. В настоящее время эта панель используется для контроля качества иммуноферментных тест-систем на территории РФ.

С использованием разработанной в представленной работе технологии были выпущены две серии стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к вирусу простого герпеса I и II типов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ивченко, Светлана Николаевна, Кольцово

1. Агаджанова А. А. Современные методы терапии больных с привычным невынашиванием беременности// Российский медицинский журнал - 2003. - Т. 11, № 1.-С.6-10.

2. Анджелов В. О., Кричевская Г. И., Хватова А. В., Катаргина JI. А. Цитомегаловирусная инфекция у детей с увеитами// Информационное письмо МНИИ ГБ им. Гельмгольца Москва - 1995.

3. Антитела. Под редакцией Д.Кэтти// Мир Москва, 1991. - Т.2 - С. 152-238.

4. Всемирная организация здравоохранения. Принципы приготовления и утверждения международных и других стандартов и эталонных материалов биологических препаратов// Серия технических докладов Женева, 1990. - № 37.

5. Долгих Т. И., Назарова О.И. Лабораторная диагностика инфекций, вызванных цитомегаловирусом и парвовирусом В19, у больных с вторичными иммунодефицитами// Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунологии -2002. № 5 - С.53-62.

6. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа// Высшая школа Москва, 1991. - С.83-11, 182-183, 266-267

7. Еремин А.Н., Будникова Л.П., Свиридов О.В., Метелица Д.И. Стабилизация разбавленных водных растворов пероксидазы хрена// Прикладная биохимия и микробиология 2002. - Т.38, №2 - С. 174-182.

8. Ивченко С.Н., Суслопаров И.М., Масычева В.И., Суслопаров М.А., Лосев М.В. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека// Сибирский медицинский журнал 2005. - Т. 20, №2. - С. 53-55.

9. Канев А.Н., Воробьева М.С., Шалунова Н.В., Карпович Л.Г., Нетесов С.В., Максютов А.З., Усова С.В. Разработка стандартных панелей сывороток для контроля качества иммуноферментных тест-систем в России// Вопросы вирусологии 1998. - № 2 - С. 47-51.

10. Канев А.Н., Шалунова Н.В., Нетесов С.В., Ястребова О.Н., и др. Конструирование референс-панели сывороток к вирусу гепатита С с нормированным уровнем IgG-антител// Вопросы вирусологии 2000 - № 4 - С. 42-57.

11. Каражас Н.С. Цитомегаловирусная инфекция современная диагностика// Клиническая лабораторная диагностика - 1998 - Т.2 - С. 16-17.

12. Кейзер С.А., Молчанов М.Г. Изменение гемопоэза у белых крыс при однократном и хроническом воздействии гамма-лучей// Вопросы радиобиологии Томск, 1968. -С. 78-85.

13. Когл Дж. Биологические эффекты радиации.// Энергоатамиздат Москва, 1986. -С. 184.

14. Коченгина С.А., Теплова С.Н., Русанова Н.Н., Малиновская В.В., Посевая Т.А. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у детей первых месяцев жизни// Журнал микробиологии 2000. - № 2 - С. 116-118.

15. Кузин С.Н., Садикова Н.В., Суслов А.П., Эльгорт Д.А., Гольцов В.А. и др. Оценка системы контроля качества детекции HBsAg в сети скрининговых лабораторий// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии 2002. - № 3 - С. 52-56.

16. Рахманова А.Г., Неверов В. А., Пригожина В.К. Инфекционные болезни: руководство для врачей общей практики// Питер Санкт-Петербург, 2001. - С. 576.

17. Решение Ученого Совета ГИСК им. Тарасевича от 24.12.2002 г.

18. Ройт А. Основы иммунологии// Мир Москва, 1991. - С. 42-68.

19. Скрипкин Ю.К., Шарапова Г.Я., Селисский Г.Д. Инфекции, передаваемые половым путем: практическое руководство// Мир Москва, 2001. - С. 221-264.

20. Тишкевич О.А., Шахгильдян В.И., Морозова С.В., Канестри В.Г. Системный цитомегаловирусный васкулит ВИЧ-инфицированного больного// Эпидемиология и инфекционные болезни 2001. - № 1 - С.31-36.

21. Шахгильдян В.И., Шипулина О.Ю., Каражас Н.В., Стаханова В.М., Евсеева Л.Ф., Тишкевич О.А. Лабораторная диагностика цитомегаловирусной инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов // Эпидемиология и инфекционные болезни 2001 -№1 - С.36-40.

22. Химическая энциклопедия// Большая Российская энциклопедия Москва, 1998. -Т.5 - С.987-988.

23. Постановление главного государственного санитарного врача РФ от 18.04.2003г.// САНПИН 2.3.2.1293-03 № 59.

24. Adler SP. Molecular epidemiology of cytomegalovirus: Evidence for viral transmission to parents from children infected at a day care center// Pediatr Infect Dis J. 1986. - V.5 -P.315-318.

25. Alford С A, Pass RF. Epidemiology of chronic congenital and perinatal infections of man// Clin Perinatol 1981. - V.8 - P.397-414.

26. Anawis M.A., Lindberg R.E. Stabilized horseradish peroxidase conjugate composition// Патент № 4782023 США, МКИ С 12 N 9/96,G 01 N 13/00. Опубл. 01.11.1988 НКИ 435/188.

27. Arens М. Methods for Subtyping and Molecular Comparison of Human Viral Genomes// Clin microbiol reviews. Oct. 1999 - V.12, №. 4 - P.612-626.

28. Aspin MM, Gallez-Hawkins GM, Giugni TD, Tegtmeier B. Comparison of plasma PCR and bronchoalveolar lavage fluid culture for detection of cytomegalovirus infection in adult bone marrow transplant recipients// J Clin Microbiol. 1994. - V.32 - P.2266-2269.

29. Baldick С J Jr, Marchini A, Patterson CE, Shenk T. Human cytomegalovirus tegument protein pp71 (ppUL82) enhances the infectivity of viral DNA and accelerates the infectious cycle. // J Virol. 1997. - V.71 - P.4400-4408.

30. Baldick CJ Jr, Shenk T. Proteins associated with purified human cytomegalovirus particles// J Virol. 1996 - V. 70 - P.6097-6105.

31. Bale JF, Petheram SJ, Inara ES, Murph JR. Cytomegalovirus reinfection in young children// J Pediatr. 1996. - V.128 - P.347-352.

32. Benko DM, Haltiwanger RS, Hart GW, Gibson W. Virion basic phosphoprotein from human cytomegalovirus contains O-linked N-acetylglucosamine. //Proc Natl Acad Sci USA. 1988. - V. 85 - P.2573-2577.

33. Bevan, I. S., R. A. Daw, P. J. Day, F. A. Ala, and M. R. Walker. Polymerase chain reaction for detection of human cytomegalovirus infection in a blood donor population// Br. J. Hematol. 1991. - V.78 - P.94-99

34. Boeckh M., and Boivin G. Quantitation of Cytomegalovirus: Methodologic Aspects and Clinical Applications// Clin microbiol reviews. July 1998. - V. 11, № 3 - P.533-554.

35. Bogner E, Reschke M, Reis B, et al. Identification of the gene product encoded by ORF UL56 of the human cytomegalovirus genome// Virology. 1993. - V. 196 - P.290-293.

36. Bongarts A, von Laer D, Vogelberg C, et al. Glycoprotein В genotype of human cytomegalovirus: Distribution in HIV-infected patients. Scand// J Infect Dis. 1996 -V.28 - P.447-449.

37. Bradshaw PA, Duran-Guarino MR, Perkins S, et al. Localization of antigenic sites on human cytomegalovirus virion structural proteins encoded by UL48 and UL56// Virology. 1994 - V.205 - P.321-328.

38. Britt WJ, Mach M. Human cytomegalovirus glycoproteins// Intervirology. 1996 - V.39 - P.401-412

39. Button L.N., DeWolf W.S., Newburger P.E. et al. The effects of irradiation on blood components// Transfusion. 1981. - V.21 - P.419-426.

40. Cha T-A, Tom E, Kemble GW, et al. Human cytomegalovirus clinical isolates carry at least 19 genes not found in laboratory strains// J Virol. 1996. - V.70 - P.78-83.

41. Chen-Yang Shen, Shu-Fen Chang, Show-Lin Yang, et al. Cytomegalovirus Is Present in Semen from a Population of Men Seeking Fertility Evaluation// The Journal of Infectious Diseases. 1994. - V.69 - P.222-223.

42. Chou S. Acquisition of donor strains of cytomegalovirus by renal-transplant recipients// N Engl J Med. 1986 - V.314 - P. 1418-1423.

43. Chou S. and K.M. Scott. Latex Agglutination and Enzyme-Linked Immunosorbent Assays for Cytomegalovirus Serologic Screening of Transplant Donors and Recipients// J Clin Microbiol. Oct. 1988 - V.26, №10 - P.2116-2119.

44. Chou S. Differentiation of cytomegalovirus strains by restriction analysis of DNA sequences amplified from clinical specimens// J Infect Dis.- 1990 V.162 - P.738-742.

45. Chou S. Molecular epidemiology of envelope glycoprotein H of human cytomegalovirus// J Infect Dis. 1992 - V.l66 - P.604-607.

46. Chou SW, Dennison KM. Analysis of interstrain variation in cytomegalovirus lycoprotein В sequences encoding neutralization-related epitopes// J Infect Dis. 1991 -V.163 -P.1229-1234.

47. Cinque P, Yago L, Brytting M, et al. Cytomegalovirus infection of the central nervous sytem in patients with AIDS: Diagnosis by DNA amplification from cerebrospinal fluid// J Infect Dis. 1992 - V.l66 - P.l408-1411.

48. Craighead JE, Kanich RE, Almeida JD. Nonviral microbodies with viral antigenicity produced in cytomegalovirus-infected cells// J Virol. — 1972 V.10 - P.766-775.

49. Delgado R, Lumbreras C, Alba C, et al. Low predictive value of polymerase chain reaction for diagnosis of cytomegalovirus disease in liver transplant recipients// J Clin Microbiol. 1992 - V.30 - P.876-1878.

50. Domen R.E., Nelson K.A. Results of a survey of infectious disease testing practices by organ procurement organizations in the United States. // Transplantation Jun. 1997. -V.63(12) - P.1790-1794.

51. Dow B.C. Microbiology confirmatory tests for blood donors// Blood Rev. Jun., 1999. -V.13(2) - P.91-104.

52. Farrell HE, Vally H, Lynch DM, et al. Inhibition of natural killer cells by a cytomegalovirus MHC class I homologue in vivo//Nature 1997 - V.386 - P.510-514.

53. Fries ВС, Chou S, Boeckh M, Torok-Storb B. Frequency distribution of cytomegalovirus envelope glycoprotein genotypes in bone marrow transplant recipients// J Infect Dis. -1994 V. 169 - P.769-74.

54. Gallina A, Simoncini L, Garbelli S, et al. Polo-like kinase 1 as a target for human cytomegalovirus pp65 lower matrix protein// J Virol. 1999 - V.73 - P. 1468-1478.

55. Gibson W. Protein counterparts of human and simian cytomegaloviruses// Virology -1983 V.128 - P.391-406.

56. Gibson W. Structure and assembly of the virion// Intervirology 1996 - V.39 - P.389-400.

57. Gilbert GL, Hudson I, Hayes K, James J. Prevention of transfusion-acquired cytomegalovirus infection in infants by blood filtration to remove leucocytes// Lancet -1989 V.l - P.1228-1231.

58. Halwachs-Baumann G, Wilders-Trucshnig M, Desoye G, et al. Human trophoblast cells are permissive to the complete replicative cycle of human cytomegalovirus// J Virol.-1998 V.72 - P.7598-7602.

59. Hemmings DG, Kilani R, Nyukiforuk C, et al. Permissive cytomegalovirus infection of primary villous term and first trimester trophoblasts// J Virol. 1998 - V.72 - P.4970-4979.

60. Horn J. Стабилизированный препарат пероксидазы. //Патент № 3726634 ФРГ, МКИ С 12 N 9108. Опубл. 23.02.1989.

61. Huang ES, Alford СА, Reynolds DW, et al. Molecular epidemiology of cytomegalovirus infections in women and their infants// N Engl J Med. 1980 - V.303 - P.958-962.

62. Huber MT, Compton T. The human cytomegalovirus UL74 gene encodes the third component of the glycoprotein H-glycoprotein L-containing envelope complex// J Virol. -1998-V.72-P.8191-8197.

63. Hunt A.F., Allen D.L., Brown R.L., Robb B.A., Puckett A.Y., Entwistle C.C. Comparative trial of six methods for the detection of CMV antibody in blood donors// J Clin Pathol. Jan. 1984 - V.37(l) - P.95-97.

64. Irmiere A, Gibson W. Isolation and characterization of a noninfectious virion-like particle released from cells infected with human strains of cytomegalovirus// Virology -1983 -V.130-P.118-133.

65. Jahn G, Kouzarides T, Mach M, et al. Map position and nucleotide sequence of the gene for the large structural phosphoprotein of human cytomegalovirus// J Virol. 1987 - V.61 - P.1358-1367.

66. Kawana Т., Kawagoe K., Takizawa J. Т., Cheng Т., Kawaguchi Т., Sacomoto S. Clinical and virologic studies on female genital herpes// Obset. Gynecol. 1982 - V.60 - P.456-461.

67. Klages S, Ruger B, Jahn G. Multiplicity dependent expression of the predominant phosphoprotein pp65 of human cytomegalovirus. //Virus Res. 1989 - V.12 - P. 159-168.

68. Komanduri K.V., Donahoe S.M., Moretto W.J., Schmidt D.K. et al. Direct Measurement of CD4+ and CD8+ T-Cell Responses to CMV in HIV-1-Infected Subjects// Virology. -2001 V.279, № 2 - P.459-470.

69. Landini MP, Guan MX, Jahn G, et al. Large-scale screening of human sera with cytomegalovirus recombinant antigens// J Clin Microbiol. 1990 - V.28 - P.1375-1379.

70. Landini MP, Severi B, Furlini G, Badiali DGL. Human cytomegalovirus structural components: Intracellular and intraviral localization of p28 and p65-69 by immunoelectron microscopy// Virus Res. 1987 - V.8 - P.15-23.

71. Landini MP. Antibodies to human cytomegalovirus structural polypeptides// Rev Med Virol. 1992 - V.2 - P.63-72.

72. Lazzarotto T, Spezzacatena P, Varani S, et al. Anticytomegalovirus (anti-CMV) immunoglobulin G avidity in identification of pregnant women at risk of transmitting congenital CMV infection// Clin Diag Lab Immunol. 1999 - V.6 - P.127-129.

73. Lazzarotto Т., Gabrielli L., Lanari M., Guerra В., Bellucci Т., Sassi M., and Landini M. P. Congenital Cytomegalovirus Infection: Recent Advances in the Diagnosis of Maternal Infection// Human Immunology. 2004 - V.65 - P.410-415.

74. Leitman S.F., Holland P.V. Irradiation of blood products// Transfusion 1985 - V.25 -P.293-303.

75. Levin MJ, Rinaldo CR, Leary PL, et al. Immune response to herpes virus antigens in adults with acute cytomegalovirus mononucleosis// J Infect Dis. 1979 - V. 140 - P.851-857.

76. Liu B, Stinski MF. Human cytomegalovirus contains a tegument protein that enhances transcription from promoters with upstream ATF and AP-1 cis-acting elements// J Virol. 1992 - V.66 - P.4434-4444.

77. M. Urban, T. Winkler,* M. P. Landini, W. Britt, and M. Mach. Epitope-Specific Distribution of IgG Subclasses against Antigenic Domains on Glycoproteins of Human Cytomegalovirus// Journal of Infectious Diseases 1994 - V. 169 - P.83-90.

78. M.P. Landini, A. Ripalti, K. Sra, and P. Pouletty. Human Cytomegalovirus Structural Proteins: Immune Reaction against ppl50 Synthetic Peptides// Journal of clinical microbiology Sept. 1991 - V.29, № 9 - P. 1868-1872.

79. Mar EC, Patel PC, Huang ES. Human cytomegalovirus-associated DNA polymerase and protein kinase activities// J Gen Virol. 1981 - V.57 - P. 149-156.

80. McMican A., Luban N.L.C., Sacher R.A., et al. Practical aspects of blood irradiation// Lab. Med. 1987 - V.l8 - P.299-303.

81. McVoy M.A. and Adler S.P. Immunologic Evidence for Frequent Age-Related Cytomegalovirus Reactivation in Seropositive Immunocompetent Individuals// The Journal of Infectious Diseases. Jul. 1989 - V.l 60, № I.

82. Meurman O., Waris M., Heedman K. Immunoglobulin G antibody in patient with respiratory syncytial infection// J. Clin. Microbiol. 1992 - V.30 - P. 1479-1484.

83. Mezzasoma L., Bacarese-Hamilton Т., Di Cristina M., Rossi R., Bistoni F., and A. Crisanti. Antigen Microarrays for Serodiagnosis of Infectious Diseases// Clinical Chemistry. -2002 V.48(l) - P. 121-130.

84. Mocarski E.S. Cytomegaloviruses and their replication. Fields of Virology. // Eds B.N. Fields et al., 3-rd Ed. Philadelphia, 1996 - P.2447 - 2492.

85. Mocarski ES. Cytomegalovirus biology and replication. In: Roizman B, Whitley R, Lopez C, eds. The Human Herpesviruses// Raven Press New York, 1993 - P. 173-226.

86. Pass RF, Britt WJ, Stagno S. Cytomegalovirus. // In: Lennette EH, Lennette DA, Lennette ET, eds. Diagnostic Procedures for Viral, Rickettsial and Chlamydial Infections, 7th ed. Washington, DC: APHA 1995 - P.253-271.

87. Pass RF, Griffiths PD, August AM. Antibody response to cytomegalovirus after renal transplantation: Comparison of patients with primary and recurrent infection// J Infect Dis. 1983 - V. 147- P.40-46.

88. Pass RF, Little EA, Stagno S, et al. Young children as a probable source of maternal and congenital cytomegalovirus infection. N Engl// J Med. 1987 - V.316 - P.1366-1370.

89. Patterson CE, Shenk T. Human cytomegalovirus UL36 protein is dispensable for viral replication in cultured cells// J Virol. 1999 - V.73 - P.7126-7131.

90. Pereira L, Hoffman M, Tatsuno M, Dondero D. Polymorphism of human cytomegalovirus glycoproteins characterized by monoclonal antibodies// Virology 1984- V.139-P.73-86.

91. Plotkin SA, Farquhar J, Hornberger E. Clinical trials of immunization with the Towne 125 strain of human cytomegalovirus// J Infect Dis. 1976 - V.134 - P.470-475.

92. Plotkin SA, Starr SE, Friedman HM, et al. Protective effects of Towne cytomegalovirus vaccine against low-passage cytomegalovirus administered as a challenge// J Infect Dis, -1989 V.59 - P.860-865.

93. Pustowoit В., Herrmann F., Макарова H.E., Кущ А.А. Динамика иммунного ответа при первичной цитомегаловирусной инфекции при реактивации цитомегаловируса у больных после аллотрансплантации органов// Вопросы вирусологии 2001. - № 2- С.24-29.

94. Revello М. G. and Gerna G. Diagnosis and Management of Human Cytomegalovirus Infection in the Mother, Fetus, and Newborn Infant. // Clinical Microbiology Reviews. -2002 V.15, № 4 - P.680-715.

95. Revello M., Percivalle E., Arbustini E., Pardi R., Sozzani S, and Gerna G. In Vitro Generation of Human Cytomegalovirus pp65 Antigenemia, Viremia, and LeukoDNAemia// J. Clin. Invest. Jun. 1998. - V.101, №12 - P.2686-2692.

96. Ripalti A, Ruan Q, Boccuni MC, et al. Construction of polyepitope fusion antigens of human cytomegalovirus ppUL32: Reactivity with human antibodies// J Clin Microbiol. -1994- V.32 P.358-363.

97. Roby C, Gibson W. Characterization of phosphoproteins and protein kinase activity of virions, noninfectious enveloped particles, and dense bodies of human cytomegalovirus// J Virol. 1986. - V.59 - P.714-727.

98. Romanowski MJ, Garrido-Guerrero E, Shenk T. pIRSl and pTRSl are present in human cytomegalovirus virions// J Virol. 1997 - V.71 - P.5703-5705.

99. Rosen HR, Corless CL, Rabkin J, Chou S. Association of cytomegalovirus genotype with graft rejection after liver transplantation// Transplantation 1998 - V.66 - P. 1627-1631.

100. S. Schmolke, H.F. Kern, P. Drescher, G. Jahn, and B. Plachter. The Dominant Phosphoprotein pp65 (UL83) of Human Cytomegalovirus Is Dispensable for Growth in Cell Culture// J Virol. 1995 - V. 69, № 10 - P.5959-5968.

101. Sarov I, Abady I. The morphogenesis of human cytomegalovirus. Isolation and polypeptide characterization of cytomegalovirions and dense bodies// Virology 1975 -V.66 - P.464-473.

102. Schoppel К, Kropff В, Schmidt С, et al. The humoral immune response against human cytomegalovirus is characterized by a delayed synthesis of glycoprotein-specific antibodies// J Infect Dis.-1997 V. 175 - P.533-544.

103. Schoub B.D., Blacburn N.K., Jonson S., et al. Low antibody avidity in elderly chickenpox patients// J Med Virol.- 1992 V.37 - P.l 13-115.

104. Shen C., Chang S., Yang S., Wu C., Yang Y., Ho H.N., and Huang E. Cytomegalovirus Is Present in Semen from a Population of Men Seeking Fertility Evaluation// The Journal of Infectious Diseases -1994 V. 169 - P.222-223.

105. Shepp DH, Match ME, Lipson SM, Pergolizzi RG. A fifth human cytomegalovirus glycoprotein В genotype// Res Virol. -1998 V. 149 - P. 109-114.

106. Sinzger C, Jahn G. Human cytomegalovirus cell tropism and pathogenesis// Intervirology 1996 - V.39 - P.302-319.

107. Somogyi T, Michelson S, Masse MJ. Genomic location of a human cytomegalovirus protein with protein kinase activity (PK68)// Virology 1990 - V. 174 - P.276-285.

108. Spaete RR, Gehrz RC, Landini MP. Human cytomegalovirus structural proteins// J Gen Virol. 1994 - V.75(12) - P.3287-3308.

109. Spector SA, Spector DH. Molecular epidemiology of cytomegalovirus infections in premature twin infants and their mother// Pediatr Infect Dis J. 1982 - V.l - P.405-409.

110. Spector SA. Transmission of cytomegalovirus among infants in hospital documented by restriction-endonuclease-digestion analyses// Lancet 1983 - V.l - P.378-381.

111. Stagno S. 1990 Cytomegalovirus. In:Remington JS, Klein JO (eds) Infectious diseases of the fetus and newborn infant// WB Sauders, Philadelphia.

112. Stinski MF. Human cytomegalovirus: Glycoproteins associated with virions and dense bodies// J Virol. 1976 - V. 19 - P.594-609.

113. Taubert H. Стабилизация гемм-содержащих ферментов и среда, стабилизированная таким образом.// Патент № 237325 ГДР, МКИ С 12 № 9/96. Опубл. 09.07.1986.

114. Thomas H.I.J., Morgan-Capner P., Cradeck-Waatson J.E., et al. Persistent of specific IgM and low avidity specific IgG, following primary rubella// J Virol Meth. 1992 -V.339 - P.149-155.

115. Thomas Morgan-Capner P., Cradeck-Waatson J.E., et al. Slow maturation of IgG avidity and persistence of specific IgM in congenital rubella; implications for diagnosis and immunopatology// J Med Virol. 1993 - V.41 - P. 196-200.

116. Torok-Storb B, Boeckh M, Hoy C, et al. Association of specific cytomegalovirus genotypes with death from myelosuppression after marrow transplantation// Blood -1997 V.90 - P.2097-2102.

117. Verbraak FD, van den Horn GJ, van der Meer JT, et al. Risk of developing CMV retinitis following non-ocular CMV end organ disease in AIDS patients// Br J Ophthalmol. -1998 V.82 - P.748-750.

118. Weber В., Berger A., Rabenau H. Human cytomegalovirus infection: diagnostic potential of recombinant antigens for cytomegalovirus antibody detection// Journal of Virological Methods 2001 - V.96 - P. 157-170.

119. Weber В., Fall E.M., Berger A., Doerr H.W. Screening of blood donors for human cytomegalovirus (HCMV) IgG antibody with an enzyme immunoassay using recombinant antigens// J Clin Virol. 1999 - V.l4(3) - P. 173-181.

120. Wehner R., Matterberger J.,Klenner D., Deutsch G. Стабилизация активности пероксидазы в растворе// Патент № 3509238 ФРГ. Опубл. 18.09.1986.

121. Wing В A, Lee GC, Huang ES. The human cytomegalovirus UL94 open reading frame encodes a conserved herpesvirus capsid/tegument-associated virion protein that is expressed with true late kinetics// J Virol. 1996 - V.70 - P.3339-3345.

122. Winkler M, Stamminger T. A specific subform of the human cytomegalovirus transactivator protein pUL69 is contained within the tegument of virus particles// J Virol. -1996-V.70-P.8984-8987.

123. Wolf DG, Honigman A, Lazarovits J, et al. Characterization of the human cytomegalovirus UL97 gene product as a virion-associated protein kinase// Arch Virol.-1998 V.143 - P.1223-1232.

124. Wolf DG, Spector SA. Early diagnosis of human cytomegalovirus disease in transplant recipients by DNA amplification in plasma// Transplantation 1993 - V.56 - P.330-334.

125. Zipeto D, Hong C, Gerna G, et al. Geographic and demographic differences in the frequency of human cytomegalovirus gB genotypes 1-4 in immunocompromised patients// AIDS Res Hum Retroviruses. 1998 - V. 14 - P.533-536.

126. Selivanov A.S. Стабильность ферментных препаратов в условиях, моделирующих распылительную сушку. // Химия растительного сырья 2002 - № 2 - С.121-127.

127. Guidance for Industry. Gamma irradiation of blood and blood components: a pilot program for licensing// www.fda.gov/cber/guidelines.htm.

Информация о работе

Ивченко, Светлана Николаевна
кандидата биологических наук
Кольцово, 2008
ВАК 03.00.23

Диссертация

Разработка стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих IgG к цитомегаловирусу человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы