Конструирование рекомбинантных антигенов и выявление генетических маркеров для диагностики герпесвирусных инфекций человека

Суслопаров, Михаил Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Конструирование рекомбинантных антигенов и выявление генетических маркеров для диагностики герпесвирусных инфекций человека
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Конструирование рекомбинантных антигенов и выявление генетических маркеров для диагностики герпесвирусных инфекций человека"

На правах рукописи

Суслопаров Михаил Александрович

КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИГЕНОВ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕРПЕСВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ЧЕЛОВЕКА

03 00 06 -вирусология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Кольцове - 2008

003172879

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Минздравсоцразвития России

Научный руководитель (или консультант) Официальные оппоненты

доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович доктор биологических наук, профессор Рябчикова Елена Ивановна доктор медицинских наук, профессор Кожевников Владимир Сергеевич

Ведущая организаг1ия

ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (ГУ НИИВ) РАМН. РАМН (Москва)

Защита состоится 26 сентября 2008 года в ** часов на заседании диссертационного совета Д 208 020 01 при ФГУН «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора по адресу ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора, Кольцово Новосибирской области, 630559, тел (8-383) 336-74-28

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора

Автореферат разослан £ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Л И Карпенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Герпесвирусные инфекции занимают одно из первых мест по распространенности, сложности диагностики и лечения среди инфекционных заболеваний Клинические симптомы этих инфекций перекрываются с множеством других заболеваний, поэтому большое значение придается разработке диагностических систем, позволяющих дифференцировать инфекционный агент с высокой степенью специфичности Сложность иммунодиагностики герпесвирусных инфекций обусловлена так же значительным серологическим перекрестом не только внутри семейства, но и с другими вирусами

Семейство Herpesviridae включает 8 видов герпесвирусов человека и состоит из трех подсемейств а-, (3- и у- herpesvinnae Наиболее существенное социальное и эпидемиологическое значение имеют шесть агентов - вирусы простого герпеса 1 и 2-го типа (ВПГ-1 ВПГ-2), вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая (ВВО), цитомегаловирус (ЦМВ), вирус герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6), и вирус Эпштейна-Барр (ВЭБ) Вирус герпеса человека 7-го типа (ВГЧ-7), и вирус саркомы Калоши или вирус герпеса человека 8-го типа (ВГЧ-8) открыты сравнительно недавно и этиопатогенетическое значение этих инфекций изучено не достаточно Данная работа посвящена исследованию первых 6-ти видов герпесвирусов человека

Социально-экономический ущерб, наносимый а-герпесвирусами, трудно переоценить Среди забочеваний, вызванных инфекцией вирусом простого герпеса, наибольшее значение имеет генитальный герпес, заболеваемость которым в разных странах достигает 80 - 200 случаев на 100 тыс населения, и этот показатель продолжает расти По данным официальной статистики, в России показатель заболеваемости генитальным герпесом составляет 8-9 случаев на 100 тыс населения, что, очевидно, не соответствует истинному положению и, прежде всего, связано с недостаточным клинико-диагностическим обследованием больных В США, по данным CDC, 45 миллионов людей старше 12 лет, или 1 из 5 подростков и взрослых заражаются ВПГ-2 Начиная с конца 1970-х годов, количество людей с генитальным герпесом в этой стране увеличилось на 30% Вероятно, при соответствующем уровне диагностики и статистических оценок, сходные показатели могут быть зарегистрированы в России Не менее значительный ущерб здоровью наносит и окулярный герпес Около половины случаев поражения роговицы и слепоты, вызванной инфекционными болезнями, связывают с герпетической инфекцией Тяжелейшей а-герпесвирусной инфекцией является энцефалит, требующий экспресс-диагностики и неотложной помощи, частота которого увеличилась вдвое в последние 5-10 лет \

В настоящее время практически во всех развитых странах Запада существует вакцинопрофилактика детей против ветряной оспы До введения VARIVAX вакцины в Соединенных Штатах Америки регистрировалось около 4 млн случаев ветряной оспы в год (количество, эквивалентное числу новорожденных), что ежегодно приводило к 8 00012 ООО случаям госпитализации и, по крайней мере, к 100 смертельным случаям В России вакцинация против ВВО отсутствует

Возрастающая угроза биотерроризма требует разработки дифференциальной экспресс-диагностики а-герпесвирусов, которая позволит дифференцировать натуральную и ветряную оспу на ранних этапах клинических проявлений

Сероэпидемиологические исследования p-герпесвирусных инфекций показывают, что цитомегаловирусная инфекция широко распространена в человеческой популяции от развитых, промышленных сообществ до различных групп аборигенов Инфекция ЦМВ превалирует среди детей и подростков развивающихся стран, и в нижних социально-экономических слоях экономически-развитых стран Социально-экономическое значение этой инфекции прежде всего связывают с поражением герминативного эпителия у мужчин и женщин У мужчин такие поражения приводят к полиплоидии сперматозоидов и к бесплодию Оценка распространенности инфекции ЦМВ среди здоровых семейных пар в Юго-Западной Азии, обращающихся за медицинской помощью по поводу бесплодия колеблется от 25,3% до 92% Чрезвычайно актуально выявление острой инфекции у беременных женщин, т к почти все случаи мертворождения инфекционной природы связывают с этой инфекцией Не менее важно выявление инфекции ЦМВ во время беременности в связи с угрозой тератогенного эффекта "Широкое распространение ЦМВ среди людей, опубликованные данные о его связи с атеросклерозом и другими болезнями, диктуют необходимость разработки более совершенных видов диагностики и детального изучения его роли в патогенезе этих заболеваний

Вирус герпеса человека 6 типа исследуется сравнительно недавно, и эпидемиология этой инфекции изучена недостаточно Значительное количество работ посвящено роли ВГЧ-6 в патогенезе рассеянного склероза и других заболеваниях нервной системы Опубликован ряд работ, показывающих вовлечение этой вирусной инфекции в формирование синдрома хронической усталости Инфекция герпесвирусом 6 типа проявляется в младенчестве в виде внезапной экзантемы, это - наиболее изученное проявление болезни Разработка высокоспецифичной диагностики Р-герпесвирусных инфекций чрезвычайно актуальна ввиду их широкой распространенности и слабой изучепности

Инфекция вирусом Эпштейна-Барр (подсемейство у - герпесвирусов) прежде всего ассоциируется с инфекционным мононуклеозом, лимфомой Биркита, носоглоточной

(назофарингеалыюй) карциномой и лимфопролиферативными болезнями иммуносупрес-сивных лиц В большинстве случаев инфекция ВЭБ протекает без видимых проявлений болезни Среди взрослого насетения планеты у 80-90% здоровых лиц регистрируется серологическое подтверждение инфекции вирусом ВЭБ в прошлом Для вируса Эпштейна-Барр, как и для других герпесвирусов человека, характерна скрытая (латентная) форма инфекции В настоящее время значительно возросло количество онкозаболеваний, этиологическим агентом которых определен вирус Эшптейна-Барр Все эти обстоятельства делают разработку диагностики у - герпесвирусных инфекций важной и актуальной

В России для выявления антител к герпесвирусам в крови пациентов до наших исследований использовался твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) на основе нативных антигенов Анализ состояния разработок диагностических тестов для выявления антител к герпесвирусам в сыворотках больных показал, что принципиально важным в этой области является поиск и выбор высоко специфичных антигенов, прежде всего, полученных методами генной инженерии

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования было конструирование видоспецифичных ре-комбинантных антигенов и выявление генетических маркеров герпесвирусов 1-6 типов для диагностики соответствующих герпесвирусных инфекций человека

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

1 На основе анализа литературных данных выбрать иммунодоминангные белки герпесвирусов 1-6 типов человека для конструирования на их основе видоспецифичных рекомбинантных антигенов

2 С помощью компьютерного анализа аминокислотных последовательностей выбранных белков-антигенов герпесвирусов определить в их структуре потенциальные антигенные детерминанты и кодирующие их участки соответствующих генов, а также подобрать о-шгонуклеотиды-праймеры и оптимальные условия ПЦР для амплификации выбранных районов генов исследуемых герпесвирусов

3 Амплифицировать и клонировать выбранные районы геномов референсных штаммов герпесвирусов 1-6 типов человека в клетках Е coli в составе плазмидных эке-прессирующих векторов Наработать, очистить и оценить пригодность для диагностики полученных рекомбинантных антигенов

• разработать вариант экспрессирующего плазмидного вектора, кодирующего шестигистидиновый тракт (6xHis), формирующий на С-конце целевого рекомбинантного белка аффинную мишень для очистки белка на металлохелатных сорбентах,

клонировать выбранные фрагменты геномных ДНК исследуемых герпесви-

русов в клетках Ecoh в составе экспрессирующего вектора и получить штаммы-продуценты соответствующих видоспецифичных рекомбинантных антигенов,

• подобрать оптимальные условия очистки рекомбинантных белков-антигенов и наработать их в препаративных количествах,

• используя стандартные панели сывороток и сыворотки от больных герпес-вирусными инфекциями, оценить возможность использования полученных рекомбинантных антигенов для выявления в сыворотках больных иммуноглобулинов, специфичных к соответствующим типам герпесвирусов,

• разработать панель сывороток человека для выявления иммуноглобулинов, специфичных к цитомегаловирусу,

• получить флуоресцентные антисыворотки к рекомбинантным антигенам ци-томегаловируса

4 Провести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей геномов герпесвирусов 1-6 типов человека, депонированных в международных электронных базах данных, с целью выявления специфичных для них генетических маркеров

• выявить районы геномов, перспективные для использования в качестве генетических маркеров соответствующих типов герпесвирусов,

• с учетом вариабельности выбранных генетических районов герпесвирусов разработать олигонуклеотиды-праймеры, условия и кинетику амплификации методом ПЦР выбранных генетических маркеров,

• создать лабораторные варианты и апробиповать разработанные способы обнаружения геномных ДНК герпесвирусов 1-6 типов методом ПЦР на коллекции референс-штаммов герпесвирусов человека, а также на клиническом материале от больных

Научная новизна

В ходе работы впервые проведена комплексная оценка иммунодоминантных районов вирионных белков герпесвирусов человека 1-6 типов Выявлены потенциальные антигенные детерминанты в иммунодоминантных районах белков шести типов герпесвирусов человека Сконструирован штазмидный вектор, обеспечивающий экспрессию клонированных в его составе чужеродных генов с образованием белков, содержащих дополнительную шестигистидиновую последовательность в С-концевой области цепи, позволяющую осуществлять аффинную очистку белка на металлохелатных сорбентах Необходимость создания такого вектора была обусловлена отсутствием в то время конструкций, формирующих на С-конце 6*His мишень для очистки полноразмерной копии белка Существовали только конструкции, обеспечивающие экспрессию генов с образованием белков, имеющих аффинную мишень на N-конце

На основе обнаруженных уникальных аминокислотных последовательностей в вирионных белках герпесвирусов (ВПГ-1, ВПГ-2, ВВО, ЦМВ, ВГЧ-6 и ВЭБ) разработаны рекомбинантные антигены, специфичные для соответствующих типов герпесвирусов человека

• вирусов простого герпеса 1 и 2 типов рек-§0-1 (ВПГ-1) и рек^О-2 (ВПГ-2)

• вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая рек^Е (ВВО)

• цитомегаловируса человека (ЦМВ) рек-рр150, рек-1Е2, рек-р52 и рек-рр65

• вируса герпеса человека 6-го типа (ВГЧ-6) рек-рЮО и рек-р41

• вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) рек-р18 и рек-р54

Продемонстрирована перспективность использования полученных в данной работе рекомбинантных белков в качестве специфичных антигенов для выявления антител к соответствующим типам герпесвирусов

Выявлены новые генетические маркеры герпесвирусов человека 1-6 типов Практическая ценность работы

Практическая значимость данного исследования состоит в разработке рекомбинантных антигенов, специфичных для герпесвирусов 1-6 типов и перспективных для создания на их основе отечественных высокочувствительных диагностических систем удовлетворяющих требованиям клиническои практики

С помощью разработанных в рамках данного исследования рекомбинантных антигенов рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65 в ЗАО «Медико-биологический союз» (г Новосибирск) создана и утверждена в ГИСК им Л А Тарасевича стандартная панель сывороток человека для контроля иммуноферментных диагностических тест-систем, выявляющих ДО к цитомегаловирусу человека Стандартная панель внесена в Реестр национальных стандартных образцов РФ под номером ОСО 42-28-360-01

На основе сконструированных в настоящей работе антигенов ЗАО «Медико-биологический союз» (Новосибирск) разработана иммуноферментная тест-система для определения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека Разработанные рекомбинантные антигены герпесвирусов в настоящее время используются для создания иммуноферментных тест-систем такими отечественными производителями, как ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск), ЗАО «Медико-биологический союз» (Новосибирск) и ЗАО «ИмДи» (Новосибирск)

Получены меченые моноспецифические кроличьи антисыворотки к рекомби-нантным антигенам рек-1Е2 и рек-рр65 цитомегаловируса, позволяющие выявлять этот вирус в клинических образцах с помощью иммунофлуоресцентного анализа т нЫ

Созданы лабораторные варианты тестов для обнаружения герпесвирусов человека, основанные на амплификации методом ПЦР выявленных в настоящей работе генетических маркёров соответствующих типов герпесвирусов Показана перспективность создания на их основе коммерческих тест-систем В настоящее время часть их из них используется в ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) для создания диагностических тест-систем Значительная часть разработанных в работе генетических конструкций, олигонуклеотидов защищена патентами Российской Федерации

Разработанные способы диагностики инфекций, вызываемых герпесвирусами 1-6 типов, могут быть использованы в клинической диагностической практике, для скрининга донорской крови, которая пока в России не тестируется на присутствие вирусов данной группы, в трансплантологии и для проведения мониторинга различных групп населения во время эпидемиологических обследований

Положения, выносимые на защиту

1 Сконструированные экспрессирующие плазмидные конструкции, включающие фрагменты генов герпесвирусов человека, обеспечивают биосинтез в клетках Е coli ре-комбинаитных белков, содержащих иммунодоминаигные области антигенов герпесвирусов 1-6 типов

2 Использование рекомбинантных антигенов герпесвирусов 1 -6 типов в ИФА позволяет выявлять антитела в сыворотке крови человека, специфичные для соответствующих герпесвирусов

3 Сконструирован бактериальный (Е coli) экспрессирующий вектор на основе плазмид-ной ДНК pUR290-6*his Отличительными особенностями этой конструкции является кодирование шестигистидинового тракта (6xHis), который формирует на С-конце целевого рекомбинантного белка аффинную мишень для очистки полноразмерной копии белка на металлохелатных сорбентах, и биосинтез ß-галактозидазы, которая в конечной конструкции укорачивается до небольшого размера и обеспечивает высокий уровень сорбции белка на полистирольных планшетах

4 • Флуоресцентные антисыворотки к рекомбинантным белкам рек-рр150, рек-1Е2 и рек-рр65 цитомегаловируса позволяют выявлять этот вирус в клинических образцах с помощью иммунофлуоресцентного анализа т situ

5 Стандартная панель сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу человека (ОСО 42-28-360-01) позволяет контролировать качество им-муноферментных тест-систем, выявляющих специфические IgG к ЦМВ

6 Олигонуклеотидные праймеры к генам US-6 (ВПГ-1) и UL44 (ВПГ-2), UL36 (ВВО), UL55 (ЦМВ), BKRF1 (ВЭБ) и Uli (ВГЧ-6), используемые в ПЦР, позволяют обнаружи-

вать геномные ДНК различных штаммов и клинических изолятов соответствующих типов герпесвирусов

Конкретное участие автора в получении результатов

Участие автора при проведении всех исследований по диссертации заключается в личном проведении и участии практически во всех экспериментальных и теоретических работ А также в научном руководстве и соруководстве исследований по герпесвирусам, выполняемых в лабораториях ФГУН ГНЦ ВБ "Вектор", совместно с сотрудниками других институтов и производственных фирм

Апробация работы

Представленные в диссертации результаты были доложены па различных конференциях и симпозиумах Международной конференции " A multidisciplmary approach towards controlling cytomegalovirus disease" (Sweden, Stockholm, 1995), Международной конференции "The 22nd International Herpesvirus Workshop"(La Jolla, California, 1997), Юбилейная конференция, посвященная 30-летию журнала "Молекулярная биология" (Москва, 1997), Международной конференции "CMV 7th Internationa! Workhop" (Brighton, UK, 1999), Международной конференции «Assessment of Sponsored Biological Research in Russia for the New Millennium» (Russia, 1999), Российской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Россия, 2005)

Публикации

По материалам исследований опубликовано 15 статей в реферируемых научных журналах и получено 10 патентов Российской Федерации

Структура работы

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, главы материалы и методы и главы из 5 разделов, отражающих результаты собственных исследований и их обсуждения, выводов и приложений Работа изложена на 416 с, включая 62 таблицы и 127 рисунков Список литературы из 657 наименований включает 35 отечественных работ

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Теоретический анализ иммунодомипантных белков

герпесвирусов человека 1-6 типов '

В настоящее время в ИФА используют денатурированные формы белков, которые обеспечивают высокую однородность сорбции на планшете и стабильность величины оцениваемой оптической плотности Поэтому этот раздел нашей работы был посвящен выявлению только непрерывных или линейных антигенных детерминант

Анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей осуществляли с помощью компьютерной программы Alignment Service (v 4 1) Для поиска гомологов белков использовали компьютерную систему создания банка образов белковых семейств PROF_PAT 1 0 Теоретический анализ структуры белка осуществляли с использованием программы PC/GENE и разработанных в ГНЦ ВБ «Вектор» программ SAL1X и Alignment Service Нуклеотидные последовательности геномных ДНК и аминокислотные последовательности белков герпесвирусов человека 1-6 типов, были получены из банка данных GeneBank и анализировались с помощью компьютерной программы ClustalX

а-Герпссвирусы Вирусы простого герпеса 1 и 2 типа По данным литературы, при инфекции максимальное количество иммуноглобулинов крови вырабатывается на структурные белки вируса, и среди этих белков наиболее сильные антигены - гликопротеины gD, gB, gC и gG , кодируемые генами US6, UL27, UL44 и US4, соответственно Гликопротеины gD-1 и gD-2 достаточно гомологичны между собой, но С-концы этих белков имеют низкую степень гомологии Показано, что специфические антитела к ВПГ-1 вырабатываются иммунной системой инфицированного человека именно к С-концевой линейной части белка Гликопротеин. рР. играет основную роль в В-клеточном иммунном ответе к ВПГ Были идентифицированы четыре области gD (I-1V), важные для вирусного морфогенеза' Показано, что мутации в этих областях gD препятствуют появлению полноценного инфекционного вируса Кроме того, они затрагивают иммунодоминантные районы и препятствуют формированию антигенных эпитопов (рис 1)

HjNI

1 1\ 27 34

сввшсШсш

I Tjr;

III

I I__I» " I — w ^ я w т

г 1~\ з~ //1\Ч I5'6'7

132 140 222 224 234 240 250 260 285

" Рас 1 Схематическое изображение полноразмерной последовательности ВПГ Полноразмерная последовательность в вирионах ВПГ Размер gD-l - 393 а. о Размер gD-2 - 392 а о Каждый из них имеет сигнальную последовательность для секреции, имеет три Ы-сцепленных углевода (круги), три дисульфидных связи (С-С) - штриховая линии Мутации, ассоциированные с функцией, накапливаются в четырех областях (I - IV) Прямоугольниками черного цвета обозначены гипотетические антигенные детерминанты 1-7, по данным литературного анализа

Учитывая данные литературного анализа, этот гликопротеин мы выбрали в качестве кандидата на создание рекомбинантного антигена ВПГ-1

Рве 2 Профиль гидрофильное™ {>0-1 В прямоугольники взяты области выявленных антигенных детерминант С-конца белка. Высота прямоугольника пропорциональна индексу гидрофильно-сти детерминанты (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках)

Компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка gD-1 (ВПГ-1) с помощью программы PC/GENE выявил основные гипотетические линейные антигенные детерминанты (рис 2) Поэтому дм амплификации гена бежа gD-1 выбрали только область, кодирующую С-концевую гидрофильную часть этого белка, с 269 по 392 а о (размер ДНК-фрагмента, включая праймеры, 395 п и ) и содержащую все 3 антигенных эпито-па, предсказанных компьютерным анализом

Одним из основных антигенов вируса простого герпеса 2 типа является гликопро-теин G (gG) Он кодируется геном US4 и представляет собой гликозилированный белок с молекулярной массой 100 кДа и является одним из белков, составляющих оболочку вируса Как показано в значительном количестве работ, в отличие от других вирусных глико-протеинов этот гликопротеин является высоко специфичным антигеном ВПГ-2 Этот вирусный белок не имеет серологического сродства с белками других герпесвирусов человека и содержит от 3-х и более антигенных эпитопов (по данным разных авторов), сосредоточенных в С-конце молекулы и обладающих высокой специфичностью по отношению к антителам, специфичным к ВПГ-2

Для поиска гомологов белка gG-2 ВПГ-2 среди всех известных белков бьша построена база данных образов белков, гомологичных gG-2 Поиск гомологов gG-2 ВПГ-2 в системе PROF_PAT 1 0 выявил 19 аминокислотных последовательностей из банка Swiss-Prot 12 - штаммов ВПГ-2, 7 - штаммов ВПГ-1 При этом последовательности генов, кодирующих gG-1 и gG-2, показывают значительные различия При степени гомологии не более 40% в банке образов остаются только гомологи gG ВПГ-1,2 Гликопротеины gG-1 и gG-2 содержат 238 и 699 а о , соответствешю Компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка gG-2 с помощью программы PC/GENE выявил основные гипотетические линейные антигенные детерминанты (рис 3)

Рис. 3. Профиль гидрофильное™ §0-2 В прямоугольники взяты области выявленных антигенных детерминант Высота прямоугольника пропорциональна индексу гидрофилшости детерминанты (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках)

/-\

676663

Агд-А1а-Gly-ArgArg-

Г 573- 578 Pro-Glu-Asp-Asp-Asp-Ser

Уровень гомологии между эпитопами гликопротеинов в у вирусов ВПГ-2 и ВПГ-1 чрезвычайно низок Это дает нам основание считать, что использование рекомбинантно-го аналога С-концевой части белка gG-2 в качестве антигена не вызовет перекрестных серологических реакций с антителами к ВПГ-1 Поэтому для амплификации гена и последующего клонирования, с целью получения рекомбинантного антигена мы выбрали район с 438 по 695 а о gG2 (1184) ВПГ-2

Гликопротеин gpl или вЕ (ORF68) обильно продуцируется в инфицированных ВВО клетках Показано, что gpl самый иммуногенный среди гликопротеинов ВВО, стимулирующий гуморальный и клеточный иммунитет Использование этого нативного гли-копротеина в качестве антигена показывает его высокую специфичность и очень слабую перекрестную реактивность

Сравнение аминокислотных последовательностей данного белка разных штаммов, полученных из базы данных SWISSPROT Protein Sequence Database Release, показало полную штаммовую гомологию этих последовательностей и очень низкую гомологию с аналогами этого белка среди других герпесвирусов (менее 50%) Сравнение аминокислотных последовательностей белка gE пяти штаммов и изолятов ВВО говорит о полной гомологии и очень высокой консервативности этого белка Это практически уникальный случай среди герпесвирусных гликопротеинов Анализ вторичной структуры белка позволил выявить наиболее вероятные области формирования ядер антигенных эпитопов

Вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая

J генных детерминант

минакг указаны в сносках)

(последовательности гипотетических детер-

Рвс 4 Профили вероятных изгибов аминокислотной последовательности gE, локализация полярных аминокислотных остатков и профиль гидрофиль-ности В прямоугольники взяты области предсказанных анти-

С помощью компьютерного анализа в аминокислотной последовательности белка gE нами было выявлено наличие 3-х антигенных эпитопов с линейными детерминантами (рис 4) Поэтому для клонирования и получения рекомбинантного белка на основе был выбран фрагмент гена, кодирующий все три эпитопа с 25 по 344 а о

р-Герпеевпрусы Цитомегаловирус человека Анализ данных литературы по антигенному спектру белков цитомегаловируса человека показал, что среди его антигенов белки рр150,1Е2, р52 и рр65 являются наиболее перспективными кандидатами для создания на их основе рекомбинантных антигенов Поэтому наше внимание было сосредоточено на получении рекомбинантных антигенов на основе этих белков

Представляемая работа начиналась в начале 90-х годов и первым, созданным ре-комбинантным антигеном, был антиген рек-1Е2 ЦМВ К сожалению, в то время в нашей стране отсутствовали возможности компьютерного анализа Поэтому выбор антигена, иммунодоминантной части и кодирующей его нуклеогидной последовательности был полностью основан на зарубежных литературных данных В начале 90-х годов значительная часть исследователей с получением рекомбинантного 1Е2 связывала возможность создания на его основе высокоспецифичной ранней ИФА-диагаостики Логика таких, в том числе и нашей, работ основывалась на том, что это предранний белок, экспонируемый на мембране зараженной клетки Предполагалось, что на него в первую очередь будут нарабатываться антитела, как на одного из первых белков, презентуемых иммунной системе в ходе развития инфекции ЦМВ Однако уже после первых работ по получению рекомбинантных форм белка 1Е2 интерес исследователей, стремящихся создать достоверную ИФА-диагностику, практически полностью пропал к этому антигену В ходе ЦМВ инфекции к этому белку, конечно, нарабатываются антитела, но в большинстве случаев их уро-

вень и время появления недостаточно достоверно связано с фазами инфекции Мы выбрали для клонирования всю последовательность гена 1Е2 (984 по)

Не смотря на слабую серологическую реактивность, свойство 1Е2, экспонироваться на мембранах зараженных клеток в ранней фазе инфекции, в настоящее время эффективно используется в клинической диагностике острой инфекции ЦМВ Меченые моно-клональные антитела и моноспецифические антисыворотки к нему позволяют с помощью микроскопии выявлять продуктивную инфекцию в той или иной ткани

Главный матричный ФосФопротеин рр!50 Компьютерный анализ первичной структуры белка позволил определить локализацию иммунодоминантных областей, специфичных для ЦМВ и перспективных для создания на их основе рекомбинантного аналога антигена рр150 Нами было обнаружено три гипотетических антигенных детерминанты, которые отмечены на рис 5 Сравнение аминокислотных последовательностей белка рр150 ЦМВ с аналогичным белком рЮО ВГЧ-6 показало, что эти эпитопы расположены в негомологичных районах белка С целью получения рекомбинантного белка рек-рр150 для клонирования была выбрана нуклеотидная последовательность гена иЬ32, кодирующая гидрофильную область белка 369-760 а о (размер ДНК-фрагмента 1176 н о) белка

щщ jli^llill

1_ая-— / «в Ш477 * о AsfM3tu-0)u-G lu rfl-Afg -Glu-Arj / \ _i ^ im \ 7*4-71» to

Рнс S Профили распределения а-спиральных (Alpha) и [i-складчатых (Beta) структур, изгибов полипептидной молекулы (Turn), зарядов (+ -) и гидрофобных областей (Hydro) белка рр150 Прямоугольниками серого цвета отмечены вероятные области формирования ядер антигенных эпитопов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках)

ДНК-связывающий белок р52 (ген UL44) Локализацию линейных антигенных детерминант осуществляли в аминокислотной последовательности, полученной из базы данных SWISSPROT (Protein Sequence Database Release 42 0) Анализ вторичной структуры белка позволил определить три наиболее вероятные области формирования ядер антигенных эпитопов

- W

л.

187-172 «о Lys-Arg-Asn Vtl-Ly»-Lye

Ж-У

410-417 ■ О. L.y*-Glu-Glu-S«r-Asp-fter-Glu-Asp

337-343 а о Gly-Lys-Lys-Hie-Asp-Arg-Gly

Рис 6 Профили распределения а-спиральных (Alpha) и Р-складчатых (Beta) структур, изгибов полипептидной молекулы (Turn), зарядов (+ -) и гидрофобных областей (Hydro) белка р52 Прямоугольниками серого цвета отмечены вероятные области формирования ядер антигенных зпитопов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках)

В ходе анализа во внимание принимались особенности вторичной структуры ((5-складчатосгь окружения, отсутствие явных изгибов полипептидной цепи в гидрофильных петлях и наличие гидрофобного окружения), заряд аминокислотных остатков и гидрофильные свойства (на рис 6, серым цветом помечены максимально гидрофильные участки)

АдЗ

RGD Ад2

OUT

кео-соон ядерная мембрана

Д> лощ ии сайг

Рис 7 Гипотетическая структура конформации белка р52 на ядерной мембране Agl,Ag2и А^З - гипотетические антигенные эпитопы ЫОБ — сайт гликозилирования, КОП — сайт адгезии Спиралевидной линией обозначен трансмембранный участок С1-Сг5 - гидрофобные участки белка состоящие из глициновых повторов

В результате были выявлены гипотетические антигенные детерминанты, ядра эпитопов, трансмембранный домен, сайты адгезии, участок связывания ДНК и построена модель конформации белка р52, локализованного на ядерной мембране (рис 7) Таким образом, выяснилось, что лишь два из трех гипотетических эпитопов способны с наибольшей вероятностью быть антигенными детерминантами, т к один элитоп расположен а зоне трансмембранного и ДНК-связывающего домена При конструировании рекомби-нантного антигена рек-р52 было решено клонировать область гена, кодирующую гидро-

фильную часть белка с 200 по 341 а о (размер ДНК-фрагмента 731 по) и содержащую два антигенных эпитопа в своем составе Выбранная область не содержит гомологии с аналогами ДНК-связывакнцего белка других типов герпесвирусов

Матричный белок тегумента рр65 Белок рр65 (белок тегумента вириона, ген UL83) был выбран как следующий кандидат для создания рекомбинантного антигена Этот белок считают «маркером патогенности» и он индуцирует синтез специфических антител на ранних стадиях продуктивной инфекции

Компьютерный анализ аминохислотной последовательности белка рр65 ЦМВ выявил наиболее гидрофильные области, и с учетом особенностей вторичной структуры, распределения зарядов и гидрофобности были предсказаны три потенциальные антигенные детерминанты (рис 8)

Исходя из полученных данных, область гена белка рр65, кодирующая гидрофильную часть этого белкас231по551ао и содержащая все антигенные эпитопы, предсказанные компьютерным анализом, была выбрана нами для амплификации методом ПЦР и последующего клонирования составе экспрессирующих векторов в клетках Е coli

гм 404-409 а О. Ser-Asp-Ser-Asp-Glu-Gfai 1 . jfV-b—-1 __ X Ю44Э «.0 / Lp-Arg-Arg-Arg-His-Arg

46М71 Я-О GJu-Glu-Asp-Thr Asp-Glu-Asp

Рве 8 Профили распределения а-спиральных (Alpha) и ß-складчатых (Beta) структур, изгибов полипептидной молекулы (Tum), зарядов (+ -) и гидрофобных областей (Hydro) белка рр65 Прямоугольниками серого цвета отмечены вероятные области формирования ядер антигенных эпитопов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках)

Вирус герпеса человека 6 типа

Структурный белок рЮО. или белок тегумента (ген Uli) вируса герпеса человека б типа является фосфопротеином (обозначается как ррЮО), активно реагирующим с сыворотками крови человека при иммунологическом анализе

B-тип

А-тип

Рис 9 Теоретические профили распределения а-спиральных (Alpha) и ß-складчатых (Beta) структур, изгибов полипептидной молекулы (Turn), зарядов (+ -) и гидрофильных областей (Hydro) белка ррЮО Прямоугольниками серого цвета отмечены вероятные области формирования ядер антигенных эпитопов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках)

В ходе компьютерного анализа был идентифицирован ген Uli, кодирующий данный белок, и определена его нуклеотидная последовательность для А- и B-типов ВГЧ-б Анализ также позволил нам предположить, что в аминокислотной последовательности белка рЮО имеется 3-х антигенных эпитопа с уникальными линейными детерминантами (рис 9) Для амплификации гена белка рЮО выбрали область, кодирующую район белка рЮО с 494 по 842 а о и содержащую 3 гипотетических антигенных эпитопа

Белок р41 ВГЧ-6, кодируемый геном U27 (старое название EPLF1), является гомологом белка ICP36, относящегося к семейству фосфорилированных и гликозилирован-ных белков, которые кодируются геном UL 44 ЦМВ человека Иммунохимические исследования с сыворотками пациентов с инфекцией герпесвируса 6 типа, показали, что белок р41 активно взаимодействует с вирусспецифическими IgM- и IgG-антителами к ВГЧ-6 В настоящее время он используется в качестве антигена при проведении ИФА Компьютерный анализ аминокислотной последовательности белка р41 с помощью программы PC/GENE выявил основные линейные антигенные детерминанты (рис 10)

Практически ничего неизвестно в литературе об антигенном спектре этого белка Поэтому в качестве района для последующего клонирования кодирующей последовательности и создания рекомбинантного антигена рек-р41 ВГЧ-6 мы выбрали всю последовательность белка (с 1 по 363 а о )

284 2»! Lyi Glu Glu-Ser Aig Glu-Lyi-Glg-Asp-Sct-Gla

Рис 10. Профили гидрофильное™ р41 ВГЧ-6 В прямоугольники взяты области выявленных антигенных детерминант Высота прямоугольника пропорциональна индексу гидрофильное™ детерминанты (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках)

у-Герпесвирусы Вирус Эпштейна-Барр

Известно, что на острых стадиях развития инфекции ВЭБ в сыворотках крови больных обнаруживают IgM-антитела к вирусному капсидному антигену VCA, а также IgG к раннему антигену ЕА В большинстве случаев при этом антитела связываются с р18 (VCA) и р54 (EA-D) Именно эти белки были выбраны для получение рекомбинантных антигенов, содержащих иммунодоминантные фрагменты белков р18 и р54

Методами компьютерного анализа были выявлены гипотетические антигенные детерминанты на аминокислотных последовательностях белков р18 (VCA) и р54 (EA-D) вируса Эпштейна-Барр (ВЭБ) (см рис 11 и 12, соответственно)

Рис 11. Профиль гидрофильности белка р18 при выборке из 7 - (А) и 5 - (Б) аминокислотных остатков в эпитопе (координаты ось абсцисс - длина белка в а о, ось ординат - индекс гидрофильности) На графике А прямоугольниками выделены области гипотетических антигенных эпигопов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках)

Рве 12 Профиль гидрофобное™ белка р54 при выборке из 7 - (А) и 5 - (Б) аминокислотных остатков в эпнтone (координаты ось абсцисс - длина белка в а о , ось ординат - индекс гидрофильное™) На графике А прямоугольниками выделены области гипотетических антигенных эпи-топов (последовательности гипотетических детерминант указаны в сносках)

На рис 11А показаны три основные гипотетические детерминанты белка р18 при выборке 7 а о При выборке 5 а о в этом белке выявлялись и другие гипотетические детерминанты, равномерно представленные в N-концевой части белка (см рис ПБ) Поэтому для клонирования иммунодоминантного района была выбрана полная нуклеотидная последовательность гена BFRF3 белка р18 Аналогичным образом были выявлены 4 основные гипотетические детерминанты при выборке 7 а о (см рис 12А) белка р54 Следует заметить, что в районе 78-391 а о были выявлены и другие гипотетические детерминанты при выборке 5 а о (рис 12Б) Фрагмент гена BMRF1, кодирующий этот иммунодоми-нантный район, был выбран для клонирования В обоих белках были выявлены области гидрофобности Однако уровень гидрофилыюсти этих участков не превышал 0 42-0 68 и поэтому рассматривать их как трансмембранные домены представляется маловероятным Сравнение аминокислотных последовательностей со всеми белками других герпесвирусов человека показало отсутствие гомологии выявленных иммунодоминантных районов pl8(VCA) и р54(ЕА) с белками других герпесвирусов Это позволило нам надеяться, что выбранные районы окажутся уникальными, а рекомбинантные белки будут взаимодействовать только со специфическими к ВЭБ антителами

Клонирование п экспрессия выбранных генов Получение и очистка рекомбинаитных белков Иммуноферментиын анализ Для получения высокоочищенных рекомбинантных антигенов в нашей лаборатории, лаборатории герпесвирусов ГНЦ ВБ «Вектор», была сконструирована плазмида для интеграции чужеродных генов, в которой за клонированной последовательностью в рамке

считывания следовала последовательность, кодирующая полигистидиновый тракт Наличие на С-конце рекомбинантного белка мишени из 6 остатков His позволяет использовать её для выделения с помощью аффинной хроматографии металлохелатные смолы (например, Ni-NTA resin) и получать уровень очистки 90-95% Наличие в нашей конструкции на С-конце рекомбинантного белка аффинной мишени, в отличие от существовавших в то время коммерческих конструкций, в которых полигистидиновый тракт чаще расположен на N- конце, при выделении на металлохелатной смоле однозначно подтверждало экспрессию гена и биосинтез полноразмерного кодируемого им рекомбинантного белка

Наша экспрессирующая плазмидная конструкция была сделана на основе плаз-миды pUR290 Отличительными особенностями этой конструкции является биосинтез полноразмерной ß-галактозидазы (которая в конечной конструкции укорачивалась до небольшого размера), генетический маркер - ген ß-лактамазы (Ыа), определяющий устойчивость трансформированных плазмидой клеток Е coli к ампициллину, и высокая устойчивость к рекомбинации при пассировании Использование этой конструкции приводит к накоплению продукта в нерастворимой форме в виде телец включения (inclusion body) в клетках Е coli Это существенно повышает выход синтезируемого белка в сравнении с растворимыми формами В производстве ИФА-тест-систем обычно используют денатурированные формы белков антигенов Это позволяет улучшить однородность сорбции белка на планшетах, что приводит к повышению стабильности, важной характеристике для воспроизведения результатов, особенно при стандартизации тест-системы в целом При этом максимальную однородность сорбции показывают гидрофобные белки, полученные в денатурирующих условиях Во всех наших случаях были получены в составе клеточных включений гидрофобные химерные белки, состоящие из фрагмента ß-галактозидазы и антигена. заканчивающегося бНк-афФинной мишенью Эти рекомбинантные белки эффективно сорбировались на полистирольных планшетах с помощью гидрофобного якоря, представленного коротким фрагментом ß-галактозидазы, и экспонировали в реакционное пространство гидрофильную часть, т е антиген

Промежуточную плазмидную ДНК pUR290-6*his, кодирующую последовательность из 6 His, конструировали так, что она располагалась после сайта узнавания эндонук-леазой рестрикции Sali Для этого ДНК pUR290 обрабатывали последовательно эндонук-леазой рестрикции HindlH, фрагментом Кленова (достройка до тупоконечного фрагмента) и эндонуклеазой рестрикции Sali, и лигировали с синтетическим адаптером длиной 50 п н, обработанным предварительно в следующем порядке эндонуклеаза рестрикции Kpnl, фрагмент Кленова (достройка до тупоконечного фрагмента) и эндонуклеаза рестрикции Sali

Kpnl

Sali

5' -ATCAGGTACCTTAGTGATGGTGATGGTGATGGTCGACAGCATCATCTTCT-3'

TAGTCCATGGAATCACTACCACTACCACTACCAGCTGTCGTAGTAGAAGA

***HisHisHisHisHisHis

Выросшие колонии клонов проверяли на присутствие вставки гидролизом эндо-нуклеазой рестрикции ЕсоШ (116 п.н) и отсутствие сайта эндонуклеазы рестрикции РвН. Таким образом, был отобран клон, плазмидная ДНК (риК290-6*)ш) которого содержала последовательность синтетического адаптера.

Амплифицированный ДНК-фрагмент (ампликон) гена US6 ВПГ-1, полученный с помощью П1ДР, компонентами которой были праймеры, в нуклеотидной последовательности которых присутствовали сайты эндонуклеаз рестрикции BaraHI и Sali соответственно прямому и обратному праймерам, и ДНК pUR290-6*his обрабатывали последовательно эндонуклеазами рестрикции BamHI и Sali. Затем выделяли в 4% полиакриламидном геле фрагмент гена US6 длиной 372 п о. и фрагмент вектора длиной 5370 п о. Концы полученного фрагмента и вектора лигировали.

Целевая нлазмида pHSVDl получается в результате обработки плазмидной ДНК pUR290-Dl-6*his эндонуклеазами рестрикции BamHI, EcoRV, фрагментом Кленова с последующим лигированием (рис. 13).

После определения первичной структуры клонированного гена методом Макса-ма-Гилберта полученные результаты сравнивали с известными литературными данными для различных штаммов ВПГ-1. Нуклеотидная последовательность клонированного гена US6 ВПГ-1 полностью совпадала с аналогичной для этого фрагмента штамма KOS ВПГ-1 (GeneBank Database, L09245).

а-Герпесвирусы Вирус простого герпеса 1 типа

АР(г) (1&

та О

Слитый thf*t-0DJ-eVils те-1742)

gD-1 /ТОТ-17Т1Я.ОУ (J72fteJ

Рис. 13. Физическая карта ре-комбинантной плазмиды pHSVDl.

На рис. 14 приведена картина электрофоретического разделения в SDS-ПААГ белков из клеточных лизатов различных клонов Е. coli. На этом же рисунке представлен аф-финно-очищенный химерный белок, синтезирующийся в клетках, несущих плазмиду pHSVDl. Электрофоретическая подвижность химерного белка соответствовала расчетной молекулярной массе 45 кДа.

Рис. 14. Электрофореграмма клеточных лизатов в? бактериальных штаммов-продуцентов, несущих

плазмиды pUR290-Dl и pHSVDl со вставками гена US6 и продуцирующих рекомбинантные антигены, шк и штамма, несущего плазмиду pUR290 (без встав-

I ки)"

Яг Дорожки:

§¡¡1 М - маркеры молекулярных масс белков (Sigma).

К - контроль бактериальных белков.

1 - хроматографически очищенный рекомбинант-ный белок рек-gD-l (указан стрелкой), продуцируемый штаммом, несущим плазмиду pHSVDl

2 - лизат клеток, несущих плазмиду pHSVDl

3 - лизат клеток, несущих плазмиду pUR290-D 1.

Вирус простого герпеса 2 типа

Получали рекомбинантную плазмидную ДНК, обеспечивающую экспрессию фрагмента гена ПЯ4 ВПГ-2, кодирующего иммунодоминантную часть gG2 с 438 по 695 а.о. в составе плазмидного вектора, кодирующего фрагмент р-галактозидазы (441 а.о.) и й*Н15-мишень для аффинной очистки белка. На рис. 15 показана физическая карга полученной рекомбинантной плазмиды рН8У02, обеспечивающей биосинтез рекомбинантно-го антигена рек-%02 ВПГ-2. В отлнчне от предыдущей конструкции (рН5У01) в составе клонируемого фрагмента гена и84 оказался сайт ЕсоЯ'У. В составе LacZ имеется 2 сайта рестриктазы Нра1. В данном случае вместо сайта ЕсоКУ был использован сайт Нра1.

Рис. 15. Физическая карта плазмиды pHSVG2.

SceRl (1169)

See RV(I299J

SiHB

(1)23)' \ Oa I (J473)

P(8U) itoR I (M97)

На рис. 16 приведена картина электрофоретического разделения в SDS-ПААГ белков из клеточных лнзатов клонов Е. coli. На этом же рисунке представлен аффинно-очищенный белок, синтезирующийся в клетках, трансформированных плазмидой pHSVG2, Электрофоретическая подвижность белка соответствовала теоретически расчетной молекулярной массе 46,3 кДа.

¡г *

:4h

Ркс. 16. Электрофореграмма хро-матографически очищенного ре-комбинантного белка - антигена peK-gG2 ВПГ-2. Дорожки:

2, 3 - peK-gG2 ВПГ-2 (46,3 кДа). 1,4 - маркер молекулярной массы в кДа (Pharmacia, США).

'тштжшщ

100

35 25

Секвенирование встроенного фрагмента Ш4, кодирующего иммунодоминант-ную часть гликопротеина gG2, показало полное соответствие нуклеотидной последовательности аналогичного района гена Ш4 штамма МБ ВПГ-2.

К сожалению, в настоящее время в России и во многих странах отсутствует стандартные панели сывороток на ВПГ-1 и ВПГ-2. Кроме того, на доступном для нас рынке тест-систем отсутствуют наборы, позволяющие выявлять с помощью ИФА антитела к ВПГ-1 и ВПГ-2. Существуют только тест-системы, выявляющие антитела к вирусам простого герпеса, не разделяя их по типу.

В рамках проекта «Клинико-диагностические особенности течения генитапьной герпетической инфекции в Новосибирске» (утвержден 19.03.2003 Этическим комитетом

ГНЦ ВБ «Вектор», 1ЯВ00001360) нами было проведено ПЦР-обследование 238 человек Средний возраст больных составил 20-39 лет Группа состояла из пациентов, обратившихся по поводу рецидивирующих высыпаний в аногенитальной области, проблем фер-тнльности и вынашивания беременности Среди этих пациентов было выбрано 16 человек, у которых в тех или иных клинических пробах (соскоб из цервикалыюго канала, сперма и содержимое морфологических элементов высыпаний) была выявлена ДНК вирусов простого герпеса 1 и 2 типа (8 пациентов с ДНК ВПГ-1 и 8 пациентов с выявленной ДНК ВПГ-2)

Таблица 1

ИФА анализ сывороток пациентов с рецидивирующим генитапьным герпесом на присутст-

№сыво-рогки ПЦР Натш 1 ОП/ОПкр»т Рехомб 1 ОП/ОПкрит Натмв 2 ОП/ОПкрит Рекам 2 ОЛ/ОПкрит

I 2 3 4 3 6 7 8 9 10

. £ ■ II* С 5 - »я-

.1 СЮ щм, (ГМ 070

3 да Л№, ** . Л>4 «'9

- «тай ^ ом 1

л • и* '¿ЬЩ обг

) «р «и ¡и ЯЛ' ми >К>

• • - - ней"" } п } Vе*, С,"Я г«» ем» , о»

С ю * юг) V ¿о,?* »14 ил • »О*«- " ЯМ деяЁ ■ а» л 4*1« * - . Г|» ^ ,0 5?

11 ПОЛ 2 6(12 3 40 0,250 1 32 изз 6,07 1497 7 86

.12 > поп 2 0,794 4 41 0,21« - 1 15 1,344 7 07 1,569 628

<3 ПОЛЕ- 0,94 ода9 0,47 160« 8,45 1,217 6 41

14 * ПИЛ г 6,17) 0,96 0,132 0,69 1,6«3 8 86 1,416 7 45

15 ПОЛ2 8,157 0 87 «дм 0 49 2,001 10,53 Ц« 708

'16 лол 2 МОТ 0 49 , ».107 056 1,ооо' 5,26 0,956 5,03

17 пол? ММ 1.12 0,04« 0,24 0 74( 390 1,143 6 02

1в пол 4 '1 0 0,206 1,14 8.НМ 0 55 6,87 1,243 6,54

6 94 '•Тм»;: 6 26 0,86 "»¿»И 058

ЛЧЬ*»," 14,11 15,63 г • тй*;* 1,13 «»4 > 0 49

\i-pn > 764 7,07 0,61 056

Я»' УЖ: 6 70 7,36 дйй 2,74 * «с, 1 11

юл,. Щтй 13 72 12,34 мп 0,91 , вит 0 51

9,14 12,68 0,72 ¿•а»' 0 42

6,15 ¿Ж"* 4 43 мм 0 49 0 59

10 76 "Щк*: 11,11 0 97 0,52

оа Крат 0,210 0,156 0,192 0,167

Прммечавне: Жирным шрифтом обозначены отрицательные сыворотки

В активной фазе заболевания у этих больных брали кровь и исследовали сыворотки в ИФА на наличие специфических IgG-антител с использованием нативных и ре-комбипантных антигенов ВПГ-1 и ВПГ-2 (см табл 1) В качестве отрицательного контроля использовали сыворотки крови здоровых доноров, в которых не были выявлены антитела к ВПГ

Статистический анализ полученных данных показал, что чувствительность для всех использованных антигенов составила 100 % Однако специфичность при этом существенно различалась для нативных и рекомбинантных антигенов

специфичность (натнвный антиген ВПГ-1) = 15/18*100%= 83%, специфичность (рекомбинантный антиген ВПГ-1) = 16/18*100%= 89%, специфичность (нативный антиген ВПГ-2) = 16/18*100%= 89%, специфичность (рекомбинантный антиген ВПГ-2) =17/18*100%=94% В этом исследовании нативные антигены были получены из вирусных референс-штаммов ВПГ-1 и ВПГ-2 (коллекция АТСС, США) Анализ полученных данных с помощью ИФА показывал соответствие реагирования с одними и теми же сыворотками натив-ного и рекомбинантного антигенов ВПГ-1 с высокой степенью специфичности (83 и 89% соответственно) Аналогичные результаты получены и для нативиого и рекомбинантного антигенов ВПГ-2 (89 и 94% соответственно) Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о перспективности использования в будущем разработанных рекомбинантных антигенов ВПГ-1 и ВПГ-2 в производстве ИФА-тест-систем для выявления специфических иммуноглобулинов

Вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая Выбранный участок гена gE был амплифицирован в ПЦР с матрицы, полученной при выделении суммарной ДНК из клеток Vero, инфицированных ВВО (изолят №4) Размер амплифицированного фрагмента составил 946 п о , что полностью совпало с теоретически рассчитанной длиной фрагмента

Нуклеотидная последовательность ампликона была определена методом Сенгера и показала полное соответствие участком гена ORF68 белка gE ВВО Проведено клонирование амплифицированного фрагмента гена gE в составе плазмидного вектора в клетках Еcoli (рис 17), как описано ранее, те сразу после амплификации в плазмидный вектор Была получена плазмидная конструкция pVZVgE-6his

Искомые клоны отбирали по наличию биосинтеза рекомбинантного белка с теоретически рассчитанной электрофоретической подвижностью - 52 kDa (рис 18, дорожка 2) Таким образом, были получены штаммы-продуценты Е coli рекомбинантного белка рек-gE Уровень биосинтеза белка составил 80-90 мкг/мл С использованием сорбента Ni-

КТЛ-ге81п проведена аффинная очистка рекомбинантного белка рек^Е из клеточного ли-зата штамма-продуцента Е сок

Рис. 17. Физическая карта плазмиды рУгЧ^Е-бЫэ

Рис.18 Элекгрофореграмма рек^Е Дорожка

1 - клеточный лизат штамма-продуцента рекомбинантного белка рек^ до проведения индукции

2 — клеточный лизат штамма-продуцента рекомбинантного белка рек^Б после индукции (ИПТГ)

3 - очищенный рекомбинантный белок рек-¿Е (аффинная хроматография и гель фильтрация)

М - белковый маркер в кДа (Зшта)

К сожалению, качество аффинного сорбента в значительной степени зависит от фирмы-производителя и это, прежде всего, приводит к присутствию разного количества клеточных белков в очищенном препарате Поэтому 2-м этапом очистки была гель-фильтрация на сефакриле 5400 в денатурирующих условиях в присутствии 0,1% БОБ Таким образом, мы достигли уровня очистки более 95% (рис 18, дорожка 3) В дальнейшем при очистке рекомбинантных антигенов, в том числе и описанных выше, мы всегда использовали двухступенчатый метод,

Для иммуноферментного анализа специфичных к ВВО использовали белок после двух этапов очистки ИФА проводили на сыворотках, выделенных от больных, инфицированных ВВО, с ярко выраженной клинической картиной кожных морфологических элементов, в содержимом которых с помощью ПЦР была выявлена ДНК ВВО Использовалась и панель предприятия ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск) положительных и отрицательных сывороток, собранных от больных с подтвержденным диагнозом и сывороток крови здоровых доноров

Таблица 2

Выявление ^О-антител к ВВО в ИФА с использованием рек-&Е и нативного антигенов ВВО

Положительные Отрицательные

Сыворотки Рек ВЕ (ОП) нативный (ОП) Рек рЕ (ОП) Нативный (ОП)

1 0 833 2 090 0143 0134

2 1 346 0 775 0 331 0 376

3 1 952 1 947 0 203 0 250

4 1 106 2 242 0 333 0 304

5 Шок , ; 0 348 0 365

6 3 064 3164 0381 0 317

7 1 755 2 017 б-Мй

8 0 838 0 670 « ада«..,. ,

9 Ь801 Г0485 ' 0142 0 189

10 к&т, , 0496,„ ; 0 312 0 366

11 2 617 0 677 0108 0 215

12 1 169 1 198

13 2 193 0 930

14 1 167 1 616

15 3 650 2 052

16 3 692 0 741

17 2 305 1 460

18 2 898 1 726

19 3 519 0 752

20 ; 1,298,,» " „ 0543

21 2 809 1 273

22 1 485 0 821

23 ' 1 654"" 1Й632 ' " т

24 1 549 1 386

25 3131 1 293

26 1 341 0628

Среднее арифме-

тическое 2 075 1 233 0245 0315

Квадратичное отк'го- 0 944526 0 700356 0 097655 0111496

нение

Отношение средних 1 ' ' "I 1 " Т *

положитечь-ных и Рекомбинантный дЕ л нгпяимлг г» - , '

отри- нательных 8461027 1.

ОП - условное значение оптической плотности в оптических единицах (о е ) на единицу объема (мл) До проведения этого исследования на доступном для нас рынке отсутствовали наборы, выявляющие антитела к ВВО Всего нами было исследовано 72 сыворотки В результате было показано, что полученный рекомбинантный белок рек-;>Е, реагирует с заведомо положительными сыворотками (от больных), а так же выявляет специфические антитела к ВВО на панели сывороток Реакция протекает с различной чувствительностью и специфичностью по сравнению с нативньш антигеном ВВО, традиционно используемым в такой диагностике Из табл 2 видно, что рекомбинантный белок обладает большей чувствительностью по сравнению с нативным антигеном Также видно, что рекомбинантный белок увеличивает специфичность выявления положительных и отрицательных сывороток по сравнению с нативным антигеном Так у положительных сывороток с №№ 5,9, 10,20 и 23 ОП в случае нативного антигена была близка к критичному значению и не могла считаться достоверно положительной Использование рекомбинантного антигена помогло разрешить эти сыворотки как строго положительные, напротив отрицательные сыворотки с №№ 7 и 8, определенные вначале в присутствии нативного антигена хак сомнительно

отрицательные, с рекомбинантиым антигеном были окончательно определены как строго отрицательные. Допустимый интервал варьирования полученных результатов был рассчитан с помощью статистического I-критерия (критерия Стьюдента). К сожалению, из-за отсутствия стандартных панелей проведение более обширных серологических исследований оказалось невозможньм. Однако, исходя из полученных результатов этого эксперимента, можно сделать вывод, что рекомбинантный антиген рек^Е значительно увеличивает чувствительность и специфичность при выявлении специфических -антител к ВВО по сравнению с нашвным антигеном в сыворотках крови при уровне достоверности 99% и может быть рекомендован к использованию в серодиагностике для их обнаружения.

Р-Герпесвирусы Цитомегаловирус человека Как описано ранее, первым рекомбинантным антигеном был белок рек-1Е2 (иЬ122) ЦМВ Он был получен в виде химерного с полноразмерной (5-галактозидазой ре-комбинантного белка, в котором отсутствовала 6*Н1Б аффинная мишень. Встроенная последовательность этого гена, определенная секвенированием, полностью совпала с последовательностями 11Ы22, взятыми из базы данных ОспеВапк Использование белка рек-1Е2 в ИФА как антигена оказалось бесперспективным, т.к. он показывал очень противоречивые результаты.

UL44HCMV, обеспечивающих биосинтез рекомбинантных антигенов рек-р52 и рек-рр!50 ЦМВ в клетках Е. coli.

Для получения чистых форм рекомбинантных белков рек-р52 и рек-рр150 (без ß-галактозидазы) фрагменты ДНК клонировали в клетках E.coli в составе плазмидных векторов серии pQE30 (Qiagen, Германия). Эти конструкции (pQE-UL44HCMV(peK-p52) и pQE-UL32HCMV(peK-ppl50)) обеспечивали биосинтез чистых форм белков в Е. coli, т.е. рекомбинантных полипептидов, содержащих иммунодоминанткые области белков р52, рр!50 ЦМВ и полигистидиновыйтракт (6*His) наN-конце (рис. 19).

На рис. 20 приведена картина электрофорегического разделения в SDS-ПААГ аффинно-очмценных белков и клеточных лизатов клонов Е. coli, несущих плазмиды pQE-UL44HCMV и pQE-UL32HCMV.

Рис. 20 Электрофореграмма исследуемых фракций белков. Электрофорез проводили в 10% SDS-ПААГ. Дорожки

2, 3, 5, 6 - клеточные лизаты бактериальных штаммов-продуцентов рекомбилантных антигенов

1,4- белковый маркер (Sigma).

2,3- химерные (с Р-галакгозидазой) белки рек-

ppl 50 и рек-р52 соответственно.

5, 6 - «чистые» формы белков рек-рр150 и рек-

р52 соответственно.

8, 9 - хроматографически очищенные белки рек-ppl 50 и рек-р52 соответственно. 7 - контроль бактериальных белков

Получив аффинно-очищенные препараты рекомбинантных рек-р52 и рек-рр150 (как отдельно, так и в комбинациях 1:1, 1:3 и 1:5), проводили исследование их антигенных свойств и диагностического потенциала методом ИФА на сыворотках пациентов.

Таблица 3

Определение абсолютной чувствительности смесей белков рек-рр150:рек-р52, как антигенов ЦМВ к ^О- и ^М-антителам.

Oil для lad

Среднее арифметическое значение отрицательных сывороток_

Среднее квадратичное отклонение_

Ошибка репрезентативности

Среднее арифметическое значение положительных сывороток_

Среднее квадратичное отклонение Ошибка репрезентативности «■цноикнпе средних полэжитаяьних н »■фкизге ".ниц ги»ч« Р»^

ОН для/цМ_

Среднее арифметическое значение ОП

отрицательных сывороток_

Среднее квадратичное отклонение

Ошибка репрезентативности

Среднее арифметическое значение ОП

положительных сывороток_

Среднее квадратичное отклонение

Ошибка репрезентативности

Используя панель ЦМВ-положительных и отрицательных сывороток фирмы «АВВОТ» (США) с нашими рекомбинантными антигенами в ИФА, было показано, что добавление рек-р52 к рек-рр150 повышало специфичность по панели сывороток суммарного

антигена как к ^О, так и к ^М ЦМВ Так, из 48 ЦМВ-положительных сывороток реагировали со смесью рек-рр150-рек-р52 все 48, в отличие от 42 сывороток реагировавших только на рек-рр150, а из 38 ЦМВ-отрицательных сывороток не реагировали со смесью рек-рр150-рек-р52 все 38, в отличие от 5 из них, реагировавших с рек-рр150 Отношение средних арифметических ОП (единицы оптической плотности в реакции ИФА) положительных и отрицательных сывороток позволяет оценить степень абсолютной чувствительности антигена Чем выше это отношение, тем выше чувствительность Абсолютная чувствительность ^О к ЦМВ и ^М к ЦМВ приведена в табл 3 Из нее видно, что максимальной чувствительностью в ИФА обладает смесь белков рек-рр150 и рек-р52 в соотношении 5 1 Уровень специфичности оценивался по достоверности различия выборок данных по ОП для положительных и отрицательных сывороток (табл 4) с помощью статистического Ь критерия (критерия Стьюдента) Расчеты показали, что самой высокой специфичностью при уровне достоверности 99% также обладает смесь белков рек-рр150 рек-р52 в том же соотношении - 5 I

Таблица 4

Оценка степени варьирования выборок для положительных и отрицательных сывороток при достоверности 99%

Для выборки положительных и отрицательных сывороток по 1дв

Соотношение по белку антигеном рек-ррНО и рек-р52 Аг-1-11 Аг-2-1 0 Аг-3-5 1 Аг-4-31 Аг-1-1 1

Среднее арифметическое значение ОП отрицательных сывороток 201 142 еУ* г 193 146

Доверительный интервал среднего арифметического значения ОП отрицательных сывороток ±167 73 ±145 04 ±135 29 ±118 46

Среднее арифметическое значение ОП положительных сывороток 860 609 Й'-чяА 948 490

Доверительный интервал среднего арифметического значения ОП положительных сывороток ±874 87 ±56918 ±919 81 ±499 37

Для выборки положительных и отрицательных сывороток по 1дМ

Соотношение по белкр антигенов рек-рр159 и рск-р52 Аг-1-1 1 Аг-2-1 0 Аг-3-5 1 Аг-4-3 1 Аг-1-1 1

Среднее арифметическое значение ОП отрицательных сывороток 311 373 216 186

Доверительный интервал среднего арифметического значения ОП отрицательных сыворотох ±218 30 ±271 81 ' "^89-42 - ±124 46 ±110 91

Среднее арифметическое значение ОП положительных сыворотох 635 737 467 384

Доверительный интервал среднего арифметического значения ОП положительных сывороток +291 59 ±304 85 фтщ: ±273 40 ±313 57

Таким образом, установлено, что наши рекомбинантные белки реагируют с поли-клональными антителами класса йиМ, присутствующими в сыворотках пациентов с заболеваниями, вызванными ЦМВ На основании полученных данных можно сделать вывод

о возможности использования смеси рекомбинантных белков рек-р52 и рек-рр150 для серодиагностики ЦМВ-специфичных IgM- и ^О-иммуноглобулинов Однако следует отметить ряд выявленных недостатков некоторую неоднородность результатов, связанную с особенностями сорбции чистых форм белков, а также сравнительно низкий выход рекомбинантных белков

Использование сочетания рекомбинантных рек-р52 и рек-рр150 улучшило ситуацию с выявлением ^С; и особенно ^М к ЦМВ, но все же в некоторых случаях такая смесь оказалась малоэффективной Поэтому наши дальнейшие усилия были направлены на получение рекомбинантного рек-рр65. который сегодня считают «маркером патогенности», и который индуцирует синтез специфических антител на ранних стадиях продуктивной инфекции

Выбранный участок гена 1_1Ь83, кодирующий гидрофильную часть этого белка с 231 по 551 а о, клонировали в составе ллазмидаого вектора р1Ж290-6*Ыз в клетках Е сок (рис 21) На рис 22 представлен очищенный аффинной хроматографией химерный белок, синтезирующийся в клетках, несущих плазмидой р11Ь83НСМУ

Рис 21 Физическая карта плазмиды PÜL83HCMV

М 1 2 3 М

! ' Щ

} 43

Рис 22.. Электрофореграмма исследуемых фракций лизатов клеток Е coli штамма-продуцента рекомбинантного рек-рр65 Электрофорез проводили в 10% SDS-ПААГ Дорожки

1 - лизат клеток после индукции

2 - хроматографически очищенный рекомбинантный белок рек-ррб5

3 - лизат клеток без индукции

М - маркер молекулярного веса в кДа (Pharmacia, США)

Параллельно были получены аналогичные шшмидные конструкции с фрагментами генов иЬ32 и \JL44 (рис 23), ранее клонированных в р<ЗЕ и кодирующие иммунодо-минантные участки белков рр150 и р52 соответствешю Уменьшение размеров фрагмента

ß-галактозидазы осуществляли делецией этого гена по сайтам рестриктаз EcoRV и Hpal соответственно для UL32 и UL44

Ряс. 23 Физические карты плазмид pUL32HCMV и pUL44HCMV, обеспечивающих биосинтез рекомбинантных антигенов рек-р52 и рек-рр150 ЦМВ в клетках Е coli

Чтобы окончательно убедиться в том, что варианты наших антигенов с фрагментом ß-галактозидазы (химерные) эффективнее в ИФА (за счет лучшей сорбции на полистироле) по сравнению с «чистыми» формами рекомбинантных белков, мы сравнивали эти две формы рекомбинантного рек-рр150, как наиболее реагирующего, на стандартной панели сывороток от пациентов с инфекцией ЦМВ В табл 5 приведены данные сравнения двух форм (химерной и «чистой») рек-рр150 на аттестованной панели Статистический анализ полученных данных показал

С (для рек-рр150- химерный) = (15/16)* 100% = 93,75%, С (для рек-рр150- «чистый») = (12/16)*100% = 75% Чувствительность по панели = (Р/20)* 100% Ч (для рек-рр150- химерный) = (20/20)* 100% = 100%, Ч (для рек-рр150- «чистый») = (19/20)« 100% = 95%

Из выше приведенных данных, очевидно, что чувствительность и специфичность «химерной» формы выше «чистой» формы антигена рек-рр150 Эти результаты убеждают в необходимости продолжения исследований по созданию и в дальнейшем рекомбинантных антигенов по разработанной нами стратегии

В итоге были получены 3 штамма Е coli, продуцирующие рекомбинантные антигены ЦМВ На рис 24 приведены результаты электрофоретического разделения » SDS-ПААГ аффинно-очищенных химерных белков рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65, синтезирующихся в клетках, несущих плазмвды pl!L32HCMV, pUL44HCMV и pUL83HCMV

Результаты сравнительного испытания двух форм рек-рр150 в ИФА

на панели сывороток содержащих специфические к ЦМВ_

№ сыворотки рек-рр150 (химерный вариант, fusion) ОП/ОП крит рек-рр!50 («чистая» форма) ОП/ОПкрит Аттестация сыворотки

1 2 3 4 5

1 0,112 0,626 0,123 0,769 отр

2 0,11 0,615 0,143 0,894 отр

3 0,076 0,425 0,086 0,538 отр

4 0.147 0,821 0,106 0,663 отр

5 0,118 0,659 0,149 0,931 отр

6 0.16 0,894 0,115 0,719 отр

7 0,143 0,799 0,173 1,081 отр

8 0,117 0,654 0,146 0,913 отр

9 0,069 0,385 0,126 0,788 отр

10 0,096 0,536 0,097 0,606 отр

11 0,101 0,564 0,051 0,319 отр

12 0,098 0,547 0,034 0,213 отр

13 0,127 0,709 0,017 0,106 отр

14 0,115 0 642 0,013 0,081 отр

IS 0,111 0,620 0,019 0,119 отр

16 0,122 0,682 0,049 0.306 отр

' 17 - 1,659 ' > 9,268 1,546 9,663 пол

It ' 1,623 9,067 1,865 11,656 поя

• 19 ■ 2,108 11,777 1,498 9,363 под

20 - " 2,19- • 12,235 2,04 12,750 пол

21. '1.707. . 9,536 1.542 9,638 под

1 2 3 4 5

22 * 2,30) 12,855 2 12,500 пая

Л 23 ,, . ' 2.132 ' 11.911 1.654 10,338 • поя

.. 24 -...... " ^ 1,87$ 10,475 1,458 9,113 под

• 2$ 1,294 * 7,229 U99 8,119 ПОЯ

'26 1.23S / 6,899 1.364- 8,525 ; ВОЯ '

Ч' " ri ' 0.4S8 ' ' 2,726 0,266 1,663 поя -

28 • * "0,714 >" 3,989 0,564 3,463 noir

. • 29 ; I,«26 - 10,201 0,908- 6,238 "-'пол

30 " . 1,356 ' 7,575 0,657 4,106 ' 'вол

31 - 0.88 'с' 4,916 0,357' 2,231 *' по*

. 32 * 0,805 4,497 0,892 5,575 юмг

33 " 1,283 - > 7,168 0,897 5,606 пол 1

34 1,223 ' 6,832 t,0Q9 6,306 пол

35 ' - * 1.247, " 6,966 0,675 4,219 . ДОИ

" 36 - », - Û.507 - .v 2,832 0,639 3,994 пая.' <■■

" ОПкрит > 0,179 ■ ,

Примечание жирным шрифтом выделены данные для «серой» зоны Специфичность по панели = (№16)*100%

М 1 2 3 М

Рис. 24. Электрофореграмма фракций хроматографически очищенных реком-

дд бинантных белков-антигенов ЦМВ. Электрофорез проводили в 10% ЭОЗ-ПААГ.

щ **

67 Дорожки. I - рек-рр150,2- рек-рр65 и 3- рех-р52.

М - маркер молекулярного веса в кДа (Pharmacia, США).

Ь •■"■Ф 31

Для оценки антигенных свойств полученных рекомбинантных белков рек-рр65 и рек-рр150 использовали разработанную с нашим участием и аттестованную ГИСК им Л.А Тарасевича панель положительных и отрицательных сывороток к ЦМВ (табл. 6). ИФА было показано, что сам по себе рекомбинантный рек-рр65 не мог являться достаточным критерием в качестве антигена для выявления антител, специфичных к ЦМВ, но в дополнении с рекомбинантным антигеном рек-рр150 значительно увеличивал чувствительность выявления таких сывороток. Как упоминалось выше, отношение средних арифметических ОП положительных и отрицательных сывороток позволяет оценить степень абсолютной чувствительности антигена. Чем выше это отношение, тем выше чувствительность, В табл. 6 мы видим, что смесь белков рек-рр150-рек-рр65 имеет более высокий показатель этого отношения, а значит и большую чувствительность. Уровень специфичности оценивали по количеству выявляемых сывороток в стандартной панели. Он показал такое же значение как для рек-рр150, так и смеси рек-рр!50-рек-рр65, т.е. все отрицательные сыворотки остались отрицательными, а положительные - положительными

Зная, что антитела к рр65 чаще всего появляются тленно при острой фазе инфекции, мы провели сравнительный анализ (табл. 7) сывороток больных, перенесших трансплантацию почки, двумя методами - с помощью ИФА, в котором использовали антигены рек-рр150, рек-рр52 и рек-рр65 для обнаружения ЦМВ-специфичных ^М, и ПЦР

Данные ОП в ИФА по панели аттестованных сывороток для ЦМВ

Панель Отрицательные сыворотки Положительные сыворотки

АГ рек-рр150 рек-рр65 рек-рр 150-рек-рр65 рек-рр! 50 рек-рр65 рек-рр! 50-рек-рр65

1 2 3 4 5 6 7

1 0 350 0 160 0411 2 255 0 162 2 658

2 0 447 0217 0 434 1 586 0 342 1 848

3 0 169 0133 0215 1 600 0217 1 792

4 0 254 0 131 0 289 2 094 0 193 2 383

5 0 517 0 158 0 442 0 952 0 276 0 972

6 0 376 0 201 0 388 1 394 0 487 1 764

7 0 263 0167 0 306 1 996 0 228 2 183

8 0 226 0104 0345 1 491 0 622 1 645

9 0 302 0 136 0317 1 778 0 503 2 064

10 0212 0 115 0 357 1 131 0 269 1291

11 0 136 0 125 0 166 2 212 0 253 2 301

12 0 260 0 126 0 261 0 732 0186 0 807

13 0 389 0133 0 270 0 651 0 162 0 804

14 0 359 0 138 0 261 1 172 0 195 1 208

15 0 158 0 133 0 308 0 671 0 204 0 753

16 0281 0179 0 271 1 132 0262 1 167

17 0 679 0 188 0 702

18 1359 0 538 1473

19 0 832 0 238 1 017

20 1 238 0 336 1 713

21 0 721 0 235 0 848

Среднее значение 0294 0147 0 315 1.318 0290 . 1495

Квадратичное отклонение 011 0 03 0 08 0 528 0 134 0 601

Отношения средних, положительных и отрицательных реБЙШ рек-рр! 50-рек-рр65 ЗЖЙ

При использовании в ИФА только рек-рр150 выявлены 5 положительных сывороток, однако в варианте с добавлением к первому рек-р52 и рек-рр65 количество таких сывороток увеличилось до 7 Таким образом, уже из этих результатов видно, что серодиагностика острой инфекции не может быть достоверно проведена с применением только одного антигена из ряда рек-рр150, рек-р52 и рек-рр65

Вероятно, что при разных течениях заболевания в острой фазе у разных пациентов присутствуют в крови антитела к каждому из трех этих белков, но с разными титрами Поэтому только совместное использование всех трех белков в качестве антигенов в ИФА

позволит эффективно выявлять характерные для разных фаз инфекции ЦМВ-специфичные антитела

Табляца 7

Результаты обследования пациентов, перенесших трансплантацию почки Наличие вируса определяли методом ПЦР Рек-рр150, рек-р52, рек-рр65 и рек-рр150/рек-рр65/рек-р52 - ИФА, где в качестве антигена использовали соответствующий рекомбинантный белок Культ АГ - ИФА, где антигеном служил натавный вирус ЦМВ (штамм АО-169)

ПЦР Рек-рр150 Рек-р52 Рек-рр65 Рек-рр150/рек-рр65/рек-р52 Культ АГ

1 +++ ++ + +/- ' +++ -

2 - - - - -

3 ++ + +/- ++ +/-

4 +/- + - - ' ++ . ' +/-

5 + + + ' ' ++ ' „ -

6 - - -

7 - - - - - -

8 - - - - - -

9 - +/- + +/- ' + -

10 + - ++ ++ + +/-

И - - - - -

12 ++ + - + ' — -

13 - - - -

14 - - - - -

15 +/- - +/- - - -

Вирус герпеса человека б типа

ПЦР-фрагмент ДНК, соответствующий размеру 1051 по и кодирующий имму-нодоминантную часть белка рЮО. был клонирован в клетках Е coli в плазмидном экспрес-сирующем векторе рШ 1HHV6 (рис 25)

На рис 26 приведена картина электрофоретического разделения белков в SDS-ПААГ из клеточных лизатов клонов Е coli На этом же рисунке представлен аффиино очищенный химерный белок, синтезирующийся в клетках, несущих плазмиду pUHHVö Электрофоретическая подвижность химерного бежа соответствует расчетной молекулярной массе 82,5 кДа

Aflri 2Ы7-)5*

т-*Г

Рис. 25. Физическая карта плазмиды b^UflM Ш-ЪШ pU 1 1 HHV6.

6-Till ^ ^ Ь»* 1(»31)

Рекомбинантный белок рек-р41 ВГЧ-6, кодируемый геном U27, получали клонированием ПЦР-фрагмента 1125 п о. в экспрессирующем векторе pUR290-6*his в клетках Е. coli. Окончательный вариант плазмиды получали делетированием последовательности гена LacZ по сайту EcoRV, т.к. в составе встраиваемого фрагмента гена U27 находится сайт Hpal. Окончательно была получена конструкция pU27HHV6 (рис. 27).

Рис. 27. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pU27HHV-6.

Рис. 26. Элекгрофореграмма

рек-рЮО

Дорожки:

1 - клеточный лизат штамма-продуцента после индукции IPTG.

2 - очищенный рекомбинантный белок рек-р 100.

3 - клеточный лизат до проведения индукции.

4 - белковый маркер (Sigma).

кДа

кДа кДа кДа

кДа

Рнс. 28. Электрофореграмма лиза-тов клеток Е.соЧ (штамм ВМН) Дорожки:

1 - клеточный лизат бактериального штамма-продуцента.

2 - хроматографически очищенный рекомбинантный белок рек-р41.

3 - контроль бактериальных белков - клеточный лизат Е. coli.

4 - белковый маркер (Sigma).

Экспрессию целевого гена U27 ВГЧ-6 проверяли по наличию рекомбинантного белка 82,4 кДа, выделяемого с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-resin из клеток E.coli, несущих плазмиду pU27HHV6 (рис. 28, дорожка 2), Были отобраны клоны, использованные в дальнейшем в качестве штаммов-продуцентов рекомбинантного антигена рек-р41 ВГЧ-6.

Полученные рекомбинантные белки рек-рЮО и рек-р41 использовали в качестве антигенов для выявления специфических IgG к ВГЧ-6 методом ИФА в сыворотках крови больных и здоровых людей.

Таблица 8

Результаты выявления специфичных к ВГЧ-6, у различных групп населения Новосибирской области.__

Пациенты (группы обследуемых) Количество пациентов Выявлены IgG к ВГЧ-6

Количество %

Матери (беременные) Новорожденные (до 1мес.) 1S3 153 110 108 71,9 70,6

Онкологические больные 52 49 94,2

Больные после трансплантации почки 16 10 63

Доноры крови 247 173 70

ff* ЯМкД,

Поскольку однозначных данных по эпидемиологии ВГЧ-6 нет, в табл. 8 представлены произвольно выбранные группы населения Новосибирской области. Полученные результаты хорошо согласуются с имеющимися литературными данными. Среди доноров крови нами было выявлено 70% серопозитивных лиц. По литературным данным, их число в процентном отношении колеблется от 64,5 до 67,4%, Однако у доноров крови Западной Африки и Карибских островов доля серопозитивных доноров значительно выше -98%. Наши результаты также совпадают с литературными данными по серопозитивности онкологических больных: 94,2% и 95%, соответственно. Достаточно хорошее совпадение получено для реципиентов почек- соответственно 63% и 66%. Выявлены отличия в полученных данных для беременных женщин 71,9% против литературных: от 20% до 100%.

Это связано с тем, что в литературе приводятся результаты обследований, которые широко различаются географией проживания обследуемого населения Так, процент серопози-тивных беременных в Марокко - 20%, в странах к югу от Сахары 50-90%, во Франции -70% Следует отметить, что высокую специфичность выявления IgG к ВГЧ-6 подтверждает хорошее совпадение результатов анализа IgG у матерей (рожениц) и их новорожденных детей - 98,7% у новорожденных выявляются материнские антитела к ВГЧ-6 Несовпадения были зарегистрированы только в двух случаях, при этом матери были серопозитив-ными, тогда как у детей IgG-антитела не были выявлены

Таким образом, в настоящей работе с использованием литературных данных и данных по теоретической структуре антигенных эпитопов белков рЮО и р41 были выбраны последовательности ДНК генов Uli и U27, кодирующих иммуподоминантные части белков рЮО и р41 Полученные в реакции амплификации фрагменты ДНК генов Uli и U27, кодирующие выбранные последовательности, клонировали в составе экспрессирую-щих векторов, которые обеспечили продукцию рекомбинантных белков рек-рЮО и рек-р41 Установлено также, что рекомбинантные антигены рек-рЮО и рек-р41 реагируют с поликлональными антителами класса G, содержащимися в сыворотках инфицированных пациентов и здоровых доноров На основании полученных данных можно сделать вывод о возможности использования полученных рекомбинантных белков в качестве антигенов при иммуноферментном анализе для выявления иммуноглобулинов класса О, специфичных к ВГЧ-6

К сожалению, ситуация по серологическому мониторингу в отношении активности ВГЧ-6 в мире оставляет желать лучшего Поэтому только в случае внезапной экзантемы детей в возрасте до 1 года можно получить однозначный серологический ответ Все остальные варианты инфекции ВГЧ-6, например рассеянный склероз, синдром хронической усталости и т п , до сих пор являются гипотетическими, и роль этого вируса в их патогенезе неоднозначна Это создает значительные трудности в оценке диагностических возможностей и наших рекомбинантных антигенов рек-рЮО и рек-р41, но никак не уменьшает ценность нашего исследования

у-Герпесвирусы Вирус Эпштейна-Барр Для клонирования фрагмента, кодирующего иммунодоминантный район белка р18, был выбран полноразмеркый ген BFRF3 А для клонирования фрагмента гена BMRF1, кодирующего иммунодоминантный район белка р54, был выбран участок с 78 по 391 а о

Рис. 29. Физические карты плазмид HpUR-pl8-6his и HpUR-p54-6his, экспрессирую-щие фрагменты ДНК, кодирующие выбранные районы белков р! 8 и р54

Были получены экспрессирующие плазмиды HpUR-pI8-6his и HpUR-p54-6his

(рис. 29). Отбор штаммов-продуцентов E.coli проводили по наличию синтезируемого белка. Электрофоретическая подвижность рекомбинантных белков совпала с рассчитанной теоретически На рис. 30 показаны хроматографически очищенные рекомбинантные белки рек-р18 (VCA) и рек-р54 (ЕА).

1 2 3

Рис. 30. Электрофореграмма хроматографически очищенных рекомбинант-, 4 к д, ных белков ВЭБ

Дорожки. 6,«д. 1 -рек-р54(ЕА),

2- рек-р18(УСА),

3- маркеры молекулярной массы (Sig-4 з к д а та)

Определение первичных структур ДНК клонированных генов показало, что первичные структуры, клонированных генов полностью совпали с аналогичными последовательностями, депонированными в мировых базах данных.

В рамках проекта «Разработка рекомбинантных антигенов и генетических маркеров для диагностики герпесвирусов» (утвержден 03.06 2003 Этическим комитетом ГНЦ ВБ «Вектор», 1RB00001360) разработанные антигены использовали для ИФА сывороток из крови больных и здоровых людей. Было проведено исследование на выявление маркеров острой стадии ВЭБ-инфекции - IgG кЕА ВЭБ (рек-р54) и lgM к VCA ВЭБ (рек-р!8). В табл. 9 приведены данные обследования пациентов.

Ара LI (3261 ^

Рт П(55)

,Р(1ЛС)

fvu О (323)

Результаты обследования пациентов на наличие острой стадии инфекции ВЭБ __методами ИФА и ПЦР_

Группы обследованных пациентов Количество обследованных пациентов Маркеры острой стадии (ГкО к ЕА ВЭБ, 1йМ к УСА ВЭБ) ДНК ВЭБ (ПЦР)

Количество положительных результатов % Титры в ИФА

1 Доноры 200 15 1 100 - 1 200

2 Беременные 100 2 1 100- 1 200 -

3 Дети, контрольная группа 50 5 1 100 - 1 200 -

4 Дети, с диагнозом инфекционный мононуклеоз 54 98 1 1600 и выше 100%

У больных с диагнозом инфекционный мононуклеоз (группа 4) к ЕА были выявлены в 85% случаев, ^М к УСА - в 88% случаев Количество пациентов, имеющих хотя бы один или два серологических маркера острой стадии ВЭБ-инфекции, составило 98% Самое низкое количество сывороток, содержащих такие антитела (менее 2%) зафиксировано в группе 2 У 15% доноров (группа 1) и 5% детей контрольной группы (группа 3) также выявлены антитела активной фазы Титр маркеров острой стадии инфекции (к УСА и ЕА) оказался очень высоким в сыворотках 4-ой группы (1 1600 и выше) Полученные нами данные совпадают с описанными в литературе В настоящее время разработанные рекомбинавтные антигены вируса Эпштейна-Барр рек-р18 (УСА) и рек-р54 (ЕА) проходят испытания при разработке тест-систем для диагностики острой фазы ВЭБ-инфекции с помощью ИФА

Выявление «маркеров патогепности».

Разработка иммунофлуоресцентного метода диагностики цитомегаловирусной инфекции

За рубежом, учитывая неоднозначность и сложность диагностики, в настоящее время диагноз острой цитомегаловирусной инфекции ставят при наличии 3-х показателей Первый - выделение инфекционного вируса в культуре клеток, второй - выявление ДНК цитомегаловируса в исследуемом образце и третий - наличие рр65-антигенемии Присутствие ррб5-антигена в крови выявляют чаще всего с помощью меченых моноклональных или поликлоналышх антител к этому белку на поверхности периферических лейкоцитов Некоторые исследователи называют этот антиген лейкоцитарным антигеном ши маркером патогепности

Этот подход к диагностике острой цитомегалии появился в последние пять лет, хотя необходимость тестировать продуктивную ЦМВ-инфекцию в органах и тканях поя-

вилась давно. В этом направлении нами также были проведены исследования. Для этого были получены гипериммунные кроличьи антисыворотки к нашим рекомбинантным белкам рек-рр150, рек-Ш2 и рек-рр65 еще до того, как в научной литературе появился критерий рр65-антигенемии. Антисыворотки метили ФИТЦ (флуоресцеинизотиоцианатом). Иммуногистохимический анализ проводили на препаратах клеток, зараженных ЦМВ с 1 -го по 10-й день от момента заражения Специфическое свечение наблюдали, начиная с 5-х суток. Максимальное свечение наблюдалось на 7-е сутки после инфицирования. В дальнейшем происходило разрушение монослоя за счет цитопатического действия ЦМВ. Контрольные препараты с незараженным монослоем после обработки флуоресцентными антисыворотками специфического свечения не показывали

К нашему сожалению, у нас не было технических возможностей диагностировать острую цитомегаловирусную инфекцию, но нами была проведена работа по выявлению связи герпесвирусов с атеросклерозом у больных с ишемической болезнью сердца, под-

Рнс. 31. Флуорограмма фрагмента ушка правого предсердия (Увеличение 1х 100).

Препарат обработан флуоресцентной антисывороткой к рекомбинант-ному белку рек-[Е2 ЦМВ человека 1 - свечение указывает на присутствие антигена 1Е2 ЦМВ в стенке мелкого сосуда; 2 - мелкий сосуд без специфического свечения.

Для проведения этого исследования была выбрана группа пациентов с ишемической болезнью сердца и выраженным атеросклерозом коронарных сосудов. Всем пациентам группы была проведена хирургическая операция аортокоронарного шунтирования, во время которой у всех больных выявлены обширные атеросклеротические повреждения сосудов сердца. Во время операции у всех пациентов брали поврежденные атеросклероти-ческими бляшками и неповрежденные фрагменты коронарных сосудов, аорты и прилежащих тканей.

Рнс. 32. Флуорограмма фрагмента мам-марной артерии, пораженной атероскле-ротическим процессом (увеличение 1х 100).

Препарат обработан флуоресцентной антисывороткой к рекомбинангному белку рек-рр65 ЦМВ человека. 1 - свечение в этой области интимы указывает на присутствие антигена рек-рр65 ЦМВ; 2 - область интимы, в которой не выявляется ЦМВ-антиген; 3 - средний слой стенки артерии.

Анализ in situ биопсийного материала показал, что после обработки срезов полученными мечеными антисыворотками практически во всех пробах наблюдается специфическое свечение. Почти во всех биопсийных образцах было выявлено специфическое свечение в стенках мелких сосудов и vasa vasorum (рис. 31). Важно отметить, что специфическое свечение всегда было связано с тканями, в которых располагались атеросклеротиче-ские бляшки (рис. 32), и лишь иногда с участками неповрежденных атеросклерозом тканей. В этих участках антисыворотка к рек-рр65 показывала более значительный уровень свечения в сравнении с другими мечеными антисыворотками. Это является, на наш взгляд, дополнительным доказательством продуктивной формы ЦМВ-инфекции в тканях сердца, которое придерживается подавляющим числом авторов, считающих белок рек-рр65 «маркером патогенности». Именно его появление в ткани связывают с продуктивной формой цитомегаловирусной инфекции. Таким образом, в ходе своих исследований мы создали третий необходимый компонент для диагностики острой цитомегаловирусной инфекции - белок рек-рр65.

Конструирование панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса G к цитомегаловирусу человека При создании панели было проверено 2340 образцов сывороток от разных доноров. Сыворотки готовили сразу после забора крови. Хранили до использования при -180С. Из них отбирались образцы янтарного цвета, прозрачные на свету, не содержащие антитела и антигены к другим вирусным инфекциям (гепатит С, гепатит В, ВИЧ 1/2, сифилис, герпес 1,2 типа и хламидиоз). Для этого каждый образец проверяли на наличие антител к перечисленным инфекциям. Затем отбирались сыворотки, показывающие одинаковые результаты на ИФА-тест-системах зарубежного производства: CMV - IgG -ELISA PKS MEDAC, CMV - IgG-EIA recombCOBAS-core, выявляющих специфичные к ЦМВ антитела. Для панели отбирались отрицательные сыворотки с оптической плотностью не выше 0,15 o.e. Положительные образцы должны были иметь титр антител не ниже 1:200 и ОП не менее 0,5 o.e. Таким образом, быпо отобрано 40 сывороток. Все отобранные сыворотки

проверяли методом ПЦР на присутствие ДНК цитомегаловируса Все исследуемые образцы показали отрицательный результат на наличие антител класса М к ЦМВ

На основе литературных данных и результатов собственных исследований была сформулирована модель стандартной панели

1 Положительные референс-панели предназначены для контроля чувствительности и стабильности диагностических систем

2 Отрицательные референс-панели предназначены для контроля специфичности и стабильности диагностических систем

Из этого следует, что в положительной референс-панели часть сывороток должна содержать концентрацию специфических к ЦМВ антител, которая обуславливает минимальный аналитический сигнал для контроля чувствительности коммерческих тест-систем Также в панели должны присутствовать и сыворотки с высоким содержанием ви-русспецифических антител, для того чтобы контролировать эффект «перенасыщения», который появляется иногда при конкурентных постановках анализа антител

Таблаца10

Аттестация лиофилизированных сывороток, входящих в состав стандартной панели (сыворотки, не содержащие антитела к ЦМВ)

-NtJft сывороток BeicTO-HMB-IgG-стрип (Веггор-Бест) ЦМВ-скрии (Биосервис) CMV-IgG-Eli» PKS medac (MEDAC)

К» оп,„,м.-оп„г ОД492 AU/мл

! 2 3 4 5 6

1 0,029 0,26 0,039 0,165 0,2

2 0,045 0,40 0.10-3 0,210 0,2

3 0,040 0,36 0,018 0,110 0

4 0,020 0,15 0,069 0,133 0

5 0,030 0,26 0.046 0,161 0

6 0,048 0,44 0.015 0,144 0

7 0,052 0,46 0,064 0,150 0

8 (5) 0,030 0,26 0,046 0,161 0

9(14) 0,08 0,15 0,013 0,147 0,1

10 0.022 0,19 0,007 0,132 0

11 0,021 0,16 0,051 0,131 0,1

12 0.011 0.15 0,034 0,126 0

13 0,020 0,18 0,017 0,151 0.1

14 0 08 0,15 0,013 0,147 0,1

15 0,025 0Д2 0,019 0,103 0.1

16 0,010 0,12 0,049 0,139 0,1

ОП крит 0,127 ЦМВ <1,0 Разность Cat off 0,4 AU/мл

ЦМВ* >1,0 (ОП.„„ - ОП- к«г) ЦМВ <0,15 ЦМВ* >2,1 серая юна 0,35-0,45 АН/мл

Для удобства использования панели из 24 положительных сывороток, содержащих антитела ^О к ЦМВ, оставили только 20 положительных сывороток Так как сыво-

ротки под номерами №№ 17, 30, 32, 39 имели «граничные» значения индекса авидности (табл 10) Сыворотки с №№ 17 по 40 перенумерованы как №№ 17-36 Количество отрицательных сывороток, не содержащих антитела к ЦМВ, осталось прежним -16 номеров

Образцы сывороток после разведения в отобранном стабилизирующем солевом растворе 1 1 были разлиты во флаконы и лиофилизированы одновременно, в стандартных условиях, после чего флаконы были укупорены под вакуумом Полученные лиофилизиро-ванные сыворотки были аттестованы по физико-химическим параметрам Величина относительной погрешности массы раствора при розливе составила 1,6%, остаточная влажность - менее 1 % Все флаконы были герметичны Полученные характеристики соответствовали нормативам ВОЗ для стандартных образцов биопрепаратов

Образцы лиофилизированных сывороток аттестовали методом ИФА в различных иммуноферментных тест-системах отечественного и зарубежного производства (табл 10 и И) Характеристики сывороток, полученные до лиофилизации, были подтверждены по ОП

Таблица 11

Аттестация лиофилизированных сывороток, входящих в состав с гандартной панели (сыворотки, содержащие антитела к ЦМВ)_

№№ сывороток Векто-ЦМВ-IgG-стрип (Вектор-Бест) ЦМВ-скрин (Биосервис) CMV-IjG-Elisa PKS medac (MEDAC) CMV-IgG-Eu recomb Cobas core (Хофф-манн ЛаРош И/мл)

оп,„ К* ОД492 А U/мл

17 2,156 19,5 1,113 2,039 28,2 н/и

18 2,217 20,05 1,191 1,946 19,9 -

19 2,116 19,15 0,931 1,650 9,3 -

20 2.642 23,8 0.910 1,674 9,8 2,5

21 2,456 22,15 1,078 1,863 15,6 -

22 2,109 19,0 1,149 2.116 40,9 -

23 1,825 16,35 0,960 1,856 15,3

24 1,560 14,14 1,060 1,952 20,4 -

25 1,455 12.9 1,117 2,125 42,8 -

26 1,532 13,8 0.924 1,984 22,7 -

27 0,230 2.06 0,347 1,209 4,00 1,9

28 0,194 1.75 0,430 1,057 3 05 1,2

29 1,779 16,07 0,874 1,327 4,95 -

30 0,315 2,83 1.027 1,477 6,55 3,5

31 0,338 3,02 0,903 1,316 4,86 -

32 0,638 5,7 0,686 1,015 2,83 65

33 1,483 13,27 1,324 1.810 13,8 -

34 0,637 5.67 0,844 1,353 52 10

35 0,259 2,33 0.970 1.416 5,8 2.3

36 0,259 2,33 0,763 1,152 3,6 1,6

ОЛкрит 0,127 ЦМВ <1,0 ЦМВ* >1,0 Разность (ОП.^-ОП- -г) ЦМВ* <0,15 ЦМВ* >2,1 Си! оЯ 0,4 АН/мл серая зона 0,35-0,45 А1//МЛ ЦМВ <0,5 И/мл ЦМВ*Х>,7 И/мл COMHUT 0,5-0,7 И/мл

На основании проведенных исследований, подтвердивших показатели иммуно-ферментиой активности лиофилизированных сывороток при храпении в различных температурных условиях, стабильность физико-химических свойств сывороток, отобранные 36 сывороток были аттестованы в качестве стандартной панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса О к ЦМВ На панель разработаны и утверждены свидетельство и инструкция по применению Стандартная панель внесена в Реестр национальных стандартных образцов РФ под номером ОСО 42-28-360-01

Выявление генетических маркеров При выборе районов генов герпесвирусов в качестве генетических маркеров мы основывались на следующих принципах во-первых, и самое важное, это максимальное количество последовательностей выбираемого района различных штаммов и изолятов, депонированных в базах данных, Анализ баз данных показал, как правило, последовательность какого-либо района генома герпесвирусов представлена из 3-5 штаммов и изолятов, редко из 10-12 Поэтому, чтобы составить картину изменчивости геномов среди выявляемых изолятов мы выбирали район по махсимальной представленности его в базах данных Во-вторых, выбранный район должен кодировать функционально важный для вируса белок, и, в-третьих, выбранный район должен иметь минимальную гомологию с аналогами других герпесвирусов

а-Герпесвирусы Вирусы простого герпеса 1 и 2 типа Анализ международных баз данных показал, что нуклеотидные последовательности геномов ВПГ в базах представлены ограниченным количеством штаммов и изолятов Для ВПГ-1 - это 6 штаммов и 5 клинических изолятов, а для ВПГ-2 - это 7 штаммов и 6 клинических изолятов Для выявления генетических маркеров вирусов простого герпеса задачей своего исследования мы определили выявление ДНК ВПГ 1 и 2 типа с высокой степенью специфичности в клинических образцах, ограничиваясь одноступенчатой процедурой проведения ПЦР Поставленная задача решалась посредством подбора уникальных олигонуклеотидов-праймеров для амплификации фрагментов генов 11Ь44 (ВПГ-2) и иБ-б (ВПГ-1), кодирующих амипокислотные последовательности гликопротеинов С и И

Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 2% агарозном геле О положительной реакции судили по полосе ампликона, соответствующей размеру 395 п о • для ВПГ-1 и 392 по- для ВПГ-2 Кроме того, были проведены ПЦР с градиентами температуры отжига 56°-64°С для ВПГ-1 и 58°-67°С для ВПГ-2 Электрофорезы продуктов проведенных реакций показали следующее как в случае ВПГ-1 (рис 33), так и в случае ВПГ-

2 (рис. 34) присутствуют только теоретически рассчитанные ампликоны при всех температурах, выбранных для градиентов.

Рее. 33. Электрофореграмма амплифицируемого фрагмента ВПГ-1. ¡-8 - градиент температуры отжига 56°-64°С, 9 - маркер риС19/Мзр1 (справа размеры рест-рикционных фрагментов, пар оснований).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12

' С: : * -

501,489 404 331 ... '' 1 . I ■' тт

242 190 147 111 ■ . , "г'.

Рис. 34. Электрофореграмма амплифицируемого фрагмента ВПГ-2 2-11 - градиент температуры отжига 58°-67°С, 1,12- маркер риС19/Мйр1 (слева размеры рест-рикционных фрагментов, пар оснований)

С использованием разработанных олигонуклеотидов-праймероа было проведено ПЦР-обследование 238 человек по поводу рецидивирующего генитального герпеса, при отсутствии клинических проявлений генитального герпеса, имеющих проблемы фертиль-ности и вынашивания беременности. При этом у каждого из пациентов неоднократно исследовали плазму крови, материал морфологических элементов, соскоб из цервикального канала, сперму как в период обострения, при рецидивирующем герпесе, так и в стадии ремиссии.

У 121 человека результаты ПЦР-обследования были положительны. В табл. 12 приведены результаты вьивления ДНК ВПГ-1 и ВПГ-2 у этих пациентов.

Таблица 12

Результаты выявления ДНК ВПГ-1 и ВПГ-2.___

Диспансерные группы Выявлен ВПГ Выявлен ВПГ-1 Выявлен ВПГ-2 ВПГ1 + 2

Пациенты с проблемами фертильности 11 - 8 3

Пациентки с проблемами вынашивания беременности 22 5 15 2

Пациенты с рецидивирующим ге-нитальным герпесом 37 6 25 6

Пациенты с асимптомнмм течением 15 - 13 2

Контактные лица 36 21 15 -

Из приведенных данных видно, что ДНК только ВПГ-2 была выявлена в 63% случаев, а ДНК только ВПГ-1 у 26% обследованных пациентов. При этом совместное выявление ДНК обоих типов составило 11%. Полученные результаты показывают, что причиной генитального герпеса чаше бывает ВПГ-2, встречаемость ВГ1Г-1 значительно ниже. Однако в 11% случаев выявляются вирусы и 1-го и 2-го типа. Полученные результата подтверждают этиологическую роль каждого из вирусов простого герпеса 1 и 2 типов в патогенезе генитального герпеса и наличие смешанного типа инфекции Очевидно, что причиной фертильности и невынашивания беременности может стать вирус простого герпеса и чаще 2-го типа.

Вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая

Поставленную задачу решали посредством подбора уникальных праймеров для амплификации фрагмента гена иЬЗб генома ВВО, кодирующего тимидинкиназу, для которого было найдено наибольшее количество нуклеотидных последовательностей из 5 штаммов и 10 клинических изолятов, депонированных в международных базах нуклеотидных данных.

Рас. 35. Определение ДНК вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая в клинических образцах.

ПЦР-продукт был подвергнут электрофорезу в агарозном геле. О положительной реакции судили по полосе ампликона, соответствующей размеру 394 п о. На рис. 35 на электрофореграмме показано расположение ампликона, соответствующего амплифици-руемому гену 11136

|5- Герпесвиру сы Цитомсгаловирус человека

Был изучен район генома ЦМВ, кодирующий гликопротеин В ^В) вирусной оболочки (ген иЬ55). Обнаружено 70 нуклеотидных последовательностей, кодирующих Ы-концевую часть белка §В, различных вариантов ЦМВ. На рис. 36 показана электрофо-реграмма продуктов (244 п. н.) полимеразной цепной реакции ДНК цитомегаловируса при градиенте температуры отжига 57°-65°С.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 М 12 13 14 15 16 17 М 19 20

Рве. 36. Электрофореграмма амплифицируемого фрагмента цитомегаловируса в 2%- ном агарозном геле.

Дорожки 1-10 - градиент температуры отжига 57-65°С; дорожки М - маркер 100-1500 п.н. (Си-бЭнзим, Новосибирск); дорожки 12-17 - ПЦР ДНК герпеевнрусов ВПГ-1, 2 (штаммы НИ и Мв из А ТСС соответственно), ВВО (штамм Е1Иеп из АТСС), ЕВУ (штамм Ка|1 из АТСС), ЦМВ (штамм АО-169 из АТСС), ННУ-6 (штамм г29 из АТСС); дорожки 19-20 - электрофорез продуктов ПЦР-анализа клинических образцов.

В данной работе проанализировано значительное количество последовательностей гена 41.55 ЦМВ - 70 депонированных последовательностей N-концевой части гена из различных регионов мира. Это позволяет надеяться, что выявленная тенденция внутривидовой изменчивости выбранного района генома будет сохраняться и предлагаемые прай-меры будут выявлять ДНК ЦМВ во всех случаях этой инфекции. ПЦР-анализ нескольких

сотен клинических образцов в случае положительной реакции всегда выявлял продукт размером 244 п.н. Таким образом, предлагаемую нами пару праймеров можно использовать для автоматического секвенирования ДНК ЦМВ из клинических образцов и определять штаммовую принадлежность региональных вирусных изолятов. Кроме того, предлагаемые праймеры могут стать основой для создания биочипа, позволяющего тестировать различные штаммы и генотипы цитомегаловируса человека.

Вирус герпеса человека 6 типа

В качестве гена-мишени нами был выбран ген Uli, кодирующий белок рЮО. Этот белок является жизненно важным белком для репликации ВГЧ-6 и не может быть делегирован или модифицирован в жизнеспособном вирусе Поэтому область генома, кодирующая этот структурный вирусный белок может являться маркерной для ПЦР-диагностики. В геноме штамма Z29 (B-тип) для дизайна праймеров был выбран район гена Ul 1 с координатами 21884-22289 н о Этот район гена имеет размер 405 п о. и 96% гомологии с ВГЧ-6А (% гомологии для всего гена Uli - 88%).

1 3 3 4 5 6 1 8 9 10 11 12 13 14

Рис. 37. Результаты ПЦР-анализа клинических образцов (электрофорез в 1% агарозном геле). 2-7 - примеры ПЦР клинических образцов, полученных от детей с диагнозом внезапная экзантема; 8-9 - ПЦР клинических образцов, полученных от пациентов с диагнозом СПИД; 11—13 — ПЦР сывороток, полученных от пациентов с/диагнозом синдром хронической усталости, 1, 10, 14 - 100 Ьр ДНК-маркер.

Элекгрофоретический анализ продуктов реакции при 1радиенте температуры отжига показал, что температура отжига может варьировать в пределах от 49,2°С до 58,4°С без существенного изменения интенсивности ПЦР-сигнала. Достаточно широкий интервал температур отжига позволяет проводить ПЦР на различных моделях отечественных и зарубежных амплификаторов. Чувствительность реакции составила 1ТЦД50. В итоге нами

были разработаны олигонуклеотиды-праймеры и оптимальные условия по использованию ПЦР для диагностики герпесвирусной инфекции ВГЧ-6 (рис. 37).

у-Герпесвирусы Вирус Эпштейна-Барр

Поставленную задачу решали посредством подбора уникальных праймеров для амплификации фрагмента гена BKR.F1, кодирующего ЕВЫА1, для которого было найдено наибольшее количество нуклеотидных последовательностей известных штаммов и клинических изолятов, учитывая факт стабильности этого белка в инфицированных тканях во всех случаях выявления ВЭБ-инфекции Для выявления гомологии ДНК ВЭБ были проанализированы консервативные участки генов, кодирующих основные белки, и из большого массива базы данных «ОепеВапк» был выбран участок гена В К К1 I ВЭБ с 27 по 538 н о. (по наибольшему числу сопоставимых гомологии).

Секвенирование и рестрикционный анализ ПЦР-продукта (рис. 38) подтвердил полное соответствие нуклеотидной последовательности выбранному участку гена ВККР1

Рис. 38. Электрофореграмма амплифицируемого фрагмента EBV (размер фрагмента 530 а. о.). Дорожки 1-4 - ПЦР суммарной ДНК из крови больных инфекционным мононуклеозом; дорожка 5 - ПЦР суммарной ДИК из культуры клеток, хронически инфицированной штаммом Raji ВЭБ; дорожки 7-11 - ПЦР суммарной ДНК культур клеток, инфицированных ВПГ-1, ВПГ-2, ВВО (зостер), ЦМВ, ВГЧ-6 соответственно; дорожка 12 -суммарная ДНК

неинфицированной культуры клеток; дорожка 6 - маркер Ä/Pspl

Разработка универсальных программ (температурно-в ременных профилей) для ПЦР-диагностики герпесвирусов человека

В рамках проведения работ по диагностике генитального герпеса мы столкнулись со значительным количеством клинических образцов. Это - и кровь, и соскобы из церви-хального канала, и образцы спермы, и корочки, и содержимое морфологических элемен-

тов Поэтому использование индивидуальных условий амплификации для каждого вида возбудителя герпеса (ВПГ-1, ВПГ-2 и ЦМВ) оказалось бы мало производительным решением Кроме того, нам пришлось разработать и праймеры для дифференциальной ПЦР-диагностики Clamydia trachomatis, Ureaplasma urealyticum и Mycoplasma hommis (данные в диссертации не указаны)

По этим соображениям для использования предлагаемых праймеров в диагностике герпесвирусов человека мы разработали универсальные условия диагностической амплификации Для этого на реактивах различных серий и различных производителей проводили амплификацию с различными градиентами температур отжига Анализ этой работы позволил всю разработанную ПЦР-диапюстику проводить по двум программ, а не по уникальным для каждой пары праймеров

Условия проведения реакций

Программа №1

Программа №2

IISV-1, HSV-2, VZV, EBV, HCMV

С trachomatis, V uealyticum, ff hommis, HHV-6

55°C-40 сек

72°C-1,0 мин 93°C-15 сек

72°C-40 сек . 93°C-15 сек

55°C- 40 сек -25 циклов

93 °C- 1,0 мин 55°C-40 сек

72°C- 40 сек 93°C-25 сек

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 39. Пример ПЦР клинических образцов:

2 - Chlamydia trachomatis (485 п. о ),

3 - Ureaplasma urealyttcum (340 п. о.),

4 — Mycoplasma hominis (240 п. о.),

5 - HHV-6 (405 п. о.), 7-HSV-1 (400 п о.),

8 - HSV-2 (392 п. о.),

9 - VZV (394 п. о ), 10-EBV (530 по),

11 - HCMV (244 п. о.),

1.6 12 - маокео f nl 1019/MsnH

На рис. 39 показана картина электрофореза диагностической ПЦР, проведенной по этим двум программам.

Таким образом, была разработана ПЦР-диагностика ДНК ВПГ-1, ВПГ-2, ВВО, ВЭБ, ЦМВ и ВГЧ-6. Проведена апробация на вирусных референс-штаммах из коллекции АТСС. Создан универсальный подход в виде двух программ для ПЦР ДНК этих вирусов.

ВЫВОДЫ

1. Создана серия экспрессирующих плазмидных конструкций, с фрагментами генов герпесвирусов человека 1-6 типов, обеспечивающих в клетках Е. coli синтез рекомбинант-ных белков, содержащих выявленные с помощью компьютерного анализа антигенные детерминанты. Плазмидные конструкции обеспечивали синтез в клетках бактерий следующих рекомбинантных белков - 1) рек-gD-l и peK-gG-2, содержащих иммунодоминантные области гликопротеина D ВПГ-1 и гликопротеина G ВПГ-2; 2) рек-gK, содержащего им-мунодоминантную область гликопротеина Е вируса ВВО; 3) рек-рр!50, рек-р52 и рек-рр65, содержащих иммунодоминантные области главного матричного фосфопротеина ppl 50, ДНК-связываклцего белка р52 и тегументного фосфопротеина рр65 цитомегалови-руса; 4) рек-рЮО и рек-р41, содержащих иммунодоминантные области белков рЮО и р41 вируса герпеса человека 6-го типа; 5) рек-р 13 и рек-р54, содержащих иммунодоминантные области белков р 18 и р54 вируса Эпштейна-Барр

2. Создан бактериальный (К coli) экспрессирующий вектор на основе плазмидной ДНК pUR290-6*his. Отличительными особенностями этой конструкции является кодирование шестигистидинового тракта (6*His), который формирует на С-конце целевого ре-комбинантного белка аффинную мишень для очистки полноразмерной копии белка на ме-таллохелатных сорбентах, и биосинтез ß-галактозидазы, которая в конечной конструкции

Программа ЛИ

Программ* JVtl

укорачивается до небольшого размера и обеспечивает высокий уровень сорбции белка на полистирольных планшетах

3 Отработаны методы выделения рекомбинантных полипептидов, достаточной чистоты, для последующего их использования при выявлении методом ИФА в исследуемых сыворотках крови антител, специфичных к вирусам герпеса человека Показано, что рекомбинантные полипептиды рек-gD-l и peK-gO-2 (ВПГ), рек-gE (ВВО), рек-р52, рек-рр65 и рек-рр150 (ЦМВ), рек-рЮО и рек-рр41 (ВПГ-6), рек-р18 и рек-р54 (ВЭБ) могут быть использованы для иммуноферменгного выявления в исследуемых сыворотках крови антител, специфичных соответствующим герпесвирусам человека 1-6 типа

4 Флуоресцентные моноспецифические кроличьи антисыворотки, к рекомбинант-ным белкам рек-рр150, рек-1Е2, рек-рр65 цитомегаловируса, обеспечивают выявление ЦМВ с помощью иммунофлуоресцентного анализа т situ

5 Создана стандартная панель сывороток (№ ОСО 42-28-360-01) для контроля им-мунофермептпых диагностических тест-систем, выявляющих антитела к цитомегаловиру-су человека

6 Выявлены уникальные генетические маркеры вирусов герпеса человека 1-6 типов, локализованные в генах US-6 (ВПГ-1), UL44 (ВПГ-2), UL36 (ВВО), UL55 (ЦМВ), BKRFI (ВЭБ) и U11 (ВГЧ-6) Амплификация методом ПЦР генетических маркеров с помощью рассчитанных олигонуклеотидных праймеров позволяет выявлять различные штаммы и клинические изоляты вирусов простого герпеса 1 и 2 типов, вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая, цитомегаловируса, вируса Эпштейна-Барр и вируса герпеса человека 6-го типа

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 М А Суслопаров, П А Белавин, А В Крендельщиков, А.И Бедристов М М Бахтина, В В Гуторов, И В Бабкин, А А Чепурнов "Клонирование и определение первичной структуры генов белков IE2 и рр150 цитомегаловируса человека (НСМУ)//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1996, N1, стр 3235

2 Суслопаров М А, Суслопаров И М, Плясунов И В , Бахтина М М, Сафронов П Ф, Гришаев М П, Блинов В М, Иванькина Т Ю «Получение рекомбинантного антигена белка р52 цитомегаловируса человека (HCMV) » // Мол генетика, микробиология и вирусология, 2000, № 4, стр 24-29

3 Суслопаров И М, Суслопаров М А, Ивченко С Н, Гришаев М П, Смердова М А, Косова Е Ю, Блинов В М , Сараев Д В, Махова Н М , Носкова Н В "Копст-

руирование рекомбинантного антигена рр65 цитомегаловнруса человека и исследование его иммунохимических свойств» // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2005, № 2, стр 28-32

4 Ивченко С Н, Суслопаров И М, Масычева В И, Суслопаров М А, Мезенцев А Н "Конструирование жидкой панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела класса IgG к цитомегаловнрусу человека" // Вестник Российской академии медицинских наук, 2004, №8, стр 37-39

5 Ивченко С Н, Суслопаров И М, Масычева В И, Суслопаров М А, Лосев М В «Разработка иммуноферментной тест-системы для опредетения антител в сыворотке крови к цитомегаловирусу человека» // Сибирский медицинский журнал, 2005, №2(том 20), стр 53-55

6 Яеган М В , Чернявский А М, Мироненко С П, Слайковская JI Е, Литасова Е Е, Лукьянчикова НЛ, Кайдорин А Г, Суслопаров МА, Махова НМ «Выявление герпесвирусов в крови пациентов с кардиоваскулярной патологией» // Клиническая лабораторная диагностика, №4,2003, стр 48-49

7 И М Суслопаров, М А Суслопаров, Н М Махова, Т Ю Загоруйко, Н В Носко-ва. «Выявление ДНК цитомегаловнруса человека (Human cytomegalovirus) с помощью ПЦР» // Биотехнология, 2004, №6, С 76-82

8 Суслопаров И М, Плясунов И В , Сафронов П Ф, Бахтина М М, Махова Н М, Локтева Л А, Гришаев М П, Суслопаров М А «Разработка и получение рекомбинантного антигена gD вируса простого герпеса 1-го типа (HSV-1) » / Мол генетика, микробиология и вирусология, 2001, №2, стр 34-37

9 Суслопаров И М, Суслопаров М А, Жукова А В , Махова Н М, Носкова Н В , Терещенко А Ю, Смердова М А, Гришаев М П, Бечикова А В "Конструирование рекомбинантного антигена gE вируса ветряной оспы и опоясывающего лишая и исследование его иммунохимических свойств" // Биотехнология, 2004, №4, С 83-89

10 Суслопаров М А, Суслопаров И М, Плясунов И В , Локтева Л А , Бахтина М М , Махова Н М, Данилюк Н К, Смердова М А, Лобанова В В, Гришаев М П, Терещенко А Ю "Конструирование рекомбинантных антигенов вируса Эпштейна-Барр и исследование их иммунохимических свойств" // Биотехнология, 2004, №5, С 87-94

11 Плясунов И В , Суслопаров М А, Суслопаров И М, Бахтина М М, Махова Н М, Гришаев М П, Терещенко А Н, Смердова М А «Получение рекомбинантного ан-

тигена plOO герпесвируса человека 6-го типа» // Биотехнология, 2004, №6, С 8388

12 И В Плясунов, М А Суслопаров, М М Бахтина, И М Суслопаров, Н М Махова, Н В Носкова, О Ю Федоренко, А В Бечикова "Использование метода полиме-разной цепной реакции для выявления ДНК вируса герпеса человека 6-го типа (Human herpes virus 6 type, HHV6)"// Биотехнология, 2005, №1, с 83-89

13 Суслопаров М А , Махова Н М, Носкова Н В, Плясунов И В , Суслопаров И М, Сергеев А Н, Шерстобоев Е Ю , Мартюшев-Поклад А В , Сергеева С А, Эпштейн О И, Глотов А Г, Глотова Т И "Изучение эффективности лечебно-профилактического действия сверхмалых доз антител к гамма-интерферону на экспериментальной мышиной модели герпесвирусной инфекции"// Антибиотики и химиотерапия -2004 -№10 - С 3-6

14 Суслопаров М А, Суслопаров И М, Махова Н М, Омигов В В , Литасова Е Е, Леган М В, Слайковская Л Е, Мироненко С П, Чернявский А М, Лукьянчикова Н Л "Исследование маркеров герпесвирусных инфекций при ишемической болезни сердца (ИБС) "// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, №4, 2005, стр 36-40

15 М А Суслопаров, И М Суслопаров, Т Ю Загоруйко, Н В Носкова, Н М Махова. "Выявление ДНК вирусов простого герпеса 1 и 2 типов (Herpes simplex virus 1,

' 2 type) с помощью ПЦР при генитальном герпесе"// Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2006, принята в печать

16 Суслопаров МА " Рекомбинантная плазмидная ДНК pUL 32 HCMV, обеспечивающая экспрессию фрагмента гена UL32 цитомегаловируса человека, кодирующего гидрофильную частЬ основного матричного белка рр150, в клетках бактерий Е coli "//Патент РФ № 2151801 от 28 07 1998 г, БИ № 18 от 27 06 2000 г

17 Суслопаров М А, Суслопаров И М, Плясунов И В "Фрагмент гена UL44 цитомегаловируса человека, кодирующий иммунодоминантную часть белка р52, и рекомбинантная плазмидная ДНК pUL44 HCMV, обеспечивающая экспрессию фрагмента гена UL44 цитомегаловируса человека в клетках бактерий Е coli" // Патент РФ №2151800 от 28 07 1998г,БИ№ 18от27 06 2000г

18 Суслопаров М А, Суслопаров И М, Плясунов ИВ" Рекомбинантная плазмидная ДНК pHSVDl, обеспечивающая экспрессию фрагмента гена US6 вируса простого герпеса 1 типа человека, кодирующего иммунодоминантную часть гликопротеина Д этого вируса, в клетках бактерий Е coli"// Патент РФ № 2178806 от 21 01 2000 г, БИ№3 от 27 01 2002 г

19 Суслопаров М А, Бахтина М М , Суслопаров И М , Махова Н М , Плясунов И В , Локтева Л А " Рекомбинантная плазмидная ДНК pUl 1HHV6, обеспечивающая экспрессию фрагмента гена Ul 1 герпесвируса человека 6 типа, кодирующего иммуно-доминантную частъ белка тегумеита рЮО, в клетках бактерий Е coli" Патент РФ № 2189393 от 20 03 2000 г, БИ № 26 от 20 09 2002 г

20 Суслопаров М А, Плясунов И В , Бахтина М М , Суслопаров И М , Махова Н М " Рекомбинантная плазмидная ДНК pU27HHV6, обеспечивающая экспрессию фрагмента гена U27 герпесвируса человека 6 типа, кодирующего имунодоминангную часть белка р41, в клетках бактерий Е coli" Патент РФ № 2201450 от 25 06 2001 г, БИ № 9 от 27 03 2003 г

21 Суслопаров М А, Суслопаров ИМ" Рекомбинантная плазмидная ДНК pUL83HCMV, обеспечивающая экспрессию в клетках бактерий Е coli рекомби-нантного белка, содержащего иммунодоминантную часть фосфопротеина рр65 HCMV и фрагмент бета-галактозидазы"// Патент РФ Na 2218408 от 05 11 2001 г, БИ № 34 от 10 12 2003 г

22 Суслопаров М А , Суслопаров И М , Махова Н М , Плясунов И В , Бахтина М М " Синтетические олигонуклеотиды - праймеры, используемые для выявления ДНК цитомегаловируса человека"// Патент РФ№ 2164945 от 07 12 1999 г, БИ № 10 от 10 04 2001 г

23 Суслопаров М А, Суслопаров И М, Махова Н М Плясунов И В Бахтина М М " Синтетические олигонуклеотиды-праймеры, используемые для выявления для выявления ДНК вируса простого герпеса 1 типа человека"// Патент РФ № 2165977 от 07 12 1999 г, БИ № 12 от 27 04 2001 г

24 Суслопаров М А , Суслопаров И М, Загоруйко Т Ю Махова Н М " Синтетические олигонуклеотиды-праймеры, используемые для выявления ДНК вируса простого герпеса 2 типа человека"// Патент РФ № 2196179 от 07 03 2001 г, БИ № 1 от 10 01 2003 г

25 Суслопаров М А, Плясунов И В, Бахтина М М, Суслопаров И М Махова Н М " Пара синтетических олигонуклеотидов-праймеров, используемых для выявления ДНК вируса простого герпеса человека 6 типа"// Патент РФ № 2193067 от 05 07 2001 г, БИ Ks 32 от 20 11 2002 г

Суслопаров М А

Суслопаров Михаил Александрович

Автореф дисс ва соискание ученой степени доктора медицинских паук Подписано в печать 29 05 2008 Заказ № 46 Формат 60x84/16 Уел печ л 2 Тираж 100 экз Типография Института катализа им Г К Борескова СО РАН

Информация о работе

Суслопаров, Михаил Александрович
доктора медицинских наук
Кольцово, 2008
ВАК 03.00.06

Автореферат

Конструирование рекомбинантных антигенов и выявление генетических маркеров для диагностики герпесвирусных инфекций человека - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы