Влияние герпесвирусных инфекций на эмбриональное развитие при экстракорпоральном оплодотворении и на течение и исход естественно наступившей беременности

Цибизов, Антон Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние герпесвирусных инфекций на эмбриональное развитие при экстракорпоральном оплодотворении и на течение и исход естественно наступившей беременности
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние герпесвирусных инфекций на эмбриональное развитие при экстракорпоральном оплодотворении и на течение и исход естественно наступившей беременности"

На правах рукописи

ЦИБИЗОВ Антон Сергеевич

ВЛИЯНИЕ ГЕРПЕСВИРУСИЫХ ИНФЕКЦИИ НА ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ ПРИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОМ ОПЛОДОТВОРЕНИИ И НА ТЕЧЕНИЕ И ИСХОД ЕСТЕСТВЕННО НАСТУПИВШЕЙ БЕРЕМЕННОСТИ

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 8 ОКТ 2012

Москва-2012

005053355

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждение «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Кущ Алла Александровна

Официальные оппоненты: Носик Николай Николаевич

доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ«НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России, заведующий лабораторией онтогенеза

Филатов Феликс Петрович

доктор биологических наук, ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России, заведующий лабораторией вирусологической диагностики

Ведущая организация:

ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ

Защита состоится «15» октября 2012 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.131.01 при ФГБУ «НИИ вирусологии

им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России; по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « » ^^/с^гуС* 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы

Вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус (ЦМВ) чрезвычайно широко распространены в популяции и вызывают широкий спектр заболеваний человека [Mocarski Е.,2007; Boppana S., 2007]. В последние годы возрастает число исследований, свидетельствующих о том, что инфекции органов мочеполовой системы, в том числе вирусные, занимают важное место в структуре причин мужского бесплодия [Pellati D. 2008; Bezold G., 2007]. Мнения исследователей относительно роли герпесвирусов в этиологии нарушений фертильности у мужчин расходятся от полного отрицания влияния ВПГ и ЦМВ на процесс созревания мужских половых клеток [Eggert-Kruse W., 2009; Neofytou Е., 2009] до установления прямой корреляции между вирусным инфицированием эякулята и мужским бесплодием [Bezold G., 2007; Ochsendorf F., 2008].

Многие вопросы в этой области оставались невыясненными. Так, не была доказана внутригамегная локализация вирусных частиц в зрелых мужских половых клетках, не установлена способность инфицированных ВПГ сперматозоидов участвовать в оплодотворении ооцитов и в передаче вируса эмбрионам через вируссодержащие сперматозоиды. Недостаточно изучены роль и механизмы противовирусной защиты в репродукции человека, которые могли бы эффективно сдерживать развитие герпесвирусной инфекции. Это, прежде всего, относится к реакциям врожденного иммунитета.

В настоящее время бесплодием страдают более 70 млн. пар во всем мире, однако результаты лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий остаются относительно невысокими. Так, средняя частота наступления беременности в цикле экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) составляет 30-40%. В связи с этим активно ведутся поиски средств и методов повышения эффективности лечения бесплодия, а также выявления маркеров, которые позволили бы прогнозировать результаты проведения ЭКО. Особый интерес представляет выяснение роли цитокинов, иммунорегуляторная функция которых в репродукции человека мало изучена В связи с этим перспективным представляется выяснение экспрессии цитокинов в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови у пациенток с бесплодием, проходящих лечение методом ЭКО.

Урогенительные инфекции (УГИ) могут оказывать влияние как на ранние стадии беременности, так и на ее течение, создают серьезный риск внутриутробного инфицирования плода и неблагоприятного исхода беременности [Гаджиева З.С., 2010]. Особое место среди возбудителей УГИ занимают возбудители вирусных инфекций: ВПГ и ЦМВ. Рост заболеваемости герпесвирусными инфекциями (ГВИ) у людей репродуктивного возраста,

многообразие клинических проявлений с преобладанием бессимптомных форм, определенные трудности в диагностике и терапии позволили Европейскому региональному бюро ВОЗ включить указанные инфекции в группу заболеваний, которые определяют будущее инфекционной патологии человека. [ВОЗ, 2007] Кроме того, эти инфекции представляют перинатальную угрозу, увеличивая риск внутриутробного инфицирования плода и неблагоприятного исхода беременности.

Цель исследования

Цель настоящего исследования заключалась в оценке влияния бессимптомных форм ВПГ- и ЦМВ-инфекций на мужскую фертильность, на ранние стадии эмбриогенеза человека и на течение беременности.

Задачи исследования

1. Оценить частоту выявления ВПГ в эякуляте пациентов с нарушением фертильности по сравнению со здоровыми мужчинами.

2. Изучить влияние ВПГ на основные показатели качества спермы (концентрацию сперматозоидов, количество подвижных и морфологически нормальных форм сперматозоидов).

3. Установить, влияют ли герпесвирусы, обнаруженные в сперматозоидах и в фолликулярной жидкости, на исход лечения бесплодия методом ЭКО.

4. Провести анализ уровней цитокинов в фолликулярной жидкости (ФЖ) и в сыворотке крови (СК) у женщин, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО, и определить, существует ли зависимость между уровнями цитокинов, показателями эмбриогенеза и эффективностью лечения.

5. Выявить частоту встречаемости прямых маркеров ВПГ и ЦМВ и серологические показатели ВПГ-инфекции у беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (ОАГА) в течение беременности, начиная со 2-го триместра

6. Провести анализ влияния иммунотерапии рекомбинантным интерфероном альфа на течение герпесвирусных инфекций у беременных женщин.

7. Оценить влияние ВПГ и ЦМВ на состояние детей, родившихся у инфицированных герпесвирусами матерей.

Научная новизна и практическая значимость

1. Установлена частота выявления ДНК ВПГ и инфекционной активности вируса в эякуляте, во фракции подвижных сперматозоидов и в ФЖ у пациентов с бесплодием в браке.

2. Проведен анализ влияния ВПГ на качество спермы, показатели эмбриогенеза и исход лечения бесплодия методом ЭКО.

3. Исследован цитокиновый профиль у пациенток, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО. Оценено влияние уровней цитокинов на основные показатели раннего эмбриогенеза и исход лечения по программе ЭКО.

4. Определена распространенность ГВИ в группе беременных женщин с ОАГА. На основании комплексного обследования беременных в динамике установлена частота первичного инфицирования и реактивации ВПГ в данной группе риска.

5. Изучено влияние иммунотерапии с использованием рекомбинантного интерферона а2Ь (Виферон®) на элиминацию маркеров ВПГ и ЦМВ.

6. Проведена оценка влияния ВПГ и ЦМВ, обнаруженных у матерей с ОАГА, на состояния новорожденных детей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Установлена прямая корреляция между инфицированностью эякулята ВПГ и показателями качества спермы. ДНК и инфекционная активность ВПГ выявлены не только в цельном эякуляте, но и во фракции подвижных сперматозоидов.

2. Частота формирования бластоцист после проведения ЭКО статистически значимо ниже при обнаружении ВПГ у партнера во фракции подвижных сперматозоидов по сравнению с пациентами, у которых ВПГ в сперматозоидах выявлен не был. Показано, что у пациенток, у которых в ФЖ присутствовали маркеры ВПГ, достоверно снижена частота имплантации эмбрионов после применения ЭКО.

3. Показано, что при высоких концентрациях ИЛ2 и ИФНу в ФЖ и в СК у женщин, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО, частота наступления беременности снижена в 7 раз и 33 раза, соответственно. Предиктором негативного результата лечения могут служить концентрации ИФНу и ИЛ2 в СК выше 9 пг/мл и 5 пг/мл, соответственно.

4. У беременных женщин с ОАГА отмечается высокая инфицированностъ ВПГ и ЦМВ. В связи с этим показана целесообразность комплексного подхода к диагностике ГВИ у беременных женщин, включающего применение вирусологических, молекулярно-биологических и серологических методов диагностики, с целью своевременного установления активности инфекционного процесса

5. Показана эффективность включения препарата рекомбинантного интерферона а2Ь (Виферон®) в состав базовой терапии при лечении ГВИ, начиная со второго триместра беременности.

6. Выявлена повышенная частота рождения детей в тяжелом состоянии и в состоянии средней степени тяжести у беременных с ОАГА, у которых перед родами были обнаружены маркеры ГВИ.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на 2-м международном конкурсе молодых ученых в области нанотехнологий (Москва, 2009); на Всероссийской междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» (Санкт-Петербург, 2010); на 4-м Региональном научном форуме «Мать и дитя» (Екатеринбург, 2010); на 20-м Мировом конгрессе по фертильности и стерильности (Германия 2010); на 12-м Всероссийском научном форуме «Мать и дитя» (Москва 2011); на 6-м Международном конгрессе по репродуктивной медицине (Москва 2012); на 23-м Европейском конгрессе по перинатальной медицине (Франция 2012).

В завершенном виде доклад по диссертационной работе прошел предварительную экспертизу на совместном заседании Отдела молекулярной вирусологии и Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России 18 апреля 2012 года. Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, 3-х глав с изложением результатов собственных исследований, главы обсуждения результатов и выводов. Работа изложена на 126 страницах, иллюстрирована 10 таблицами и 13 рисунками. Список цитированной литературы включает 37 отечественных и 205 иностранных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточная культура. В работе использовали перевиваемую культуру клеток почек зеленой мартышки Vero, полученную из лаборатории культур тканей ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. Для культивирования Vero использовали среду Игла-МЕМ (ПанЭко, Москва), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США), 2 мМ L-глугамина, 50 мкг/мл гентамицина.

• Вирус. В работе использовали референс-штамм вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) - F, любезно предоставленный доктором L. Pereira (США). ВПГ-1 поддерживали путем пассирования на чувствительных клетках линии Vero.

Определение инфекционной активности ВПГ. Инфекционный титр ВПГ, характеризующий активность вируса, определяли в клеточной культуре модифицированным методом бляшек. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса, которые вносили по 0,05 мл в 96-ти луночные планшеты с монослоем клеток Vero. Активность вируса выражали в количестве бляшкообразующих единиц, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл). Титр вируса составлял не менее 1х108 БОЕ/мл.

Пациенты. Обследование беременных женщин и их новорожденных детей проводилось на базе ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва) в период 2010-2012 г.г. Были исследованы клинические материалы от 115 беременных женщин с ОАГА. Обследование 404 супружеских пар, обратившихся для лечения бесплодия методом ЭКО, проводилось в лечебно-диагностическом центре «Евро-Клиник» (г. Москва), в отделении репродукции ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва) и в Медицинском Центре «Новая жизнь» (г. Москва). Эякулят был получен и исследован от 315 мужчин, обратившихся в медицинские учреждения г. Москвы: в Медико-генетический научный центр РАМН; в ФГБУ «НЦАГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвигия России, в клинику «Апьтра-Вита», в клинико-диагностический центр «Пастер» и в медицинский центр «Евро-Клиник».

Быстрый культуральный метод (БКМ) выполняли в соответствии с методическими рекомендациями, утвержденными Роспотребнадзором [М., 2008]. Для выявления ВПГ в культуру клеток Vero вносили 0,2 мл образцов и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С в атмосфере 5% СОг. Через 24 ч клетки фиксировали холодным ацетоном в течение 30 мин при +4°С и проводили детекцию белков ВПГ в реакции непрямой иммунофлюоресценции (рНИФ) с помощью вирусспецифических моноклонапьных антител (МКА).

Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА). Определение антител к ВПГ и ЦМВ классов М и G в сыворотке крови проводили методом тИФА с помощью сертифицированных наборов фирм НПО «Диагностические системы» (Россия), а также ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Для определения антител IgM использовали набор «ВектоВПГ-IgM» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М». Для выявления и определения титра IgG антител использовали наборы «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-G» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G». Индекс авидности (ИА) специфических IgG определяли с помощью набора «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-С-Авидность» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О-АВИДНОСТЬ». Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение и амплификацию ДНК проводили с помощью сертифицированных коммерческих наборов ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Для экстракции ДНК использовали наборы «ДНК-сорб-АМ» или «ДНК-сорб-В». Выявление нуклеогидных последовательностей проводили с помощью наборов «АмплиСенс® HSV I, II-EPh», «АмплиСенс® CMV-EPh». Амплификация проводилась с использованием термоциклера «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) при определенной температурной программе, согласно рекомендации производителя тест-систем.

Полимеразная цепная реакция in situ (ПЦР in situ). Метод ПЦР in situ был модифицирован и использован для анализа клинических материалов и культур клеток. Препараты готовили на стеклах с адгезивным покрытием (Histobond, Германия). В работе были

использованы праймеры, направленные к гену ДНК-полимеразы ВПГ. Визуализацию результатов реакции проводили с помощью светового микроскопа. В препаратах от пациентов, инфицированных ВПГ, наблюдали темно-коричневую метку ДНК ВПГ. Далее подсчитывали количество клеток, содержащих метку, и общее количество клеток в препарате.

Анализ интерферонового статуса и уровней цитокинов. Уровни цитокинов и факторов роста у женщин, проходивших программу ЭКО, определяли в CK и ФЖ с использованием тест-систем: Human G-CSF (Invitrogen, USA), Human GM-CSF (Biosourse, USA), Human Bcl-2 (Bender MedSystems, USA), CD95 Human ELISA Kit (Abeam, USA) и Fas Ligand Human ELISA Kit (Abeam, USA). Использовали также тест-системы ЗАО «Векгор-Бест» (Новосибирск, Россия): гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-4 - ИФА - БЕСТ, альфа-ФНО - ИФА - БЕСТ, альфа-Интерферон - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-1 бега - ИФА - БЕСТ, Ингерлейкин-6 - ИФА - БЕСТ, Ингерлейкин-18 - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-2 - ИФА - БЕСТ, Интерлекин-10 - ИФА - БЕСТ.

Характеристика используемого иммунопрепарата. Для лечения беременных женщин использовали иммуномодулирующий препарат Виферон® (ООО «Ферон», Россия). В состав препарата входит человеческий рекомбинантный интерферон-а2Ь, антиоксиданты (а-токоферола ацетат и аскорбиновая кислота) и основа (масло какао).

Статистическая обработка данных. Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных компьютерных программ STATISTICA 6,0. При анализе полученных данных были использованы приемы альтернативного анализа и описательной статистики (среднее арифметическое значение, медианы, среднее квадратичное отклонение и ошибка среднего). Применение критерия Шапиро-Уилка использовалось для оценки присутствия нормального распределения признаков. Оценка статистической значимости различий в группах с нормальным распределением проводилась с помощью t-критерия Стъюдента и двухстороннего точного критерия Фишера Для сравнения непараметрических данных использовали критерий Манна-Уитни, для парных сравнений - критерий Вилкоксона. Различия показателей считали статистически значимыми при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ Влияние бессимптомной герпесвирусной инфекции на результаты экстракорпорального

оплодотворения

Частота обнаружения ВПГ в цельном эякуляте и во фракции подвижных сперматозоидов

Было изучено влияние ВПГ на показатели спермы. Инфекционно активный вирус методом БКМ определяли в эякуляте 245 мужчин, из которых 164 пациента обследовались по

оводу бесплодия в браке и 81 фертильных мужчин проходили обследование для включения в эуппу доноров спермы. Данные по частоте обнаружения вируса у пациентов с бесплодием и у даровых фертильных мужчин представлены в таблице 1.

аблица 1. Сравнительный анализ частоты обнаружения инфекционно активного ВПГ в якуляте пациентов с бесплодием и у фертильных мужчин

Изученные группы Пациенты с бесплодием Фертильные мужчины

п=164 п=81

Детекция ВПГ в 47/164 7/81

эякуляте 28,6% 8,6%

Статистическая

значимость различий Р= =0,039

(критерий хи-квадрат)

Из таблицы 1 видно, что частота выявления инфекционно активного вируса как в ;ельном эякуляте, так и в подвижных гаметах пациентов с бесплодием в браке статистически начимо выше, чем у фертильных мужчин.

Методом ПЦР были изучены подвижные сперматозоиды (ПС), выделенные из эякулята т 131 пациента с бесплодием. Кроме того, у 64 пациентов из этой группы исследование вирусного генома проводили дополнительно методом ПЦР in situ. В целом, частота обнаружения ДНК вируса в сперматозоидах у обследованных пациентов методами ПЦР и ПЦР in situ составила 21,4% (28/131). Инфекционная активность ВПГ во фракции ПС была обнаружена у 11,4% мужчин с бесплодием. Результаты других исследователей также свидетельствуют о том, что отдельные вирусные продукты (ДНК и белки) и структуры (вирусные капсиды) могут обнаруживаться в мужских половых клетках чаще, чем инфекционно активный вирус [Бочарова E.H., 2007; Науменко В.А., 2010].

Представляло интерес изучить влияние ВПГ-инфекции на показатели спермы. В этом разделе работы проведено обследование 315 мужчин, из которых у 101 (32%) маркеры ВПГ в эякуляте были обнаружены и у 214 выявлены не были. Оценивали основные параметры спермы. Данные приведены в таблице 2.

Таблица 2. Влияние вируса простого герпеса на основные показатели спермограммы обследованных мужчин

Показатели спермограммы Исследуемые группы

ВПГ+ (п=101) ВПГ- (п=214)

Концентрация сперматозоидов 64 60

(10б/мл) [0;415] [0; 504]

р=0,299

Подвижность сперматозоидов 21 40

(а+Ь, %) [0; 86] [0; 85,5]

р=0,0001

Количество морфологически 13 19

нормальных форм (%) [0; 56] [0; 67]

р=0,002

Примечание. Данные представлены в медианах [минимальное; максимальное значение]. Различия статистически значимы при р<0,05, критерий Манна-Уитни.

Результаты, представленные в таблице 2, показали, что подвижность сперматозоидов, а также количество морфологически нормальных клеточных форм в эякуляте мужчин, у которых был обнаружен ВПГ, статистически значимо ниже по сравнению с эякулятами, не содержащими вирус. Это означает, что ВПГ оказывает негативное влияние на качество спермы. Полученные данные дополняют и уточняют результаты исследователей, которые указывали на обнаружение ДНК ВПГ у пациентов, в эякуляте которых отмечалась низкая концентрация и снижение подвижности сперматозоидов [ВегоМ в, 2007].

Рисунок 1. Выявление ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах человека

; **г •

к ч »

* * 0 * »_ , *

* * • * t

- » ,

+ J

V • '

»i1 ♦

» W

к» _ V I » щ „ *

Цитологический препарат сперматозоидов, выделенных из фракции подвижных клеток эякулята пациентов с бесплодием. Реакция ПЦР in situ. Окраска гематоксилином Караччи. Гаметы, содержащие ДНК ВПГ, обозначены стрелками. Увеличение 400х.

Сходные данные были получены при изучении ПС методом ПЦР in situ с целью локализации ДНК ВПГ в сперматозоидах (рисунок 1).

Данные детального изучения морфологии индивидуальных сперматозоидов показали, что такие нарушения строения клеток, как макроголовки, микроголовки и сохранение цитоплазматической капли на шейке сперматозоидов у ВПГ-инфицированных лиц встречались достоверно чаще, чем у мужчин, у которых ВПГ обнаружен не был (р<0,05).

На рисунке 1 видно, что сперматозоиды, содержащие геномную ДНК ВПГ, имеют нарушение строения головки. В целом, около половины сперматозоидов в эякуляте мужчин с бесплодием имели морфологические аномалии.

Оценка влияния ВПГ-инфицированных сперматозоидов на эмбриогенез in vitro

Для оценки влияния ВПГ на ранние стадии развития человека были проведены исследования материалов от пациентов, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО.

По результатам выявления вирусной ДНК пары, обратившиеся в клиники ЭКО (п=131), были разделены на две группы. В группу 1 вошли пары, у которых ПС содержали ВПГ (ВПГ+, п=28). Группу 2 составили пары, у которых в ПС ВПГ выявлен не был (ВПГ-, п=103) В изученных группах сопоставляли результаты оплодотворения и развития эмбрионов в условиях in vitro. Данные представлены в таблице 3.

Таблица 3. Сравнительная оценка развития эмбрионов при экстракорпоральном оплодотворении сперматозоидами, инфицированными (ВПГ+) и неинфицированными (ВПГ-) вирусом простого герпеса

Сперматозоиды от Группа 1 Группа 2

пациентов с ВПГ+ ВПГ-

Данные ^^^бесплодием п=28 п=103

Эмбриогенеза

Частота оплодотворения, % 76 66

(276/362) (1136/1715)

Частота 76 84

дробления, % (210/276) (958/1136)

Частота формирования 21,4* 493*

бластоцист, % (6/28) (51/103)

*Различия статистически значимы, р=0,015

Представленные в таблице 3 результаты показали, что такие параметры как частота оплодотворения и частота дробления в изученных группах статистически значимо не различались. Важно отметить, что частота формирования бластоцист в группе, положительной по ВПГ, была статистически значимо ниже, чем в группе, отрицательной по ВПГ (р=0,015). Это

означает, что ВПГ-инфекция сперматозоидов негативно влияет на раннее развитие эмбриона, а

именно, на стадию формирования бластоцисты.

Анализ результатов ЭКО при ВПГ инфицировании мужских гамет

Результаты анализа эффективности лечения бесплодия методом ЭКО у пациентов с ВПГ в ПС и у ВПГ-негативных пациентов представлены в таблице 4.

Таблица 4. Сравнительный анализ эффективности экстракорпорального оплодотворения при инфицировании сперматозоидов вирусом простого герпеса (ВПГ+) и при отсутствии вируса в сперматозоидах (ВПГ-)

Пациенты группа I группа II Статистическая

ВПГ+ ВПГ- значимость

Показатели^-^

эффективности п=28 п=103 (критерий х2)

ЭКО

Частота имплантации 2,6 14,1 р=0,01

эмбрионов, % (2/76) (40/284)

Частота наступления 7 32 р=0,016

беременности, % (2/28) (33/103)

Сравнительный анализ показал, что при обнаружении ДНК ВПГ в ПС (группа ВПГ+) частота имплантации эмбрионов (ЧИЭ) была в 5,4 раз ниже и частота наступления беременности (ЧНБ) - в 4,6 раз ниже, чем в группе ВПГ- , в которой ПС не содержали ДНК ВПГ. Снижение частоты имплантации, обнаруженное в настоящей работе, может быть следствием разных причин, в том числе: низкой потенции эмбрионов к имплантации у ВПГ-инфицированных пациенток, а также влияния вируса на иммунные механизмы, которые могут негативно действовать на репродуктивные органы на ранних стадиях беременности. Выявление ДНК ВПГ и инфекционно активного вируса в фолликулярной жидкости у пациенток ЭКО

Методом БКМ ВПГ в ФЖ был обнаружен у 33 пациенток из 404 (8%). Определение ДНК ВПГ проводили у 300 пациенток из 404 обследованных. Частота ПЦР-позитивных результатов в ФЖ пациенток составила 5% (15 из 300 пациенток). Данные по ВПГ в ФЖ сопоставляли с количеством полученных ооцитов, количеством оплодотворившихся клеток, а также количеством образовавшихся эмбрионов и частотой их имплантации. Было установлено, что количество ооцитов и эмбрионов, а также качество эмбрионов у ВПГ-позитивных и ВПГ-негативных пациенток статистически не различались. В то же время различия были выявлены при анализе ЧИЭ (рисунок 2). На рисунке видно, что у инфицированных пациенток наблюдается выраженное снижение ЧИЭ (6 имплантировавшихся эмбрионов из 91

перенесенных - 6,6%, против 134/811 - 16,5%, соответственно). Различия статистически значимы (р=0,02). ЧНБ у пациенток с ВПГ в ФЖ также была ниже, чем у ВПГ-негативных женщин. Показатель ЧНБ составил 18% (6/33), что ниже, чем у неинфицированных женщин 31% (115/371).

Рисунок 2. Негативная связь частоты имплантации эмбрионов с частотой выявления инфекционно активного ВПГ в фолликулярной жидкости

Оценка эффективности ЭКО у пациенток в зависимости от уровней антител к ВПГ

Оценивали уровни противовирусных антител класса в СК у 123 пациенток, обратившихся для лечения бесплодия в клиники ЭКО. Образцы периферической крови были получены у пациенток перед процедурой пункции фолликулов яичника. Антитела класса 1§0 были обнаружены у 95% женщин с бесплодием. Во всех случаях были обнаружены высокоавидные антитела. Кроме оптической плотности уровень антител оценивался по коэффициенту позитивности (КП), расчет которого производился в соответствии с инструкциями фирмы производителя тест-систем и представлял отношение оптической плотности пробы к пороговому уровню оптической плотности.

Анализировали показатели ЧНБ у пациенток с высоким и низким уровнем анти-ВПГ в изученных материалах. Для этого пациентки с бесплодием были разделены на 2 группы: группу I составили пациентки, у которых значения оптической плотности (ОП) анти-ВПГ ДО были ниже 1,4; в группу II вошли пациентки, у которых значения ОП анти-ВПГ ДО >1,4. Указанные значения ОП были выбраны исходя из средних значений ОП у обследованных пациенток с бесплодием (0п=1,4±0,88). Данные сравнительного анализа результатов лечения бесплодия пациенток обеих групп представлены в таблице 5.

Таблица 5. Сравнительный анализ частоты наступления беременности у пациенток с высокими и низкими уровнями антител к белкам ВПГ в сыворотках крови

Группы пациенток Оптическая плотность (ОП) М±ш Коэффициент позитивности (КП=ОПпро6ы/ОП1фит.) Частота наступления беременности ЧНБ, в%

Группа I ОП анти-ВПГ <1,4 п=83 0,73±0,5 3±2,1 36,1 (30/83)

Группа II ОП анти-ВПГ >1,4 п=40 2,1±0,43 8±1,6 17,5 (7/40)

Статистическая значимость р=0,001** р=0,001** р=0,039***

*ОПкРит= ОП отрицательного образца +0,2; "Критерий Стьюдента; ***Критерий Фишера.

Из таблицы 5 видно, что у пациенток с высокой концентрацией анти-ВПГ в СК, ЧНБ статистически значимо снижена, по сравнению с пациентками с низким уровнем антител. Исследование цитокинного профиля в материалах от пациенток с бесплодием

Для объяснения полученных результатов по влиянию ВПГ на формирование бласгоцисг, имплантацию эмбрионов и частоту наступления беременности было выдвинуто предположение о влиянии иммунных механизмов на ранние стадии репродукции. В связи с этим было проведено изучение цитокинов в ФЖ и СК пациенток ЭКО. Для анализа были выбраны провоспалигельные цитокины ИЛ1р, ИЛ2, ИЛ6, ФНОа, ИФНа, ИФНу; два противовоспалительных цитокина (ИЛ4 и ИЛ 10), а также ростовые факторы (ГМ-КСФ и Г-КСФ), которые участвуют в регуляции дифференцировки клеток гранулоцитарно-макрофагального ряда.

При изучении цитокинов в ФЖ и в СК было установлено, что частота выявления цитокинов в изученных биологических материалах варьирует. Определение цитокинов в двух материалах, полученных от пациенток ЭКО, показало, что в большинстве случаев концентрации изученных цитокинов не отличались в ФЖ и СК. Статистически значимые различия были выявлены при изучении ФНОа: уровень ФНОа был достоверно выше в ФЖ, чем в СК (р=0,003). Было установлено также, что концентрации ИЛ2 и ИФНу в ФЖ коррелируют с уровнями данных цитокинов в СК, г=0,93 и г=0,86, соответственно, р=0,001.

Изучение зависимости эффективности ЭКО от концентрации цитокинов в фолликулярной жидкости.

Для изучения влияния цитокинов, находящихся в ФЖ, на исход лечения бесплодия методом ЭКО определяли медианные значения концентраций цитокинов у пациенток, у которых беременность наступила (группа I) и у пациенток с неудачной попыткой ЭКО (группа

И).

Рисунок 3. Зависимость частоты наступления беременности от концентрации цитокинов в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови пациенток ЭКО

а) 1Ш2 в фоллюттсфнон жидкости

70-/. -I

б) ИЛ2 в сыворотке крови

60% т

50% 30% 50'/.

По оси абсцисс - концентрация цитокина, пг/мл; по оси ординат - частота наступления беременности, %.

в) НФН; в фолликулярной жидкости

вОУ.п

10 12 14 >16

I) ПФН7 в сыворотке крови 80%-,

12 3 4 5 «»?

Изучали зависимость между ЧНБ и уровнями цитокинов в ФЖ и СК пациенток. Результаты анализа эффективности ЭКО при различных концентрациях ИЛ2 и ИФНу в биологических образцах представлены на рисунке 3 (а - г). Можно видеть, что при превышении концентрации цитокинов ИЛ2 и ИФНу в ФЖ определенной «критической» величины (совпадающей с пиковыми значениями на графиках) наблюдается резкое снижение ЧНБ. Так, негативное влияние на исход проведения ЭКО проявляется при концентрации ИЛ2 в ФЖ, превышающей 15 пг/мл (рисунок 3, а). Резкое снижение ЧНБ наблюдалось при концентрации ИФНу в ФЖ, превышающей 9 пг/мл (рисунок 3, в), а также при концентрации ИФНа- 12 пг/мл (данные не представлены).

Сходную картину наблюдали при изучении СК. Концентрации цитокинов в СК, выше которых резко снижалась ЧНБ, составили: для ИЛ2 - 11 пг/мл (рисунок 3, б), для ИФНу - 6 пг/мл (рисунок 3, г). Полученные данные о влиянии концентрации ИФНу на ЧНБ

принципиально сходны с результатами других исследователей [Thum М. et al, 2007]. Обращает на себя внимание тот факт, что концентрации цитокинов в CK, при которых наблюдалось снижение ЧНБ, были значительно ниже, чем в ФЖ. Зависимости между показателями ЧНБ и концентрациями других изученных цитокинов и факторов роста установлено не было. Таблица 6. Частота наступления беременности при высоких и низких значениях концентраций провоспалительных цитокинов в фолликулярной жидкости

Цитокины Показатель ЧНБ, % Статистическая значимость Ос2)

ИЛ2 п=137 Высокий уровень (>15 пг/мл) п=19 5,3 (1/19) р=0,028

Низкий уровень (<15 пг/мл) п=118 36,4 (43/118)

ИФНу п=192 Высокий уровень (>11 пг/мл) п=13 0 (0/13) р=0,03

Низкий уровень (>11 пг/мл) п=172 33 (59/179)

цитокинов ИЛ2 и ИФНу в ФЖ выше «критических» значений, эффективность лечения

бесплодия статистически значимо снижена.

Представляло интерес определить, на какую стадию эмбриогенеза влияют провоспалительные цитокины. Для этого исследовали возможную связь между обнаружением и концентрацией изученных цитокинов в ФЖ и количеством полученных ооцитов, зигот, эмбрионов до стадии бласгоцисты и бласгоцисг. Анализ показал, что у 13 пациенток с высокой концентрацией ИФНу сформировались 70 эмбрионов из 149 ооцитов, что составляет 47%. У 179 пациенток, у которых цитокины в ФЖ отсутствовали или находились в низкой концентрации, из 1676 ооцитов было получено 1174 эмбриона (70%). Выявленные различия статистически значимы (р<0,05). Ни в одном случае из 13 с высоким уровнем ИФНу не наблюдали формирование бласгоцисг, в том числе у пациенток, у которых было получено от 18 до 42 яйцеклеток. В то же время у 179 пациенток с низким уровнем ИФНу образование бластоцист было выявлено в 63 случаях (35%), различия статистически значимы (р=0,03). Таким образом,

высокие концентрации провоспалительных цитокинов негативно влияют на самые ранние стадии эмбриогенеза.

Суммируя результаты собственных исследований и данные литературы, можно заключить, что высокие концентрации ИЛ2 и ИФНу оказывают негативное влияние на эффективность ЭКО. ИЛ2 и ИФНу представляют особый интерес как предикторы исхода ЭКО в связи с прямой корреляцией между обнаружением указанных цитокинов в ФЖ и в СК. Уровень ИФНу и ИЛ2 в СК выше 9 пг/мл и 5 пг/мл, соответственно, является неблагоприятным иммунным фоном для наступления беременности. С учетом основной биологической функции ИФНу можно предположить, что индукция интерферона связана с проявлением ВПГ-инфекции. Об этом свидетельствуют данные настоящей работы об ассоциации между обнаружением ВПГ в сперматозоидах и в ФЖ и снижением частоты наступления беременности. Изучение маркеров герпесвирусных инфекций ВПГ- и ЦМВ-этиологии у беременных женщин с ОАГА

Внутриутробное инфицирование плода ВПГ во многом определяется заболеваниями будущих матерей во время беременности. Особенно опасна генитальная локализация герпеса у беременных, которая встречается в 7 - 35% случаев, и в последнее время этот показатель постоянно увеличивается [Bursrein D.N., 2003; Баринский И.Ф., 2004]. Наиболее опасна бессимптомная и атипичные формы ВПГ инфекции. Об этом свидетельствуют данные, показавшие, что большинство детей с неонатальным герпесом рождаются от матерей с атипичными или бессимптомными формами инфекции [Bursrein D.N., 2003].

Для изучения частоты встречаемости маркеров ВПГ под наблюдением находились 115 беременных женщин репродуктивного возраста с ОАГА. Исследование проводилось, начиная со второго триместра беременности (16-24 недель). С целью выявления маркеров ВПГ были применены вирусологические (БКМ), молекулярно-биологические (ПЦР) и серологические методы (ИФА). В качестве клинического материала от беременных женщин были обследованы кровь, моча и урогенитапьные соскобы (УГС).

У подавляющего большинства беременных в анамнезе были признаки неблагоприятного течения беременности. У 40,9% обследованных женщин во время предыдущих беременностей отмечено обострение ГВИ, вызванной ВПГ и/или ЦМВ. Во время настоящей беременности при обследовании отмечалась высокая отягощенность матерей по инфекционным заболеваниям, и была выявлена та или иная урогенитальная инфекция вирусной и/или бактериальной этиологии. Частота выявления маркеров ВПГ и ЦМВ у беременных женщин с ОАГА

На первом этапе обследования женщин был проведен сравнительный анализ частоты выявления прямых маркеров ВПГ и ЦМВ (инфекционной активности и вирусной ДНК). Пациентку считали инфицированной, если маркеры вирусов у нее были обнаружены, по

крайней мере, в одном изученном клиническом материале (моче, крови, УГС) хотя бы одним из использованных методов. В течение всего периода обследования у 43 из 115 (37,4%) беременных были выявлены маркеры исследуемых вирусов. Маркеры ВПГ выявлены при первичном обследовании в 21 из 115 наблюдений (18,3%). Клинических проявлений генитального герпеса во время обследования выявлено не было. Маркеры ЦМВ были обнаружены у 26 из 115 (22,6%) беременных женщин. Маркеры ВПГ и ЦМВ одновременно были выявлены у 4-х женщин, что составило 3,5%.

Частота обнаружения маркеров ВПГ и ЦМВ в различных клинических материалах

Мы проанализировали частоту выявления маркеров ВПГ и ЦМВ у беременных женщин в различных биологических материалах. Были исследованы 573 пробы: по 191 образцу крови, мочи и УГС. Было показано, что ДНК ВПГ и ЦМВ чаще всего обнаруживается в УГС, несколько реже - в моче и в единичных случаях - в крови. Различия между обнаружением маркеров ЦМВ и ВПГ в УГС и в моче по сравнению с обнаружением в образцах крови были статистически значимы (р<0,05). Статистически значимых различий между обнаружением маркеров ВПГ в моче и в УГС обнаружено не было. В то же время статистически значимые различия были выявлены между частотой выявления маркеров ЦМВ в УГС и моче: 16,2% против 5,2%, соответственно.

Выявление серологических маркеров ВПГ- и ЦМВ-инфекций у беременных женщин

Для оценки параметров гуморального ответа исследовали СК методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) на наличие специфических анти-ВПГ и анш-ЦМВ антител (АТ) классов ^М и ДО, определяли титры и авидность ДО-АТ.

Иммуноферментиое исследование СК показало, что у 74 из 85 (87,1%) беременных при обследовании присутствовали анти-ЦМВ-ДО ашитела и у 80% (68/85) присутствовали анти-ВПГ-^О . Анти- ЦМВ-ДО антитела отсутствовали у 11 (12,9%) женщин, анги-ВПГ-ДО отсутствовали у 17 из 85 женщин, что составило 20%. У трех (3,5%) беременных при обследовании были обнаружены антитела класса ^М против ВПГ и у 14 - анти-ЦМВ-^М (16,4%). Считается, что антитела класса 1ёМ являются маркерами острой инфекции. Среди обследованных нами беременных у 3 из 14 с анти-ЦМВ ^М были выявлены прямые маркеры ЦМВ. Из 3-х беременных, у которых были обнаружены анти-ВПГ ^М, прямые маркеры вируса были выявлены в 1 случае. Одним из объяснений этих результатов может быть низкое содержание герпесвирусов в клинических материалах - ниже чувствительности использованных методов. Другое возможное объяснение состоит в том, что при ГВИ антитела класса 1§М могут циркулировать в периферической крови продолжительное время и после перехода острого периода инфекции в другую форму [0гпоу,2002].

При оценке индекса авидности (ИА) ДО было обнаружено, что у 59 (86,8%) женщин были выявлены высокоавидные (ИА>50) анти-ВПГ-ДО. Высокоавидные анти-ЦМВ-ДО были выявлены у 69 из 74 обследованных женщин (93,2%).

Комплексное лабораторное обследование 85 беременных женщин с ОАГА с помощью серологических, вирусологических и молекулярно-биологических методов позволило определить характер ВПГ и ЦМВ инфекций у этих женщин на втором триместре беременности. У большинства беременных отмечались бессимптомные ВПГ и ЦМВ инфекции (рисунок 4): у 50 женщин из 85 (58,8%) - бессимптомная ВПГ инфекция, у 47 из 85 женщин (55,3%) - бессимптомная ЦМВ инфекция. Маркеры ЦМВ- и ВПГ- инфекции не были обнаружены у 11,8% (10/85) и 15,3% (13/85) женщин, соответственно. Реактивация ЦМВ инфекции была отмечена у 30,6% из обследованных нами женщин (26/85). Реактивация ВПГ в период обследования была обнаружена у 19 из 85 женщин (22,4%). Первичное ВПГ- или ЦМВ-инфицирование было отмечено у 3,5% (3/85) и 2,4% (2/85) женщин, соответственно, у которых отсутствовали ДО АТ, но обнаруживались 1£М и/или прямые вирусные маркеры. Рисунок 4. Формы герпесвирусных инфекций ВПГ и ЦМВ этиологии у беременных

По горизонтали - формы ГВИ, обнаруженные у беременных женщин с ОАГА;

по вертикали - количество беременных женщин, в процентах.

Полученные данные показали, что у значительной части беременных женщин с ОАГА произошла реактивация ГВИ или первичное инфицирование: у 33% - ЦМВ, у 26% - ВПГ. Эти женщины составили группу риска как по развитию заболевания, так и по передачи ГВИ плоду и новорожденному.

Влияние иммунотерапии рекомбинантным интерфероном альфа на течение герпесвирусных инфекций у беременных женщин

Для предотвращения неблагоприятного течения ГВИ у беременных женщин с ОАГА и лечения других сопутствующих патологических состояний использовали препарат Виферон®,

женщин во 2-м триместре беременности

Бессимптомная Отсутствие инфекции Реактивация инфекция инфекции

■ ВПГ в ЦМВ

Первичное инфицирование

который представляет собой рекомбинантный ИФНа2Ь в сочетании с антиоксидантами. Этот препарат разрешен к использованию у новорожденных детей и беременных женщин в 3-м триместре, преимущественно в виде ректальных свечей и геля. В настоящей работе был проведен сравнительный анализ эффективности включения Виферона® в комплексное лечение беременных, начиная со второго триместра беременности.

Из 21 беременной женщины, имевших маркеры ВПГ при первом обследовании, 14 были повторно обследованы через 1 месяц после курса терапии: 5 женщин получали базовую терапию и 9 женщин - базовую терапию с Вифероном® (Таблица 7). При базовой терапии вирус не был обнаружен у 1/5, элиминация произошла в 20% наблюдений. При базовой терапии с Вифероном® элиминация ВПГ произошла у 9/9 женщин, то есть в 100% случаев. Из 26 женщин, инфицированных ЦМВ, повторно были обследованы 15 женщин. Вирус не был обнаружен у 10/13 женщин, получавших базовую терапию с Вифероном® и у 2/2 женщин -базовую терапию без Виферона®. Статистически значимые различия между этими группами не выявлены.

Таблица 7. Элиминация прямых маркеров герпесвирусов после иммунотерапии беременных женщин с ОЛГЛ

Лечение*

Сроки обследования Вирусы базовая терапия + Виферон® базовая терапия

100% 20%

ВПГ 9/9 1/5

II триместр р=0,005

беременности 76,9% 100%

ЦМВ 10/13 2/2

р>0,05

100% 41,6%

ВПГ (8/8) (5/12)

III триместр р=0,015

беременности 100% 0

ЦМВ (3/3) (0/4)

р=0,029

На повторное обследование из 94 исходно ВПГ-отрицательных беременных женщин явились 76, у 25 из них был обнаружен вирус (33%). Инфицированные женщины прошли курс лечения, после которого 20 женщин были обследованы третий раз в третьем триместре: 12

женщин получали базовое лечение, 8 - с включением Виферона®. Маркеры ВПГ не были выявлены у 5/12 (41,7%) при базовой терапии и ни у одной из 8 (100%) - при включении Виферона® ,р<0,05 (Таблица 7).

Из 89 исходно ЦМВ-отрицательных беременных женщин на повторное обследование явились 75, у 11 из них был обнаружен вирус (14,7%). На третье обследование явились 7 женщин: 4 - получавших базовую терапию и 3 - сочетание с Вифероном® (Таблица 7). После базовой терапии ЦМВ не элиминировал ни у одной женщины, после терапии с Вифероном® -элиминировал у всех обследованных женщин. Как видно из представленных данных, трехкратно удалось обследовать небольшое количество пациенток. Тем не менее анализ результатов лечения этой группы беременных женщин с ОАГА во втором и в третьем триместрах беременности показал, что включение Виферона® в состав базовой терапии приводит к положительному эффекту как против ВПГ, так и против ЦМВ значительно чаще, чем базовая терапия без Виферона®. Это открывает перспективы проведения дальнейших расширенных исследований для совершенствования терапии беременных женщин с ОАГА. Оценка влияния инфицированности матерей на состояние новорожаенных

Анализ частоты выявления вирусных инфекций у матерей, родивших детей в ГБУЗ МО «МОНИИАГ», показал, что маркеры ГВ были обнаружены у 25/69 (36,2%) женщин. У 25 инфицированных матерей 8 детей родились в тяжелом состоянии и 3 ребенка - в состоянии средней тяжести, суммарно в 11/25 (44%) наблюдений. У неинфицированных матерей 5 из 44 (11,4%) детей родились в тяжелом состоянии или в состоянии средней тяжести. Статистический анализ показал, что риск рождения детей в тяжелом состоянии у инфицированных матерей был в 3,9 раза выше, чем у неинфицированных (44% против 11,4% р=0,006; OR=6,l 95% ДИ [1,625]; RR=3,9 95% ДИ [1,4-11,7]).

Следует отметить, что у матерей с неблагоприятным исходом беременности (новорожденные в тяжелом состоянии или в состоянии средней тяжести) значимо чаще выявляли ЦМВ (5/14, 35%) по сравнению с женщинами, у которых дети родились в удовлетворительном состоянии (4/55, 7,2%;, р=0,02, OR=7,l 95% ДИ [1,3;40,8]; RR=4,9 95% ДИ [1,25;19,5]). Для ВПГ такая закономерность не установлена (28,6% против 21,8%, соответственно, р>0,05). ВЫВОДЫ:

1. В эякуляте и во фракции подвижных сперматозоидов у мужчин с бесплодием в браке обнаружена инфекционная активность ВПГ в 28,6% и 11,4% случаев, соответственно. Частота определения ДНК ВПГ во фракции подвижных сперматозоидов была выше и составила 21,4%. Выявлена зависимость между присутствием ВПГ и ухудшением

показателей качества спермы: снижена подвижность и количество морфологически нормальных форм сперматозоидов.

2. Показано, что при лечении бесплодия методом ЭКО присутствие ВПГ в сперме не влияет на частоту оплодотворения яйцеклеткок и дробления зиготы, но статистически значимо снижает частоту формирования бластоцист, частоту имплантации эмбрионов и частоту наступления беременности.

3. Обнаружение ИЛ2 и ИФНу в высоких концентрациях в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови у женщин, проходящих лечение бесплодия методом ЭКО, ассоциируется со статистически значимым снижением частоты наступления беременности. Предиктором негативного результата лечения могут служить концентрации ИФНу и ИЛ2 в сыворотке крови выше 9 пг/мл и 5 пг/мл, соответственно.

4. У 43 из 115 обследованных беременных женщин (37,4%) с ОАГА, но без клинических проявлений ГВИ, в материалах обнаружены маркеры ВПГ и ЦМВ. Реактивация и первичная ЦМВ инфекция были выявлены 30,6% и 2,4%, соответственно. Реактивация и первичная ВПГ инфекция была установлена в 22,4% и 3,5% случаев, соответственно.

5. Включение Виферона® в состав базовой терапии беременных женщин приводило к элиминации маркеров герпесвирусов статистически значимо чаще, чем при базовой

терапии без Виферона®.

6. Установлено, что у женщин с ОАГА при обнаружении ЦМВ в III-м триместре беременности риск рождения детей в тяжелом состоянии в 3,9 раза выше, чем у неинфицированных беременных женщин.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

В журналах:

1. Климова P.P. Вирус простого герпеса и цитомегаловирус в эякуляте мужчин: вирус простого герпеса чаще встречается при идиопатическом бесплодии и коррелирует со снижением показателей спермы./ Климова P.P., Чичев Е.В., Науменко В.А., Гаджиева З.С., Цибизов A.C., Алиева A.A., Львов Д.К., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Остроумова Т.В., Сорокина Т.М., Гаврилов Ю.А., Левчук Т.Н., Сухих Г.Т., Яковенко С.А., Васильева С.Г., Вознесенская Ю.В., Симоненко Е.Ю., Кущ A.A.// Вопросы вирусологии - 2010, №1. -С.27-31.

2. Науменко В.А. Выявление вируса простого герпеса в мужских половых клетках при экспериментальной инфекции органной культуры семенника и в эякуляте мужчин с нарушениями фертильности./ Науменко В.А., Климова P.P., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Чичев Е.В., Гаджиева З.С., Цибизов A.C., Гаврилов Ю.А., Кущ A.A., Сухих Г.Т// Акушерство и гинекология. - 2010, №3. - С. 42-46.

3. Гаджиева З.С. Выявление маркеров герпесвирусной инфекции у беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом./ Гаджиева З.С., Цибизов A.C., Новикова C.B., Агаджанова Е.А., Алиева A.A., Альховский C.B., Малиновская В.В., Климова P.P., Кущ A.A. // Современные проблемы дерматовенерологии, иммунологии и врачебной косметологии. - 2010, №3. - С.35-37.

4. Цибизов А. С. Обнаружение вируса простого герпеса в сперматозоидах человека коррелирует со снижением частоты формирования бластоцист и частоты имплантации эмбрионов при экстракорпоральном оплодотворении. / Цибизов А. С., Абдулмеджидова А. Г., Краснопольская К. В., Гаджиева 3. С., Кущ А. А. // Онтогенез. - 2011 Т 42, № 6. - С. 403-480.

5. Абдулмеджидова А.Г. Высокие уровни интерлейкина 2 и интерферона гамма в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови коррелируют со снижением эффективности лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения./ Абдулмеджидова А.Г., Цибизов A.C., Краснопольская КВ., Померанцева Е.И., Красова Н.К., Кущ A.A. // Российский иммунологический журнал. - 2012, Т.6, №1, - С. 35-45.

6. Климова P.P. Влияние иммунотерапии на частоту обнаружения маркеров вирусных инфекций у беременных с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом./ Климова P.P., Зароченцева Н.В., Новикова C.B., Торшина З.В., Цибизов A.C., Агаджанова Е.А., Малиновская В.В., Кущ A.A. //Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии. -2012, Т.11, №1. - С.25-30.

Тезисы докладов:

7. Науменко В.А. Выявление вируса простого герпеса в клетках сперматогенного эпителия на модели инфекции семенника мыши in vitro / Науменко В.А., Гаджиева З.С., Цибизов A.C. // Материалы 11-го международного конкурса молодых ученых в области нанотехнологий (6-8 октября 2009 г.). - Москва 2009. - С. 792-794.

8. Науменко В.А. Герпесвирусная инфекция гамет как фактор мужского бесплодия./ Науменко В.А., Тюленев Ю.А., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Ковалев В.А., Сегал A.C., Завалишина Л.Э., Цибизов A.C., Климова P.P., Кущ A.A. // Материалы 3-ей Всероссийской междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия» (3 июня 2010 г.). -Санкт-Петербург, 2010.-С. 66.

9. Абдулмеджидова А.Г. Анализ результатов лечения бесплодия методом ЭКО у пациенток с различной активностью провоспалительных цитокинов в фолликулярной жидкости/ Краснопольская К.В., Кабанова Д.И., Горская О.С., Крстич Е.В., Цибизов A.C., Кущ A.A.//

Тез. Докл. IV Региональный научный форум «МАТЬ И ДИТЯ» (28 - 30 июня 2010), Екатеринбург 2010.- С. 4-5. 10. Abdulmedjidova A.G. A Comparative Analysis of Cytokines in the Follicular Fluid of Patient with Various Outcomes of In Vitro Fertilization/ Abdulmedjidova A.G., Krasnopolskaja K.V, Kabanova D.I., Tsibizov A.S., Kushch A.A.// Abstracts of the IFFS 20th World Congress on Fertility & Sterility (12-16 September 2010).- Munich (Germany) 2010,- P. 310.

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

АТ - антитело

БКМ - быстрый культуральный метод

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВПГ - вирус простого герпеса

ВУИ - внутриутробная инфекция

ГВ - герпесвирусы

ГВИ - герпесвирусная инфекция

ДНК-дезоксирибонуклеиновая кислота

ИА - индекс авидности

ИЛ (II) - интерлейкин

ИФА - иммуноферментный анализ

ИФН (1Пч1) - интерферон

КП - коэффициент позитивности

МКА - моноклональные антитела

ОАГА - отягощенный акушерско-гинекологический анамнез ПС - фракция подвижных сперматозоидов ПЦР - полимеразная цепная реакция СК - сыворотка крови

тИФА - твердофазный иммуноферментный анализ

УГИ - урогенительная инфекция

УГС - урогенитапьный соскоб

ФНОа (ЮТа) - фактор некроза опухоли

ФЖ - фолликулярная жидкость

ЦМВ - цитомегаловирус

ЧИЭ - частота имплантации эмбрионов

ЧНБ - частота наступления беременности

ЭКО - экстракорпоральное оплодотворение

Подписано в печать: 06.09.2012 Объем: 1,0усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 613 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г. Москва, ул. Рождественка, д. 5/7, стр. 1 (495) 623-93-06; www.reglet.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Цибизов, Антон Сергеевич

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Характеристика альфагерпесвирусов

1.1. Вирусы простого герпеса 1, 2 типов

1.2. Строение вируса простого герпеса

1.3. Организация вирусного генома

1.4. Жизненный цикл вируса

1.5. Экспрессия вирусного генома

1.6. Сборка дочерних вирусных частиц

1.7. Выход вируса из клетки

1.8. Цитомегаловирус человека

1.8.1. Строение вириона

1.8.2. Структура ДНК. Организация генома

1.8.3. Жизненный цикл вируса

1.8.4. Пути заражения и клинические проявления ЦМВ инфекции

Глава 2. Инфекции, вызванные вирусом простого герпеса

2.1. Латентная ВПГ инфекция

2.2. Реактивация ВПГ инфекции

2.3. Клинические проявления ВПГ инфекции

Глава 3. Влияние герпесвирусов на процессы репродукции человека

3.1. Ассоциация герпесвирусной инфекции с возникновением мужского бесплодия

3.2. Герпесвирусная инфекция и женское бесплодие

3.3. Влияние герпесвирусной инфекции на развитие эмбриона и плода

3.4 Влияние герпесвирусов на течение беременности и ее исход

3.5. Герпесвирусная инфекция у новорожденных детей

3.6. Влияние клеточного иммунитета на наступление, течение и исход беременности при вирусных инфекциях

3.7. Лечение бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения

3.8. Влияние иммунорегуляторных факторов на эффективность ЭКО

Глава 4. Лабораторная диагностика герпесвирусных инфекций

4.1. Культуральные методы

4.2. Иммуноцитохимическое определение вирусных антигенов в клинических образцах

4.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

4.4. Иммуноферментный метод для обнаружения противовирусных антител

4.5. Определение авидности антител 54 Заключение

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Глава 5. Материалы и методы

5.1. Список основных реактивов и препаратов, использованных в работе

5.2. Клеточные культуры

5.3. Вирусы

5.4. Определение инфекционной активности ВПГ-1 58 5.5 Быстрый культуральный метод (БКМ)

5.6. Пациенты

5.7. Клинический материал

5.8. Твердофазный иммуноферментный анализ (тИФА)

5.9. Определение авидности антител

5.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

5.11. Полимеразная цепная реакция in situ

5.12. Анализ интерферонового статуса и уровней цитокинов

5.13. Характеристика используемого лечебного препарата - Виферон®

5.14. Статистическая обработка данных

Глава 6. Влияние бессимптомной герпесвирусной инфекции на результаты экстракорпорального оплодотворения

6.1. Детекция ВПГ в эякуляте

6.1.1. Частота обнаружения ВПГ в цельном эякуляте и во фракции подвижных сперматозоидов

6.1.2. Оценка влияния ВПГ-инфицированных сперматозоидов на эмбриогенез in vitro

6.1.3. Анализ результатов ЭКО при ВПГ инфицировании мужских гамет

6.2. Детекция прямых маркеров ВПГ у пациенток, проходивших лечение бесплодия методом ЭКО 72 6.2.1. Выявление ДНК ВПГ и инфекционно активного вируса в фолликулярной жидкости у пациенток ЭКО

6.3. Изучение антител против ВПГ в периферической крови женщин с бесплодием 73 6.3.1. Оценка эффективности ЭКО у пациентов в зависимости от уровней IgG антител к ВПГ

6.4. Исследование цитокинового профиля в материалах от пациенток с бесплодием

6.4.1. Определение цитокинов в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови

6.4.2. Изучение зависимости эффективности ЭКО от концентрации цитокинов в фолликулярной жидкости

Глава 7. Изучение маркеров герпесвирусных инфекций ВПГ-и ЦМВ-этиологии у беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом

7.1. Частота анализ выявления маркеров ВПГ и ЦМВ у беременных женщин

7.2. Результаты обнаружения маркеров ВПГ и ЦМВ у беременных женщин различными методами

7.3. Частота определения маркеров ВПГ в различных клинических материалах

7.4.Выявление серологических маркеров ВПГ и ЦМВ инфекций у беременных женщин

7.5. Влияние иммунотерапии рекомбинантным интерфероном альфа на течение герпесвирусных инфекций у беременных женщин

7.6. Оценка влияния инфицированности матерей герпесвирусами на состояние новорожденных детей

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние герпесвирусных инфекций на эмбриональное развитие при экстракорпоральном оплодотворении и на течение и исход естественно наступившей беременности"

Вирус простого герпеса (ВПГ) и цитомегаловирус (ЦМВ) чрезвычайно широко распространены в популяции и вызывают широкий спектр заболеваний человека [162, 195]. В последние годы возрастает число исследований, свидетельствующих о том, что инфекции органов мочеполовой системы, в том числе вирусные, занимают важное место в структуре причин мужского бесплодия [32, 61]. Мнения исследователей относительно роли герпесвирусов (ГВ) в этиологии нарушений фертильности у мужчин расходятся от полного отрицания влияния ВПГ и ЦМВ на процесс созревания мужских половых клеток [96,191] до установления прямой корреляции между вирусным инфицированием эякулята и мужским бесплодием [67, 173]. V

Многие вопросы в этой области оставались невыясненными. Так, не была доказана внутригаметная локализация вирусных частиц в зрелых мужских половых клетках, не установлена способность инфицированных ВПГ сперматозоидов участвовать в оплодотворении ооцитов и в передаче вируса эмбрионам через вируссодержащие сперматозоиды. Недостаточно изучены роль и механизмы противовирусной защиты в репродукции человека, которые могли бы эффективно сдерживать развитие герпесвирусной инфекции (ГВИ). Это, прежде всего, относится к реакциям врожденного иммунитета.

В настоящее время бесплодием страдают более 70 млн. пар во всем мире, однако результаты лечения методами вспомогательных репродуктивных технологий остаются относительно невысокими. Так, средняя частота наступления беременности в цикле экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) составляет 30-40%. В связи с этим активно ведутся поиски средств и методов повышения эффективности лечения бесплодия, а также выявления маркеров, которые позволили бы прогнозировать результаты проведения ЭКО. Особый интерес представляет выяснение роли цитокинов, иммунорегуляторная функция которых в репродукции человека мало изучена. В связи с этим перспективным представляется выяснение экспрессии цитокинов в фолликулярной жидкости и в сыворотке крови у пациенток с бесплодием, проходящих лечение методом ЭКО.

Урогенитальные инфекции (УТИ) могут оказывать влияние как на ранние стадии беременности, так и на течение беременности, создают серьезный риск внутриутробного инфицирования плода и неблагоприятного исхода беременности [16]. Особое место среди возбудителей УГИ занимают возбудители вирусных инфекций: ВПГ, ЦМВ. Рост заболеваемости ГВИ у людей репродуктивного возраста, многообразие клинических проявлений с преобладанием бессимптомных форм, определенные трудности в диагностике и терапии позволили Европейскому региональному бюро ВОЗ включить указанные инфекции в группу заболеваний, которые определяют будущее инфекционной патологии человека [13]. Кроме того, эти инфекции представляют перинатальную угрозу, увеличивая риск внутриутробного инфицирования плода и неблагоприятного исхода беременности [19].

Цель и задачи исследования

Цель настоящего исследования заключалась в оценке влияния бессимтомных форм ВПГ- и ЦМВ-инфекций на мужскую фертильность, на ранние стадии эмбриогенеза человека и на течение беременности.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

7. Оценить влияние ВПГ и ЦМВ на состояние детей, родившихся у инфицированных герпесвирусами матерей.

Научная новизна и практическая значимость

5. Изучено влияние иммунотерапии с использованием рекомбинантного интерферона а2Ъ (Виферон®) на элиминацию маркеров ВПГ и ЦМВ.

6. Проведена оценка влияния ВПГ и ЦМВ, обнаруженных у матерей с ОАГА, на состояния новорожденных детей.

Основные положения, выносимые на защиту

4. У беременных женщин с ОАГА отмечается высокая инфицированность ВПГ и ЦМВ. В связи с этим показана целесообразность комплексного подхода к диагностике ГВИ у беременных женщин, включающего применение вирусологических, молекулярно-биологических и серологических методов диагностики, с целью своевременного установления активности инфекционного процесса.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Цибизов, Антон Сергеевич

ВЫВОДЫ:

2. Показано, что при лечении бесплодия методом ЭКО присутствие ВПГ в сперме не влияет на частоту оплодотворения яйцеклеток и дробления зиготы, но статистически значимо снижает частоту формирования бластоцист, частоту имплантации эмбрионов и частоту наступления беременности.

5. Включение Виферона® в состав базовой терапии беременных женщин приводило к элиминации маркеров герпесвирусов статистически значимо чаще, чем при базовой терапии без Виферона®.

6. Установлено, что у женщин с ОАГА при обнаружении ЦМВ в Ш-м триместре беременности риск рождения детей в тяжелом состоянии в 3,9 раза выше, чем у неинфицированных беременных женщин.

Заключение

Анализ данных научной литературы, приведенных в настоящем обзоре, показал, что вопросы, связанные с воздействием герпесвирусной инфекции на процессы репродукции, в настоящее время являются актуальными и интенсивно изучаются. В то же время следует отметить, что как в результатах экспериментов, так и в их интерпретации, наблюдаются существенные расхождения. Многие вопросы, связанные с иммунной регуляцией процессов репродукции и с влиянием герпесвирусной инфекции на эти процессы остаются до конца невыясненными. Некоторые из них перечислены ниже.

Во-первых, не определена роль бессимптомной ВПГ-инфекции в процессах репродукции человека. Ассоциация бесплодия с ГВИ.

Во-вторых, не установлены стадии репродукции человека, чувствительные к воздействию вируса.

В-третьих, не выяснено влияние иммунных реакций, развивающихся при вирусной инфекции, на ранние стадии эмбриогенеза.

В-четвертых, отсутствуют необходимые сведения о связи между инфицированием герпесвирусами и исходом лечения бесплодия методом ЭКО.

В-пятых, не получены достаточно полные и достоверные данные о влиянии бессимптомных герпесвирусных инфекций на течение беременности и ее исход.

Цель и задачи диссертационной работы направлены на поиск ответов на поставленные вопросы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 5. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

5.1. Список основных реактивов и препаратов, использованных в работе

Антимышиные иммуноглобулины, меченные ФИТЦ (Dako, Дания)

Бальзам для заключения препаратов (Shandon, США) Гематоксилин (БиоВитрум, Россия) Диаминобензидин (ДАБ) (Bioscience, США) Конъюгат Streptavidin/HRP (Dako, Дания)

Моноклональные антитела к белкам ВПГ (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского»Минздравсоцразвития России)

Перевиваемые клетки почки зеленой мартышки линии Vero (ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского»Минздравсоцразвития России)

Праймеры, меченные биотином (Синтол, ДНК-синтез, Россия)

Протеиназа К (Dako, Дания)

Среда Игла MEM (ПанЭко, Россия)

Тест-системы для выделения ДНК: «ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В (ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия)

Тест-системы для детекции ДНК: «АмплиСенс® HSV I, II-EPh»; "АмплиСенс® CMV- EPh" (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Россия)

Тест-системы для выявления антител: «ВектоВПГ-IgM» (ООО «Ветор-бест Россия) , «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М», «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-0» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G» («Диагностические системы», Россия) Тест-система для определения индекса авидности IgG-AT «ДС-ИФА-Анти-Bnr-1,2-G- Авидность», «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-О-АВИДНОСТЬ» Тест-системы для определения уровня цитокинов и ростовых факторов: Human G-CSF (Invitrogen, USA), Human GM-CSF (Biosourse, USA), Human Bcl-2

Bender MedSystems USA), CD95 Human ELISA Kit (Abcam, USA) и Fas Ligand Human ELISA Kit (Abcam, USA). А также тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия): гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-4 - ИФА

- БЕСТ, альфа-ФНО - ИФА - БЕСТ, альфа-Интерферон - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-1 бета - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-6 - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-18 - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-2 - ИФА - БЕСТ, Интерлекин-10

- ИФА - БЕСТ

Трис (гидроксиметил) аминометан (Serva, Германия) ТритонХ-100 (Serva, Германия) Фосфатно-солевой буфер (ФСБ) Эванс голубой (Sigma, США)

Эмбриональная телячья сыворотка (ЭТС) (ПанЭко, Россия) СупраСперм (Medi-Cult, Дания)

5.2. Клеточные культуры

В работе использовали перевиваемую культуру клеток почек зеленой мартышки Vero, полученную из лаборатории культур тканей ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. Для культивирования Vero использовали среду Игла-MEM (ПанЭко, Москва), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) (HyClone, США), 2 мМ L-глутамина, 50 мкг/мл гентамицина.

5.3. Вирусы

В работе использовали референс-штамм вируса простого герпеса 1 типа

- F, любезно предоставленный доктором L. Pereira (США). ВПГ-1 поддерживали путем пассирования на чувствительных клетках линии Vero. Адсорбцию вируса с инфекционной множественностью (ИМ) = 0,1-0,01 БОЕ/кл проводили в течение 1 часа при 37°С. Затем вносили поддерживающую среду с 2% ЭТС. Инфицированные клетки инкубировали при 37°С. Сбор вируссодержащей жидкости производили при выявлении 90%-ого цитопатического действия (ЦПД) в монослое (в среднем, 2 дня для ВПГ-1). Для освобождения от фрагментов клеточного детрита вируссодержащую жидкость центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10-15 мин. на центрифуге Jouan MR1812 (Франция) и отбирали пробу для контроля инфекционного титра.

5.4. Определение инфекционной активности ВПГ-1

Инфекционный титр ВПГ-1, характеризующий активность вируса, определяли в клеточной культуре модифицированным методом бляшек. Для титрования готовили возрастающие десятикратные разведения вируса, которые вносили по 0,05 мл в 96-ти луночные планшеты с монослоем клеток Vero. Панели с материалом инкубировали при 37°С в течение 7 дней. Очаги инфицированных клеток (бляшки) выявляли иммуноцитохимическим методом с использованием смеси моноклональных антител (МКА) к сверхраннему и позднему белкам ВПГ. Титр вируса выражали в количестве БОЕ, содержащихся в 1 мл (БОЕ/мл), используя формулу А=(а х b)/v, где А - число бляшкообразующих единиц в 1 мл; а - среднее число бляшек на одну лунку; b -разведение вируса; v - объём вносимого вируссодержащего материала.

5.5. Быстрый культуральный метод (БКМ)

БКМ выполняли в соответствии с Методическими рекомендациями, утвержденными Роспотребнадзором [20].

Для выявления ВПГ в культуру клеток Vero вносили 0,2 мл образцов и инкубировали в течение 1 ч при температуре 37°С в атмосфере 5% СОг. Через 24 ч клетки фиксировали холодным ацетоном в течение 30 мин. при +4°С и проводили детекцию белков ВПГ в реакции непрямой иммунофлюоресценции (нИФ) с помощью вирусспецифических МКА.

5.6. Пациенты

Обследование беременных женщин и их новорожденных детей проводилось на базе ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва) в период с 2010 г. по 02 июня 2011 г. Были исследованы клинические материалы (кровь, моча, соскоб из цервикального канала, вагинальный смыв) от 115 беременных женщин с отягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом (ОАГА), проходящих обследование и лечение в акушерском обсервационном отделении (зав. отд. - д.м.н. Зароченцева Н.В.) и в клинико-диагностическом отделении (зав.отд. - д.м.н. Новикова C.B.) ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва).

Обследование 404 супружеских пар, обратившихся для лечения бесплодия методом ЭКО, проводилось в лечебно-диагностическом центре «Евро-Клиник» (г. Москва), в отделение репродукции ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (г. Москва) и в Медицинском Центре вспомогательных репродуктивных технологий «Новая жизнь» (г. Москва).

Эякулят было получен и исследован от 315 мужчин, обратившихся в медицинские учреждения г. Москвы: в Медико-генетический научный центр РАМН; в ФГБУ «НЦ АГиП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России; в клинику «Альтра-Вита», в клинико-диагностический центр «Пастер» и в медицинский центр «Евро-Клиник».

5.7. Клинический материал

В качестве клинических образцов исследовали кровь, мочу, урогенитальные соскобы, цельный эякулят, фракцию подвижных сперматозоидов (ПС), а также фолликулярную жидкость (ФЖ).

Цельную кровь центрифугировали в течение 10 мин при 1000 об./мин. Затем стерильно отбирали фракцию лейкоцитов, расположенную над эритроцитами. Для проведения БКМ по 0,2 мл лейкоцитарной фракции вносили в культуру клеток. Сыворотку и/или плазму крови использовали для серологического анализа и определения цитокинового статуса. Мочу центрифугировали в тех же условиях. Для проведения анализа БКМ использовали осадок мочи. Фракцию ПС получали с использованием набора СупраСперм (Medi-Cult). Во всех случаях объем анализируемой пробы ФЖ и ПС для метода БКМ составлял 0,2 мл.

5.8. Твердофазный нммуноферментный анализ (тИФА)

Определение антител к ВПГ и ЦМВ классов M и G в сыворотке крови проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА).

Выявление вирусоспецифических антител проводили с помощью сертифицированных наборов фирм НПО «Диагностические системы» (Россия), а также ЗАО «Вектор-Бест» (Россия). Для определения антител IgM использовали набор «ВектоВПГ-IgM» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-М». Для выявления и определения титра IgG антител использовали наборы «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-0» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G». Анализ и интерпретацию результатов осуществляли в соответствии с инструкциями фирмы-производителя.

5.9. Определение авидности антител

Индекс авидности (ИА) специфических IgG определяли с помощью набора «ДС-ИФА-Анти-ВПГ-1,2-С-Авидность» и «ДС-ИФА-АНТИ-ЦМВ-G-АВИДНОСТЬ» фирмы «Диагностические системы» (Россия). Оценку результатов осуществляли согласно рекомендациям фирмы производителя.

5.10. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Выделение ДНК проводили с помощью двух сертифицированных коммерческих наборов ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора («ДНК-сорб-А-М», «ДНК-сорб-В»), в зависимости от природы анализируемой биологической пробы.

В работе были использованы наборы реагентов для выявления нуклеотидных последовательностей методом полимеразной цепной реакции ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора «АмплиСенс® HSV I, II-EPh»; «АмплиСенс® CMV- EPh» согласно инструкции фирмы производителя. Амплификация проводилась с использованием термоциклера «Терцик» («ДНК-Технология», Россия) при определенной температурной программе, согласно рекомендации производителя тест-систем.

5.11. Полимеразная цепная реакция in situ

Препараты для ПЦР in situ готовились на стеклах с адгезивным покрытием (Histobond). Препараты культур клеток для положительных контролей были получены путем культивирования клеток Vero и ФЛЭЧ на адгезивных стеклах.

Фиксировали препараты в 10% нейтральном формалине в течение 4 часов, затем промывали в 0,05М ТРИС-НС1 рН 8,0 буфере. Затем на стёкла наносили 200 мкл 0,01%) раствора ТритонХ-100 на 90 секунд и стекла промывали в 0,05М ТРИС-НС1 буфере в течение 2 минут.

Препараты обрабатывали протеиназой К в разведении 1:50 (разведение проводилось в ТРИС-НС1 буфере 0,05М). Время инкубации с протеиназой К было определено в результате проведения серии предварительных опытов. Для препаратов культур клеток оптимальное время инкубации составило 5 мин. Инкубацию проводили в термостате при 37°С, затем препараты промывали в ТРИС-НС1 буфере 0,05М. Промытые стекла высушивали на воздухе.

На высушенные стекла наносили по 20 мкл амлификационной смеси, состоящей из смеси праймеров, ПЦР-буфера, дНТФ, ДНК-полимеразы и деионизованной воды. Препараты накрывали покровными стёклами и обрабатывали края клеем для предотвращения испарения амлификационной смеси.

В работе были использованы праймеры, направленные к гену ДНК-полимеразы ВПГ. Амплификация проводилась в амплификаторе Вютейа ТЬегтосус1ег Т1 при оптимизированной температурной программе: 95°С 2 мин, 30 циклов; 95°С - 30 сек, 60°С - 35 сек, 72°С - 50 сек; 72°С - 4 мин.

Препараты вынимали из амплификатора, погружали в ёмкость с буфером (0,05 М ТРИС-НС1) и, не вынимая из раствора, с препаратов снимали покровные стёкла. Затем препараты высушивали на воздухе.

Детекцию проводили с использованием комплекса биотин-стрептавидин-пероксидаза хрена и красителя ДАБ. Конъюгат разводили в соотношении 1:100 в ТРИС-НС1 буфере. Инкубацию с коньюгатом проводили в течение 1 часа при 37°С. После инкубации стекла промывали в ТРИС-НС1 0,05М буфере и высушивали на воздухе.

На препараты наносили смесь, которую готовили непосредственно перед употреблением: 36% перекись водорода смешивали с раствором ДАБ+ТРИС (в

1 мл ТРИС-НС1 буфера растворяли 0,0005г ДАБ) из расчета Імкл Н2О2 на 1 мл ДАБ+ТРИС, наносили 500 мкл раствора на стекло.

Реакцию останавливали через 15 минут дистиллированной водой. После этого препараты 10 секунд докрашивали гематоксилином, высушивали и заключали в бальзам.

Визуализацию проводили с помощью светового микроскопа. В препаратах, инфицированных ВПГ, наблюдались метки в виде темно-коричневых зерен. Далее подсчитывали количество клеток, содержащих метку, и общее количество клеток на препарате.

5.12. Анализ интерферонового статуса и уровней цитокинов

Уровни цитокинов и факторов роста у женщин, проходящих программу ЭКО, проводили в сыворотке крови и фолликулярной жидкости с использованием тест-систем: Human G-CSF (Invitrogen, USA), Human GM-CSF (Biosourse, USA), Human Bcl-2 (Bender MedSystems USA), CD95 Human ELISA Kit (Abeam, USA) и Fas Ligand Human ELISA Kit (Abeam, USA). А также тест-системы ЗАО «Вектор-Бест» (Новосибирск, Россия): гамма-Интерферон-ИФА-БЕСТ, Интерлейкин-4 - ИФА - БЕСТ, альфа-ФНО - ИФА - БЕСТ, альфа-Интерферон - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-1 бета - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-6 - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-18 - ИФА - БЕСТ, Интерлейкин-2 - ИФА -БЕСТ, Интерлекин-10 - ИФА - БЕСТ.

5.13 Характеристика используемого иммунопрепарата

Для лечения беременных женщин использовали иммуномодулирующий препарат Виферон® (ООО «Ферон», Россия). В состав препарата входит человеческий рекомбинантный интерферон-а2Ь, антиоксиданты (а-токоферола ацетат и аскорбиновая кислота) и основа (масло какао).

5.14. Статистическая обработка данных

Для статистической обработки результатов использовали пакет прикладных компьютерных программ STATISTICA 6,0. При анализе полученных данных были использованы приемы альтернативного анализа и описательной статистики (среднее арифметическое М, медианы, среднее квадратическое отклонение а и средняя ошибка ш). Оценка статистической значимости различий в группах с нормальным распределением проводилась с помощью 1>критерия Стьюдента и двухстороннего точного критерия Фишера.

Применение критерия Шапиро-Уилка использовалось для оценки присутствия нормального распределения признаков. Для сравнения непараметрических данных использовали критерий Манна-Уитни, для парных сравнений - критерий Вилкоксона. Различия показателей считали статистически значимыми при р<0,05.

Глава 6. Влияние бессимптомной герпесвируснон инфекции на результаты экстракорпорального оплодотворения

6.1. Детекция ВПГ в эякуляте

6.1.1. Частота обнаружения ВПГ в цельном эякуляте и во фракции подвижных сперматозоидов

Было изучено влияние ВПГ на показатели спермы. Работа проведена совместно с сотрудниками лаборатории генетики нарушений репродукции ГУ МГНЦ РАМН (зав. лаб. доктор биол. наук, профессор Л.Ф. Курило), а также были обследованы мужчины, обратившиеся для лечения бесплодия методом ЭКО в отделение репродуктологии ГБУЗ МО «МОНИИАГ» (руководитель, д.м.н. Краснопольская К.В.).

Инфекционно активный вирус методом БКМ определяли в эякуляте от 245 мужчин, из которых 164 обследовались по поводу бесплодия в браке, 81 фертильный мужчина, проходивших обследование для включения в группу доноров спермы. Данные по частоте обнаружения вируса у пациентов с бесплодием и у здоровых фертильных мужчин представлены в таблице 1.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Цибизов, Антон Сергеевич, Москва

1. Абдулмеджидова А.Г., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Макарова Н.П., Климова P.P., Кущ A.A. Бессимптомная форма генитального герпеса и бесплодие у мужчин// Урология. 2007. - №3. - С. 56-59.

2. Аншина М. Б. Если вам нужен ребенок// Изд. 8-е, доп. и перераб. М., 2006.

3. Аншина М.Б. ВРТ: прошлое, настоящее, будущее// Проблемы репродукции. 2002. - №3. - С. 6-15.

4. Баринский И.Ф. Герпевирусная инфекция иммунодефицитные заболевания XXI века// Аллергология и иммунология. - 2004. - Т.5. -С. 202-204.

5. Баринский И.Ф., Шубладзе А.К., Каспаров A.A., Гребешок В.Н. Герпес (этиология, диагностика, лечение)// М.: Медицина. 1986. - С. 272.

6. Баркалина Н.В. Фолликулярная жидкость и прогноз исходов программ ВРТ// Проблемы репродукции. М.: Медиа Сфера. - 2006. - Т. 12 № 6. -С. 57-64.

7. Безнощенко Г.Б., Долгих Т.И., Кривчик Г.В. Внутриутробные инфекции (вопросы диагностики и врачебной тактики)// М.: Мед. Книга, Н.Новгород: Издательство НГМА 2006; 41-52.

8. Бочарова E.H., Брагина Е.Е., Гусак Ю.К. и др. Спонтанное прерывание беременности, неудачи при использовании репродуктивных технологий и герпетическое инфицирование сперматозоидов// Андрол. и генит. хир. 2006. - №1. - С. 59-65.

9. Бочарова E.H., Завалишина Л.Э., Брагина Е.Е. и др. Выявление геномной ДНК простого герпеса методом гибридизации in situ в сперматозоидах человека при нарушении фертильности// Докл. РАН. -2007. Т. 412 №3. - С. 417-421.

10. Брагина Е.Е., Абдулмаликов P.A., Курило Л.Ф., Шилеко Л.В. Дмитриев Г.А. Выявление сперматозоидов, инфицированных вирусом простого герпеса// Вестник дерматологии венерологии. 2006. - №5. -С. 18-22.

11. Владимирова Н.Ю., Никитин В.Г., Чижова Г.В. Индивидуальный подход к дородовой подготовке женщин с синдромом потери плода на фоне различных форм генитального герпеса// Акушерство и гинекология. 2008 . - N 5 . - С. 31-35.

12. Власова М.А., Островская О.В., Львов Н.Д., Никитина A.A. Влияние бессимптомного генитального герпеса на течение и исход беременности//Вопр. Вирусологии. 1991. - №36(6).- С.501-503.

13. ВОЗ. Глобальная стратегия профилактики инфекций, передаваемых половым путем, и борьбы с ними 2006-2015 гг.». 2007. стр.5.

14. Володин H.H., Рогаткин С.О. Современные подходы к комплексной терапии перинатальных поражений ЦНС у новорожденных// Фарматека. 2004. - № 1. - С. 72-80.

15. Воробьева O.A., Кирсанов A.A., Потин В.В. Особенности оплодотворения ооцитов и развития эмбрионов в культуре у женщин с недостаточностью яичников// Проблемы репродукции. 1999. - №4. -С. 17-21.

16. Кудашов Н.И. Клинико-диагностические аспекты внутриутробной герпесвирусной инфекции у новорожденных// Вестник акуш. и гинек. 1993.- 1-2: 5-12

17. Кущ A.A., Федорова Н.Е., Климова P.P. и др. Быстрый культуральный метод диагностики герпесвирусных инфекций// Методические рекомендации. 2008. - №02.030-80.

18. Львов Д.К. Медицинская вирусология: Руководство// М.: ООО «Медицинское информационное агентство», 2008 г. С. 260 -266; 310312; 318-321; 330-339; 413-419;426-432

19. Макаров, О.В., Алешкин В.А., Савченко Т.Н. Внутриутробное инфицирование// Инфекции в акушерстве и гинекологии. М.: МЕДпресс-информ. - 2007. - С. 263-419.

20. Марченко JI. А., Лушкова И.П. Генитальный герпес и его влияние на репродуктивное здоровье женщины// Медицина. 2004. - С. 39-43.24

Информация о работе

Цибизов, Антон Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.03

Диссертация

Влияние герпесвирусных инфекций на эмбриональное развитие при экстракорпоральном оплодотворении и на течение и исход естественно наступившей беременности - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы