Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление антигенов вируса иммунодефицита человека 1- и 2-го типов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Выявление антигенов вируса иммунодефицита человека 1- и 2-го типов"

На правах рукописи

Федюк Нина Владимировна

ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИГЕНОВ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА 1- И 2-ГО ТИПОВ

03.00.06. - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Кольцово, 1997 г.

Работа выполнена в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук А.Г.Покровский Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Э.Г.Малыгин

доктор медицинских наук.профессор А.Н.Евстропов

Ведущая организация: Институт вирусологии

им.Д.И.Ивановского РАМН

Защита состоится « 3 » _1997 г. в У часов

на -заседании диссертационного бовета Д 074.20.01 в НИИ молекулярной биологии ГНЦ ВБ «Вектор» по адресу: 633159, п.Кольцово Новосибирской

области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ ВБ «Вектор». Автореферат разослан « .¿г/ » __1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Т.Н.Шубина

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) является возбудителем тяжелого инфекционного заболевания - синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), поразившею практически все ораны мира. По расчетам экспертов Совместной программы ООП по ВИЧ/СПИД (UNAIDS) в настоящее время более 20 млн. люден заражены или больны СПИДом, а 2 млн. жителей Земли уже умерли от тгого заболевания.

На сегодняшний день, когда в арсенале практической медицины отсутствуют эффективные средства специфической профилактики и лечения СПИДа, выявление ВИЧ-инфицированных является одним и$ основных средств ограничения распространения этого заболевания.

Основным способом обнаружения ВИЧ-инфекции, применяемым в практическом здравоохранении в настоящее время является тестирование сывороток крови людей на наличие антител к белкам вируса методом твердофазного иммуноферментного анализа, с последующим подтверждением результатов методом иммуноблота. Хотя такая комбинация тестов считается достаточной для установления диагноза, несомненный интерес представляет выявление вирусного антигена, поскольку в начальной фазе инфекции или в терминальной стадии заболевания в сыворотке крови ВИЧ-инфицированных людей антитела к вирусу могут не выявляться. В то же время именно в этот период в крови может быть обнаружено высокая концентрация инфекционного вируса. Поэтому в настоящее время все большее распространение, наряду с методами обнаружения антител, приобретают методы обнаружения вирусного антигена. Основным считается тест на вирусный антиген р24 (мажорный белок вирусной сердцевины - продукт экспрессии гена gag). Он служит не только для ранней диагностики ВИЧ-инфекции, когда антитела еще не выявляются, но и помогает определить вероятность прогрессирования заболевания у ВИЧ-инфицированных пациентов, поскольку выявление антигена р24 на ранних стадиях ВИЧ-инфекции рассматривается как плохой прогностический симптом, предсказывающий развитие клинических проявлений СПИДа. Тест на выявление антигена р24 используется также для определения инфицированности детей, родившихся от ВИЧ-инфицированных матерей, и при оценки эффективности антиВИЧ-терапии.

Цели п задачи исследования. Целью настоящей работы было выявление антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, находящихся как в составе комплекса антиген-антитело, так и в свободном состоянии в материалах от ВИЧ-инфицированных пациентов и в инфицированных культурах клеток, а также изучение возможной связи между наличием антигена р24 ВИЧ-1 и стадией заболевания у ВИЧ-инфицированных лиц из различных регионов СНГ.

Исходя из этого решались следующие задачи:

- разработка экспериментальных иммуноферментных тест-систем для определения суммарных вирусных антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2;

- разработка экспериментальной тест-системы для определения антигена р24 и исследование с се помощью содержания этого антигена в клиническом материале от ВИЧ-инфицированных пациентов.

- обнаружение антигена р24 в составе комплекса антиген-антитело с помощью различных методов разрушения иммунных комплексов;

- анализ корреляции между наличием антигена р24 и стадиен заболевания;

- создание панели сывороток с разным представительством антшел к индивидуальным белкам ВИЧ методом исющения нагивных сывороток различными антигенами ВИЧ.

Научная новизна работы. Впервые показана возможность специфического выявления антигенов ВПЧ-1 и ВПЧ-2 с помощью 1ест-епстем на основе поликлональных сывороток. Проанализирована коллекция и; 7 моноклональных антител к белку р24 ВПЧ-1 на возможность применения в иммуноферментной тест-системе и показана пригодность M К A NS5H4 для создания тест-системы на выявление антигена р24 ВПЧ-1 с чувствительностью 50 пг/мл. Получен патент РФ. Проведены исследования по обнаружению вирусного антигена р24 ВИЧ-1 в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных пациентов из различных регионов СНГ.

Выбран оптимальный способ выявления антигена р24 ВПЧ-1 в составе иммунных комплексов, пригодный для анализа клинических образцов. С использованием этого метода впервые было установлено, что частом выявления антигена р24 в сыворотках крови пациентов из различных регионов СНГ повышается на поздних стадиях ВИЧ-инфекции.

Разработаны методические подходы к получению панели положительных контрольных сывороток, используемых для оценки чувствительности тест-системы на выявление антител. В результате проведенных исследований подана заявка на Патент РФ.

Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований разработаны экспериментальные иммуноферментные тест-системы для выявления антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Тест-системы апробированы в экспериментальных условиях и показали хорошие результаты в исследованиях по контролю за вирусной репродукцией в клеточных культурах. Проведенные параллельно исследования методом непрямой иммунофлюоресценции подтвердили специфичность результатов, полученных методом ИФА.

Апробация экспериментальной тест-системы для выявления антигена р24 ВИЧ-1 в НИИ и центрах СПИД показала, что тест-система имеет чувствительность, достаточную для выявления вирусного антигена у бессимптомных вирусоносителей и может быть использована для контроля продукции вируса в организме в процессе лечения.

Экспериментальные тест-системы для выявления суммарных антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, а также антигена р24 ВИЧ-1 использовались для оценки ингибирования репродукции вируса различными препаратами в целях поиска эффективных лекарственных средств.

Создана панель «истощенных» сывороток, содержащих антитела преимущественно к оболочечным белкам ВИЧ и характеризующихся низкими значениями оптической плотности при исследовании их в иммуноферментных тест-системах. Использование полученных сывороток позволило эффективно оценивать качество коммерческих тест-систем для определения антител.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на 2-ой Международной конференции «СПИД, рак и ретровирусы человека» (Санкт-Петербург, 1993) и представлены на Международной конференции «Молекулярно-биологические аспекты диагностики и терапии СПИД» (Новосибирск, 1991), на YIII и IX Международных конференциях по СПИДу (Амстердам, 1992; Берлин, 1993), Международному конгрессу по иммунореабилитации (Сочи, 1994).

Результаты проведенных исследований отражены в 12 печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, включая 14 рисунков и 15 таблиц. Список литературы содержит 123 ссылки на публикации отечественных и зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Харастеризация используемых антигенов

Для исследования тест-систем, которые разрабатывались нами с целью детекции антигенов ВИЧ крайне важным было получить охарактеризованные препараты антигенов вируса, которые в последующем могли бы быть использованы, как стандартные антигены. С этой целью нами были охарактеризованы различные вирусные антигены, содержащие разное количество балластных белков, в частности, культуральная жидкость (ЮК), полученная после инфицирования клеточной культуры МТ-4 различными штаммами ВИЧ-1 и ВИЧ-2, 10-кратный концентрат культуральнОй жидкости, лизаты мембран ВИЧ-инфицированных клеток, очищенный вирус. Эти препараты были охарактеризованы с определением суммарного белка и представительства вирусных, белков, которое оценивали с использованием метода иммунного блаттинга (рис.1). Кроме-того, некоторые образцы антигена ВИЧ исследовали на содержание антигена р24 ВИЧ-1 с использованием коммерческой тест-системы для определения антигена р24 производства фирмы «Du Pont».

ЧР 160/120-Р 66 -

Р 51/ 55-др 11 -Р 31 -

Р 21 -

р 17 -

Р 13 -

Н>140/10$

- р68 - р56

-ерЗб - р26

а б в г

Д

♦

Рис.1. Иммуноблот различных препаратов антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2:

а) клеточный лизат ВИЧ-1 (штамм ГКВ 4046);

б) очищенный вирус ВИЧ-1 (штамм ГКВ 4005);

в) клеточный лизат ВИЧ-1 (штамм ГКВ 4005); ^

г) 10-кратный концентрат КЖ ВИЧ-1 (штамм ГКВ 4005);'

д) клеточный лизат ВИЧ-2 (штамм ВИЧ-2Я1СЮ).

2. Конструирование экспериментальных тест-систем для определения суммарных антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2.

Одной из основных проблем, решение которых было необходимо при создании таких тест-систем, был подбор и стандартизация сывороток, используемых для выделения иммуноглобулинов и получения на'их основе конъюгатов с пероксидазо». Нами были проверены сыворотки от ВИЧ-инфицированных больных на разных стадиях ВИЧ-инфекции (7 образцов), а также гипериммунная сыворотка, полученная от кролика, иммунизированного очищенным антигеном ВИЧ-1.

Сыворотки, используемые для приготовления иммуноглобулинов и конъюгата, были охарактеризованы в иммуноблоте на представительность антител к вирусным белкам. Для выделения иммуноглобулинов были

использованы сыворотка человека, инфицированного ВИЧ-1, имеющая титр в ИФА 1:3200 и взаимодействующая в иммуноблоте с белками р17, р24, рЗ 1, р40, ир41, р51, р55, рбб, §р120, др160 . В тест-системе на антиген ВИЧ-2 была использована сыворотка от серопозитивного на ВИЧ-2 человека, взаимодействующая в иммуноблоте белками р26, щ>36, р56, р68, др105/140. Были также выделены иммуноглобулины^ из сыворотки кролика, иммунизированного очищенным антигеном ВИЧ-1, но их использование дало менее удовлетворительные результаты. За. основу разработанной нами тест-системы была положена стандартная схема конкурентного иммуноферментного анализа. На рис. 2 и 3 приведены полученые данные, демонстрирующие специфичность тест-систем.Тест-система на антиген ВИЧ-1 не позволяла выявлять антиген ВИЧ-2 и наоборот.

Таким образом, впервые показана возможность специфического выявления антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с помощью тест-систем на основе поликлональных сывороток

Оптическая плотность (Х=492 нм)

1оцг обратной величины разведения антигена

Рис. 2. Определение антигена ВИЧ-1 (в качестве иммуносорбента служат ^С из ВИЧ-1 положительной сыворотки)

1-10 кратный концентрат культуральной жидкости ВИЧ-1 (штамм ГВК 4005); 2 - культуральная жидкость ВИЧ-2 (штамм ВИЧ-2/ГШО);

1о^2 обратной величины разведения антигена

Рис. 3. Определение антигена ВИЧ-2 (в качестве нммуносорбента служат

из ВИЧ-2 положительной сыворотки)

1 - культуральная жидкость ВИЧ-2 (штамм ВИЧ-2/1ЮО);

2 - клеточный лизат ВИЧ-1 (штамм ГВК 4005).

3. Конструирование тест-системы для определения антигена р24 ВИЧ-1.

Весьма важным этапом при создании специфичной и чувствительной тест-системы для детекции вирусного антигена служит выбор конкретного маркерного вирусного белка, использование которого позволит проводить эффективное тестирование клинических образцов. Анализ литературных данных показал, что использование моноклональных антител (МКА) к р24 ВИЧ в иммуноферментных тест-системах обеспечивает их высокую специфичность и, в силу этого, позволяет более четко проследить динамику инфекционного процесса в сравнении с тестами на основе пол'иклональных антител человека, которые при любом подборе сывороток будут давать неспецифические реакции вследствие наличия в сыворотке антител к различным клеточным и/или вирусным антигенам. Нами была проанализирована коллекция из 7 видов МКА к р24 ВИЧ-1, секретируемых 4 мышиными и 3 крысиными гибридомами. Методом иммуноблотинга. было установлено, что все моноклональные антитела связывались с вирусным белком р24, а также с его предшественниками, имеющими молекулярную

массу 40 и 55 килодальтон. Основным, требованием, которому должны удовлетворять ,МКА для применения их в диагностической тест-системе для определения антигена - • это сохранять способность эффективно взаимодействовать с антигеном при сорбции МКА на твердую матрицу (планшет). Для этого было проведено исследование всех полученных МКА на взможность их использования в диагностических тест-системах. Из всех исследованных МКА была выявлена только одна мышиная гибридома NS5E4, продуцирующая МКА, пригодные для использования в качестве иммуносорбента в ИФА в качестве антигенной «ловушки», включающей сорбцию МКА на планшет, захват антигена р24 из вируссодержащей пробы с последующим проявлением комплекса антиген-антитело конъюгатом пероксидазы с иммуноглобулинами, выделенными из сыворотки ВИЧ-инфицированного человека.

Результаты экспериментов по определению чувствительности тест-систем для определения суммарных антигенов ВИЧ-1 и антигена р24 приведены на рис.4 и 5. Чувствительность тест-систем «IgG» для выявления суммарных антигенов ЕИЧ составила 5 нг/мл. Применение моноклональных антител позволило повысить чувствительность тест-системы «р24» для выявления антигена р24 ВИЧ-1 до 0,5 нг/мл (первый вариант тест-системы). В качестве референс антигена использовали антиген ВИЧ-1 из набора фирмы «Dupont», с общей концентрацией вирусных белков 0,8 мкг/мл и концентрацией р24 ВИЧ-1 0,2 мкг/мл. В параллельных экспериментах использовали очищенный препарат ВИЧ-1, полученный в нашей лаборатории. При этом, в зависимости от использования разных образцов для калибровки, различия в чувствительности тест-системы были.незначительны.

Сравнительный анализ препаратов, содержащих антигены ВИЧ-1 и ВИЧ-2, представлен в таблице 1. Необходимо отметить, что количественное определение вирусных белков с использованием суммарных IgG может быть только относительным, поскольку величина сигнала зависит как от состава IgG (наличие и соотношение IgG к различным' вирусным белкам), взятых для приготовления тест-системы, так и от соотношения различных белков ВИЧ-1 в исследуемой пробе. В этом отношении выгодно отличается тест-система на антиген р24, которую можно использовать для количественного определения антигенэр24. Комплексное применение диагностикумов для определения суммарного антигена и антигена р24 позволяет также получить данные о представительности вирусных белков в исследуемых препаратах.

Таким- образом, разработанные варианты тест-систем, в том чисЬе впервые для определения антигена ВИЧ-2, могут быть использованы для текущего контроля за состоянием клеточных культур, инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-2, оценки готовых серий концентрированного и очищенного вируса. Впервые показана возможность специфического выявления антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с помощью 1~ест-систем на основе поликлональных сывороток.

концентрация вирусных белков, нг/мл

Рис. 4. Определение чувствительности тест-системы для выявления суммарного антигена ВИЧ-1.

Оптическая плотность (Х=492 нм)

концентрация антигена р24, пг/мл

Рис. 5. Сравнение чувствительности двух вариантов тест-систем для опреде ления антигена р24 ВИЧ-1.

1 - первый вариант тест-системы, конъюгат анти-ВИЧ 1^0 пероксидаза хренг

2 - второй вариант, биотин - стрептавидинпроявляющая система.

Таблица 1

Сравнительный анализ препаратов, содержащих антигены ВИЧ-1 и ВИЧ-2 с использованием тест-систем «^в» и «р24»

Исследованные образцы Общая концентрация белка, мг/мл Тест-система

«IgG» «р24»

Титр Концентрация вирусных белков, мкг/мл Концентрация антигена р24 ВИЧ-1, мкг/мл

КЖ клеток МТ-4,инфи- 7,17±0,50 1:1024 18,33±1,43 2,7010,25

цированных ВИЧ-1

(штамм ГКВ 4005)

Лизаты клеток МТ-4,

инфицированных ВИЧ-1

изолятом №1 * 2,47±0,38 1:16000 51,00±2,48 4,90Ю,26

изолятом №10* 1,41+0,21 1:16000 63,3013,50 5,ЗОЮ,18

штаммом ГКВ 4005 1,75±0,14 1:32000 110,00±4,97 19,6712,87

штаммом ГКВ 4046 4,24±0,26 1:32000 210,00±5,71 42,1716,60

Очищенные препараты

ВИЧ-1

штамм ГКВ 4005 0,56±0,40 1:64000 520,00124,86 100,6314,58

штамм ГКВ 4046 1,05±0,19 1:64000 970,80±30,50 169,70+14,60

Лизат клеток МТ-4,

инфицированных ВИЧ-2 1,93±0,32 0 0 0

(штамм ГКВ 4047)

* - Материалы любезно предоставлены Черных А.И.

Особый интерес представляет тест-система для выявления антигена р24, разработанная впервые в нашей стране. Для расширения области ее применения - использования для анализа клинических образцов, была исследована возможность увеличения чувствительности разработанной нами тест-системы за счет использования биотин-стрептавидинпроявляющей системы. При этом первая стадия реакции осталась без изменения (специфическое связывание антигена р24 из тестируемой пробы с сорбированными на полистироле МКА), на втором этапе вместо конъюгата анти-ВИЧ-^О с пероксидазой использовали конъюгат анти-ВИЧ-^О с биотином. Наличие образованного комплекса определяли с применением конъюгата стрептавидин-пероксидаза. Результаты экспериментов по определению чувствительности второго варианта тест-системы представлены на рис.5. Использование стрептавидин-пероксидазной системы усиления для

выявления биотинилированных позволило увеличить чувствительность на порядок - она составила 50 пг/мл. Важной характеристикой тест-систем служит их стабильность при хранении. Тест-системы стабильны после хранения при 4°С на протяжении 3-х и 8-ми месяцев. Достоверность различий оценивали по ^критерию Стьюдента для доверительной вероятности 95% (для 1-го варианта тест-системы : 13 мес=1,0; 18 мсс =0,29; для 2-го варианта 13 мес=1,0).

Проведено изучение чувствительности и специфичности предложенного варианта тест-системы на панели положительных сывороток, выделенных от ВИЧ-инфицированных пациентов из различных регионов СНГ и панели отрицательных сывороток. Как видно из таблицы 2 среди 100 ВИЧ-позитивных сывороток наличие антигена р24 выявлено в 5% случаев, что достаточно хорошо коррелирует с данными литературы. Содержание антигена р24 ВИЧ-1 в -позитивных образцах сывороток составило 50-60 пг/мл. Ни одна из 200 отрицательных сывороток не дала положительного результата.

Таким образом, достигнутая чувствительность открыла возможность использования тест-системы для определения антигена р24 ВИЧ-1 в клинических образцах.

Таблица 2

Исследование сывороток крови ВИЧ-инфицированных лиц при прямой детекции антигена р24 ВИЧ-1 и после кислотной диссоциации

ВИЧ- Всего

положительные обследованных

сыворотки из сывороток Число положительных сывороток

различных

регионов СНГ

при прямой после кислотной

детекции диссоциации

Ростов-на-Дону 42 3 24

Элиста 36 0 6

Минск 17 1 0

Новосибирск 5 1 1

Общее 100 5 31

количество

ВИЧ- 200 0 0

отрицательные

сыворотки*

* - сыворотки получены от доноров и' больных другими вирусными заболеваниями.

4. Выявление антигена р24 в составе иммунных комплексов.

В последние годы появился ряд сообщений о значительном расширении области применения тест-систем для определения антигена р24 за счет предварительного разрушения в тестируемой сыворотке комплекса антиген-антитело. При этом количество, позитивных на р24 проб значительно увеличивается и достигает 50-70% от общего количества тестируемых ВИЧ-позитивных сывороток.

Существует несколько подходов для выявления антигена в составе иммунного комплекса. Наиболее часто используемым способом выявления связанного, антигена является кислотная диссоциация, применяемая в двух модификациях, обозначенных нами как метод 1 и метод 2.

Метод 1: Исследуемую пробу смешивали с 0,05 М глицин-НС1 буфером (рН 2.0 ) в соотношении 1:2 и нагревали в течение 10 минут при 70°С. После нейтрализации 1,7 М Трисом (9 мкл на 100 мкл пробы) образцы тестировали на.наличие антигена р24 ВИЧ-1. Учет результатов проводился исходя из 3-х кратного разведения пробы.

.Метод 2. Исследуемую пробу смешивали с 1 М НС1 (рН 3.0) в соотношении 15 мкл НС1 на 200 мкл пробы и инкубировали в течение 90 Минут при 20°С.-Затем нейтрализовали до рН 7.4 добавлением 20 мкл 1 М №ОН на холоду и тестировали на наличие антигена р24 ВИЧ-1. Доведение рН осуществляли по индикаторной бумаге. Учет результатов проводили исходя из разведения пробы в 1.2 раза.

Мы попытались сравнить их и выбрать наиболее оптимальный. В качестве модели для исследования был выбран иммунный комплекс, образованный стандартным антигеном с концентрацией р24 ВИЧ-1 1 нг/мл и иммунной сывороткой в различных разведениях (инкубация Ьчас при 37°С) (рис.6). Полученные результаты по сравнению двух способов разрушения иммунных комплексов показывают, что разрушение иммунных комплексов методом 1 меньше зависит от концентрации антител и дает более полное выявление антигена. Результаты модельного эксперимента были подтверждены при исследовании сывороток от ВИЧ-инфицированных пациентов (таблица 3). Проверка связанных выборок с помощью I - критерия показала значимость различий при двух способах воздействия (р<0,01).

Нами также был проверен способ осаждения иммунного комплекса полиэтиленгликолем и ЭДТА с последующим центрифугированием и разрушением 6 М гуанидином.

Метод 3. Исследуемую пробу (400 мл) инкубировали ночь при 4°С с равным объемом 0.2 М ЭДТА (рН 7.5) и с 200 мкл РЕв 6000 (12%). После центрифугирования осадок растворяли в 6 М гуанидине. Этот метод более громоздок и трудоемок и не во всех исследуемых сыворотках нам удалось осадить иммунный комплекс.

1оцг обратной величины разведения сывороток

Рис. 6. Разрушение иммунных комплексов(ИК) различными методами. 1 - ИК до разрушения;2 - ИК после разрушения по методу 1; 3 - ИК после разрушения по методу 2.

Таблица 3

Сравнение двух методов кислотной диссоциации при тестировании ВИЧ-положительных сывороток

Содержание антигена р24 ВИЧ-1, пг/мл

Образец Без обработки После обработки

метод 1 метод 2

1 <50 285±15 210+12

2 <50 270±18 54+9

3 <50 525±26 8417

4 <50 487±23 150111

5 <50 315114 5417

6 <50 390±19 168116

7 <50 465116 132114

8 <50 22518 300113

9 <50 195112 138114

10 50 11219 8819

Нами была исследована панель сывороток от пациентов из различных регионов СНГ. Полученные результаты сопоставлены с данными клинического и иммунологического обследования. Пациенты были разделены на 4 группы, указанные в таблице 4. Как следует из представленных данных, обнаружена выраженная корреляция между выявлением антигена р24 в плазме крови и клиническим диагнозом пациентов. Коэффициент корреляции равен 0,7.

Таблица 4

Определение антигена р24 в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных пациентов

№ п/п Клинический статус Количество исследованных пациентов Количество р24 + пациентов (после кислотной диссоциации) % выявления антигена р24

1. Бессимптомные

вирусоносители 6 0 12,5±11

2. Лица с

генерализованной 32 5 16±6

лимфаденопатией

3. Больные с

проявлением СПИД-

ассоциированных 32 16 50±8

оппортунистических

инфекций

4. Больные СПИД 8 6 75±15

В связи с тем, что известны существенные межштаммовые различия, дополнительно была исследована возможность тестирования антигена р24 различных штаммов ВИЧ-1 в составе иммунного комплекса кислотной диссоциацией (двумя методами). Результаты представлены в таблице 5. Обработка антигенов, полученных при культивировании штаммов ГКВ4005, ВИЧ-1/BRU и ВИЧ-1/RF по методу 1 приводит к незначительной инактивации тестируемой нами антигенной детерминанты р24 - количество антигена р24 после обработки составляло до 82-99% от исходного. Использование метода 2 оказало более жесткое воздействие на антигенные детерминанты исследуемых штаммов. Количество выявляемого после обработки антигена составило 6285% от исходного. Аналогичная картина наблюдалась и при выявлении антигена в составе иммунного комплекса. Количество антигена после разрушения иммунного комплекса составляло для первого метода - 87-58% от исходного, для второго метода - 47-24% от исходного.

Таблица 5

Влияние кислотной диссоциации на выявление в составе иммунного

Наименование %

тестируемой Содержани е антигена р24 пг/мл выявления

пробы и До После разрушения антигена р24

разведение разрушения

метод 1 метод 2 метод 1 метод 2

Лизаты* различных штаммов ВИЧ-1'

ГКВ4005

1:1000 999 ± 16 987 ± 11 848 ± 7 99 85

1:2000 490 ± 17 465 ± 7 377 ± 18 95 77

1:4000 233 ±15 195 ± 13 178 ±7 84 76

1:8000 118 ± 7 110 ± 4 77 ±3 93 65

ВИЧ-1/BRU

1:250 751 ±51 650 ± 62 520 ±27 87 69

1:500 365 ±7 300 ± 13 228 + 22 82 62

ВИЧ-1/RF

1:256 575 ±7 565 ± 17 396+ 16 98 65

АнтиВИЧ-1

сыворотка (1:8000)+'

лизаты различных штаммов ВИЧ-1:

ГКВ4005 1:1000 <50 575 + 27 357 + 16 58 35

1:2000 <50 312 ± 19 118 ± 2 64 24

1:4000 <50 120 ± 13 <50 52 0

1:8000 <50 <50 <50 0 0

ВИЧ-1/BRU

1:250 <50 554 ± 314+12 74 42

ВИЧ-1/RF

1:256 <50 505 ± 23 268 ±9 87 47

* - лизаты клеток МТ-4, инфицированные различными штаммами ВИЧ-1 :

Следует особо отметить, что в пробах с низким содержанием антигена р24 (концентрации 50-70 пг/мл) после кислотной обработки возможно получение отрицательных результатов (таблица 2). Этим можно объяснить тот факт, что при прямой детекции в сыворотке пациента из Минска был обнаружен антиген, а при кислотной диссоциации - нет. Ложно отрицательные результаты возможны в сыворотках с низким содержанием антигена р24

ВИЧ-1, когда особенно чувствительны потери, возникающие после кислотной обработки сывороток.

Полученные нами результаты позволяют рекомендовать для массового применения 1-ый метод разрушения иммунных комплексов.

Таким образом, проведено сравнение трех методов разрушения иммунных комплексов и выбран оптимальный способ выявления антигена в составе иммунного комплекса и впервые проведены исследования по обнаружению вирусного антигена р24 ВИЧ-1 в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных пациентов из различных регионов СНГ. Обнаружена выраженная корреляция между частотой выявления антигена р24 и клиническим диагнозом пациентов. Высокий процент сывороток, содержащих антиген р24 (31% после разрушения иммунного комплекса), дает основание для внедрения этого метода для обследования всех ВИЧ-инфицированных пациентов. Результаты, такого обследования могут быть полезными при прогнозировании развития заболевания. Поскольку в ряде работ показано, что развитие клинических проявлений СПИДа достаточно сильно связано с частотой выявления антигена р24 в составе иммунных комплексов в течение раннего постсероконверсионного периода, то есть если в ранней стадии ВИЧ-инфекции антиген р24.обнаруживается, то очень велика вероятность быстрого прогрессированйя заболевания. . Важность использования предложенного метода подтверждается внедрением такого теста в США в 1996 году в качестве обязательного для анализа донорской крови.

5. Получение эталонных ВИЧ-положительных сывороток методом их истощения различными антигенами

Проведенные нами исследования по тестированию антигена р24 в составе иммунного комплекса и его «маскирование» антисывороткой позволили предложить новый способ получения анти-ВИЧ сывороток, модулирующий реальные процессы в организме ВИЧ-инфицированного человека, где представительство антител к различным белкам вируса регулируется ' двумя основными факторами: уровнем накопления индивидуальных вирусных белков и гуморальным ответом, то есть уровнем образования антител к индивидуальным белкам (эпитопам этих белков вируса). Титр антител к ■ белкам . ВЙЧ, выявляемый. йммуноферментными тест-системами, определяется соотношением между уровнем "накопления вирусных антигенов и антител' к этим антигенам и представляет некую суммарную хараетеристику. ' , '

Для оценки диагностических тест-систем для определения антител к ВИЧ главным инструментом служат панели стандартных сывороток, полученных ,от ВИЧ-инфицированных пациентов. Значительной проблемой при создании панели Эталонных сывороток, особенно положительных, служит выбор конкретных репрезантативных образцов. Следует подчеркнуть, что

сыворотки от ВИЧ-положительных пациентов существенно отличаются по своим характеристикам в зависимости от стадии развития заболевания.

Крайне желательным является включение в панель сывороток с различными параметрами, включая низкотитражные, которые характеризуют в первую очередь начальные стадии инфекции. Эти сыворотки имеют невысокий уровень антител к белкам гена gag и содержат в основном антитела к оболочечным белкам.

Предложенный рядом авторов метод разведения исходных ВИЧ-положительных сывороток позволяет получить низкотитражные образцы, характеризуемые низкой оптической плотностью в иммуноферментных тест-системах, но, как правило, спектр антител таких сывороток характеризуется преобладанием антител к белкам гена gag, с небольшим присутсвием антител к белкам гена evn - наиболее информативному при постановке диагноза ВИЧ-Инфекция, так как по требованиям ВОЗ сыворотка считается положительной, если в ней обнаруживаются антитела к каким-либо двум гликопротеинам оболочки (gpl60, gpl20, gp41).

Сущность предложенного нами способа заключается в истощении исходных охарактеризованных сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов, различными антигенами ВИЧ, отличающимися по представительству вирусных белков. ВИЧ-положительную сыворотку в различных разведениях смешивали с различными охарактеризованными в иммуноблоте антигенами ВИЧ-1 в соотношении 1:1 и инкубировали в течение 1 часа при 37°С. При создании панели сывороток, содержащих антитела к индивидуальным белкам ВИЧ-1 в низких концентрациях, и преимущественно к оболочечным белкам среди препаратов антигенов,, используемых для истощения были выбраны те из них, которые содержали наименьшее количество оболочечных белков - это 10-кратный концентрат КЖ ВИЧ-1 (штамм ГКВ4005) и препарат вирусных белков, солюбилизированных из мембран инфицированных клеток - лизат ВИЧ-1 (штамм ГКВ4005) (рис.1), обозначенные как АГ6 и JI.11 в таблице 6. Для истощения были выбраны плазма и сыворотка А-7, имеющие полный набор антител к вирусным белкам, а также сыворотка «Си», имеющая антитела к оболочечным белкам gp 160/120 и к р51/55 и р24, полученные от ВИЧ-инфицированных пациентов. Разведения исходных ^сывороток варьировали от 1:8 до 1:64. Разведение проводили отрицательной сывороткой. После инкубации с антигенами сыворотки тестировали в иммуноблоте и различных ИФА тест-системах. Как видно из таблицы 6 предложенный способ позволил получить набор сывороток, содержащих антитела преимущественно к оболочечным белкам и существенно отличающихся по данным иммуноферментного анализа.

Полученная панель сывороток может быть использована для сравнительной характеристики тест-систем, применяемых для диагностики ВИЧ-инфекции.

Таблица 6

Характеристика ВИЧ-положительных сывороток, полученных методом

истощения

т/с «Антиген» т/с «Рекомби-

№ Наименование Иммуноблот Бест-антиВИЧ-

п/п пробы ОП^ 0.359 1,2»

Оп,^ 0,281

титр ОП* титр ОП*

1 Плазма (П) Нр160/120, рбб, 1/55, Вр41, р40,рЗ 1, р24, р17, р13 1:12800 2,28 1:3200 1,913

2. П1:8) +АГб . ер160/120, р24 1:1600 1,654 1:400 1,041

3. П(1:1б)+ АГб Яр160/120, р24 1:800 1,073 1:200 0,679

4. П(1:8) + Л.11 Зр160/120, р24 1:800 1,455 1:400 0,888

5. П(1:16)+ Л. 11 §р 160/120, р24 1:400 0,890 1:200 0,688

6. Сыворотка А-7 Яр1б0/120, рбб, р51/55, Яр41,р40, р31, р24, р17, р13 1:51200 2,318 1:12800 2,198

7. А-7(1:32)+АГ6 др 160/120, р51/55, р24 1:400 0,648 1:200 0,586

8. А-7(1:64)+АГ6 §р160/120, р51/55, р24 1:200 0,592 1:100 0,324

9. А-7(1:32)+Л.11 ЯР 160/120, р51/55, р24 1:200 0,806 1:100 0,342

10. А-7(1:64)+Л.11 бр!60/120, р51/55, р24 1:100 0,422 <1:100 0,272

11. Сыворотка Си £р 160/120, р51/55, р24 1:12800 2,250 1:6400 1,963

12. Си(1:16)+АГ6 £Р 160/120, р51/55, р24 1:800 1,488 1:100 0,705

13. Си(1:32)+АГ 6 £р 160/120, р51/55, р24 1:400 1,138 1:200 0,712

14. Си(1:16)+Л. 11 Вр160/120, р51/55, р24 1:800 1,536 1:400 1,088

15 Си(1:32)+Л.11 2р160/120, р51/55, р24 1:400 0,953 1:100 0,376

16. Положительный контроль 2,314 2,286

17. Отрицательный контроль 0,159 0,081

* - с целью облегчения восприятия материала приведены только средние значения ОП

(Х=492 нм)

ВЫВОДЫ

1. Разработаны экспериментальные иммуноферментные тест-системы для специфического выявления суммарных антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2, позволяющие выявлять антигены этих вирусов в инфицированных культурах клеток с чувствительностью 5 нг/мл вирусного антигена. С использованием этих тест-систем показано, что содержание вирусных антигенов в культурах ВИЧ-1 и ВИЧ-2 инфицированных клеток и препаратах вируса с разной степенью очистки составляло 20- 1000 мкг/мл.

2. Показана пригодность моноклональных антител NS5K4 к , белку сердцевины ВИЧ-1, р24 для использования в тест-системе на выявление этого антигена. Разработана на основе этих антител экспериментальная тест-система для обнаружения антигена р24 ВИЧ-1 с чувствительность' 50 пг/мл, позволяющая проводить анализ сывороток от ВИЧ-инфицированных пациентов. Установлено наличие антигена р24 в 5% случаев при анализе панели из 100 ВИЧ-положительных сывороток от пациентов из различных регионов СНГ.

3. С использованием иммунных комплексов, полученных в модельных экспериментах, проведено сравнение различных методов выявления антигена р24 ВИЧ-1 в составе этих комплексов. Использование кислотной диссоциации иммунных комплексов при 70UC в течение 10 минут позволило добиться наиболее высокого процента выявления антигена р24 в составе иммунных комплексов. Он составил 52-87% от исходного.

4. Показано, что применение метода кислотной диссоциации иммунных комплексов на панели из 100 ВИЧ-позитипных сывороток позволило обнаружить антиген р24 в 31% случаев, что значительно увеличивает прогностическую ценность этого метода. Установлено, что частота выявления антигена р24 в сыворотке крови повышается на поздних стадиях ВИЧ-инфекции.

5. Предложен новый метод конструирования панелей сывороток, содержащих разное представительство антител к различным вирусным белкам, заключающийся в истощении исходных охарактеризованных сывороток, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов, различными антигенами ВИЧ. Создана панель стандартизованных сывороток, характеризующихся невысоким уровнем антител к белкам гена gag и содержащих в основном антитела к оболочечным белкам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1.Федюк Н.В., Коновалов Е.Е., Локтев В.Б., Урываев Л.В., Куляндин С.А., Покровский А.Г. Выявление и количественное определение антигенов вируса иммунодефицита человека типов 1 и 2. // Вопросы вирусологии. -1992. -№ 3. -С.135-138.

2. Коновалов Е.Е., Локтев В.Б., Покровский А.Г., Федюк Н.В., Черных А.И., Нечаев Ю.С., Куляндин С.А., Киприянов С.М., Офицеров В.И. Изучение антигенной структуры белка р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа с помощью моноклональных антител // Вестник Российской Академии мед. Наук. -1992. -№ 9-10. -С.55-59.

3. Плясунова O.A., Егоричева И.Н., Федюк Н.В., Покровский А.Г., Балтина Л.А., Муринов Ю.И., Толстиков Г.А. Изучение анти-ВИЧ-активности ß-глицирризиновой кислоты // Вопросы вирусологии.-1992.-№ 5-6. -С.235-238.

4 1кжровский Л.Г., Фсдюк П.В., Ржанинова А.А., Гараев М.М. Выявление р24 ашигсна вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) в составе иммунных комплексов // Вопросы вирусологии. -1995. -№ 1 .-С.8-12.

5 Якубов Л Л.. Плясунова OJ1.. Федкж Н.В., Покровский А.Г., Власов В.В. Имитирование репродукции вируса иммунодефицита человека анионными краен Iелями И ДАН -1996. -Т.347. 5. -С.696-698.

6 Локтев В.]}.. Коновалов Е.Е., Федюк Н.В., Покровский А.Г., Куляндин С.А. Штамм п|бридных культивируемых клеток животного Mus musculus L., пснолмуемый для получения моноклональных антител к С-концевой части белка р24 вируса иммунодефицита человека типа 1, // Патент РФ № 2070926, приоритет от 19.04.93 г. -БИ.-1996. -№ Зб.'-С. 176.

Федкж П.В., Покровский А.Г., Ломанова Г.А., Воробьева М.С. Способ получения японных положительных сывороток для контроля качества icci-ciicicm. предназначенных для определения антител. II Заявка на патент РФ Ni 96106118 от 28.03.96.

X Fed\uk N V.. Konovalov Е.Е., Loktev V.B., Urivaev L.V. , Pokrovsky A.G. Detection and quantitation of human immunodeficiency viruses I and II antigens // Abstracts of the international Conference on Molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Akademgorodok. -1991. -(1-5 July). -P.32.

9 Fedyuk N.V., Konovalov E.E., Pokrovsky A.G., Kovalenko V.A., Plaksin D.Y. Detection and quantitation of p24 antigen of HIV // Abstracts of the International Simposium of . structure and function of regulatory polypeptiides, Moskow. -1992. -(26-30 June). -P. 18.

10. Fedyuk N.V., Konovalov E.E., Pokrovsky A.G.,Loktev V.B., Kovalenko B.A. Detection of the core HIV-1 antigen p24 by enzyme immunoassay [EIA] and immunofluorescence assay // Abstracts of the VIII International Conference on A1DS/III STD World Congress, Amsterdam. -1992. -(19-24 Ju!e). -V.3. -P.20.

11. Fedyuk N.V., Pokrovsky A.G., Garaev M.M. Detection of HIV-1 p24 antigen in sera of HIV-infected patients from Russian federation. // Abstracts of the IX th International Conference on AIDS, IV th STD World Congress, Berlin. -1993. -(711 June).-V.l .-P.260.

12. Fedyuk N.V., Pokrovsky A.G., Garaev M.M., Rjaninova A.A. HIV antigen and immune complexes. // Abstracts of the 2-nd International Conference «AIDS, cancer and human retroviruses», St.-Peterburg,.-1993. -(November 29-December 3). -P. 18.

13. Fedyuk N.V., Pokrovsky A G., Rjaninova A.A., Garaev M.M. Antigen p24 as serological marker of HIV infection. // . International Journal of Immunorehabilitation. - Abstracts of the 1 International Congress on Immunorehabilitation, Sochi.-1994. -№ 1. -Suppl.. -P.l 11-112.