Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование геномов вирусов герпетической группы и ретровируса HTLVI при лимфомах и ангиитах кожи методом полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хасан Хамад Али, Москва

/ , / "*» } / ,•> „ . V, ' ' ■ \

МОСКОВСКАЯ МЕДИЦИНСКАЯ АКАДЕМИЯ имени И.М. СЕЧЕНОВА

На правах рукописи УДК 578.825.11:616-006.441-092

ХАСАН ХАМАД АЛИ

ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНОМОВ ВИРУСОВ ГЕРПЕТИЧЕСКОЙ ГРУППЫ И РЕТРОВИРУСА НТЬУ1 ПРИ ЛИМФОМАХ И АНГИИТАХ КОЖИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

03.00.04 - биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

доктор химических наук, чл. - корр. РАН, профессор Е.С.Северин

кандидат биологических наук Н.Н.Белушкина

Москва 1998

Список принятых сокращений

ЕВУ вирус Эпштейна-Барр

НБУ вирус простого герпеса

Н8У1 вирус простого герпеса типа 1

НБУ2 вирус простого герпеса типа 2

СМУ цитомегаловирус

НТЬУ1 вирус Т-клеточной лейкемии человека типа 1

ЛК лимфома кожи

ТКЛК Т-клточная лимфома кожи

вклк В-клточная лимфома кожи

ЛБ лимфома Берркитта

ПЦР полимеразная цепная реакция

гПЦР "гнездовая" полимеразная цепная реакция

ЬСЬ лимфобластные клеточные линий

сть цитотоксические Т-лимфоциты

ж природные киллеры

СШТР ; - дезоксинуклеотидтрифосфаты

ёатр дезоксиаденозинтрифосфат

с!ТТР дезокситимидинтрифоефат

астр дезоксицитидинтрифосфат

<ЮТР дезоксигуанинтрифосфат

БОБ додецилсульфат натрия

РВ8(ФСБ)- 0,145 М КаС1, 0,76 шМ КаН2Р04 Н20,

тМ Ш2 Р04 7Н20; рН 7,4

Н.п. нуклеотидные пары

Др доксорубицин

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.......................................................................6

1. Вирусы герпетической группы и ретровирус НТЬУ1........................8

1.1. Вирусы герпетической группы: НБ VI, Н8У2, СМУ и

ЕВУ.........................................................................8

1.1.1.Эпштейна-Барр вирус...................................................9

1.1.2. Вирусы простого герпеса (ШУ1, НБУ2).........................12

1.1.3. Цитомегаловирус (СМУ).............................................14

1.2. Вирус Т-клеточной лейкемии человека типа I - НТЬУ1............16

2. Лимфомакожи......................................................................19

2.1. Т-клеточные лимфомы кожи.............................................20

2.1.1. Грибовидный микоз....................................................21

2.2.Патогенез Т- клеточных лимфом кожи..................................24

3.Ангииты кожи........................................................................28

3.1.Общее представление, классификация ангиитов кожи...............28

3.2 .Патогенез ангиитов кожи................................................... 30

4. Полимеразная цепная реакция...................................................34

4.1. Параметры влияющие на эффективность ПЦР....................37

4.1.1. Денатурация ДНК - матрицы........................................37

4.1.2. Стадия гибридизации праймеров....................................37

4.1.3. Стадия полимеризации................................................38

4.1.4. Состав компонентов реакционной смеси..........................39

4.1.5. Температурный режим ПЦР..........................................41

4.2. Практическое применение ПЦР............................................42

5. Апоптоз в патогенезе заболеваний............................................. .44

5.1. Апоптоз и вирусная инфекция..............................................45

5.1.1. Вирусы, инициирующие апоптоз клеток...........................45

5.1.2. Вирусы, ингибирующие апоптоз клеток............................47

5.2. Роль белка Вс1-2 в развитии опухолевых заболеваний................48

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ..........53

1 .Выделение мононуклеарных клеток.........................................53

2. Подсчет клеток..................................................................54

3. Выделение ДНК фенолхлороформным методом.........................55

4. Полимеразная цепная реакция...............................................56

4.1. Приготовление реакционной смеси....................................56

4.2. Проведение полимеразной цепной реакции.........................57

4.3. Электрофорез ДНК в агарозном геле.................................59

5 .Разделение субпопуляций лимфоцитов.............................................60

6. Проточная цитофлуориметрия.................................................61

6.1. Культивирование клеток.................................................61

6.2.Фиксация клеток............................................................61

6.3. Окращивание ДНК клеток йодистым пропидием

и цитофлуориметрия........................................................61

7. Статистика........................................................................62

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ..................65

1. Исследование содержания геномов вирусов герпетической группы и ретровируса НТЬУ1 у пациентов с ТКЖ

и ангиитами кожи...............................................................65

1.1. Анализ геномов вирусов ЕВУ, СМУ, ШУ1 и

ШУ2, у пациентов с ТКЖ................................................65

1.2. Анализ геномов EBV, CMV, HSV1 и HSV2 у

пациентов с ангиитами кожи.............................................72

1.3. Исследование содержания генома вируса Т-клеточной лейкемии человека типа I (HTLV1) у пациентов

с ТКЛК и ангиитами кожи................................................78

1.4. Анализ содержания генома EBV в Т- и B-лимфоцитах у пациентов с ТКЛК и ангиитом кожи.....................................80

2. Роль вируса Эпштейн-Барр в патогенезе ТКЛК и

ангиитов кожи. .................................................................82

2.1. Исследование апоптоза в лимфоцитах периферической

крови пациентов с Т-клеточной лимфомой

кожи и ангиитами кожи..................................................83

2.2. Исследование индукции апоптоза в первичной культуре лимфоцитов пациентов с ТКЛК и ангиитами кожи

под действием доксорубицина............................................88

ВЫВОДЫ...........................................................................92

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................ .93

ВВЕДЕНИЕ

Пристальное внимание клиницистов к вирусам герпетической группы обусловлено их онкогенными свойствами и важной ролью в этиологии опухолей. Доказана роль вируса простого герпеса типа I (ШУ1) при развитии лимфомы Беркитта [63]; простого герпеса типа П (ШУ2) при раке шейки матки [119]; цитомегаловируса (СМУ) при инфекционном мононуклеозе и цитомегалии [177]. Важное значение в патогенезе онкологических заболеваний имеет вирус Эгаптейна-Барр (ЕВУ), который ассоциирован с лимфомой Беркитта [48], инфекционным мононуклеозом и носоглоточной лимфоэпителиомой [182], с лимфомами у людей с иммуннодефицитными состояниями [61], болезнью Ходжкина [173], периферической Т-клеточной лимфомой [79] и гастрокарциномой [112].

Проблема кожных заболеваний, во всем ее многообразии, на сегодняшний день является одной из самых сложных в связи с недостаточным этиопатогенетическим исследованием отдельных кожных нозологий. В клинической практике возникают трудности в дифференциальной диагностике эритродермии у больных с ТКЛК и вторичных эритродермий, которые могут развиться у больных при воспалительных дерматозах [8]. Кожные реакции обладают большой вариабельностью, поэтому все больные с атипичными, неясными кожными реакциями требуют к себе особенно пристального внимания [1].

Известно, что вирусы герпетической группы сопутствуют многим кожным заболеваниям. Однако, не изучена их роль в этиологии ангиитов

кожи и кожных лимфопролиферативных заболеваний. Появление нового, специфического, высокочувствительного метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющего анализировать малые количества ДНК и РНК, произвело революционный переворот в молекулярной биологии и диагностике [108]. Применение этого метода открывает новые возможности исследования вирусной этиологии ангиитов кожи и Т-клеточных лимфом кожи (ТКЛК).

Цель настоящей работы заключалась в выявлении геномов вирусов герпетической группы - вируса Эппггейна-Барр (EBV), вирусов простого герпеса типа I (HSV1) и простого герпеса типа П (HSV2), цитомегаловируса (CMV) и вируса Т-клеточной лейкемии человека типа I (HTLV1) и выяснении их возможной этиологической и патогенетической роли у пациентов с ТКЛК и ангиитами кожи.

{.Вирусы герпетической группы и ретровируса HTLV1.

1.1.Вирусы герпетической группы: HSV1, HSV2, CMVu EBV.

По данным ВОЗ, заболевания, обусловленные герпесвирусами, занимают второе место после гриппа, как причина смертности от вирусных инфекций; 35-95% людей инфицированы семью представителями этого семейства [83]. Известно около 80 в той или иной степени охарактеризованных герпесвирусов: пять из них выделены от человека [вирус простого герпеса 1(HSV1)], вирус простого герпеса 2 (HSV2), цитомегаловирус (CMV), вирус ветряной оспы/ опоясывающего лишая (VZV) и вирус Эпштейна-Барр (EBV)].

Герпесвирусы крайне разнообразны по биологическим свойствам. Некоторые из них имеют довольно широкий спектр хозяев, они очень эффективно размножаются, быстро разрушая заражаемые ими клетки (HSV1, HSV2) [155]. Другие, в частности EBV, имеют более узкий спектр хозяев. Некоторые герпесвирусы размножаются довольно медленно, и обладают менее выраженным цитопатическим действием (CMV). Одним из наиболее характерных свойств герпесвирусов является их способность оставаться в латентном состоянии в хозяине, в котором они размножаются [132]. Механизм, обеспечивающий латентность, определяется действием специальных вирусных генов, а также ассоциацией вирусов с клетками подходящего типа [146].

ДНК, выделенная из вирионов вируса герпеса, представляет собой линейную двухцепочечную молекулу [88, 100, 174]. ДНК разных

герпесвирусов различаются по молекулярной массе и составу оснований.

6 6

Молекулярные массы варьируют примерно от 80.10 до 150.10 [145]. Подробно исследована гомология между молекулами ДНК разных герпесвирусов, а также гомология между вирусной ДНК и ДНК клетки-хозяина. Учитывая вариации размеров молекул и состава оснований,

области гомологи обнаруживаются у вирусов, сходных по организации ДНК, антигенной специфичности и биологическим свойствам. Так, вирусы рода Simplex virus HSV1 и HSV2 содержат гомологичные участки, выявляющиеся даже при очень строгих условиях гибридизации [89, 151]. Подобного ряда гомологичные участки найдены у вирусов рода Lymphocrytovirus (EBV) [56, 67]. Вместе с тем у ДНК вирусов, принадлежащих разным родам, гомологичные участки вообще или почти не обнаруживаются даже при весьма нестрогой гибридизации [26,124].

Количество генов, идентифицированных у герпесвирусов, около 70-200. Герпесвирусы млекопитающих и приматов вероятно имеют набор из примерно 40 "core" генов взаимосвязь которых основана на гомологии аминокислот или структурных сходствах. Они кодируют задержание ранних и поздных протеинов, функции которых зависят, главным оброзом, от гомологии вируса простого герпеса-1, и необходимы для репликации, но не вовлеченны в латентное состояние, патогенез или иммунную защиту [43]. Во многих лабораториях обнаружена гомология между ДНК вируса герпеса и ДНК клеток. Наиболее полные данные получены для EBV [65].

Интерес к герпесвирусам обусловлен онкогеном, который был обнаружен у всех вирусов герпеса человека, за исключением вируса ветряной оспы/ опоясывающего лишая. Вирусы простого герпеса типа I и II, цитомегаловирус и Эпштейн-Барр вирус трансформируют клетки человека in vitro. Геномы этих вирусов обнаружены в клетках различных злокачественных опухолей человека [23].

1.1.1. Эпштейн-Барр вирус.

EBV - один из наиболее распространенных вирусов герпетической группы, до 90% населения заражены этим вирусом [37]. Для вируса Эпштейна-Барр характерно латентное существование в B-лимфоцитах и репликация в эпителиальных клетках. Эти оба вида клеток являются потенциальными местами образования злокачественных опухолей,

связанных с EBV. EBV эффективно трансформирует В-лимфоциты, индуцируя непрерывный рост in-vitro лимфобластных клеточных линий (LCL) с теломеразной активностью [57]. Это доказало основную модель вирусной латенции (in vitro). Латентные HS VI, HSV2 инфекций вероятно ассоциированы с ограниченной или неограниченной вирусной транскрипцией или экспрессией белка [131,152]. Тогда как у медленно реплицирующегося CMV латентное состояние оспаривается [30].

Злокачественная пролиферация B-лимфоцитов обусловлена уникальными ДНК-последовательностями вируса, в которых закодированы ядерные антигены (EBNA) и интегральные мембранные белки (LMP-латентные мембранные протеины). Цитотоксические Т-лимфоциты (CTL) адаптивной иммунной системы контролируют содержание в организме латентно инфицированных клеток. Действительно, адаптивная терапия с CTL эффективна при EBV связанных лимфопролиферативных заболеваниях у

иммунносупрессированных пациентов [82]. Однако, нарушение программы латентного состояния вируса может привести к развитию EBV-зависимых опухолей у людей с абсолютно нормальным антивирусным действием CTL.

ДНК-EBV представляет собой большую линейную двух-цепочечную молекулу. Геном EBV -полностью секвенированный герпесвирус генома человека [68]. Антигенный комплекс вируса Эппггейна-Барр, сохраняет названия, отражающие его распространение в клетке (мембранный антиген MA; ядерный антиген вируса Эпштейна-Барр EBNA; латентный мембранный протеин LMP) или функцию (вирусный капсидный антиген VCA, ранний антиген ЕА). Ядерные протеины, экспрессированные в латентном состоянии, названы EBNA-1 до EBNA-6 (по возрастанию молекулярного веса). Белки LMP-1,-2A, и -2В также связаны с латентным состоянием [68].

Другой вирусный протеин, обычно участвующий в репликации, но вероятно, экспрессирован во время латентной инфекции - это BHRF1 Почти 100% клеток линии LCL инфицированных EBV временно экспрессируют протеин в Gl фазу клеточного цикла [91]. Таким образом, BHRF1 обуславливает выживание вируса в латентно инфицированных клетках. BHRF1 особенно интересен, так как структурно и функционально гомологичен Вс1-2, митохондриальному протеину с анти-апоптотическим свойством [106]. BHRF1 замедляет окончательную дифференцировку популяций эпителиальных клеток, и таким образом может способствует замедлению апоптоза.

У 25-70% подростков и взрослых, первично инфицированных вирусом, развивается клинический синдром инфекционного мононуклеоза, характеризующийся лихорадкой, лимфаденопатией и фарингитом, транзиторным появлением гетерофильных антител и атипических лимфоцитов [181]. EBV вызывает 85% слчаев инфекционного мононуклеоза, в то время как цитомегаловирус ответственен за большинство остальных. EBV также может служить причиной развития носоглоточной лимфоэпителиомой [181], болезни Ходжкина [172, 173] и гастрокарциномы [112].

Последовательность ДНК, характерная для EBV, была выявлена в опухолевой ткани более чем у 90% больных с лимфомой Беркитта (Л Б) [48]. Это моноклональная опухоль В-лимфобластов, встречается примерно в 30 раз чаще на территории Африки чем в остальных странах. При ЛБ обнаружена хромосомная транслокация, которая проявляется в перемещении онкогена с-тус с хромосомной ленты 8q24 точно в пределах локуса Ig, на хромосомы 14(85%), 22(10%), или 2(5%) которые действуют согласно генной рекомбинации и транскрипции [97]. Таким образом, EBV непосредственно связан с эндемичной ЛБ и является наиболее фактором ее генеза.

Продолжает увеличиваться число доказательств участия EBV в патогонезе некоторых лимфатических лимфом у лиц с иммуннодефицитными состояниями [61]. B-клеточная лимфома значительно опережает другие злокачественные новообразования, развивающиеся у лиц с ослабленным иммунитетом, но в последнее время, описанны случаи EBV-инфецированных пациентов с периферической Т-клеточной лимфомой (Mycosis fungoides) [79].

Было установлено, что EBV вызывает летальные лимфопролиферативные заболевания, причем иногда с особенностями выраженной лимфомы, а у некоторых пациентов с признаками глобального иммунодефицита, который может быть, по-видимому, либо врожденным, либо приобретенный, в результате иммуносупрессии при трансплантированнии органа или ткани, или в результате СПИДа [17,164]. Было установлено, что геном EBV кодирует белковый фактор, способный активировать репликацию вируса иммунодефицита человека [84]. Большинство EBV-ассоциированных лимфопролиферативных повреждений не проявляют характерной для лимфомы Беркитта хромосомной аномалии.

1.1.2.Вирусы простого герпеса (HSV1, HSV2).

Вирусы простого герпеса первого и второго типа распространены по всему миру. Практически во всех популяциях более чем 90% лиц в возрасте старше 40 лет имеют антитела к вирусу простого герпеса 1 [37]. Антитела к HSV2 обнаруживают, как правило, лишь у лиц, достигших половой зрелости до 60% взрослого населения [153].

Геном вируса простого герпеса представлен двуспиральной линейной ДНК(мол. Масса около 100.106 D), длины которой достаточно для того, чтобы закодировать на 60-70 генных продуктов сверх обычной нормы [131]. Геномы HSV1 и HSV2 приблизительно на 50% гомологичны. Гомологичные участки распределены по всей карте гена. Большинство

полипептидов, специфичных для одного типа вирусов, антигенно связаны с полипептидами другого типа [152].

Вирусы простого герпеса (HSV1, HSV2) вызывают разнообразные инфекционные заболевания, поражающие слизистые оболочки и кожные покровы, центральную нервную систему, а иногда и внутренние органы [41]. Момент первоначальной инфекции герпесвирусами HSV1 и HSV2, как и при инфецированием EBV, часто остается незамеченным, за исключением случаев первичного системного заболевания у маленьких детей; протекающего с генерализованным или локальным поражением кожи и слиизстых на фоне тяжелых общих проявлений [146].

Проникновение вирусов простого герпеса в некоторые клетки (в частности, нейроны) не сопровождается репликацией вируса и гибелью клетки. Напротив, клетка оказывает на вирусные геномы угнетающее влияние, приводя их в состояние, при котором существование вируса совместимо с нормальной активностью клетки- (Вирус персистирует в латен