Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства изолятов ВИЧ-1, выделенных от пациентов с территорий СНГ

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сахурия, Ирма Бухутиевна, Москва

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК ИНСТИТУТ ВИРУСОЛОГИИ им. Д.И. ИВАНОВСКОГО

Сахурия Ирма Бухутиевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ИЗОЛЯТОВ ВИЧ-1, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВ С ТЕРРИТОРИИ СНГ.

Специальность 03.00.03 — "Молекулярная биология"

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: с.н.с. Э.В. Карамов Академик РАМН, д.м.н., профессор С.М. Клименко

Москва — 1999

ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

АЗТ, AZT - азидотимидин (3'-азидо-2\ З'-дидезокситимидин, зидовудин, ретровир)

АЗТМФ, AZTMP - монофосфат азидотимидина АЗТТФ, AZTTP - трифосфат азидотимидина ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ИФА - иммуноферментный анализ

МПК, РВМС - мононуклеары периферической крови (peripheral blood mononuclear cells

ПААГ - полиакриламидный гель ПЦР, PCR - полимеразная цепная реакция PC - ростовая среда

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

ФГА - фитогеммагглютинин

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат

AMP - аденозинтрифосфат

Asp - аспартат

Asn - аспарагин

Arg - аргинин

CD5o - 50% цитотоксическая доза

dNTP - трифосфат дезоксинуклеозида

ddA - дидезоксиаденозин

ddC - дидезоксицитидин, зальцитабин

d4C -2', 3' -дидезокси -2', З'-дидегидроцитидин

ddG - дидезоксигуанозин

ddl - дидезоксиинозин, диданозин

ddT - дидезокситимидин

d4T - 2', 3'-дидезокси-2', З'-дидегидротимидин

Fab - фрагмент молекулы иммуноглобулина, несущий один

антигенсвязывающий центр (antigen binding fragment) FCS - телячья эмбриональная сыворотка FTC - дезоксифтороцитидин ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ env - ген ВИЧ, кодирующий белки оболочки gag - ген ВИЧ, кодирующий белки сердцевины Gin - глутамин

gpl20 - поверхностный вирусный гликопротеин массой 120kD gp41 - поверхностный вирусный гликопротеин массой 41kD GTP - гуанозинтрифосфат

HEPES - N-2-гидроксиэтилпиперазин - N 5, 0-2-этансульфоновая кислота

HHV - вирус простого герпеса

HpddA - фосфонат дидезоксиаденозина

HpddT - фосфонат дидезокситимидина

HU - гидроксимочевина

Ш50 - 50% ингибирующая доза

IDgo - 90% ингибирующая доза

NSI - несинцитийобразующий

Met - метионин

MDR - клетки с множественной лекарственной устойчивостью

(multidrag-resistant cell) МТТ - 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид PBS - фосфатно-солевой буфер Phe - фенилаланин

pol - ген ВИЧ, кодирующий обратную транскриптазу р170 - трансмембранный гликопротеин массой 170kD r/h - фенотип ВИЧ-1: быстрый с высокой продукцией вирусных антигенов RT - обратная транскриптаза SI - синцитийобразующий SIV - вирус иммунодефицита приматов

s/1 - фенотип ВИЧ-1: медленный с низкой продукцией вирусных антигенов TCID50 - инфекционная доза вируса, приводящая к продуктивной вирусной

инфекции в культуре клеток в 50% случаев ТК - тимидинкиназа Thr - треонин

ЗТС - тритиоцитидин, ламивудин Туг - тирозин

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ................................................................................. 1

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Этиология и эпидемиология ВИЧ ........................................................ 3

Молекулярная биология и жизненный цикл вируса иммунодефицита

человека ........................................................................................ 4

Генетическая изменчивость ВИЧ ....................................................... 10

Субтипы ВИЧ-1 и их географическое распространение ........................... 12

Фенотипические свойства различных вариантов ВИЧ-1 .......................... 14

Внутриклеточные факторы, влияющие на фенотип ВИЧ-1 ....................... 21

Химиотерапия ВИЧ-инфекции и СПИДа ............................................. 23

ЧАСТЬ И. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ВИЧ-инфицированные пациенты ....................................................... 30

Клеточные культуры ...................................................................... 30

Вирусные штаммы ......................................................................... 31

Культуры донорских мононуклеаров периферической крови (МПК) .......... 31

Определение числа жизнеспособных клеток с помощью исключающего

витального красителя трипанового синего ........................................... 32

Определение числа жизнеспособных клеток с помощью МТТ-теста ........... 32

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) .................................................. 33

Иммуноферментный анализ (ИФА) для определения антигенов ВИЧ-1 ...... 35

Определение ТСГО50 ....................................................................... 36

Изоляция ВИЧ в смешанной культуре МПК ВИЧ-инфицированных пациентов и

МПК здоровых доноров .................................................................. 37

Исследование in vitro фенотипических особенностей изолятов

ВИЧ-1 ......................................................................................... 38

Азидотимидин (AZT) ...................................................................... 38

Определение цитотоксичности AZT .................................................. 38

Определение AZT-чyвcтвитeльнocти изолятов ВИЧ-1 ............................. 39

Определение анти-ВИЧ эффективности КЪТ на модели МПК пациента ...... 40

УЗ-имитирующие синтетические пептиды ............................................ 41

ИФА на основе синтетических пептидов .............................................. 44

ЧАСТЬ III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 1. Биологические свойства первичных изолятов ВИЧ-1 на различных стадиях инфекции .......................................................................... 45

Глава 2. Изучение биологических особенностей in vitro первичных изолятов ВИЧ-1 субтипа А, циркулирующих среди внутривенных наркоманов на территории бывшего СССР .............................................................. 67

Глава 3. Разработка экспериментальной системы для комплексной диагностики in vitro анти-ВИЧ-эффективности AZT ................................................ 89

ВЫВОДЫ .................................................................................. 102

Список научных публикаций по теме диссертационной работы ............... 103

Библиографический список

107

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) приводит к летальному заболеванию - синдрому приобретенного иммунодефицита (СПИД). По данным ВОЗ, в 1998-ой год человечество вступило с более, чем 30-тью миллионами ВИЧ-инфицированных пациентов. Из них большая часть (21 млн.) проживает на Африканском континенте (главным образом, в центральной и южной Африке); 5.8 млн. - в Юго-Восточной Азии; 12 тыс. - в Австралии, Новой Зеландии и Океании; 1.2 млн. - в Латинской Америке; 860 тыс. - в США и Канаде; 480 тыс. - в Западной Европе; 180 тыс. - в Восточной Европе; около 2 тыс. - в Беларуси; около 10 тыс. - в России. Кумулятивная смертность от СПИДа составила 11.7 млн.. В 1997 г. было выявлено 5.8 млн. новых случаев ВИЧ-инфекции, причем государства бывшего СССР уверенно лидируют по скорости развития эпидемии (ежегодный прирост -более 100%). В контексте сложившейся эпидемиологической обстановки, исследования (включая данную работу), направленные на изучение биологических свойств различных вариантов ВИЧ и эффективности схем химиотерапии этой вирусной инфекции, представляются чрезвычайно актуальными.

Цель работы. Целью данной работы является изучение биологических свойств ряда первичных изолятов ВИЧ-1 in vitro, выделенных от инфицированных пациентов с территории СНГ, установление взаимосвязи между фенотипическими особенностями изолятов, стадией инфекции и клиническими характеристиками заболевания; разработка подходов к созданию индивидуальных схем химиотерапии ВИЧ-инфекции с учетом ее характеристик для конкретного пациента.

Научная новизна работы. Сегодня отсутствует общепризнанная классификация первичных изолятов ВИЧ на основании сравнения их фенотипических свойств. В данной работе проанализирована взаимосвязь между скоростью и уровнем репродукции ряда первичных изолятов ВИЧ-1 в различных

клеточных системах. Впервые изучены биологические свойства вариантов ВИЧ-1 субтипа А, вызвавших резкую эпидемическую вспышку в г. Светлогорске (Гомельская обл. Беларуси). Предложена экспериментальная система для оценки эффективности химиопрепаратов на модели мононуклеаров периферической крови пациента in vitro.

Научно-практическое значение работы. Стоимость эффективной анти-ВИЧ химиотерапии (например, тройных комбинаций AZT+ЗТС+индинавир и т.п.), в настоящее время, чрезвычайно высока (такая терапия оценивается в 20-25 тыс. долларов США ежегодно на одного пациента). Эффективность различных химиопрепаратов ограничивается появлением резистентных вирусных вариантов. Выходом из этой ситуации мог бы оказаться доклинический анализ возможной химиотерапии in vitro. Поэтому развитый в данной работе подход по индивидуальному подбору схем химиотерапии имеет практическое значение.

Характеристики изученных изолятов ВИЧ-1 переданы лечащим врачам соответствующих пациентов в клинику Института иммунологии МЗ РФ, Клиническую инфекционную больницу № 2 г. Москвы, Районную поликлинику г. Светлогорска (Гомельская обл. Беларуси).

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах машинописного текста, включая 5 таблиц, 22 рисунка, и состоит из разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Выводы. Библиографический список включает 231 наименование.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Этиология и эпидемиология ВИЧ.

В 1964 году Говард Тёмин наблюдал, что заражение некоторыми РНК-содержащими вирусами, такими, как вирус саркомы птиц (саркомы Рауса), блокируется ингибиторами синтеза ДНК. В результате этого открытия было высказано предположение, что для репродукции некоторых РНК-содержащих вирусов необходим синтез ДНК. Гипотеза о том, что для вирусов, содержащих РНК, нужна транскрипция ДНК, а ДНК-содержащий провирус служит промежуточным звеном в репликации этих вирусов нашла экспериментальное подтверждение [Temin Н., 1972; Baltimore D., 1976]: был открыт новый фермент -обратная транскриптаза, необходимая для жизненного цикла ретровирусов (от англ. reverse transcriptase - обратная транскриптаза).

С этого момента стали активно развиваться иммунохимические и молекулярно-биологические методы детекции и анализа нового фермента, что привело к открытию первых ретровирусов человека. Был выделен и исследован вирус, вызывающий у человека Т-клеточный лейкоз (HTLV-1) [Poiesz А.Р., 1980]. Позлее был изолирован второй тип ретровируса этого семейства (HTLV-2) [Kalyanaraman V.S., 1982].

К июню 1981 года в CDC (Center for the Disease Control, Атланта, США) поступили сообщения о пациентах с пневмоцистной пневмонией, отягощенной грибковыми заболеваниями. У большинства из пациентов при обследовании было выявлено снижение показателей клеточного иммунитета. Поступившие данные заставили экспертов CDC обратить более пристальное внимание на молодых людей с вторичными иммунодефицитами, на фоне которых развивались тяжелые формы условно патогенных инфекций и некоторые неоплазии, свойственные пожилым людям (например, саркома Капоши). Полученная информация свидетельствовала о появлении новой болезни, названной впоследствии Синдромом Приобретенного Иммунодефицита

(СПИДом), и которая, вероятно, вызывается неизвестным инфекционным агентом [CDC, 1981].

Изучение причин СПИДа в начале 80-х было сфокусировано на различных вирусах, вызывающих иммунодефицитные состояния, - в первую очередь ретровирусах, а так же парвовирусах и вирусах герпеса [Levy J.A., 1993]. Первыми вирус, вызывающий СПИД, в 1983 г. выделили сотрудники лаборатории Люка Монтанье (Институт Пастера, Париж, Франция) и назвали его LAV (от англ. Lymphadenopathy-Associated Virus) [Barre-Sinoussi В., 1983]. В мае 1984 г. Роберт Галло (руководитель лаборатории клеточной биологии опухолей при Национальном институте рака, Бетезда, США) сообщил о выделении этиологического агента СПИДа и, предполагая его взаимосвязь с семейством вирусов HTLV, назвали его HTLV-III (от англ. Human Т cell Leukemia/lymphoma Virus type III - вирус Т-клеточного лейкоза/лимфомы человека III типа) [Gallo R., 1983]. Данные сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей LAV и HTLV-III привели к выводу, что они являются различными вариантами одного и того же вируса [Florino P.M., 1985]. В июне 1986 г. на Международном Вирусологическом Конгрессе в Париже было решено обозначить возбудитель СПИДа как Вирус Иммунодефицита Человека (ВИЧ; HIV - от англ. Human Immunodeficiency Virus) [Gallo R. and Montagnier L., 1987].

В 1986 г. появилось сообщение [ClavelF., 1986] об изоляции нового ретровируса, ассоциированного со СПИДом: на основании клинических данных больным был поставлен диагноз СПИД, однако тестирование сывороток на антитела к ВИЧ-1 дало отрицательный результат. Авторами было показано, что новый вирус родственен ВИЧ-1, и он был назван ВИЧ-2.

Молекулярная биология и жизненный цикл вируса иммунодефицита человека.

ВИЧ относится к семейству Retroviridae, подсемейство Lentivirinae. Кроме него в подсемейство лентивирусов входят вирус инфекционной анемии

лошадей, вирус меди-висна овец, вирус артрита/энцефалита коз и овец, вирус иммунодефицита крупного рогатого скота, вирус иммунодефицита кошек и вирусы иммунодефицита обезьян.

Поданным электронной микроскопии [Gelderblom H.R., 1989] вирионы ВИЧ имеют размер 100-120 нм (рис.1). Наружная мембрана вируса позаимствована у клетки-хозяина и содержит поверхностные вирусные белки: трансмембранный gp41 (от англ. glycoprotein 41 kD) и нековалентно связанный с ним gpl20 (от англ. glycoprotein 120 kD). Нуклеоид вируса имеет форму усеченного конуса с октаэдрической симметрией и состоит из вирусного белка р24. Между поверхностной мембраной и нуклеоидом находится каркас, состоящий из так называемого матриксного вирусного белка р17. Белок р17 миристилирован, и гидрофобный остаток миристиловой кислоты позволяет ему прочно связываться с липидным бислоем. Внутри нуклеоида содержится геном вируса, состоящий из двух молекул одноцепочечной РНК, с которыми связаны белки с молекулярными массами 6 и 7 kD. Кроме того, в нуклеоиде содержатся продукты генов vif и vpu, а также комплекс ферментов: протеаза и обратная транскриптаза (51 и 66 kD), обладающая активностью ДНК- и РНК-зависимой ДНК-полимеразы, РНКазы Н и интегразы (только 66 kD). В зрелых вирионах (в нуклеоиде) содержится регуляторный белок Vpr - продукт гена vpr. Вирионы ВИЧ-2 содержат белок Vpx - продукт гена vpx, составляющий, по-видимому, так называемые латеральные тельца внутри вириона [Haseltine W.A., 1992; Gamier L., 1998].

Процесс ВИЧ-инфекции клетки-мишени можно разделить на следующие стадии (рис.2):

1. Адсорбция вириона на поверхности клетки; рецепция вируса.

2. Слияние (фузия) мембран вируса и клетки; проникновение вируса внутрь клетки (пенетрация).

3. Высвобождение нуклеоида и геномной РНК вируса; обратная транскрипция.

4. Интеграция генома вируса в геном клетки.

Рис. I. Морфология вириона (СеМегЫот 1998).

5. Латентная стадия инфекции (это период времени, в течение которого ДНК провируса интегрирована в геном; но транскрипции и трансляции с генов вируса нет).

6. Активация процесса транскрипции ДНК провируса и последующей трансляции белков вируса.

7. Активная репликация вируса, то есть крупномасштабная наработка всех компонентов вируса и формирование из них зрелых вирионов.

8. Высвобождение дочерних вирионов из клетки-хозяина во внешнюю среду.

Геном ретровирусов состоит из двух одинаковых молекул РНК(+). После проникновения вируса в клетку и освобождения от внешней оболочки и капсида вирусный фермент обратная транскржггаза обеспечивает синтез одкоцепочечной нити ДНК на матрице вирусной РНК (осуществляет этап обратной транскрипции). Геномная РНК имеет размер 9,2 кЬ. она участвует в жизненном

цикле вируса только одни раз, когда ока является матрицей для обратной транскриптазы при биосинтезе комплиментарной ДНК.

Рис.2. Схема жизненного цикла ВИЧ.

Исходная РНК-матрица расщепляется и строится вторая цепь ДНК с использованием первой (синтезированной ранее) уже в качестве матрицы, и такая двунитчатая ДНК в результате интегразной активности 66 kÜ-субъединицы обратной транскриптазы встраивается в хромосомную ДНК (Fields et al,, 1986). ДНК нровируса содержит 9749 пар нуклеотидов. Это увеличение по сравнению с РНК происходит за счет наращивания длинных концевых повторов (от англ. Long Terminal Repeats, LTR), включающих в себя ряд сайтов связывания для факторов регуляции транскрипции и трансляции.

Ретровирус в интегрированном состоянии называют провпрусом. Провйрус может долгие годы ничем себя не проявлять, но рано или поздно он активируется (под воздействием температуры, ультрафиолета), обеспечивая продукцию новых вирусных частиц. Заболевания, вызываемые лентивирусами, чаще всего связаны с поражением иммунной, кроветворной и нервной систем и развиваются по типу медленных инфекций с длительным инкубационным периодом между заражением и клинической манифестацией.

Провйрус содержит в себе следующие гены [Букринский М.И., 1987; Gallo К., 1988; Vogt G.M., 1997; рис.3]:

gag - (от англ. group specific antigens - группоспецифический антиген) -кодирует внутренние белки вируса. Белок-предшественник, Gag. имеет молекулярный вес 55 kD. Эта молекула расщепляется протеазой вируса на следующие компоненты, считая сМ-конца; р17т р24, р7 и рб.

pol - (от англ. polymerase - полимераза) - кодирует вирусные ферменты. Обратная транскриптаза (51 kD и 66 kD) получается из белка рбб путем отщепления фрагмента с С-конпа, при этом интегразной активностью обладает только большая субъединица.

env - (от англ. envelope - оболочка) - кодирует оболочечные вирусные белки (прямой продукт гена, р97.5, после гл и коз и л и р о ва н и я превращается в gp 160 и нарезается на gp 120 и gp4 i),

Как и у других ретровирусов, продукты генов pol и gag считываются в виде общего предшественника (молекуляр