Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы резистентности при ВИЧ-инфекции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Механизмы резистентности при ВИЧ-инфекции"



У?

1 ■> ? 1 Л Г! ■> г

На прайах рукописи

Пашкова Татьяна Анатольевна

МЕХАНИЗМЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

специальность 03.00.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени Кандидата биологических нау*

Москва - 1997

Работа выполнена в группе иммунохимии лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН

Научные руководители:

Э,|3. Карамов, ртарщий научный сотрудник С.М. Клименко, академик РАМН, профессор

Официальные оппоненты:

Л.П. Алексеев, доктор медицинских наук, профессор В.р. Зверев, доктрр бирлргических наук Ведущая организация:

Институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН

Защиту состоится "г на за-

седании специализированного совета Д.001.20.01 при НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Иванрвского РАМН.

Автореферат разослан "—¿I_" £¿¿£1/^?$ 1997г.

Ученый секретарь специализированного совету,

доктор медицинских наук Н.П. Косякова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), открытый в начале 80-ых годов XX века, является этиологическим агентом синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД), неизлечимого в настоящий момент заболевания. Ежегодно в мире растет чцсло инфицированных лиц и заболевших, эпидемия приняла всемирные масштабы. Поиск химиопрепаратов, способных подавить или замедлить развитие ВИЧ-инфекции ведется непрерывно.

Однако главной трудностью в этом процессе является быстрое развитие устойчивости вируса к применяемым соединениям. Одним из широко используемых в настоящее время в терапии СПИДа химиопрепаратов является аналог природного нуклеозида тимидина - азидотимидин (АЗТ, ретровир, зидовудин)

- ингибитор обратной транскрипции ВИЧ. Но его применение в клинике наталкивается на ряд ограничений, наиболее серьезными из которых являются значительная токсичность и возникновение устойчивости к АЗТ, что, в конечном счете, снижает эффективность лечения.

Ранее была выдвинута гипотеза, связывающая феномен резистентности с мутациями, возникающими в различных вирусных генах. Для ВИЧ справедливо то, что потеря чувствительности к АЗТ связана с точечными или множественными мутациями в гене pol, кодирующем обратную транскриптазу вируса: позиции 41 (Met - Leu), 67 (Asp - Asn), 70 (Lys - Arg), 215 (Tbr - Phe пли Туг), 219 (Lys

- Gin). Большинство вирусных вариантов, изолированных от пациентов длительное время получавших ретровир обладают АЗТ-устончивым фенотипом и слабыми репликативными свойствами.

Однако понятие "резистентность при вирусной инфекции" включает в себя не только устойчивость вируса к применяемым препаратам, но также нечувствительность клетки-мишени как к возбудителю заболерания-вирусу, так и к применяемым лекарственным препаратам. В связи с этим особую актуальность приобретают исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе феномена резистентности. Не менее важным направлением является поиск веществ, способных подавить репликацию резистентных штаммов вируса.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение механизма устойчивости трех клонов (СЕМ-K) Т-лимфоцитов к ВИЧ-1-инфекции, исследование устойчивых к АЗТ штаммов вируса, а также поиск веществ, способных подавить репликацию таких штаммов. В ходе исследования ставились следующие экспериментальные задачи:

1) исследовать клеточную модель на основе Т-клеток, нечувствительных к заражению ВИЧ-1;

2) создать коллекцию АЗТ-устойчивых изолятов ВИЧ, полученных от пациентов длительное время получавших АЗТ-терапию;

3) изучить биологические свойства (активность репликации, цитопатоген-ность, способность к сцнцитийобразованию, клеточный тропизм) и чувствительности к АЗТ полученных изолятов;

4) найти комбинации препаратов, подавляющих репликацию АЗТ-устойчивых изолятов ВИЧ-1.

Научная новизна. В диссертационной работе, представленной к рассмотрению, описано получение уникальных Т^клеточных клонов СЕМ-K, нечувствительных к заражению ВИЧ-1. Путем трансфекции (электропорации) ролнораз-мерным геромом ВИЧ-1 клеток СЕМ-K получено вирусное потомство и исследован его клеточный тропизм. Изолированы АЗТ-резистентные варианты ВИЧ-1, обладающие высокой устойчивостью к азидотимидину и активными реплика-

тивными свойствами. Найдена оригинальная комбинация веществ, подавляющих репликацию АЗТ-устойчивых иэолятов ВИЧ-1 в культуре клеток.

Направленность и ценность работы. Выполняя диссертационную работу, мы получили оригинальную Т-клеточную модель, нечувствительную к заражению ВИЧ-1. Установлен механизм устойчивости полученных клеточных линий к ВИЧ-инфекщш. Данные линии Т-клеток могут быть успешно использованы в молекулярно-биологических исследованиях.

Создана коллекция АЗТ-усгойчнвых иэолятов ВИЧ-1. Изучены биологические свойства полученных природных вариантов вируса: репликативная активность, цитопатогенность, тропизм к МПК (мононуклеарам периферической крови) и различным перевиваемым Т-клеточным линиям, способность к синци-тийобразованию. Данная коллекция может быть применена для химиотерапев-тических исследований ВИЧ-1, в том числе для поиска препаратов, способных подавить репликацию АЗТ-устойчивых вариантов ВИЧ-1. Исследовали возможность сочетанного влияния препаратов на репликацию ВИЧ-1. Найдена оригинальная комбинация веществ, способных подавить репликацию АЗТ-устойчивых штаммов ВИЧ-1 in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Получены уникальные клоны СЕМ-К перевиваемой Т-клеточной линии человека СЕМ, устойчивые к заражению ВИЧ-1.

2. Расшифрован механизм устойчивости клеток СЕМ-К к ВИЧ-1 - отсутствие С04-антигена - поверхностного маркера лимфоцитов человека, главного рецептора для ВИЧ.

3. Установлено, чгро вирус, полученный путем трансфекции (электропора-цпи) CD4- клеток СЕМ-К полноразмерным геномом ВИЧ-1, содержащимся в плазмиде HXB2D, не обладает новым фенотипом, идентичен исходному штамму ВИЧ-1 и остается тропным к CDклеткам.

4. Получено 22 АЗТ-резистентных изолята ВИЧ-1, 14 из которых являются активнореплицирующимися (rapid/high). 4 изолята проявляют высокий уровень устойчивости к АЗТ (ID50 свыше 20 мкМ).

5. Показано, что комбинация АЗТ с ингибиторами клеточного фермента рибонуклеотидредуктазы (гпдроксимочевиной или ее аналогами) подавляет репликацию ВИЧ-1 в культуре клеток. Эта комбинация эффективна для АЗТ-устойчивых вариантов вируса in vitro.

Апробация работы. Результаты работы представлены на Юбилейной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Института им. Па-стера (С-Петербург,1993), на II, III, IV международных конференциях "СПИД, рак и родственные проблемы" (С-Петербург, 1993, 1995,1996), на X международной конференции по СПИДу (Иокогама, 1994), на X Вирусологическом Конгрессе (Иерусалим, 1996), на 1-ой международной конференции, посвященной памяти М. Калоши (Будапешт, 1996). В 1995 году на Всероссийском конкурсе молодых ученых-биологов в Черноголовке работа была удостоена премии.

Объем и структура работы. Диссертация построена по общепринятому плану и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов и выводов. Объем диссертационной работы составляет 165 страниц машинописного текста. Полученные результаты иллюстрированы 18 таблицами, 21 рисунком. Список литературы включает 238 наименований.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. СЕМ-К - клоны перепиваемой линии Т-клеток человека, устойчивые к ВИЧ-инфекции.

1.1. Получение клеточных клонов и их морфологическая характеристика.

Нами получена новая клеточная модель СЕМ-К, представляющая собой Т-лнмфоциты человека. Чувствительная к заражению ВИЧ-1 лимфобластоидная линия СЕМ была успешно трансплантирована на бестнмусных мышей Ва1В/С (nude/nude), и получен перевиваемый опухолевый штамм. После 4-го, 7-го, 20-го пассажу на животных образовавшиеся опухоли были ретрансплантированы в культуру клеток. Проводился гистологический я морфологический контроль полученных клеточных линий СЕМ-К4, СЕМ-К7 и СЕМ-К20.

Микроскопическое исследование клеток СЕМ-К4, СЕМ-К7 и СЕМ-К20 после 10-дневного их культивирования в ростовой среде в сравнении с родительскими клетками СЕМ дало следующие результаты. Показано, что по размерам, форме клеток и ядер полученные и родительские клетки соответствуют лимфобласто-пдному ряду. Наблюдается активная пролиферация всех клеточных линий, много фигур митоза. Все культуры характеризуются крупными округлыми или многолопастными ядрами с четкими контурами. Не обнаружено четких различий в морфологии между культурами CEM-JC4, СЕМ-К7 и СЕМ-К20. Однако цитоплазма клеток CJ3M-K, в отличие от родительских СЕМ, сдержит большое количество вакуолей, гипертрофированные митохондрии с нарушением морфологии внутреннего матрнкса и структуры крнст. Фоном служит электронноцрозрачная гиалоплазма. Для четырех клеточных линий характерен небольшой объем цитоплазмы. Еще одним отличием линий СЕМ-К от родительской является больший диаметр клеток. Несмотря на то, что структурные особенности культур СЕМ и СЕМ-К доказывают их принадлежность к Т-лимфобластоидным линиям, имеющиеся отличия клеток СЕМ-К от родительских не позволяют сказать о том, что после пассирования на мышах линия СЕМ не претерпела изменений.

Таким образом, при пассировании на бестнмусных мышах Т-лимфобластоидной клеточной линии СЕМ был получен перевиваемый опухолевый штамм. После ретрансплантации опухолей, изолированных от различных пассажей на животных, в культуре клеток получены три клона лимфобластоидных клеток СЕМ-К4, СЕМ-К7, СЕМ-К20, отличающихся от родительской линии СЕМ по ряду морфологических признаков.

1.2. Характеристика некоторых особенностей клеток СЕМ-К.

Культуральные свойства. Среда для культивирования - RPMI1640 (производство Института полимиелита и вирусных энцефалитов, Москва), содержащая 7.5-15% телячьей эмбриональной сыворотки (ТЭС), 100 мкг/мл сульфата гентамицина и 300 мкг/мл L-глутамина при содержании СОг 5%, Клетки растут в виде суспензионной культуры. Однако было установлено, что полученные клеточные клоны СЕМ'К в течение длительного периода сохраняют свою жизнеспособность при пассировании в ростовой среде с отсутствием ТЭС, а также при пассировании клеток без ОО2. Необходимо отметить, что родительская линия СЕМ очень чувствительна к концентрации ТЭС и СО2, и низкое содержание углекислого газа может привести клетки к гибели. Досевная Доза 2 • 10s клеток в мл, кратность рассева 1:4, 1:5 через 3-4 дня.

Изучение чувствительности клеток СЕМ-К к ВИЧ-1. Была изучена чувствительность полученных линий СЕМ-К4, СЕМ-К7 и СЕМ-К20 к заражению ВИЧ-1. В качестве источника ВИЧ использовали референс-штаммы ВИЧ-1 Н9др и CEM/LAV^ny. 0.5 мл осветленной центрифугированием культуральной жидкости хронически инфицированных клеток Н9д/.' (1 • 104 ТСШ50/МЛ) или CEM/LAVBH[/ (0.58 • 104 TClD50 /мл) инкубировали с 1 • 10® клеток СЕМ-К в течение 2 часов при 37°С. После удаления вируссодержащего супернатанта осадок клеток ресуспендировалн в ростовой среде. Аналогичным образом поступали с клетками СЕМ, которые служили контролем в данном эксперименте. Развитие инфекции оценивали в течение 7 дней. Продукцию вирусных антигенов в четырех клеточных линиях изучали двумя методами: ИФА (р24, "Вектор", Новосибирск) и реакцией обратной транскрипции (ИТ) (Lee et al., 1987) на 3-й и 7-е сутки после заражения. Положительным контролем служили клетки хронически инфицированной линии НЭдр. Результаты испытаний представлены в таблице 1 (данные для 7-х суток).

Таблица 1. Сравнительная характеристика развитая инфекции в клетках СЕМ и СЕМ-К на 7-е сутки *.

Развитие инфекции, %

RT р24

100% 100%

СЕМ-К4 - H9ñF 5% 6%

СЕМ-К7 - Н9д^ 3% 5%

СЕМ-К20- Н9Л^ 3% 7%

СЕМ-К4 - СЕМ/LAУвни 6% 5%

СЕМ-К7 - СЕМ¡ЬА\вни 7% 7%

СЕМ-К20- СЕМ/ЬАУяди 4% 6%

СЕМ - 96% 106%

СЕМ - CEM/LAVBñy 123% 118%

* За 100% инфекции были приняты количество р24 (нг/мл) е ИФА и радиоактивность в ИТ для клеток хронически инфицированной линии Яйдр.

Необходимо отметить, что родительские клетки СЕМ успешно заражались ВИЧ-1 (положительные сигналы в обоих тестах на 3-й и 7-е сутки). Сигнал в ИФА и тесте обратной транскрипции, регистрируемый для всех трех линий СЕМ-К, составляет лишь 5-7% от положительного контроля, что свидетельствует о практическом отсутствии в них инфекции.

Цолученные данные позволяют сделать вывод р том, что после пассирования на животных чувствительная к заражению ВИЧ-1 лимфобластоидная линия СЕМ практически утратила способность к заражению вирусом. Клоны СЕМ-К отличаются от родительской линии не столько морфологическими характеристиками, а таким важным признаком как потеря чувствительности к вирусной инфекции.

1.3.Изучение механизмов устрйчивости клеточных клонов ОЕМ-К к

ВИЧ-1 инфекции.

Свойство устойчивости к заражению ВИЧ-1 для клеток СЕМ-К остается постоянным и сохраняется при длительном культивировании клеток в суспензии

(более 300 пассажей в культуре). Значит этот феномен не является результатом временной адаптации клеток при переходе от одних условий культивирования к другим. Устойчивость к заражению не может также быть объяснена наличием микоплазменной или любой другой контаминации, поскольку пассирование на бестимусных мышах клеточных линий является одним из способов их деконтаминирования (Van Diggelen et al., 1977). Электронно-микроскопическое исследование клеток СЕМ-К от различных пассажей не выявило в них наличия контаминнруюших агентов (отсутствие бактерии, грибов, дрожжей, микоплазм).

Анализируя возможные механизмы, которые могут быть причиной резистентности клонов СЕМ-К к ВИЧ, мы пришли к необходимости изучения спектра поверхностных антигенов исходной и полученных линий, а также проведения подробного кариологическогр анализа.

Изучение экспрессии антигенов на поверхности клеток СЕМ-К. Лля определения экспрессии клеточных рецепторов на поверхности клеток СЕМ-К мы использовали панель моноклональных антител к поверхностным антигенам лимфоцитов человека и метод РИФ. Результат исследования представлен в таблице 2. Поскольку антигенные спектры линий СЕМ-К4 и СЕМ-К7 практически идентичны, мы приводим характеристику одного из них.

Таблица 2. Характеристика экспрессии поверхностных антигенов линий СЕМ и СЕМ-К.

Клеточный антиген СЕМ CEM-K7 CEM-K20

CD 1а 3.67* 3.1 2.2

CDlb 1.8 1.0 0.9

CDlc 2.0 12.1 0.5

CD3 14.9 6.0 54.6

CD4 1еиЗаР 74.7 7.4 5.0

CD4 ¡со86 81.3 1.8 1.5

CD4 leu3a 50.8 1.0 0.17

CD4IOT4F 50.01 0.9 0.17

CD4 Т033 8.7 0.6 0.17

CD4ОКТ4 81.0 4.5 0.07

CD5 94.4 44.2 98.9

CD7 ico87 99.9 23.0 99.2

CD8 6.4 2.7 17.3

CD25 icol05 5.4 1.0 0.23

CD26 T079 10.5 1.27 0.2

CD29 25.6 41.2 1.2

CD34 3.5 3.4 3.6

CD45 RO 36.5 2.9 1.0

CD71 96.5 16.2 3.7

CD95 6.1 47.8 52.6

THYl 10.6 65.7 4.0

* % антигепположителъных клеток в РИФ, расчитанный из 10.000 событий в программе Lists 2 при подсчете на проточном цитофлюориметре FACScan (Becton Dickinson, USA).

Выводы, которые можно сделать на основании полученных антигенных характеристик, таковы:

1) родительская линия СЕМ и полученные линии СЕМ-K являются Т-лимфо-цитарными, поскольку на их поверхности присутствуют рецепторы, характерные для Т-лимфоцнтов человека - CD3, CD5, CD7;

2) на поверхности клеток СЕМ-K в отличие от родительских практически перестают экспрессировагься такие антигены как CD26, CD25, CD45, CD71 и, что особенно интересно, не выявлена экспресия антигена CD4;

3) на поверхности клеток СЕМ-K наблюдается значительная, в сравнении с клетками СЕМ, экспрессия антигена Fas (APO-1/CD95) - антигена, опосредующего апоптоз.

Анализируя данные результаты, очевидным представляется механизм устойчивости клеток СЕМ-K к воздействию вируса - практически отсутствует экспрессия CD4. Первым этапом ВИЧ-инфекции является проникновение вируса в клетку, чему предшествует специфическое связывание вирусного поверхностного гликопротеина gpl20 с CD4 рецептором клеток-мишеней (Dalgleish et al., 1984; Klatzmann et al., 1984), Также представляет интерес резкое уменьшение экспрессии С026-антигена, т.к. ведется дискуссия о том, что CD26, дипептидил-пептидаза IV, возможно, является дополнительным рецептором, ответственным за проникновение ВИЧ в клетки-мишени (Thieblemont et al., 1993; Cohen, 1993).

Еще одним важным, на наш взгляд, обстоятельством является экспрессия CD95-peuerrropa на поверхности прлученных клеток СЕМ-K. Установлено, что именно Fas (APO-1/CD95) является одним из антигенов, опосредующих апоптоз (Yanehara et al., 1989; Trauth et al., 1989). Интересно, что при наличии экспрессии Fas-антигена культуры клеток СЕМ-K длительное время сохраняют свою жизнеспособность в нестандартных условиях: в среде без ТЭС, при низком содержании СО2. В то же время, родительские клетки СЕМ не отличаются высокой экспрессией CD95, но недостаток углекислого газа и/или низкое содержание ТЭС приводят их к быстрой гибели. Возможно, в клетках СЕМ-K запускается механизм анти-апоптоза.

Таким образом, в результате пассирования CD4+ - клеточной линии СЕМ на бестимусных мышах мы получили клоны CD4- клеток, устойчивые к заражению ВИЧ. Объяснить этот факт возможно, во-первых тем, что изначально любая клеточная линия гетерогенна - содержит CD4+ - и CD4- - клетки; при пассцровашш в непривычных условиях произошла селекция и отобрались клоны CD4- клеток. Низкие сигналы в ИФА и тесте обратной транскрипции при заражении клеток СЕМ-K референс-штаммами ВИЧ-1 119д/,- и СЕМ/LAVвни как раз свидетельствуют о том, что полученные после пассирования на животных клоны клеток так же гетерогенны и содержат некоторое количество CD4+ - клеток. Однако неясным остается механизм такой селекции и почему именно CD4~ - клетки получили преимущество в размножении. С другой стороны, отсутствие экспрессии CD4 на клеточной поверхности, возможно, связано с цитогенетиче-скими изменениями родительских клеток - отсутствием гена, кодирующего рецептор CD4, изменение его локализации в результате хромосомных перестроек или внутригенным дефектом. И, наконец, при условии целостности гена CD4, возможны регуляторные события, не связанные с перестройками на уровне хромосом, например, блокирование экспрессии продукта гена, кодирующего этот гликопротеин, как на стадии транскрипции, так и на стадии трансляции.

Цитогенетическое исследование клеток СЕМ-K. Хромосомные препараты клеток СЕМ и СЕМ-K изготовляли стандартным методом (Seabright, 1972). Модальный кариотип рпределяли путем подсчета хромосом на 100 метафазных пластинках. Количество полиплоидных клеток определяли путем анализа 1000 метафаз. Некоторые препараты подвергались С-окрашиванию или окрашиванию

нитратом серебра, чтобы проявить районы ядрышковых организаторов. Детальный цитогенетический анализ проводился на микрофото 15 G-окрашенных ми-тофазных пластинок в каждой линии. Для родительской линии СЕМ и линий СЕМ-К были получены обобщенные реконструированные кариотипы.

Цитогенетическое исследование клеток СЕМ-К7 и СЕМ-К20 показало, что их кариотип соответствует кариотипу человека. 12-ая хромосома, в которой локализован ген CD4 (Van Dongen et al., 1986; Dean et al., 1991; Glukhova et al., 1994), сохранила свою целостность. В ее составе не обнаружено какихтлибо изменений в сравнение с аналогичной хромосомой линии СЕМ. В то же время, имеют место некоторые специфические особенности.

Родительская линия СЕМ характеризуете^ 2п=47 числом хромосом, тогда как клетки СЕМ-К7 и СЕМ-К20 отличаются возникновением полиплоидности: 2п ~ 90. Наблюдается появление дополнительных перестроенных хромосом (таблица 3), а в ряде хромосом зарегистрированы разрывы по отдельным онкогенам.

Таблица 3. Перестроенные хромосомы в линиях клеток СЕМ и

СЕМ-К.

Исходная линия Полученные линир

СЕМ С ЕМ-К 7 СЕМ-К20

9q21 9q21 9q21

9р12 9р12 9р12

8р11 Spil

9р24

микрохромосома микрохромосома

11р12 - spil 11р12 - spil

lqll 2ql3 - fra

Однако открытым оставался вопрос о локализации гена CD4 в самой хромосоме. После гибридизации ДНК хромосом in situ с ДНК-зондом (плазмида pCDZ 245, содержащую НаеЩ-фрагмент ДНК размером 0.7 т.п.н., кодирующий 2 первых домена (Vl, V2) рецептора CD4) , в 100 метафазных пластинках для каждой из исследуемых линий зерна серебра были локализованы в районе pi 1 для СЕМ-К7 и в районе р12 для СЕМ и СЕМ-К20. Полученные нами результаты не противоречат известным литературным данным (Isobe et al., 1986). Следовательно предположение о том, что отсутствие экспресии CD4 связано с изменением места локализации гена, его кодирующего, не подтвердилось.

Генетическая информация о СБ4-рецепторе для клеточных линий СЕМ и СЕМ-К осталась неизменной. Исходя из этого, изменение таких кариологических характеристик, как новые маркерные хромосомы и полиплоидность, не могут объяснить отсутствие экспрессии СС4-антигена на поверхности клеток СЕМ-К. Однако появление разрывов по онкогенам spil и fra, возможно, вносит изменения в свойства и поведение клеток в культуре (Mulder et al., 1991; Itkes, 1996). Пока неизвестны функции онкогена spil, но можно предположить, что разрыв в этой области является причиной блокирования экспрессии CD4 на уровне транскрипции или трансляции.

^аким образом, в результате пассирования на бестимусных мышах CD4+ , чувствительной к заражению ВИЧ-1 лимфобластондной клеточной линии СЕМ впервые получены клоны CD4- Т-лимфобластоидных клеток человека СЕМ-К, утерявшие чувствительность к заражению ВИЧ-1. Полученные клеточные клоны могут служить новой моделью для исследования механизмов взаимодействия вируса с клеткой-Мишенью.

1.4. Получение в клетках СЕМ-К вирусного потомства и изучение

его свойств.

С целью изучения возможного, CD4-независимого механизма ВИЧ-инфекции мы поставили задачу получить вирусное потомство в CD4~ - клетках СЕМ-К и изучить его свойства.

Трансфекция ВИЧ-1 в клетки СЕМ-К. Поскольку на прямое заражение вируссодержащим супернатантом культура клеток СЕМ-К не реагировала, мы воспользовались методом трансфекции - электропорацин (Chu et al., 1987).

В наших экспериментах мы использовали клон клеток СЕМ-К7 и плазмиду НХВ 2D (Mann et al., 1987), содержащую полноразмернын геном ВИЧ-1. Элек-тропорация проводилась по ранее разработанной методике для лимфобластоид-ных клеточных линий ( Агаркова и др., 1987; Sukharev et al., 1992). В качестве контроля мы использовали родительскую линию клеток СЕМ.

После электротрансфекции жизнеспособность СЕМ-К клеток составила 36%, для клеток линии СЕМ - 28%. Клетки помещали в ростовую среду и наблюдали в течение 3-4 недель, регистрируя развитие инфекции визуально, с помощью сэндвич-метода твердофазного ИФА (Жданов и др., 1988), детектирующего антигены ВИЧ-1 и метода количественной ДНК-ПЦР (Yolov et al., 1995).

Для клеток СЕМ, и для клеток С К М-К 7 наблюдалось развитие инфекции по данным ИФА и ДНК-ПЦР (результаты представлены в таблицах 4, 5, 6), что свидетельствует об успешно проведенной трансфекции. Продукция вирусных антигенов по результатам ИФА для клеток СЕМ четко регистрируется уже на третьи сутки после трансфекции; для клеток СЕМ-К - на 13-е сутки.

Таблица 4. Развитие инфекции в клетках СЕМ после электротрансфекции (результаты ИФА).

Сутки после СЕМ+пл+эл* СЕМ+СЕМ+

трансфекции -(-пл+эл*

3 1.99 2.1

13 12.1 12.5

18 13.7 12.4

24 13.9 13.9

30 12.6 13.4

* CEM-f-пл+эл - клетки с плазмидой, подвергшиеся электропорации без подсева свежих клеток, СЕМ+СрМ+пл+эл - клетки с плазмидой, подвергшиеся электропорации с подсевом свежих клеток. Цифры в таблице -отношение значения оптической плотности при 492 нм к cutoff (cutoff =2.5 X значение оптической плотности при 492 нм отрицательного контроля)

Таблица 5. Развитие инфекции в клетках СЕМ-К после электротрансфекции

(результаты ИФА).

Сутки после К7 + пл +эл* К7 + К7+

трансфекции + пл + эл*

3 0.72 0.71

13 11.31 5.31

18 11.04 11.90

24 11.19 11.61

30 12.39 11.87

* К7+пл+эл - клетки с плазмидой, подвергшиеся электропорации без подсева свежих клеток, К7+К7+пл+эл - клетки с плазмидой, подвергшиеся электропорации с подсевом свежих клеток. Цифры в таблице - отношение значения оптической плотности при 492 нм к cutoff (cutoff=2.5 X значение оптической плотности при нм отрицательного контроля)

Таблица 6. Результаты трансфекцни, определенные методом количественной ДНК-ПЦР (число копий ВИЧ-1/ 1000 HLA DQa).

Сутки после к/к* К 7 + пл +эл*

трансфекции

7 0 625

14 0 412

30 17 400

к/к* СЕМ+пл+эл*

7 0 890

14 0 886

30 14 1530

* к/к - контроль клеток, К7-Ьпл+эл - клетки с плазмидой, подвергшиеся электропорации без подсева свежих клеток, СЕМ+пл+эл - клетки с плазмидой, подвергшиеся электропорации без подсева свежих клеток.

На основании визуального контроля и двух количественных тестов, характеризующих накопление вирусных антигенов, можно сделать следующие выводы: 1) при электропорации произошло внедрение генома ВИЧ-1 в клетки СЕМ и СЕМ-К; 2) в супернатангах обеих линий клеток определяется накопление специфических белков ВИЧ-1, что свидетельствует о трансляции вирусного материала.

Однако наличие характерных для ВИЧ-1 белков не может свидетельствовать о том, что, образовались полноценные вирусные частицы. Для проверки этого мы использовали чувствительные к В114 1 Т-лимфобластоидные линии клеток ,1игка1^а1, МТ4, СЕМ и нечувствительную линию клеток СЕМ-К7. Су-пернатанты были получены при центрифугировании двух вариантов клеток 1) К7 клетки с плазмидой, подвергшиеся электропорации без подсева свежих клеток ( К7 + пл + зл)'и 2) клетки СЕМ с плазмидой, подвергшиеся электропорации без подсева свежих клеток ( СЕМ + пл + эл) на 13 сутки после электропорации. 2 • 10® клеток каждой линии инокулировали 100 мкл полученных супернатан-тов и наблюдали в течение недели. Развитие инфекции тестировали методами НИФ и ИФА (р24). Положительным контролем служили клетки хронически инфицированной линии 110 . На 7-е сутки инкубации во всех чувствительных к ВИЧ-1 клеточных линиях регистрировалось четкое развитие инфекцир (по двум тестам), в то время как в клетках СЕМ-К не обнаруживалось ни "перстневого" свечения, ни положительного сигнала в ИФА. Реэультаты исследований по данным ИФА представлены в таблице 7.

Таблица 7. Изучение инфекционности супернатанта, полученного при трансфекцин плазмиды НХВ 2D в клетки СЕМ-К7.

СЕМ Jurkat-tat | МТ4 | СЕМ-К7

3-й сутки инкубации

34% 47% | 45% | 0.5%

7-е сутки инкубации

110% 127% | 130% | 0.7%

* За 100% инфекции было принято количество р24 (нг/мл) в ИФА для хронически инфицированной линии клеток Н9цр,

Полученные в этом эксперименте данные бесспорно свидетельствуют о том, что при внедрении в CD4- - клетки СЕМ-К7 плазмиды НХВ 2D, содержащей полноразмерный геном ВИЧ-1, произошла репродукция вирусного материала, в результате чего образовалось новое, полноценное BiipycHoe потомство, обладающее способностью заражать пермиссивные для ВИЧ-1, CD4"*" - клеточные линии. Новый вирус не вызывает инфекции в клетках СЕМ-К7. Это означает, что вирусы, полученные в CD4" - клетках СЕМ-К, не аттенуированы. Вирусное потомство не обладает новым фенотипом, идентично исходному штамму ВИЧ-1, и остается тройным к CD4"'" - клеткам.

Таким образом, в изученной нами модели генетическая конституция вируса и его фенотипические свойства (тропизм) не изменяются р результате экспрессии в клетках, утерявших рецепторы для проникновения ВИЧ-1. Проведенные нам и исследования являются подтверждением того, что для проникновения и последующей продуктивной ВИЧ-инфекции в Т-лимфоциты человека необходимо наличие CD4 - антигена. Исследуя механизму устойчивости клеток СЕМ-К к воздействию вируса, мы пришли к заключению, что одним из таких механизмов является возникновение клонов клеток с отсутствием экспрессии CD4-peuenTopa. Поскольку клеточные линии СЕМ-К характеризуются также отсутствием других поверхностных антигенов, возможно играющих роль дополнительных рецепторов для проникновения ВИЧ, то полученная клеточная модель может быть использована для изучения механизмов ВИЧ-инфекции.

По проделанной работе подана авторская заявка в Патентное ведомство Российской Федерации с приоритетом от 28.12.1995 Г.

2. Природные (wild) изоляты ВИЧ-1 и их биологические свойства.

2.1. Подбор пациентов и изоляция от них вирусных вариантов.

Мы провели работу по созданию коллекции природных вариантов ВИЧ-1, изолированных от пациентов, проходивших курс АЗТ-терапип, а также от пациентов, не получавших такого лечения. Было выбрано 15 пациентов на различных стадиях ВИЧ-инфекции: от бессимптомной А2 до терминальной СЗ (классификация CDC, 1987). Для 8 пациентов изоляция вирусов проводилась до и после курса лечения АЗТ, а также на различных сроках болезни. Географическое распределение исследуемых образцов представлено следующим образом: 23 изолята получено от лиц, проживающих в различных районах Российской Федерации, 3 -от белорусского пациента, 2 -от граждан Грузиии и 2 кубинских образца. Общая клиническая характеристика пациентов представлена в таблице 8.

Таким образом, стадии заболевания представлены следующим диапазоном А2, В2, ВЗ, С2, СЗ, для четырех пациентов этот параметр неизвестен. 11 изолятов

получено от пациентов, не получавших АЗТ-терапию, 4 нзолята - от лиц, для которых время приема ЛЗТ не превышало полгода, 7 изолятов от пациентов, для которых общая продолжительность лечения АЗТ составила 12 месяцев и 8 вирусных вариантов - от лиц, получавших АЗТ-терапию более года.

При изоляции ВИЧ-1 вариантов мы использовали стандартную методику (Albert et al., 1987; Fiore et al., 1991):

1) выделение МПК (мононуклеаров периферической крови) из гепарннизиро-ванной крови пациентов в градиенте Ficoll;

2) сокультивапия их с ФГА-стимулированнынр МПК здорового донора; куль-туральный суцернатант, соответствующий максимальной продукции антигенов ВИЧ-1 после проверки в ИФА и RT (14-21 сутки после сокультивацин) служил источником ВИЧ-1, его расфасовывали в ампулы по 1 мл и хранили при —70°С; использовали во всех дальнейших экспериментах, называя "сток вируса";

3) закрепление нзолята в одной или нескольких Т-лимфобластоидных клеточных линиях. Нами получено 30 изолятов от ВИЧ-инфицнрованных и больных СПИД.

Таблица 8. Клинические данные ВИЧ-инфицированных пациентов.

Код изолята Стадия инфекции Концентрация Время приема

(no CDC- р24 в плазме АЗТ

классифцкашш) (нг/мл) (месяцы)

PKVR-53 B2 0.026 0

PKVR-193 В2 0.096 0

PSNM-55 ВЗ 0.660 0

PSST-29 ВЗ 0.365 0

PSST-86 ВЗ 0.000 0

PSRL-128 сз 0.372 0

СВ1-22 X X 24

CJ32-216 X X 24

PDRN-iOO А2 0.160 12

PSMV-112 ВЗ 0.136 12

PgMV-165 ВЗ 0.374 12

PKLN-95 СЗ 0.217 12

PKLN-J7S СЗ 0.147 14

GRl-56 X 1.368 6

GR2-59 X 0.864 12

PMSL-20 В2 0.144 0

PMSL-75 ВЗ 0.139 0

PMSL-225 ВЗ 0.060 12

PNDN-52 В2 0.221 0

PNDN-209 ВЗ 0.252 4

PLMN-24 В2 0.221 0

PJJMN-60 В2 0.054 0

PLMN-198 С2 0.000 4

PLMN-204 ВЗ 0.111 6

PKKR-13 ВЗ 0.394 12

PKKR-32 ВЗ 0.090 15

PKKR-54 ВЗ 0.200 15

PJCKR-}72 С2 0.223 16

PKKR-192 СЗ 0.117 18

PKKR-208 СЗ 0.149 18

2.2. Изучение биологического фенотипа изолятов ВИЧ-1.

Представляет интерес наличие корреляции между свойствами вируса и стадией ВИЧ-инфекции, а также взаимосвязь биологических характеристик изоля-тов и длительности приема азидотимидина. На основании таких данных возможно составить прогноз течения ВИЧ-инфекции для каждого пациента и сравнить его с реальным развитием инфекционного процесса.

Мы изучили репликагивную активность, цитопатогенность, способность к синцитийобразованню полученных вариантов ВИЧ-1 в различных Т-клеточных системах, определив таким образом спектр их тропизма.

3 • 1Û6 клеток различных перевиваемых линий (Jurkat-tat, МТ-4, 119, СЕМ, CEM-SS, Sup Т1) или МГ1К здорового донора заражали 0.5 мл стока вируса каждого из полученных изолятов, инкубировали 2 часа при 37°С, после освобождения от вируса осадок клеток рссуспендировали в ростовой среде и наблюдали за развитием инфекции в течение 4-х недель. Отбор проб для определения антигенов ВИЧ-1 проводился каждые 3-е суток, а также по мере проявления характерных визуальных признаков инфекции: распад кластеров, значительная клеточная гибель, балоны, множественные структуры диаметром в 3 и более клеток и т.д. Использовались методы ИФА, RT, РИФ. Анализируя результаты, полученные в трех тестах, мы определили спектр клеточного тропизма для каждого изолята полученной коллекции природных вариантов ВИЧ-1.

Сравнивая репликацию природных изолятов в МПК здорового донора и различных перевиваемых Т-клегочных линиях, необходимо отметить, что для всех без исключения изолятов наблюдается развитие инфекции в МПК-клетках не зависимо от стадии заболевания. Среди использованных Т-лимфобластоидных линяй наиболее чувствительными оказались МТ-4, СЕМ, Jurkat-tat и CEM-SS.

Поскольку развитие инфекции для всех изолятов имело четкие специфические признаки в линии CEM-SS, то активность репликации различных вариантов ВИЧ-1 изучали именно в этой клеточной системе. Заражение клеток CEM-SS проводили как описано выше. В течение 25 суток наблюдали за развитием инфекции, отбирая пробы для ИФА (р24) каждые 3-е суток, а также при визуальном наблюдении характерных признаков инфекции. При количественном контроле накопления вирусных антигенов в культуральном супернатанте каждого изолята отмечали пик продукции р24 и временной интервал с момента заражения, ему соответствующий.

Определение фенотипа как "синцитийобразующий/ несинцитийобразующий (SI/NSI)" проводили в МТ2-тесге, поскольку эта клеточная линия наиболее чувствительна к синцитийобразующим вариантам ВИЧ-1. Кроме того, способность образовывать синцитии в этой клеточной системе служит одним из неблагоприятных прогностических критериев для дальнейшего хода инфекционного процесса в организме пациента (Grunow et al., 1993, Fenyo, 1996). 3 • 105 клеток MT2 сокультивировали с 1 • 10'' МПК пациента. Визуальный контроль и накопление вирусных антигенов проводили в течение 21 суток после сокультивации. Изолят обозначали как синцитийобразующий (SI), если в течение срока наблюдения в нем детектировался р24 и развивались синцитии диаметром 3 и более клеток. При отсутствии многоядерных образований в культуре изолят считали несин-цитийобразующим (NSI). Сопоставляя способность реплицироваться в различных Т-клеточных линиях, максимальное значение р24 и время его накопления, а также S]/NS [-способность, мы определяли фенотип каждого изолированного вируса. Если репликация ВИЧ-1 регистрировалась в МПК и во всех использованных Т-клегочных линиях, фенотип изолята определяли как rapid/high. Если

репликация вирусного иэолята не наблюдалась в большинстве клеточных линий, то фенотип изолята определяли как blow/low (WHO Network for Isolation and Characterization, 1994). Полученные результаты представлены в таблице 9.

Таблица 9. Репликативная активность цзолятов ВИЧ-1 и их биологический

фенотип.

Код изолята шах р24 время накопления Биологический фенотип

в супере (нг/мл) шах р24 (сутки) SI/NSI г/h/ s/1

PKVR-53 0.370 19 NSI s/1

PKVR-193 0.620 12 NSI s/1

PSNM-55 1.200 15 NSI s/1

PSST-29 0.930 91 NSI r/h

PSST-86 0.430 14 NSI s/1

PSRL-128 0.740 12 SI s/1

СВ1-22 1.128 5 SI r/h

СВ2-216 1.520 3 SI r/h

PDRN-100 1.500 19 NSI s/1

PSMV-112 1.400 H NSI s/1

PSMV-165 0.850 9 NSI s/1

PKLN-95 0.700 5 SI s/1

PKLN-178 0.980 7 SI r/h

GR1-56 1.500 7 SI r/h

GR2-59 1.340 5 SI r/h

PMSL-20 0.670 14 SI s/1

PMSL-75 0.750 19 NSI s/1

PMSL-225 1.320 9 SI r/h

PNDN-52 0.730 9 NSI s/1

PNDN-209 1.230 6 NSI r/h

PLMN-24 0.800 13 SI s/1

PLMN-50 1.110 5 SI r/h

PLMN-198 0.450 12 SI s/1

PLMN-204 0.520 7 NSI s/1

PKKR-13 0.930 12 SI r/h

PKKR-32 0.800 14 SI r/h

PKKR-54 1.520 5' SI r/h

PKKR-172 0.700 7 NSI r/h

PKKR-192 0.620 6 NSI r/h

PKKR-208 0.-550 6 NSI r/h

Нами изолировано 15 вариантов ВИЧ-1, обладающих фенотипом rapid/high. Изоляты получены от пациентов на стадии, не ранее чем ВЗ. И^ них 9 вирусов являются синцитийобразующимн. Кроме того, сравнивая количество SI и NSI вариантов на стадиях А2, В2, ВЗ, С2 и СЗ, мы сделали заключение, что на стадии ВЗ в основном изолируются вирусы с SI-фенотипом, что не противоречит данным, полученным ранее (Schuitemaker et al., 1992; Fouchier and Schuitemaker, 1996). На более ранних стадиях заболевания А2, В2 преимущественно изолируются NSI-варианты ВИЧ-1 (таблица 10). Вместе с тем, на поздних стадиях кроме SI-вариантрв могут также присутствовать NSI-вирусы. Более высокий уровень экспрессии р24 регистрируется для rapid/high вариантов ВИЧ-1 с SI-фенотипом.

Не для всех SI-вариантов характерно быстрое достижение пика репликации: 6 из 15 изолятов, определенных как SI, выходят на максимальную продукцию вируса только через 12-14 суток после заражения. Синцитийобразующие варианты ВИЧ-1 индуцируют значительную гибель CD4 - клеток в синцитиях in vivo (Levy, 1993), а за счет fusion-способности, позволяющей лизировать клеточные мембраны, расширяется диапазон инфицируемых клеток, увеличивается общая зараженность организма (Fouchier and Schuitemaker, 1996). Появление SI-вирусов означает быструю прогрессию к СПИД, а значит малый срок жизни. Поэтому, определение SI/NSI - фенотипа вирусного изолята in vitro дает возможность не только сделать прогноз дальнейшего течения болезни, но и правильно подобрать пациенту соответствующее лечение.

Таблица 10. Репликативная активность изолятов ВИЧ-1 в Т-клеточных линиях в зависимости от стадии заболевания.

Стадия Общее NSI-изоляты SI-изоляты

инфекции Число время достиж. Р 24, время достиж. Р 24,

изолятов пика р24 (нг/мл) пика р24 (нг/мл)

9 0.73 5 1.11

В2 6 12 0.62 13 0.80

(4NSI + 14 0.67

2SI) 19 0.37

7 0.52 5 1.52

9 0.85 6 1.23

ВЗ 12 14 0.75 9 1.32

(4NSI+- 19 0.43 9 0.95

8SI) 12 0.93

14 0.80

14 1.40

15 1.20

7 0.70

С2 2 12 0.45

(2NSI)

5 0.70

6 0.55 7 0.98

СЗ 5 6 0.62

(4NSI+ 12 0.74

1SI)

2.3. Изучение чувствительности изолятов В^Ч-1 к азидотимидину.

Следующим этапом нашей работы было изучение чувствительности изолированных вариантов ВИЧ-1 к азидотимидину. Представлялось интересным сопоставить реплнкативные свойства "диких" вирусов и их восприимчивость к

АЗТ.

Цля исследования чувствительности к АЗТ 5 • 104 клеток СЕМ-БВ/лупку инкубировали с различными концентрациями АЗТ: 0.01, 0.1, 1, 10, 100 мкМ в течение 2 часов в 96-луночных панелях. Затем вносили 20 мкл вирусного стока каждого иэ полученных изодятов, полученного как описано выше. За развитием инфекции наблюдали в течение 4 суток и определяли продукцию антигенов ВИЧ-1 методом ИФА. Проводили расчет Ю-,о с помощью линейной логарифмической

интерполяции. Изолят считали устойчивым к АЗТ, если Ю50 находилась в диапазоне 0.2-50 мкМ (ШсЬшапп, 1995). В качестве контроля использовали референс-штаммы ВИЧ-1 Н9лр и СЕМ^-Ь чувствительные к данному соединению. Для части изолятов результаты расчетов представлены в таблице 11.

Таблица 11. АЗТ-чувствительность ВИЧ-1 - изолятов в клеточных линиях.

Код изолята Ш50, мкМ Время приема Фенотип в Чувствительность

АЗТ (месяцы) МТ2 к АЗТ

PKVR-53 0.05 0 NSI S

PKVR-193 1.0 0 NSI R

PSST-29 >20.0 0 NSI R

PSST-86 10.0 0 NSI R

СВ1-22 >20.0 24 SI R

СВ2-216 >20.0 24 SI R

PKLN-95 3.0 12 SI R

PKLN-178 4.0 14 SI R

GR2-59 >20.0 12 SI R

PMSL-75 0.10 0 NSI S

PMSL-225 7.50 12 SI R

PNDN-52 0.05 0 NSI S

PNDN-209 5.0 4 NSI R

PKKR-32 5.50 15 SI R

PKKR-54 7.50 15 SI R

PKKR-192 10.0 18 NSI R

PKKR-208 0.5 18 NSI R

синцитийобразующий несинцитийобразующий резистентен к АЗТ чувствителен к АЗТ

Интересны следующие данные. Из 30 изолятов ВИЧ-1 22 проявляют устойчивость к АЗТ в культуре клетор. Причем 3 АЗТ-устойчивых изолята получены от пациентов, никогда не получавших азидогимидин. Этот факт, возможно, имеет разные объяснения. Во-первых, возможно, инфицирование пациента произошло уже устойчивым к АЗТ штаммом вируса. Во-вторых, схема изоляции вирусных вариантов с определенным порогом устойчивости к АЗТ позволяет предположить, что в популяции вирусов, циркулирующих в одном организме, уже существуют резистентные к АЗТ квазивиды.

Изоляты СВ1-22, CJ32-216, GR2-59 характеризуются SI - rapid/high - фенотипом, причем все три проявляют устойчивость к АЗТ. Пациенты GBl и СВ2 получали АЗТ-терапию в течение 2-х лет, пациент GR2 - 1 год. Биологические свойства этих изолятов не соответствуют положению о том, что АЗТ-резистентные варианты ВИЧ-1 являются слабо-реплинирующимнор. Полученные нами результаты подтверждаются отдельными находками, о которых сообщалось в литературе (Fouchier and Schuitemaker, 1996). Однако механизм этого явления достоверно неизвестен. Ранее было выдвинуто предположение (Карамов, 1994), что мутации в гене pol ВИЧ-1 могут быть компенсированы мутациями в гене enu, а это, в свою очередь, приводит к активной репродукции вируса.

Корреляция между ВИЧ-1 - фенотипом и стадией инфекции предполагает, что фенотипическая вариабельность ВИЧ-1 играет важную роль в патоге-

"57"

„ "NSI"

примечания: „п„ К

"S"

незе СПИДа. На ранних аснмптоматическнх стадиях ВИЧ-инфекции изолируются макрофаготропные, slow/low, NSI-варианты вируса. Приблизительно у 50% ВИЧ-инфицированных в течение инфекции развивается rapid/high SI - фенотип вируса (Koot et al., 1992), тропного к Т-клеткам. Полученные нами данные подтверждают это положение. Однако результаты наших исследований также свидетельствуют о возможности изоляции на поздних стадиях ВИЧ-инфекции NSI-вирусов, которые активно реплицируются в МПК и линиях Т-клеток т vitro, о чем свидетельствует значительное количество р24-антигена при коротком сроке культивирования. Появление SI-вариантов означает быструю прогрессию к СПИД, а значит малый срок жизни. В связи с этим, особое значение приобретает выработка правильной стратегии лечения каждого пациента. Возникновение или утрата резистентности к применяемым средствам противовирусной терапии, определяемое накоплением вирусов с определенными мутациями, влияют на скорость и течение инфекционного процесса.

3. Исследование комбинации азидотимидина и гидроксимочевины или ее аналогов на репликацию АЗТ-устойчивых вариантов ВИЧ-1.

С целью поиска эффективных комбинаций, подавляющих репродукцию ВИЧ-1, использовали препарат Ну d rea ("Wellcome") - гидроксимочевину. Также была исследована группа аналогов мочевины, вещества SPT 1-5, полученные из НИИ проблем онкологии им. Н.Н. Петрова г. Санкт-Петербурга.

Мы изучали сочетанное влияние гидроксимочевины (или ее аналогов) и азидотимидина на анти-ВИЧ активность АЗТ-устоПчицых изолятов ВИЧ-1 в культуре клеток. Выбор азидотцмидина объясняется тем, что его мишенью является процесс обратной транскрипции вируса. Механизм действия гидроксимочевины (HU) состоит в подавлении клеточного фермента рибонуклеотидредуктазы - медиатора трансформации 4-ех рибонуклеотидов в дезоксирибоцуклеотиды. Мы предполагали подобный механизм действия и для аналогов гидроксимочевины. Таким образом, выбирая АЗТ и HU, мы предусматривали воздействие не только на вирус, но и на клетку-мишень.

Были выбраны клеточная модель Sup Ti, устойчивые к АЗТ изоляты ВИЧ-1 СВ1-22 и СВ2-216 (ГО50 > 20 мкМ), а также CEMLA/ - референс-штамм ВИЧ-1, который характеризуется как чувствительный к АЗТ. Для АЗТ применялись концентрации от 0.01 мкМ до 100 мкМ. Гидроксимочевина и ее аналоги использовались в концентрациях от 0.01 до 100 мкг/мл.

Изучая токсичность как отдельных веществ, так и их комбинаций на Т-лимфобластоидных клетках, мы определили, что CD50 (50% цитотоксическая доза) для гидроксимочевины составила 77 мкг/мл, CD50 для аналогов гидроксимочевины находилась в диапазоне от 25 до 50 мкг/мл, для АЗТ эта величина составила 150 мкМ; вещества группы SPT в концентрации 10 мкг/мл при 100 мкМ АЗТ не вызывали гибели, превышающей значение клеточного контроля; при 100 мкМ АЗТ и 10 мкг/мл HU гибель клеток составила 20% от клеточного контроля. Поэтому для изучения влияния комбинации A3f и гидроксимочевины или ее аналогов на репродукцию АЗТ-резистентных изолятов были выбраны концентрации: для АЗТ - 0.01, 0.1, 1, 10, 100 мкМ; для HU и ее аналогов - 0.01, 0.1, 1, 10 мкг/мл.

Клетки Sup Ti подвергали двухчасовой инкубации с препаратами, после чего инокулировали вирусными стоками изолятов СВ1-22, СВ2-216 и культуральным супернатантом штамма СЕМ^д/ (1000 ТСГО50/ 500мкл). В течение 5-и суток наблюдали развитие инфекции, после чего продукцию вирусных антигенов определяли методами количественной ДНК-ПЦР, fHIÍ -RT/ПЦР, ИФА (р24).

Применение гидрокснмочевины в сочетании с АЗТ позволило значительно снизить репродукцию ВИЧ-1 in vitro. Наблюдается синергизм действия АЗТ и гидрокснмочевины. По данным ИФА даже при сочетании малых концентрациий двух веществ (0.01 мкг/мл HU и 0.01 мкМ АЗТ) не регистрируется продукции вирусного белка р24 (сигнал на уровне клеточного контроля), однако каждое из веществ в отдельности не обладает ярко выраженной анти-ВИЧ активностью. Результаты ДНК-ПЦР регистрируют дозозависимый характер изменения лро-вирусной ДНК ВИЧ-1.

Рис. 1. Синергичное подавление репродукции АЗТ-устойчивого изолята ВИЧ-1 СВ2-216 комбинацией препаратов гидрокснмочевины и АЗТ.

На рис. 1 представлена диаграмма, иллюстрирующая снижение содержания ДНК ВИЧ-1 для изолята СВ2-216 при использовании комбинации гидрокснмочевины от 10 до 0.01 мкг/мл и АЗТ от 100 до 1 мкМ. Так при использовании 10 мкг/мл гидроксимочевины и 100 мкМ АЗТ синтез вирусной ДНК падает с 431 копии на клетку до 1.4 копии на клетку. При использовании 0.01 мкМ АЗТ эффективность репликации ВИЧ-1 снижается до 6 копий на клетку. Необходимо отметить, что для изолята СВ2-216 использование только 10 мк!Ц АЗТ лишь на порядок снижает содержание ДНК ВИЧ-1 (431 копии ВИЧ на клетку в контроле инфекции и 28 копии ВИЧ на клетку при применении 10 мкМ АЗТ). Используя 1 мкг/мл гидроксимочевины при этой же концентрации АЗТ, удается снизить содержание провируса на три порядка в сравнении с контролем инфекции (1.9 копии на клетку) и на два порядка в сравнении с 10 мкМ АЗТ.

Из 5-ти соединений группы ЭРТ в изучаемой комбинации активным оказалось только одно - ЗРТ-5. Для этого вещества и АЗТ также характерен синергизм в подавлении репродукции ВИЧ-1. Это вещество в сочетании с АЗТ активнее, чем гидроксимочевина в сочетании с АЗТ. Изменение ДНК ВИЧ также носит дозозависимый характер. Применение 0.01 мкг/мл этого соединения вместе с 10 мкМ азидотимидина снижает синтез ДНК ВИЧ-1 для изолята СВ2-216 на четыре порядка в сравнении с контролем инфекции (0.5 копии на клетку). Даже при 0.1 мкМ АЗТ при 0.01 мкг/мл БРТ-5 количество провирусных копий составляет лишь 4.4 на клерку.

Для СВ1-22 АЗТ-устойчивого изолята наблюдаются такие же закономерности, а именно снижение синтеза ВИЧ-1 ДНК на клетку при использовании комбинации АЗТ и ЭРТ-5, АЗТ и гидроксимочевины. При контроле инфекции в 286

копий ВИЧ-1 на клетку даже малые концентрации двух веществ 0.01 мкг/мл SPT-5 и 0.1 мкМ АЗТ вызывают подавление репликации ВИЧ-1 до 1.2 копии на клетку (при том, что 1Q мкМ АЗТ снижают этот показатель лишь до 36 копий). Комбинация гидроксимочевины и АЗТ и для этого изолятз оказалась весьма эффективной, однако в Меньшей степени, чем предыдущая (0.1 мкМ АЗТ и 0.01 мкг/мл гидроксимочевины приводят к 2.2 копиям ВИЧ-1 на клетку).

Синергичное подавление репродукции ВИЧ-1 комбинациями АЗТ и гидроксимочевины, АЗТ и соединения SPT-5 наблюдалось и в случае АЗТ-чувствительного штамма С ЕМ Было установлено, что обе комбинации проявляет большую активность в подавлении репликации ВИЧ-1, чем применение только одного азидотимидина. При контроле инфекции 288 копий ВИЧ-1 на клетку, применение 10 мкМ АЗТ оставляет 4.8 копии ВИЧ на клетку, Такое же количество провирусных копий наблюдается в случае использования 0.1 мкМ АЗТ и 0.01 мкг/мл гидроксимочевины или соединения SPT-5. Даже для чувствительного варианта ВИЧ-1 возможно снижение концентрации АЗТ на два порядка.

Исследования комбинаций гидроксимочевины с другими анти-ВИЧ агентами уже предпринимались несколькими группами исследователей (Lori et al., 1994; Malley et al., 1994). Группа исследователей из центра Л. Бернара сообщила, что применение гидроксимочевины и ddl вызывало полное подавление вирусной продукции в активированных Т-лимфоцитах, чего не наблюдалось для комбинаций гидроксимочевины и АЗТ, гидроксимочевины и ddC. Группа Галло (Lori et al. 1994) представила данные, что, напротив, в митогенстимулированных Т-лимфоцитах наблюдается эффект синергичного подавления репликации ВИЧ-1 ddl и гидроксимочевины, также как АЗТ и гидроксимочевины. В макрофагах, по их мнению, такой эффект достигается при меньших концентрациях гидроксимочевины. Однако четких рекомендаций по той или иной комбинированной схеме терапии так и не сформулировано.

Наши результаты позволяют сказать, что эффект синергичного действия гидроксимочевины и АЗТ наблюдается и в Т-лимфоцитах, и в макрофагах (были использованы изоляты СВ2-216 и СВ1-22 в культуре клеток ТНР-1, данные не представлены) при одинаковых концентрациях. Но наиболее интересным результатом, на наш взгляд, является тот факт, что эта комбинация позволяет более полно ннгибировать репродукцию АЗТ-устойчивых вариантов ВИЧ-1 при низких концентрациях АЗТ, что является немаловажным для снижения токсичности этого препарата. Оба использованных в экспериментах изолята характеризуются не только высокой устойчивостью к АЗТ, но и SI-фенотипом, для которого, как установлено, АЗТ-терапия малоэффективна. Наши данные демонстрируют возможность препятствовать репликации SI-вариантов ВИЧ-1. Содержание ДНК ВИЧ-1, определенное методом количественной ПЦР, коррелирует с вирусологическими параметрами (ИФА, р24). Кроме того, найдена оригинальная комбинация препаратов, обладающая выраженной анти-ВИЧ активностью, в том числе и для АЗТ-резистентпых изолятов с SI-фенотипом.

Таким образом, привлекая для комбинированной терапии препараты, способные воздействовать как на различные процессы вирусной репликации, так и на саму клетку-мишень, возможно добиться прогресса в подавлении репликации ВИЧ, а следовательно, в лечении ВИЧ-инфекции.

выводы.

1. Получены уникальные клоны СЕМ-К перепиваемой Т-клеточной линии человека СЕМ, устойчивые к заражению ВИЧ-1.

2. Расшифрован механизм устойчивости клеток СЕМ-К к ВИЧ-1 - отсутствие С04-антигена - поверхностного маркера лимфоцитов человека, главного рецептора для ВИЧ.

3. Установлено, что вирус, полученный путем трансфекции (электропора-ции) CD4-- клеток СЕМ-К полноразмерным геномом ВИЧ-1, содержащимся в плазмиде HXB2D, не обладает новым фенотипом, идентичен исходному штамму ВИЧ-1 и остается тройным к CD4+- клеткам.

Получено 22 АЗТ-резистентных изолята ВИЧ-1, 14 из которых являются активнореплицирующимися (rapid/high). 4 изолята проявляют высокую устойчивость к АЗТ (ID50 свыше 20 мкМ).

5. Показано, что комбинация АЗТ с ингибиторами клеточного фермента рнбонуклеотидредуктазы (гидроксимочевиной и ее аналогами) подавляет репликацию ВИЧ-1 в культуре клеток. Эта комбинация эффективна для АЗТ-устоцчнвых вариантов вируса in vitro.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Verification of the MTT-assay model for the detection of anti-HIV compounds. ShchplkanovM.Yu., PashkovaT.A., Lukashov V.V., Kornilayeva G.V., Karamov E.V. Program and abstracts of 2-nd international conference "AIDS, Cancer and Нцтап Retroviruses", St.-Peterburg, Russia, November 29-December 3, 1993, p. 37.

2. Combinatory action of ribavirine and 5'-phosphates of modified nucleosides. Pashkova T.A., Lukashov V.V., Krayevsky A.A., Karamov E.V. Program and abstracts of 2-nd international conference " AIDS, Cancer and Human Retroviruses", St.-Peterburg, Russia, November 29-December 3, 1993, p. 40,

3. Chromosopie rearrangements in the cells with different sensitivity to HIV-I, Kushch A.A., Glukhova L.A., Grabovskaya I.L., Pashkova T.A., Karamov E.V. Program and abstracts of 2-nd international conference "AIDS, Cancer and Human Retroviruses", St.-Peterburg, Russia, November 29-December 3, 1993, p. 41.

4. Mathematical analysis of cell death dynamics during HIV-infection in situ. ShchelkanovM.Yu., PashkovaT.A., Kornilayeva G.V., Lukashov V.V., Karamov E.V. Baltic against AIDS, St-Petersburg, March 1-4, 1994, Abstract book, p. 20.

5. Phenotyping of HIV-isoIates by the evaluation of cell death parameters during acute infection in situ. Kornilayeva G.V., Shchelkanov M.Yu., Pashkova T.A., Karamov E.V. Baltic against AIDS, St-Petersburg, March 1-4, 1994, Abstract book, p. 14.

6. Cell sensitivity to HIV and change in their karyotype. Kushch A.A., Grabovskaya I.L., Pashkova T.A., Karamov E.V. Tenth International conference on AIDS, Yokohama, Japan, 7-12 August, 1994, PA 0015, Abstract book, v.l, p.99.

7. Characteristics of the cell clone resistant to HIV-infection, Pashkova T.A., Baryshnikov A.Yu., Sedyakina N.P., Kushch A.A., Serov S.M., Karasyeva N.G., Grabovskaya I.L., Karamov E.V. 3-rd International conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St-Petersburg, Russia, May 22-26, 1995, Book of abstracts, p. 29.

8. Search ofnew inhibitors of HIV-1 reverse transcriptase. PashkovaT.A., Sahibov A.D., Kornilayeva G.V., Karamov E.V. 3-rd International conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St-Petersburg, Russia, May 22-26, 1995, Book of abstracts, p. 75.

9. Anti-HIV-activity of some piperidine derivatives. Pashkova T.A., Shchelkanov M.Yu., Karamov E.V., Grishina G.V., Smolensky E.A., Nosov K.S., Chumakov T.I., Zefirov N.P. 3-rd International conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St-Petersburg, Russia, May 22-26, 1995, Book of abstracts, p. 76.

10. A choice of individual chemotherapy based on the model of patient PBMC in vitro, Sakhuria I.B., Shchelkanov M.Yu., Papuasfivili M.N., Abelian A.V., Pashkova T.A., Karamov E.V. 3-rd International Conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St-Petersburg, Russia, May 22-26, 1995, Book of abstracts, p. 64.

Ц. Optimization of the MTT-based assat for screening of the anti-HIV compounds. Shchelkanov M.Yu., Yudin A.N., Sakhuria I.R., Poliakova E.B., Pashkova T.A., Karamov E.V. 3-rd International conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St-Petersburg, Russia, May 22-26, 1995, Book of abstracts, p. 74.

12. HIV-1 AZT-resistance should take into account the cell metabolism. Pashkova T.A., Sakhuria I.B., Kornilayeva G.V., Shchelkanov M.Yu., Karamov E.V. 4-th International conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St-Petersburg, Russia, May 21-25, 1996, Book of Abstract, p. 81.

13. The collection of AZT-resistant HIV-1 strains. Pashkova T.A., Kornilayeva G.V., Papuashvili M.N., Shchelkanov M.Yu., Abelian A.V., Yaroslavtseva N.G., Karamov E.V. 4-th International conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St-Petersburg, Russia, May 21-25, 1996, Book of Abstract, p. 104.

14. Cell models for the investigation of CD4-independent HIV virus entry. Pashjcova T.A., Revazova E.S., Baryshnikov A.Yu., Karamov E.V. 4-th International conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St-Petersburg, Russia, May 21-25, 1996, Book of Abstract, p. 107.

15. Assessment of HIV-inhibitors combination upon AZT-resistatit HIV-1 strains replication by quantitative PCR. Kozlova A.V., Pashkova T.A., Abelian A.V., Kornilayeva G.V., Yolov A.A., Kozlov A.P., Karamov E.V. 4-th International conference "AIDS, Cancer and Related Problems" St-fetersburg, Russia, May 21-25, 1996, Book of Abstract, p. 74.

16. Susceptible cells become resistant to HIV infection. Pashkova T.A., Serov S.M., Revazova E.S., Baryshnikov A.Yu., Kushcl? A.A., Karamov E.V. X-th International Congress of virology, Jerusalem, Israel, 11-16 August, 1996, Book of Abstract, p. 136.

17. Phenotyping studies of HIV-1 variants isolated in Russia. Pashkova T.A., Yaroslavtseva N.G., Kornilayeva G.V., Sakhuria I.В., Shchelkanov M.Yu.,' Karapnov E.V. I-st International conference on AIDS of the Мог Kaposhi Research Foundation, Budapest, Hungary, 25-28 August, 1996, Book of abstracts, p. 54.

18. Грибкова H.B., Еремин В.Ф., Вотяков В.И., Щелканов М.Ю., Пашкова Т.А., Карамов Э.В. Подавление репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) ннтокпноподобным антивирусным фактором. Журнал микробиологии, эпидемиологии!!, иммунологи^ - 1996. - N5, стр. 27-29.

19. Клон долгоживущих лимфобластоидных клеток с гиперэкспрессией СР95-антигена. Пашкова Т.А., Ревазова Е.С., Барышников А.Ю., Полосухина Е.Р., Карамов Э.В. Материалы 1-го Съезда онкологов стран СНГ, 3-6 декабря 1996, Москва, Россия, стр. 175.