Количественные и качественные характеристики субпопуляций ВИЧ в крови и спинномозговой жидкости

Дементьева, Наталья Евгеньевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Количественные и качественные характеристики субпопуляций ВИЧ в крови и спинномозговой жидкости
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Количественные и качественные характеристики субпопуляций ВИЧ в крови и спинномозговой жидкости"

На правах рукописи

ДЕМЕНТЬЕВА Наталья Евгеньевна

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ И КАЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ СУБПОПУЛЯЦИЙ ВИЧ В КРОВИ И СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ

03.02.02 - вирусология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 4 АПР 2014 005547615

Санкт-Петербург 2014

005547615

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СевероЗападного отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

академик РАН, доктор медицинских наук, профессор Николай Алексеевич Беляков

Научный консультант:

доктор биологических наук Марина Ридовна Бобкова

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, руководитель отдела лабораторной диагностики ГБУЗ «Научно-исследовательского института скорой помощи им. Н.В.Склифосовского департамента здравоохранения города Москвы» Михаил Андреевич Годков

доктор биологических наук, руководитель лаборатории ассоциированных инфекций (с группой по изучению возбудителя СПИД) ФГБУ «Научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи» МЗ РФ Галина Генриховна Миллер

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации

Защита диссертации состоится » часов на

заседании Диссертационного совета Д 208.131.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздрава Российской Федерации по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, д. 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздрава РФ (123098, Москва, ул. Гамалеи,

Автореферат разослан «

Г2 »

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор медицинских наук Елена Ивановна Бурцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Вирусная популяция в инфицированном организме генетически гетерогенна, что является следствием естественных мутационных процессов, существования гистогематических барьеров и селективного давления противовирусных препаратов (Бобкова М.Р., 2010, Alexaki A. et al., 2008). При исследовании разных биологических материалов, полученных у одного и того же пациента, могут быть обнаружены локальное увеличение вирусной нагрузки ВИЧ в тканях, а также различный спектр мутаций генома ВИЧ (Caragounis Е.С. et al., 2008, Cunningham Р.Н. et al., 2000, Lambert-Niclot S. et al., 2012, Cu-Uvin S. et al., 2010).

Центральная нервная система (ЦНС) - один из наиболее объемных и клинически значимых резервуаров ВИЧ в инфицированном организме. Гематоэнцефалический барьер препятствует не только свободному переходу ВИЧ из крови в ткани ЦНС и обратно, но и затрудняет проникновение лекарственных препаратов (Letendre S. et al., 2008). Несмотря на широкое применение антиретровирусной терапии, распространенность нейрокогнитивных расстройств средней и легкой степени остается высокой, достигая уровня 50% и более (Patel К. et al, 2009, Heaton R.K. et al., 2011, Simioni S. Et al., 2010). На фоне антиретровирусной терапии и супрессии ВИЧ в крови часто наблюдается длительное сохранение у больных неврологических нарушений. В настоящее время не существует алгоритма лабораторной диагностики ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС и мониторинга вирусологической эффективности антиретровирусной терапии в тканях ЦНС.

Таким образом, изучение генетических особенностей вируса и оценка его количества в различных биологических субстратах является важной составляющей исследования патогенетических механизмов развития ВИЧ-инфекции и эволюции вируса в инфицированном организме, а также способствует созданию более эффективных методов диагностики и лечения ВИЧ-инфекции.

Состояние научной разработанности проблемы. В мировой научной литературе встречаются результаты исследований, направленных на изучение особенностей репликации ВИЧ в клетках ЦНС и патогенеза ВИЧ-ассоциированных нейрокогнитивных расстройств, однако полученные разными научными группами результаты значительно различаются. В России подобные исследования не проводили, а зарубежные исследования выполнялись с

использованием биологических образцов пациентов, инфицированных субтипами ВИЧ, не получившими в России широкого распространения.

Клиническая информативность вирусологических исследований СМЖ для оценки степени тяжести ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС до сих пор не доказана. В мире не существует зарегистрированных тест-систем для оценки вирусной нагрузки и профиля лекарственной устойчивости ВИЧ в СМЖ, и эти методы диагностики не применяются в клинической практике.

Цель исследования. Провести сравнительный анализ и оценить клинико-диагностическое значение определения уровня вирусной нагрузки и исследования генотипа ВИЧ в парных образцах спинномозговой жидкости и крови у больных ВИЧ-инфекцией.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ уровня вирусной нагрузки в парных образцах плазмы крови и СМЖ и оценить взаимосвязь количества ВИЧ в СМЖ и содержания С04+-лимфоцитов в крови.

2. Проанализировать взаимосвязь между субтипом ВИЧ, содержанием CD4+-лимфоцитов в крови, уровнем вирусной нагрузки в крови и СМЖ и наличием признаков ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС.

3. Выполнить сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена pol ВИЧ, полученных в результате генотипирования ВИЧ в парных образцах крови и СМЖ.

4. Оценить клинико-диагностическое значение определения уровня вирусной нагрузки и тестирования лекарственной устойчивости ВИЧ в образцах СМЖ у больных ВИЧ-инфекцией.

Объект исследования. Исследование посвящено изучению вирусологических аспектов патогенеза ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС, а также разработке новых диагностических подходов для оценки степени поражения ЦНС при ВИЧ-инфекции и вирусологической эффективности антиретровирусной терапии.

Предмет исследования. Основные результаты получены при исследовании вирусной нагрузки и нуклеотидной последовательности гена pol ВИЧ в образцах плазмы крови и СМЖ, количества С04+-лимфоцитов в крови ВИЧ-инфицированных пациентов. В процессе анализа учитывалась клиническая оценка состояния функций ЦНС у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Теоретические и методологические основы исследования. В основу научно-квалификационного исследования легли вопросы вирусологии, патологической физиологии, лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции. В процессе работы применялись общенаучные и специальные методы исследования (методы клинической и лабораторной медицинской диагностики, эпидемиологические методы). Для анализа значимости выявленных закономерностей применялись современные статистические методы оценки.

Информационная база исследования. В качестве информационных источников использовали научные публикации российских и зарубежных исследователей, материалы конференций, нормативные документы, инструкции к

использованным в работе тест-системам, данные клинической документации, собственные результаты исследований.

Основные научные результаты исследования, полученные лично автором. Автор участвовал в сборе материала, самостоятельно проводил молекулярно-биологические исследования биологических образцов, анализ архивной и клинической документации, статистическую обработку и интерпретацию полученных результатов, подготовку и публикацию материалов.

Впервые проведены исследования уровня вирусной нагрузки и генотипирование ВИЧ в образцах СМЖ в большой выборке пациентов, инфицированных характерным для России ВИЧ субтипа А1.

Обнаружены ранее неизвестные особенности (соотношение вирусной нагрузки и генетические различия ВИЧ в крови и СМЖ, количество ВИЧ в СМЖ при наличии ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС), характеризующие количественные и качественные различия субпопуляций ВИЧ в двух биологических жидкостях инфицированного организма.

Обоснована возможность и целесообразность применения молекулярно-биологических исследований образцов спинномозговой жидкости для подтверждающей диагностики ВИЧ-обусловленных поражений центральной нервной системы и определения профиля лекарственной устойчивости ВИЧ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Между концентрацией ВИЧ в СМЖ и крови обнаружена корреляционная связь слабой силы (г=0,3, р<0,01). У пациентов, не принимавших антиретровирусных препаратов, вирусная нагрузка ВИЧ в СМЖ ниже, чем в крови, в среднем на 1,5 1§ копий РНК/мл (р<0,01). У нелеченых больных с клиническими признаками поражения ЦНС уровень вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ в среднем на 1,4 ^ копий РНК/мл выше, чем у пациентов без нарушения функций ЦНС, при этом разница между концентрацией ВИЧ в крови и СМЖ составляет 0,8 и 1,9 ^ копий РНК/мл соответственно (р<0,0001).

2. У пациентов, не принимавших антиретровирусные препараты, количество ВИЧ в СМЖ, равное или превышающее 4,00 1§ копий РНК/мл, свидетельствует о высокой вероятности наличия ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС (р<0,0001). Определение вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ рекомендуется применять для лабораторной диагностики ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС.

3. Обнаружена генетическая дивергенция и, в ряде случаев, несовпадение профилей лекарственной устойчивости субпопуляций ВИЧ, циркулирующих в СМЖ и крови. Определение профиля лекарственной устойчивости ВИЧ в СМЖ рекомендуется использовать для лабораторного мониторинга эффективности антиретровирусной терапии в ЦНС.

ряде случаев определение профиля лекарственной устойчивости ВИЧ только в образцах крови может быть недостаточно информативным, так как степень чувствительности ВИЧ к препаратам в СМЖ может отличаться от результата, полученного в крови. Полученные данные могут быть использованы для диагностики ВИЧ-ассоциированных поражений ЦНС и лабораторного мониторинга эффективности терапии ВИЧ-инфекции.

Апробация результатов исследования. Материалы работы были представлены на двух Международных симпозиумах «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2011, 2013 г.), региональной научно-практической конференции «Развитие службы ВИЧ/СПИДа. Современные подходы к профилактике, диагностике и лечению ВИЧ-инфекции» (Мурманск, 2011 г), Международном симпозиуме «Женщина, ребенок и ВИЧ» (Санкт-Петербург, 2011 г.), Научно-практической конференции III Виноградовские чтения «ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии -приверженность больных к лечению и фармакорезистентность ВИЧ» (Санкт-Петербург, 2011 г.), Международном конгрессе «Женщина, ребенок, ВИЧ» (Санкт-Петербург, 2012 г.), Юбилейной всероссийской научной конференции «Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые направления диагностики и профилактики болезней человека» (Санкт-Петербург, 2012 г.), Международном круглом столе «НейроСПИД - от минимальной когнитивной дисфункции до грубых структурных изменений» (Санкт-Петербург, 2013 г.).

Полученные результаты внедрены в практическую диагностику ВИЧ-ассоциированных поражений ЦНС в Санкт-Петербургском Центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, а также включены в учебный курс «ВИЧ-медицина» СПбГМУ им. И.П.Павлова.

Публикации по теме диссертации. По результатам исследования опубликовано 18 печатных работ, из них 9 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК. Материалы исследования были использованы при подготовке двух руководств для врачей: «ВИЧ-медицина» (СПб, 2010 г.) и «Женщина, ребенок и ВИЧ» (СПб, 2012 г.)

Структура и содержание диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка использованной литературы. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста, текст иллюстрирован 10 таблицами и 12 рисунками. В списке литературы приведены 272 источника, из них 38 отечественных и 234 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Отбор больных производился методом спонтанной выборки среди ВИЧ-инфицированных пациентов, пришедших на прием в Санкт-Петербургский Центр СПИД. Основным лимитирующим фактором было согласие пациента на

проведение спинномозгового пунктирования. Критериями исключения являлись возраст менее 18 лет и старше 60 лет, черепно-мозговые травмы и психические расстройства в анамнезе, признаки органического заболевания ЦНС, текущая зависимость от психоактивных веществ, острые соматические заболевания, беременность. Всего было получено 150 парных образцов крови и спинномозговой жидкости от 139 пациентов, из них 5 больных обследовались в динамике двукратно, 3 пациента - трехкратно.

Для оценки клинического статуса больных использовался комплекс диагностических методов: клинический осмотр врача-инфекциониста, врача-невролога, других специалистов, психологическое тестирование, лабораторные и инструментальные методы диагностики.

У 54 пациентов (39,1%) были выявлены клинические признаки ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС (энцефалит, менингоэнцефалит, энцефалопатия, судорожный синдром, мозжечковая атаксия, дистальная сенсорная полинейропатия, умеренное и выраженное снижение нейрокогнитивных функций при психологическом тестировании и др.). У 90% пациентов была диагностирована 4 стадия ВИЧ-инфекции, 75% больных до включения в исследование не принимали АРВП.

Парные образцы крови и СМЖ отбирали у пациентов одномоментно во время каждого визита. Всего было получено 150 парных образцов крови и СМЖ.

Определение вирусной нагрузки ВИЧ выполняли с использованием автоматизированного комплекса Abbott /я2000 RealTime System. Исследования проводили с помощью тест-систем Abbott RealTime HIV-1, предназначенных для анализа вирусной нагрузки ВИЧ в плазме крови. Исследование СМЖ проводили по такой же методике, как и для плазмы, так как химический состав и реологические свойства СМЖ позволяют использовать данную методику без дополнительной модификации. Чувствительность метода для плазмы крови составила 40 копий РНК/мл, линейный диапазон измерения от 40 копий РНК/мл (1,6 lg копий РНК/мл) до 10 млн. копий РНК/мл (7 lg копий РНК/мл). В связи с невозможностью получить достаточный объем образцов СМЖ для выполнения исследований с такой же высокой чувствительностью, количество ВИЧ в СМЖ определяли с чувствительностью 150 копий РНК/мл (2,2 lg копий РНК/мл) согласно инструкции по применению тест-системы Abbott RealTime HIV-1.

Определение нуклеотидной последовательности гена pol ВИЧ проводили с помощью системы генотипирования ViroSeq™ HIV-1 Genotyping System (Celera Diagnostics), предназначенной для анализа области генома ВИЧ, включающей ген протеазы (кодоны 1-99) и две трети гена обратной транскриптазы (кодоны 1-335). Детекцию нуклеотидной последовательности осуществляли на анализаторе молекул ДНК ABI Prism 3100-Avant.

Для анализа мутаций и получения заключения о профиле фармакорезистентности применяли программное обеспечение базы данных HIVdbProgram: SequenceAnalysis Стэнфордского университета (URL: http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra).

Субтипирование ВИЧ проводили с применением on-line программы Rega HIV-1 Subtyping Tool (URL: http://dbpartners.stanford.edu/RegaSubtyping). Для

оценки генетических дистанций между последовательностями и построения филогенетических деревьев с помощью метода ближайших соседей (neighbor-joining method) использовали программный пакет Mega 5.05. Референсные нуклеотидные последовательности субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ были получены с сайта базы данных ВИЧ Национальной лаборатории Лос-Аламоса (URL: http://www.hiv.lanl.gov/content/index). Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, полученных из парных образцов плазмы и СМЖ, выполняли с применением программы CLC Sequence Viewer (URL: http://www.clcbio.com/products/clc-sequence-viewer).

Оценку количества С04+-лимфоцитов в крови выполняли методом проточной цитофлюориметрии на проточном цитометре Becton Dickinson FACS Calibur с использованием реагента TriTEST CD3/CD4/CD45 в пробирках TruCount.

Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием программы SAS 9.3 (SAS Institute Inc., США). Различия признавали значимыми при критическом уровне вероятности принятия «нулевой гипотезы» р<0,05.

Результаты определения количества СБ4+-лимфоцитов, вирусной нагрузки и генотипирования ВИЧ при исследовании парных образцов крови и СМЖ

Результаты определения количества С04+-лимфоцитов в крови, концентрации ВИЧ в плазме крови и СМЖ удалось получить для всех 150 парных образцов, полученных у 139 пациентов (табл. 1).

Количество С04+-лимфоцитов в крови составляло от 1 клетки/мкл до 862 клеток/мкл. Концентрация ВИЧ в плазме крови колебалась от неопределяемой (ниже границы аналитической чувствительности теста) до 6,78 lg копий РНК/мл, в СМЖ - от неопределяемой до 6,08 lg копий РНК/мл.

Таблица 1

Средние величины исследуемых показателей у ВИЧ-инфицированных пациентов

(по данным первого визита)

Исследуемый показатель Среднее значение с 95% ДИ

Количество С04+-лимфоцитов в крови (клеток/мкл, п=139) 101 (71-133)

Уровень вирусной нагрузки ВИЧ в крови (1§ копий РНК/мл, п=139) 5,3 (5,1-5,4)

Уровень вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ (1й копий РНК/мл, п=139) 3,7 (3,5-4,0)

Количество однонуклеотидных замен при сравнении нуклеотидных последовательностей гена ро1 ВИЧ, выявленного в крови и СМЖ (п=105) 20(17-23)

Для определения субтипа ВИЧ проводили анализ полученных нуклеотидных последовательностей гена pol. Во всех случаях результаты определения субтипа в образцах крови и парных образцах СМЖ совпадали между собой. Из 133 обследованных пациентов, для которых удалось получить

нуклеотидную последовательность гена pol ВИЧ в крови и/или СМЖ, 88 0% (117) были инфицированы ВИЧ субтипа AI, 11,2% (15) - субтипа В и 0,8% (1) циркулирующей рекомбинантной формой CRF 06_срх.

Результаты проведенных исследований показали, что уровень вирусной нагрузки ВИЧ в спинномозговой жидкости варьирует в таком же широком диапазоне, как и в крови. Нуклеотидная последовательность гена pol ВИЧ характеризующая ВИЧ в СМЖ, имеет отличия (однонуклеотидные замены) от нуклеотидной последовательности вирусов, циркулирующих в крови.

Вирусная нагрузка ВИЧ в крови и СМЖ у пациентов, ранее не принимавших АРВП, и на фоне ВААРТ

Среди обследованных пациентов 21 принимали АРВП на момент участия в исследовании, 104 больных никогда ранее не принимали АРВП. Так как назначение ВААРТ приводит к супрессии репликации ВИЧ, был проведен сравнительный анализ содержания С04+-лимфоцитов и уровней вирусной нагрузки ВИЧ в плазме крови и СМЖ в группах пациентов с разным опытом приема ВААРТ (табл. 2).

Результаты исследования уровня вирусной нагрузки ВИЧ в крови и спинномозговой жидкости у пациентов до и на фоне ВААРТ показали, что прием антиретровирусных препаратов приводит к снижению количества вируса и в крови, и в СМЖ, однако динамика супрессии вирусов в этих биологических жидкостях значительно различается. У пациентов, принимающих ВААРТ, разница между показателями вирусной нагрузки ВИЧ в крови и СМЖ была значительно меньше, чем у нелеченых пациентов, достигая отрицательных значений в группе больных, принимающих препараты более полугода.

+ Таблица 2

показатели содержания CD4 -лимфоцитов в крови и концентрации ВИЧ в крови и

СМЖ в зависимости от опыта приема антиретровирусных препаратов (усеченные

средние величины с 95% ДИ, п=125)

Опыт приема АРВП

Никогда не принимали АРВП (п=104)

Начали ВААРТ (6-127 дней приема) (п=12)

Вирусная нагрузка ВИЧ в крови (lg копий РНК/мл)

5,4 (5,3-5,6)*

3,5 (2,8-4,2)*

Вирусная нагрузка ВИЧ в СМЖ (lg копий РНК/мл)

3,8 (3,5-4,0)

3,2(1,9-4,5)

Разница между

вирусной нагрузкой ВИЧ в крови и СМЖ (1§ копий РНК/мл)

1,5(1,3-1,8)*

0,4 (-0,3-1,0)*

Количество CD4+-лимфоцитов в

крови (клеток/мкл)

97 (58-136)

153(60-245)

Длительно принимают ВААРТ (более 199 дней) (п=9)_

1,6 (0,1-3,2)*

1,7 (0-3,4)**

-0,4 (-0,9-0,1)*

265 (150-380)**

статистически значимые различия между всеми группами (р<0,05, критерий Манна-Уитни)— статистически значимые различия между группой пациентов, длительно принимающих ВААРТ, и группами начинающих ВААРТ и никогда не принимавших АРВП (р<0 05 кпитспий Манна-Уитни) ' ' н 1

Анализ взаимосвязи между исследуемыми лабораторными показателями и клиническими характеристиками заболевания ВИЧ-инфекцией у пациентов, ранее не принимавших АРВП

Поскольку прием АРВП оказывает значительное влияние на уровень вирусной нагрузки, как в крови, так и в СМЖ, для дальнейшего статистического анализа были отобраны результаты, полученные у пациентов, не имевших опыта приема препаратов. Была обнаружена статистически значимая взаимосвязь между концентрацией ВИЧ в крови и количеством С04+-лимфоцитов и их корреляция со стадией и продолжительностью заболевания (р<0,05). Концентрация ВИЧ в СМЖ находилась в корреляции слабой степени с вирусной нагрузкой в крови (г=0,3, р<0,01) и не коррелировала с количеством С04т-лимфоцитов, продолжительностью заболевания и стадией ВИЧ-инфекции (р>0,05).

В группе пациентов, ранее не принимавших АРВП, вирусная нагрузка в крови колебалась от 2,7 до 6,8, составляя в среднем 5,4 ^ копий РНК/мл, в СМЖ - от неопределяемой до 6 копий РНК/мл, в среднем 3,8 1§ копий РНК/мл. В среднем в крови концентрация ВИЧ была выше на 1,5 1§ копий РНК/мл. Подъем вирусной нагрузки в крови на 1 1§ копий РНК/мл соответствовал росту концентрации ВИЧ в СМЖ только на 0,37 ^ (робастная регрессия, р=0,04).

Преобладание уровня вирусной нагрузки ВИЧ в крови над количеством ВИЧ в СМЖ было выявлено у большинства больных - 89,4% (93/104). Однако, среди этих пациентов у 26,9% (25/93) наблюдалось значительное превышение разницы между концентрацией ВИЧ в крови и СМЖ по сравнению со средним значением: более 2,5 1§ копий РНК/мл, вплоть до полного отсутствия вируса в СМЖ на фоне количества ВИЧ в крови более 4 копий РНК/мл. В этой группе пациентов только у одного (4%) были обнаружены признаки поражения ЦНС.

У остальных 10,6% (11/104) нелеченых пациентов количество вируса в СМЖ было равным или превышало вирусную нагрузку в крови. Из них 81,8% (9/11) принадлежали к когорте пациентов с неврологическими нарушениями.

Таким образом, у 35% больных были выявлены значительные отличия от среднего значения разницы между уровнями вирусной нагрузки ВИЧ в крови и СМЖ. Сокращение разницы между концентрацией ВИЧ в крови и СМЖ наблюдалось преимущественно у больных с клиническими признаками поражения ЦНС.

Анализ взаимосвязи между наличием ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС и субтипом ВИЧ, количеством СБ4+-лимфоцитов в крови, вирусной нагрузкой ВИЧ в крови и СМЖ

В целях изучения взаимосвязи результатов выполненных исследований с наличием у пациентов неврологических нарушений для дальнейшего статистического анализа были отобраны результаты, полученные у больных, не имевших опыта приема АРВП, чтобы исключить влияние терапии на уровень этих показателей (табл. 3).

Выполненный анализ показал, что наличие у пациентов клинических признаков поражения ЦНС было статистически значимо взаимосвязано с уровнем вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ (логистическая регрессия, р<0,0001) и не связано

с содержанием С04+-лимфоцитов, уровнем вирусной нагрузки ВИЧ в крови, субтипом ВИЧ (р>0,05). Концентрация ВИЧ в СМЖ у больных с неврологическими нарушениями была в среднем на 1,4 ^ копий РНК/мл выше, чем у пациентов без симптомов нарушения функций ЦНС (р<0,0001). Разница между вирусной нагрузкой ВИЧ в крови и СМЖ при наличии нейрокогнитивных нарушений сокращалась до 0,8 копий РНК/мл по сравнению с 1,9 ^ копий РНК/мл в группе больных без признаков поражения ЦНС.

Таблица 3

Средние величины количества С04+-лимфоцитов в крови и вирусной нагрузки ВИЧ в крови и СМЖ в группах пациентов с наличием и без неврологических нарушений (по данным первого визита у нелеченых пациентов, п=104)

Группа пациентов Наименование исследования Пациенты с неврологическими нарушениями, (среднее значение с 95% ДИ, п=34) Пациенты без неврологических нарушений, (среднее значение с 95% ДИ, п=70) р-уровень, однофакторный дисперсионный анализ, критерий Манна-Уитни

Количество СВ4+-лимфоцитов в крови (клеток/мкл) 74(14-133) 107 (49-165) р=0,66

Концентрация ВИЧ в крови копий РНК/мл) 5,6 (5,3-5,8) 5,3 (5,1-5,5) р=0,08

Концентрация ВИЧ в СМЖ (1й копий РНК/мл) 4,8 (4,5-5,2) 3,4 (3,2-3,6) р<0,0001

Разница концентрацией ВИЧ в крови и СМЖ копий РНК/мл) 0,8 (0,4-1,1) 1,9(1,6-2,2) р<0,0001

Оценка клинической информативности определения уровня вирусной

нагрузки ВИЧ в СМЖ для лабораторной диагностики ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС у не принимавших АРВП пациентов

Анализ кривой оперативной характеристики лабораторного теста (ЯОС-кривая) показал, что метод определения количества ВИЧ в СМЖ обладает хорошей клинической информативностью (АиС=0,85 - «очень хорошая прогностическая модель», р<0,0001) для диагностики ВИЧ-ассоцированного поражения ЦНС.

Определение порога клинического решения при интерпретации результатов исследования, то есть числового значения количества ВИЧ в СМЖ являющегося критерием поражения ЦНС, проводилось с помощью индекса Юдена. Уровень вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ, равный или превышающий 4,00 копий РНК/мл, свидетельствовал о значительной вероятности наличия у пациентов ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС (р<0,0001).

Определение вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ с порогом принятия клинического решения на уровне 4,00 ^ копий РНК/мл обладало следующими характеристиками диагностического лабораторного теста: 1. Выявление в СМЖ концентрации ВИЧ, равной или превышающей 4,00 копий РНК/мл, обладало диагностической чувствительностью 76% и

диагностической специфичностью 84% в отношении наличия у пациента ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС.

2. Вероятность обнаружения у больного ВИЧ-ассоциированного нейрокогнитивного расстройства (прогностическая ценность положительного результата) при вирусной нагрузке ВИЧ в СМЖ, равной или превышающей 4,00 1§ копий РНК/мл, составила 70%.

3. Вероятность отсутствия у пациента ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС (прогностическая ценность отрицательного результата) при вирусной нагрузке ВИЧ в СМЖ меньше 4,00 ^ копий РНК/мл составила 88%.

4. Диагностическая эффективность теста (процент истинных результатов к общему числу полученных результатов) составила 82%. Истинность результатов, то есть наличие или отсутствие поражения ЦНС, определяли по клиническим критериям.

5. Вероятность обнаружить ВИЧ-ассоциированное поражение ЦНС при выявлении концентрации ВИЧ в СМЖ, равной или большей 4,00 копий РНК/мл, в 4,9 раза выше, чем получить такой же результат при отсутствии неврологических нарушений (отношение правдоподобия для положительного результата).

6. Шансы обнаружить ВИЧ-ассоциированное поражение ЦНС при выявлении у ВИЧ-инфицированных пациентов вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ, равной или большей 4,00 ^ копий РНК/мл, в 17 раз выше, чем диагностировать неврологические нарушения у пациентов с вирусной нагрузкой в СМЖ менее 4,00 ^ копий РНК/мл (отношение шансов ОЯ, р<0,0001).

Определение уровня вирусной нагрузки ВИЧ в образцах СМЖ может применяться для оптимизации алгоритма диагностики ВИЧ-ассоциированных поражений ЦНС, дифференциальной диагностики с неврологическими расстройствами другой этиологии. Порогом принятия клинического решения является уровень вирусной нагрузки ВИЧ в образце СМЖ, равный или превышающий 4,00 ^ копий РНК/мл, что свидетельствует о значительной вероятности наличия у пациента ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС.

Сравнительный анализ результатов генотипирования ВИЧ в парных образцах крови и спинномозговой жидкости

Для оценки существования генетических различий между вирусами, циркулирующими в крови и СМЖ, был проведен анализ парных нуклеотидных последовательностей ВИЧ. У обследованных пациентов при сравнении парных нуклеотидных последовательностей гена ро1 ВИЧ обнаруживалось до 65 нуклеотидных замен. Величина эволюционной дистанции между вирусами в различных тканях организма может быть оценена как количество однонуклеотидных замен при сравнении парных нуклеотидных последовательностей одного и того же вирусного гена, полученного из разных биологических образцов. У нелеченых пациентов количество однонуклеотидных замен находилось в прямой зависимости от продолжительности заболевания ВИЧ-инфекцией (коэффициент корреляции Спирмена, г=0,60, р<0,0001). При увеличении продолжительности заболевания на 1 год количество

однонуклеотидных замен в парных нуклеотидных последовательностях увеличивалось на 2 замены (робастная регрессия, р<0,0001) (рис. 1).

50-

S 30 -

1 20-

!10 -

о -

Рис. 1. Зависимость количества однонуклеотидных замен от продолжительности заболевания ВИЧ-инфекцией в парных нуклеотидных последовательностях гена pol ВИЧ у нелеченых пациентов (робастная регрессия с зоной 95% ДИ, п=82)

Косвенным подтверждением генетической дивергенции вирусов в крови и ЦНС с увеличением продолжительности заболевания ВИЧ-инфекцией является также статистически значимая обратная зависимость между количеством однонуклеотидных замен в парных нуклеотидных последовательностях гена pol и уровнем С04+-лимфоцитов в крови (коэффициент корреляции Спирмена, г= — 0,54, р<0,0001). Очевидно, что выявленная зависимость является опосредованной, так как количество С04+-лимфоцитов в крови падает с увеличением продолжительности заболевания.

Вследствие вырожденности генетического кода, некоторые нуклеотидные замены являются синонимичными и не приводят к замене аминокислоты в соответствующей позиции. При оценке различий в кодируемых геном pol парных аминокислотных последовательностях белков были обнаружены закономерности, сходные с полученными при анализе нуклеотидных последовательностей. Количество аминокислотных замен находилось в прямой зависимости от продолжительности заболевания ВИЧ-инфекцией (коэффициент корреляции Спирмена, г=0,58, р<0,0001), и наблюдалась косвенная обратная зависимость с содержанием CD4-лимфоцитов в крови (коэффициент корреляции Спирмена, г= - 0,53, р<0,0001).

Частным и клинически значимым следствием аминокислотных замен в белковой структуре ферментов ВИЧ является возникновение лекарственной устойчивости вируса. При анализе профилей лекарственной устойчивости ВИЧ было обнаружено, что у 13 пациентов в гене pol ВИЧ присутствуют мутации, связанные с формированием лекарственной устойчивости, в том числе у 6

—|-1-1-1-1-1—

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5

Продолжительность заболевания ВИЧ-инфекцией |годы)

пациентов (6%) профили фармакорезистентности при сравнении парных образцов крови и СМЖ не совпадали (табл. 4).

Таблица 4

Случаи несовпадения профилей лекарственной устойчивости ВИЧ в парных образцах крови и СМЖ (согласно интерпретации базы данных Стенфордского _университета HIV Drug Resistance Database)_

Пациенты Аминокислотные замены в геноме ВИЧ, связанные с формированием фармакорезистентности и обнаруженные в крови Аминокислотные замены в геноме ВИЧ, связанные с формированием фармакорезистентности и обнаруженные в СМЖ

Обратная транскриптаза Протеаза Обратная транскриптаза Протеаза

Х2647 К70ТК, V106IV L10I - L10FI

Б1711 - - T69NT

А1411 - - T215IT

В1455 T69NT, V108IMV - -

П1243 K103KN, Е138А, G190GS - Е138АЕ

В1273 M184V, L74V, К.101Е, Y181F, G190S M46IM, L10I - L10I

Результаты генотипирования ВИЧ показали, что с увеличением продолжительности заболевания ВИЧ-инфекцией наблюдается генетическая дивергенция ВИЧ в крови и СМЖ. Профили лекарственной устойчивости ВИЧ, полученные при анализе образцов СМЖ, у ряда пациентов отличаются от результатов, полученных при исследовании крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При разработке подходов к лечению и лабораторной диагностике ВИЧ-ассоциированных поражений органов и систем организма необходимо учитывать гистологические, физиологические и иммунологические особенности тканей и органов, неодинаковую тропность ВИЧ к различным клеткам и значительную генетическую изменчивость ВИЧ.

Анализы крови малоинформативны для диагностики ВИЧ-ассоциированных неврологических расстройств. Для лабораторной диагностики состояния ЦНС используют клинические и биохимические исследования ликвора, но оценить степень инфицированное™ клеток ЦНС с помощью этих методов не представляется возможным. Для более детального изучения вопросов вирусной репликации в ткани ЦНС, патогенеза и диагностики ВИЧ-ассоциированных неврологических расстройств нами были проанализированы парные образцы СМЖ и крови, полученные у пациентов с ВИЧ-инфекцией.

Результаты исследования показали, что вирусная нагрузка ВИЧ в СМЖ не коррелирует ни с содержанием С04+-лимфоцитов в крови, ни с продолжительностью заболевания. Статистическая взаимосвязь обнаружена

только с вирусной нагрузкой ВИЧ в крови. Однако слабая степень корреляции (г=0,3, р<0,01) и значительные отклонения от средней разницы между количеством ВИЧ в крови и СМЖ у трети пациентов говорят о том, что степень инфицированности клеток ЦНС, вероятно, находится во взаимосвязи с другими факторами, например с концентрацией некоторых цитокинов в ткани мозга или с различиями во внутриклеточных условиях размножения вируса.

В результате статистического анализа полученных в исследовании данных было обнаружено, что в среднем у нелеченых пациентов вирусная нагрузка в крови превышает показатель в СМЖ на 1,5 копий РНК/мл. Более высокая концентрация вируса в СМЖ и уменьшение разницы между количеством ВИЧ в крови и СМЖ наблюдались в группе пациентов с ВИЧ-ассоциированными нарушениями. Выявленные закономерности позволили рекомендовать определение вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ для оптимизации алгоритма диагностики ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС у нелеченых пациентов.

Прием антиретровирусных препаратов значительно изменял картину результатов лабораторных исследований. У пациентов, обследованных на фоне ВААРТ, было обнаружено сокращение разницы между количеством ВИЧ в крови и СМЖ. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что сроки наступления супрессии вируса в СМЖ на фоне терапии могут быть сравнимы с принятыми для крови, то есть 24 недели после начала ВААРТ, или более длительными.

При изучении нуклеотидных последовательностей гена ро1 ВИЧ в парных образцах крови и СМЖ было установлено, что с увеличением продолжительности заболевания ВИЧ-инфекцией степень генетической дивергенции вирусов, циркулирующих в СМЖ и в крови, росла. Возможно, это свидетельствует о независимой эволюции субпопуляции ВИЧ, относительно изолированной в ткани ЦНС из-за гематоэнцефалического барьера. Мутации в геноме ВИЧ, связанные с лекарственной устойчивостью к антиретровирусным препаратам, у некоторых обследованных пациентов обнаруживались только в крови, или только в СМЖ. Возможно первичное формирование фармакорезистентных вариантов ВИЧ в ЦНС из-за неполного проникновения АРВП через гематоэнцефалический барьер или других особенностей фармакокинетики.

Риск появления лекарственной устойчивости ВИЧ особенно возрастает по мере повышения продолжительности репликации вирусов на фоне приема ВААРТ. По нашим и литературным данным, вирусная нагрузка ВИЧ в СМЖ медленно снижается на фоне терапии, что особенно характерно для пациентов с ВИЧ-ассоциированным поражением ЦНС. У пациентов с ВИЧ-ассоциированными неврологическими расстройствами вирусы могут длительно реплицироваться в клетках ЦНС на фоне селективного давления АРВП, что увеличивает вероятность появления и закрепления мутаций, связанных с лекарственной устойчивостью.

Таким образом, определение вирусной нагрузки и генотипирование ВИЧ в СМЖ позволяет более точно оценить степень тяжести поражения ЦНС и оптимизировать антиретровирусную терапию для снижения патогенного влияния ВИЧ на клетки ЦНС.

выводы

1. Установлено, что вирусная нагрузка ВИЧ в СМЖ у пациентов, не принимавших АРВП, коррелирует с количеством ВИЧ в крови (г=0,3, р<0,01) и в среднем ниже показателя в крови на 1,5 ^ копий РНК/мл. Между количеством ВИЧ в СМЖ и содержанием С04+-лимфоцитов в крови не выявлено статистически значимой корреляционной связи (р>0,05).

2. В отсутствие терапии у больных с клиническими признаками поражения ЦНС вирусная нагрузка ВИЧ в СМЖ в среднем на 1,4 ^ копий РНК/мл выше, чем у пациентов без нарушения функций ЦНС, а разница между концентрацией ВИЧ в крови и СМЖ составляет 0,8 1§ и 1,9 1§ копий РНК/мл соответственно (р<0,0001). Статистически значимой связи между содержанием С04+-лимфоцитов в крови, подтипом ВИЧ и наличием клинических признаков поражения ЦНС не выявлено.

3. Выявление уровня вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ > 4,00 копий РНК/мл у не принимавших АРВП больных обладает диагностической чувствительностью 76% и диагностической специфичностью 84% в отношении наличия у пациента ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС.

4. При сравнении аминокислотных последовательностей, кодируемых геном ро1 ВИЧ и полученных при анализе парных образцов крови и СМЖ, обнаружены точечные замены, количество которых растет с увеличением продолжительности заболевания ВИЧ-инфекцией (р<0,0001), что свидетельствует о генетической дивергенции вирусов.

5. Установлено, что у 6% (6/108) пациентов профили лекарственной устойчивости субпопуляций ВИЧ, циркулирующих в крови и СМЖ, различались между собой.

Практические рекомендации

1. Для подтверждающей диагностики ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС у нелеченых больных с ВИЧ-инфекцией рекомендуется исследование вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ. Количество ВИЧ в спинномозговой жидкости, равное или превышающее 4,00 копий РНК/мл, свидетельствует о высокой вероятности наличия ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС.

2. При отсутствии улучшения нейрокогнитивных функций или при появлении неврологических нарушений у пациента на фоне терапии через 24 недели после ее начала рекомендуется определение вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ для оценки вирусологической эффективности антиретровирусной терапии в ткани ЦНС. Результаты исследования могут быть показанием к определению профиля фармакорезистентности ВИЧ в СМЖ, если обнаружено отсутствие супрессии ВИЧ в образце СМЖ через 6 месяцев после начала терапии.

Перспективы дальнейшей разработки темы

Особенности патогенеза ВИЧ-ассоциированных неврологических

расстройств остаются недостаточно изученными. Отсутствует диагностический

алгоритм и система мониторинга нейрокогнитивных нарушений у ВИЧ-

инфицированных больных. Учитывая медленную положительную динамику

нейрокогнитивных нарушений у больных на фоне ВААРТ и возможные отличия в пенетрации антиретровирусных препаратов через гематоэнцефалический барьер, существует потребность в разработке алгоритма оценки вирусологической эффективности ВААРТ в ткани ЦНС. Для решения этой проблемы необходимо провести проспективное исследование с изучением парных образцов крови и СМЖ у больных в динамике до и на фоне ВААРТ. Информативным может оказаться определение в образцах СМЖ уровней цитокинов, неоптерина, нейрофиламентов, концентрации антиретровирусных препаратов.

Список сокращений

АРВП - антиретровирусные препараты

ВААРТ - высокоактивная антиретровирусная терапия

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ДИ - доверительный интервал

СМЖ - спинномозговая жидкость

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита

ЦНС - центральная нервная система

AUC — Area Under The Curve (площадь под ROC-кривой)

CRF - Circulating Recombinant Form (циркулирующая рекомбинантная форма)

OR - Odds Ratio (отношение шансов)

ROC-кривая - Receiver Operating Characteristic (кривая взаимной зависимости вероятностей ложноположительных и истинно положительных результатов)

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК

[1] Петрова, Л.В. Проблема резистентности к антиретровирусным препаратам в терапии ВИЧ-инфекции и результаты ее определения у ВИЧ-инфицированных больных по материалам ГИБ № 30 имени С.П.Боткина/ Л.В.Петрова, Н.Е.Дементьева, А.А.Яковлев// Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 11: Медицина. — 2008. — №2. — С.59-67. (0,7 п.л.)

[2] Анализ субтипов и фармакорезистентных вариантов ВИЧ, циркулирующих среди ВИЧ-инфицированных пациентов Санкт-Петербурга/ Н.Е.Дементьева, Н.В.Сизова, З.Н.Лисицина, В.А.Маклакова, Л.И.Крутицкая, Н.А.Беляков// ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. — 2011. — Т.З, №4. — С.34-43. (0,8 п.л.)

[3] Определение ВИЧ и его генотипов в спинномозговой жидкости/ Н.Е.Дементьева, Н.В.Фоменкова, О.Н.Леонова, А.С.Шеломов, Н.А.Беляков// ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. — 2011. — Т.З, №4. — С.96. (0,1 пл.)

[4] Дементьева, Н.Е. Особенности репликации и компартментализации ВИЧ в ЦНС/ Н.Е.Дементьева, А.С.Шеломов// ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии.

— 2012. — Т.4, №4. — С.132-133. (0,1 п.л.)

[5] Механизмы поражения головного мозга при ВИЧ-инфекции/ Н.А.Беляков, С.В.Медведев, Т.Н.Трофимова, В.В.Рассохин, Н.Е.Дементьева, А.С.Шеломов// Вестник Российской академии медицинских наук. — 2012. — №9.

— С.4-12.(1,3 пл.)

[6] Моделирование и общие закономерности циркуляции субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ/ Н.А.Беляков, В.В.Розенталь, Н.Е.Дементьева, Т.Н.Виноградова, Н.В.Сизова// ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. — 2012. — Т.4, №2. — С.7-18.. (0,9 пл.)

[7] Эффективность химиопрофилактики и исследование фармакорезистентности ВИЧ у инфицированных беременных женщин/ А.В.Самарина, М.М.Мартиросян, Н.В.Сизова, Н.Е.Дементьева, Н.А.Беляков // ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. — 2012. — Т.4, №3. — С.28-34. (0,8 пл.)

[8] Выбор методов нейропсихологической, клинической и инструментальной диагностики ВИЧ-обусловленных нейрокогнитивных расстройств/ В.В.Рассохин, Т.Д.Сизова, Н.Е.Дементьева, Е.А.Громова, Т.Н.Трофимова, О.Е.Гурская, Н.А.Беляков// ВИЧ-инфекция и иммуносупрессии. — 2013. — Т.5, №1. — С.42-53. (1,3 пл.)

[9] Клиническое значение парного определения ВИЧ-1 у больных в крови и цереброспинальной жидкости / Е. В. Степанова, О. Н. Леонова, А. С. Шеломов, Н. В. Фоменкова, Н.Е.Дементьева, Н. А. Беляков // Журнал инфектологии. — 2013. — Т.5, №1. — С.55-62. (0,8 пл.)

Учебные и учебно-методические пособия

[10] Дементьева, Н.Е. Этапы лабораторной диагностики и организации мониторинга ВИЧ-инфекции/ Н.Е.Дементьева, Л.И.Крутицкая, З.НЛисицина// Вирус иммунодефицита человека - медицина: руководство для врачей/ Под ред. Н.А.Белякова, А.Г.Рахмановой. — СПб:Балтийский медицинский образовательный центр, 2010. — С.489-522. (2,5 пл.)

[11] Лисицина, З.Н. Лабораторная диагностика и оценка иммунного статуса у беременных женщин и детей/ З.Н.Лисицина, Н.Е.Дементьева, Л.И.Крутицкая// Женщина, ребенок и ВИЧ/ Под ред. Н.А.Белякова, Н.Ю.Рахманиной, А.Г.Рахмановой. — СПб: Балтийский медицинский образовательный центр, 2012. — С.279-312. (2,7 пл.)

[12] Риски заражения плода и ребенка ВИЧ/ Е.В.Степанова, А.В.Самарина, Н.В.Сизова, Н.Е.Дементьева, М.М.Мартиросян // Женщина, ребенок и ВИЧ/ Под ред. Н.А.Белякова, Н.Ю.Рахманиной, А.Г.Рахмановой. — СПб: Балтийский медицинский образовательный центр, 2012. — С.99-130. (2,5 пл.)

[13] Эпидемиология ВИЧ-инфекции/ Н.А.Беляков, Т.Н.Виноградова, Н.Е.Дементьева, В.Е. Жолобов, О.В.Пантелеева// Женщина, ребенок и ВИЧ/ Под ред. Н.А.Белякова, Н.Ю.Рахманиной, А.Г.Рахмановой. — СПб: Балтийский медицинский образовательный центр, 2012. — С.17—44. (2,2 пл.)

Публикации в других изданиях

[14] Молекулярно-эпидемиологическая характеристика ВИЧ-инфекции в Санкт-Петербурге/ Н.Е.Дементьева, Н.В.Сизова, З.НЛисицина, Н.А.Беляков// Медицинский академический журнал. — 2012. — Т.12, №2. — С.97-104. (0,6 пл.)

[15] Дементьева, Н.Е. Первый опыт оценки вирусной нагрузки, определения генотипа ВИЧ и количества С04-клеток в спинномозговой жидкости/ Н.Е.Дементьева, З.НЛисицина, Л.И.Крутицкая// Сборник тезисов III

Международного симпозиума "Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии". — СПб, 2011. — С.94. (0,1 п.л.)

[16] Анализ циркулирующих субтипов ВИЧ и передающейся лекарственной устойчивости у пациентов с ВИЧ в Санкт-Петербурге/ Н.Е.Дементьева, З.Н.Лисицина, Л.И.Крутицкая, Н.В.Сизова, Н.А.Беляков// Сборник тезисов Юбилейной всероссийской научной конференции "Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека". — СПб, 2012, —С.78. (0,1 п.л.)

[17] Взгляд эпидемиологов, генетиков и математиков на развитие эпидемии ВИЧ-инфекции/ Н.А.Беляков, Т.Н.Виноградова, Н.Е.Дементьева, В.В.Розенталь, О.В.Пантелеева// Сборник тезисов Юбилейной всероссийской научной конференции "Отечественная эпидемиология в XXI веке: приоритетные направления развития и новые технологии в диагностике и профилактике болезней человека". — СПб, 2012. — С.74. (0,1 п.л.)

[18] Распространенность резистентности ВИЧ к антиретровирусным препаратам в Санкт-Петербурге у больных, получающих высокоактивную антиретровирусную терапию (ВААРТ)/ Н.Г.Захарова, А.Н.Виноградова, Н.Е.Дементьева, О.В.Калыгина// Альманах "Инфекционные болезни - 2007 г." / Под. ред. А. А. Яковлева и А. Г. Рахмановой. — СПб: НИИХ, 2008. — С.98-100. . (0,2 п.л.)

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Дементьева, Наталья Евгеньевна, Москва

ФГБУ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ МЕДИЦИНЫ» СЕВЕРО-ЗАПАДНОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ

МЕДИЦИНСКИХ НАУК

На правах рукописи

04201457275

ДЕМЕНТЬЕВА Наталья Евгеньевна

КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ И КАЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

СУБПОПУЛЯЦИЙ ВИЧ В КРОВИ И СПИННОМОЗГОВОЙ ЖИДКОСТИ

03.02.02 - вирусология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Научный руководитель: академик РАН, доктор медицинских наук, профессор

Н.А.Беляков

Научный консультант: доктор биологических наук М.Р.Бобкова

Санкт-Петербург 2014

ОГЛАВЛЕНИЕ

Оглавление.......................................................................................................2

Введение...........................................................................................................4

Глава 1. Современный взгляд на вопросы патогенеза, диагностики и лечения ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС (обзор литературы).. 12

1.1. Патогенез ВИЧ-инфекции....................................................................12

1.2. Генетическая гетерогенность ВИЧ.....................................................15

1.3. Лекарственная устойчивость ВИЧ......................................................18

1.4. Оценка вирусной нагрузки ВИЧ в различных тканях и биологических жидкостях инфицированного организма.........................20

1.5. Патогенез ВИЧ-инфекции в центральной нервной системе............24

1.6. Клинические проявления ВИЧ-обусловленного поражения центральной нервной системы.....................................................................35

1.7. Вирусологические исследования спинномозговой жидкости.........37

1.8. Влияние антиретровирусной терапии на глубину ВИЧ-

ассоциированного поражения центральной нервной системы................40

Глава 2. Материалы и методы исследования.............................................45

2.1. Материалы исследования.....................................................................45

2.3. Методы исследования..........................................................................48

Глава 3. Результаты определения количества СБ4+-лимфоцитов в крови, вирусной нагрузки и генотипирования ВИЧ при исследовании парных образцов крови и спинномозговой жидкости...............................57

3.1. Результаты определения изучаемых показателей в обследуемой группе ВИЧ-инфицированных пациентов..................................................57

3.2. Вирусная нагрузка ВИЧ в спинномозговой жидкости на фоне высокоактивной антиретровирусной терапии...........................................60

3.3. Анализ взаимосвязи между исследуемыми показателями, продолжительностью и стадией заболевания ВИЧ-инфекцией...............62

Глава 4. Исследование парных образцов крови и спинномозговой жидкости у больных с ВИЧ-ассоциированными неврологическими расстройствами..............................................................................................66

4.1. Изучение взаимосвязи между наличием ВИЧ-ассоциированного поражения центральной нервной системы и субтипом ВИЧ, количеством СБ4+-лимфоцитов в крови, уровнем вирусной нагрузки ВИЧ в плазме крови и спинномозговой жидкости....................................66

4.2. Оценка клинической информативности тестирования уровня вирусной нагрузки ВИЧ в спинномозговой жидкости для диагностики

ВИЧ-ассоциированного поражения центральной нервной системы.......68

Глава 5. Анализ результатов генотипирования ВИЧ в парных образцах крови и спинномозговой жидкости.............................................................72

5.1. Сравнительный анализ парных нуклеотидных последовательностей гена pol ВИЧ.............................................................72

5.2. Анализ парных аминокислотных последовательностей, кодируемых геном pol, и профилей лекарственной устойчивости ВИЧ 75

5.3. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей

гена pol ВИЧ при обследовании пациентов в динамике...........................80

Глава 6. Обсуждение.....................................................................................84

Выводы...........................................................................................................93

Практические рекомендации.......................................................................93

Перспективы дальнейшей разработки темы..............................................94

Список сокращений......................................................................................96

Список литературы.......................................................................................98

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Высокая значимость исследований в области патогенеза, диагностики, лечения и профилактики ВИЧ-инфекции обусловлена исключительной опасностью и широкой распространенностью этого инфекционного заболевания, а также отсутствием средств, способных полностью излечить либо способствовать развитию невосприимчивости к этому заболеванию. Несмотря на значительные усилия, предпринимаемые международным научным сообществом, многие вопросы патогенеза и диагностики этого заболевания остаются недостаточно изученными. По данным ЮНЭЙДС к концу 2011 года оценочное число людей, живущих с ВИЧ, составило 34 (31,4-35,9) миллиона человек [241]. За последние 10 лет количество людей с положительным ВИЧ-статусом в мире увеличилось на 17% [242]. Ежегодный прирост новых случаев ВИЧ-инфекции стабилизировался и составил 2,7 миллиона человек в 2010 году и 2,5 миллиона в 2011 году. Число лиц с положительным ВИЧ-статусом в России уже к 2008 году превышало 400 тыс. человек [29], а к 2013 году достигло более 700 тыс. человек [243]. В Санкт-Петербурге к 2013 году было зарегистрировано более 50 тыс. ВИЧ-инфицированных пациентов - один из самых высоких показателей в Российской Федерации [34, 5, 15], и более 7 тыс. из них была назначена антиретровирусная терапия [35]. Высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ) стала мощным средством спасения человеческих жизней. За 20102011 годы число людей, имеющих доступ к антиретровирусной терапии, возросло на 63% [241]. Число людей, живущих с ВИЧ, ежегодно возрастает не только в связи с появлением новых случаев заражения, но и благодаря расширению доступа к лечению, снижению смертности и увеличению продолжительности жизни людей с положительным ВИЧ-статусом [26].

Значительным препятствием на пути создания вакцины и средств для лечения и диагностики ВИЧ-инфекции является высокая генетическая неоднородность и высокая вероятность мутаций при репликации генома [208,

115]. Эти свойства вируса создают предпосылки для широкого разнообразия вариантов ВИЧ, как с точки зрения чувствительности к различным противовирусным препаратам, так и с позиций особенностей патогенеза. Уникальная генетическая изменчивость вируса приводит к появлению новых субтипов и рекомбинантных форм ВИЧ, обеспечивает вирусу возможность противодействовать иммунной системе и нивелировать эффекты лекарственных препаратов путем селекции устойчивых вариантов вируса с дальнейшим распространением этих штаммов по эпидемическим цепочкам [10]. К настоящему моменту в развитых странах в результате достаточно длительного и широкого охвата антиретровирусной терапией регистрируется сравнительно высокий уровень первичной резистентности у ВИЧ-инфицированных больных - до 15% среди пациентов, не принимавших антиретровирусные препараты (АРВП) [269, 109, 268, 102].

Вирусная популяция в пределах одного инфицированного организма генетически гетерогенна, что является результатом естественных мутационных процессов, существования гистогематических барьеров и селективного давления противовирусных препаратов. При назначении терапии следует учитывать, что степень проникновения лекарственных веществ в различные органы и ткани неодинакова. Таким образом, возможно формирование условий для избирательной репликации и селекции устойчивых вариантов ВИЧ в тканях, где ингибирующие концентрации препаратов снижены. Образование в организме резервуаров ВИЧ, таких как Т-клетки памяти, микроглиальные клетки мозга, макрофаги, дендритные клетки, является причиной «архивирования» различных генетических вариантов ВИЧ, в том числе лекарственно устойчивых, и персистенции вируса в организме больного [11, 8, 39]. Такие резервуары становятся источником множества генетических вариантов вируса и способствуют прогрессированию заболевания. Косвенным подтверждением этому могут служить молекулярно-генетические исследования ВИЧ в различных биологических жидкостях (спинномозговая жидкость (СМЖ), сперма, цервиковагинальные мазки и др.), выявляющие локальное

увеличение вирусной нагрузки ВИЧ в тканях и различный спектр мутаций у изолятов ВИЧ, полученных из разных биологических материалов у одного и того же пациента [81, 106, 91, 123, 122]. Различия в нуклеотидных последовательностях вариантов ВИЧ, выделенных из крови и других биологических образцов, могут служить косвенным подтверждением независимой эволюции вируса в различных органах и тканях.

Центральная нервная система (ЦНС) - один из наиболее объемных и клинически значимых резервуаров ВИЧ в инфицированном организме. Благодаря широкому применению антиретровирусной терапии случаи ВИЧ-ассоциированной деменции наблюдаются в настоящее время значительно реже, однако распространенность нейрокогнитивных расстройств средней и легкой степени остается высокой, достигая уровня 50% и более [156, 139, 79]. Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) препятствует не только свободному переходу ВИЧ из крови в ткани ЦНС и обратно, но и затрудняет проникновение лекарственных препаратов. Эти особенности создают условия для избирательной репликации и селекции устойчивых вариантов ВИЧ в ЦНС на фоне низкой концентрации антиретровирусных препаратов [234].

Часто выявляемое длительное сохранение неврологических нарушений у больных на фоне антиретровирусной терапии и супрессии ВИЧ в крови заставляет искать новые подходы для оценки степени ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС и оптимизации схемы терапии. В настоящее время не существует алгоритма лабораторной диагностики ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС и мониторинга эффективности лечения при нейрокогнитивных нарушениях у ВИЧ-инфицированных пациентов.

Состояние научной разработанности проблемы. В мировой научной литературе встречаются результаты исследований, направленных на изучение особенностей репликации ВИЧ в клетках ЦНС и патогенеза ВИЧ-ассоциированных нейрокогнитивных расстройств, в том числе с применением вирусологических методов анализа спинномозговой жидкости (СМЖ). Полученные разными научными группами результаты значительно различаются.

В России подобные исследования не проводили, а зарубежные исследования выполнялись с использованием биологических образцов пациентов, инфицированных субтипами ВИЧ, не получившими в России широкого распространения.

2. Проанализировать взаимосвязь между субтипом ВИЧ, содержанием С04+-лимфоцитов в крови, уровнем вирусной нагрузки в крови и СМЖ и наличием признаков ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС.

Информационная база исследования. В качестве информационных источников использовались научные публикации российских и зарубежных исследователей, материалы конференций, нормативные документы, инструкции к использованным в работе тест-системам, данные клинической документации, собственные результаты исследований.

интерпретацию полученных результатов, подготовку и публикацию материалов.

Положения, выносимые на защиту:

1. Между концентрацией ВИЧ в СМЖ и крови обнаружена корреляционная связь слабой силы (г=0,3, р<0,01). У пациентов, не принимавших антиретровирусных препаратов, вирусная нагрузка ВИЧ в СМЖ ниже, чем в крови, в среднем на 1,5 ^ копий РНК/мл (р<0,01). У нелеченых больных с клиническими признаками поражения ЦНС уровень вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ в среднем на 1,4 1§ копий РНК/мл выше, чем у пациентов без нарушения функций ЦНС, при этом разница между концентрацией ВИЧ в крови и СМЖ составляет 0,8 и 1,9 копий РНК/мл соответственно (р<0,0001).

2. У пациентов, не принимавших антиретровирусные препараты, количество ВИЧ в СМЖ, равное или превышающее 4,00 копий РНК/мл, свидетельствует о высокой вероятности наличия ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС (р<0,0001). Определение вирусной нагрузки ВИЧ в СМЖ рекомендуется применять для лабораторной диагностики ВИЧ-ассоциированного поражения ЦНС.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Обнаружены ранее неизвестные особенности патогенеза поражения ЦНС при ВИЧ-инфекции, а также генетической изменчивости и репликации ВИЧ в инфицированном организме. Выявленные закономерности позволили произвести оценку диагностической эффективности определения уровня вирусной нагрузки и определения профиля фармакорезистентности ВИЧ в СМЖ.Обнаружено, что в ряде случаев определение профиля лекарственной устойчивости ВИЧ только в образцах крови может быть недостаточно информативным, так как степень чувствительности ВИЧ к препаратам в СМЖ может отличаться от результата, полученного в крови. Полученные данные могут быть использованы для диагностики ВИЧ-ассоциированных поражений ЦНС и лабораторного мониторинга эффективности терапии ВИЧ-инфекции.

Апробация результатов исследования. Материалы работы были представлены на двух Международных симпозиумах «Взаимодействие нервной и имму

Информация о работе

Дементьева, Наталья Евгеньевна
кандидата медицинских наук
Москва, 2014
ВАК 03.02.02

Диссертация

Количественные и качественные характеристики субпопуляций ВИЧ в крови и спинномозговой жидкости - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы