Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная характеристика нейронов спинномозговых узлов при раневом процессе

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная характеристика нейронов спинномозговых узлов при раневом процессе"

На правах рукописи

Фетисов Сергей Олегович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА НЕЙРОНОВ СПИННОМОЗГОВЫХ УЗЛОВ ПРИ РАНЕВОМ ПРОЦЕССЕ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

А В Т О Р Е Ф Е PAT диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

~ Т- СЕН 2015

005561887

Новосибирск - 2015

005561887

Работа выполнена на кафедре нормальной анатомии человека Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Воронежский государственный медицинский университет имени H.H. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научные руководители: кандидат медицинских наук, доцент

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

Архипов Сергей Алексеевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией цитологии и клеточных культур ФГБНУ Научно-исследовательского института экспериментальной и клинической медицины (Новосибирск).

Чепурнов Александр Алексеевич, доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории регуляции иммуно-поэза ФГБНУ Научно-исследовательского института фундаментальной и клинической иммунологии (Новосибирск).

Ведущая организация:

ФГБНУ Научно-исследовательский институт клинической и экспериментальной лимфологии, лаборатория ультраструктурных исследований (Новосибирск).

Защита состоится: «_» ___ 2015 г. в _ час.

на заседании совета Д 001.037.01 в ФГБНУ Институте молекулярной патологии и патоморфологии по адресу 630117, Новосибирск, ул. Ти-макова, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ФГБНУ Института молекулярной патологии и патоморфологии http://pathomorphology.ru

Автореферат разослан «_»_2015 г.

Алексеева Наталия Тимофеевна Никитюк Дмитрий Борисович

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

Молодых Ольга Павловна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одной из актуальных задач современной медико-биологической науки является изучение ответных морфологических реакций различных элементов нервной системы на процессы, сопровождающие нарушение целостности покровных тканей организма. Актуальность подобных работ связана с высокой распространенностью воздействия различных травматизирующих факторов внешней среды на жизнедеятельность различных биологических объектов. Комплекс реакций со стороны нервной системы особо интересен для специалистов в области клинической медицины, учитывая необходимость выбора оптимальной тактики применения местных санационных воздействий, что особо актуально в связи с существенным расширением арсенала методов региональной терапии.

Известен широкий ряд работ, посвященных изучению реакций нейронов спинномозговых узлов (СМУ) на травматическое повреждение их периферических окончаний (Ермолин И.Л., 2006; Порсева В.В., 2012; Fukai Т .et al., 2005; Shaible H.G. et al., 2005; Ogawa R„ 2011; Cheret J. et al., 2014). При этом установлено, что помимо передачи афферентной информации в вышележащие отделы нервной системы, имеется определенное эфферентное влияние со стороны нейронов на иннервируемые ткани.

Комплекс указанных периферически направленных по отношению к нейронам СМУ реакций обеспечивается за счет совокупности эффектов, обусловленных выделением ряда биологически активных веществ, поступающих в ткани с аксоплазматическим током и действующих на периферические мишени: различные популяции клеток иммунной системы, тучные клетки, клетки сосудистой стенки. Такие воздействия могут в определенной степени обусловливать локальную воспалительную реакцию, описываемую как «нейрогенное воспаление». Большая роль уровня активности нервной системы для развития данного комплекса реакций была подтверждена в ряде экспериментальных работ, в том числе посвященных изменению процессов репарации кожных ран при денервации или повреждении спинного мозга (Ansel J. et al., 1996; Rook J., 2007; Chen Y. et al., 2014; Huang et al., 2014).

С другой стороны, в ряде исследований был выявлен определенный спектр реакций, проявлявшихся в изменении морфологии нейронов и касавшихся как изменения их стереометрических характеристик и тинкто-риальных свойств, так и изменения метаболических процессов в нервных клетках, оценивавшихся с помощью гистохимической и иммуногистохи-мической техник (Душкова З.Г., 2004; Navarro X. et al., 2007; Hart A.M. et al., 2008; He S.-Q. et al., 2010).

Отдельный ряд исследований показал наличие тесной взаимосвязи между структурно-функциональными изменениями нейронов СМУ и реакцией их глиального окружения, что достаточно однозначно связы-

валось со значительным влиянием сателлитных глиоцитов на трофику нейронов (Архипова С.С. и др., 2009; Pannese Е. et al., 2003; Elson К. et al., 2004; Hanani M„ 2004; Butt A., Verkhratsky A., 2007; Dublin P., 2007). Тем не менее, в доступных литературных источниках недостаточно полно освещены реакции нейронов СМУ, сопровождающие заживление кожных ран в сравнительном аспекте при различных видах течения раневого процесса: асептическом и инфицированном.

Степень разработанности темы исследования. Необходимо отметить, что в настоящее время большую распространенность получают разнообразные методы регионального воздействия на область раневого дефекта (Андреев А.А и др., 2012, 2013; Глухов А.А. и др., 2012). К их числу можно отнести гидроимпульсную санацию как метод физического воздействия (особо актуальный при наличии гнойного процесса в раневом дефекте) или использование обогащенной тромбоцитами плазмы крови (ОТПК) как одного из вариантов таргетной клеточной терапии.

В ряде исследований даётся оценка реакций нейронов разных типов и глиального компонента при использовании различных вариантов тканевой и клеточной терапии для улучшения репарации элементов нервной системы (Челышев Ю.А. и др., 2012; Масгутов Р.Ф. и др, 2013; Гайович В.В., 2014; Cho Н.Н. et al., 2010; Toledo R.N. et al., 2010). Однако, несмотря на всё возрастающую в настоящее время популярность указанных методов регионального воздействия, морфологическая картина реакций нервной системы при их местном применении для терапии повреждений покровных тканей изучена недостаточно, что и обусловливает актуальность цели настоящего исследования.

Цель исследования - выявить морфофункциональные особенности поясничных спинномозговых узлов Ьш-Ьу при моделировании септического и асептического течения раневого процесса в условиях спонтанного и стимулированного заживления.

Для достижения поставленной цели, в ходе выполнения работы были сформулированы следующие задачи исследования:

1. Провести исследование морфологических и морфометрических характеристик нейронов и нейроглии спинномозговых узлов после нанесения раны при асептическом и септическом течении раневого процесса при спонтанном заживлении.

2. Изучить изменения морфофункциональных реакций нейронов и глиальных клеток спинномозговых узлов при раздельном и комбинированном использовании методов регионального воздействия: применения обогащенной тромбоцитами плазмы крови (ОТПК) и гидроимпульсной санации раны (ГИС).

3. Оценить по данным динамического моделирования взаимосвязь морфофункциональных характеристик нейронов и нейроглии спинномозговых узлов, видов течения раневого процесса и применяемого метода региональной терапии.

Научная новизна. Впервые проведено морфофункциональное исследование поясничных спинномозговых узлов Ьщ-Ц/ при септическом и инфицированном течении раневого процесса при спонтанном заживлении и после применения обогащенной тромбоцитами плазмы крови и гидроимпульсной санации раны.

Впервые в рамках созданной экспериментальной модели представлены качественные и количественные молекулярно-биологические характеристики субпопуляций нейронов спинномозговых узлов (СМУ) при спонтанном и стимулированном течении раневого процесса в асептических условиях и при внесении инфекции в раневой дефект.

Впервые установлено, что изменения морфологических форм нейронов (А и В) СМУ носили неспецифический характер и демонстрировали фазность реакций: в начальный период преобладали хроматолитические реакции, пикнотические изменения, режим повышенной функциональной активности; затем дистрофические (деструктивные) и компенсаторные гиперпластические реакции; на третьей фазе (с 7-х суток) - преобладание регенераторных процессов над дистрофическими. Следует отметить большую выраженность изменений В-нейронов - их реакции нарастали быстрее и имели большую амплитуду значений.

Впервые по данным планиметрических характеристик нейронов СМУ, иннервирующих область кожи, выявлены особенности реакций нервных клеток в условиях различного типа течения раневого процесса и в сопоставлении с фазами воспаления. Установлена корреляция изменения тинкториальных свойств и морфометрической и гистохимической характеристик нейронов СМУ (по уровню оптической плотности РНК и белка, как маркеров белкового обмена). Показана динамика изменений морфометрических показателей, количества сателлитных глиоцитов и доли многоядрышковых нейронов.

Установлено, что в условиях асептического течения раневого процесса наибольшую эффективность имеет применение обогащенной тромбоцитами плазмы крови, а в условиях инфицированного течения - комплексное применение гидропрессивной санации и обогащенной тромбоцитами плазмы крови.

Впервые на основании комплексного анализа разработан ряд математических моделей, описывающих взаимосвязь планиметрических и гистохимических реакций нейронов, с учетом временного фактора, вида регионального воздействия и типа течения раневого процесса, как категориальных независимых предикторов (динамические и стохастические модели), что позволяет осуществлять рациональный выбор корректирующего воздействия в рамах избранной экспериментальной модели.

Теоретическая н практическая значимость работы. Полученные результаты дополняют и расширяют представления о структурных реакциях нейронов спинномозговых узлов в зависимости от типа раневого процесса и при стимуляции заживления. Данные о характеристиках долей нейро-

нов различных субпопуляций, числа многоядрышковых клеток, реакции глиального окружения в зависимости от динамики сокращения раневого дефекта важны для понимания механизмов репарации повреждений.

Применение математического моделирования позволяет выявить специфические паттерны результирующих модели квадратичных поверхностей, находящих отражение в классической тинкториальной характеристике нейронов, что может быть использовано при проведении комплексной оценки реакции спинномозговых узлов при регенерации раны. Полученные в работе данные могут быть использованы для дальнейшей коррекции и адекватной разработки методов регионального воздействия на зону раневого дефекта.

Методология и методы исследования. В работе использованы современные методы сбора и обработки исходной информации. Диссертация основана на результатах морфологического исследования нейронов спинномозговых узлов при асептическом и септическом раневом процессе при спонтанном заживлении и после воздействия обогащенной тромбоцитами плазмы крови и/или гидроимпульсной санации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлена динамика численности субпопуляций нейронов СМУ при различных типах течения раневого процесса (асептическое и инфицированное). Выявлено, что применение различных методов регионального воздействия вносит существенный вклад в изменение числа нейронов в пределах субпопуляций, что может использоваться для косвенной оценки рациональности применения методов региональной стимуляции заживления повреждения.

2. Проведена оценка количественной характеристики долей нейронов различных субпопуляций, числа многоядрышковых клеток, реакции глиального окружения в зависимости от динамики сокращения раневого дефекта, что позволяет осуществлять прогноз хроновектора возникновения деструктивных форм нейронов в зависимости от используемой методики местного воздействия на поврежденные ткани.

3. По данным многомерного корреляционного анализа была установлена корреляция между уровнем оптической плотности РНК и белка, ядерно-цитоплазматическим индексом и площадью клетки: при асептическом течении в случае спонтанного заживления и использовании ОТПК выявлено увеличение площади нейронов, оптической плотности и индекса; при инфицированном течении наиболее гармоничное воздействие оказывало применение ГИС+ОТПК, что можно расценивать как наиболее адекватное применения методов регионального воздействия при гнойной форме раневого процесса.

4. Проведенное математическое моделирование выявило наличие специфических паттернов результирующих модели квадратичных поверхностей, находящих отражение в классической тинкториальной характеристике нейронов, что может быть использовано при проведении

комплексной оценки реакции спинномозговых узлов на тяжесть течения раневого процесса при регенерации кожной раны.

Личный вклад автора: весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.

Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в научно-исследовательскую практику НИИ экспериментальной биологии и медицины при ГБОУ ВПО «Воронежский государственный медицинский университет имени H.H. Бурденко» МЗ РФ. Материалы диссертации используются на лекциях и практических занятиях кафедры анатомии и физиологии ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный педагогический университет» Министерства образования и науки РФ, кафедре гистологии ГБОУ ВПО «Воронежский государственный медицинский университет имени H.H. Бурденко» МЗ РФ.

По результатам выполнения работы оформлено одно рационализаторское предложение № 1513 от 15.05.2015 г.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены на III молодежном инновационном форуме (Воронеж, 2010); заседаниях Воронежского филиала ВНОАГЭ (Воронеж, 2011, 2014); VIII Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2011); И международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине» (Санкт-Петербург,

2011); III Эмбриологического симпозиума «Югра-Эмбрио-2011» (Ханты-Мансийск, 2011); общероссийской научной конференции «Инновационные медицинские технологии» (Москва, 2011); международной научной конференции «Актуальные вопросы морфологии» (Кишинев, Молдова,

2012); X, XI и XII Конгрессах Международной Ассоциации Морфологов (Ярославль, 2010, Самара, 2012, Тюмень, 2014); на заседании Воронежского филиала Российского хирургического общества (Воронеж, 2012); II межрегиональной научно-практической конференции «Наука - социально-значимые проекты», VII-го молодежного инновационного форума, 11 научно-практической конференции хирургов «Бурденковские чтения» (Воронеж, 2012); VI Всероссийской конференции молодых ученых «Комплексный подход к диагностике, лечению и профилактике в медицине» (Воронеж, 2013); Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаратив-ных гистогенезов», посвященной памяти чл.-корр АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко (Оренбург, 2013); международной научно-практической конференции «Макро-микроскопическая анатомия органов и систем в норме и патологии», посвященной 100-летию дня рождения профессора Ибрагимовой З.И. (Витебск, 2014); научном совещании «Учение о тканях. Гистогенез и регенерация» (Санкт-Петербург, 2015).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 научных работ, из них 10 статей - в рецензируемых журналах, рекомендованных

ВАК РФ для публикации результатов диссертационного исследования, и в системе цитирования (библиографической базе) Web of Science.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 169 страницах текста компьютерного набора, состоит из введения, обзора литературы, материала и методов исследований, 3 глав результатов собственных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа содержит 16 таблиц, иллюстрирована 91 рисунком. Список литературы включает 267 источника, в том числе 127 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Диссертационная работа выполнена на основе совместно проведенного эксперимента кафедр нормальной анатомии человека Воронежского государственного медицинского университета имени H.H. Бурденко, НИИ хирургической инфекции и НИИ экспериментальной биологии и медицины ВГМУ им. H.H. Бурденко.

Эксперимент выполнен на 300 половозрелых самцах белых беспородных крыс с начальным возрастом 4 мес и массой 250 - 300 г. Протокол эксперимента в разделах выбора, содержания животных и выведения из опыта был составлен в соответствии с принципами биоэтики и правилами лабораторной практики, которые представлены в «Международных рекомендациях по проведению медико-биологических исследований и использованию животных» и приказе МЗ РФ /№ 267 от 19.06.2003 г. «Об утверждении правил лабораторной практики».

Для моделирования различного течения ран кожи были выделены следующие экспериментальные группы:

1. Естественное заживление асептических ран (АР) — 40 животных.

2. Естественное заживление гнойных ран (ГнР) — 40 животных.

3. Применение обогащенной тромбоцитами плазмы крови (ОТПК) в процессе заживления асептических ран (АР+ОТПК) - 40 животных.

4. Применение ОТПК в процессе заживления гнойных ран (ГнР+ОТПК) - 40 животных.

5. Использование методики гидроимпульсной санации (ГИС) в процессе заживления асептических ран — 40 животных.

6. Использование методики ГИС при гнойном раневом процессе (ГнР+ГИС) - 40 животных.

7. Использование комплекса — гидроимпульсная санация и обогащенная тромбоцитами плазма крови при гнойном раневом процессе (ГИС+ОТПК) - 40 животных.

В соответствии с планом эксперимента были сформированы группы животных, для каждого срока эксперимента был определен свой интакт-ный контроль (ИК, 20 животных). Забор материала осуществлялся на 1, 3, 5, 7, 14-е и 21-е сутки после моделирования раны.

Моделирование естественного заживления асептической раны. В стерильных условиях на переднюю поверхность левого бедра крысы острым скальпелем наносили разрез длинной 1 см и глубиной 0,5 см. Швы на рану не накладывали. Раневой дефект закрывали стерильной повязкой, которую меняли при каждом кормлении животных.

Моделирование естественного заживления септической раны. Для моделирования гнойного раневого процесса крысе наносили линейный разрез кожи и подлежащих тканей длинной 1 см и глубиной 0,5 см. В образовавшийся раневой дефект вносили марлевый тампон с взвесью суточной культуры Staphillococcus aureus с концентрацией 1010 микробных тел в 1 мл 0,9% раствора NaCl, на рану накладывали адаптационные швы.

Моделирование стимулированного заживления раны. В качестве фактора, изменяющего скорость заживления раны, применяли сгусток ОТГПС. Тромбоцитарный концентрат, с концентрацией тромбоцитов не менее 1 млн/мкл, получали путем центрифугирования в цитратном буфере аутологической крови крысы, забранной из хвостовой вены животного. Для внесения ОТПК применяли устройство для нанесения гелеобразных лекарственных средств «УНГЛС - 01» (Глухов, Алексеева, 2012).

Для осуществления гидроимпульсной санации раны использовали модифицированный аппарат УГОР-1М, который способен формировать мелкодисперсный поток раствора с заданным давлением. Санацию раны осуществляли изотоническим раствором NaCl, струю направляли под углом 45° к условной поверхности дна раны.

Морфологические методы исследования. Спинномозговой ганглий фиксировали в жидкости Карнуа (хлороформ, абсолютный спирт, ледяная уксусная кислота в соотношениях 6:3:1) с последующей заливкой в смесь парафин-гистомикс после стандартной процедуры обезвоживания. Серийные продольные срезы толщиной 6-7 мкм окрашивали крезиловым фиолетовым по методике Ниссля в модификации И.В. Викторова (Викторов, 1969). Для окрашивания использовался забуференный 0,2% раствор крезилового фиолетового прочного pH = 3,6 - 3,8. Для качественного анализа и идентификации структурных особенностей в популяции нейронов СМУ нами выделялись и подсчитывались нейроны на четырех равноудаленных срезах каждого СМУ с различимыми ядрами и ядрышками, отдельно фиксируя при этом клетки с морфологическими эквивалентами дистрофических и деструктивных реакций.

Цито- и кариометрический анализ клеток проводился в контрольной и опытных группах по следующим параметрам: площади поперечного среза клетки, при нахождении в этом срезе ядра и ядрышка, площади ядра, значениям ядерно-цитоплазматического индекса (ЯЦИ). Для определения площади ядер и площади центрального среза нейронов производили цифровую микрофотосъемку с использованием компьютерного комплекса анализаторов изображений на базе микроскопа Leica DMLB. Полученные изображения обрабатывали с использованием графического

планшета и программы ImageJ ver. 1.68. Значения площади в пикселях переводили в мкм2 при помощи встроенного в программу и откалиброван-ного конвертера. Оценку глиального компонента проводили с помощью дифференцированного подсчета сателлитных глиальных клеток вокруг перикарионов нейронов для каждого морфофункционального и размерного типа нервных клеток. К сателлитам относили клетки, удалённые не далее чем на диаметр их ядра от тела нейрона.

Количественная оценка РНК и общего белка. Учитывая, что изменение количества РНК в цитоплазме нейронов является одним из существенных и постоянных показателей, характеризующих повышение или снижение их функциональной активности, проведено исследование содержания РНК и общего белка в нейронах СМУ. Для выявления РЖ фиксированные в жидкости Карнуа срезы окрашивали азуром В (pH 4,0) по методу S. Shea (S. Shea, 1970). Суммарный белок выявляли окрашиванием реактивом сулема-бромфеноловый синий (D. Mazia, P. Brewer, D. Alfert, 1953). Количественную цитофотометрию для оценки количественного эквивалента содержания РНК и суммарного белка производили при увеличении х400 на микроскопе Leica DML с помощью программного комплекса «ВидеоТест Морфология» в патологоанатомическом отделении Дорожной клинической больницы ОАО «РЖД» (г. Воронеж). Оптическую плотность продуктов реакции выражали в условных единицах.

Статистический анализ проведён с помощью компьютерной программы Statistica 10.0. Результаты подсчёта представлены в виде М ± а, где М - среднее значение исследуемого показателя, о - стандартное квадратичное отклонение.

Для оценки характера распределения использовались графический метод построения гистограмм и критерии Колмогорова-Смирнова и Ли-лиенфорса, межгрупповые сравнения выполнялись с помощью непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни, непараметрического дисперсионного анализа Спирмена. Также использовался одно- и многомерный регрессионный анализ, вычислялся коэффициент корреляции. При изучении взаимосвязей строились двумерные диаграммы рассеяния и результирующие трехмерные квадратичные поверхности. Достоверными считались результаты при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка морфологических изменений нейронов. При анализе морфологических особенностей нейронов СМУ было установлено деление их на различные популяции. Произведенные морфометрические измерения в контрольной группе животных продемонстрировали бимодальный характер распределения выборки (рис. 1), что было положено нами в основу разделения нейронов СМУ сегментов Ьш-Ь/ у экспериментальных животных на две группы - А и В типа.

5. ггЛтгг

Рис. 1. Бимодальный характер распределения площадей нейронов поясничных СМУ. По оси абсцисс - площадь среза нейрона (Б, мкм2), по оси ординат - число наблюдений.

Рис. 2. Полиморфизм реакций нейронов СМУ при спонтанном течении асептических ран. Окраска по Нисслю. а - интактные нейроны А- и В-типа, 1 сут, х 480; б - хроматолиз в нейронах СМУ на 3-й сут асептического процесса, х 240; в - пикнотические изменения нейронов СМУ, высокий уровень базофилии на 7-е сут асептического процесса, х 120.

А-тип нейронов - крупные, светлые нейроны с отчётливыми глыб-ками базофильного вещества и волокнистой ядерной мембраной, одним большим центрально расположенным ядрышком или иногда с 1-2 мелкими ядрышками, чаще с миелинизированным аксоном (рис. 2, а). У интактных животных доля таких клеток составляла 32,9%. По данным морфометрии средняя площадь центрального среза таких нейронов составляла 95 8,3±12,4 мкм2, площадь ядра 167,2±6,1 мкм2. Среднее значение ядерно-цитоплазматического индекса для А-типа нейронов составляло 0,211±0,04 ед. Перинейрональное окружение таких нейронов составляло 3,44±0,12 сателлитов на одну клетку. Содержание РНК и общего белка, по результатам измерения оптической плотности продуктов реакции составляло 0,081 ±0,009 и 0,021±0,004 усл. ед. соответственно.

В-тип нейронов—мелкие, тёмные клетки с диффузным распределением базофильного вещества, часто со светлым ореолом в центре клетки, гладкой ядерной мембраной, с одним или более мелкими ядрышками, часто расположенными на периферии ядра, преимущественно с немиелинизи-рованными отростками (см. рис. 2, а). Доля таких нейронов у интактных животных составляла 61,6%. Средняя площадь среза нейрона составляла 335,2±37,2 мкм2, площадь ядра 99,1±3,2 мкм2. Среднее значение ядерно-цитоплазматического индекса равнялось 0,418±0,11 ед. Количество клеток сателлитов равнялось 2,31±0,13 на один нейрон. Содержание РНК и общего белка, по результатам измерения оптической плотности продуктов реакции было определено в 0,111±0,014 и 0,0322±0,008 усл. ед. соответственно.

В пределах указанных подтипов отмечались группы клеток отличных по своим тинкториальным характеристикам от подавляющего большинства. Данную популяцию мы расценивали как клетки с хорошо различимыми на светооптическом уровне реактивными изменениями, проявляющимися в значительных изменениях хроматофильной субстанции, формы ядра и перикариона.

Доля нейронов А-типа с проявлениями реактивных реакций в контрольной группе была незначительной и составила 1,8% от всех изученных нейронов. Площадь среза таких нейронов составляла 956,4±47,2 мкм2, площадь ядра 179,1±13,2 мкм2. Среднее значение ядерно-цитоплазмати-ческого индекса равнялось 0,231 ±0,18 ед. Количество клеток сателлитов равнялось 3,46±0,09 на один нейрон. Содержание РНК и общего белка, по результатам измерения оптической плотности продуктов реакции было определено в 0,103±0,018 и 0,019±0,007 усл. ед. соответственно.

Доля нейронов В-типа с признаками альтеративных реакций в контроле была также незначительна и составила 2,8%. Площадь среза таких нейронов составляла 337,6±38,2 мкм2, площадь ядра 101,4± 11,2 мкм2. Среднее значение ядерно-цитоплазматического индекса равнялось 0,428±0,14 ед. Количество клеток сателлитов было схожим с таковым у интактных нейронов и составило 2,32±0,08 на один нейрон. Содержание РНК и общего белка, по результатам измерения оптической плотности продуктов реакции составляло 0,094±0,017 и 0,024±0,006 усл. ед. на один нейрон.

Отдельно наблюдались единичные клетки с выраженными признаками нарушения метаболизма, проявляющимися в виде крайней степени изменений тинкториальных свойств, выраженным пикнозом и процессами лизиса клеточного тела — фактически наблюдались клетки, вошедшие в стадию необратимых дистрофических и деструктивных изменений. Данная группа клеток определялась нами как деструктивно измененные нейроны, их доля в контрольной группе составила 0,9%. Вследствие значительной деформации клеточного тела и распада ядра измерения их морфометрических характеристик и деление их на подгруппы нами не производилось.

Асептическое течение раневого процесса. Результаты гистологического анализа состояния нейронов СМУ при асептическом течении раневого процесса показали, что уже через 24 часа после операции в структуре изучаемых ганглиев были обнаружены изменения реактивно-деструктивного характера. У некоторых нейронов отмечены признаки первичного раздражения: тела клеток набухшие с различной степенью лизиса хроматофильного вещества от распыления в центре до почти полного исчезновения, ядра смещены к одному из полюсов, ядрышко нередко принимало эксцентричное положение. Отдельные нейроны имели признаки центрального хроматолиза, проявления эктопии и набухания ядра, распыления вокруг него глыбок тигроида (рис. 2, б).

Нейроны с такими признаками реактивных реакций обнаруживались среди обеих популяций клеток ганглия. Среди А-нейронов их доля на 1-е сутки эксперимента составляла 3,7%, для В-клеток 9,6% (рис. 3, а). Для части таких клеток в дальнейшем возможен переход к необратимым структурным изменениям с дальнейшим цитолизом. В дальнейшем на всем протяжении первой недели эксперимента отмечалось нарастание доли реактивно измененных клеток с выходом на максимальное значение на 7-е сутки в 13,2% для А-типа и в 32,3% для В-типа нейронов. На всем протяжении этого периода преобладающими формами изменений были различные виды хроматолиза—от краевого до тотального, конформацион-ные нарушения вследствие изменения структуры коллоидов цитоплазмы и элементов цитоскелета - пикноз тел нервных клеток (см. рис. 2, б, в). Максимальное количество деструктивных форм (5,4%) также отмечалось на 7-е сутки.

К исходу второй недели эксперимента количество измененных форм А-нейронов начинало снижаться (11,8%), доля же реактивных В-клеток продолжала оставаться на максимально высоком уровне (32,8%). Однако надо отметить, что внутри популяции реактивно измененных нейронов начинали отмечаться в значимом числе темно окрашенные нейроны с крупными ядрам, относящиеся к обоим подтипам (А- и В-). На 21 -е сутки наблюдалось снижение числа измененных нейронов до 10,2% и 26,6% для А- и В-клеток соответственно (см. рис. 3, а). Компенсаторные реакции в нейронах СМУ при этом продолжали нарастать, однако количество деструктивных форм практически не изменилось в сравнении с предыдущим экспериментальным сроком.

В группе с применением ГИС при схожей последовательности смены типа доминирующих реакций отмечалось значительно более быстрое нарастание числа реактивно измененных клеток: для А-нейронов с 3,9% на 1-е сутки до 12,2%) и 15,5% на 3 и 5-е сутки соответственно; для В-нейронов с 13,3% до 30,1% и 34,2% на 1,3,5-е сутки соответственно (рис. 3, б). В дальнейшем процент измененных клеток А-типа начинал снижаться, процент для клеток В-типа оставался высоким и на 21 -е сутки незначительно превышал таковой для первой группы. Деструкция клеток также была

г

■ Дестр

■ РеактВ г РеактА « ИнтВ

ИнтА

100% 80% 60% 40% 20% 0%

Естественное заживление асептической раны

1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 14 сут 21 сут ик

Асептическая рана с

1 в| 100% 80%

— | Асептическая рана

с обработкой ГИС

100%

60% 40% 20% 0%

1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 14 сут 21 сут ик

введением ОТПК

60% 40% 20% 0%

1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 14 сут 21 сут ик

Рис. 3. Соотношение долей интактных и измененных нейронов обеих размерных субпопуляций при асептическом раневом процессе. Ось абсцисс: сроки забора материала; ось ординат: доля в процентах изучаемых подтипов клеток.

выражена сильнее (6%) на протяжении с 7-х по 21 -е сутки. Значительное нарастание числа измененных форм в этой экспериментальной группе в начальные сроки, по всей видимости, можно трактовать как следствие более выраженной афферентной импульсации вследствие механического воздействия ГИС на уже поврежденные нервные окончания в области раневого дефекта.

Применение ОТПК приводило к довольно значительному изменению как характера реакций, так и их количественного эквивалента. Максимальная доля нервных клеток с реактивными изменениями отмечалась уже на 3-й сутки эксперимента и была ниже таковой у других экспериментальных групп, в особенности для малых В-нейронов (рис. 3, в). При этом среди таких клеток уже на 5-е сутки преобладали нейроны с компенсаторными и регенераторными изменениями. Дальнейшее уменьшение числа измененных нервных клеток обеих популяций происходило с большей скоростью, на 21 -е сутки эксперимента доли измененных А- и В-нейронов составляли соответственно 2,2% и 3,6%). Деструкция в данной группе также была выражена значительно слабее и не превышала 3%.

Септическое течение раневого процесса. При гнойном течении раневого процесса в случае естественного заживления отмечалось постепенное снижение долей интактных нейронов: для А-нейронов с 29,9% на 1 -е сут

100% 80% 60% 40% 20%

Естественное заживление гнойной раны

100% 80% 60% 40% 20%

1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 14 сут 21 сут ик

' Селективное применение ОТПК

1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 14 сут 21 сут ик

Селективное применение ГИС

100% 80% 60% 40% 20% 0%

100% 80% 60% 40% 20% 0%

1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 14 сут 21 сут ик

Комплексное применение ГИС и ОТПК

1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 14 сут 21 сут

«ИнтА «И нтВ «РеактА "РеактВ "Дестр

Рис. 4. Соотношение долей интактных и измененных нейроцитов обеих размерных субпопуляциях при инфицированном течении и различных видах регионального воздействия. Ось абсцисс: сроки забора материала; ось ординат: доля в процентах изучаемых подтипов клеток.

до 15,9% на 7-е сут; для В-нейронов с 54,1% на 1-е сут до 23,1% на 14-е сутки. К окончанию эксперимента доля интактных нейронов проявляла тенденцию к восстановлению, так на 21 -е сутки количество интактных нейронов А-типа составило 17,4%, В-типа - соответственно увеличилась до 27,1% (рис. 4, а).

Соответственно вышеописанным сдвигам нарастало число нейронов с признаками реактивных изменений. На первые сутки отмечались преобладающие явления центрального хроматолиза, более выраженные для малых. В-нейронов - 10,6% клеток, доля измененных А-клеток в этом сроке была незначительной и составляла 3,9% от всего числа оцененных клеток СМУ. С 3-х по 5-е сутки был зафиксирован активный рост доли измененных нейронов, среди которых возникали клетки с тотальным хроматолизом, явлениями эктопии ядра и различными пикнотическими изменениями (см. рис. 2, б, в). В максимуме на 5-е сутки доля измененных А-нейронов составляла 17,2%, В-нейронов - 37,6% соответственно (см. рис. 4, а).

В продолжении эксперимента доля измененных А-нейронов незначительно снижалась к 21-м суткам до 14,5%, В-клетки продемонстрировали

более значительное снижение с 36,3% на 14-е сутки до 31,8% на 21 -е сутки. Однако в целом необходимо отметить, что к окончанию эксперимента в данной группе доля измененных клеток была достаточно большой. Отдельный интерес вызывало нарастание с 3-х суток доли погибающих нейронов, которая продолжала оставаться на уровне 9,2% вплоть до окончания эксперимента.

В экспериментальной группе с применением ГИС отмечались схожие качественно и хронологически изменения (рис. 4, б). Максимальная доля клеток обеих субпопуляций с обратимыми изменениями регистрировалась на 5-е сутки, однако была достоверно меньше и составила 14,1% А-нейронов и 32,8% В-нейронов. В конце эксперимента количество измененных А-нейронов составило 11,2% и было ниже, чем при естественном заживлении раневого дефекта. Однако количество реактивно измененных В-нейронов на 21-е сутки продолжало оставаться высоким, практически не продемонстрировав в период 5-е - 21-е сутки тенденции к снижению. Доля деструктивно измененных клеток в данной группе достигала максимума в 6,1% на 21-е сут эксперимента и была хоть незначительно, но достоверно ниже, чем в первой экспериментальной группе.

Применение изолированного введения ОТПК при схожей временной динамике отразилось в значительном увеличении доли измененных нейронов и, соответственно, сильно выраженном снижении количества ин-тактных нейронов (рис. 4, в). В данной экспериментальной группе высокое количество измененных А- и В-клеток, 18,2% и 39,6% соответственно, отмечалось в период 5-е- 7-е сутки эксперимента. При этом на 14-е сутки для А-нейронов продолжался рост доли измененных нейронов до 19,2%; доля реактивных В-клеток снижалась до 35,3%. В конце эксперимента доли измененных А- и В-нейронов составляли 15,2% и 33,1% соответственно. Отдельно необходимо отметить значительно увеличившуюся деструкцию, максимальное количество таких клеток было зафиксировано на 21 -е сутки и составило 14,3% от всех изученных нейронов. Также в данной группе было отмечено достоверное изменение соотношения общего количества А- и В-клеток: на 14-е сутки произошло уменьшение на 12,3% суммарной доли малых В-нейронов.

Комплексное применение ГИС и ОТПК в последней экспериментальной группе продемонстрировало отличный от предыдущих групп характер (рис. 4, г). Схожий с естественным заживлением рост количества измененных клеток наблюдался лишь на протяжении первых 5 суток эксперимента. При этом надо отметить, что при максимальном показателе доли измененных А- и В-нейронов на 5-е сутки, среди них преобладали клетки с компенсаторными реакциями, пикнотические изменения были выражены слабее. В подтверждение этого можно отметить значительно менее выраженную деструкцию: максимальное количество таких клеток отмечалось на 21 -е сутки и составило всего лишь 3,1 % от общего количества нейронов. Наблюдалось также достоверное по отношению ко всем остальным

группам снижение доли обратимо измененных нейронов на 21-е сутки эксперимента: 6,8% и 16,8% для А- и В-нейронов соответственно.

Обобщая качественную и количественную оценку изменения морфологических форм нейронов СМУ можно отметить, что наблюдавшиеся изменения носили неспецифический характер и демонстрировали некоторую фазность реакций. Так, в начальный период, до 3-х суток, преобладали изменения, характеризующие ярко выраженную первичную реакцию нейронов на резко возросшую функциональную активность и последствия повреждения периферических отростков - преимущественно хроматолитические реакции и начальные проявления пикнотических изменений. При этом, как показал дальнейший анализ, интактные клетки переходили в режим повышенной функциональной активности.

На следующем этапе, продолжительность которого сильно варьировала между экспериментальными группами, происходило разделение альтеративных процессов на дистрофические с исходом в деструкцию и на компенсаторные гиперпластические реакции. На третьей фазе, для большинства групп начинающейся в районе 7-х суток, начинали преобладать регенерационные процессы, а дистрофические процессы массово заканчивались клеточной деструкцией. Отдельно необходимо отметить большую выраженность изменений В-нейронов, их реакции нарастали быстрее и имели большую амплитуду значений.

Результаты измерений планиметрических характеристик нейронов суммарно отражали преобладающие на различных этапах неспецифические изменения тинкториальных свойств нейронов обеих субпопуляций.

Для интактных нейронов без проявлений клеточной дистрофии была характерна динамика роста размера клетки с максимальными значениями в пике регенерационных процессов в раневом дефекте. Положение максимума площади перемещалось к более ранним срокам в ряду: для асептического течения - ОТПК, ГИС, естественное заживление; для гнойного течения - комплекс ОТПК и ГИС, селективное применение ГИС, естественное заживление и селективное применение ОТПК. В последнем случае максимальные размеры нейронов субпопуляций приходились на 14-е сутки (табл. 1). Инфицированному течению соответствовали большие значения размеров интактных нервных клеток.

Для реактивных нейронов была свойственна нелинейная динамика изменения площади во всех группах, кроме применения ОТПК при асептическом процессе и комплексной терапии при гнойном процессе. Большая часть реактивных нейронов двух подтипов демонстрировала быстрый рост на первые сутки, на стадии первичного раздражения, который сменялся уменьшением площади и дальнейшим «сморщиванием». В дальнейшем большая часть нейронов переходила к повторному увеличению размеров и восстановлению полноценной функциональной активности. Однако в случае спонтанного течения гнойного процесса и при селективном применении ОТПК остановка роста размеров могла смениться тенденцией к

Таблица 1. Площади нейронов в зависимости от типа течения раневого процесса и вида регионального воздей-ствия, мкм2_ _ _____

Тип течения раневого процесса Размерная группа Тип нейронов Площадь нейрона, мкм2, М ± б

Контроль 1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 14 сут 21 сут

АР А-тип Интакт 958±14,6 959±17,3 961±18,6 965±21,9 965±22,0 963±26,1 960±20,1

Реакт 95б±17,7 97 Ш 9,2* 955±20,6 949±24,4 966±25,6* 961 ±29,0 959±22,3

В-тип Интакт 332±10,2 336±10,9 339±11,9 341±14,4* 342±14,3* 340±17,2 337±13,0

Реакт 335±И,4 339±12,1 334±12,9 336±15,3 340±15,3 337±18,2 336±14,0

АР+ГИС А-тип Интакт 958±14,6 958±19,6 960±21,2 964±24,1 967±23,7 965±28,2 962±21,5

Реакт 956±17,7 967±21,8* 957±23,5 954±26,8 961±27,7 965±31,4 960±23,9

В-тип Интакт 332±10,2 337±12,3 340±13,6 341±15,8 343±15,4 340±18,6 339±13,9

Реакт 335±П,4 338±13,7 336±14.8 335±16,8 340±16,5 33 9± 19,7 337±15,0

АР+ОТПК А-тип Интакт 958±14,6 960±18,8 966±20,3 969±23,1 968±22,8 960±27,1 959±20,7

Реакт 956±17,7 975±20,7 976±22,3 978±25,4* 969±26,3 959±29,8 957±22,7

В-тип Интакт 332±10,2 337±11,3 342±12,4 344±15,0 345±14,8 341±17,9 337±13,5

Реакт 335±11,4 341± 12,6 342±13,5 347±15,9 343±15,9 339±19,0 337±14,6

ГнР А-тип Интакт 958±14,6 960±20,8 1033±22,4* 1043±25,6* 1025±25,1 * 1019±29,9* 1009±22,8*

Реакт 956±17,7 982±13,0 920±14,4 918±16,8 1043±16,3* 1046±19,7* 1026±14,7*

В-тип Интакт 332±10,2 342±23,1 373±24,9 369±28,4 381±29,3 377±33,3 369±25,3

Реакт 335±11,4 346±14,5 331±15.6 329±17,8 340±17,5 346±20,9 340±15,9

ГнР+ГИС А-тип Интакт 958±14,6 994± 19,6 996±21,2 999±24,1 1003±23,7* 998±28,2 968±21,5

Реакт 956±17,7 977±12,3 931±13,6 945±15,8 986±15,4 981±18,6 979±13,9

В-тип Интакт 332±10,2 348±21,8 351±23.5 353±26,8 354±27,7 352±31,4 341±23,9

Реакт 335±11,4 350±] 3,7 336±14,8 351±16,8 348±16,5 345±19,7 338±15,0

ГнР+ОТПК А-тип Интакт 958±14,6 962±20.9 1022±22,6* 1031±25,8* 1039±25,4* 1043±30,2* 1015±23,0*

Реакт 956±17,7 972±13,1 913±14,5 911±16,9 1036±16,5* 1055±19,9* 1035±14,9*

В-тип Интакт 332±10,2 347±23,3 363±25,2 357±28,7 366±29,6 384±33,6 376±25,6

Реакт 335±11,4 351±14,6 331 ±15,8 329±18,0 336±17,7 340±21,1 346±16,1

ГнР ГИС+ОТПК А-тип Интакт 958±14,6 972±19,8 979±21,4 982±24,4 981±23,2 972±27,7 971±21,1

Реакт 956±17,7 1004±12,4* 1005±13.7* 1007±16,0*# 998±15,1# 988±18.2# 986±13,6

В-тип Интакт 332±10,2 343±22,0 345±23.7 352±27,1 347±27,1 342±30,7 340±23,4

Реакт 335±11,4 368±13,8 357±14,9 359±17,0" 357±16,2 353±19,3 349±14,7

Примечание. * - р < 0,05 при сравнении с интактным контролем,# - р < 0,05 при сравнении со спонтанным течением

для данного типа раневого процесса в области иннервации СМУ.

Рис. 5. Выявление РНК в нейронах СМУ. Окраска азуром В, х 480. а - АР+ГИС, 14 сут; б - ГнР+ОТПК, 14 сут, повышенное содержание продукта реакции.

их снижению не только до уровня интактных животных, но и ниже него, что соответствовало пикнотическим изменениям. Причем такая динамика отмечались и у интактных по всем признакам нейронов.

При анализе белоксинтетической активности по показателям оптической плотности РНК (рис. 5) и белка было установлено, что при асептическом характере раневого процесса в случае спонтанного заживления максимальные значения оптической плотности наблюдались в интактных нейронах А-типа на 5-е сутки (табл. 2). Кривая носила фазный характер с вторичным минимумом на 14-е сутки эксперимента. Использование ГИС в целом не изменяло ход результирующей кривой, однако сопровождалось общей тенденцией к уменьшению величины оптической плотности и появлением вторичного максимума на 14-е сутки. Применение ОТПК сопровождалось формированием однофазной кривой с максимумом белоксинтетической активности на 5-е сутки.

В реактивных нейронах А-типа в целом отмечались более высокие значения оптической плотности, ход результирующих кривых, их хроновектора были однонаправлены с таковыми у интактных нейронов А-типа. Тем не менее, отмечалось определенное своеобразие данного паттерна при применении ГИС и ОТПК, выражавшееся в более высоких значения оптической плотности при применении ГИС с 5 по 14-е сутки и формировании максимумов на 5-7-е сутки при применении ОТПК, в последнем случае отмечались наибольшие значения оптической плотности. Указанные изменения, вероятно, обусловлены стимуляцией белоксинтетической активности, привносимой за счет использования обогащенной тромбоцитами плазмы крови.

В случае субпопуляции интактных нейронов В-типа максимум оптической плотности отмечался при спонтанном течении раневого процесса на 5-е сутки, при применении ГИС он смещался в сторону 1-х суток. Действие ! тромбоцитарных факторов роста приводило к формированию максимума

17

________

Тип течения раневого процесса Размерная группа Тип нейронов Оптическая плотность РНК, усл. ед., М ± б

Контроль 1 сут 3 сут 5 сут 7 сут 14 сут 21 сут

АР А-тип Интакт 0,081 ±0.006 0,090±0,007 0.093±0.007 0,101±0,008* 0.092±0,007 0,083±0,006 0,082±0,006

Реакт 0.103±0.008 0,112±0,008 0,112±0,008 0,148±0,01Г 0,144±0,01Г 0,129±0,010* 0,106±0,008

В-тип Интакт 0,1П±0,008 0,105±0,008 _0,П4±0,009 0,131±0,010* 0,130±0,010 0,124±0,009 0,118±0,009

Реакт 0.094±0,007 0,093±0,007 0,084±0.006' 0,137±0.010* 0,153±0,011 * 0,153±0,011* 0,110±0,008

АР+ГИС А-тип Интакт 0,081 ±0,006 0,074±0.006* 0,077±0,006# 0,084±0.006# 0.084±0,006* 0,088±0,007# 0,085±0,006

Реакт 0.103±0,008 0.101±0.008" 0,103±0.008 0,132±0,010* 0,130±0,010* 0,138±0,010*# 0,107±0,008

В-тип Интакт 0,) 11 ±0,008 0,100±0,008 0,105±0.008 0,140±0,01 Г" 0.146±0,01Г* 0,135±0,010" 0,119±0,009

Реакт 0.094±0,007 0,083±0,006 0,073±0,005* 0.141±0,01Г 0,152±0,01Г 0,157±0,012* 0,108±0,008

АР+ОТПК А-тип Интакт 0,081±0,006 0,094±0.007 0,092±0,007 0,100±0,008 0,094±0,007 0,088±0,007 0,083±0,006

Реакт 0,103±0,008 0,130±0,010*# 0.133±0,010*« 0,154±0,012* 0,148±0,01Г 0,137±0,010* 0,104±0,008

В-тип Интакт 0,111±0.008 0,115±0,009 0,121±0,009* 0,151±0.011 0,135±0.010* 0,131±0,010 0,119±0,009

Реакт 0,094±0,007 0.112±0,008*# 0,114±0,009*" 0,157±0,012** 0,161±0,012* 0,150±0,01Г 0,097±0,007

ГнР А-тип Интакт 0,081±0,006 0,072±0,005 0,073±0,005 0.081 ±0,006 0,085±0,006 0,091±0,007 0,086±0,006

Реакт 0,ЮЗ±0,008 0,096±0.007 0,098±0,007 0,127±0,010 0,133±0,010* 0,142±0,01Г 0,109±0,008

В-тип Интакт 0.111 ±0,008 0.095±0,007 АЮ0±0,008 0,136±0.010" 0.148±0,01Г 0,139±0,010* 0,121±0,009

Реакт 0,094±0.007 0,079±0.006 0,069±0,005* 0,123±0,009* 0,162±0,012* 0,199±0,015* 0,111±0,008

ГнР+ГИС А-тип Интакт 0.081±0.006 0,096±0,007*# 0,079±0,006 0,090±0,007 0,102±0,008*# 0,095±0,007 0,084±0,006

Реакт 0,103±0.()08 0,106±0,008 0,106±0,008 0,125±0,009 0,160±0,012*# 0,148±0,011 * 0,108±0,008

В-тип Интакт 0.111±0,008 0,099±0,007 0,108±0.008 0,121 ±0.009 0,133±0,010*# 0,133±0,010* 0,120±0,009

Реакт 0,094±0.007 0.088±0,007" 0,080±0,006# 0,133±0,010*# 0,172±0,013* 0,170±0,013*# 0,112±0,008

ГнР+ОТПК А-тип Интакт 0.081±0.006 0,069±0,005 0,072±0,005 0,080±0,006 0,084±0,006 0,086±0,006 0,083±0,006

Реакт 0.103±0.008 0,094±0,007 0,096±0,007 0,121±0,009* 0,128±0,010* 0,135±0,010* 0,110±0,008

В-тип Интакт 0,111±0,008 0.093±0.007 0,098±0,007 0,131±0,010* 0,133±0,010*# 0,140±0,01Г 0,116±0,009

Реакт 0.094±0,007 0,077±0.006 0,068±0,005* 0,099±0,007# 0,144±0,01 Г* 0,189±0,014* 0,120±0,009*

ГнР ГИС+ОТПК А-тип Интакт 0,081 ±0.006 0.097±0,007*# 0,100±0,008*# 0,099±0,007* 0,100±0,008* 0,090±0,007 0,091±0,007

Реакт 0,103±0,008 0,104±0,008 0,104±0,008 0,128±0,010* 0.153±0,011*# 0,140±0,01Г 0,104±0,008

В-тип Интакт 0,111±0,008 0.097±0.007 0,106±0.008 0,116±0,009" 0,127±0,010# 0,127±0,010 0,115±0,009

Реакт 0.094±0,007 0,087±0,007 0,099±0,007" 0,144±0.01Г# 0,165±0,012* 0,154±0,012*" 0,108±0,008

Примечание. ' - р < 0,05 при сравнении с интактным контролем, # - р < 0,05 при сравнении со спонтанным течением для данного типа раневого процесса в области иннервации СМУ.

в сроки соответствующие 5-м суткам, при этом аналогично субпопуляции нейронов А-типа применение тканевой терапии сопровождалось максимальными значениями маркеров белоксинтетической активности. Характерной особенностью результирующей реакции А-нейронов вне зависимости от типа воздействия являлось формирование однофазной кривой.

В случае реактивных нейронов В-типа отмечается формирование двухфазной кривой не зависимой от типов воздействия. Во всех случаях первичный максимум соответствовал первым суткам, однако характерной особенностью реакции данной субпопуляции являлось формирование вторичных максимумов, временная локализации которых была специфичной для каждого вида воздействия. В случае спонтанного течения вторичный максимум формировался на 7-е сутки, в случае ГИС на 14-е сутки, в случае применения ОТПК максимальные значения оптической плотности отмечались в промежутке с 5-х по 14-е сутки. Во всех случаях отмечалось приближение значения оптической плотности к величинам интактной группы к 21-м суткам, однако наиболее выраженной данная динамика была в группе с использованием ОТПК (см. табл. 2).

При инфицированном течении ран в интактных А-нейронах максимальное значение оптической плотности выявлялось к 14-м суткам. Применение всех видов регионального воздействия вносило определенное своеобразие в динамику изменения оптической плотности. Только при использовании ГИС формировалась двухфазная кривая с максимальными значениями оптической плотности на 1-е и 7-е сутки.

Реактивная субпопуляция нейронов А-типа при всех видах воздействия и спонтанном течении формировала двухфазные результирующие графики. Максимальные значения оптической плотности выявлялись при спонтанном течении инфицированной раны на 14-е сутки, использование ГИС формировало максимум на 7-е сутки, как при её изолированном применении, так и в сочетании с ОТПК. Изолированное использование ОТПК также формировало максимум на 14-е сутки, как и в случае спонтанного течения, однако величины оптической плотности в данной группе были ниже по сравнению со спонтанным течением, что вероятно можно расценивать как негативную реакцию данной субпопуляции на неадекватный для данного вида течения раневого процесса метод регионального воздействия.

Изучение реакции субпопуляции интактных нейронов В-типа показало наличие максимальных значений оптической плотности РНК на 7-е сутки при спонтанном течении, при этом в случае как комбинированного применения, так и изолированного использования ГИС данный пик не смещался и не изменялся по амплитуде. Изолированное применения ОТПК в то же время смещало его на 14-е сутки.

Значительно отличалась динамика при исследовании реактивной субпопуляции нейронов В-типа. Сочетанное применение ОТПК и ГИС формировало максимальное значение оптической плотности РНК на 7-е сутки, в то время как применение ГИС и, в особенности, ОТПК, а так же

при спонтанном течении смещало данный максимум к 14-м суткам (см. табл. 2). Вероятно, это можно расценивать как положительную реакцию нейронов на сочетание тканевой терапии и физических факторов воздействия.

Анализ зависимости содержания РНК в различных субпопуляциях нейронов и числа многоядрышковых клеток показал сложную нелинейную зависимость между указанными параметрами вне зависимости от вида раневого процесса. В целом можно отметить, что общей является тенденция к увеличению величины оптической плотности при нарастании процента многоядрышковых клеток. Наибольшие значения оптической плотности и числа многоядрышковых клеток отмечались в реактивных субпопуляциях вне зависимости от видов воздействия. По всей видимости, можно говорить о формировании некоторых оптимальных соотношений: максимальное значение оптической плотности в интактных субпопуляциях нейронов А- и В-типов отмечалось при меньших значениях числа многоядрышковых клеток в диапазоне от 2 до 4% (рис. 6). В субпопуляции реактивных В-нейронов регистрировался более высокий процент многоядрышковых клеток по сравнению с интактной субпопуляцией - максимум оптической плотности приходился на диапазон 5,0% - 6,0%.

При инфицированном течении характерной оказалась реакция, сопровождавшаяся увеличением процента многоядрышковых клеток, как в случае интактных, так и реактивных субпопуляций. Обращает внимание увеличение процента многоядрышковых клеток как в случае спонтанного течения, так и при всех видах использованного регионального воздействия. Тем не менее, наиболее «гармоничные» соотношения выявлялись при применении сочетания ГИС и ОТПК: доля многоядрышковых клеток приближалась к таковой в случае асептического течения при соответствующей динамике уровня оптической плотности РНК.

Анализ численности сателлитных глиоцитов и функциональной активности нейронов. Исследования соотношений числа глиальных клеток и гистохимических маркеров белоксинтетической активности как отражения активности метаболических процессов показало, что основным трендом во всех исследованных субпопуляциях нейронов вне зависимости от типа течения раневого процесса является увеличение уровня оптической плотности при росте числа глиальных клеток сателлитов (рис. 7). Тем не менее, отмечается определенное своеобразие этих взаимоотношений при разных типах течения раневого процесса и видах регионального воздействия.

В целом, при инфицированном течении отмечалось большее разнообразие реакций, проявлявшееся в появлении двухфазных результирующий кривых: первоначальному росту числа клеток сателлитов соответствовало кратковременное снижение уровня оптической плотности РНК, сменявшееся прямой зависимостью (г=0,858), выражавшейся в увеличении денситометрических характеристик при росте числа глиальных клеток.

Рис. 6. Результаты корреляционного и регрессионного анализов зависимостей гистохимических маркеров от числа многоядрышковых клеток в зависимости от вида регионального воздействия при асептическом течении. По оси абсцисс - доля многоядрышковых клеток в %, по оси ординат - оптическая плотность РНК в усл. ед. а - интактные В-нейроны, асептический процесс, естественное заживление, линейная регрессия; б - интактные В-нейроны, асептический процесс, полиноминальная регрессия (сплайн); в - реактивные В-нейроны, асептический процесс, обработка ГИС, линейная регрессия; г - реактивные В-нейроны, асептический процесс, обработка ГИС, полиноминальная регрессия (сплайн).

По достижении некоторого порогового значения оптической плотности дальнейший рост числа глиальных клеток сопровождался резким снижением денситометрических характеристик.

Наиболее выраженные реакции данного типа отмечались при изолированном и сочетанном с ГИС применении ОТПК при инфицированном течении раны. Вероятно, изменение хода кривой в начальные сроки связано с первичной реакцией, когда метаболические процессы носят стартовый, разнонаправленный характер, а снижение оптической плотности при параллельном увеличении количества сателлитов связано с формированием клеток больших размеров с низкой оптической плотностью РНК в цитоплазме, окруженных большим числом глиальных клеток, то есть, по существу' формированием клеток-«теней» (деструктивных форм нейронов). Анализ регрессионных кривых при сопоставлении показателей оптической плотности белка с количеством сателлитных глиоцитов характеризовался схожими закономерностями.

(\

/ 1 1 \

/ 1

\Ш

' 3,0 3.2 3,4 3,6 3,8 4,0 4Л 4,4 4,6 4,6 5,0 5,2 ' 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2

Рис. 7. Результаты корреляционного и регрессионного анализов зависимостей гистохимических маркеров от числа сателлитных гаиоцитов. По оси абсцисс - среднее количество сателлитных глиоцитов на один нейрон, по оси ординат - оптическая плотность РНК в усл. ед.

а - интактные В-нейроны, септический процесс, применение ОТПК, линейная регрессия; б - интактные В-нейроны, септический процесс, применение ОТПК, полиноминальная регрессия (сплайн); в - реактивные В-нейроны, септический процесс, обработка ГИС и последующее введение ОТПК, линейная регрессия; г - реактивные В-нейроны, септический процесс, обработка ГИС и последующее введение ОТПК, полиноминальная регрессия (сплайн).

Характерным является то, что при сопоставлении числа субпопуляций нейронов, их тинкториальных свойств, числа глиальных клеток, типов течения раневого процесса и видов регионального воздействия выявлялась положительная корреляция (112=0,9216), достигавшая максимальных значений при применении ОТПК и инфицированном течении ран, сопровождавшихся наибольшим числом деструктивных форм нейронов. Это, вероятно, является отражением биологической неадекватности данного вида регионального воздействия и типа течения раневого процесса. В то же время применение ГИС способствовало меньшей выраженности указанных проявлений.

Оценка корреляции планиметрических характеристик клеток и уровня белоксинтетической активности. В результате проведенного

многомерного корреляционного анализа было установлено наличие тесных корреляционных зависимостей между уровнем оптической плотности РНК и белка, ядерно-цитоплазматическим индексом и площадью клетки, выступавших в качестве непрерывных и категориальных предикторов для типа течения раневого процесса и вида регионального воздействия (рис. 8). В целом отмечается тенденция к формированию оптимумов, соответствующих максимальным значениям площади клетки при средних значениях ЯЦИ и оптической плотности РНК, при этом крайние формы, характеризовавшиеся максимальными значениями данных величин, визуально соотносились с деструктивными формами в виде клеток-«теней» и гиперхромных нейронов с признаками пикноза.

При асептическом течении в случае спонтанного раневого процесса и использовании ОТПК отмечалось формирование в целом линейной зависимости, при которой в интактной субпопуляции увеличение площади клетки сопровождалось гармоничным повышением оптической плотности и увеличением ЯЦИ. При этом для реактивной субпопуляции нейронов В-типа при применении ОТПК характер несколько изменялся с увеличением числа крайних форм. В случае применения ГИС характер зависимости также характеризовался некоторым увеличением числа крайних форм.

Для инфицированного течения общий характер зависимости был сходным, тем не менее, изолированное использование ОТПК сопровождалось резким изменением хода результирующих поверхностей и значительным увеличением доли нейронов, соотносимых с крайними морфологическими формами, что соответствовало значительному росту доли деструктивных форм. Комбинированное использование ГИС и ОТПК оказывало наиболее гармоничное воздействие на анализируемые параметры, что можно расценивать как морфологический эквивалент адекватности применения данного сочетания методов регионального воздействия при гнойной форме раневого процесса.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АР - асептические раны;

ГИС - гидроимпульсная санация;

ГнР - раны, осложненные гнойной инфекцией;

Дестр- нейроны с выраженными необратимыми изменениями структурно-функционального состояния (лизис клеточного тела, апоптотиче-ские изменения, клетки тени, крайние степени гиперхромности и пикноза);

Инт- нейроны без признаков значительного изменения структурно-функционального состояния;

НГ - нейроглия;

Реакт - нейроны с заметными альтеративными изменениями структурно-функционального состояния, на момент описания в основном об-

и

Рис. 8. Результаты моделирования с построением трехмерных результирующих поверхностей гистохимических и морфометрических характеристик нейронов ; СМУ. Горизонтальная ось X - значение ядерно-цитоплазматического индекса; горизонтальная ось У - оптическая плотность РНК, усл. ед.; вертикальная ось Т - площадь среза нейрона, мкм2.

а - интактные А-нейроны, асептическая рана при применении ОТПК; б - реактивные В-нейроны, асептическая рана при применении ОТПК; в - интактные А-нейроны, асептическая рана после обработки ГИС; г - интактные В-нейроны, асептическая рана после обработки ГИС; д - реактивные А-нейроны, гнойная рана после селективного применения ОТПК; е - интактные А-нейроны, гнойная рана после комплексного применения ГИС и ОТПК.

ратимыми (гипо- и гиперхромные клетки, незначительная вакуолизация, смещение ядра на периферию);

РНК - рибонуклеиновая кислота;

СМУ - спинномозговой узел;

ОТПК - обогащенная тромбоцитами плазма крови;

ЦНС- центральная нервная система;

ЯЦИ - ядерно-цитоплазматический индекс;

А-клетки - А-тип нейронов, крупные, с фрагментированным содержанием хроматофильного вещества;

В-клетки - В-тип нейронов, мелкие и средние, с диффузным распределением хроматофильной субстанции.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены характерные паттерны различных субпопуляций нейронов в зависимости от типа течения раневого процесса. При естественном заживлении особенностью септического течения, по сравнению с асептическим процессом, было увеличение доли деструктивных форм (9,2 против 5,4%) и доли реактивных нейронов А и В типа (14,5 и 31,8% против 10,2 и 26,6%).

2. Стимуляция заживления асептического процесса методом ГИС приводила к увеличению числа реактивно измененных нейронов (А - менее 15% и В - 34%), методом ОТПК - снижению числа реактивно измененных нейронов (А - до 2,2% и В до 3,6%) по сравнению с естественным заживлением. Стимуляция заживления септического процесса методами ГИС и ОПТК выявила сохранение числа реактивно измененных нейронов, комбинации ГИС и ОТПК - снижение числа реактивно измененных нейронов (А - до 6,8% и В - до 16,8%) по сравнению с естественным заживлением.

3. Оценка площади интактных нейронов показала, что положение максимума перемещалось к более ранним срокам в ряду: для асептического течения - ОТПК, ГИС, естественное заживление; для септического течения- комплекс ОТПК и ГИС, селективное применение ГИС, естественное заживление и селективное применение ОТПК. Для реактивных нейронов характерна нелинейная динамика изменения площади (кроме ОТПК при асептическом и ГИС+ОПТК при септическом процессе) - транзиторное снижение размеров с дальнейшим увеличением и восстановлением полноценной функциональной активности. В случае спонтанного течения и селективном применении ОТПК при септическом процессе установлено снижение размеров до уровня пикнотических изменений.

4. Анализ белоксинтетической активности (по показателям оптической плотности РНК и белка) в нейронах при асептическом процессе показал ее стимуляцию после применения ГИС и ОТПК, в наибольшей степени выраженную для реактивных А-нейронов; при инфицированном течении

процесса максимальные значения выявлялись при спонтанном течении, ГИС и ГИС+ОТПК.

5. Выявлены положительные корреляционные зависимости (максимум коэффициента детерминации R2=0,9216) между долями субпопуляций нейронов, их тинкториальными свойствами, числом глиальных клеток, типами течения раневого процесса и видами регионального воздействия, достигавшие максимальных значений при применении ОТПК при асептическом раневом процессе и после комплексного воздействия ГИС и ОТПК при септическом процессе.

6. На основе многомерного корреляционного анализа установлена взаимосвязь между уровнем оптической плотности РНК и белка, ядерно-цитоплазматическим индексом и площадью клетки. При асептическом течении в случае спонтанного процесса и применения ОТПК выявлено увеличение площади нейронов, их оптической плотности и индекса. При инфицированном течении применение ОТПК приводило к увеличению доли деструктивных форм нейронов, а сочетание ГИС+ОТПК оказывало наиболее гармоничное воздействие. При этом для большинства экспериментальных групп выявлялись диапазоны показателей, соответствующих с одной стороны крайним формам дистрофии, с другой стороны - оптимальным изменениям, направленным на успешную регенерацию.

7. Результаты математического моделирования позволяют осуществлять оценку динамики субпопуляции нейронов, их тинкториальных свойств и планиметрических характеристик, как отражение их морфо-функционального состояния, что является дополнительным методом комплексной оценки реакций спинномозговых узлов при различном течении раневого процесса.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Фетисов С.О., Семенов С.Н. Морфофункциональная характеристика нейронов спинномозговых узлов при различном течении поверхностных ран в эксперименте // Вестник молодежного инновационного центра. Выпуск III / под. ред. Проф. И.Э. Есауленко. - Воронеж, 2010. - С. 87-89.

2. Фетисов С.О., Семенов С.Н., Бугримов Д.Ю. Морфометрические показатели нейронов спинномозговых узлов при различном течении ранений мягких тканей // Альманах «Ретиноиды»: материалы 8-й Всероссийской научной конференции «Бабухинские чтения в Орле». - М.: ЗАО «Ретиноиды», 2011. - Вып. 32. - С.99-102.

3. Семенов С.Н., Глухов A.A., Алексеева Н.Т., Остроушко А.П., Фетисов С.О. Морфофункциональные изменения нейронов спинномозговых узлов при ранах мягких тканей // Вестник экспериментальной и клинической хирургии. - 2011. - Т. IV, № 3. - С.557-561.

4. Фетисов С.О., Семенов С.Н., Бугримов Д.Ю. Структурно-функциональная перестройка нейронов спинномозговых узлов в динамике заживления кожных ран // Вестник новых медицинских технологий.

- 2011. - Т. XVIII, № 2. - С.66-69.

5. Фетисов С.О., Семенов С.Н. Структурные перестройки глиального компонента спинномозговых узлов в ответ на глубокую рану кожи // Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии, фармакологии и медицине: Сборник статей 2-й международной научно-практической конф., 26-28 окт. 2011 г. / Под ред. А.П. Кудинова, Б.В. Крылова. -СпБ.: Изд-во Политехнического универ., 2011.-Т. 1.-С. 200-202.

6. Фетисов С.О. Динамика морфофункциональных изменений нейронов чувствительных узлов спинномозговых нервов при ранах мягких тканей и их лечении // Морфология. - 2011. - Т. 140, Вып. 5. - С. 122.

7. Алексеева Н.Т., Семенов С.Н., Фетисов С.О., Остроушко А.П. Изменения в нейронах спинномозговых узлов крысы в процессе моделирования глубоких ран кожи осложненных гнойной инфекцией // Успехи современного естествознания - 2011. - № 12.-С. 35-36.

8. Фетисов С.О., Семенов С.Н., Алексеева Н.Т. Динамика морфофункциональных изменений нейронов спинномозговых узлов при использовании тромбоцитарного концентрата для лечения глубоких ран кожи // XII Всемирный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке»: Сборник научных трудов. — 2011. - С. 485.

9. Фетисов С.О., Семенов С.Н. Морфологические особенности нейронов спинномозговых узлов у экспериментальных животных при моделировании раневого процесса // Украинский морфологический альманах.

- 2011. - Т. 9, № 3 (приложение 2). - С. 71-73.

10. Фетисов С.О., Семенов С.Н., Алексеева Н.Т. Морфологическая характеристика популяций нейронов спинномозговых узлов при моделировании глубоких ран кожи // Морфологические ведомости. - 2011. - № 4. - С. 47-55.

11. Фетисов С.О., Семенов С.Н., Алексеева Н.Т. Синтетическая активность нейронов спинномозговых узлов при стимуляции заживления кожной раны тромбоцитарным концентратом // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований.-2012. -№ 2.-С. 71-72.

12. Глухов A.A., Семенов С.Н., Алексеева Н.Т., Фетисов С.О. Реакции нейронов спинномозговых узлов крысы при стимуляции заживления глубокой раны кожи введением тромбоцитарного концентрата // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2012.

- № 7. - С. 114-115.

13. Фетисов С.О., Семенов С.Н. Структурные перестройки в спинномозговых узлах при применении тромбоцитарного концентрата для лечения глубоких ран кожи // Морфология. — 2012. - Т. 141, Вып. 3. -С.163.

14. Фетисов С.О., Алексеева Н.Т., Бугримов Д.Ю. Особенности гли-ального окружения нейронов спинномозговых узлов при применении тромбоцитарного концентрата для лечения глубоких ран кожи // Морфология. - 2012. - Т. 141, Вып. 3. - С. 29.

15. Фетисов С.О., Семенов С.Н., Алексеева Н.Т., Кварацхелия А.Г. Изменения морфофункционального состояния нейронов спинномозговых узлов крысы при стимуляции заживления глубокой раны кожи введением тромбоцитарного концентрата // Астраханский медицинский журнал. -2013. - Т. 8, № 1. — С. 226-229.

16. Глухов A.A., Семенов С.Н., Алексеева Н.Т., Фетисов С.О. Реакция глиального окружения нейронов спинномозгового ганглия на глубокую рану кожи и стимуляцию её заживления тромбоцитарным концентратом // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. -2012,-№7.-С. 43-44.

17. Фетисов С.О., Семенов С.Н., Алексеева Н.Т. Структурные перестройки в нейронах спинномозговых узлов крысы в динамике заживления глубоких ран кожи осложненных гнойной инфекцией // Вестник новых медицинских технологий. - 2012. - Т. XIX, № 2. - С. 279-282.

18. Fetisov S.O., Semenov S.N., Alexeeva N.T. Reactive and destructive reactions of dorsal root ganglion neurons in the simulation of deep skin wounds healing at different rates //ACTUAL ISSUES OF MORPHOLOGY: Materials of the International Scientific Conference dedicated to the birth centenary of Professor B. Z. Perl in. Chisinau, 2012. - P. 131-135.

19. Фетисов C.O., Семенов C.H. Роль сенсорных нейронов и их мор-фофункциональное состояние при раневом процессе // Журнал анатомии и гистопатологии. - 2012. - Т. 1, № 4. - С. 25-33.

20. Фетисов С.О., Семенов С.Н., Алексеева Н.Т. Полиморфизм нейронов спинномозговых узлов при глубокой ране мягких тканей и стимуляции её регенерации тромбоцитарным концентратом // Журнал анатомии и гистопатологии. - 2013. - Т. 2, № 1. - С. 46-52.

21. Фетисов С.О., Алексеева Н.Т., Спицин В.В. Популяционные изменения нейронов спинномозговых узлов при повреждении нервных волокон в мягких тканях // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2013. - № 7. - С. 138-140.

22. Фетисов С.О., Семенов С.Н. Характеристика нейронов спинномозговых узлов при различном течении заживления ран мягких тканей в эксперименте // Морфология. - 2013. - Т. 144, Вып. 5. - С. 124.

23. Фетисов С.О., Алексеева Н.Т. Изменения планиметрических показателей нейронов спинномозговых узлов при стимулировании заживления раны мягких тканей тромбоцитарным концентратом // Морфология. -2013. - Т. 144, Вып. 5. - С. 123-124.

24. Фетисов С.О., Спицин В.В., Кварацхелия А.Г. Состояние первичного афферентного звена при гнойной ране мягких тканей с различной скоростью заживления // Морфология - 2014. - Т. 145, Вып. 3. - С. 204.

25. Фетисов С.О., Алексеева Н.Т., Никитюк Д.Б. Гистометаболическая характеристика нейронов СМУ при моделировании гнойной раны мягких тканей // Макро-микроскопическая анатомия органов и систем в норме, эксперименте и патологии: материалы международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию дня рождения профессора Зои Измайловны Ибрагимовой. - Витебск, 2014. — С. 210-212.

26. Фетисов С.О., Алексеева Н.Т., Никитюк Д.Б. Структурные перестройки в спинномозговых узлах при применении тромбоцитарного концентрата для лечения асептических кожных ран // Актуальные вопросы морфологии: материалы симпозиума с международным участием, посвященного 90-летию со дня рождения выдающегося ученого профессора Петра Федоровича Степанова. - Смоленск, 2014. - С. 58.

27. Фетисов С.О., Никитюк Д.Б., Алексеева Н.Т. Афферентная иннервация асептических и инфицированных ран кожи // Журнал анатомии и гистопатологии. - 2014. - Т. 3, № 1. - С. 45-54.

28. Фетисов С.О., Алексеева Н.Т., Сереженко Н.П. Структурно-функциональная характеристика афферентных нейронов инфицированной раны мягких тканей при применении различных методов региональной терапии // Вопросы морфологии XXI века: Сборник научных трудов. -СПб.: ДЕАН, 2015. - Вып. 4 - С. 195-199.

29. Фетисов С.О., Алексеева Н.Т., Никитюк Д.Б. Качественная морфологическая оценка состояния нейронов спинномозговых узлов при регенерационном процессе в гнойной ране кожи // Журнал анатомии и гистопатологии. - 2015. - Т. 4, № 1. - С. 31 -37.

Подписано в печать 17.06.2015. Формат 60x84/16. Гарнитура Тайме. Бумага Zoom plus. Усл. печ. л. 1.0. Тираж 100 гжз. Заказ № 53. Отпечатано в типографии ОАО "НИИ систем" Новосибирск-58, ул. Русская, 39. т. 306-67-39

Соискатель

С.О.Фетасов