Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммунологические вирусспецифические маркеры и ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология
Автореферат диссертации по теме "Иммунологические вирусспецифические маркеры и ингибиторы репродукции вируса иммунодефицита человека"
РГ6
РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НИИ ВИРУСОЛОГИИ им. ДЛ.ИВАНОВСКОГО
ОД
На правах рукописи
ПОКРОВСКИЙ Андрей Георгиевич
ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ВИРУССПЕЦИФИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ И ИНГИБИТОРЫ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА
Специальность 03.00.06 - Вирусология
ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени доктора медицинских наук (в Форме научного доклада)
москва 1994
Работа выполнена в лаборатории ретровирусов научно-исследовательского института молекулярной биологии НПО "Вектор".
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ
академик РАН, профессор, а.а.краевский академик РАМН, профессор, а .а.воробьев профессор, доктор биологических наук, а.а.кущ
ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ Московский НИИ вирусных препаратов РАМН
защита диссертации состоится —-1994 Г->
в * ^ часов на заседании специализированного совета д 00i.20.0i при НИИ вирусологии им.д.и.ивановского- РАМН по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи,16.
С диссертацией можно ознакомиться в бибилиотеке НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.
Автореферат разослан —Диу^^С-З^ 994 г
Ученый секретарь специализированного совета, кандидат медицинских наук,
старший научный сотрудник А.м .Жуковский
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы. Одним из наиболее опасных и широко распространяющихся в последнее время вирусных заболеваний, связанных с преимущественным поражением иммунной системы организма, является инфекция, вызываемая вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ-инфекция) и получившая название СПИД (синдром приобретенного иммунодефицита человека). Со времении появления этого заболевания в 1981 году количество заболевших оценивается на середину 1993 года цифрой 2,1 млн человек, а общее количество инфицированных превышает 10 млн человек (Norton, 1993).
Открытый в 1983 году вирус иммунодефицита человека, относящийся к семейству ретровирусов, является этиологическим агентом СПИД (Barre-Sinoussi et al., 1983; Popovic et al.,1984). Изучение чувствительности различных популяций лимфоцитов показало, что специфической мишенью для этого вируса служат Т-хелперы (Klatzman et al., 1984; Dalgleish et al.,1984).
Основные проявления патогенеза при ВИЧ-инфекции связываются с гибелью популяции Т-хелпероз, в которых происходит размножение ВИЧ (Klatzmann et al.,1984, Mo Dougal et al., 1985). Рецептором для ВИЧ является Т4 рецептор лимфоцитов (или СД4 антиген) - белок с молекулярной массой 55 кД (Sattentau et al.,1984, Lasky et al.,1987), с которым взаимодействуют поверхностные гликопротеиды (gpl20) вируса. Было обнаружено, что моноциты/макрофаги также могут быть инфицированы ВИЧ (Gartner et al.,1986, Growe et al.,1987). Подробное изучение роли клеток макрофагального ряда в инфекционном процессе при ВИЧ-инфекции еще не закончено, но исследователи выявили по крайней мере одну значительную особенность: в отличие от изменений, которые происходят с Т-хелперами, изменение числа моноцитов периферической крови, их фенотипа и функций минимальны даже на поздних стадиях инфекции (Gendelman et al., 1989, Bender et al.,1988). Предполагается, что именно участие макрофагов в инфекционном процессе объясняет многие особенности клинической картины при СПИДе, в частности, наличие длительного латентного периода (до нескольких лет) от момента инфицирования до развития клинических проявлений заболевания (Meitzer at al., 1990).
В последние годы внимание исследователей направлено на изучение механизмов латентности и ее активации при ВИЧ-инфекции.
Причины, вызывающие переход от латентной к продуктивной ВИЧ-инфекции могут быть разнообразны - инфицирование другими ретрови-русами, например, HTLV-1, цитомегаловирусом, воздействие различных химических соединений. Исследованиями ряда авторов установлено, что антигенная или митогенная стимуляция лимфоцитов приводят к клеточной пролиферации и активации транскрипции и репликации ВИЧ (Bednarik & Folks,1992, Matsuyama,1991). Крайне важным представляется изучение особенностей активации ВИЧ-инфекции. Знание этих,механизмов может обеспечить как прогноз развития заболевания так и создание эффективных средств борьбы.
Для постановки диагноза ВИЧ-инфекция используются иммунологические методы определения содержания в сыворотке пациента антител к белкам ВИЧ-1. При этом на первом этапе проводится первичный скрининг с использованием в основном иммуноферментных тест-систем на основе лизата вирусных белков, рекомбинантнах белков вируса или пептидов-фрагментов белков ВИЧ (Хаитов и Игнатьева, 1992). Подтверждается диагноз с применением иммунофер-ментной тест-системы для определения антител к индивидуальным белкам вируса - иммуноблот, изготавливаемой на основе лизата вирусных белков иммобилизованного на нитроцеллюлознке полоски. Хотя такая комбинация тестов считается достаточной для установления диагноза, несомненный интерес представляет выявление вирусного антигена. Тест на вирусный антиген служит дополнительным тестом для лабораторного диагноза асимптоматической ВИЧ-инфекции в ранний период, когда антитела еще не выявляются, а также помогает определить вероятность прогрессирования инфекции у ВИЧ-инфицированных пациентов (Hjelle & Busch,1989, Анджапаридзе с со-авт., 1991).
В связи с появлением и распространением СПИДа начался активный поиск препаратов, обладающих выраженным анти-ВИЧ действием. Одной из основных проблем при проведении этих исследований послужило отсутствие адекватной модели этого инфекционного заболевания на лабораторных животных. Это в значительной степени затрудняет иссследования как по поиску эффективных противовирусных препаратов, так и вакцины. Общепринятой моделью служат перевиваемые культуры Т-хелперов, инфицированные эталонными штаммами ВИЧ. При использовании таких модельных систем была выявлена анти-ВИЧ активность сурамина (Mitsuya Н., et al., 1984), азидоти-мидина (Mitsuya Н., et al.,1985), - глицирризиновой кислоты (Ito
1,1988), рибавирина (Williams I.G., 1989), ауринтрикарбоновой сислоты (Balzarini J.,, et al.,1989) и многих других препаратов. Гем не менее, использование только одной модели, очевидно, не юзволяет проводить полноценный отбор соединений - кандидатов в 1екарственные препараты, поскольку особенности ВИЧ-инфекции в различных клетках-мишенях значительно отличаются. Исходя из это-"о, нами были предприняты попытки оценить перспективность приме-юния различных моделей и методов оценки для отбора перспективах • ингибиторов ВИЧ-инфекции.
Наиболее эффективные анти-ВКЧ препараты относятся к группе {уклеотидных аналогов, являющихся ингибиторами вирусного фермен-?а-обратной транскриптазы. Один из них - азидотимидин (AZT) -¡тал первым препаратом, нашедшим применение в медицинской прак-:ике для лечения СПИД. Обладая высокой эффективностью ингибиро-¡ания ВИЧ в культуре клеток , азидотимидин, тем-не менее, имеет >яд недостатков, ограничивающих его применение в клинической фактике: он токсичен (Richman et al.,1987), обладает низкой эффективностью ингибирования репродукции ВИЧ в макрофагах (Crowe it al.,1989), длительное применение азидотимидина приводит к по-[влению AZT-устойчивых штаммов ВИЧ (Larder et al.,1989, Larder ind Kemp,1989). Более того, результаты расширенных клинических гопытаний этого препарата в клинике показали, что его применение ie приводит к продлению жизни больных СПИДом (Dickson & (aoilwain, 1993). Поэтому актуальным представляется поиск новых ¡нгибитсров размножения ВИЧ.
Развитие исследований по изучению молекулярной биологии ВИЧ ¡делало возможным применение самых современных подходов для раз->аботки средств лечения заболевания, вызываемого этим вирусом. >дин из таких подходов основан на использовании для ингибирова-:ия репродукции ' вируса синтетических олигодезоксинуклеотидов, :омлементарных консервативным участкам вирусной мРНК (Zamecnik t al.,1986), Предполагается, что использование таких антисмыс-:овых олигонуклеотидов приводит к блокированию трансляции вирусах белков. К настоящему времени в литературе описано ингибиро-ание размножения ВИЧ в культуре клеток олигонуклеотидами, комп-ементарными различным функциональным участкам РНК вируса Zamecnik et al., 1986; Matsukura et al., 198?, 1989; Agrawal et 1., 1988, 1989;). Тем не менее, поиск новых, более эффективных отношении ВИЧ антисмысловых олигонуклеотидов и разработка на
их основе лекарственных средств остается актуальным. Более того, при использовании модифицированных антисмысловых олигонуклеоти-дов, содержащих реакционноактивные группировки, которые обеспечат повреждение провирусной ДНК, возможно излечение этого заболевания.
Другим методом направленного конструирования препаратов-ингибиторов ВИЧ-инфекции служит использование пептидов-фрагментов вирусных белков, соответствующих функционально-8начимым районам и блокирующих связывание вируса с клетками-мишенями или сборку вирусных частиц.
Следует подчеркнуть, что в настоящее время не существует такого подхода к созданию лекарственных препаратов для лечения СПИД, который мог бы претендовать на монополию. Скорее всего, как и для других инфекционных заболеваний, эффективная терапия ВИЧ-инфекции будет заключаться в применении системного комплексного подхода, когда в зависимости от стадии или формы проявления болезни будут использоваться лекарственные средства с разными механизмами действия и их различные комбинации.
Исходя из этого, нами проводился поиск новых перспективных анти-ВИЧ агентов среди уже известных ингибиторов ВИЧ-инфекции (0-глицирризнновая кислота) путем получения их различных химических производных, среди химических препаратов, для которых показана противовирусная активность в отношении других вирусов, а также оценивали возможность их совместного применения.
Настоящая работа выполнялась в рамках исследований по государственной научно-технической программе "Борьба с наиболее распространенными заболеваниями" по проблеме СПИД темы 102, 310, 312, 389, 418, по программе "Ген-направленные препараты".
Дели и задачи исследования. Основной целью настоящей работы было исследование особенностей репродукции ВИЧ на различных клетках-мишенях (Т-хелперах и моноцитах) и разработка технологии получения на основе изолированных и охарактеризованных штаммов ВИЧ антигенов и антител, пригодных для исследования иммунологических вирусспецифических маркеров этой инфекции. Кроме того, планировались исследования по поиску эффективных ингибиторов репродукции ВИЧ.
Основными задачами исследования явилось:
-разработка технологии получения полноценного очищенного
вирусного антигена, пригодного для изготовления диагностических иммуноферментных тест-систем для детекции антител к белкам ВИЧ;
-разработка иммуноферментных тест-систем для детекции вирусного антигена ВИЧ-I и ВИЧ-2;
-изучение особенностей репродукции ВИЧ на различных клетках-мишенях (Т-хелперах и моноцитах/макрофагах) и активаторов репродукции ВИЧ;
-проведение оценки анти-ВИЧ активности ранее известных препаратов, обладающих противовирусным эффектом;
--изучение перспективы применения в качестве специфических ингибиторов ВИЧ-инфекции пептидов-фрагментов белков ВИЧ, антисмысловых олигодезоксинуклеотидов и производных азидотимидина,-
Научная новизна работы. В результате выполнения настоящих исследований был получен ряд новых результатов, имеющих важное теоретическое и практическое значение.
Исследованы особенности репродукции ВИЧ в хронически-инфи-цированной культуре клеток моноцитов человека и-937.
Ввделен высокопродуктивный штамм ВИЧ-I, пригодный для получения вирусного антигена для диагностических тест-систем. Определена первичная структура областей Vi, V2 и V3 гена env этого штамма.
Выявлены новые ингибиторы репродукции ВИЧ среди производных глицирризиновой кислоты, эффективно ингибирующих размножение ВИЧ-I как в культуре лимфоцитов, так и в моноцитарной клеточной системе. Впервые установлена анти-ВИЧ активность нового класса химических соединений - сложных эфиров изоборнеола (2, 9-диметил-За, 4, 9, 9а-тетрагидрофуро-[ 2, 3-ь] -хиноксалин- 3 карбоновой кислоты - энциклан). Впервые показана высокая противовирусная активность (I s 100-500) и специфичность анти-ВИЧ действия олигонуклеотидов последовательности
pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA (РМ-20), комплементарной 'области начала трансляции открытой рамки считывания на (+) цепи ДНК ВИЧ-I, и последовательности pígcctggagctgcttgatgc (МР-20), комплементарной олигонуклеотиду РМ-20. Показано, что энциклан и глицирам не является антагонистами азидотимидина.
^Основные положения, выносимые на защиту: I. Хронически инфицированная ВИЧ-Глиния перевиваемых моно-
цитов человека ГКВ-4005 продуцирует инфекционные вирусные частицы в течение длительного непрерывного культивирования (более 20С пассажей) без подсева неинфицированных клеток. Предложенный способ сокультивирования хронически инфицированной ВИЧ-1 культурь клеток моноцитов (ГКВ 4005) и Т4-лимфоцитов человека (МТ-4) позволяет получать вирусный антиген с полным набором вирусспецифи-ческих белков.
2. Изолирований высокопродуктивный штамм ВИЧ-1 охарактеризован по культуральным свойствам и определена первичная структура областей VI, У2 и УЗ гена епу этого штамма. На основе этого штамма разработана технология получения очищенного вирусного антигена, пригодного для использования в диагностических тест-системах.
3. Разработаннные диагностические тест-системы для детекцш; вирусных антигенов ВИЧ-1 (суммарного и р24) и ВИЧ-2 с чувствительностью до 50пг/мл позволяют проводить определение вирусного антигена в клинических образцах. Выбран оптимальный метод тестирования вирусного антигена в составе иммунного комплекса. Анализ клинических образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов с использованием тест-системы для детекции антигена р24 показал, что I свободном состоянии антиген р24 присутствует в 5 процентах исследованных образцов и в 31 процентах в составе иммунных комплексов.
4. Оценку анти-ВИЧ активности тестируемых соединений следует проводить с использованием как лервично-инфицированнш культур Т-хелперов, так и хронически-инфицированных культур клеток моноцитов с определением уровня защиты клеток по жизнеспособности и уровня подавления синтеза вирусных белков.
5. Олигонуклеотиды РМ-20 - рССАТСААйСасстссассса , комплементарный области начала трансляции открытой рамки считывания нг (+) цепи ДНК ВИЧ-1, и МР-20 - рТСССТСбАССТССТТвАТСС, комплементарный олигонуклеотиду РМ-20, оказывают выраженный анти-ВИЧ эффект на модели ВИЧ-инфицированных клеток МТ-4 (1Б >100 и >500, соответственно). Присоединение к 5' -концевым фосфатам олигонук-леотидов алифатических аминов или остатков холестерина приводи: к существенному повышению эффективности ингибирования мш репродукции ВИЧ.
6. Пептид (426-439 епу) - МЫЧЕУСКАМУАРР, соответствуют!! сайту связьвания поверхностного белка ВИЧ др120 с СД4 рецепторо]
- 7 -
обладает анти-ВИЧ активностью.
7. 5' -фосфонаты азидотимидина с различными типами остатков модифицированного фосфата и 5' -фосфонатов фтортимидина обладают более низкой токсичностью для неинфицированных клеток, чем ази-дотимидин. Наиболее выраженным ингибирущим действием обладает 5' -карбоксифосфонат азидотимидина в культуре клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-1. На моделях первичной культуры нестимулирован-ных моноцитов периферической крови, инфицированных ВИЧ-1 и в культурах клеток перевиваемых линий Т-хелперов, хронически инфицированных ВИЧ-1, ингибирузоций эффект азидотимидина и его производных существенно снижен.
8. Производные глицирризиновой кислоты эффективно ингиби-рукгг репродукцию ВИЧ-1 в хронически инфицированной ВИЧ-1 культуре клеток моноцитов человека. Анти-ВИЧ активностью обладают гли-копептиды и амиды глицирризиновой кислоты. Сложные эфиры изо-борнеола (энциклан) являются ингибиторами репродукции как ВИЧ-1, так и ВИЧ-2 в культуре клеток - (1Э - 406 и 10, соответственно). Энциклан и глицирам не являются антагонистами азидотимидина и могут быть использованы для комбинационной терапии ВИЧ-инфекции.
9. 2, 3,7, 8-тетрахлордибензо-пара-диоксин является активатором ВИЧ-инфекции на модели клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1.
Практическая ценность работы. Разработана технология культивирования и очистки вирусного антигена для использования в им-муноферментных диагностических тест-системах для определения антител к белкам ВИЧ как для первичного скрининга, так и для проведения верификации (иммуноблот). В настоящее время эта технология внедрена в промышленное производство.
Разработаны тест-системы для детекции антигенов ВИЧ-1, ВИЧ-2 и антигена р-24 ВИЧ-1. С помощью этих тест-систем проведен анализ клинических .образцов от ВИЧ-инфицированных в нашей стране.
Подготовлены "Методические рекомендации по выделению вирусов иммунодефицита человека от ВИЧ-инфицированных лиц и больных СПИДоьГ (совместно с Д Н. Носиком, Л & Калниной, А. Е Злобиным, И. А. Киселевой, М. С. Бочковой, Е Е Покровским), утвержденные Ученым советом Института вирусологии им. Д И. Ивановского 17. 05.1991 и "Временные требования к линиям клеток-продуцкнтов вируса иммунодефицита человека, рекомендуемых для производства (совместно с.
Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тара-севича, Московским научно-исследовательским институтом вирусных препаратов, Институтом вирусологии им. Д, И. Ивановского РАМН), ут-вержденнные Минздравом СССР 25. 04.1988г. N 28-6/д.
Апробация работы. Основные экспериментальные материалы и положения диссертации были представлены на v, VI, VIII, IX,
международных конференциях поо СПИДу (Монреаль, Сан-Франциско, Амстердам, Берлин) Всесоюзной конференции "Химия природных и низкомолекулярных биорегуляторов" (Ереван, 1990), Международной конференции по терапии нуклеиновыми кислотами "international Conference on Nucleic Acid Therapeutics" (Флорида, США, 1991), IX Всесоюзном симпозиуме "Целенаправленное изыскание лекарственных средств" (Юрмала, 1991), Международной конференции "Молеку-лярно-биологические аспекты диагностики и терапии СПИД" "International conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS" (Новосибирск, Академгородок, 1991), IV Всесоюзном симпозиуме "Изучение и использование солодки в СССР' (Алма-Ата, 1991), I Съезде иммунологов России (Новосибирск, 1992), на международной конференции "Antlsensa oligonucleotides and rl bonucl eases H" (Аркахон, Франция, 1992), на I и 2 международных конференциях "СЛВД рак. и рэтровирусы человека" (Санкт-Петербург, 1992,1993) и ряде других международных: конференциях.
щ
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 55; ра
бот.
ф
Основные результаты, изложенные в диссертации, получены в соавторстве с сотрудниками НИИ молекулярной биологии НПО "Вектор": Плясуковой 0. А., Мамаевой 0. А., Федаж Н. Е, Куляндиным С. А., Киселевым Н. Н. , Гашниковой li Li , Красных Е Н., Черных
A. И., Ястребовой 0. Н., Чаплыгиной С. Р., Е1'оричевой И. Н., Нечаевым id С., Блиновым Е М. , Коноваловы«.! Е Е , Локтевым Е Е, Института вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН: Рудневой И. Л. г Карамовым Э. Е , Гараевым М. М., Урысаевым JL Е ; Новосибирского института биоорганической химии СО РАН: Власовым
B. Е, Свинарчуком Ф. П., Коневцок Д. к; Института орга-
нической химии Башкирского научного центра РАН: Толетиковым Г.А., Балтикой Л,А., Мурашовым Ю.И., Русаковым И.А.; Уральского политехнического института: Чупахиным О.Н., Чарушиным В.Н., По-низовскш М.Г.; Института гриппа: Киселевым О.И. Своим коллегам и соавторам проведенных исследований автор приносит искреннюю благодарность.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
1. Разработка технологии получения очищенного вирусного антигена, пригодного для изготовления диагностических тест-систем для детекции антител к белкам ВИЧ.
Несмотря на значительные успехи в использовании рекомби-кештных белков и синтетических пептидов - фрагментов белков ВИЧ в качестве антигенов при диагностики ВИЧ-инфекции, диагностические теот-сисгемы на основе природного вирусного лизата до настоящего времени не утратили своего значения и, по данным ряда авторов (СауаШ ©I а!. ,1992), дают более надежные результаты при Диагностике. Одной из * причин этого может быть высокий процент 'ликозялирования оболочных белков'ВИЧ - др120 и ер41 (до 50 сайтов гликозилирования (СЬакгаЬагЬ! еЬ а1.,1987), что сущест-»енно влияет на антигенные характеристики белков, и отсутствие 'ликсзклирования может в некоторых случаях послужить причиной гаудач в диагностике. .
Проблема полученшг.$ирусного антигена для диагностических •ест-систем включает, на наш взгляд, решение трех основных воп-иэсов:
1) выбор системы культивирования;
2) выбор оптимального метода очистки вирусного антигена;
3) выбор вирусного штамма,
В реальной ситуации решения этих вопросов достаточно тесно вязаны между собой и, скорее всего, невозможно выбрать опти-альный способ очистки вирусного' антигена, не учитывая особен-остей конкретного штаммй или схемы его культивирования. Тем на енее, при проведении этих исследований мы начали с решения пер-ого вопроса и параллельно проводили сравнение различных штаммов ИЧ и методов очистки вируоного антигена.
- 10 -
1.1. Выбор системы культивирования ВИЧ.
На основании данных литературы и результатов исследований по культивированию штаммов ВИЧ в различных лабораториях в нашей стране Национальным контрольным органом - Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича в 1988 году разработаны "Временные требования, предъявляемые к штаммам клеток-продуцентов ВИЧ".
Учитывая эти требования, было проведено изучение различных культур-продуцентов ВИЧ, с целью выбора культуры, перспективной для использования в производстве вирусного антигена.
Было проведено исследование культуры-продуцента БИЧ-1 ГКВ-4005 (ЭВК-ИРА/3, депонент N 4005 в Государственной коллекции института им.Л.И.Ивановского, N 200 ■ НПО "Вектор")". Культура-продуцент была получена при инфицировании клеточной линии моноцитов человека U-937 изолятом БИЧ-1, выделенным от инфицированного человека (Карамов с соавт., 1986). Работу с этой культурой клеток проводили в двух направлениях: изучали особенности культивирования (режим культивирования, сохранение уровня ви-руспродукции при серийном пассировании и т.д.) и специфичность продуцируемого культурой вируса (методом непрямой иммунофлюорес-ценции, вестерн-блотта, иммуноферменткого анализа, электронной микроскопии).
Было проведено сравнение двух способов культивирования: стационарного (в матрасах) и роллерно-суспензионного. В процессе культивирования (в конце каждого пассажа) контролировали индекс пролиферации и долю жизнеспособных клеток, уровень вируспродуции по данным ИФА. Установлено, что по уровню вируспродукции, индексу пролиферации и доли жизнеспособных клеток эти два способа культивирования достоверно не отличаются. • Культура клеток ГКВ-4005 сохраняет уровень вируспродукции при серийном пассировании в течение 180 пассажей (таблица 1).
Была исследованы динамика пролиферации клеток, уровень вируспродукции по данным ИФА в течение одного пассажа на протяжении 8 суток. На 6 сутки культивирования достигаются более высокий индекс пролиферации (2,28 ± 0,8) и доля жизнеспособных клеток (65,2 ± 12,7)%, а максимальный уровень вируспродукции отмечен на 6-7 сутки культивирования. Начиная с 7 суток культивирования происходит постепенное снижение всех контролиремых пара-
метров культивирования. Вероятно это связано с истощением питательной среды, гибелью клеток (в первую очередь инфицированных). Вышеизложенные данные позволили нам выбрать оптимальный интервал пассирования культуры - 6 суток.
Специфичность продуцируемого культурой клеток вируса иммунодефицита человека подтверждали методами электронной микроскопии, вестерн-блотта, непрямой иммунофлюоресценции. Показано также, что данная культура клеток обладает ревертазной активностью. Методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием сыворотки крови больного, содержащей антитела к ВИЧ-1, показано наличие 20-40Х клеток, продуцирующих вирусный антиген.
Таблица 1
Роллерное культивирование клеток ГКВ-4005
Номер пассажа Индекс пролиферации Доля жизнеспособных клеток (%) Титр антигена ВИЧ-1 в ИФА
51-55 2,12*0,32 71,0*6,3 1:(85,3*91,8)
56-60 2,16*0,36 70,6*9,5 1:(108,8*53,3)
61-65 2,08*0,39 68,0*4,2 1:(70,4*43,5)
66-70 1,94*0,23 70,2*5,2 1:(57,6*51,8)
71-76 1,92*0,43 69,8*4,8 1:(48,0*18,4)
176-180 1,91*0,33 66,7*9,4 1:(96,0*22,6)
С помощью электронной микроскопии клеток ГКВ-4005 методом негативного контрастирования показано, что вирусные частицы, продуцируемые культурой, имеют размеры (90-110) А° и обладают морфологией, типичной для лентивирусов. Методом вестерн-блотта в дизате инфицированных клеток выявлено наличие трех вирусных белков gp 120, ер 41, р 24. Наличие вирусспецифической РНК в культуре клеток подтверждено методом РНК-ДНК гибридизации.
Таким образом, вышеизложенные данные позволяют охарактери-
зовать моноцитарную культуру клеток ГКВ-4005 - продуцент ВИЧ-1 как пригодную для культивирования ВИЧ-1 и соответствующую требованиям ГИСКа. Тем не менее, заключение о пригодности этой линии клеток для производства вирусного антигена могло быть дано лишь после получения препарата очищенного антигена» пригодного для иммуноферментных тест-систем.
1.2. Сравнение различных методов очистки вирусного анти- • гена.
Фирмы-изготовители диагностических тест-систем для выявления антител к вирусу СПИД используют антиген ВИЧ, получаемый различными методами. Так, в литературе описан метод получения антигена ВИЧ ультрафильтрацией (Эайдес с соавт.,1986). Другие авторы применяют иммуноаффинную хроматографию белков ВИЧ, используя способность ковалентно связанных иммуноглобулинов сорбировать антиген из культуральной вируссодержащей среды (Pyle et al., 1987). Фирма "Du Pont", США сообщает о получении антигена ВИЧ методом ультрацентрифугирования (Dupont Biotechnology Update, 1988). В работе Matsiota et al. (1988) описан метод получения антигена ВИЧ собилизацией белков мембран инфицированных клеток детергентом. На основании многочисленных и во многом противоречивых литературных данных не представляется возможность выбрать оптимальный метод получения вирусного антигена, тем более, что требования к антигену для различных диагностических систем могут значительно варьировать. Так, для конкурентной тест-системы с использованием подложки из иммуноглобулинов, не требуется применение высокоочищенного антигена, с другой стороны, для непрямой тест-системы решающим фактором служит степень очистки используемого антигена (Clark et al.,lG87). Важно также отметить, что в зависимости от культуры-продуцента, динамики накопления вирусного антигена при культивировании, применение того или иного метода очистки может дать весьма различные результаты.
Учитывая эти обстоятельства, нами было проведено сравнение различных методов очистки вирусного антигена, наработанного на культуре клеток ГКВ-4005.
1.2.1. Использование метода ультрафильтрации для получения обогащенного вирусного антигена.
Десятикратный концентрат культуральной жидкости получали с использованием установки для ультрафильтрации фирмы "Миллипор"
(США) о использованием двух кассет фильтров - для отделения ви-руспродуцирующих клеток от культуральной среды с диаметром пор 0,22 мк и для концентрации вирусных частиц применяли мембраны, задерживающие белки с молекулярной массой 100000 дальтон. Затем в концентрат добавляли раствор детергента твин-20 до конечной концентрации 0,1%, и концентрат обрабатывали с помощью ультразвукового дезинтегратора УД-60 при частоте 22 кГц, амплитуде тока 20 мА три раза по 1 мин с перерывами по 15 секунд. Концентрат антигена БИЧ имеет все белки вируса, общая концентрация белка 10-15 мг/мл. Данный антиген использовался в конкурентной иммуно-ферментной тест-системе для определения антител к ВИЧ и вирусного антигена, и был не пригоден для непрямой иммуноферментной тест-системы в силу плохой сорбционной способности на полисти-рольные планшеты из-за наличия больших количеств балластных белков.
1.2.2. Использование иммуноаффинной хроматографии для очистки белков вируса иммунодефицита человека.
Одним из наиболее эффективных методов выделения белков из сложных исходных смесей с низким содержанием целевых полипептидов является иммуноаффинная хроматография. Уникальная селективность разделения этого метода позволяет за одну стадию получить высокоочищенный и иммунологически активный антиген. Опубликованы работы, в которых иммуноаффинная хроматография была использована для выделения белков ВИЧ др 120 и ер 41 из вируссодержащей культуральной жидкости (Ру1е et а1.,1987, беМегЫот еЬ а1.,1987). Очищенные полипептиды взаимодействовали с сероположительными к ВИЧ сыворотками, а также при иммунизации животных индуцировали образование антител, связывающих вирионы ВИЧ.
В качестве исходного материала для выделения белков ВИЧ использовали концентрат вируссодержащей культуральной жидкости, полученной ультрафильтрацией. Содержание вирусных белков в таком концентрате составляет менее 0,1% и оценить количественный или хотя бы качественный состав белков ВИЧ в нем при отсутствии моноспецифических антител к индивидуальным полипептидам ВИЧ невозможно. Поэтому для'' синтеза сорбентов мы использовали фракции иммуноглобулинов, в$целенные из трех типов сероположительных к БИЧ сывороток, охарактеризованных методом иммуноблотинга. Максимальный выход антигенов ВИЧ был получен на сорбентах ковалентно свя-
ванной с серофазной фракцией из сывороток, содержащей антитела к большей части вирусспецифических белков (вр 160, др 120, р 24, р 55 и т.д.). Выход антигенов на сорбентах с антителами из сывороток, взаимодействующих на стрипах иммуноблотинга в основном с белками гена епу был в 2-3 раза меньше. Анализ аффинноочи-щенного антигена БИЧ методами электрофореза и иммуноблотинга по-
Таблица 2
Основные характеристики антигена ЕИЧ-1, полученного равными методами
\ Способ Ультра- Выделение Очистка Ультра- Антиген
Чполучения фильтра- мембраны, на им- центри- фирмы
Ха- \ ция инфици- муно- фугиро- Ш Роп1 »
ракте-\ рованных сорбенте вание
ристики \ клеток
В конкурентной 1:256 1:6400 1:1000 - 1:6400 Титр системе
анти------------------------------------------;-------------
гена В непря- Не сор-
мой сис- бируется 1:3200 1:200 1:3000 1:3200 теме на планшете
Концентрация
белка (мг/мл) 10-15 3-6 0,2 5,1 2
Рекомендуемое 1:800-
рабочее раз- 1:50 1:1000 1:50 1:1400 1:1500
ведение
Представи- полный полный отсутст- отсутст- полный
тельство ви- состав состав вует р17 вуют вр состав
русных бел- 160.сле-
ков по им- довые кот
муноблоту личества
БР 120
каэал, что он содержит вирусспецифические полипептиды gp 120, gp 41. р 24. р 55 и т.д., и в значительной степени обогащен белком р 24, основным внутренним белком вариона, продуктом гена gag. Наряду о белками ВИЧ в эдюированной с колонки фракции присутствуют полипептиды невирусной природы, однако аффинная хроматография позволяет за одну стадию добиться по крайней мере 1000-кратной очистки антигена.
Недостатком хроматографической очистки на сорбентах с матрицей из ВгСЫсефарозы является возможность гидролиза между матрицей и лигандом. Действительно, как показали наши эксперименты, в хроматографически очищенном антигене ВИЧ имеется примесь иммуноглобулинов. И хотя их содержание незначительно, при использовании антигена в иммуноферментном анализе для тестирования сывороток наблюдали неспецифический фон. Однако, в иммуноблотинге эти примеси иммуноглобулинов не мешали выявлению сероположитель-ных к ВИЧ сывороток.
. 1.2.3. Получение очищенных вирусных частиц методом ультрацентрифугирования .
Наиболее распространенным способом получения очищенных ви-рионов ВИЧ служит метод ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы. При оценке пригодности этого подхода для очистки вируса, продуцируемого клетками-продуцентами ГКВ-4005 были проведены следующие эксперименты. На различных сроках культивирования клетки осаждали центрифугированием при 4000 g в течение 10 ,мин и отбрасывали; из супернатанта осаждали вирус, центрифугируя при ускорении 70000 g в течение 2-х часов при +4°С, сводок растворяли в 10%-ном растворе сахарозы на 0,2 М фосфатном^буферном растворе рН 7,4 и наслаивали на линейный градиент сахароаы (0-40)%, центрифугировали 18 час, при ускорении 70000г"5и температуре +4° 0. Вируссодержащую фракцию собирали, осаждали центрифугированием при ускорении 70000 g в течение 1 часа и гатем растворяли в лизирующем буферном растворе, содержащем 1%-ный тритон Х-100.
Было установлено, что количество зрелых вирионов, выделяемых при использовании этого способа, не меняется на различных сроках культивирования клеток ГКВ-4005. Выход вирусных частиц составляет 1-2% от общего количества вирусспецифических белков, выявляемых иммуноферыентным методе«. Кроме того, в полученном
таким способом препарате вируса, по данным иммуноблота, нет белка вр 160 и лишь следовые количества белка gp 120. Характеристики полученного антигена приведены в таблице 2.
Таким образом, применение этого подхода для получения очищенного антигена ВИЧ-1 с использованием в качестве продуцента клеток ГКВ-4005 представляется нецелесообразным.
Тем не менее, следует подчеркнуть, что этот метод позволяет получить высокоочищенный препарат вирусных частиц и при изменении схемы культивирования может быть использован для получения высокоочищенных вирионных белков.
1.2.4. Получение мембран клеток, инфицированых ВИЧ-1.
В сыворотках сероположительных к ВИЧ-1 лиц обнаруживаются антитела не только к белкам вирионов, но и к другим вирусспеци-фическим белкам - вирусным ферментам и регуляторным белкам. Поэтому для диагностических целей целесообразно использование наиболее полноценного по составу антигена. Особенности 'Морфогенеза ВИЧ-1 - накопление практически всех вирусспецифических белков в наружной мембране клетки позволяет использовать для получения вирусных антигенов описанные в литературе методы очистки мембран клеток.
О этой целью мы попытались получить лизированные мембраны клеток ГКВ-4005. Через 96 ч культивирования культуру клеток центрифугировали при ускорении 2000 g и температуре 6° 0 в течение 10 минут. Супернатант сливали, а осадок клеток ресуспендиро-вали в физиологическом растворе рН 7,4, охлажденном до 6° 0 до концентрации 2 • 10® кл/мл и добавляли равный объъм охлажденного лизирующего буфера, содержащего 1% тритона Х-100, 0,05% азида натрия, 0,01% ингибитора трипсина и 0,02% фенил-метил-сульфо-нилфлуорида. После 10 минутной инкубации при температуре 6° С лизированные клетки переносили в центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 мин при ускорении 10000 g при температуре 6° С. Осадок отбрасывали, а к супернатанту приливали этилени-мин до конечной концентрации 0,1% для инактивации вируса.
В полученном таким образом лизате инфицированных клеток представительство вирусных белков было более полным. Характеристики полученного лизата приведены в таблице 2. При оценке пригодности этого препарата антигена вируса в непрямой иммунофер-ментной тест-системе было обнаружено, что он дает очень высокий
фон отрицательных сывороток. Аналогичные данные были получены при использовании антигена, очищенного на иммуносорбенте. Причиной этого служит, вероятно, наличие в мембранах клеток макрофа-гального ряда U-937, послуживших основой для получения штамма-продуцента ВИЧ-1 ГКВ-4005, рецепторов для связывания Fe фрагмента иммуноглобулинов. "Загрязнение" этими рецепторами препаратов вирусного антигена и приводит к резкому возрастанию фона в иммуноферментном анализе.
Другим недостатком применения моноцитарных линий клеток для получения антиген^ ВИЧ может быть снижение представительства в зрелых вирионах оболочечных вирусных белков по сравнению с вирусными частичами, формируемыми при культивировании ВИЧ на Т-хелперах, как это показано в сообщениях Meitzer et al.(1990), Orestein et al.(1988).
Таким образом, сравнение различных способов получения обогащенных препаратов вирусных антигенов показало перспективность использования следующих подходов: а) очистка с использованием иммуносорбентов; б) ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы; в) получение мембран инфицированных клеток. Представленные в настоящем разделе результаты демонстрируют, что эффективность применения того или иного способа очистки вирусных антигенов существенно зависит от способа культивирования вируса. Это послужило основанием для проведения ряда экспериментов по оптимизации схемы культивирования и очистки ВИЧ-1.
1.3. Использование чувствительных к ВИЧ культур клеток для накопления вируса.
Наиболее широкое применение для тестирования биологической активноси ВИЧ и накопления вируса получили перевиваемые лимфоид-ные культуры - СШ^-СЕМ, Н9, 11-937, МТ-4 (Ророу1с et а1.,1984, Нагас1а еЬ а1. ,1985).
В предварительных экспериментах с использованием различных лимфоидных культур клеток из коллекции нашего института было установлено, что наиболее чувствительными к штамму ВИЧ-1, продуцируемому клетками ГКВ-4005, являются клетки МТ-4 и Н9. Клетки линий СИУ (СЕМ), К, Ни1-78 обладают значительно меньшей чувствительностью к вирусу. Так, заражающая доза ВИЧ-1 для этих культур клеток на 1-2 порядка превышает инфицирующую дозу для клеток Н9
и МТ-4.
Учитывая то, что линия клеток МТ-4 обладает лучшими показателями пролиферации (индекс пролиферации 4-5) и наиболее стабильна при культивировании, дальнейшие эксперименты проводили с использованием этой линии клеток. Необходимо отметить, что, переходя от культивирования - персистентно-инфицированной культуры к острой (литической) форме инфекции мы получаем возможность, синхронизации инфекции. Это обстоятельство может оказаться решающим при подборе оптимальной схемы получения вирусных антигенов.
Использование обогатительного пассажа на клетках МТ-4 (со-культивирование клеток МТ-4 и ГКВ-4005) позволяет подучить существенный прирост как вирусных белков (выявляемых в Шк и по активности обратной транскриптазы), так и доли инфицированных клеток по сравнению с тем, что получаем при культивировании клеток ГКВ-4005 - продуцентов ВИЧ-1 (табл. 3). Последующее инфицирование клеток МТ-4 полученной культуральной жидкостью приводит к дальнейшему возрастанию доли инфицированных клеток и количества вирусных белков (табл. 3).
При изучении динамики накопления вирусных белков в клетках МТ-4, инфицированных ВИЧ-1 было установлено, что активность обратной транскриптазы в культуральной жидкости возрастает, достигает максимума на четвертые сутки культивирования (92,6614,25) 106 имп/мл и снижается на пятые сутки культивирования. Условия адсорбции не влияют на дальнейшее накопление вирусных белков.
Таким образом, изложенные данные позволили предложить следующую схему культивирования ВИЧ-1: стабильным источником вируса служит хронически инфицированная линия клеток ГКВ-4005, культивируемая роллерно-суспензионным способом. На 5-6 сутки культивирования клетки ГКВ-4005 смешивали с клетками МТ-4 в соотношении 1:1 и культивировали также роллерно-суспензионным способом на среде (гРМ1-1640 с добавлением 10-152 сыворотки плода коров, 0,062 Ь-глутамина и антибиотиков в течение 4 суток. По окончании культивирования клетки осождади централизованием 4000 в в течение 10 минут при температуре 4° С (посевйО& ВИЧ-1). Подученным супернатантом инфицировали клетки МТ-4. Для этого к (2,6-2,7)х109 клеток МТ-4 приливали (520±20) ид посевного ВИЧ-1, тщательно перемешивали и инкубировали при температуре 37° С не менее 1 часа. По окончании адсорбции инфицированные клетки рассеивали в ролдерные бутыли с посевной концентрацией 0,7х 10б
кл/мл. Клетки культивировали 4 суток при частоте вращения роллера 1 об/мин и температуре 37° 0.
Таблица 3
Накопление белков БИЧ-1 при сокультивировании клеток штаммов ГКВ-4005 и МТ-4
Соотношение Активность обратной log2 обратного
клеток транскриптазы (х10б титра суммарного
МТ-4 : ГКВ-4005 имп/мин) антигена в ИФА
0,4 : 1 н/д 6,69*0,58
1:1 13.54*0,37 8,23*0,70
2,3 : 1 . 17,87*0,35 8,33*0,29
9 : 1 30,94±1.39 8,72*0,72
ГКВ-4005 5,76*0,43 6,69*0.58
МТ-4 0,16±0.02 0
н/д - нет данных.
Результаты учитывали на 4-е сутки культивирования.
Для этой схемы культивирования были опробованы несколько способов очистки антигена, подробно описанные в разделе 1.1.2. Лучшие результаты были получены при использовании методов дифференциального центрифугирования, с помощью которого выделяли вирусные антигены или мембраны инфицированных клеток. В образцах очищенных вирусных частиц данного штамма содержание наружного гликопротеида gp 120 было незначительным, что снижает ценность применения препарата в диагностических тест-системах. Кроме того, потеря вирусных белков при получении очищенных вирионов составляют до 90-95%.
Метод получения мембран инфицированных клеток позволяет выделить полноценный вирусный антиген, содержащий полный набор ви-
русспецифических белков и существенно снизить потери при очистке (потери составляют не более 20-30%).
Испсш>80вание обогатительного пассажа на клетках МТ-4 позволяет увеличить урожай вируса в 4-5 раз по сравнению с вирусп-родукцией хронически-инфицированным ВДЧ-1 штаммом клеток ГКВ-4005. По описанной вше технологии культивирования вируса и приготовления антигена ВИЧ-1 было изготовлено 12 лабораторных ■ серий антигена, которые .в последующем использовались для изго- ' товления тест-систем.
Клеточная система, включающая сокультивирование хронически инфицированной ВИЧ линии промоноцитов ГКВ 4005 и обеспечивающих продуктивную ВИЧ-инфекцию Т-клеток МТ-4. на наш взгляд, может -отражать реальную картину инфекции в организме больного. Воамож- "' ны такие ситуации,- при которых в хронически инфицированных и не продуцирующих инфекционного вируса моноцитах-макрофагах каки- " ми-либо факторами индуцируется вируспродукция, что вызывает инфицирование чувствительной популяции Т-лимфоцитов. Создание и изучение подобных клеточных систем важно для включения их в традиционную схему оценки противовирусного действия потенциальных-химиотерапевтических припаратов.
1.4.Выделение высокопродуктивных изолятов вируса от ВИЧ-инфицированных пациентов
К настоящему времени в лабораториях-мира выделены десятки вариантов ВИЧ, отличающихся не только организацией генома, но и своими биологическими свойствами (Вагге-Sinoussi et al.,1983, Popovic et al.,1984, Alizon et al.,1987, Gallo et al.,1985). В ; нашей стране выдано авторское свидетельство на штамм ВИЧ-lZmb (ГКВ-878), выделенный в Белорусском НИИ эпидемиологии и микробиологии г. Минска (Рытик с соавт.,1992). В производстве вирусного антигена также использовалась полученная нами совместно с Институтом вирусологии хронически инфицированная ВИЧ-1 перевиваемая"4'' моноцитарная линия клеток человека (ГКВ-4005) (Руднева с соавт.7 1988). Тем не менее, задача выделения высокопродуктивного штамма ВИЧ-1 остается актуальной, поскольку природные вирусные белки до настоящего времени используются в качестве основного компонента диагностических тест-систем, применяемых как для скрининга сывороток, так и для верификации диагноза. Следует особо отметить, что использование продуктивного итамма БИЧ (так называемого
rapid high) может существенно повысить выход вирусного антигена.
О целью выделения отечественного штамма ВИЧ-1. обладающего высоким и стабильным уровнем вируспродукции и пригодного для изготовления диагностических тест-систем были проведены исследования по выделению штамма ВИЧ от ВИЧ-инфицированных пациентов. В;,, результате проводимых работ было выбрано 3 высокопродуктивных перспективных для использования в производстве вирусного антигена штаммов вируса. После проведения серии сравнительных исследований нами был отобран наиболее перспективный штамм ВИЧ-1 N (Л-88), выделенный в 1988 году из мононуклеарных клеток периферической крови инфицированного ВИЧ-1 мужчины, 40 лет с симптоматикой лимфоаденопатии (до применения химиотерапии). Клинический материал получен на базе клиники ЦНИИ эпидемиологии г.Москвы (инфекционная больница N2), изоляция штамма проведена в отделе: . культивирования и диагностики ретровирусов НПО "Вектор". Штамм' депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского АМН СССР г. Москвы под номером-ГКВ-4046 (удостоверение о депонировании от 08.02.91г.. К 68-12/206).
При получении данного штамма использовали методы сокульти-вирования первичной культуры лимфоцитов, выделенной иэ периферической крови инфицированного ВИЧ-1 человека в градиенте фиколла и первичной культуры лимфоцитов, выделенной из периферической крови здорового донора, а также сокультивирование перевиваемой лимфоидной культуры клеток МТ-4 с первичной культурой лимфоцитов, выделенной из периферической крови инфицированного ВИЧ-1 человека.
После подтверждения вирусной продукции в сокультиватах по -данным иммуноферментного анализа, непрямой иммунофлюоресценции, определения активности обратной транскриптазы и электронной микроскопии, полученный материал исследовали путем заражения перевиваемых лимфоидных культур клеток МТ-4, Н-9, Hut-78, в которых также отмечалась вируспродукция, подтвержденная выше названными методами. На хранение заложены образцы на 12, 27, 34 пассажах.
Штамм ГКВ-4046 относится к семейству ретровирусов, подсемейству лентивирусов, имеет характерный для ВИЧ морфогенез, обусловленный почкованием вирусных частиц через клеточную мемб- ". рану, размер зрелых вирусных частиц 110-120 нм с конусовидным нуклеоидом. По данным непрямой иммунофлюоресценции процент, ви-руссодержащих клеток в популяции (при одноцикловом заражении)
МТ-4 на 3-4 сутки составляет 60-100% при жизнеспособности 60-45%, в линии Н-9 на 4-5 сутки - 30-50%, при жизнеспособности 54%. в линии Hut-78 на 3-4 сутки 50-75% при жизнеспособности клеток 60-56%.
Специфичность ВИЧ-1 продукции в культурах лимфоидных линий клеток МТ-4, Н-9. Hut-78, инфицированных штампом ГКВ-4046, подтверждена данными иммуноблота и электронной микроскопии.
Наиболее чувствительной культурой клеток для данного штамма вируса является перевиваемая лимфоидная культура клеток МТ-4. Так, по данным иммуноферментного анализа, содержание антигена в культуральной жидкости на 4 сутки культивирования составляет 1:512 - 1:1028.
Электрофоретический профиль вирусных белков штамма ГКВ-4046, наработанного на культуре клеток МТ-4 соответствует белковому спектру ВИЧ-1. Плотность вирусных частиц в градиенте Сахаровы 1,16-1,18 г/см3 ; культуральная жидкость и препараты очищенного вируса проявляют активность обратной транскриптааы в присутствии ионов Mg++ , синтетической матрицы poll (гА) и прай-мера oligo (dT). На перевиваемой культуре клеток МТ-4, инфицированной штаммом ГКВ-4046 проведено 55 пассажей (с периодическими заморозками).
В отличие от штамма ГКВ-878, где накопление до Ю-0 происходит на 7 сутки культивирования, средний титр штамма ГКВ-4046 в культуре клеток ЫТ-4 составляет 10~7 -10"8 на 3-4 сутки культивирования. В сравнении с хронически инфицированной ВИЧ-1 культурой клеток ГКВ-4005, штамм ГКВ-4046 также отличается более высоким уровнем накопления антигена на различных клеточных культурах и пригодностью для получения препаративных количеств очищенного вирусного антигена ( Таблица 4).
Для получения фрагментов лровирусной ДНК изолята ВИЧ-1 применяли цепную полимераэную реакцию. Были выбраны гипервариабельные районы VI, V2, V3 гена env, в нуклеотидных и аминокислотных последовательностях которых зарегистрированы значительные межш-таммовые вариации. Использованные праймеры содержат на своих 5'-концах сайты узнавания для рестриктаз BamHI, PstI и BglII, HindiII, обеспечивающие возможность эффективного клонирования амплифицированных фрагментов. В качестве вектора для клонирования использовали плазмиду pMTL21, содержащую протяженный полилинкер и позволяющею проводить высокоэффективную селекцию реком-
бинантных клонов.
Результаты секвенирования клона, полученного после амплификации и клонирования района VI и V2, представлены на Рис.1 (а). При сравнении полученных структур с данными литературы (Ratner et al.,1985) обнаружено, что структуры проклонированных фрагментов отличаются от ранее описанных. По сравнению с прототипным штаммом ВН10 штамм ГКВ-4046 содержит 14 точечных замен: С на Т в положении 30, Т на С в положении 45, G на А в положении 57, G на А в положении 69, G на А в положении 93, G на А в положении 95, G на А в положении 101, G на А в положении 117, G на А в положении 119, С на Т в положении 133, С на Т в положении 137, С на Т в положении 143, G на А в положении 164, С на G в положении 180, приводящих к 8 заменам аминокислот:
Pro' на Ser в положении 10, Asp на Asn в положении 19, Asp на Asn в положении 23, Gly на Arg в положении 31, Met на Ile в положении 33, Glu на Lys в положении 39, Ser на Phe в положении 44, Pro на Ala в положении 60.
Результаты секвенирования района V3 представлены на рис.1 (б). Клон содержит замены: GT на АА в положении 50 и 51, приводящие к аминокислотной замене Ser на Lys; А на G в положении 66, не приводящая к аминокислотной замене, а также имеется замена С на А, которая приводит к аминокислотной замене Asn на Lys.
Полученные данные показывают, что изолят ВИЧ-1 ГКВ-4046 является оригинальным штаммом ВИЧ-1.
С целью определения пригодности этого штамма для получения очищенного вирусного антигена проводили очистку вируссодержащей культуральной жидкости методом дифференциального центрифугирования. Для очистки использовали культуральную жидкость на 4 сутки после инфицирования клеток МТ-4 штаммом ГКВ-4046 с множественностью 10-30 инфекционных вирусных частиц на клетку. Посевная концентрация клеток составляет 0,9 - 1,1x10® мл. Очистку проводят по стандартной методике (Зайдес с соавт.,1986) в линейном градиенте сахарозы 0 - 60% при 70000 g, длительность центрифугирования 18 часов.
Выход вируса составляет около 20% от общего содержания вирусного антигена в культуральной жидкости (Таблица 5). Электро-форетический профиль вирусных белков штамма ГКВ-4046 соответс-
вню
ГКВ-4046
ВНЮ
ГКВ-4046
ВНЮ
ГКВ-4046
ВНЮ
ГКВ-4046
ВНЮ
ГКВ-4046
ВНЮ
ГКВ-4046
внЮ
ГКВ-4046
ВНЮ
ГКВ-4046
ВНЮ
ГКВ-4046
а)
АААБССТАААБССАТБТБТААААТТААССССАСТСТБТБТТАБТТТАААБ
II1111111 ИМ III11II111111III ПППМППИ 11111
АААБССТАААСССАТБТСТААААТТААССТСАСТСТБТБТТАБТСТАААБ Т6САСТ6АТТТ6ААБААТБАТАСТААТАССААТАБТАБТАБСБББАБААТ
ИНН IIIIIIIIIII IIII ПШПП 1111111111 I 11111
Т6САСТААТТТБААБААТААТАСТААТАССААТАБТА6ТА6СА6АА6ААТ
6АТААТ66А6ААА66А6А6АТААААААСТ6СТСТТТСААТАТСА6САСАА 11II111IIII11II I II ШПИПИ III ||||| П1П11
ААТААТББА6АААББАААААТААААААСТ6СТТТТТТААТАТТА6САСАА 6САТАА6А66ТАА66Т6СА6ААА6ААТАТССАТТТТТТТАТАААСТТ6АТ
IIIIIIIIIIIII ПШНМППМ IIIIIIIIIII1111111II
6САТАА6АБ6ТААА6Т6САБАААБААТАТ6САТТТТТТТАТАААСТТ6АТ АТААТАССААТАбАТААТБАТАСТАССАБСТАТАСбТТбАСААБТТБТАА
1(11! 1111 ¡111II1111¡111111111IIIIIIIIII I II II I III II
АТААТАССААТАБАТААТБАТАСТАССАБСТАТАСБТТБАСААБТТБТАА САССТСАБТСАТТАСАСАББССТ
I пп мшит пшш
САССТСАБТСАТТАСАСАББССТ
б)
СААТСТБТАБАААТТААТТБТАСААБАСССААСААСААТАСААБАААААБ
1111111111111111111111П11111111П1 1111111111111
СААТСТБТАБАААТТААТТБТАСААБАСССААСАААААТАСААБАААААА ТАТСС6ТАТСА6АБАББАССАБББАБАБСАТТТБТТАСААТАББАААААТ
II ИПППП I ИНИИПИИШ!!! ПНППНИП! ААТССБТАТСА6А6Б6БАССАБББАБАБСАТТТБТТАСААТАББАААААТ
АЕБАААТАТБАБАСААБСАСАТТБТААСАТТАБТА
1(111111111111111111111111111111111 АББАААТАТБАБАСАА6САСАТТБТААСАТТАБТА
Рис. I. Первичная структура областей VI, 1/2, (а) и 1/3
гена епу штамма БИЧ-1 ГКВ-4046. Амплификацию проводили с использованием следующих праймеров
для района VI-!/2 5' БАББАТССААТСАБТТТАТБББАТС 3' И 5' БбСТБСАббТСАААББАТАССТТТББАС 3', для района чЗ
5' АТАБАТСТБТАБСААТТААСТБТАСААББСС 3' И 5' ААТСААБСТТАСТААТАТТАСААТБТБСТТЕ 3' .
Сравнение ГНВ-4005 и ГКВ-4046
Таблица 4
NN Показатели
ГКВ-4005
ГКВ-4046
1 Рабочий банк
г Длительность культивирования 1 пассажа
В Среда культивирования
I Титр в ИФА
> Клетки-продуценты вируса
5 Наличие вирус-специфических белков
' Выход очищенного вирусного антигена ВИЧ-1
хронически инфицированная первичная культура клеток
5-6 сут
замороженная
суспензия
вируса
3-4 сут
1?РШ-1640 + 10% сыворотки плода коров 1:124 1:512
и-937
мало и>1б0/10,
р66,р55/51,вр41,
р31,р24,р17
2-3 %
МТ-4, Н-9, СЕМ,
ер160/120,р66,
р55/51,ер41,
р31.р24,р17
20-25 %
Контаминация клеток-продуцентов: микоплазма
+ +
вует белковому спектру ВИЧ-1. Таким образом, полученные резуль-аты демонстрируют пригодность штамма ГКВ-4046 для получения чищенного вирусного антигена в препаративных количествах.
Для определения пригодности штамма ГКВ-4046 в диагностичес-
ких тест-системах проводили оценку чувствительности и специфичности диагностикума, изготовленного с использованием лизата ви-
Таблица 5
Основные характеристики культуральной вируссодержащей жидкости и очищенного вируса ____
Культуральная Показатели вируссодержащая Очищенный
жидкость вирус
Белок по Лоури 5,0 mg/ml 2,0 mg/ml
Общий объем 40 литров 70 мл
Титр в ИФА 1:512 1:512000
руоных белков, полученных методом центрифугирования. Чувствительность диагностикума оценивали на нескольких панелях серопо-зитивных к ВИЧ-1 сывороток, а также по сравнительному определению титров эталонных анти-ВИЧ-1 сывороток. Специфичность системы определяли на панели донорских сывороток, не содержащих антител' к ВИЧ.
Для сравнения использовали вирусный лизат фирмы "Du Pont". Сорбцию лизатов на планшеты из полистирола проводили в разведении 1:1000 в 0,05 M карбонатном буфере pH 9,6. Полученные данные показали, что тест-система на основе вирусного лизата из предлагаемого штамма по чувствительности (100%) и специфичности (100%) не уступает антигену фирмы "Du Pont". Данные по сравнению чувствительности антигена, полученного при использовании штамма ГКВ-4046 с антигеном фирмы "Du Pont", представлены также на рис.2. Оценка чувствительности двух антигенов в коммерческой непрямой иммуноферментной тест-системе "Антиген" (использовали все компоненты набора, кроме планшет) была проведена на микропанели из 5 референс сывороток в разведении 1:400 (разведение антигена 2 и антигена Du Pont при сорбции 1:1000).При сравнении с тест-системой "Антиген" (изготовленной на вирусном лизате фирмы "Du Pont") с использованием стандартной панели ГИСНа, установлено, что вирусный лизат, приготовленный ка основе этого штамма,
Рис. 2. Исследование эталонных ВИЧ-1 положительных сывороток с использованием вирусного антигена фирмы "Dupont"H штамма ГКВ-4046.
I - вирусный антиген фирмы "Dupont", 2 - вирусный антиген из штамма ГКВ-4046. По оси ординат - величина оптической плотности при 492 нм, по оси абсцисс - номера эталонных сывороток.
ftS
/в/я
nini r « » я u a » я
CJj«-„---—
»" «пмшшам сыимгв
e • ir • • ■■ s пакт
гшвег
wwimim ii tm-i nuntiii
Рис. 3. Связывание антител эталонных анти-ВИЧ-1 сывороток с белками вируса иммунодефицита человека I типа ГКВ-4046.
позволяет получить тест-систему с аналогичной чувствительностью и специфичностью (Таблица 6). Это демонстрирует пригодность по, Таблица 6 Сравнение чувствительности и специфичности антигена на панели сывороток ГИСКа им. Л.А. Тарасевича
Наименование N серии Чувстви- . Специ-
тест-системы тельность фичность
% %
Тест-система ИФА на
вирусном лизате
фирмы "Du Pont" 13 100 100
Тест-система ИФА на 01 100 100
вирусном лизате 02 100 100
из штамма ГКВ 4046 03 100 100
лученного антигена для производства коммерческой тест-системы.
Также проведена оценка пригодности антигена, полученного при культивировании штамма ГКВ-4045 для изготовления тест-системы иммуноблот. Полоски с иммобилизованными белками вирусного ли-вата получали по традиционной схеме, включающей разделение вирусных белков электрофорезом в 13%-ном полиакриламидном геле и перенос их на нитроцедлшо8ную мембрану. Исследование проводили с использованием панели аттестованных на наличие антител к БИЧ-1 положительных сывороток, при этом было отмечено полное совпадение картины распределения специфически окрашенных зон с паспортными данными эталонных анти-ВИЧ-1 сывороток (Рис.3).
Таким образом, штамм „ГКВ-4046 может использоваться для получения вирусного антигена, пригодного для использования в диагностических тест-системах. Предложенная для этого штамма схема культивирования обладает рядом преимуществ по сравнению с культурой клеток ГКВ-4005: штамм вируса обеспечивает высокий и стабильный уровень вируспродукции; обеспечивает получение высокоо-чищенного вирусного антигена в препаративных количествах; не требует постоянного культивирования клеток-продуцентов и может храниться в течение длительного времени в ваморояенном состоя-
2. Разработка тест-систем для детекции вирусного антигена БИЧ-1 и ВИЧ-2.
Наряду с определением антител к белкам ВИЧ, важное место в диагностике ВИЧ-инфекции занимает определение вирусного антигена. Наличие длительного периода до появления антител к вирусным белкам - до 6 месяцев, послужило основанием для проведения исследований по определению вирусного антигена в ранний период ВИЧ-инфекции. Первые работы по определению вирусного антигена у ВИЧ-инфицированных появились в 1986-87 годах (Landge et al.,1986; Mayer et al.,1987; de Wolf et al.,1987; Allaln et al.,1987; Cao et al.,1987). После этого значительное количество исследований по этому направлению было выполнено в ряде лабораторий. Было установлено, что частота выяления вирусного антигена в значительной степени зависит от стадии инфекции и выраженности клинического проявления заболевания.
На первом этапе исследований для детекции вирусного антигена использовались тест-системы, приготовленные из иммуноглобулинов, выделенных из сывороток инфицированных людей или иммуноглобулины животных, иммунизированных очищенным инактивированным вирусом. Чувствительность этих тест систем составляла 0,5 -1,0 нг суммарного вирусного антигена/мл (Landge et al.,1986; Allaln et al.,1987).
К моменту начала наших исследований по этому направлению в нашей стране отсутствовали коммерческие диагностические тест-системы для выявления антигена ВИЧ. Существовали экспериментальные разработки тест-систем ИФА для индикации антигена БИЧ-1, позволяющие определять антиген ВИЧ-1 в концентрации 25-50 нг/мл (Маренникова с соаэт.,1989) и до 1 нг/мл (Трушинская с со-авт.,1989). Согласно схеме, предложенной в работе Жданова с со-авт.(1988), нами были сконструированы тест-системы как для выявления антигена ВИЧ-1, так и для выявления антигена ВИЧ-2.
Сыворотки, используемые для приготовления иммуноглобулинов и конъюгата проверялись в иммуноблоте на полноту представительности антител к вирусным белкам. Так сыворотка человека, инфицированного ВИЧ-1, имеющая титр в ИФА 1:3200 и взаимодействующая в иммуноблоте с белками р17, р24, р31, р40, gp41, р51, р55, рбб, ÏP120, gpl60 обеспечивала получение активных в ИФА IgG (концентрация белка антител 11,8 мг/мл, рабочее разведение 1:400) и пе-
роксидазного конъюгата (рабочее разведение 1:2000). В тест-системе на антиген ВИЧ-2 была использована сыворотка от серопози-тивного на ВИЧ-2 человека, взаимодействующая в иммуноблоте белками р26, ЕрЗб, р56, р68, ер105. Вьщеленные имели концентрацию 4,2 мг/мл, рабочее разведение иммуносорбента и конъюгата соответственно составило 1:250 и 1:500. Иммуносорбент для ИФА готовили путем-адсорбции в лунках 96-луночных полистироловых пластин (фирмы "тегйек", Нидерланды) по 100 мкл или монокло-нальных антител (МКА) на 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,6. Оптимальная концентрация для сорбции составила 10-20 мкг/мл, режим сорбции 16 ч при 4° 0. В случае использования МКА применяли 30-ти минутную "забивку" 0,5% раствором казеина при 37° С. Для нативных вируссодержащих жидкостей и концентрированных вируссодержащих материалов исходные разведения составляли соответственно 1:2 и 1:100. Инкубацию проводили 2 часа при 37°0. Планшеты на всех этапах постановки ИФА четырехкратно отмывали физиологическим раствором, содержащем 0,1% твин-80 (ФРД). Из двух лунок с анализируемыми пробами в одну вносили смесь конъюгата с отрицательной, а в другую - с положительной сыворотками в разведении 1:100 и инкубировали 1,5 часа при 37° С. Рабочее разведение конъюгата варьировало в пределах 1:500 - 1:2000. Все разведения готовили на ФРД. Наличие пероксидазы, являющейся показателем образования комплекса антиген-антитело, определяли с помощью раствора ортофенилендиамина 0,4 мг/мл в 0,1 М цитрат-но-фосфатном буфере, рН 6,0 содержащем 0,02% перекись водорода. Реакцию останавливали через 20 минут добавлением в каждую лунку 50 мкл 0,9 М серной кислоты.
В каждую постановку для стандартизации результатов реакции включали антиген с известным титром в ИФА. Учет ИФА вели спект-рофотометрически при длине волны 492 нм. За титр исследуемого вируссодержащего материала принимали то его наибольшее разведение, показатель оптической плотности (ОП) которого с отрицательной сывороткой минимум в 2,5 раза превосходил ОП соответствующего разведения с положительной сывороткой.
Хотя антигены ЕИЧ-1 и ВИЧ-2, кодируемые генами и ро1, обнаруживают значительную гомологию и перекрестные реакции наблюдаются не только в ИФА, но и в иммуноблоте, а также в реакции нейтрализации вирусов, при использовании конкурентного ИФА они встречаются значительно реже (Бектемиров,1990). Зто подтверди-
лось и нашими данными. Как видно из рис.4, тест-система на антиген ВИЧ-1 не позволяла выявлять антиген ВИЧ-2 и наоборот.
Весьма важным этапом для исследований по созданию тест-системы для детекции вирусного антигена служит выбор конкретного маркерного вирусного белка, использование которого позволит проводить эффективное тестирование клинических образцов. Кроме структурных белков вируса, внимание исследователей привлекла возможность определения активности специфичной для ВИЧ РНК-зависимой ДНК-полимеразы образцах от ВИЧ-инфицированных пациентов и ВИЧ-инфицированных культур клеток. Наряду с тест-системами для детекции суммарных вирусных белков, в качестве кандидатов в маркерные белки исследовали оболочечные gpl20 и gp41, а также мажорный белок вирусной сердцевины р24 - продукт экспрессии гена gag. Опубликованы данные по конструированию тест-системы для определения gpl20 в клеточных лизатах. Однако, проведенные экспериментами по тестированию этих белков в сыворотке, показали неспособность детекции gpl20. Следует отметить, что реальная концентрация этого белка в сыворотке не должна быть значительной (в отличие от р24), поскольку весьма высока аффинность СД4 рецептора для gpl20 - 1нМ или 120 нг/мл и, вследствие этого, маловероятно наличие значительных количеств этого белка в свободной, несвязанной с СД4 рецептором форме.
Имеются данные, что использование MRA к р24 ВИЧ в иммуно-ферментных тест-системах обеспечивает их высокую специфичность и, в силу этого, позволяет более четко проследить динамику инфекционного процесса в сравнении с тестами, в которых участвуют поликлональные антитела человека (Grunow et al.,1990, Wolf et al.,1990). Нами была проанализирована коллекция из 7 видов МКА к р24 ВИЧ-1, секретируемых 4 мышиными и 3 крысиными гибридомами. В процессе исследований была выявлена мышиная гибридома NS5T4, продуцирующая МКА IgG 2а класса для использования в качестве им-муносорбента в ИФА. Концентрация белка 7 мг/мл, титр в ИФА 1:128000, рабочее разведение 1:700.
Результаты экспериментов по определению чувствительности тест-систем для определения р24 и суммарных белков ВИЧ-1 приведены на рис.4. В качестве референс антигена использовали очищенный р24 ВИЧ-1 из набора фирмы "Dupont", с общей концентрацией вирусных белков 0,8 мкг/мл и концентрацией р24 ВИЧ-1 0,2 мкг/мл. В паралельных экспериментах использовали очищенный препарат
ВИЧ-I, полученный в нашей лаборатории. При этом, в зависимости от использования разных образцов для калибровки, различия в чувствительности тест-системы были незначительны. Во всех экспериментах тестировали так же пробу, представлявшую собой 10-кратный концентрат культуральной жидкости ГКВ-4005, полученный методом ультрафильтрации и используемую впоследствии в качестве стандарта.
В тест-системе "igG" положительной считали пробу ОП которой с отрицательной сывороткой минимум в 2,5 раза превышало значение соответствующего разведения с положительной сывороткой. Чувствительность тест-системы "IgG" составила 5 нг/мл.
В системе р24 чувствительность системы определяли по пробе с минимальной концентрацией р24 ВИЧ-I, ОП которой превышала значение ОП отрицательного контроля в 2 раза. В качестве отрицательного контроля был использован раствор ФРД. Чувствительность тест-системы - составила до 0, 5 нг/мл р24 ВИЧ-1.
Необходимо отметить, что количественное определение вирусных белков с использованием суммарных IgG может быть только относительным, поскольку величина сигнала зависит как от состава IgG, (наличие и соотношение IgG к различным вирусным белкам) взятых для приготовления тест-системы, так и от соотношения различных белков ВИЧ-I в исследуемой пробе. В этом отношении выгодно отличается тест-система на р24, которую можно использовать для количественного определения р24.
Предложенные варианты ИФА позволяли определять антиген ВИЧ-I в нативной культуральной жидкости, концентратах неочищенного и очищенного вирусов, а также в культурах лимфоцитов, выделенных от серопозитивных лиц. Следует отметить, что комплексное применение диагностикумов для определения суммарного антигена и р24 позволяет получить данные о представительности вирусных белков в исследуемых препаратах.
Определение антигена ВИЧ-I в лимфоцитах, выделенных от серопозитивных лиц, проводилось с использованием двух иымунофер-ментных тест-систем "IgG" и "Abbott" (США). Культуры лимфоцитов, полученные из периферической крови одиннадцати лиц, серопозитивных к ВИЧ-I, выделяли в градиенте фикола и культивировали в течение 5-7 пассажей. В IO-ти из 11-ти случаев были получены сходные результаты.
Проведенные параллельно выборочные исследования культу-
ры-продуцента на содержание антигена в клетках методом непрямой иммунофлюоресценции и методом определения активности обратной транскриптазы в целом дало совпадающие результаты: высокие титры антигена в культуральной жидкости соответствовали высокому проценту антигенсодержащих клеток и эффективному копированию синтетической гомополимерной матрично-праймерной комбинации. Причем чувствительность предлагаемых тест-систем на порядок превышала чувствительность метода обратной транскриптазы, в котором за титр исследуемой культуры также принималось последнее разведение, количество распадов в минуту которого в 2,5 раза превышало величину отрицательного контроля.
С целью изучения эффективности анти-ВИЧ активных препаратов (антисмысловые олигонуклеотиды, пептиды, препараты растительного происходжения и т.д.) было протестировано более 50000 проб. Для экономии труда и всех расходуемых ингредиентов эффект ингибиро-вания вычислялся не по изменению титра исследуемого вирусного материала, а по изменению оптической плотности (ОП) в одном предварительно выбранном разведении. Предварительные опыты показали, что наиболее подходящим для этой цели являются рабочие разведения 1:8 или 1:16, поскольку именно для них наиболее значимы различия ОП, характеризующие материалы с разным содержанием антигена ВИЧ-1.
Процент ингибирования (X инг.) вычислялся по формуле:
а
% инг. - 100% --- * 100% . где
X'
а - обратная величина выбранного рабочего разведения исследуемой пробы (8 или 16), х' - обратная величина разведения исследуемой пробы.
Для расчета % инг. в каждом эксперименте строили график зависимости ОП контрольного вируса (без добавления анти-ВИЧ препарата) от log х, где х - обратная величина разведения контрольного вируса. Затем по значению ОТ исследуемой пробы (с анти-ВИЧ препаратом) на графике (рис. 4) находили соответствующее ей значение х*.
Таким образом, предлагаемые варианты тест-систем могут быть использованы для текущего контроля за состоянием клеточных культур, инфицированных ВИЧ-1 и ВИЧ-2, оценки готовых серий концентрированного и очищенного вируса. Полученные данные показывают
Рис. 4. Определение антигенов БИЧ-1 и ВИЧ-2 с использованием тест-систем "I дБ" и антигена р24.
1 - культуральная жидкость (КЖ) ВИЧ-2 в тест-системе "р24",
2 - И № в тест-системе "р24'\ 3 - КЖ ВИЧ-1 в тест-системе "1дС', 4 - КЖ ВИЧ-2 в тест-системе 'Чдв". По оси ординат - величина оптической плотности при 492 нм; по оси абсцисс - 7 од2 обратной величины разведения антигена.
1
Рис. 5. Сравнение чувствительности двух вариантов тест-систем
для определения р24 антигена. I - первый вариант тест-системы, коньюгат анти-ВИЧ I дБ -пероксидаза хрена, 2 - второй вариант, биотин-стрептавидин проявляющая система. По оси ординат -величина оптической плотности при 492нм; по оси абсцисс - концентрация антигена (пг/мл).
возможность специфического выявления антигенов ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Применение МКА к р24 БИЧ позволило, повысить чувствительность ®н-редеяения тест-системы на определение антигена до 0,5 нг/мл р24 ВИЧ (рис.4). Особый интерес представляет проведение расширенного исследования по определению антигенов ВИЧ в клинических образцах сывороток и клеток крови. В связи с этим следует отметить, что существенным преимуществом тест-системы р24 в этом случае может быть ее более высокая специфичность, что особенно важно при исследовании клинических образцов.
Использование ИФА для выявления антигена наталкивается на трудности, связанные, во-первых, с весьма низким содержанием антигена в крови пациента. Известно, что существенное повышение диагностической эффективности ИФА может быть достигнуто за счет использования комплекса биотин-стрептовидин пероксидаза хрена.
Применение биотин-стрептавидиновой системы позволило повы-,\сить чувствительность на порядок. Чувствительность 1-го варианта 500 пг/мл, 2-го -50 пг/мл. На рис,5-представлены калибровочные ^.кривые для двух вариантов тест-систем. По оси ординат - ОП492 по •"оси абсцисс - концентрация р24 антигена ВИЧ-1 пг/мл. Кривая 1 -1-ый вариант тест-системы, кривая 2 - 2-ой вариант, (в первом варианте ИФА тест-систем в качестве проявляющей системы служил конъюгат пероксидазы с IgG, выделенными из савороток БИЧ-инфицированных людей,- во втором биотинилированные анти-БИЧ-1 IgG человека и конъюгат стрепгавидина с полимерной пероксидазой. В качестве положительного контроля использовали концентрат ВИЧ-1, откалиброванный по референс антигену р24 ВИЧ-1 из тест-системы Du Pont).
Проведено изучение чувствительности и специфичности 2-го варианта тест-системы на панели положительных сывороток и лимфоцитов, выделенных от ВИЧ-инфицированных пациентов из различных регионов СНГ и панели отрицательных сывороток, взятых от различных больных в том числе с вирусными заболеваниями. Полученные данные представлены в таблице 6. Среди БИЧ-позитивных сывороток наличие антигена р24 выявлено в 5% случаев, что достаточно хорошо коррелирует с данными литературы (Kageyara et al.,1988, Mathiesen et al.,1988). Отсутствие антигена в пробах лимфоцитов объясняется, по-видимому, низкой концентрацией клеток (105-10е мл). Содержание р24 антигена ВИЧ-1 в позитивных образцах сыоро-ток составило 60-60 пг/мл.
Таблица 6
Исследование сывороток крови ВИЧ-инфицированных лиц при прямой детекции р24 антигена БИЧ-1 и после кислотного гидролиэа
ВИЧ-положительные сыворотки из различных регионов СНГ Всего обследованных сывороток Число положительных результатов
при прямой детекции после кислотного гидролиза
Ростов-на-Дону 42 3 24
Элиста 36 0 6
Минск 17 1 0
Новосибирск 5 1 1
общее количество 100 5 31
ВИЧ-отрицательные 200 О
сыворотки от доноров и больных другими вирусными заболеваниями
В последние годы появился ряд сообщений о значительном расширении области применения тест-систем для определения антигена р24 за счет предварительного разрушения в тестируемой сыворотке комплекса антиген-антитело. При этом количество позитивных на р24 проб значительно увеличивается и достигает 50-70% от общего количества тестируемых ВИЧ-поэитивных сывороток ШзИаМап е1 а1.,1990, АсЬег еЪ а1.,1992). О целью выбора оптимального варианта выявления антигена в составе иммунного комплекса были проведено сравнение различных способов их разрушения. Полученные результаты сопоставлены с данными клинического и иммунологического обследования.
Существует несколько подходов для выявления антигена в сос-
таве иммунного комплекса. Наиболее часто используемым способом выявления связанного антигена является кислотный гидролиз, применяемый в двух модификациях, обозначенных нами как метод 1 и метод 2, и также некоторые вариации этих методов
(Nishanian et al.,1990, Acher et al.,1992, Symon et al.,1992). Мы попытались сравнить их и выбрать наиболее оптимальный.
Метод 1. Исследуемую пробу смешивали с 0,05 М глицин-Н01 буфером (рН 2.0) в соотношении 1:2 и нагревали в течение 10 минут при 70°0. После нейтрализации 1,7 М Трисом (9 мкл на 100 мкл пробы) обраэцы тестировали на наличие р24 антигена ВИЧ-1. Учет результатов проводили исходя из 3х кратного разведения пробы.
Метод 2. Исследуемую пробу смешивали с 1 М НС1 (рН 3.0) в соотношении 15 мкл НС1 на 200 мкл пробы и инкубировали в течение 90 минут при 20°С. Затем нейтрализовали до рН 7.4 добавлением 20 мкл 1М NaOH на холоду и тестировали на наличие р24 антигена ВИЧ-1. Доведение рН осуществляли по индикаторной бумаге. Учет результатов проводили исходя из разведения пробы в 1.2 раза.
На первом этапе нами был исследован процесс маскирования вирусного антигена антителами к вирусу. Стандартный антиген с конечной концентрацией антигена р24 1нг/мл инкубировали 90 мин при 37°С с различными разведениями сывороток после чего проводили повторное определение антигена р24. Установлено, что даже слабо-титракная сыворотка эффективно маскирует антиген р24 до разведения 1/4, а высокотитражная - вплоть до конечного исследованного разведения сыворотки 1/64. В качестве модели для исследования был выбран иммунный комплекс, образованный стандартным антигеном с концентрацией р24 ВИЧ-1 1 нг/мл и иммунной сывороткой в раэве-' дении 1:8000. Полученные результаты по сравнению двух способов разрушения иммунных комплексов показывают, что разрушение иммунных комплексов методом 1 меньше зависит от концентрации антител , и дает более полное выявления антигена.
Нами также был проверен способ осаждения иммунного комплекса полизтиленгликолем и ЗДТА с последующим центрифугированием и разрушением 6 М гуанидином, предложенный Landze et al.,1987. Этот метод более громоздок и трудоемок и не во всех исследуемых сыворотках нам удалось осадить иммунный комплекс, ра гетерогенность иммунных комплексов и важность выбора Ьптямального метода их анализа указывают авторы аналогичного экспериментального подхода к выделению иммунных комплексов (Morrow et а1.'Д !}$$).
Результаты модельного эксперимента были подтверждены при исследовании сывороток от ВИЧ-инфицированных пациентов. Полученные данные представлены в таблице 6,7. При тестировании сывороток на содержание р24 антигена БИЧ-1 бее применения кислотного гидролиза 9 сывороток показали отрицательный результат и 1 сыворотка положительный. Использование метода 1 по сравнению с методом 2 позволило получить более высокие значения содержания р24
Таблица 7
Определение антигена р24 в сыворотках крови ВИЧ-инфицированных
пациентов
Клинический статус Количество исследованных пациентов Колчество р24+ пациентов (после кислотного гидролиза) X
Бессимптомные вирусоносители 6 0 12,6 ± 11
Лица с генерализованной лимфаденопатией 32 б 16 ± 6
Больные о проявлением ЯВД-ассоцииро-ванных оппортунистических инфекций 32 16 50 ± 8
Больные СПИД 8 6 75 ± 15
ВИЧ-1, но трехкратное разведение исследуемой пробы в методе 1 уменьшает его чувствительность. Так сыворотка N 10 при принятой системе учета является отрицательной на р24 антиген ВИЧ-1 по методу 1 и положительной по методу 2. С помощью метода 2 нами была исследована панель сывороток от пациентов ив различных регионов СНГ.
В результате анализа клинических проявлений ВИЧ инфекции, пациенты были разделены на 4 группы, указанные в таблице 7. Была обнаружена выраженная корреляция между выявлением р24 антигена в
плазме крови и клиническим диагнозом пациентов, что хорошо согласуется с литературными данными. Возрастание частоты обнаружения р24 антигена по мере развития заболевания, по-видимому, связано с учащением возникновения вирусемии при прогрессировании ВИЧ инфекции. Использование кислотного гидролиза позволило выявить антиген в 31 сыворотке и увеличить процент выявления р24 ВИЧ-1 антигена от 5 % до 31% (таблица 6). Кроме того, у 19 сывороток ОП имела пограничное значение.
Дополнительно нами была исследована возможность тестирования антигена р24 различных штамммов ВИЧ-I. С этой целью мы сравнили как влияют различные методы обработки на клеточные культуры, инфицированные различными штаммами ВИЧ-I. Обработка штаммов ЭВК, BRU и RF по методу I произвела на них незначительное воздействие - процент выявления составил 82-98. Использование метода 2 оказало более жесткое воздействие на антигенные детерминанты исследуемых штаммов. Процент выявления составил 62-77. Аналогичная картина наблюдалась и при выявлении антигена в составе иммунного комплекса для метода I - 64-87% , для метода 224-47%.
Следует особо отметить, что в пробах с низким содержанием антигена р24 (концентрации 50-70 пг/мл) после кислотной обработки возможно получение отрицательных результатов. Этим можно объяснить тот факт, что при прямой детекции в сыворотке из Минска был обнаружен антиген, а при кислотном гидролизе - нет. О подобных случаях сообщается в работах (Nishanian et al., 1990, Acher et al., 1992). Ложно отрицательные результаты возможны в сыворотках с низким содержанием р24 антигена ВИЧ-I, когда особенно чувствительны потери, возникающие при преобработке сывороток.
Полученные нами результаты позволяют рекомендовать для массового применения метод I. Таким образом, нами предложен быстрый и удобный способ выявления антигена в составе иммунного комплекса. Проведенные исследования демонстрируют возможность тестирования вирусного антигена в различных пробах от ВИЧ-позитивных пациентов. Высокий процент сывороток, содержащих антиген р24 (после разрушения иммунного комплекса), дает основания для рекомендации о внедрении этого метода для тестирования всех ВИЧ-инфицированных пациентов. Результаты такого обследования могут быть полезными для прогноза развития заболевания.
- 40 -
3. Изучение особенностей репродукции ВИЧ на различных клетках-мишенях (Т-хелперах и моноцитах/макрофагах) и активаторов репродукции ВИЧ.
Отсутствие до настоящего времени адекватной модели ВИЧ-инфекции на лабораторных животных, возможность латентного и продуктивного типа ВИЧ-инфекции и существенные отличия в репродукции ВИЧ на различных клетках-мишенях делают необходимым углубленное изучение особенностей репродукции вируса в различных клетках-мишенях. Этим исследованиям посвящены многочисленные сообщения ряда ведущих лабораторий. Нами проводилось- изучение особенностей репродукции ВИЧ на различных культурах клеток проводилось с целью развития подходов к а) изучению различных противовирусных препаратов, перспективных для использования в качестве ингибиторов ВИЧ-инфекции; б) исследованию особенностей активации ВИЧ-инфекции.
3.1. Выбор клеточной системы для оценки препаратов-ингибиторов репродукции ВИЧ.
Традиционными клеточными моделями, используемыми для скрининга препаратов с анти-ВИЧ активностью, служат перевиваемые линии Т-хелперов, обеспечивающие развитие продуктивной вирусной инфекции (ое С1егсц, 1988). Среди исследованных нами клеточных линий МТ-4, СЕМ, Н-9 наиболее чувствительной оказалась линия МТ-4, которая и была выбрана в качестве основной при проведении этих исследований. Следует подчеркнуть, что клетки МТ-4 широко используются для оценки анти-ВИЧ эффекта различных соединений, и это позволяет сравнивать полученные в различных лабораториях результаты. Полученная нами клеточная линия моноцитов человека, инфицированных ВИЧ-1 (ГКВ-4005), была использована в качестве дополнительной модели для оценки анти-ВИЧ активности тестируемых соединений. На наш взгляд, хроническая ВИЧ-инфекция, протекающая в этой культуре, более адекватно отражает картину инфекции на уровне организма, по сравнению с острой продуктивной инфекцией в клетоках МТ-4.
Существенным моментом при отборе препаратов-ингибиторов ВИЧ-инфекции служит выбор показателей для определения эффекгив-
ности исследуемых соединений. Первичная оценка соединений по их способности защищать инфицированные клетки от гибели, широко используемая в ряде лабораторий (Ре СТегсд, 1989), по нашему мнению, не позволяет получить полную информацию о препарате. Так, при таком подходе, в неперспективные попадут соединения, вызывающие гибель инфицированных клеток. Исходя из этого, при скрининге препаратов-ингибиторов репродукции ВИЧ нами в обязательном порядке определялись активность вирусной обратной транскриптазы и/или уровень накопления вирусных белков (суммарных и р24) имму-ноферментным метод. В некоторых случаях дополнительно определяли количество вируспродуцирующих клеток методом непрямой иммунофлю-оресценции. Определение степени защиты инфицированных ВИЧ клеток от гибели проводилось путем оценки жизнеспособности клеток методом окрашивания клеток трипановым синим. В паралельных экспериментах оценивали цитотоксический эффект тестируемых соединений на неинфицированные клетки.
В работе использовали штаммы ВИЧ-1/ЗВК (ГКВ 4005), ВИЧ-1/В(»и, ВИЧ-1/йР и ВИЧ-2/яоо, полученные из института вирусологии им. Д. И. Ивановского, г. Москва, а также штамм ВИЧ-1 N I (ГКВ 4046), выделенный в нашей лаборатории из мононуклеарных клеток периферической крови ВИЧ-инфицированного пациента (свойства описаны в разделе 1.4). Тестирование препаратов проводили с использованием рабочих банков этих штаммов вирусов и рабочих банки выбранных для скрининга анти-ВИЧ препаратов культур клеток МТ-4 и хронически инфицированных ВИЧ-1 и-937. Использование такой схемы позволило проводить тестирование противовирусных препаратов в стандартных условиях. Рабочие банки клеток и вирусов хранились в жидком азоте.
Инфицирование клеток МТ-4 разными штаммами ВИЧ проводили путем добавления вируса к клеточной суспензии с концентрацией 2 млн клеток/мл. Множественность заражения в стандартных условиях составляла - 0,2-0,5 инфекционных вирусных частиц на клетку. После проведения адсорбции вируса в течение одного часа при температуре 37 С, инфицированные клетки разводили средой для культивирования до концентрации 0, 5 млн клеток/мл и вносили растворы исследуемых препаратов в клеточную суспензию. В качестве эталонных препаратов использовали известные ингибиторы репродукции ВИЧ: азидотимидан, гепарин, ауринтрикарбоновую кислоту (табл.
8). Контрольные и инфицированные ВИЧ клетки (с анти-БИЧ препаратом и без него) культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10-15% фетальной сыворотки (сыворотку предварительно прогревали при 56° С, 1 час), 300 мкг/мл L-глутамина, 100 мкг/мл гентамици-на, 100 мкг/мл канамицина или 60 мкг/мл линкомицина в 96-луночных культуральных планшетах фирмы "Costar" при температуре 37° С во влажной атмосфере 5% СОг.
Таблица 8
Ингибирование репликации ВИЧ-1 в культурах клеток
Кон- МТ-4 ГКВ 4005
Препараты цент- Ингибирование, % Ингибирование, %
рация активности накопления активности накопления
обратной вирусного обратной вирусного
мкМ тазы тазы
AZT 10 98,1 94,2 57,4 55,7
Гепарин 50 98,8 96,3 47,0 н/д
АТК 20 91,2 н/д 11,8 6,7
_ »» _ 10 85,3 н/д 11,7 3,4
В-ГК 1000 99,3 97,2 0 н/д
_ 1» _ 500 98,3 97,0 10,0 н/д
В-ГК - в-глицирризиновая кислота АТК - ауринтрикарбоновая кислота
В таблице приведены средние значения 3-6 экспериментов.
Ингибирующий эффект препаратов оценивали наЧ-5 сутки культивирования измерением активности вирус-специфического фермента РНК-зависимой ДНК-полимеразы, как описано ранее Lee et al., 1987 (за активность обратной транскриптазы принимали включение радиоактивной метки в импульсах на 1 мл культуральной жидкости), вирусного антигена иммуноферментным методом (Жданов и др., 1988), количества вирусного белка р24 (как описано в предыдущем разделе) , а также определяли долю жизнеспособных клеток методом включения трипанового синего. По такой схеме проводилось тестирова-
- 43 -
ние всех исследуемых препаратов.
" Для сравнения препаратов различных групп и оценки их перспективности нами определялись количественные характеристики противовирусной активности химиопрепаратов: а) концентрация препарата, вызывающая 50% снижение жизнеспособности клеток (CD50); б) концентрация, на 50% ингибирующая репродукцию ВИЧ (ID50); в) хи-миотерапевтический индекс (индекс селективности-IS) - отношение CD50 к ID50.
о »
3.2. Изучение влияния диоксина на репродукцию ВИЧ.
В последнее время в сзязи со значительным увеличением числа случаев заболевания СПИДом и нарастающим загрязнением окружающей среды ксенобиотиками диоксинового ряда не исключена возможность сочетанного воздействия на клетки иммунной системы ВИЧ-инфекции и 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксина (ТХДД). Исследование комбинированного влияния ВИЧ-инфекции и ТХДД на лимфоидные клетки приобретает особую важность, учитывая данные об уменьшении соотношения Т-4/Т-8 лимфоцитов при воздействии ТХДД, однако выраженность иммунодефицита существенно меньше, чем при ВИЧ-инфекции (Hoffman et al.,1986, Evans et al.,1988) . Механизм иммуно-токсического действия ТХДД до настоящего времени остается неизвестным.
В этом разделе приводятся результаты изучения влияния ТХДД на репродукцию ВИЧ-1 в хронически и первично инфицированных культурах лимфоидных клеток.
Выбор концентраций ТХДД основывался на данных Guenthner & Nebert (1977), показавших, что ТХДД в концентрациях 10-150 нМ не обладает выраженным цитотоксическим эффектом, но стимулирует индукцию содержащей цитохром P450IA1 микросомальной монооксигеназ-ной системы метаболизма 7-этоксирезоруфина и 3,4-бензпирена.
Эксперименты на линии клеток МТ-4 прозедены в двух вариантах: I. Заражение клеток ВИЧ-1 осуществляли через 48 ч (время, необходимое для индукции микросомальной монооксигеназной системы) после внесения в культуральную среду ТХДД в соответствующих концентрациях. II. Клетки инфицировались вирусом в этот же период, но инкубация их с препаратом диоксина ограничивалась 1,5 ч, после чего препарат удаляли (клетки осаждали центрифугированием, культуральную жидкость сливали и заменяли свежей средой).
На рис.6 приведены результаты экспериментов (вариант I) по
Рис. 6. Влияние различных концентраций 2, 3, 7, 8-ТХДЦ на репродукцию ВИЧ-1 по данным активности обратной транскрип-тазы в супернатанте клеток МТ-4: I - инкубированных со 150 нМ 2, 3,7, 8-ТХДД 2 - зараженных ВИЧ-1; 3 -. зараженных ВИЧ-1 через 48 ч после инкубации клеток с 10 нМ 2,3,7,8-ТХДЦ: 4 - то же. что и 3 с 50 нМ 2, 3,7, 8-ТХДД 5 - то же, что и 3 со 150 нМ 2,3,7, 8-ТХДД По оси абсцисс - активность обратной транскиптазы (расп/мин хКр), по оси ординат - время после инфицирования (сутки).
Рис. 7. Влияние длительности инкубации клеток МТ-4 с 2, 3, 7, 8-ТХДД на репродукцию ВИЧ-1 по данным активности обратной транскриптазы в супернатанте клеток МТ-4: I - инкубированных со 150 нм 2,3,7,8-ТХДЦ; 2 - зараженных ВИЧ-1; 3 - зараженных ВИЧ-1 через 48 ч после начала инкубации клеток с 10 нМ 2, 3, 7, 8-ТХДД 4 - зараженных ВИЧ-1 через 48 ч после начала 1,5 ч инкубации клеток с 2, 3,7,8-ТХДД По си абсцисс^ - активность обратной транскиптазы расп/мин хПг), по оси ординат - время после инфицирования сутки).
определению эффекта различных концентраций ТХДД на репродукцию ВИЧ-1. Выявлено значительное (в 3-6 раз) повышение активности обратной транскриптазы в образцах клеток, обработанных ТХДД.
Стимулирующий эффект ТХДД сохранялся и во втором варианте эксперимента с заменой питательной среды после 1,5 часов инкубации с ТЗДД (рис. 7). При этом максимальный эффект наблюдался на 9-13 день после инфицирования. При использовании ТХДД в концентрациях 50 и 150 нМ его стимулирующее влияние не зависело от введения отмывки в схему эксперимента.
Возможность повышения активности обратной транскриптазы под влиянием ТХДД за счет индукции этого фермента у другого ретрови-руса (вируса Т-клеточного лейкоза человека, тип I, использованного для получения культуры клеток МТ-4 (Harada et al.,1985) или другой "эндогенной" РНК - зависимой ДНК-полимеразы исключается, поскольку обработка препаратом диоксина неинфицированной ВИЧ-1 культуры клеток МТ-4 не приводило к появлению активности фермента. Параллельно с определением активности обратной транскриптазы было изучено накопление вирусных белков. Иммуноферментным методом также показано существенное (в 4-6 раз) увеличение вируспро-дукции в зависимости от концентрации ТХДД.
Таким образом, полученные результаты показывают, что ТХДД обладает выраженным стимулирующим эффектом на репродукцию ВИЧ-1 в первично инфицированной культуре клеток МТ-4. Необходим9 отметить, что, несмотря на существенное повышение уровня экспрессии вирусных белков и активности обратной транскриптазы жизнеспособность клеток в этих условиях по сравнению с контрольными образца»,® (без ТХДД) не менялась, чтс> свидетельствует об отсутствии цитотоксического эффекта использованных доз препарата. Что касается хронически инфицированной культуры клеток ГКВ-4005, то в этом случае наблюдалось лишь незначительное повышение вируспро-дукции - на 20-30£. Это может быть обусловлено тем, что данная культура клеток была отобрана как клон с максимальной вируспро-дукцией, поэтому возможности дальнейшего повышения за счет регу-ляторных механизмов в этой культуре исчерпаны.
Ранее описаны случаи активации ВИЧ-инфекции как химическими соединениями различного происхождения (Bohan et al.,1987), так и другими вирусами (Zack et al.,1988, Gengelman et al.,1986, Seto et al.,1988). Активирующий эффект связывается в большинстве случаев с феноменом транс-активации, играющим решающее значение в
регуляции процессов репродукции ВИЧ. Так, с использованием конструкции, содержащей концевые повторы (LTR) ВИЧ и ген хлорамфени-кол ацетилтрансферазы (ХАТ), установлено, что X белок вируса гепатита В вызывает 10-кратное увеличение продукции ХАТ (Seto et al.,1988). Ранее было показано, что X белок обладает транс-акти-вирующим действием для гомологичных и нескольких гетерологйчных энхансеров (Spandau and Lee,1988).
В случае ТХДД активирующий эффект, возможно, также обусловлен регуляторными белками, которые образуются при диоксиновой индукции и обладают транс-активирующим действием. В- этом смысле представляется вероятным и требующим экспериментальной проверки предположение о подобном механизме активирующего действия ТХДД, точнее комплекса "ТХДД-Ah-рецептор", поскольку имеются данные, что ТХДД в комплексе со своим высокоспецифичным цитозольным Ah-рецептором способен взаимодействовать с энхансерным участком человеческого гена СУР1А1, вызывая транс-активирующий эффект в генноинженерной конструкции, содержащей "репортерный" ген ХАТ (Jones et al., 1986). Наблюдаемый нами эффект!'-Вероятно, обусловлен именно связанным с Ah-рецептором ТХДД , поскольку удаление "свободного" ТХДД не влияет на активирующий эффект (рис.7).
О другой стороны, эффект ТХДЦ может быть связан с влиянием-продуктов, образующихся при его воздействии на клетки, на регу-ляторные белки ВИЧ - tat и rev, определяющие уровень репродукции вируса. Нельзя исключить и возможности активирования вируспро-дукции в результате сочетанного воздействия препарата диоксина на ряд процессов: транскрипцию, процессинг, стабильность РНК, трансляцию или стабильность белков.
- 47 -
4.Изучение перспективы применения в качестве специфических ингибиторов ВИЧ-инфекции антисыысловых олигодезоксинук-леотидов и пептидов-фрагментов белков ВИЧ.
При поиске препаратов-ингибиторов ВИЧ-инфекции в качестве мишеней исподьзуютя вирусепецифические ферменты: а) обратная транскриптаза, обеспечивающий синтез провирусной ДНК, необходимо й для реализации генетической информации вируса; б) аспарати-ловая протеаза, необходимая для процессинга белка gag. Кроме того, поиск средств лечения проводится среди препаратов, специфически блокирующих связывание поверхностного гликопротеида вируса gpl20 с CD4 рецептором Т-лимфоцитов. Специфически блокировать процессы репрликации, транскрипции и трансляции вирусспецифичес-ких нуклеиновых кислот возможно также с использованием антисыысловых олигонуклеотидов и их производных. Нами были предпринято изучение в качестве специфических ингибиторов репродукции ВИЧ препаратов нескольких различных групп: антисмысловых олигонукле-твдов и их производных, пептидов-фрагментов белков ВИЧ и производных нуклеозидов.
4.1.Изучение анти-ВИЧ активности антисмысловых олигонуклеотидов.
Перспективность использования антисмысловых олигонуклеотидов как потенциальных противовирусных препаратов нового поколения, направленных на определенные последовательности вирусных нуклеиновых кислот подтверждается рядом исследований последних лет (Zamecnik et al.,1986; Matsukura et al.,1987,1989). К настоящему времени в литературе описано ингибирование размножения ВИЧ-1 в культуре клеток олигонуклеотидами, комплементарными различным функциональным участкам (+) цепи РНК вируса. Однако (-) цепь вирусной РНК также может кодировать белки. В этой связи представлялось интересным сравнить эффективность подавления размножения ВИЧ-1 в культуре клеток олигонуклеотидами, комплементарными (+) и (-) цепям РНК вируса.
В качестве антисмысловых олигонуклеотидов были выбраны оли-гонуклеогиды, комплементарные донорному сайту сплайсинга (нукле-отиды 278-299 (Ratner et al., 1985), структура олигонуклеотида pTGGCSTACTCACCAGTCGCCGC -ДОС-22 и поли(А) последовательности мРНК (рТТТТТТТТТТТТТТТТ - ПА-16), ранее показавшие высокую ан-
ти-ВИЧ активность (Agrawal et al., 1989), олигонуклеотид pCTCCGCTTCT (REV-10), комплементарный началу гена rev. В качестве олигонуклеотида, комплементарного (-)цепи РНК, нами была выбрана последовательность pGCATCAAGCAGCTCCAGGCA (РМ-20), комплементарная области начала трансляшш предсказанной Роджером Миллером в 1988 году открытой рамки считывания на (+) цепи ДНК ВИЧ-1 (нуклеотиды 7516-7535). Кроме того, была исследована ан-ти-ВИЧ активность олигонуклеотида pCGTAGTTCGTCGAGGTCCGT (МР-20) комплементарного РМ-20. В качестве контрольного олигонуклеотида использовали олигонуклеотид структуры pTTGAAACCCGAGAACATCAT (fos), комплементарный началу мРНК гена c-fos мыши.
Олигонуклеотиды были синтезированы в Новосибирском Институте биоорганической химии СО РАН гомогенным фосфотриэфирным методом, как описано Абрамовой с соавторами, . 1990. Препараты, использовавшиеся в экспериментах, были гомогенны по данным электрофореза (чистота не менее 95%). Структура олигонуклеотидов подтверждалась результатами секвенирования по методу Макса-ма-Гилберта. '
Полученные экспериментальные данные (табл.9) показывают высокую противовирусную активность олигонуклеотида РМ-20, значительно превышающую эффект олигонуклеотидов, использованных ранее в других лабораториях. Учитывая данные о неспецифическом действии антисмысловых олигонуклеотидов на размножение ВИЧ (Moser, De г vari, 1987; Povslo, Dervan, 1989), нами для изучения специфичности анти-ВИЧ эффекта были использованы различные штаммы ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Специфичность действия исследованных олигонуклеотидов подтверждается результатами экспериментов с ВИЧ-2: препараты, , обладающие выраженным ингибиторным эффектом для ВИЧ-1, оказывают • меньшее действие на репродукцию ВИЧ-2 (табл.9). При анализе структуры вирусных генов ВИЧ-1 было установлено, что. гомология препаратов ДСС-22 и РМ-20 с соотвествующими нуклеотидными последовательностями в ВИЧ-2 составляет менее 30%. Что касается олигонуклеотида ПА-16, то его противовирусная активность также значительно ниже для ВИЧ-2. Эти данные позволяют предположить, что эффект этого олигонуклеотида связан не только с его взаимодействием с поли А последовательностями тРНК, как предполагалось ранее (Agrawal, 1988). При анализе первичной структуры ВИЧ-1 было установлено, что в области гена env (5740-5753, 7702-7717) локализованы кластеры поли А, отсутствующие в геноме ВИЧ-2. Это дает
возможность предположить, что анти-ВИЧ активность этого олиго-нуклеотида связана в большей степени с блокированием этапа трансляции mPHK env эа счет его вэаимодействия с mPHK.
Высокая анти-ВИЧ активность антисмыслозых олигонуклеотидов показана в ряде работ. Большую эффективность олигонуклеотида МР-20 по сравнению с олигонуклеотидами, описанными в этих работах, можно, вероятно, объяснить удачным выбором структуры мишени.
Высокая ингибирующая активность смыслового олигонуклеотида РМ-20 может быть объяснена его эффективным действием на нескольких этапах развития вируса: 1) блокирует инициацию трансляции ва счет взаимодействия с mPHK гена +0RF, описанного Миллером, если он - функционирующий ген. Эффективность этого процесса может быть особенно высока, поскольку участок, комплементарный этому олигонуклеотиду, соответствует сайту инициации трансляции шРНК гена +0RF и локализуется в выпетленном районе вторичной структуры шРНК (предсказание вторичной структуры РНК было выполнено В.М.Блиновым с помощью программы "PCFOLD" (Zuker, Stiegler, 1981; Jacobson et al., 1984). 2) Олигонуклеотид ингибирует транскрипцию с геномной ДНК mPHK ehv; 3) За счет его взаимодействия с (-)цепью ДНК возможно блокирование синтеза (+)цепи ДНК вируса. 4) Олигонуклеотид может ингибировать процесс репликации вирусной (геномной) РНК на этапе ее синтеза с ДНК матрицы.
Олигонуклеотид РМ-20 оказывает также выраженный ингибирую-щий эффект на репродукцию выделенного от инфицированного человека штамма ВИЧ-1 N 1 (ГКВ 4046). Компьютерный анализ этого района 4.7 различных штаммов ВИЧ-1 показал, что участок, к которому комплементарен олигонуклеотид РМ-20, является консервативным для всех известных штаммов ВИЧ-1 (не более 1-2 замен).
Контрольный олигонуклеотид fos, хотя и в меньшей степени, также оказывал ингибирующее действие на размножение вируса, однако абсолютно не защищал клетки от гибели. Но так как контрольный олигонуклеотид не имеет совершенных участков связывания с РНК ВИЧ-1, объяснение его противовирусной активности взаимодействием с генетическим материалом вируса представляется маловероятным. Анализ опубликованных данных по действию олигонуклеотидов и их аналогов на репродукцию ВИЧ-1 приводит к заключению, что, по-видимому, имеется несколько механизмов подавления вирусной инфекции олигонуклеотидами, и в ряде случаев ведущим из них ока-
зывается механизм, не связанный с образованием совершенных комплементарных комплексов. Так, отмечена относительно высокая противовирусная активность гомоолигонуклеотидов (Аггаиа1 et а1., 1988), а в случае фосфотиоатных аналогов гомоолигонуклеотид (олигоцитидилат) оказался самым активным (Аегача1 еЬ а1., 1988; МаЪэикига еЬ а1., 1987). В таблице 10 приведены результаты экспериментов по определению количественных характеристик ингибиро-вания репродукции ВИЧ-1 для некоторых антисмысловых олигонуклео-тидов. Для сравнения использовали один из наиболее эффективных для лечения ВИЧ-инфекции препаратов - азидотимидин. Как видно из таблицы 10 индекс селективности существенно отличается для равных антисмысловых олигонуклеотидов. Наибольшим 1Б характеризуются олигонуклеотиды РМ-20 и комплементарный ему ЫР-20 - 1Б до 500.
Таким образом, результаты экспериментов с использованием модели инфицированных БИЧ клеток позволили найти перспективные олигонуклеотиды с высоким вначением 13.
Ингибирование репродукции различных штаммов БИЧ антисмысловыми олигонуклеотидами
Таблица 9
Наименование Концентрация, Ингибирование, X
препарата мкМ ГКВ 4005 ГКВ 4046 БИЧ-2/гос1
ОТ АГ ОТ ОТ АГ
р(ЗСАТСАА<ЗСАОСТССАаЗСА 5 98 97 95 39 64
(РМ-20 ) 1 97 94 97 - -
ртаяотАстсАСЮАетсшн; 10 94 - - 39 -
(Д00-22) 5 68 - - 40 -
1 13 19 - 2 -
ртттттттттттттттт 10 63 83 - 40 -
(ПА-16) 1 6 8 - 22 •-
рТТ(ЗАААСССОА(ЗААСАТСАТ 10 50 - - - -
(Гоэ) 1 24 13 - - -
А2Т 0, ,35 97 95 97 98 99
без препарата - 0 0 0 0 0
В таблице приведены средние данные 3-6 экспериментов ОТ - обратная транскриптаза, АГ - вирусный антиген
Таблица 10
Эффективность анти-ВИЧ действия антисмысловых олигонуклеотидов
Ингибитор Юэо. С®50, 1Б
мкМ мкМ
реСАТСААССАеСТССАОЗСХ 0,5 >50 >100
(РМ-20)
рСвТАЗПССТСеАЗСТССет 0,1 >50 >500
дар-20)
рТООССТАСТСАССАеТСаСШЗ 4,7 >50 >10,6
(ДОС-22)
рТТТТТТТТТТТТТТТТ 8,0 >50 >6,3
(ПА-16)
Агт 0,0025 3,5 1400
Дополнительно была изучена возможность увеличения ингибиру-ющей активности исследованных нами олигонуклеотидов путем введения в 5'-положение молекулы химических модификаций, облегчающих попадание олигонуклеотидов в клетку. Нашими коллегами из Института биоорганической химии были синтезированы производные олигонуклеотидов. несущие на 5'- конце алифатические остатка различной длины, либо остаток холестерина. Алифатические остатки длиной 18, 16 и 15 атомов углерода присоединяли к 5*-концу олигонуклеотидов через фосфамидную связь либо напрямую, либо используя в качестве спейсерз ешвоуксусвую кислоту и пропилендиашн. Остаток холестерина присоединяли, используя в качестве спейсера аыиноуксусную кислоту. Полученные соединения были охарактеризованы с помощью обращеннофазовой хроматографий и электрофореза в полиакриламидном геле.
Как и ожидалось, присоединение гидрофобных остатков существенно увеличивает связывание олигонуклеотидов с клетками. Полученные экспериментальные данные по ингибированко размножения ЕИЧ-1 в культуре клеток (табл.11) показывают высокую противовирусную активность таких производных олигонуклеотидов, значительно превышающую эффект немодифицирозанных олигонуклеотидов. Следует отметить, что абсолютные значения ингибирования размножения вируса могут отличаться в разных сериях экспериментов, что может
быть связало с нуклеазной активность сыворотки и/или неконтролируемыми изменениями в состоянии клеток. Однако внутри одной серии экспериментов отклонение выбранных параметров от средних не превышает 5 - 102. Представленные в табл. 11 значения представляют собой среднее из трех повторов в одной серии-экспериментов. В качестве параметров, по . которым следили за ингибированием размножения вируса, мы выбрали 1) увеличение жизнеспособности клеток (так, если для незараженных клеток жизнеспособность составила 90"± 52, а для зараженных - 35-± 32, то увеличение жизнеспособности клеток измеряли как ®
х-35
у - х 100
90-35 '
где х - жизнеспособность клеток при данной концентрации производного олигонуклеотида; 2) подавление активности обратной травскриптазы; 3) уменьшение суммарного вирусного антигена; уменьшение антигена р24. Как видно из таблицы 11, результаты этих измерений для производных олигонуклеотидов достаточно хорошо согласуются между собой.
^модифицированные олигонуклеотиды оказывают влияние главным образом на активность обратной транскриптазы, причем это действие примерно одинаково для контрольного и опытных олигонуклеотидов. В то же время подавление суммарного антигена и антигена р24 составляет лишь 5 - 30%, а небольшое увеличение жизнеспособности происходит лишь в случае олигонуклеотида МР-20. Немоди-фицированный олигонуклеотид длиной 10 (ИЕУ-Ю) практически не влияет на все четыре показателя (табл.11).
Противовирусная активность производных контрольного олигонуклеотида значительно ниже, чем у немодифицированного (табл.11). Во всех остальных случаях противовирусная активность производных антисмысловых олигонуклеотидов коррелирует с их способностью связываться с клетками. Крайний случай этой закономерности проявляется на примере олигонуклеотида ИЕУ-Ю - противовирусную активность проявляют только холестериновые производные этого короткого олигонуклеотида и лишь при концентрации 2,5 - 5 мкМ. Наилучшей противовирусной активностью, так же как и в случае ^модифицированных олигонуклеотидов, обладают производные олигонуклеотидов РМ-20 и МР-20.
Ингибирование репродукции ВИЧ-1 производными олигонуклеотидов в культуре клеток МТ-4
Таблица II
Олиго- Кон-нук- цент лео- раци тиды (мкМ Модификация
и немодифи- 1 ) цированный) А Б В Г
П1| П2| ПЗ) П4 ГП| П2| ПЗ) П4 ПГ) П2| ПЗ) П4 1Щ П2) ПЗ) П4 1Щ П2| ПЗ) П4
МР-20 5 2.5 0.5 34 62 31 29 6 41 15 16 32 43 34 21 0 95 87 8& 12 53 24 31 0 41 7 15 0 29 28 21 12 32 24 12 19 33 0 4 89 82 70 74 14 41 17 25 0 23 0 13 62 91 87 86 90 91 89 88 16 46 0 33
РМ-20' 5 • 2.5 аз 0 47 23 19 0 52 13 13 , 0 57 29 9 0 70 50 59 . 0 43 0 12 0 27 0 5 0 44 21 13 0 36 20 5 0 30 13 3 51 59 29 45 12 68 0 27 0 23 0 а 0 93 86 88 68 90 88 87 76 63 43 57
16т 5 ' 2.5. «» а 5 0 3 24 41 0 59 7 23 0 52 0 II ■ • V ■" 29 28 7 9 I? 30 15 6 0. >9 15 2 48 34 7 II 13 39 27 2 22 5 17 С 70 60 21 36 39 33 0 0 38 13 0 0 81 88 86 81 63 86 79 77 0 17 15 0
Г05 5 2.5 ^ а5 0 94 73 67 0 50 23 16 0 19 0 5 0 58 6 0 28 0 — ООО — 0 15 0 1а 0 18 0 1С 0 II — 3 0 Г7-- 0 25 -- 0 21-- 0 27 24 8 0 13 12 2 0 13 16 0
КЕУ—10 5 2.5 а5 0 23 0 6 0 17 — 5 0 7 0 2 56 62 34 ЗС 0 28 19 II 0 0 0 С 0 81 0 8 0 I? 0 С 0 9 0 — 62 85 66 67 0 36 0 6 ОПОС 28 91 85 79 59 90 83 79 0 7 0 С
ГОНИ - параметры, по которым оценивалась противовирусная активность
Г из водных олигонуклеотидов (Ш - увеличение жизнеспособности клеток; - подавление активности обратной транскриптазы; ПЗ - уменьшение суммарного вирусного антигена; П4 - уменьшение антигена р24]. Использовались производные следующих олигонуклеотидов: МР-20 рТЕССТеЕАЕСТБСТТСЛТБС; РЫ-20 - рвСАТСААССАССТССАЕвСА; Г05 рТТ&АААССССАСААСАТСАТ; 1!ЕУ-10 - рСТССССТТСТ.
-НН-(СНг)1?СЬа а
-НН-СН2-С-0-(СН2)15СЬа
а
-КН-{СНа) -НН-С-(СН2) СН3 а 1»
1 •
а II
-ИН-СНя-С
I ГГ)
л
НдС СЬ0
Как следует из табл.11, наибольшее противовирусное действие оказывают производные холестерина. Эти данные соответствуют исследованиям Letsinger et al.(1989) по увеличению противовирусной . активности холестериновых производных антисмысловых олигонуклеотидов, однако в этих работах использовались другие способы пришивки остатка холестерина к олигонуклеотиду. Увеличение анти-ВИЧ активности также происходило при пришивке остатка холестерина к фосфоротиатноыу аналогу гомоолигонуклеотида dCIO Stein et al. (1991). В настоящей работе противовирусный эффект производных контрольного олигонуклеотида F0S-20 минимален (табл.11), что расходится с данными об увеличении сиквенс-неспецифического действия фосфоротиатных производных олигонуклеотидов (Stein et al.,1991).
Результаты проведенной работы по изучению анти-ВИЧ эффекта гидрофобных производных олигонуклеотидов показали высокую избирательность выбранных препаратов. Отсутствие токсического эффекта и низкие концентрации, при которых работают холестериновые производные позволяет отнести эти препараты к переспективным анти-ВИЧ соединениям.
4.2. Использование пептидов-фрагментов белков ВИЧ в качестве ингибиторов репродукции вируса.
Высокая вариабельность оболочечных белков вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) служит основным препятствием для создания вакцинных препаратов при заболевании, вызываемом этим вирусом (Folks et al., 1987). Одним из перспективных направлений, позволяющим найти подходы к созданию средств лечения и профилактики СПИД, является определение консервативных областей белков ВИЧ, ответственных за взаимодействие с клеточными рецепторами с последующим синтезом пептидов и проверкой их противовирусного эффекта.
При поражении ВИЧ клеток иммунной системы важным этапом служит взаимодействие вируса с Т4-рецептором (McDougal et al., — 1Э86). Следует отметить, что в неинфицированных клетках Т4-ре-дептор взаимодействует с антигеном гистосовместимости (HLA) 11 класса, что обеспечивает правильную функцию Т-клеточного иммунного ответа. Т4-рецептор и антиген HLA имеют сходство в строении и принадлежат к суперсемейству иммувоглобулинподобных белков (Trannecker et al., 1989). С помощью сравнения первичных струк-
тур иммуноглобулинподобных доменов с одной стороны и белков БИЧ с другой, в белках вируса были локализованы области, схожие с HLA 11 класса (в СООНконцевой части gpl20) и области, схожие с Т4-рецептором - в NH2 -концевом районе gp41, а также в белках gag и vpu.
Исходя из этого, в белках вируса были выбраны пептиды-аналоги Т4-рецептора и HLA 11 класса.
g90 (547-559 env) - SSIVQQQNNLLRA; g92 (557-573 env) -RAIEAQQHLLQLT VWG; g93 (43-53 vpu) - DRLIERAEDSG; g94 (92-107 gag) - IEIKDTKEALDKI EEE; g96 (419-430 env) - CRIKQ1INMWQE; g97 (426-439 env) - NMWQEVGKAMYAPP; g98 (68-81 vpu) - VEMGHAPWDVDDL.
Предполагалось провести изучение противовирусной активности выбранных пептидов и сравнить их эффект с анти-ВИЧ действием пептида "Т", ингибирующим репродукцию ВИЧ (Pert et al.,1986).
Выбранные пептиды были синтезированы в Институте биоорганической химии им. Шемякина РАН твердофазным методом на автоматическом синтезаторе Beckman 990М с использованием НОВТ-эфиров Вос-аминокислот на РАМ-полимере. Полученные пептиды охарактеризованы данными аминокислотного анализа, масспектра и аналитической ВЭЖХ.
Проверку противовирусного эффекта синтезированных пептидовп-роводили на первично-инфицированной ВИЧ-1 клеточной линии МТ-4 с определением активности обратной транскриптаэы, количества инфицированных клеток методом непрямой иммунофлюоресценции и накопления вирусных белков иммуноферментным методом.
На первом этапе была подобрана оптимальная инфицирующая доза вируса. Была выбрана множественность заражения около 0,1 ИД50 на, клетку, при этом на 5-7 сутки после инфицирования определялась активность вирусной обратной транскриптазы и накопление вирусс-пецифических белков.
Изучение противовирусной активности синтезированных пептидов проводили при однократном добавлении пептидов в культуральную среду в концентрации 1000 нМ. Концентрация пептидов была выбрана на основании предварительных экспериментов, показавших отсутствие токсического эффекта пептидов в указанной концентрации. Остальные пептиды также были не токсичны в концентраций 1000 нМ, как в культуре клеток Н9, так-и МТ-4. Схема постановки эксперимента включала проведение предварительной инкубации в течение 30 мин пептидов сг клетками в среде РРМ1-1640 без добавления сыво-
ротки с последующим инфицированием. Культивирование вараженных клеток проводили на среде PPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки и 0,062 глютамина.
На таблице 12 приведены результаты проведенных экспериментов. При сравнении различных методов оценки синтеза вирусных белков, следует отметить, что иммуноферментным методом определяется суммарное количество вирусных белков синтезированных за все время наблюдения (включая вирусные белки в культуралъной среде), а при использовании иммунофлюоресцентного метода тестируется количество вируспродуцирующих клеток в конкретные сроки наблюдения (на V день). Наибольшим ингибирующим эффектом обладают пептиды g97 и g98. Они вызывают как снижение активности обратной транскрипта-зы, так и ингибируют синтез вирусных белков. Противовирусный эффект пептидов g97 и g98 выражен сильнее, чем эффект пептида "Т" и его аналога. Среди других исследованных пептидов следует выделить g92 и g94, которые ингибируют репродукцию ВИЧ на уровне пептида "Т". Ингибирующий эффект остальных препаратов выражен значительно слабее.
Обладающий наибольшей противовирусной активностью пептид g97 имеет частичную гомологию со 2 (константным) доменом -субъединицы HLA 11 класса. Он локализован в области вирусного белка gpl20, которая, как показано в экспериментах о использованием моноклональных антител, ответственна за связывание этого вирусного белка с Т4-рецептором (Lasky et al.,1987). Таким образом, противовирусный эффект пептида g97 связан, вероятно, с взаимодействием его с Т4-рецептором и блокированием участка связывания для ВИЧ. В работе Sun et al. (1989) подтверждено, что этод пептид соответствует сайту связывания gpl20 о Т4-рецептором. Пептид, испольэованный в этой работе, отличается от g97 только на три аминокислотных остатка, на СООН-конце отсутствует пролин, а на NH2 -конце имеются два изолейцина.
Пептид g98, также вызывающий значительное подавление размножения вируса, имеет ограниченную гомологию с NH2 -концом молекулы Т4-рецептора. Учитывая данные работы Jameson et al. (1988), показавших с использованием пептидов - фрагментов . Т4-рецептора, что область взаимодействия с gpl20 ВИЧ локализована в NH2 -концевом домене Т4-рецептора, можно предположить, что этот пептид конкурирует за взаимодействие gpl20 с Т4-рецептором к за счет этого обладает противовирусной активностью. Данный пептид лока-
лизован в вирусном белке vpu, который, как предполагает Cohen et al. (1988), может определять вирулентность ВИЧ.
Обладающие менее выраженным противовирусным эффектом пептиды g92 и g94, схожи с 4 доменом СООН-концевой области Т4-рецептор.а и локализованны в белках env (gp41) и gag, соответственно.
Таблица 12
Влияние синтетических пептидов на репродукцию БИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 (163 часов после инфицирования).
Название пептидов
% подавления синте8а вирусных белков
% ингибирова-ния активности обратной транс-криптазы
Количеств клеток, н сущих ант ген ВИЧ (
g90 6,7 ± 5,0 26,5 ± 19,4 9,5 ± 1,8
g92 16,9 ± 1,0 61,0 ± 1,3 4,8 ± 0,5
g93 17,4 ± 6,5 49,5 ± 11,9 9,5 ± 1,8
g94 20,3 ± 1,9 51,0 ± 11,5 4,8 ± 0,3
g96 9,3 ± 2,4 34,5 ± 11,2 15,0 ± 0,9
g97 24,6 + 13,9 65,0 ± 8,3 1,2 ± 2,6
g98 18,8 ± 8,9 66,0 ± 7,0 1,1 ± 2,0
пептид "т" 24,0 ± 5,0 48,0 i 31,0 4,9 ± 0,5
Ш2-Ю-А1а-пептид "T" 19,8 + 5,1 50,5 ± 40,8 4,9 ± 0.6
Клетки, инфицированные ВИЧ, без пептида Неинфицированные клетки
15,7 ± 0,9 О
Представленные результаты показывают перспективность использованного подхода для поиска пептидных структур, ингибирующих , репродукцию ВИЧ. Следует подчеркнуть, что участок, отвечающий за . взаимодействия Т4-рецептора с антигеном HLA 11 класса локализован также в Nife -конце белка Т4-рецептора (Jameson et al.,1988), и болеазтого, моноклональные антитела к Т4-антигену, блокирующие связывание ВИЧ с Т4-рецептором, нарушают взаимодействие Т4-ре-цептора с антигеном HLA 11 класса (Coulie et al.,1985). Эти данные показывают, что при использовании растворимого Т4-рецептора для терапии СПИД существуют значительные трудности, так как введение Т4-рецептор^ в организм может вызвать блокирование взаимо-
действия Т-хелперов с антигенпредставляющими клетками и вследствие этого будет блокирован антигензависимый иммунный ответ. Использование пептидов для терапии СПИД представляется более перспективным, поскольку в этом случае "мишень" може? быть четко локализована.
4.3. Изучение анти-БИЧ активности 5'-фосфонатов азидотими-
дина и фтортимидина Среди множества классов соединений, обладающих анти-ВИЧ активностью, выделяются аналоги нуклеозидов, избирательно ингиби-рукдае обратную транскриптазу вируса - 3'-азидо-2',3'-дидезокси-тимидин (AZT), 2',3'- дидезоксицитидин (DDC), 2',3'-дидезоксии-нозин (DDI) (Mitsuya et al.,1985,1986; Baba et al.,1987; Herdewijn et al.,1988). Эти соединения в настоящее время официально разрешены к применению для лечения больных СПИД.
Нами было проведено изучение противовирусной активности 5'-фосфонатов 3'-азидо-2',3'- дидезокситимидина (AZT) и 3'-фтор-2',3'- дидезокситимидина (FLT) (Рис.8) - перспективных ингибиторов размножения ВИЧ - в культуре клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-1. Синтез соединений проведен в Институте молекулярной биологии им.Энгельгарда РАН.
, Отличительной особенностью . исследуемых соединений первой группы является то, что они менее токсичны для неинфицированных клеток, чем AZT. Результаты, представленные в табл. 13, показывают, что 5'-метилфосфонат AZT (I), 5'-карбоксифосфонат AZT (11) и 5'-фосфит AZT (III) с высокой эффективностью подавляют размножение ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4. Индексы селективности, определенные по накоплению в культуральной жидкости вирусного антигена и активности обратной транскриптазы для соединений 1-111 сравнимы с индексами селективности для AZT (табл.13). Эта группа препаратов обеспечивает также эффективную защиту инфицированных клеток от цитопатогенного действия вируса. Все исследованные соединения в концентрациях выше 0,3 мкМ обеспечивают сохранение более 50% жизнеспособных клеток, тогда как AZT в этих концентрациях токсичен для инфицированных клеток.
Изучение второй группы соединений - 5'-фосфонатов FLT - соединения IV и V по сравнению с FLT показало, что они также менее токсичны для неинфицированных клеток, чем исходный FLT (табл.13).
Однако, эти соединения менее эффективно подавляют репродукцию вируса, чем А2Т (табл.13). Следует отметить,'что ПТ по токсичности токсичности для клеток сравним с Агт, но значительно эффективнее защищает инфицированные клетки от цитопатогенного действия вируса. В целом, 5'-фосфонаты РЬТ менее эффективно подавляют размножение ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4 и оказывают менее выраженное защитное действие на инфицированные клетки, чем не только ПЛ1, но и А2Т.
Таким образом, предположение о перспективности применения 5'-фосфонатов МТ в качестве ингибиторов ВИЧ-инфекции подтверждается полученными результатами: 5'-фосфонаты кЪ1 с достаточно высокой эффективностью подавляют размножение ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4. Полученные нами данные о том, что указанные соеди-
Таблица 13
Противовирусное действие соединений на клетки МТ-4, инфицированные ВИЧ-1
Соеди- С05о.
Ю50. мкМ
нение мкМ по
вирусному антигену
по активности обратной транс-криптазы
1Б
по по активно-
вирусному сти обрат-антигену ной транс-криптазы
1 >145 0,093±0,029 н/д >1559 Н/Д
II 161 0,016±0,009 н/д 10053 Н/Д
III >174 0,12±0,03 0,054±0,015 >1450 >3222
IV 123 0,13±0,05 0,092±0,009 946 1337
V 160 0,15±0,04 0,13+0,03 1067 1231
пт 89 0,0029±0,0007 0,0084±0,0012 30690 10595
ш 84 0,013±0,005 0,012±0,002 6462 7000
нения менее токсичны для неинфицированных клеток, чем согласуются с полученными ранее экспериментальными данными (Тарусо-ва с соавт.,1987; Бибилашвили с соавт.,1988; Карамов с со-авт.,1990). Более того, данные по изучению цитотоксичности фос-фонатов Риг показывают, что в этом случае введение фосфонатной
II
на-р-о-1 сна
Р
На
II
НС-Р-0-|
надс
ТЬу
II
I)
н-р-1
I
си
1Ьу ¥
III
ТНу
IV
ия
Рис. 8. Структурные формулы наследованных 5' фосфонатов и РЦТ.
Рис. 9. Влияние дгт и его производных на накопление р24 ан-тигенга в первичной культуре моноцитов периферической крови человека, инфицированного ВИЧ-1. I- без внесения препарата, 2 - А2Т, 3 - Р1.т, 4 - препарат I. По оси абсцисс - концентрация соединений (мкМ), по оси ординат - количество антигена р24 (мкг/мл).
группировки в 5' положение«приводит к достоверному снижению токсичности всех исследованных производных FLT, как и для фосфона-тов AZT. Это позволяет предположить универсальность используемого подхода для получения модифицированных производных нуклеози-дов со сниженной цитотоксичностью.
Среди исследованных фосфонатов А2Т наиболее перспективным по исследованным параметрам является 5'-карбоксифосфонат AZT (11) - его индекс селективности (IS) составил 10063 (табл.13). Это показывает необходимость дальнейшего поиска наиболее активных ингибиторов репродукции ВИЧ в исследуемой группе соединений.
При сравнении биологических активностей аналогичных фосфонатов FLT - (IV) и AZT - (III) наблюдается достоверное различие в эффекте таких модификаций на цитотоксичность и анти-ВИЧ активность. Так, цитотоксичность 5'-фосфита AZT (111) в 2 раза ниже, чем AZT и практически такое же снижение цитотоксичности наблюдается для 5'-фосфита FLT (IV). Тем не менее, при исследовании анти-ВИЧ активности 5'-фосфита FLT обнаружено резкое уменьшение противовирусной активности препарата - в 45 раз при оценке IDso по вирусному антигену и в 32 раза по значению индекса селективности по сравнению с FLT, в отличие от снижения ID50 в случае 5'-фосфита AZT - в 9, а индекса селективности - в 4,5 раза по сравнению с AZT (см. табл.13). Это может свидетельствовать о суммарном влиянии модифицирующих группировок на анти-ВИЧ активность производных исследованных нуклеозидов.
Следует отметить, что исследованные фосфонаты AZT более эффективно (по сравнению с AZT) защищают инфицированные клетки от цитопатогенного действия вируса (табл.13). AZT в концентрациях, обеспечивающих полное подавление накопления вирусного антигена и активности обратной транскриптазы не предохраняет инфицированные ВИЧ-1 клетки от гибели. Этот- эффект может быть объяснен возможным включением трифосфата AZT в синтетические процессы с клеточными невируеными РНК, катализируемые обратной транскриптазой, присутствующей в ВИЧ-инфицированных клетках (Linial et al.,1987; Dorngurg and Temin,1988). Хотя внутриклеточный метаболизм 5'-фосфонатов не исследован, высказано предположение, что после проникновения в клетку эти соединения могут окисляться в соответствующие монофосфаты или превращаться при катализе нуклеотид-киназами в 5*-(з.г-дифосфорил)-«- фосфонаты AZT, которые ингиби-руют синтез провирусной ДНК, катализируемый обратной транскрип-
тазой ВИЧ ( Дяткина с соавт., 1992). При этом реальная концентрация 5' -(£,* -дифосфорил)-А-фосфонатов AZT в клетке существенно ниже, чем трифосфата AZT, поскольку они менее стабильны (быстрее гидролизуются в водной среде) и это может бьггь одной из причин их меньшей токсичности для ВИЧ-инфицированных клеток. Обсуждая эти результаты следует отметить, что неясно, какой из вариантов анти-ВИЧ эффекта предпочтительнее: обеспечивающий гибель инфицированной клетки или полное ингибирование репродукции ВИЧ при сохранении жизнеспособности клеток (с возможным сохранением про-вирусной ДНК, интегрированной в клеточный геном).
На втором этапе работы была изучена анти-ВИЧ активность AZT, FLT, 5*-метилфосфоната AZT (I) в первичной культуре моноцитов периферической крови здорового донора, инфицированной ВИЧ-I штамм ГКВ 4005.
Результаты, представленные на рис. 9, показывают, что в первичной культуре нестимулированных моноцитов периферической крови исследуемые соединения не обладают выраженным ингибирующим действием. Соединение I в большей степени, чем AZT и FIT ингибирует репродукцию ВЙЧ-1, но' не достигается даже 50% подавления.
Литературные данные об ингибируюцей активности AZT на различных моделях ВИЧ-инфицированных моноцитов/макрофагов достаточно противоречивы. Так, в работе Rlchman et al. (1987) показано, что AZT не блокирует репродукцию ВИЧ, в то время как в сообщении Perno et al. (1988) представлены убедительные данные о наличии четкого ингибирующего эффекта AzT. Кроме того, недавно было показано, что ингибирующий эффект AZT различен в культурах моноцитов разного происхождения (Beenhouwer et al.,1992). На наш взляд, различия в этих результатах могут бьггь связаны с особенностями используемых для тестирования анти-ВИЧ активности клеточных культур. При использовании хронически инфицированных клеток или нестимулированных моноцитов (в которых, по-видимому, инфекция также проходит по хроническому типу) ингибирующий эффект AzT слабо выражен или не проявляется. В культурах моноцитов, где инфекция протекает по логическому типу (как правило после стимуляции цитокинами или антигеном) авторами определяется выраженный ингибирующий эффект AzT. Полученные нами результаты об отсутствии выраженного ингибирующего эффекта AzT и фосфитов на первичной культуре нестимулированных моноцитов человека достаточно хо-
- 63 -
рошо согласуются с этим предположением.
Было исследовано также противовирусное действие azt, fit и 5' -метилфосфоната azt в культурах хронически инфицированных клеток линий сеи/hiv-I/bru и h-9/hi v-1/rf. Ингибируицее действие препаратов оценивали по снижению уровня р24 антигена в культу-ральной жидкости через 4 суток инкубации с указанными соединениями по сравнению с необработанными культурами. Показано, что исследованные соединения не обладают выраженным ингибирупцим действием ни в культуре клеток H-9/HI V-1/rf, ни в культуре клеток ceh/hiv-1/bru. Полученные наш результаты не противоречат результатам других исследователей (Crowe et al.,I989). Эти исследователи считают, что относительная неэффективность в хронически инфицированных линиях клеток таких ингибиторов обратной транскриптазы как azt и фоскарнет связана с тем, что в этих клетках имеются большие концентрации вирусной кДНК, а процессы обратной транскрипции на минимальном уровне. Таким образом, приведенные в этом разделе данные демонстрируют необходимость изучения анти-БИЧ активности исследуемых соединений не только на модели первичноинфицироваиных Т-клеточных линий, обеспечивающих развитие продуктивной ВИЧ-инфекции, но и обязательного применения линий клеток, моделирующих хроническую ВИЧ-инфекцию.
5. Изучение анти-ВИЧ активности ранее известных препаратов, обладающих противовирусным эффектом.
Среди многочисленных групп химических соединений, исследуемых в качестве, - потенциальных ингибиторов:ВИЧ-инфекции, особое внимание привлекают- лекарственные препараты, разрешенные для клинического применения для терапии других заболеваний (в т. ч. вирусных). Время внедрения таких лекарственных препаратов для клинического использования при ВИЧ-инфекции, может быть самым коротким, поскольку в этом; случае не требуется проведения многочисленных доклиничасййх испытаний соединений. Это послужило основой для поиска соединений с анти-ВИЧ активностью среди препаратов, обладающих противовирусной активностью (в отношении других вирусов) и прошедших стадию доклинических исследований. Всего нами было исследовано более 10 групп различных химических соединений и наибольшую ,анти-ВИЧ активность среди них показали препараты глицирр.изиновой кислоты (ГК) и «сложных афиров изобор-неола.
5.1. . Исследование анти-ВИЧ активности глицирризиновой кислота к ее производных.
Одним из препаратов, достаточно широко используемьс: в практической медицине для терапии ряда заболеваний, является ГК -соединение, присутствующее в водном экстракте корня солодки (GlусуггЫza radtx). Было установлено, что ГКэффективно ингиби-рует репродукцию ВИЧ в культуре клеток (ito etal., 1987). Применение инекцианной лекарственной формы на основе-ГК в высоких дозах (80Ci-I600 мг/день) больным СПИДом вызывает у них увеличение содержания Т4 лимфоцитов и снижение количества вирусного антигена. v
Установлено, что ГК непосредственна! блокирует связывание ВИЧ с клвТ1СО;й-мишеяыО' (.Ito et al., 1988),. тем не менее, механизм антивирусного.действия ГК до настоящего времени остается невыясненным. Предполагается, что одним из факторов может служить блокирование ГК протеинкиназы (Ito et al., 1988), фосфорилирование которой молекулы Т4 рецептора необходимо, для связывания вируса с Т4 рецептором (Fields eUal., 1988).
В нашей странв/среди лекарственных, соединений, производимых из корня; солодки ,и разрешенных для клинического применения, наше внимание привлек- глицирам, который-представляет собой моноаммо- ,-, нийную сольчГТО Результаты тестирования анти-ВИЧ активности гли- '
цирама приведены на рис. 10. Представленные данные показывают, что, что глицирам в в концентрациях, превышающих^ ТОО мкг/мл, обеспечивает выживание клеток МТ-4. Следует /отметить, что при этих же концентрациях наблюдается практически-потов .подавление синтеза вирусных белков. Дополнительно была исследована анти-ВИЧ активность глицирама с использованием различных штаммов ВИЧ-I и БИЧ-2. Препарат -применяли в концентрациях 500 - 1000 мкг/мл. Представленные в таблице 14 результаты демонстрируют выраженный ингибиругаций эффект тлицирама на репродукцию исследованных штаммов ВИЧ в культуре клеток МТ-4.
Таблица 14
Ингибирование репродукции разных штаммов ВИЧ , в культуре клеток МТ-4 •
Наименование - •Кон-.:л. ГКВ 4005 ГКВ 4046 ■ ВИЧ-2/гос)
препарата цент-"*-------------—- *------
.фация.-.Л(Ьл-во Инги- Кол-во Шги-'..-Кол-во Инги-
препа--живых биро- живых биро- живых биро-
рата- клеток вание клеток •вание клеток вание
мкг/мл нако- % нако- % нако-
- - ■ .. .. .,-4.- пления пления пления
--■= ; вирус- вирус- вирус-
ного ного ного
АГ, % АГ,. % АГ, %
"1нн4-соль-ГК 1000 . 61,9 95,9 65,9 94,-3 - -75,1 -79,7
_ и _ 500 S6,7 95,3 67,8 94,0 88, 9 -- 42,5
Контроль (ин-
фицированные -
клетки) - 50,0 0 42,8 0 19,1 0
Контроль (не-
инфицированные * ' -
клетки) - 81,5 - 81,5 '—'—"П. 501, --
В таблице приведены-средние данные 3-6 экспериданов-.
Значительный интерес - представляло исследовать 'анти^ШЧ -ак-:
— тивность различных производных ГК и попытаться.зыяснйть возможность создания нр ее основе более активных ингибиторов^, ре продук-
- ции ВИЧ.-"
I
I
Рис. 10 - Анти-ВИЧ активность глицирама. I - неинфицированные клетки МТ-4; 2 - содержание вирусного антигена; 3 - инфицированные ВИЧ-1 клетки МТ-4. По оси абсцисс - концентрация (мкг/мл); по оси ординат (слева) - жизнеспособность клеток (% от контроля); по оси ординат (справа) - уровень вирусного антигена {% от контроля^.
Рис. II. Анти-ВИЧ активность различных солей ГК в хронически инфицированной ВИЧ-1 культуре клеток ГКВ-4005.
I - контроль клеток без препарата, 2 - Агт (Юыкг/мл), 3 -ГК^(1мг/мл). 4 - 1на-соль-ГК (I мг/мл), 5 - 1На-соль-ГК (0,56 Омг/мл), 6 - 1к-21 \-соль-ПС (I мг/мл), 7 -1К-2|_ 1 -соль-ГК (0,5 мг/мл); а - жизнеспособные клетки, б -активность обратной транскриптазы. По оси абсцисс - препараты в различных концентрациях, по оси ординат справа - активность обратной транскриптазы (%6 Оот контроля), слева количество жизнеспособных клеток (млн/мл).
Таблица 15
Подавление продукции ВИЧ-1 в культуре клеток 1ТГ-4 и цитотоксический эффект ПС и ее производных
Наименование ID5Q мкМ CD50, IS
препарата
■О по активности по вирусному нкМ
обратной транс- антигену
• криптазы ВИЧ
ПС 170 231 756 4,45
1К-211-соль-ПС 178 103 >П93 >6,70
1ин4-соль-ГК 48 <48 2542 53,0
ГК-к. -гистидин 66 - 380 5,8
ПС+6-аминоурацил 35 - 1000 28,6
ПС+5-амин§урацил 55 - 2150 39,1
ниглизин 26 - 1479 56,9
ПС + А$р(0Не)2 133 - 422 3,2
АТК 10 - 118 0 то
дгт 0.0025 0,001 3,5 140010
Нашими коллегами в Институте органической химии, г. Уфа, были получены различные производите ПС. На первом этапе была исследована анти-ШЧ активность различных солей ПС. В таблице 15 приведены результаты экспериментов по определению химиотерапев-тического индекса для проверенных соединений. Кромз того, гс-пользовали для сравнения Агт, механизм действия которого связан с ингибированием вирусной обратной травскриптазы и терминированием синтеза вирусной ДНК и ауринтрикарбоновуп кислоту (АТК). анти-ВИЧ эффект которой связывается с блокированием взаимодействия С04 рецептора с вирусным др120 (Ва1гаг1п1 ег а1.,1989). Как видно из таблицы 15, индекс селективности различен для разных солей ПС Установлено, что ПС и ее производи« эффективно инги-бирусг репродукцию ВИЧ-1, причем значение I $ для глициракз превышает 50, что указывает на перспективность использования этого препарата для лечения ВИЧ-инфекции. Дополнительно был исследован ингибирупцяй эффект различных солей ПС на предложенной няни модели хронически - инфицированных ШЧ-1 клеток моноцитов человека (ПСВ-4005). Представленные на рис. П данные демзвстрирувт, что
при использовании этой модели противовирусное действие некоторых производных ГК превышает эффект дгт - Nа-соль ГК ингибирует репродукцию ВИЧ-1 более чем на 80%, в то время^как эффект А2Т не" превышает 50% даже в максимально высокой концентрации 35 мкм. Таким образом, в отличие от А2Т, препараты ГК в значительной степени эффективно подавляют репродукцию БИЧ как в культурах Т-хелперов, так и в моноцитарных клетках.
Установив, что разные соли ГК имеют различную эффективность ингибирования репродукции ВИЧ в клетках МГ-4, а сама га не эффективна как ингибитор репликацииЧЗИЧ при хронической инфекции, было проведено исследование анти-ВИЧ активности других производных ГК, полученных путем химических модификаций ПС К ним относятся ранее не описанные в литературе амиды и гликопептиды ПС Результаты ислледования этих препаратов приведены в таблице<_15.
Как показали проведенные наш эксперименты, все исследованные производные ГК обладают анти-ВИЧ активностью Среди исследованных соединений наиболее активным оказался ниглизин (пен-та-О-никотинат-глицирризиновой кислоты) - препарат, разработанный в институте органической химии г. Уфа в качестве противовоспалительного средства. Ниглизин эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-1 и ВИЧ-2 в культуре клеток МТ-4 и более эффективен по сравнению с дгт в культуре хронически инфицированных клеток (табл.16). Среди изученных производных ГК он имеет самый высокий индекс селективности -56, 88.
Для определения возможного механизма действия .препаратов на основе ГК было проведено изучение ингибирукщего^эффекта гли-цирама в сравнении с А2Т и АТК в зависимости от времени добавления препарата к инфицированным клеткам. Препараты добавляли к ВИЧ-инфицированным клеткам в двух вариантах: а) на стадии адсорбции с последующим удалением; б) без удаления через час после добавления вируса. Для АТК Ю50 практически не меняется при этих схемах добавления препарата (6, 2 и 10 ыкМ, соответствию), что подтверждает данные Ва1 гаМ п> е1 а1.(1989) о блокировании этим препаратом этапа связывания вируса с клеткой.
В случае дгт различия в Iо50достигают 2 порядков -0,35 и О, 0025 мкМ. Вероятно, ингибирующий эффект Агт при добавлении его на стадии адсорбции и последующей отмывке клеток обусловлен проникновением за это время препарата в клетки или остаточными количествами, неудалаиными при отмывке клеток.
Значения ЮбОдля глицирама в этих экспериментах составляют
. - 69 -
соответственно 300, 0 и 48, 0 мкМ. Это позволяет предположить, что механизм действия глицирама отличается от АТК и связан не только с блокированием связывания ВИЧ с клетками-мишенями, но и обусловлен другими механизмами. Это косвенно подтверждается данными
Таблица 16
Анти-ВИЧ активность ниглизина
Наимено- Кон- U-937 МТ-4 МТ-4
вание цент- (ВИЧ-1/ЭВК) (ГКВ 4005) (ВИЧ-2/rod)
препа- рация ---------- ------------
рата препа- - Мигри- Ингибиро- Ингибиро- Ингибиро-
рата рова- вание на- вание на- вание на-
мкг/мл ние От, копления копления копления
% вирусного вирусного вирусного
АГ, % АГ, % АГ, %
Ниглизин 1000 66,4+3,2 60,1±4, 9 96, 6±0, 4 91, 8+1,1
•I 500 65, 9±1, 9 61, 8±6, 6 96, 7+0, 4 86, 8+8,1
« ГК 1000 н/э н/э 99, 3+2, 8 н/о
ti 500 н/э н/э 98,3+5,1 н/о
AZT 10 57, 4+2,1 55,7±0,4 96, 4+0, 9 80,1+3, 3
н/э -• нет эффекта н/о - не определяли
работа Ito et al. (1988), показавшими, что ГК непосредственно блокирует связывание вируса с клеткой в очень высокой концентрации - 1,2 мМ глицирризина при инкубации в течение I часа только на 25-30% снижают связывание вируса с клетками МТ-4, в то время как I ОбОсоставляет О, I - 0, 3 мМ. Необходимо также отметить, что ранее описано противовирусное действие. ГК в близких концентрациях (0, 5-2, 4 мМ, iD50- 0, 71мМ) в отношении представителя семейства герпесвирусов - вируса ветрянки-опоясывающего лишая (Baba, Shigeta, 1987). Ингибирукхций эффект ГК в этом случае авторы связывают с ранней стадией вирусной репликации - проникновением или
раздеванием вируса. Возможно, и в случае ВИЧ-инфекции механизм противовирусного действия связан с этими стадиями вирусной репродукции.
К перспективным производным ПС относятся ПС + 5-ами-ноурацил и ПС + 6-аминоурацил, которые в исследованных концентрациях предохраняют клетки от гибели вследствии инфекции. Таким образок наши эксперименты показали перспективность дальнейшего поиска эффективных ингибиторов репликации ВИЧ в группе производных ПС Полученные вами данные по влиянию химических модификаций на анти-ШЧ активность производных ПС могут послужить основанием для проведения синтеза новых производных ПС и создания на их основе препаратов для терапии ВИЧ-инфекции.
5.2. Изучение анти-ВИЧ активности сложных зфиров изоборнео-ла.
Среда других соединений, исследованных нами на наличие ан-ти-ШЧ активности, следует выделить мзмбраноактивный препарат -изооборниловни . эфир 2,9-дииетил-За, 4,9,9а -тетрагидрофу-ро[2,3-ъ]- хиноксалин- 3-карбоновой кислоты (энциклан, рис.12), обладатели противовирусной активностью в отношении вирусов гриппа, клещевого энцефалита. Этот препарат был синтезирован в Уральском Политехническом Институте, г. Екатеринбуг.
При исследовании анти-ВИЧ активности энциклана в стандарт-ног системе первично-инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4«было показано, что. этот препарат обладает выраженным ингибирухщим эффектом на репродукцию ШЧ. По-видимзму, анти-ВИЧ эффект энциклана вв связан с блокированием обратной транскриптазы, поскольку в экспериментах было установлено, что энциклан в концентрациях до 40 авЗД добавленный к очищенному препарату ВИЧ, не ингибирует активность обратной транскриптазы.
Следует отметить, что по сравнение с дгт или ПС, энциклан в иееыпвй степени обеспечивает защиту инфицированныг клеток от гибели в результате вярусной инфекции. Ю5СХ определенная исходя ш доза, обеспечивапвей 508 зашту инфицированных клеток, составляет 0,3 икЦ что почти в 20 раз больше, чем 1050, определенное до прдаллвнзш синтеза вирусных белков или активности обратной -гравскртптазы. На нал взгляд, ори клиническом применении-болев э5*£ектиЕндаи могут оказаться* именно такие препараты, обеспе-дциншвцие увичгохежие вируемдфицированных клеток.
¡Пос&омЬЕу звцвхлзн представляет собой соединение, состоящее
Анти-ВИЧ активность энцюслана и исходных компонентов для его синтеза
Таблица Г7
Исследуемэе соединение Ю50, мкн юэа мкн С050, юси 1Б
I И <> III IV а к 15,93 а 365 >65 1,6 2^68 33,58 >65 21,5 38,94 47,45 >130 134,4 2,4 то
С
Но«Ч ^СНв
СНв
I
СНв
I Знциклан
С**
I
Сйц
П Н ¡-Иэтнлхиноксапиний йоХид
л
НзС-О-СНз-С-О-*^ ¿„^
НвС^ ^СНв
III ИзоОорнюгавый эфир ацетоуксусной кислоты
IV Изоборнеод
Рис. 12. Структурные формулы исследованных химических соединений.
из гидрофобного остатка изоборнилового'эфира ацетоуксусной кислоты и гидрофильного (гетероциклического) остатка, были предприняты попытки определить анти-ВИЧ активность каждого из компонентов энциклана, а также изоборнеола, являющегося компонентом пихтового масла и служащего исходным сырьем для получения изоборнилового эфира ацетоуксусной кислоты ( Рис.12).
В таблице 17 приведены полученные результаты по определению количественных характеристик анти-ВИЧ активности этих соединений в культуре клеток МТ-4 (ингибирующий эффект определяли по снижению активности обратной транскриптазы в супернатанте инфицированных клеток). Установлено, что изоборниловый эфир ацетоуксусной кислоты обладает выраженным ингибируюцим эффектом на репродукцию ВИЧ, сравнимым с эффектом энциклана (ю50- 0,1 М, IБ -130). Следует подчеркнуть, что в отличие от этого, подавление размножения ВИЧ изоборнеолом не превышает 50% даже в концентрации 5 мкг/мл. Гидрофильный фрагмент энциклана также обладает незначительным анти-ВИЧ эффектом (15 -2,4). Таким образом, полученные данные позволяют сделать предположение о том, что активным началом энциклана служит изоборниловый эфир. Дополнительно были определены значения 1090- концентраций препаратов, вызывающих 90% ингибирующий эффект. При этом выявлены четкие различия между энцикланом и изоборниловым эфиром ацетоуксусной кислоты (Табл. 17). Следует отметить, что введение химических модификаций может определять проявление анти-ВИЧ активности ряда соединений - так, АТК относится к наиболее активным анти-ВИЧ препаратам (¡Б - 118, Ю50 - 10 мкМ), в то время как аурин не оказывает влияния на размножение ВИЧ (Ва1 гаН гп е! а 1., 1989).
Дополнительно была изучена анти-ВИЧ-2 активность энциклана. Было установлено, что энциклан эффективно ингибирует репродукцию ВИЧ-2 в культуре клетов МТ-4 в концентрациях, превышающих 0,5 мкг/мл. Определение количественных характеристик по уровню инги-бирования накопления вирусного'антигена показало, что. энциклан более, чем на порядок эффективнее в отношении ВИЧ-1 (1050=0,053 и 15=405,7) по сравнению с ВИЧ-2 (ю50=2, 09 и 15=10,29).
Таким образом, приведенные нами результаты показывают открытие принципиально нового класса химических соединений, обладающих выраженной анти-ВИЧ активностью и высокой селективностью -изоборниловые эфиры. Безусловно, крайне интересным представляется получение данных о механизме действия этих соединений, что может бьггь сделано при более детальном исследовании их эффекта
- 73 -
на конкретные стадии вирусной репродукции.
5. 3. Изучение анти-ВИЧ действия различных препаратов в комбинации с дгт.
Комбинационная терапия применяется при лечении различных инфекционных заболеваний. На наш взгляд, этот подход должен быть эффективен и при терапии ВИЧ-инфекции. Поскольку АП и его аналоги являются сегодня основой анти-ВИЧ терапии, существенной характеристикой препаратов с анти-ВИЧ активностью служит возможность их использования совместно с дгт. Учитывая это, мы провели оценку возможности совместного с лп использования наиболее перспективных из выявленных нами препаратов с анти-ВИЧ активностью.
Оценку проводили с использованием двух основных моделей -первично инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 и хронически инфицированных ВИЧ-1 моноцитов человека ГКВ-4005. Эксперименты, проведенные с использованием первично инфицированных ВИЧ-1 клеток МТ-4 показали, что глицирам не является антагонистом дгт (табл. 18). Схожие данные бьши получены при изучении ингибирующе-го действия комбинаций энциклана с дгт в инфицированных ВИЧ-1 клетках МТ-4 (табл. 18).
Таблица 18
Сочетанное действие препаратов на репродукцию ВИЧ-1 в хронически инфицированной культуре клеток
Препарат Концентрация препарата, Ингибирование
мкг/мл обратной
транскриптазы
вируса, %
AZT 10 52, 7+7, 7
ГК 1000 н/э
AZT+ГК 10+1000 89, 6+1, 4
Энциклан 20 12, 4±4, 2
AZT+энциклан 10+20 87, 3±0, 7
Дополнительно нами был определен комбинационный индекс (FIС) для смеси-AZT : глицирам согласно (Allen et al., 1989). Было выбрано соотношение препаратов I: IOOOO, исходя из концент-
раций препаратов, вызывающих 50% ингибируший эффект. Комбинационный индекс для такой смэси равен 1,55, что свидетельствует о независимости действия этих соединений.
ID50 вещества А в снеси Ю50 вещества Б в смеси
FI с =-+-
ID50 вещества А 1050 вещества Б
Эксперименты с применением модели хронически инфицированных ШЧ-1 моноцитов человека - клеточной линии ГКИ-4005 показали, что несмотря на неэффективность ПС в этой культуре клеток, в комбинации с AZT ГК ингибнрует размножение вируса в ней на 89,6% (табл. 18). Таким образом, по этому параметру ПС также южно отвести к перспективным анти-БИЧ препаратам. На этой клеточной модели энциклан также проявил низкую анти-БИЧ активность, однако, в комбинация с AZT энциклан ингибирует репродукцию вируса на 86% (табл.19).
Таблица 19
Ингибирование репродукции БИЧ-I в культуре клеток 1ГГ-4 комбинациями наиболее эффективных препаратов с AZT
Препараты Концентрация, Ингибирование
и их активности обратной
комбинации мкг/мл транскриптазы, %
AZT a oí 26. э±а 9
W а 05 92. 0+1, 3
Энциклан а об 46. iia 5
Эяциклан + AZT аоб + аох 93.5+а 2
Энциклан + AZT а об + а 05 96.4±ЦЗ
Гайдарам 5а о 69. 4±а 8
Глгсщирам + AZT 5а о + а tu 99. IiA 3
Эти данные даго возможность предположить наличие синергетическо-го анти-БИЧ действия этих соединений.
Таким образом, применение комбинаций препаратов может быть перспективно для разработки комплексной терапии ВИЧ-инфекции. Особенный интерес представляют комбинации препаратов с различными механизмами действия, которые могут дополнять друг друга, влкшфун различные этапы репродукции БИЧ. Следует подчеркнуть перспективность использования комбинации дгт-глицирам, поскольку эти препараты разрешены для клинического применения.
ВЫВОДЫ:
1. Получена хронически инфицированнаяВЙЧ-1 линия перевиваемых моноцитов человека ГКВ-4005, отличающаяся тем, что клетки ПСВ 4005 продуцируют инфекционные вирусные частицы в течение длительного непрерывного культивирования (более 200 пассажей) без подсева неинфицированных клеток.
2. Предложен способ сокультивирования хронически инфицированной ВИЧ-1 культуры клеток моноцитов (ГКВ 4005) и Т4-лимфоцитов человека (МТ-4). Применение этого способа для культивирования . ВИЧ-1 позволяет получать антиген с полным набором вирусспе-цифических белков.
3. Изолирован .охарактеризованный по культуральным свойствам высокопродуктивный штамм ВИЧ-1. Определена первичная структура областей VI, 42 и УЗ гена епу этого штамма. На основе этого штамма разработана технология получения очищенного вирусного антиге-
у на, пригодного для использования в диагностических тест-системах.
4. Разработаны диагностические тест-системы для детекции вирусных антигенов ВИЧ-1 (суммарного и р24) и ВИЧ-2 с чувствительностью до 50пг/мл. Проведено сравнение способов тестирования вирусного антигена в составе иммунного комплекса и выбран оптимальный метод. При анализе клинических образцов от ВИЧ-инфицированных пациентов с использованием тест-системы для детекции антигена р24 установлено, что в свободном состоянии антиген р24 присутствует в 5 процентах исследованных образцов и в 31 процентах в составе иммунных комплексов.
5. Предложена схема оценки анти-ВИЧ активности тестируемых соединений, включающая тестирование на первично-инфицированных
- культурах Т-хелперов и хронически-инфицированной культуре клеток моноцитов с определением уровня защиты клеток по жизнеспособности и уровня подавления синтеза вирусных белков.
6. Установлено, что олигонуклеотиды РМ-20 рйСАТСААвсАйСТССАСйСА , комплементарный области начала трансляции открытой ражи считывания на (+) цепи ДНК ВИЧ-1, и МР-20 -ртесстбЕАбСТасттсдтсс, комплементарный олигонуклеотиду РМ-20, эффективно ингибируют репродукцию ВИЧ-1 в культуре клеток МТ-4. Показано, что анти-ВИЧ активность олигонуклеотидов существенно повышается при присоединении к 5' -концевым фосфатам алифатических аминов или холестерина.
- 76 -
7. Проведено изучение анти-ВИЧ активности пептидов-фрагментов белков оболочки ВИЧ. Наибольшая анти-ВИЧ активность выявлена для пептида (426-439 env) - NMWQEVGKAMYAPP.
8. Установлено, что 5' -фосфонаты азидотимидина с различными типами остатков модифицированного фосфата и 5' -фосфонатов фтор-тимидина обладают значительно более низкой токсичностью для не-инфицированных клеток, чем азидотимидин. Показано, что в культуре клеток МТ-4, инфицированной ВИЧ-I, среди изученных 5* -фосфо-натов азидотимидина наиболее выраженным ингибирукхцим действием обладает 5' -карбоксифосфонат азидотимидина. Анти-ВИЧ эффект азидотимидина и его производных существенно снижен на моделях первичной культуры нестимулированных моноцитов периферической крови, инфицированной ВИЧ-I и в перевиваемых культурах клеток, хронически инфицированных ВИЧ-1.
9. Исследована способность ингибировать репродукцию ВИЧ различных солей, гликопептидов, амидов и пента-о-никотината гли-цирризиновой кислоты и определены количественные характеристики анти-ВИЧ активности этих сооеданений. Установлено, что производные глицирризиновой кислоты эффективно ингибируют вируспро-дукцию как при продуктивной инфекции клеток МТ-4, так и при хронической инфекции в культуре клеток моноцитов.
10. Показано, что энциклан - изооборниловый эфир 2,9-диме-тил-За, 4,9,9а -татрагидрофуро- [2, 3-ь]- хиноксалин- З-карббновой кислоты является ингибитором репродукции как ВИЧ-I, так и ВИЧ-2 в культуре клеток - (is - 406 и 10, соответственно).
11. С использованием хронически инфицированных ВИЧ-I моно- . цитов человека и Т-хелперов показано, что энциклан и глицирам не являются антагонистами азидотимидина и могут быть использованы для комбинационной терапии ВИЧ-инфекции.
12. Установлено, что 2,3,7,8-тетрахлордибензо-пара-диоксии является активатором ВИЧ-инфекции на модели клеток МТ-4, инфицированных ВИЧ-1.
- 77 -
РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУКЩХ РАБОТАХ:
1. Блинов В.М., Покровский А.Г., Сандахчиев Л.О. Локализация им-
муноглобулинподобных доменов в белке оболочки вируса иммунодефицита человека // в сб: Фундаментальные и прикладные вопросы проблемы СПИД. М. 1988. С.88-90.
2. Ястребова O.A., Киселев H.H., Покровский А.Г., Кожич А.Т.
Исследование влияния пептида "Т" на репродукцию вируса имму--нодефицита человека в культуре клеток.//Сб. научных трудов "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и гемотрансфузи-онных препаратов". Ленинград. 1989. 0.126-129.
3. Черных А.И., Куляндин O.A., Ткачев В.К., Покровский А.Г. Оп-
ределение ВИЧ-1 в лимфоцитах периферической крови носителей вируса СПИД// Сб. научных трудов "Проблемы биотехнологии иммунобиологических и гемотрансфузионных препаратов". Ленинград. 1989. С.132-134.
4. Абрамова Т.В.. Блинов В'.М., Зласов В.В.,' Горн В.В. .Зарытова
В.Ф,, Иванова Е.М., Коневец Д.А., Плясунова 0.А., Покровский А.Г., Сандахчиев Л.С., Свинарчук Ф.П., Старостин В.П., Чаплыгина O.P. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека в культуре клеток производными антисмысловых олиго-нуклеотидов // Докл. АН ССОР. 1990. Т.312. N 5. С. 1259-1262.
Б. Покровский А.Г., Черных А.И., Чаплыгина С.Р., Ястребова О.Н., Цырлов И.Б. Влияние 2,3,7,8-тетрахлордибензопара-диоксина на репродукцию вируса иммунодефицита человека // Докл. АН СССР. 1990. Т. 313. H 3. С. 723-725.
6. Покровский А.Г., Блинов В.М., Ястребова О.Н., Чаплыгина O.P.,
Егоричева И.Н., Сандахчиев Л,С.. Кожич А.Т., Мошников O.A., Чикин Л.Д., Иванов В.Т. Влияние пептидов-аналогов Т4 рецептора и HLA 11 класса на репродукцию вируса иммунодефицита человека // Докл. АН СССР. 1990. Т. 313. N 3. С. 734- 740.
7. Abramova T.V., Blinov V.M., Vlassov V.V., Gom V.V., Zarytova
V.F., Ivanova E.M., Konovets D.A., Plyasunova O.A., Pokrovsky A.G., Sandahchlev.L.S., Svinarchuk F.P., Starostln V.P., Chapligina S.R. Anti-HIV activity of the antisense oligonucleotides bearing lipophilic and alkylating groups at the 5'- terminus // Nuoloosides & Nucleotides. 1991. V.
10(1-3). P. 419-422.
8. AbrarovaT.. Blinov V., Vlassov V., Gorn V., ZarytovaV.,
Ivanova E., Konevets D., Plyasunova 0., Pokrovsky A., Sandahchiev L., Svlnarchuk F., Starostin V., Chapligina S. Specificity of HIV inhibition by modified antlsense oligonucleotides // Nucleic Acid Res. 1991. V.24 P.283.-
9. Мамаева O.A., Плясунова O.A., Проняева Т.P., Покровский А.Г.,
Ткачев В.К.. Карамов Э.В., Руднева И.А. Особенности длительного непрерывного культивирования линии клеток, хронически инфицированной вирусом иммунодефицита человека 1 типа //Вопросы вирусологии. 1991. N 6. 0. 447-450.
10. Pokrovsky A.G., Chernych АЛ., Yastrebova O.N., Tsyrlov I.В., 2,3,7,8-Tetrachloro-dibenzo-P-Dioxin as a possible activator of HIV infection // Biochem. Biophys. Res. Coroiun.
1991. V.179. N. 1. P.46-51.
11. Плясунова O.A., Егоричева И.Н., Федюк H.B., Покровский А.Г., Балтика Л.А., Муринов Ю.И., Толстиков Г.А. Изучение анти-ВИЧ активности з-глицирризиновой кислоты //Вопросы вирусологии.
1992. N 3. С. 25-38.
12. Покровский А.Г., Плясунова 0.А., Сандахчиев Л.С., Киселев О.И., Чупахик О.Н., Чарушин В.Н., Понизовский М.Г., Дубур Г.Я., Бисениекс Э.А. Анти-ВИЧ активность сложных зфиров изо-борнеола // Докл. РАН. 1992.
13. Федюк Н.В., Коновалов Е.Е., Локтев В.Б,, Урываев Л.В., Покровский А.Г. Выявление и количественное определение антигенов вируса иммунодефицита челове2ка 1 и 11 типа // Вопр.виру-сол.1992. N 3. С. 135-138.
& *
14. Коновалов Е.Е., Локтев В.Б., Покровский А.Г., Федюк Н.В., Черных А.И., Нечаев Ю.О., Куляндин 0.А., Киприянов С.М., Офицеров В.И. Изучение антигенной структуры белка р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа с помощью моноклональных антител // Вестник АМН COOP. 1992. N59. N.9-10.С.55-59,
15. Svinarchik F.Р., Копеvetz D.A., Plyasunova 0;А., Pokrovsky A.S.. Vlassov V.V. Inhibition of HIV proliferation "by antisense oligonucleotide conjugated to lipophilic groups // Biochimie. 1993. V.75. P.49-54. -16. Tsyrlov I.B. & Pokrovsky A.G. Stimulatory effect of CYP1A1
inducer 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin on the reproduction of the HIV-1 in human lymphoid cell culture //
- 79' -
Xenobiotica. 1993. V.23. Р.457-467.
17. Tsyrlov I.B. & Pokrovsky A.G. Pleotropic trans-activating effects of TCDD, BCodA and BCotlP on structural genes of CYP1A1 and HIV-1 in human CD4 lymphoid oells // in: Organohalogen Compounds (eds: Fiedler H. et al.,) 1993. V.14. P.44-49.
18. Покровский А.Г., Плясунова O.A., Блинов В.М., Власов В.В., Свинарчук Ф.П., Абрамова Т.В., Горн В.В., Коневец Д.А. Инги-бирование репродукции вируса иммунодефицита человека олиго-дезоксинуклеотидами // Молекулярная биология. 1993. Т. 27. Вып. 5. С. 1039-1043.
19. Мамаева O.A., Плясунова O.A., Покровский А.Г., Дяткина Н.Б., Арзуманов A.A. Изучение анти-ВИЧ активности 5'-фосфонатов азидотимидина и фтортимидина // Молекулярная биология. 1994. Т.28. N 1. 0.137-142.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ ЗАПЩЕНЫ АВТОРСКИМИ СВИДЕТЕЛЬСТВАМИ:
20. Покровский А.Г., Плясунова O.A., Толстиков Г.А., Балтина Л.А., Муринов Ю.И. Ингибитор размножения вируса иммунодефицита человека // Заявка на A.c. СССР N 489792/14-124380, положительное решение от 09.08.91.
21. Балтина Л.А., Покровский А.Г., Плясунова O.A., Толстиков Г.А. Амид з-глицирризиновой кислоты с б-амино-2-тиоурацилом, проявляющий анти-СПИД активность // Заявка на A.c. СССР N 4916058/04, положительное решение от 10.01.92.
22. Балтина Л.А., Покровский А.Г., Плясунова 0.А., Толстиков Г.А. Амид ß-глицирриэиновой кислоты с метиловым эфиром L-гистидина, проявляющий анти-СПИД активность // Заявка на A.c. СССР N 4915764/04, положительное решение от 03.01.92.
23. Толстиков Г.А., Балтина Л.А.. Покровский А.Г., Плясунова O.A., Сандахчиев Л.С. Гликопептид о-глицирризиновой кислоты с дибутиловым эфиром L-глутаминовой кислоты, проявляющий ан-ти-СШД активность // Заявка на A.c. СССР N 4916056/04, положительное решение от 03.01.92.
24. Толстиков Г.А., Балтина Л.Д., Покровский А.Г., Плясунова O.A., Муринов Ю.И., Сандахчиев Л.С. Амид а-глицирризиновой кислоты с 6-амшюурацилом, проявляющий анти-СПИД активность // Заявка на'А.с. СССР N 4916055/04, положительное решение от 03.01.92.
25. Балтина JL А., Покровский А. Г., Плясунова 0. А., Толстиков Г. А. Гликопептид -глицирризиновой кислоты с метиловым эфиром глицил-L-валина, проявляющий анти-СПИД активность // Заявка на А. с. СССР N 4915763/04, положительное решение от 03. 01. 92.
26. Толстиков Г. А., Балтина Л. А., Покровский А. Г., Плясунова 0. А., Муринов Ю. И. Гликопептид -глицирризиновой кислоты с диметиловым эфиром L-аспарагиновой кислоты, проявляющий анти-СПИД активность // Заявка на А. с. СССР N 4915765/04, положительное решение от 03. 01. 92.
27. Покровский А. Г., Плясунова 0. А., Блинов R М., Киселев 0. И., Петрова Г. М., Чупахин 0. Е , Чарушин R Е, Понизовский М. Г., Дубур Г. Я , Бисениекс Э. А., Улдрикис Я Р. Применение изобор-нилового эфира 2, 9-диметил - За, 4, 9, 9а - тетрагидрофуро -[2,3-ь] - хиноксалин- 3-карбоновой кислоты (энциклана) как ингибитора размножения вируса иммунодефицита человека ( ВИЧ) // Заявка на А. с. СССР N 4903830/14, положительное решение от 22. 06. 92.
28. Руднева И. А., Карамов Э. К , Горчакова Т. А., Черных А. И., Мамаева 0. А., Плясунова 0. А., Покровский А. Г. Штамм перевиваемых клеток моноцитов человека - продуцент вируса иммунодефицита человека I типа //Заявка H 4496852, патент РФ N1554370 от 19. 03. 93, приор. 08. 08. 88.
29. Покровский А. Г., Мамаева 0. А., Плясунова 0. А., Киселев Е Е, Куляндин С. А., Способ получения антигена вируса иммунодефицита человека I типа// Заявка N4827359, патент РФ N1717631 от 15.12. 92, приор. 21. 05. 90.
30. Черных А. И., Куляндин С. А., Покровский А. Г., Казаринова Ф. С., Егоричева И. К , Красных Е Е , Гашникова Е И., Нечаев Ю. С., Ломанова Г. А., Покровский Е Е Штамм вируса иммунодефицита человека I типа, используемый для производства диагностических тест-систем // Заявка N 5057382 от 31. 07. 92, П. р. от 21. 09. 93.
ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ
31. Pokrovsky A., Plyasunova 0., Yastrebova 0., Chaplygina S. Comparison of various drugs effect on HIV reproduction on primary and chronlcal 11 Infected cell Unes. - Abstracts of the Sixth International conference on AIDS, San Francisco.
- 81 -
USA. 1990 (20-24 June). P.112.
32. Балтина Л.A., Зиновьева С.А., Сахаутдинова Г.М., Покровский А.Г., Плясунова 0.А., Толстиков Г.А. Гликопептиды глицирриэиновой кислоты - новый класс Юкмуномодуляторов и анти-БИЧ агентов. -Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Химия природных низкомолекулярных биорегуляторов", Ереван.1990 (29 октября-1 ноября).0.84.
33. Pokrovsky A.G., Plyasunova О.А., Blinov V.M., Abramova Т.V.. Svinarohuk F.P., Vlassov V.V. Specificity of anti-HIV action of antisense oligonucleotides on different HIV strains. - Abstracts of the International Conference on Nucleic Acid Therapeutics, Florida, USA. 1991. (13-17 January). P.80.
34. Плясунова 0.А., Покровский А.Г., Блинов B.M., Власов В.В., Свинарчук Ф.П., Абрамова Т.В., Горн В.В., Коневец Д.А. Изучение специфичности анти-ВИЧ действия . антисмысловых олигонуклеотидов на разные штаммы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). -Тезисы докладов IX Всесоюзного симпозиума по целенаправленному изысканию лекарственных средств, Рига. 1991 (22-24 января). С.З.
35. Покровский А.Г., Плясунова О.А., Русаков И.А., Балтина Л.А., Муринов Ю.И., Толстиков Г.А. Ингибирование репродукции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) в культуре клеток продуктами экстракции корня солодки и производными й-глицирризиновой кислоты. -Тезисы докладов IX Всесоюзного симпозиума по целенаправленному изысканию лекарственных средств, Рига. 1991 (22-24 января). 0.54.
36. Pokrovsky A.G., Plyasunova О.А., Sandahchiev L.S. Perspectives for therapy of HIV infection by drugs with different mechanisms of action. - Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July). P.11.
37. Abramova T, Blinov V., Vlassov V., Gorn V., Zarytova V., Ivanova E., Konevets D., -Plyasunova 0., Pokrovsky A., Sandahchiev L., Svinarohuk F., Starostin V., Chapligina S.Specificity of HIV inhibition by modified antisense olygonucleotides.- Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of diagnostics end therapy of
- 82 -
AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.8.
38. Plyasunova 0.A., Pokrovsky A.G., Rusakov I.A., Baltina L.A., Murinov V.I., Tolstlkov G.A. Inhibition of human immunodeficiency virus (HIV) reproduction in cell cultures by glycyrrhizio acid. - Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July).P.15.
39. Ponizovsky M., Petrova G., Charushin V., Dubur G., Chupakhin 0., Pokrovsky A., Kiselev 0., Plyasunova 0., Egoricheva I.. New heterocyclic compounds with anti-HIV activity. -Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July). P.5.
40. Vlassov V., Konevets D., Plyasunova 0., Pokrovsky A., Svinarchuk F. Hydrolysable oligodeoxynuoleotides derivatives as anti-HIV agents. - Abstracts of the International Conference on molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1931 (1-5 July). P.25.
41. Tolstlkov G. A., Baltina L.A., Ryzhova S.A., Murinov Yu. Pokrovsky A.G., Plyasunova O.A., Sandahchiev L.ST Development of new anti-HIV agents based on glycyrrhizio acid. - Abstracts of the International Conference ori molecular biology aspects of diagnostics and therapy of AIDS, Novosibirsk, Academgorodok. 1991 (1-5 July). P.14.
42. Толстяков Г.А., Балтина Л.А., Покровский А.Г., Плясунова 0.А. Разработка новых средств для борьбы с ВИЧ-инфекцией на основе глицирри8йНовой кислоты. Материалы IV Всесоюзного симпозиума "Изучение и использование солодки в ССОР", Алма-Ата. 1991 (3-5 октября). С.160-161.
43. Plyasunova О.А., Pokrovsky A.G., Rusakov I.A., Baltina L.A., Murinov Yu.I., Tolstlkov G.A. Inhibition of HIV reproduction in cell cultures by glycyrrhizio acid.- Abstracts of the VIII International . Conference on AIDS/I 11 STD World Congress, Amsterdam. 1992 (19-24 July). P.31.
44. Pokrovsky A.G., Plyasunova O.A., Blinov V.M., Abramova T.V., Svinarchuk F.P., Vlassov V.V. Anti-HIV action of antisense and sense oligodeoxynuoleotides and Its derivatives. -
Abstracts of the VIII International Conference on AIDS/III STD World Congress, Amsterdam. 1992 (19-24 July). P.32.
45. Svinarchuk F.P., Konevetz D.A., Vlassov V.V., Pokrovsky A.Q., Plyasunova O.A. Anti-HIV action of antisense and sense oligodeoxynucleotide derivatives. - Abstracts of the International Conference on Antisense Oligonucleotides and Ribonucleases H, Arcachon. 1992 (27 september-2 october).
46. Коновалов E.E., Локтев В.В., Перебоев А.В., Протопопова Е.В., Киселев Н.Н., Куляндин С.А., Киприянов С.М., Покровский А.Г. Получение коллекции гибридом, продуцирующих монок-лональные антитела к белку р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа. - Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов". Москва. 1990 (3-5декабря). С.27.
47. Куляндин С.А., Покровский А.Г., Коновалов Е.Е., Локтев В.В., Использование моноклональных антител к р24 вируса иммунодефицита человека 1 типа для иммуноаффинной очистки белка и тестирования антигенпродуцирующих клеток. - Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов". Москва. 1990 (3-5декабря). С.28.
48. Chupakhin 0.N., Ponizovsky М. G., Charushhin V.N., Dubur G.J., Biseniieks E.A., Kisselev 0.1., Ilienko A.I., Pokrovsky A.G., Encyclane, a new wide range antiviral drug. - Abstracts of the International Symposium "100 years of virology", St. Petersburg. 1992 (21-25 September). P.95.
49. Yastrebova O.N., Sandahchiev L.S., BlinovV.M., Pokrovsky A.G. Inhibition of HIV -1 reproduction by synthetic peptides from region of ENV, GAG, VPU proteins similar to cell receptors CD-4 and HLA-DR - Abstracts of the International conference on AIDS, Monreal 1989 (4-9 June). P.590.
50. Tsyrlov I.В., Pokrovsky A.G. A stimulatory effect of the monooxygenase inducer 2,3,7,8-TCDD upon reproduction of HIV-1 in lymphoid cell culture - Abstracts of the International conference on modern perspectives in xenobiotic metabolism, San Diego, 1990 (21-25 October). P.10.
51. Chupahin 0., Charushin V., Dubur G., Kiselev 0., Pokrovsky A.G..Syntesis of New Furoguinoxalines with antiviral activity - Abstracts of the 17th international Congress of Chemotherapy; Berlin, 1991 (23-28 June). N 1523.
52. Kiselev 0., Dubur G., Charushin V., Chupahin 0., Bisenleks E., Platonov V., Iljenko V., Pokrovsky A., Blinov V. M., Rosenberg 0. A. Aencyclan-New highly potential drug against HI V-i nfecti on: mode of action and properties -Abstracts of the I7th international Congress of Chemotherapy, Berlin, 1991 (23-28 June). N 1519.
53. Fedyuk N.F., Konovalov E.E., Pokrovsky A. G., Loktev V.B., Kovalenko B.A. Detection of the core HIV-I antigen p24 by Immunoassay and i miSuRofl ui orescence assay -.Abstracts of VIII International Conference on AIOS/lII STD World Congress, Amsterdam, 1992 (19-24 Jul y). V. 3. P. 20.
54. Pokrovsky A., Plyasunova 0., Klselev 0., Ponlzovsky H., Charushin V., Chupahin 0., Anti-HIV activity of Isoborneol ethers - Abstract book of IX International Conference or AIDS/IV STD World Congress, 1993 ( 6-II June). P. 236.
55. Fedyuk N.V., Pokrovsky A. G., Garaev M. M. Detection of HIV p24 antigen in sera of HIV-infected patients from Russiar Federation -IX International Conference on AIDS , Berlin, Abstact book. - 1993.- Vol.1. - P. 260.
-
Покровский, Андрей Георгиевич
-
доктора медицинских наук
-
Москва, 1994
-
ВАК 03.00.06
- Моделирование и диагностика персистентной гриппозной инфекции на мышах
- Вирус Синдбис, резистентный к производным адамантана
- Молекулярно-биологический и иммунохимический анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вируса клещевого энцефалита
- Молекулярно-биологический и иммунологический анализ вирусспецифических белков и надмолекулярных структур вируса клещевого энцефалита
- Сравнительная характеристика структурно-функциональных изменений органов и тканей мышей с врожденной патологией, индуцированной инактивированным и инфекционным вирусом гриппа
