Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Стандартизация и разработка системы контроля препаратов для диагностики ВИЧ-инфекции методом полимеразной цепной реакции

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Стандартизация и разработка системы контроля препаратов для диагностики ВИЧ-инфекции методом полимеразной цепной реакции"

на правах рукописи

Саркисян Каринэ Арташесовна

| 003062!360

I

СТАНДАРТИЗАЦИЯ И РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ КОНТРОЛЯ ПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

03.00.06,- вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва -2007

Работа выполнена в ФГУН Государственном научно-исследовательском институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича Роспотребнадзора.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

Доктор медицинских наук, профессор Воробьева Мая Сергеевна ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор Гараев Мансур Мухамедович доктор медицинских наук, профессор Игнатьев Георгий Михайлович

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ

Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова.

заседании диссертационного совета Д 001.020.01 при научно-исследовательском институте вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 123098, Москва, ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, ул. Гамалеи, 16, тел. (499) 190-30-40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского.

Автореферат разослан « № » 2007 г.

Защита состоится

Ученый секретарь Диссертационного совета

д.м.н. Косякова Н.П.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы.

В связи с отсутствием эффективных средств защиты и иммунопрофилактики ВИЧ-инфекции, огромную роль в предотвращении и распространении этой инфекции играет качественная и своевременная диагностика. В последние годы в диагностике ВИЧ-инфекции широкое распространение получили методы выявления генома ВИЧ. С помощью этих методов можно не только подтверждать наличие ВИЧ-инфекции, но и судить об активности вируса в организме инфицированного человека, прогнозировать развитие заболевания, наблюдать за эффективностью противовирусной терапии. Одним из наиболее переспективных вариантов метода является специфическая амплификация нуклеиновых кислот in vitro - полимеразная цепная реакция. Развитие технологии получения ПЦР-тест-систем, организация производственного выпуска препаратов для ПЦР, мониторинг качества выпускаемых препаратов, определили необходимость создания системы контроля тест-систем, создания и аттестации стандартных образцов (как отраслевых - ОСО, так и стандартов предприятия - СОП) для оценки чувствительности и специфичности диагностических препаратов.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было: стандартизация и создание системы контроля препаратов для генодиагностики ВИЧ-инфекции. В соответствии с этим необходимо было решить следующие задачи:

1. изучить основные характеристики препаратов для генодиагностики ВИЧ-инфекции;

2. стандартизовать основные методы оценки качества тест-систем -аналитическую чувствительность и специфичность;

3. разработать и аттестовать стандартные образцы: ОСО и СОП;

4. оценить диагностическую чувствительность и специфичность ПЦР-тест-систем при исследовании клинического материала для решения вопроса о целесообразности внедрения препаратов для генодиагностики ВИЧ-инфекции в практику здравоохранения.

Научная новизна.

На основе проведенных исследований впервые в стране разработана система контроля качества препаратов для генодиагностики ВИЧ-инфекции. С этой целью разработаны, аттестованы и применены при оценки качества ПЦР-тест-систем отраслевой стандартный образец - ОСО «ДНК ВИЧ-1 К+»,

1

стандартные образцы предприятия: СОП «ПКО ДНК ВИЧ-1» и СОП «РНК ВИЧ», разработанные совместно с ФГУН ЦНИИЭ.

В процессе выполнения данной работы была аттестована и подтверждена высокая чувствительность гибридизационно-ферментной детекции продуктов амплификации по сравнению с электрофоретическим методом детекции, было показано, что наиболее технологичным является метод выделения лимфоцитов путем гемолиза цельной крови,.

Впервые в РФ проведены независимые клинические шифрованные испытания отечественных и зарубежных ПЦР-тест-систем с целью решения вопроса о целесообразности внедрения этих препаратов в практику здравоохранения.

Научно-практическая значимость.

Разработан, аттестован и зарегистрирован в Реестре национальных стандартов МИБП РФ - отраслевой стандартный образец «ДНК ВИЧ-1 К+» - ОСО 42-28-303-98. На ОСО оформлено свидетельство и инструкция по применению. В настоящее время ОСО с успехом применяется для контроля аналитической чувствительности и специфичности ПЦР-тест-систем для выявления ДНК ВИЧ-1.

Аттестованы разработанные в ФГУН ЦНИИЭ стандартные образцы предприятия СОП «ПКО ДНК ВИЧ-1» и СОП «РНК ВИЧ». Показана возможность применения этих образцов для оценки аналитической чувствительности выпускаемых серий тест-систем, а так же для приготовления контрольных образцов, входящих в состав тест-систем. Применение стандартов (ОСО, СОП) включено в нормативную документацию на тест-системы в разделы «Подлинность» и «Специфическая активность».

На представительном клиническом материале проведены шифрованные клинические испытания ПЦР-тест-систем в соответствии с утвержденными Комитетом МИБП Протоколами государственных испытаний. Показано, что отечественные ПЦР-тест-системы по своей диагностической чувствительности и специфичности не уступают зарубежным препаратам. В настоящее время

«

прошли регистрацию в РФ и разрешены к применению в диагностической практике следующие ПЦР-тест-системы: «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96», «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», «АмплиСенс ДНК-ВИЧ РИТ» «АмплиСенс ВИЧ Монитор», «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест».

Положения, выносимые на защиту: 1. Проведены исследования и подтверждены оптимальные условия выделения

лимфоцитов из цельной крови при постановке ПЦР для выявления ДНк ВИЧ-1 из

,2 .1

цельной крови, изучены два метода детекции для тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96»;

2. Проведена оценка чувствительности и специфичности тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» в шифрованном клиническом опыте;

3. Разработан и аттестован ОСО «ДНК ВИЧ-1 К+», показана целесообразность применения этого стандарта для контроля качества выпускаемой продукции и для оценки чувствительности;

4. Проведена оценка чувствительности и специфичности отечественных и зарубежных ПЦР-тест-систем «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», «АмплиСенс ДНК-ВИЧ FRT», «АмплиСенс ВИЧ Монитор», «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест» в шифрованных клинических испытаниях;

5. Аттестованы разработанные в ЦНИИЭ СОП «ПКО ДНК ВИЧ-1» и СОП «РНК ВИЧ»; показана целесообразность применения этих стандартных образцов для получения и калибровки положительных контрольных образцов, входящих в состав наборов, а так же для оценки чувствительности ПЦР-тест-систем.

Апробация работы

Основные экспериментальные материалы и положения диссертационной работы были доложены и обсуждены на IV международной конференции «СПИД, рак и родственные проблемы» Санкт-Петербург, 1997 г, XII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии», Гурзуф, 2004 г, Международной научно-практической конференции по вопросам ВИЧ-инфекции и вирусных парентеральных гепатитов», Суздаль 2004 г. , 1-ой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций», Москва, 2004 г.

Материалы диссертации изложены в 9 публикациях, в том числе в 3 статьях и 6 тезисах в материалах отечественных и международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах машинописного текста и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждения результатов, заключение, выводы, список литературы. Работа содержит 14 рисунков, и 30 таблиц. Библиография включает 111 источников литературы отечественных и зарубежных авторов.

Содержание работы.

Материалы и методы.

Цельная кровь человека. Забор образцов цельной крови проводили из локтевой вены пациента утром натощак в пробирку с 0,2 мл 3%-го ЭДТА. После забора пробирку с кровью закрывали крышкой и перемешивали переворачиванием 3-4 раза; хранили при температуре от 2 до 8 0 С не более 3-х дней. Для изучения чувствительности и специфичности ПЦР-тест-систем для выявления провирусной ДНК ВИЧ-1 было использовано 447 образцов цельной крови. Плазма крови человека. Пробирку с крозью (с 6% раствором ЭДТА) центрифугировали 20 мин. при 800-1600 д, после чего отбирали плазму и переносили в пластиковые пробирки объемом 1,5 мл типа «эппендорф». Хранили образцы плазмы при температуре от 2 до 8 0 С не более 5 дней, или при температуре минус 70 0 в течении года. Для изучения чувствительности и специфичности ПЦР-тест-систем для количественного определения РНК ВИЧ-1 было использовано 178 образцов плазмы крови.

Сыворотку крови человека получали стандартным методом и использовали либо сразу, либо после хранения при минус 70 0 С . Образцы сывороток крови пациентов получали параллельно с образцами цельной крови и плазмы. Общее количество образцов сывороток доноров, ВИЧ-инфицированных, использованных в работе было 625.

Коммерческие ПЦР-тест-системы для генодиагностики ВИЧ-инфекции использованные в работе.

Тест-система для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) методом полимеразной цепной реакции «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96», производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ.

Тест-система для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) методом полимеразной цепной реакции модифицированная «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ.

Тест-система для выявления провирусной ДНК вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1) методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс ДНК-ВИЧ ЯЯТ», производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии МЗ РФ.

Тест-система для количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека 1 типа методом обратной транскрипции и

полимеразной реакции «АмплиСенс ВИЧ Монитор», производства ФГУН ЦНИИ эпидемиологии, г.Москва.

Тест-система для качественного определения ДНК ВИЧ-1 в препаратах лейкоцитов методом ПЦР «Ампликор ВИЧ-1 Тест», производства Рош Молекуляр Системе, Инк., США.

Тест-система для количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека 1-го типа «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест», производства Рош Молекуляр Системе, Инк., США.

СОП для контроля качества тест-систем для выявления ДНК ВИЧ методом

ПЦР «Положительный контрольный образец содержания ДНК ВИЧ-1 «СОП ПКО ВИЧ-1»», производства ЦНИИЭ. Препарат представляет собой раствор плазмиды pBluescript II SK+/-, несущий две вставки ДНК фрагментов генома ВИЧ - генов gag и pol, в ТЕ-буфере с добавлением ДНК фага Л (в концентрации 0,02 мг/мл). СОП ПКО ВИЧ-1 содержит 1,3x10s ГЭ/мл.

СОП для контроля качества тест-систем для количественного определения РНК ВИЧ-1 методом ОТ-ПЦР «СОП РНК ВИЧ-1», производства ЦНИИЭ. Препарат представляет собой плазму крови человека, содержащую вирус иммунодефицита человека 1 типа в концентрации 53000 копий РНК/мл. Панель субтипов РНК ВИЧ-1для полимеразной цепной реакции кат.№01/466-панель образцов плазмы крови человека, содержащих ВИЧ-1 (производства Национального Института биологической стандартизации и контроля, Великобритания). В панели представлены следующие субтипы ВИЧ-1: 8 образцов субтипов группы M - А, В, С, D, Е, F, G, Н, образцы группы О и N. Международный стандартный образец ВИЧ РНК кат.№ 97/656 (производства Национального Института биологической стандартизации и контроля, Великобритания) лиофилизированная плазма крови человека с содержанием РНК ВИЧ-1 в концентрации 106 ГЭ/мл.

ОСО ДНК ВИЧ-1. В качестве ОСО использовали рекомбинантную плазмиду pUC 19 DNA несущую вставку области генома gag ВИЧ-1, субтип В.

Методы выделения лимфоцитов из цельной крови.

В работе использовали два метода выделения лимфоцитов: I - выделение лимфоцитов из цельной крови методом фикольного градиента (Kawasaki E.S., 1980); Ii - выделение лимфоцитов из цельной крови с помощью гемолизирующего раствора, содержащего хлорид аммония, трис-HCI, Na2-3flTA и азид натрия. Лизис клеток осуществляли с помощью буферного раствора, содержащим хлорид

аммония, трис-HCI, №2-ЭДТА, Тритон Х-100, протеиназу К и азид натрия, при 60° С в течении 30 мин с последующей инактивацией протеиназы при 95° С в течении 30 мин. После центрифугирования при 10 тыс.об./мин. в течении 1 мин. в ПЦР брали 25 мкл супернатанта. Методы детекции продуктов амплификации.

Электрофоретический метод. Электрофорез амплифицированного продукта проводили в 1% агарозном геле с бромистым этидием. (Sambrook J., Maniatis Т., 1989).

Гибридизационно-Ферментный метод. Проведение гибридизационно-ферментной детекции идентично постановке классического твердофазного ИФА и осуществлялось согласно инструкциям по применению.

Гибридизационно-флуоресцентный метод детекции проводили с использованием програмного обеспечения приборов: «Rotor-Gene» фирмы «CorbettResearch» и «IQ ¡Cycler» фирмы «Био-Рад».

Статистические методы обработки полученных результатов.

При аттестации кандидата в ОСО ДНК ВИЧ-1 для определения числа копий ДНК в препарате использовали метод конечных разведений с использованием ПЦР-анализа. Определение числа копий рекомбинантной плазмиды проводили, анализируя лимитирующие разведения кандидата в ОСО ДНК ВИЧ-1 методом ПЦР (Taswell С. 1981). Оценивали достоверность полученных данных, используя программу Quality (httpV/ubik.microbiol.washinqton.edu/computing/qualitv/gualitv.htm). Оценка диагностической чувствительности и специфичности ПЦР-тест-систем.

При сравнении разных методов детекции продуктов амплификации (электрофоретического и гибридизационно-ферментного): чувствительность ПЦР-анализа определяли как процент положительных проб крови, полученных от ВИЧ-инфицированных пациентов, заведомо позитивных по результатам ИФА и ИБ; специфичность ПЦР-анализа - как процент отрицательных в ПЦР проб крови полученных от доноров серонегативных по данным ИФА.

При проведении шифрованных клинических испытаний ПЦР-тест-систем: чувствительность - число положительных реакций (в %) при исследовании образцов крови по отношению к числу положительных реакций (в %) при исследовании этих же образцов в референс-лрепарате; специфичность - число отрицательных реакций (в %) при исследовании методом ПЦР образцов крови в сравнении с числом отрицательных реакций (в %) при исследовании этих же образцов в референс-препарате.

Результаты и обсуждение. Изучение и стандартизация основных этапов постановки ПЦР-анализа для выявления ДНК ВИЧ-1.

Сравнительное изучение и аттестация методов выделения лимфоцитов из цельной крови ВИЧ-инфицированных пациентов. Для сравнительного изучения двух методов выделения лимфоцитов (I - выделение лимфоцитов из цельной крови методом фикольного градиента, II - выделение лимфоцитов из цельной крови с помощью гемолизирующего раствора) анализировали 30 образцов цельной крови от ВИЧ-инфицированных пациентов. Параллельно сыворотки ВИЧ-инфицированных пациентов были предварительно аттестованы методами ИФА и И Б. Сыворотки крови всех пациентов в ИФА имели высокие значения ОП, в иммуноблоте выявлялось наличие полного белкового профиля, характерного для ВИЧ-1 Полученные 60 образцов ДНК, изучали в ПЦР по единому протоколу постановки амплификации и электрофоретической детекции. В результате сравнительного изучения методов выделения ДНК ВИЧ из цельной крови ВИЧ-инфицированных пациентов были получены одинаковые результаты. Наиболее целесообразным было использование второго метода выделения лимфоцитов, т.к. этот метод более технологичен для пробоподготовш большого числа образцов и по своей чувствительности не уступает первому методу выделения лимфоцитов.

Сравнительное изучение методов детекции продуктов амплификации. При

стандартизации метода детекции ампликонов сравнивали два основных

применяемых в ПЦР метода: злектрофоретический и гибридизационно-

ферментный. Использовали 207 образцов цельной крови от ВИЧ-

инфицированных пациентов - опытная группа, и 100 образцов цельной крови

доноров- контрольная группа. При детекции ампликонов элекрофоретическим

методом в контрольной группе (100 серонегативных доноров) - девять образцов

дали ложноположительные результаты. При исследовании ампликонов

гибридизационно-ферментным методом все 100 образцов контрольной группы

были отрицательными. Результаты исследования опытной группы показывают,

что при применении электрофоретического метода детекции из 176 проб от ВИЧ-

инфицированных пациентов 18 образцов визуально на электрофореграмме

верифицировались как отрицательные. При детекции ампликонов

гибридизационно-ферментным методом из 176 проб от ВИЧ-инфицированных

пациентов 7 образцов имели ОП ниже 0,35 O.E., т.е. дали отрицательный

результат. Таким образом, при использовании электрофоретического метода

7

детекции ампликонов чувствительность ПЦР-анализа равнялась - 89,6%, а специфичность - 91%. Причиной большого числа ложноотрицательных результатов в этом случае может быть недостаточная чувствительность электрофоретического способа детекции ампликонов (лимит 50 - 100 нг ДНК в лунке). Причиной ложноположительных результатов - принципиальная невозможность с помощью гель-электрофореза визуально различать продукты специфической и неспецифической амплификации, если они имеют одинаковую или близкую длину. При использовании гибридизационно-ферментного метода детекции ампликонов специфичность тест-системы составила - 100%, чувствительность - 95,1 %

На основании полученных результатов при исследовании двух вариантов методов детекции нами было подтверждено значительное преимущество гибридизационно-ферментного метода, которое заключается в следующем: 1. более высоко чувствительный и специфичный метод по сравнению с электроферетическим вариантов детекции;

2 позволяет оценивать одновременно большее количество исследуемых проб; 3. позволяет на спектрофотометре определить цифровые значения оптической плотности ампликонов в отличии от визуальной электрофоретической оценки. Изучение тест-системы для выявления ДНК вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ 1) методом ПЦР «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» в шифрованном клиническом опыте. Исследование было проведено на трех экспериментально-производственных сериях ПЦР-тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» для выявления ДНК вируса иммунодефицита человека. В качестве препарата сравнения (референс-препарата) использовали зарубежную тест-систему «Ампликор ВИЧ-1 Тест», предназначенную для качественного определения ДНК в препаратах лейкоцитов методом полимеразной цепной реакции.

Для проведения клинических испытаний было сформировано три группы: контрольная, опытная, и отдельно группа детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей. Контрольная группа включала образцы цельной крови от 50 доноров не имеющих антител к ВИЧ-1, в возрасте от 20-59 лет и от 50 пациентов с различными формами гепатита (из них 33 образца гепатит С, 17 образца - гепатит В). Диагноз гепатита у пациентов ставился на основании клинической картины, данных биохимических исследований и подтверждалось выявлением антител или антигенов в ИФА. В тест-системе «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» всего было исследовано 100 образцов цельной крови доноров - по 2

забора крови от каждого донора и 50 образцов цельной крови пациентов с различными формами гепатита. В препарате сравнения «Ампликор ВИЧ-1 Тест» были исследованы только 50 образцов цельной донорской крови. Опытная группа включала образцы цельной крови от 105 пациентов с диагнозом ВИЧ-инфекция. У всех 105 пациентов была определена стадия ВИЧ-инфекции согласно классификации В.И. Покровского. Кроме того, в группу ВИЧ-инфицированых пациентов были включены лица, в сыворотках которых в ИФА выявлялась позитивная реакция, а по ИБ определялись антитела к белку р24 ВИЧ-1 - 10 пациентов. В опытную группу были так же включены образцы крови ВИЧ-инфицированных пациентов с различными формами гепатита (гепатит В - 7 пациентов, гепатит С - 2 пациента, гепатит А - 2 пациента, гепатит В+Д-4 пациента).

В референс-препарате «Ампликор ВИЧ-1 Тест», все образцы опытной группы были положительными, образцы контрольной группы были отрицательными. Диагностическая чувствительность тест-системы «АмплиСенс ДНК ВИЧ - 96» по сравнению с референс-препаратом составила 96,7%, а специфичность -100%. В ходе клинических испытаний были протестированы 110 образцов цельной крови от 60 детей, рожденых от ВИЧ-инфицированных матерей на разных сроках жизни. Дети наблюдались от 1 до 9 месяцев. Детей в возрасте 1 месяца было 60, из них через 3 месяца удалось исследовать (по техническим причинам) кровь 30 детей, к 6 месяцам - 15 и к 9 месяцам только - 5. ДНК ВИЧ1 обнаруживалась только у 9 детей из 60 детей в возрасте 1 месяца. Из этих 9 детей, достигших 3 месяцев, исследовали кровь у 6 детей, в 6 месяцев у 3 детей, а 9 месяцев удалось исследовать кровь только 1 ребенка. Всем детям на этих сроках жизни проводился иммуноферментный анализ на наличие антител к ВИЧ; у всех детей до 6 мес. ИФА показывал положительный результат. Детей, достигших 9 мес. было пять: из них ИФА- отрицательные - 4 ребенка (ПЦР отрицательная от 1 до 9 мес) и ИФА- положительный - 1 ребенок ( ПЦР положительная от 1 до 9 мес) (таблица № 1).

Таблица № 1

Сводная таблица результатов тестирования детей, рожденных от ВИЧ-

инфицированных матерей.

возраст 1 мес 3 мес 6 кес 9 мес

ко-во 60 30 15 5

ИФА полож 60 30 15 1

отриц - - - 4

ПЦР полож 9 6 3 1

отриц 51 24 12 4

Все остальные результаты тестирования образцов крови других детей (в возрастной динамике) были отрицательными. Таким образом, с помощью ПЦР было установлено наличие ВИЧ-инфекции у 9 детей (таблица № 1), остальные дети (51 ребенок) были не инфицированы, т.к в крови у них не обнаруживалась ДНК ВИЧ. Таким образом, на основании проведенного исследования можно заключить, что ИФА-положительные результаты у 51 ребенка при отрицательном результате ПЦР, говорят только о носительстве материнских антител. Полученные нами результаты подтверждают необходимость исследования детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей методом ПЦР на выявление ДНК ВИЧ-1 в цельной крови для определения тактики дальнейшего лечения и наблюдения за такими детьми.

В испытуемой тест-системе и в препарате сравнения была исследована группа лиц (10 пациентов) с неопределенным результатом имммуноблота. Только у одного пациента из 10 обследованных определялась ДНК ВИЧ-1 как в испытуемой, так и в референс тест-системе.

Таким образом, в ходе проведенных испытаний всего было исследовано 443 образца цельной крови, из них в тест-системе «АмплиСенс ДНК ВИЧ-96» 152 образца дали положительный результат (ОП > 0.35 О.Е), а 291 образец -отрицательный результат. В референс-препарате «Ампликор ВИЧ-1 Тест» 157 образцов имели положительные значения ОП, а из 358 образцов цельной крови все образцы дали отрицательный результат.

На основании всех проведенных исследований разработана система контроля и аттестации тест-систем для ПЦР-анализа, разработан Государственный стандарт качества в виде фармакопейной статьи предприятия (ФСП 42-0115194001), в которой отражаются требования и методы контроля препарата по основным показателям качества - подлинности и специфической активности.

Разработка отраслевого стандартного образца для стандартизации и контроля качества выпускаемой продукции.

Расчет копийности концентрированного исходного препарата ДНК ВИЧ-1. Для подсчета количества копий рестрикцированной и очищенной ДНК ВИЧ-1 рекомбинантной плазмиды был произведен спектрофотометрический анализ на стадии полученного концентрированного продукта при длине волны 260 нм. Установили приблизительную концентрацию данной плазмиды - 7 хЮ11 копий ДНК в 10 мкл. Для получения партии конечного продукта с концентрацией 105 копий ДНК в 10 мкл в количестве 100 пробирок (по 100 мкл) концентрированный

10

препарат разводили ТЕ-буфером для разведения используя метод десятикратных последовательных разведений. Разведенный до концентрации 105 препарат хранили при температуре минус 70 °С. Конечный продукт -рекомбинантная плазмида, содержащая фрагмент ДНК ВИЧ-1, был принят в качестве кандидата в ОСО.

Для уточнения концентрации молекул ДНК ВИЧ-1 в полученной партии готового продукта использовали методику, предложенную Simmonds Р (1990). Для того, чтобы определить количество копий в пробе готовили разведения препарата от 2" 1 до 2"16 с использованием ТЕ-буфера, анализу подвергали конечные разведения 2"13, 2'14, 2"15 и 2"18. Каждое разведение исследовали в пяти повторах. С каждой полученной пробой разведения ДНК ВИЧ-1 проводили по пять постановок ПЦР в разное время, причем вышеуказанные разведения продукта рекомбинантной плазмиды ДНК ВИЧ-1 готовили непосредственно перед каждым проведением реакции амплификации. Использовали праймеры SK38/SK39 (S. Kwok 1988). Учет результатов проводили методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле. Данные результатов ПЦР для каждого анализируемого разведения (количество полученных положительных ПЦР и общее количество ПЦР) вводили в таблицу программы Quality, которая считает число копий ДНК в исходном образце в объеме пробы (в данном случае - в 10 мкл), а также £ (критерий Пирсона), стандартную ошибку и вероятность появления данного значения х2 (таблица № 2).

Таблица № 2

Результаты исследований стандарта ДНК ВИЧ-1 методом лимитирующих разведений

№ эксперимента Результаты ПЦР "АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96" в разведениях* Число копий в 10 мкл исходного образца

13 14 15 16

1 4/5" 3/5 2/5 0/5 1,346x 10"

2 4/5 2/5 3/5 2/5 1,613x10"

3 5/5 4/5 1/5 1/5 1,882 х 10"

4 3/4 2/4 3/4 0/4 1,527x10"

5 4/5 3/5 1/5 1/5 1,337x10"

Среднее число копий в 10 мкл исходного образца 1,540x10"

Примечание: * - число двукратных разведений** -число отрицательных/общее число реакций

Полученный конечный препарат - ОСО ДНК ВИЧ-1 представляет собой

прозрачный бесцветный раствор, содержащий в составе ллазмидного вектора

pUC 19 вставку ВИЧ-1 (область генома gag). Концентрация препарата составила

(1,540 ± 0,166)х 104 копий ДНК на 10 мкл (или 1,6 х 10® ГЭ/мл). Для стабильности

11

в препарат добавляли 96% этиловый спирт в соотношении 1:2 и ДНК фага лямбда в концентрации 0,02 мг/мл. ОСО ДНК ВИЧ-1 розлит по 100 мкл в 100 пробирок типа «эппендорф», хранится при температуре минус 70 °С.

На полученный препарат - ОСО ДНК ВИЧ-1 - разработаны Свидетельство, и Инструкция по применению. Стандарт зарегистрирован в реестре отраслевых стандартных образцов МИБП с присвоением номера ОСО-42-28-303-98. Согласно утвержденному Свидетельству на ОСО ДНК ВИЧ-1, препарат предназначен для определения чувствительности выпускаемых коммерческих тест-систем для выявления ДНК вируса иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) методом ПЦР. ОСО ДНК ВИЧ-1 может так же использоваться для приготовления положительного контрольного образца при проведении полимеразной цепной реакции для выявления ДНК ВИЧ-1.

Изучение стабильности ОСО ДНК ВИЧ-1. ОСО ДНК ВИЧ-1 применяется для определения чувствительности как при исследовании качества экспериментальных серий тест-системы для выявления ДНК ВИЧ-1 «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96», так и при контроле выпускаемых коммерческих серий данного препарата. Накопленные данные за период использования ОСО ДНК ВИЧ-1 в течение 5 лет (таблица № 3) позволили сделать вывод о стабильности ОСО, так же о стабильности качества выпускаемых серий тест-системы.

Таблица № 3

Стабильность ОСО ДНК ВИЧ-1._

год 2001 2002 2003 2004 2005

серия т/с 002 003 009 010 3608 0809 1110 3004 2805 2806 2504

ГЭ/мл Коэффициент реактивности*

5x10" 13,2 12,3 13,4 12,5 13,4 13,8 12,9 13,8 13,5 13,2 j 12,8

5x10J 13,5 10,6 13,2 12,8 13.2 13,5 13,1 13,6 13,6 13.3 12,7

5x102 13,4 11,3 13,3 12,6 13,3 13,7 12.7 13,7 13,4 12,9 | 12,9

Примечание * - значение оптической плотности (ОЕ)/ ОПкрит (0,35 ОЕ)

Кроме того, ОСО ДНК ВИЧ-1 применяется при аттестации СОП ПКО ВИЧ-1 (стандартного образца предприятия «Положительный контрольный образец содержания ДНК ВИЧ-1»). СОП ПКО ВИЧ-1 используется так же для определения чувствительности новой модифицированной тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» и для приготовления положительного контрольного образца для этой тест-системы.

Стандартизация модифицированной тест-системы для выявления ДНК ВИЧ-1 методом полимеразной цепной реакции «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М»

Аттестация стандартного образца предприятия (СОП) и проведение контроля серий. Введение в состав тест-системы новых праймеров, комплементарных другой, более консервативной области (pol) ДНК ВИЧ-1, повлекло за собой изменение в системе контроля чувствительности тест-системы. При конструировании СОП ПКО ВИЧ-1 использовали два фрагмента генома ВИЧ-1 -gag и pol. Аттестация СОП проводили параллельно с ОСО ДНК ВИЧ-1 в ПЦР тест-системах «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» и «Amplicor HIV 1 test», направленных на выявление ДНК ВИЧ-1 области генома gag. Сводные результаты аттестации представлены в таблице № 4.

Таблица N2 4

Результаты аттестации СОП ПКО ВИЧ-1._

Концентрация СОП/ОСО* в пробе (ГЭ/мл) Значения оптической плотности в стандартных образцах при проведении реакции в различных тест-системах

АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96М АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 Amplicor HIV 1 test

СОП СОП ОСО con ОСО

5x10" 4,414 4,783 4, 779 4,893 4,608

5x103 4,909 4,378 4,766 4,409 4,471

5x10¿ 4,694 5,075 4,988 3,936 4,844

5x10"' 0,097 0,083 0,091 0,048 0,048

Примечание: * ОСО - отраслевой стандартный образец ДНК ВИЧ-1, СОП - стандартный образец предприятия ПКО ВИЧ-1

При проведенных одновременных исследований ОСО ДНК ВИЧ-1 и СОП ПКО ВИЧ-1 в вышеуказанных тест-системах была выявлена корреляция результатов, которая позволила использовать СОП ПКО ВИЧ-1 для подтверждения специфической активности и подлинности модифицированной тест-системы. Анализ специфичности праймеров. входящих в состав модифицированной тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М». Решение этой задачи было осуществлено с помощью тест-системы для количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека 1 типа методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции «АмплиСенс ВИЧ Монитор», производства ФГУН ЦНИИЭ, в которую входят эти же праймеры. Такой вариант оценки праймеров тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» обусловлен тем, что в мире не существует коммерческих панелей, содержащих ДНК ВИЧ-1 разных субтипов. Праймеры, применяемые в испытуемой тест-системе «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» имеют ту же нуклеотидную последовательность что и праймеры в тест-системе «АмплиСенс ВИЧ Монитор». Исследование проведено на панели

образцов плазмы, содержащей 10 субтипов ВИЧ-1: А, В, С, О, Е, Р, С, Н, группы О и N. Полученные результаты подтвердили способность праймеров, входящих в состав исследуемых тест-систем выявлять большинство субтипов ВИЧ-1 (Рис, 1).

субтипы ВИЧ-1

OAlllplttor HIV Monitor test О Amplicor HTV-I Monitof tel I - ВОЗ I О Ari.TwCenc QHL T

Рис.1 Эффективность выявления субтипов ВИЧ-1 в трех исследуемых тест-системах.

Изучение модифицированной тест-системы «АмппиСенс ДНК-ВИЧ-96 Мм в шифрованном клиническом опыте. Оценку диагностической чувствительности и специфичности проводили в шифрованном опыте на специально подобранном клиническом материале, из которого были сформированы две группы: опытная и контрольная. Опытная группа включала ВИЧ-инфицированных пациентов на различных стадиях ВИЧ-инфекции от II Б до III 8-60 образцов. Наличие антител к ВИЧ в соответствующих сыворотках выявляли с помощью ИФА-тест-системы «Mitrex-HIV-1.2.0.» производства «Эббот Лэбораториз», В опытную группу были включены так же образцы цельной крови детей (в возрасте до шести месяцев), рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей - 12 образцов, с сомнительным диагнозом ВИЧ-инфекция, и 5 детей с подтвержденным диагнозом ВИЧ-инфекция. Во всех обследованных в ИФА образцах сывороток детей (с помощью тест-систем «КомбиБест-ВИЧ-1.2 А ПАТ» - ЗАО «Вектор-Бест» и «ДС-ИФА-ВИЧ-АГ/АТ» - НПО «Диагностические системы») и ИВ {«Блот-ВИЧ» - ЗАО «Биосервис») были установлены положительные результаты. Часть детей с сомнительным диагнозом ВИЧ-инфекция исследованы двукратно с интервалом в шесть месяцев (8 пациентов).

Контрольная группа образцы крови от пациентов, относящиеся к группам риска (беременные, пациенты с различными формами гепатита) - 50 образцов пациенты с хроническими инфекциями - герпес, ЦМВ - 20 образцов; доноры - 30 образцов Диагнозы герпес, ЦМВ и гепатиты ставились на основании клинической

картины и данных лабораторных исследований с помощью ИФА-тест-систем. Полученные результаты испытаний представлены в таблице № 5.

Таблица № 5

Результаты испытаний тест-системы «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М»

Кол-во образцов Количество положительных образцов в ПЦР тест-системах

«АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96» «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96М»

комплект № 1а' комплект № 1°"

Опытная группа 60 60 60 59

Контрольная группа 100 0 0

чувствительность 100% 100% | 98,3%

специфичность 100% 100%

Примечание: - комплекты для выделения ДНК: № 1а «Цитмлозин», № 16 «Иммуносорб».

Исследование цельной крови детей с сомнительным диагнозом ВИЧ-инфекция, которые были рождены от ВИЧ-инфицированных матерей - 12 образцов -показало, что у пятерых обнаруживается наличие ДНК ВИЧ-1 как в испытуемой тест-системе, так и в референс-препарате, что свидетельствует о наличии истинной ВИЧ-инфекции у этих детей. У остальных семерых детей результаты ПЦР-анализа были отрицательные как в испытуемой тест-системе, так и в референс-препарате. Результаты анализа крови образцов детей с ВИЧ-инфекцией - 5 образцов - как в испытуемом, так и в референс-препарате прошли с высокими значениями оптических плотностей, что подтверждает наличие ДНК ВИЧ-1 у этих детей.

Данные ПЦР-анализа совпадают с результатами, полученными при исследовании сывороток этих детей в иммуноблоте: все ПЦР-положительные дети имеют полный белковый профиль антител к ВИЧ-1. ПЦР-отрицательные дети при первичном исследовании сывороток в ИБ (10.09.04) имели весь спектр антител к ВИЧ-1, при повторном исследовании (через шесть месяцев) - сыворотки детей в ИБ были отрицательные, кроме одного образца сыворотки, в котором были выявлены антитела к р24 антигену ВИЧ-1. Данные результаты исследования сывороток в иммуноблоте подтверждают, что первоначальный положительный иммуноблот свидетельствует только о носительстве материнских антител, которые в последующем элиминируют из организма ребенка или сохраняются в остаточном количестве. Таким образом, из всей группы обследованных детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей - 17 образцов цельной крови -

15

только у 10 детей методом ПЦР был установлен диагноз ВИЧ-инфекции. Полученные данные еще раз подтверждают диагностическую -значимость ПЦР-анализа для ведения и лечения детей, рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей.

Таким образом, тест-система «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» по своей диагностической эффективности: специфичности, чувствительности, воспроизводимости сопоставима с референс-препаратом «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96». Тест-система «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» благодаря модификации использованных в ее составе праймеров, способна выявлять все субтипы ВИЧ-1 группы М. На основании вышеизложенного тест-система «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М» была зарегистрирована в РФ.

Стандартизация тест-системы для выявления ДНК ВИЧ-1 методом полимеразной цепной реакции с гибридизационно-фпуоресцентной детекцией «АмплиСенс ДНК-ВИЧ FRT».

Определение подлинности и специфической активности «АмплиСенс ДНК-ВИЧ FRT» проводили с применением: стандартного образца предприятия «СОП ПКО ВИЧ-1 в концентрациях: 1,0x10® ГЭ/мл, 5х105 ГЭ/мл, 5x10" ГЭ/мл, 5х103 ГЭ/мл; положительного контрольного образца «ПКО ДНК ВИЧ 1», приготовленного из СОП ДНК ВИЧ-1 в концентрациях 1x103 ГЭ/мл, 5х102ГЭ/мл, отрицательного контрольного образца - ДНК плаценты человека.

Все вышеуказанные материалы тестировались с применением трех комплектов для выделения ДНК, реакция амплификации проводилась в двух разных амплификаторах: «Rotor-Gene» ф. «CorbettResearch» и «IQ ¡Cycler» ф. «Био-Рад». Полученные результаты интерпретировались с помощью программного обеспечения этих приборов. Положительным результатом после компьютерной обработки считалось пересечение кривой флюоресценции с пороговой линией не превышающее 40. Для образцов СОП ПКО ВИЧ-1 в конечной концентрации 5х104 ГЭ/мл, 5х103 ГЭ/мл, 5х102 ГЭ/мл и ПКО ДНК ВИЧ 1 в концентрациях 1х103 ГЭ/мл, 5х102ГЭ/мл был получен положительный результат. При анализе результатов исследования как отрицательного контрольного образца, так и образца СОП ПКО ВИЧ-1 с концентрацией 5х101 ГЭ/мл - кривая флюоресценции не пересекала пороговую линию, что означало отрицательный результат. Кроме этого изучали воспроизводимость полученных результатов, которая оценивалась при исследовании стандартного образца предприятия СОП «ПКО ДНК ВИЧ» в концентрациях 103 ГЭ/мл и 102 ГЭ\мл в двух повторах.

Исследование СОП производилось 3-х кратно с применением трех наборов для выделения ДНК. Воспроизводимость составила 100%.

Шифрованные клинические испытания тест-системы «АмплиСенс ДНК ВИЧ FRT». Изучение диагностическорй чувствительности и специфичности препарата «АмплиСенс ДНК ВИЧ FRT» было проведено на следующем клиническом материале: ВИЧ-инфицированные на различных стадиях заболевания с серологически подтвержденным диагнозом - 30 образцов; Лица, относящиеся к группам риска (беременные, пациенты с различными формами гепатита, пациенты с заболеваниями иммунной и кроветворной систем) - отрицательные на наличие антител по результатам ИФА и ИБ -15 образцов; Контрольная группа (доноры) - отрицательные на наличие антител по результатам ИФА и ИБ - 15 образцов.

Испытуемая тест-система «АмплиСенс® ДНК ВИЧ FRT» оценивалась в сравнении с референс-препаратом «АмплиСенс © ДНК ВИЧ-96 М» (ФСП 42-01157187-05) по показателям чувствительности, специфичности. В ходе испытаний один и тот же образец был исследован с применением трех наборов для выделения, реакция амплификации проводилась в двух разных амплификаторах: «Rotor-Gene» ф. «CorbettResearch», «IQ ¡Cycler» ф. «Био-Рад». Поэтому один и тот же образец был исследован шестикратно. Полученные результаты интерпретировались с помощью программного обеспечения этих приборов. Чувствительность и специфичность испытуемой тест-системы оценивали по отношению к результатам, полученным при исследовании этих же образцов в референс-препарате. Установлено: чувствительность - 100 %, специфичность -100 %, по отношению к референс-препарату.

При анапизе полученных результатов установлено, что существенных различий при исследовании клинических образцов с помощью разных методов выделения и амплификации в двух разных приборах не выявлено. Однако, обращает на себя внимание, что пробы ДНК от ВИЧ-инфицированных пациентов, выделенные с помощью набора «Иммуно-сорб» детектировались на более ранних циклах амплификации по сравнению с пробами ДНК, выделенных с помощью набора «Гем-сорб». Пробы ДНК, выделенные с помощью набора «Цитолизин», показывали флуоресцентный сигнал несколько позднее. Отмечается корреляция полученных результатов на разных приборах, используемых при испытаниях. Хотелось бы отметить, что применение разных методов выделения не отразились на чувствительности испытуемого препарата и

воспроизводимости результатов при тестировании одного образца цельной крови с помощью разных методом выделения.

Результаты проведенных исследований показали, что испытуемая тест-система по показателям чувствительности и специфичности не уступает референс-препарату, а учитывая новый формат детекции, имеет преимущества, которые связаны с сокращением времени реакции и снижением риска контаминации. Стандартизация ПЦР тест-систем для количественного определения РНК ВИЧ-1 методом обратной транскрипции и попимеразной реакцией в плазме крови.

Проверка аналитической чувствительности количественных ПЦР-тест-систем с применением стандартов и контрольных образцов. В данной работе при стандартизации тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» использовался Международный стандартный образец ВИЧ и стандартный образец предприятия - СОП РНК ВИЧ. Результаты аттестации СОП РНК ВИЧ и калибровка его по международному стандарту (таблица № 6) выявили высокую степень совпадения результатов при тестировании этих образцов - разница результатов не превышала 0,2 dig. В связи с полученными данными была подтверждена возможность применения СОП РНК ВИЧ для стандартизации и контроле серий количественных тест-систем.

Таблица № 6

Результаты измерения концентрации РНК ВИЧ в образцах

Образцы Разведения Концентрация РНК ВИЧ (ГЭ/мл)

«АмплиСенс ВИЧ Монитор» «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест»

Международный стандарт б/р* 35000 55000

1:10 6000 5600

1:100 <500 417

СОП РНК ВИЧ б/р* 38000 54000

60000 52000

1:10 7600 10000

9300 н/д

1:100 1700 2200

н/д 1100

2000 1300

Примечание: * - без разведения

Результаты исследования панели субтипов (рис. 1) выявили, что тест-система

«АмплиСенс ВИЧ Монитор» и тест-система «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест»

одинаково эффективно выявляют большинство субтипов ВИЧ-1 (А, В, С, Е, Р, С,

Н). Тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор» с большей эффективностью

18

выявляла субтип О: полученный результат был на 0,6 1д выше, чем в тест-системе «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест». Образец, содержащий вирус из группы N находился за пределами чувствительности тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор». Ни одна из тест-систем не выявила образец, содержащий ВИЧ-1 группы О.

Шифрованные клинические испытания количественных ПиР-тест-систем. Целью исследования являлось проведение шифрованных клинических испытаний тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» для определения диагностической ценности отечественной тест-системы по сравнению с тест-системой «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест» - референс-препарат. Чувствительность оценивали при исследовании опытной группы: 72 образца плазмы крови были получены от ВИЧ-инфицированных пациентов, из них 5 образцов - от инфицированных детей в возрасте до 1 г., рожденных от ВИЧ-инфицированных матерей, 30 образцов - от 15 пациентов, получавших противоретровирусную терапию, оставшиеся 37 образцов - от взрослых ВИЧ-инфицированных пациентов, не получавших противовирусной терапии.

Оценку эффективности противовирусной терапии оценивали при тестировании образцов плазмы крови от 15 ВИЧ-инфицированных пациентов, получавших противоретровирусную терапию. Эти образцы плазмы были протестированы с помощью тест-систем «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест» и «АмплиСенс ВИЧ Монитор». Анализируемые образцы плазмы крови были взяты от пациентов до начала лечения и через 1 месяц лечения. Эффект противовирусной терапии оценивали по изменению концентрации РНК ВИЧ в процессе лечения (в логарифмических единицах). Специфичность оценивали при исследовании образцов контрольной группы: 106 образцов плазмы крови от лиц, у которых подтверждено отсутствие ВИЧ-инфекции с помощью ИФА. Все результаты, полученные с помощью двух тест-систем «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест» и «АмплиСенс ВИЧ Монитор», считали совпадающими, если разница между ними не превышала 0,5 1д. Корреляцию результатов, полученных с помощью двух тест-систем, оценивали, рассчитывая коэффициент корреляции по Спирмену. Анализ полученных результатов выявил высокую корреляцию результатов измерения концентрации РНК ВИЧ, полученных с помощью тест-систем «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест» и «АмплиСенс ВИЧ Монитор»: коэффициент корреляции составил 0,93 (ру<0,001). В среднем разница между значениями, полученными с помощью двух тест-систем, составила 0,25 1д. Дискордантные

результаты (когда разница между значениями превышала 0,5 1д) наблюдались в 10% случаев. Однако во всех случаях разница между результатами не превышала 0,8 (д.

Возможность использования тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» для мониторинга противоретровирусной терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов была продемонстрирована на группе из 15 пациентов. Мониторинг вирусной нагрузки в процессе противоретровирусной терапии показал, что уже через 1 мес после начала лечения у большинства пациентов наблюдалось значительное снижение концентрации РНК ВИЧ в плазме крови. У 11 пациентов из 15 наблюдалось снижение вирусной нагрузки в процессе лечения более чем на 1,5 1д, у 2 - более чем на 1 1д, у 1 - на 0,8 1д. Только у одного пациента не наблюдалось достоверного изменения вирусной нагрузки, т.е. изменение не превышало 0,5 !д. Дальнейший детальный анализ показал, что у данного пациента эффект от терапии не наступил и в более поздние сроки, после чего была изменена схема терапии. Полученные результаты подтверждают необходимость ранней оценки эффективности противовирусной терапии, а также демонстрируют возможность выявления низкой эффективности терапии уже через месяц после начала лечения.

При исследовании 106 образцов плазмы крови от здоровых лиц, не имеющих антител к ВИЧ были получены отрицательные результаты, т.е. ниже уровня детекции тест-системы. Таким образом, специфичность тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» составила 100% по сравнению с реферес-препаратом.

Полученные результаты показывают, что тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор» обладает аналитическими характеристиками (линейный диапазон измерения, специфичность, воспроизводимость), сравнимыми с показателями референс-препарата «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест» производства фирмы «Хоффманн-Ла Рош» (Швейцария). Полученные результаты свидетельствуют о возможности использования тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор» для мониторинга противовирусной терапии у ВИЧ-инфицированных пациентов, начиная с ранних сроков от начала лечения.

выводы.

1. Впервые в рамках исследований по стандартизации и разработки системы контроля препаратов для диагностики ВИЧ-инфекции методом полимеразной цепной реакции аттестованы и рекомендованы для диагностической практике четыре тест-системы для выявления ДНК и РНК ВИЧ отечественного производства и две тест-системы зарубежного производства:

2. Для измерения аналитической чувствительности тест-систем для выявления ДНК ВИЧ-1 методом ПЦР разработан и аттестован отраслевой стандартный образец ДНК ВИЧ-1 - ОСО 42-28-303-98, применение которого включено в нормативную документацию на препарат «АмплиСена ДНК ВИЧ 96» в разделы «Подлинность» и «Специфическая активность». На ОСО оформлено Свидетельство и Инструкция по применению.

3. Аттестованы стандартные образцы предприятия (СОП): «ПКО ДНК ВИЧ-1» и «РНК ВИЧ». Показана целесообразность применения этих образцов для оценки аналитической чувствительности выпускаемых серий ПЦР тест-систем. Стандартные образцы предприятия включены в нормативные документации на препараты для выявления ДНК ВИЧ-1 и для количественного определения РНК ВИЧ-1.

4. Разработана система оценки на клиническом материале диагностической эффективности ПЦР-тест-систем с учетом специфики заболевания. Эта система оценки применена при изучении следующих ПЦР тест-систем «АмплиСенс ДНК ВИЧ 96», «АмплиСенс ДНК-ВИЧ-96 М», «АмплиСенс ДНК-ВИЧ ЯРТ», «АмплиСенс ВИЧ Монитор», «Ампликор ВИЧ-1 Монитор Тест».

5. На основе разработанных критериев оценки возможности использования препаратов для генодиагностики ВИЧ-инфекции в практическом здравоохранении, проведена экспертиза четырех ПЦР тест-систем производства ФГУН ЦНИИЭ и установлено, что они могут быть использованы для лабораторной диагностики ВИЧ-инфекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Саркисян К.А., Шипулин Г.А., Шипулина О.Ю., Воробьва М.С. «Принципы стандартизации методов оценки качества тест-систем для выявления ДНК ВИЧ-1 методом ПЦР» Материалы IV международная конференция «СПИД, рак и родственные проблемы» 1997 г. с. 73.

2. Саркисян К.А., Шипупин Г.А., Воробьева М.С., Шипулина О.Ю. Шахгильдян

В.И. «Чувствительность и специфичность ПЦР-тест-системы для диагностики

ВИЧ-инфекции» - Вопросы вирусологии. 1997 г.№ 6, с. 187-190.

21

3. Шипулин Г.А., Саркисян К.А., Богословская Е.В., Шипулина О.Ю., Воробьева М.С., «Место полимеразной цепной реакции в диагностики ВИЧ-инфекции» -Эпидемиология и инфекционные болезни 1998 г. № 5 с. 59-63

4. Манзенюк И.Н, Саркисян К.А., Воробьева М.С., Волкова Р.А, Ладыжинская И.П. «Аттестация тест-систем для молекулярной диагностики ряда социально значимых инфекций». Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний 2002 г., с 430.

5. Саркисян К.А., Воробьева М.С., Манзенюк И.Н., Шипулин Г.А. «Стандартизация препаратов для генодиагностики ВИЧ-инфекции» - Материалы XII Международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии» 2004 г, с. 150-152.

6. Саркисян К.А, Воробьева М.С. «Стандартизация препаратов, предназначенных для генодиагностикаи ВИЧ-инфекции». Материалы 111 Международной конференции «Высокие медицинские технологии XXI века 2004 г, Бенидорм, Испания, с.59.

7. «Стандартизация препаратов, предназначенных для генодиагностики ВИЧ-инфекции» - 1-я Всероссийская конференция по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» 2004 г., М. МЗ РФ, с.

8. Богословская Е.В., Саркисян К.А., Манзенюк И.Н., Воробьева М.С., Цыганова Г.М., Шипулин Г.А. «Результаты испытаний отечественной ПЦР-тест-системы «АмплИСенс ВИЧ Монитор» для количественного определения РНК ВИЧ в плазме крови пациентов» - научно-практический журнал «БИО препараты» 2005 г., №2 , с.21-25.

9. Саркисян К.А., Воробьева М.С. « Современные препараты для генодиагностики инфекционных заболеваний». Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней.» 2006 г., с. 85

Подписано в печать 30.03.2007 г. Исполнено 02.04.2007 г. Печать трафаретная.

Заказ № 242 Тираж: 100 экз.

Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 www.aulorefcral.ni