Иммуногенотипирование и генодиагностика в биомедицине: фундаментальные и прикладные аспекты

Кофиади, Илья Андреевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Иммуногенотипирование и генодиагностика в биомедицине: фундаментальные и прикладные аспекты
ВАК РФ 03.03.03, Иммунология

Автореферат диссертации по теме "Иммуногенотипирование и генодиагностика в биомедицине: фундаментальные и прикладные аспекты"

•7

На правах рукописи

Кофиади Илья Андреевич

ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОДИАГНОСТИКА В БИОМЕДИЦИНЕ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ

«03.03.03 - иммунология» АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2013

15 АВГ 2013

005532120

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Государственный научный центр «Институт иммунологии» ФМБА России

Научные консультанты: Алексеев Леонид Петрович,

член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор,

Гудима Георгий Олегович, доктор биологических наук.

Официальные оппоненты: Филатов Александр Васильевич,

доктор биологических наук, профессор,

заведующий лабораторией иммунохимии

ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России,

Кадагидзе Заира Григорьевна, доктор медицинских наук, профессор, руководитель Централизованного клинико-лабораторного отдела РОНЦ имени H.H. Блохина РАМН,

Полевщиков Александр Витальевич, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой фундаментальной медицины Дальневосточного Федерального университета.

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и

сывороток им. И.И.Мечникова РАМН.

Защита состоится 24 апреля 2013 года в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.017.01 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, дом 24, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан » ■^ХА'р^Гд, 2013 года

Ученый секретарь Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор медицинских наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Одним из крупнейших научных достижений на рубеже XX-XXI веков стала расшифровка генома человека. В качестве новой задачи на пути практического использования полученных знаний постулируется изучение молекулярных основ изменчивости, в том числе определение роли генетического полиморфизма в формировании уникальных признаков организма Прогресс в этой области напрямую связан с внедрением методов молекулярной генетики [Venter J.C., 2010]. Применение молекулярно-генетических подходов к изучению механизмов реализации жизненно-важных функций организма уже сегодня привело к прорыву во многих областях науки и медицины [Bell J., 2004; Hamburg М.А., Collins F.S., 2010].

Наиболее ярким примером проявления полиморфизма генов является иммунная система человека, и, в частности, главный комплекс гистосовместимости. Именно с исследованием системы генов HLA (Human Leucocyte Antigenes), кодирующего молекулы главного комплекса гистосовместимости, была связана одна из первых международных программ в области молекулярной генетики, результаты которой были представлены на XI Международном рабочем совещании и конференции по изучению HLA (г. Иокогама, Япония, 1991 г.). На сегодняшний день эта система генов насчитывает более 8000 аллельных вариантов.

Важнейшим достижением биомедицинской науки последних лет стало формирование представлений о роли генетического полиморфизма на уровне одиночных нуклеотидных замен (SNP - Single Nucleotide Polymorphism). В настоящий момент в геноме человека насчитывается более 50 миллионов SNP. Многие из них расположены в так называемых «не-HLA генах иммунного ответа», играющих ключевую роль в распознавании сигналов, дифференцировке и регуляции компонентов клеточного и гуморального иммунитета и, как следствие, в защите человека от огромного числа внешних и измененных собственных антигенов.

Изучение структуры генов иммунного ответа имеет глубокую фундаментальную значимость. Генетический полиморфизм необходим для выживания человека как вида в условиях агрессивной окружающей среды. Он определяет адаптационный потенциал человека и отражает эволюционную роль мутационного процесса.

Задача сохранения генетического полиморфизма решается на популяционном уровне путем поддержания разнообразия комбинаций аллелей среди представителей тех или иных этнических групп. В связи с этим чрезвычайную актуальность для теоритической и экспериментальной биологии приобретают исследования, направленные на установление популяционных особенностей распределения иммуногенетических маркеров. В особенности это актуально для таких многонациональных государств, как Россия [Болдырева М.Н., 2007].

Нарушение функций генов иммунного ответа и их продуктов ведет к развитию тяжелых форм иммунологической недостаточности и иммунозависимым заболеваниям, в том числе инфекционного и онкологического характера. В связи с этим, одной из наиболее актуальных и перспективных задач современной биомедицинской науки является расширение теоретических знаний в области иммуногенетического контроля канцерогенеза и противоинфекционного иммунитета [Hill A.V., 2001].

Одним из приоритетных направлений фундаментальных исследований в данной области является изучение молекулярных и генетических механизмов ВИЧ-инфекции. Исследование иммуногенетических маркеров, ассоциированных с устойчивостью и чувствительностью к ВИЧ-инфекции, с динамикой ее прогрессии, чувствительностью к антиретровирусным препаратам необходимо для разработки эффективных стратегий превенции и терапии ВИЧ-инфекции/СПИД [Cohen J., 2011].

ВИЧ поражает клетки иммунной системы, несущие рецептор CD4, и принимающие непосредственное участие в инициации и контроле иммунного ответа [Dalgleish A.G., et al. 1984]. Наличие рецептора CD4 на поверхности клетки обеспечивает проникновение вируса в клетку. Но в этом процессе обязательно участвуют ко-рецепторы, контакт с которыми также является необходимым условием проникновения ВИЧ. В частности, с ко-рецептором CCR5 связан единственный из известных на сегодняшний день примеров формирования естественной устойчивости к ВИЧ-инфекции.

Иммуногенетическим маркером устойчивости к ВИЧ-инфекции является делеция CCR5delta32, расположенная в гене, кодирующем этот рецептор. В отличие от более распространенного полноразмерного варианта гена CCR5, ген, несущий делецию на обеих гомологичных хромосомах, не экспрессируется и рецептор CCR5

исчезает с поверхности клетки. Это приводит к блокированию проникновения R5 штаммов ВИЧ в клетки-мишени [Хаитов P.M. с соавт. 2009].

В отличие от особенностей взаимодействия человека и инфекционных агентов, вопрос влияния на организм факторов физико-химической природы изучен в меньшей степени. Наибольшую значимость для биомедицины представляют техногенные факторы вредности, связанные с онко- и иммунопатологиями. При этом одним из наиболее актуальных вопросов, представляющих научно-практический интерес, является вопрос о действии радиации на организм человека.

Установлено, что при радиационном воздействии даже невысокой мощности реакция тканей на одинаковые дозы радиации варьирует на индивидуальном уровне [Crompton N.E., et al. 2001]. На сегодняшний день детально изучены патогенез, патологическая морфология и клиника заболеваний, обусловленных патогенным действием облучения, риски их возникновения и зависимость от дозы радиации. При этом одной из важнейших, нерешенных до настоящего времени проблем, остается поиск биологических маркеров, позволяющих выявлять лиц с повышенной или пониженной чувствительностью к радиационному воздействию [Greve В., et al. 2012]. Результатом этого является не прогнозируемая в настоящее время индивидуальная реакция человека на действие ионизирующего излучения, как техногенного и естественного фактора вредности.

В первую очередь это связано с отсутствием адекватной модели исследования. Эксперименты с лабораторными животными, равно как и с культурами клеток, не позволяют учесть фактор генетической изменчивости. Поэтому для дальнейшего развития знаний и создания теоретической базы в данном направлении могут быть адаптированы современные клинико-статистические методы, позволяющие устанавливать связь конкретных генетических особенностей с устойчивостью или чувствительностью человека к радиационному воздействию. С фундаментальной точки зрения связь ионизирующего излучения с онкопатологиями может служить моделью при совершенствовании концепций канцерогенеза и поиске молекулярных маркеров, определяющих риск развития онкологических заболеваний [Hiño О., et al. 1993].

Генотипирование на уровне установления аплельных вариантов генов иммунного ответа, а также ряда других генетических систем, которые

рассматриваются в качестве мишеней неблагоприятного воздействия радиации, может стать перспективным подходом для оценки риска развития патологий, ассоциированных с облучением, в том числе, в отдаленные периоды времени. Решение этой задачи позволит повысить эффективность профессионального подбора, снизить смертность и заболеваемость персонала предприятий атомной отрасли. В то же время, поиск путей оценки риска развития осложнений радиационного воздействия, является важнейшим звеном в выборе и назначении эффективной приемлемой дозы при радиотерапии больных онкологическими заболеваниями, а также при радиодиагностике [Barnett G.C., et al. 2009].

Говоря о необходимости дальнейшего развития фундаментальных представлений иммуногенетики, не следует забывать и о перспективах практического внедрения в биомедицине молекулярно-генетических подходов, которые имеют преимущества по сравнению с клеточными и гистологическими методами.

В частности, в связи с широким распространением и повышением эффективности антиретровирусной терапии остро встает вопрос об оценке риска развития осложнений, вызванных приемом некоторых препаратов. Так, например, широко известны примеры с развитием реакции гиперчувствительности у лиц, принимающих Абакавир (Abacavir) и Невирапин (Nevirapine) - ингибиторы протеазы ВИЧ. Наличие побочных эффектов достоверно ассоциировано с носительством аллелей HLA-B*57:01 и HLA-DRB*01 [Vitezica Z.G., et al. 2008; Tozzi V., et al. 2010]. Кроме того, с генетическими особенностями человека связана эффективность применения антиретровирусных препаратов, препятствующих проникновению ВИЧ в клетку. Так, ингибитор рецептора CCR5 (Maraviroc), одобренный в 2011 году Федеральной администрацией США по пищевым продуктам и лекарственным препаратам (FDA), неэффективен для ВИЧ-инфицированных лиц, гомозиготных по делеции CCR5delta32 [MacArthur R.D., et al. 2008; Gorry P.R., et al. 2002; Gray L„ et al. 2006].

С другой стороны, основой для разработки методов молекулярной диагностики может стать геном самого патогена. В настоящее время все больше внимания уделяется фармакологическим подходам, основанным на понижении уровня экспрессии вирусных генов и, как следствие, подавлении ключевых стадий

репликативного цикла вирусов, и в частности, вируса гепатита С. Среди них наибольшего внимания заслуживают методы, основанные на механизме интерференции РНК. Суть процесса заключается в ингибировании трансляции за счет комплементарного связывания РНК-мишени с короткими молекулами РНК (миРНК) [Fire A., et al. 1998]. Однако для отбора молекул миРНК, наиболее перспективных с точки зрения терапии, необходима разработка технологии оценки эффективности ингибирования экспрессии. И здесь единственным методом, отвечающим условиям точности и специфичности анализа, является количественная полимеразная цепная реакция.

Еще одной важной областью практического применения количественных молекулярно-генетических методов, основанных на специфическом выявлении фрагментов вирусного генома, является трансплантология. К первоочередным факторам риска, угрожающим здоровью реципиента относятся вирусные инфекции, среди которых особое клиническое значение имеют условно патогенные вирусы, широко распространенные в человеческой популяции. В первую очередь это вирусы, относящиеся к семейству Herpesviridae, а также вирусы ВК и JC [Tanenbaum N.D., et al. 2009; Nickeleit V., Mihatsch M.J., 2006]. Кроме того, активно изучается роль вируса TTV (p. Anellovirus) в развитии тяжелых осложнений трансплантации [Piaggio F., et al. 2009; Burra P., et al. 2009]. Диагностика инфекций и мониторинг вирусной нагрузки у пациентов в посттрансплантационный период позволяет повысить эффективность профилактики и лечения пациентов, и, таким образом, снизить число осложнений трансплантации, в том числе летальных. Поэтому внедрение количественных методов генодиагностики в области трансплантологии может стать универсальным инструментом оценки адекватности применяемой программы ведения реципиентов органного трансплантата.

Таким образом, актуальность настоящего исследования обусловлена необходимостью обобщения накопленных данных в области фундаментальных исследований и разработки новых молекулярно-ориентированных подходов в борьбе с иммунозависимыми нарушениями.

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

Дели работы:

1. Определение наиболее перспективных в настоящее время областей применения молекулярно-генетических методов в фундаментальной и прикладной иммуногенетике; разработка спектра оригинальных тест-систем для оценки полиморфизма генов на индивидуальном и популяционном уровне.

2. Получение новых данных о факторах наследуемой устойчивости и чувствительности к социально-значимым заболеваниям, в том числе к ВИЧ-инфекции и онкопатологиям.

3. Разработка новых подходов в области клинико-иммунологического, лабораторного и фармакогенетического использования методов детекции нуклеиновых кислот, в том числе для мониторинга эффективности противоинфекционной терапии в клинике органной трансплантации, а также для анализа безопасности и эффективности препаратов, обладающих противовирусной активностью.

Задачи работы:

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

1. Проанализировать международный опыт применения генодиагностических подходов, в том числе методов БЫР- и НЬА-генотипирования, в биомедицине.

2. Охарактеризовать особенности популяционного распределения аллельных вариантов генов, определяющих устойчивость к ВИЧ-инфекции, динамику прогрессирования ВИЧ-инфекции в СПИД и возможность контролирования вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции в популяциях, проживающих на территории России и сопредельных государств.

3. Выбрать гены-кандидаты, перспективные для поиска маркеров наследуемой устойчивости или чувствительности человека к радиационному воздействию с точки зрения риска развития осложнений облучения.

4. Установить частоты генетических маркеров, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний в

группах лиц, подвергшихся хроническому низкодозному радиационному воздействию, а также в группах клинического и популяционного контроля.

5. Охарактеризовать распределение аллелей, ассоциированных с повышенной или пониженной чувствительностью к радиационному воздействию, как фактору риска развития осложнений в исследованных группах сравнения, дать популяционно-генетическую характеристику обнаруженных отличий.

6. Разработать генодиагностические лабораторные тест-системы для генотипирования иммуногенетических локусов и молекулярно-генетической оценки эффективности подавления экспрессии генов вируса гепатита С, а также для установления маркеров повышенного риска развития реакции гиперчувстительности, ассоциированной с приемом антиретровирусных препаратов.

7. Разработать новый подход в области мониторинга противоинфекционного иммунитета реципиентов почечного трансплантата в целях профилактики развития инфекционных осложнений, в том числе ведущих к летальному исходу.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Впервые проведен комплексный анализ распределения аллельных вариантов генов CCR5, CCR2, SDF1, НСР5, HLA-C, определяющих устойчивость к ВИЧ-инфекции, динамику прогрессирования ВИЧ-инфекции в СПИД и возможность контроля вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции в выборках из 12 популяциий, проживающих на территории России и сопредельных государств; дана характеристика генетической структуры популяций. Оценена относительная опасность развития СПИД (OOP) и смерти в результате СПИД (ООС) в исследованных популяциях для носителей аллельных вариантов, ассоциированных с динамикой прогрессирования СПИД. Проведен анализ данных, позволяющий определить уровень межэтнической гетерогенности в распределении исследованных маркеров. Результаты рассмотрены с точки зрения молекулярной эпидемиологии, фундаментальной иммунологии и популяционной генетики.

Впервые продемонстрирована ассоциация иммуногенетических маркеров системы HLA класса II с риском развития онкопатологий в группах лиц, подвергшихся радиационному воздействию. Проведен анализ иммунологических

основ формирования индивидуальной реакции человека на облучение. Полученные данные позволяют по-новому оценить роль главного комплекса гистосовместимости в реализации защитных функций организма человека в ответ на цитотоксическое и мутагенное воздействие радиации.

Показаны достоверные отличия в распределении аллельных вариантов генов ATM (rsl801516, rs664677), OGGi (rsl052133), XRCC1 (rsl799782) в группах лиц, подвергшихся хроническому низкодозному радиационному воздействию по сравнению с группами клинического и популяционного контроля.

Полученные данные служат теоретической основой для создания нового подхода к оценке индивидуальной реакции на радиационное воздействие. Данные о частотах распределения клинически значимых генетических маркеров могут быть использованы при проведении клинико-статистических исследований и оценке онкологического риска.

Проведена оценка распределения аллелей HLA-B*57:01 и HLA-DRB*01, ассоциированных с развитием острых осложнений у ВИЧ-инфицированных лиц, принимающих ингибиторы протеазы ВИЧ Абакавир (Abacavir) и Невирапин (Nevirapine), в российской популяции (N=800) и продемонстрирована эффективность метода количественной ПЦР с обратной транскрипцией при разработке антисмысловых препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.

С помощью количественных ПЦР-тест-систем для экспресс-скрининга возбудителей латентных вирусных инфекций, ' показана возможность контролирования уровня вирусной нагрузки в условиях постгрансплантационной терапии в клинике трансплантации органов. Охарактеризована представленность вирусных инфекций, являющихся основным фактором риска развития тяжелых инфекционных осложнений. Показано, что из числа исследованных условно-патогенных вирусов наиболее часто встречающимся у реципиентов почечного трансплантата является вирус TTV. Такая распространенность делает его перспективным маркером, способным отражать эффективность применяемой терапевтической схемы.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Разработаны и внедрены в лабораторную практику тест-системы для определения однонуклеотидных полиморфизмов CCR5delta32 rs333, CCR2-641 rs 1799864, SDF1-3 'A rsl801157, HCP5 rs2395029 и HLA-C rs9264942 методом ПЦР в реальном времени. Тест-системы просты в использовании, экономичны, обладают высокой пропускной способностью и полностью адаптированы к производимому в Российской Федерации оборудованию. Это создает потенциал для использования данных тест-систем в клинической практике, в качестве инструмента для оценки предрасположенности человека к ВИЧ-инфекции. Полиморфизм исследованных генов иммунной системы обеспечивает межпопуляционные различия в устойчивости к ВИЧ-инфекции.

Разработаны и внедрены в лабораторное производство генотипирующие ПЦР-тест-системы для выявления аллелей генов ATM (rsl801516, rs664677), TGFBI (rs 1800469), XRCC1 (rsl799782), OGG1 (rsl052133), IL-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135). Данные маркеры играют важную роль в механизмах канцерогенеза, а также восстановления и адаптации организма после генотоксического воздействия и могут быть использованы при комплектации панелей молекулярно-генетических тестов в области практической иммуногенетики и онкологии.

Разработанная методика также перспективна для формирования комплексного подхода к определению риска развития отдаленных последствий радиационного воздействия. При определении таких рисков должны учитываться генетические факторы, ассоциированные с повышенной или пониженной чувствительностью к радиационному воздействию. Эти параметры могут использоваться для оптимизации радиационной защиты.

Полученные данные об эффективности противовирусных препаратов дают основания для продолжения клинических исследований, как в области индивидуального мониторинга эффективности терапии в посттрансплантационный период, так и в области создания новых средств борьбы с вирусными инфекциями. В свою очередь, данные об индивидуальной непереносимости ингибиторов протеаз ВИЧ могут служить основанием при принятии решения о целесообразности внедрения и безопасности назначения препаратов на их основе в России.

Результаты исследования могут быть включены в научно-методические программы для студентов медицинских ВУЗов, а также в образовательные программы учреждений высшего профессионального и последипломного образования.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Впервые в отечественной практике проведено комплексное популяционно-гентическое исследование по установлению особенностей распределения аллельных вариантов, определяющих устойчивость человека к ВИЧ-инфекции, динамику прогрессирования ВИЧ-инфекции в СПИД и возможность контроля вирусной нагрузки при ВИЧ-инфекции; обобщены популяционно-генетические данные по распространению делеционного полиморфизма CCR5delta32.

2. Предложен и реализован подход к исследованию механизмов генетического контроля восстановления и адаптации организма в условиях хронического низкодозного радиационного воздействия. В результате анализа частот аллелей генов системы HLA класса II установлена ассоциация группы аллелей HLA-DRB1 *11 и подтверждена ассоциация SNP-маркера rsl799782 гена XRCC1 с формированием фенотипа, характеризующегося повышенной предрасположенностью к развитию онкопатологий. Установлены достоверные отличия в распределении аллельных вариантов генов ATM (rs 1801516, rs664677) и OGG1 в группах лиц, подвергшихся хроническому низкодозному радиационному воздействию по сравнению с группами клинического и популяционного контроля.

3. Разработан генодиагностический подход к оценке противоинфекционного иммунитета в клинике трансплантации органов, основанный на мониторинге показателей вирусной нагрузки.

4. Установлены частоты аллелей HLA-B*57:01 и HLA-DRB*01, ассоциированных с развитием острых осложнений у ВИЧ-инфицированных лиц, принимающих препараты Абакавир и Невирапин.

5. Метод ПЦР в реальном времени эффективен при отборе антисмысловых препаратов, обладающих наибольшей противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Результаты работы доложены на III Съезде Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова (2005, Москва), XVIII и XIX зимней молодежной научной школе ИБХ РАН (2005, Москва; 2007, Москва), конференции Genomics, Proteomics, Bioinformatics and Nanotechnologies for Medicine (2006, Новосибирск), Международной конференции «Генетика в России и мире, посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н. И. Вавилова РАН» (2006, Москва), конференции Human Genome Meeting (2006, Хельсинки, Финляндия), VI Съезде аллергологов и иммунологов СНГ (2006, Москва), на 16 европейском конгрессе по иммунологии (2006, Париж, Франция), 21 и 24 Европейской конференции по иммуногенетике и гистосовместиммости (2007, Барселона, Испания; 2010, Флоренция, Италия), I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика» (2010, Москва, Россия), на семинаре по урегулированию радиационной безопасности и медицинскому аварийному реагированию в случае аварий при транспортировании радиоактивных веществ (2011, Сочи, Россия), на III Европейском совещании «Successful R&D in Europe» (2011, Дюссельдорф, Германия), VII Международном ядерном форуме «Безопасность ядерных технологий: транспортирование радиоактивных материалов - «Атомтранс - 2012» (2012, Санкт-Петербург, Россия), научно-практической конференции ФМБА России «Медицинское обеспечение работников ядерно-энергетического комплекса, химических производств, предприятий водного транспорта» (2012, Саратов, Россия), II Российском конгрессе с международным участием «Молекулярные основы клинической медицины» (2012, Санкт-Петербург), 16 рабочем совещании и совместной конференции Европейской федерации иммуногенетиков и британского общества гистосовместимости и иммуногенетики (2012, Ливерпуль, Британия), на 19 международном симпозиуме по вирусу гепатита С и ассоциированным заболеваниям (2012, Венеция, Италия).

ПУБЛИКАЦИИ

По материалам диссертации опубликовано 46 печатных работ, из них 14 статей в 10 научных изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки для публикации

материалов докторских и кандидатских диссертаций («Иммунология», «Российский аллергологический журнал», «Доклады Академии наук», «Молекулярная биология», «Генетика», «Кардиология», «Молекулярная медицина», «Прикладная биохимия и микробиология», «Микробиология», «Ядерная и радиационная безопасность»), 7 статей в научных журналах, 1 монография, 24 публикации в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Результаты работы использованы в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, ЗАО «НПФ ДНК-Технология», ФГБУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского» РАМН.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 237 страницах машинописного текста, содержит 36 таблиц, 21 рисунок. Диссертация включает главы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», а также два приложения. Библиография включает 435 источников, в том числе 42 отечественных и 393 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Образцы, использованные в работе

В рамках работы по установлению особенностей популяционного распределения аллелей, ассоциированных с устойчивостью и чувствительностью к ВИЧ-инфекции, были обследованы 1120 здоровых (ВИЧ-серонегативных), взрослых представителей 12 этнических групп, не связанных кровным родством, проживающих в определенных регионах России, Белоруссии, Украины, Казахстана, Кыргызстана и Молдовы (рис. 1). Образцы крови для исследования были получены из Медико-генетический научного центра РАМН (Москва), Северного Государственного медицинского университета (Архангельск), Ижевской государственной медакадемии, Вологодской областной больницы, Кировского НИИ гематологии и переливания крови, Института медицинских проблем Севера СО РАМН (Красноярск) и ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

(Москва). Образцы собраны с соблюдением процедуры информированного согласия и учетом данных о предках двух поколений.

Рис. 1. Географическое расположение исследованных популяций.

I. поморы, 2. русские (Вологодская область), 3. русские (Псковская область), 4. белорусы, 5. украинцы, 6. гагаузы, 7. удмурты, 8. татары, 9. чеченцы, 10. казахи,

II. киргизы, 12. тувинцы.

В рамках работы по установлениию частот генетических маркеров, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний, в группах лиц, подвергшихся хроническому низкодозному радиационному воздействию, а также в группах клинического и популяционного контроля были исследованы образцы геномной ДНК, выделенной из образцов крови 220 человек, полученных квалифицированным медицинским персоналом в рамках плановых медицинских осмотров на базе региональных МСЧ ФМБА России.

В первую группу (группа Ы1) вошли 70 образцов геномной ДНК из коллекции Уральского научно-практического центра радиационной медицины, полученных от неродственных пациентов - жителей прибрежных сёл р. Теча, подвергшихся длительному комбинированному облучению: внешнему у-облучению и внутреннему, обусловленному инкорпорацией 903г в костную ткань. Медиана накопленной дозы на

красный костный мозг составляла 1,23 Зв. Обследованные лица не имели серьёзной соматической патологии и прожили более 60 лет от начала облучения.

Во вторую группу (группа RS) вошли 50 образцов ДНК, полученные от индивидуумов с клиническими признаками соматической патологии. Образцы собраны в ходе проспективного обследования персонала предприятий атомной промышленности, проводимого ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

В третью группу (группа сравнения Р — популяционный контроль) вошли образцы ДНК, полученные от 100 здоровых представителей русской популяции -доноров первичной кроводачи из коллекции ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, собранной на базе ФГБУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского» РАМН. Группу составили индивидуумы, проживающие на территории Центрального, Южного, Волжского, Уральского и Северного-западного федеральных округов РФ.

Лица, принимавшие участие в исследовании, посвященному установлению частот генетических маркеров, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к развитию осложнений радиационного воздействия, были проинформированы о проведении исследования и дали согласие на использование образцов биологического материала и обработку клинических данных.

Материалом для апробации ПЦР-тест-систем для мониторинга вирусных инфекций у пациентов клиники органной трансплантации служили образцы мочи и периферической крови, поступившие из отделения трансплантации почки ФГБУ «Российский научный центр хирургии им. акад. Б.В. Петровского» РАМН. За период с сентября по ноябрь 2007 года было собрано 183 образца крови и 165 образцов мочи от 137 человек. В течение указанного времени осуществлялся мониторинг образцов крови для 32 пациентов и мочи для 24 пациентов.

Очистка нуклеиновых кислот

Очистку ДНК проводили методом высаливания по стандартной процедуре [Miller S.A., et al. 1988] или протеиназным лизисом с последующей очисткой фенольно-хлороформным методом.

Разработка тест-систем

Генотипирование образцов проводили методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с детекцией накопления продуктов реакции «в реальном времени» или методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с оценкой температуры плавления дуплексов синтетических аллель-специфичных проб и ДНК-мишени в режиме реального времени (рис. 2, 3). Точность использованных систем была подтверждена повторным генотипированием выборки образцов методом секвенирования по Сэнгеру [Sanger F. et al., 1975].

Для количественной оценки вирусной нагрузки была использована модификация метода, основанная на детекции накопления продукта реакции с помощью линейных гидролизующихся проб [Ребриков Д.В. с соавт. 2009].

А Б

Рис. 2. Графики накопления ДНК, полученные с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»), А - результат исследования гомозиготного образца. Темная кривая соответствует накоплению продукта реакции с частично некомплементарного праймера; Б - результат исследования гетерозиготного образца.

Определение чувствительности разработанных тест-систем проводили методом серийных десятикратных разведений в диапазоне от 1х102 до 1х107 копий на мл образца [Ребриков Д.В. с соавт. 2009]. В качестве стандарта использовали плазмиду со специфической вставкой известной концентрации, разведенную в ТЕ-буфере. Расчет эффективности ПЦР проводили с помощью программы ДТ-96 у.7.3. На рисунке 4 приведен пример определения эффективности ПЦР путем построения стандартной кривой. Анализ показал, что все тест-системы способны детектировать вирусную ДНК в линейном диапазоне от 1х103 до 1х107 копий геномов на мл с

эффективностью более 93%. Чувствительность систем составила 300 копий на мл образца.

Поскольку на эффективность амплификации могут влиять неспецифические нуклеиновые кислоты находящихся в образце, мы провели сравнение стандартных кривых, полученных по результатам анализа плазмид, разведенных в чистом ТЕ-буфере и в ТЕ-буфере, содержащем ДНК CMV, EBV, HHV-6, HSV, ВК, JC и TTV-негативных индивидуумов. Сравнение кривых показало, что разработанные тест-системы практически невосприимчивы к неспецифической ДНК (данные не приведены).

А Б

Рис. 3. Кривые плавления ДНК-дуплексов, полученные с помощью детектирующего амплификатора ДТ-96 (ЗАО «НПФ ДНК-Технология»), А - результат исследования гомозиготного образца. Светлая кривая отражает динамику денатурации частично некомплементарного праймера; Б - результат исследования гетерозиготного образца.

4540 - ЭФФекл ивность ПЦР ОТКЛ.......С 4ации. 1 93 <W>

...........^t N Сред Д остов« ё'ё keäa рность i этичное ппрокси г°099 Щ

30 «Сц

30 ut

1 <) 1 Э 3 4 3 б 7

1_О(|10(Концент|>ацпя)

Рис. 4. Стандартная кривая, построенная по результатам ПЦР в реальном времени (тест-система для выявления генетического материала СМУ). Для построения ] кривой использована серия разведений стандарта в диапазоне концентраций от 103 до 1х107 копий геномов на мл. По оси "У" отложены значения пороговых циклов; по оси «X» концентрация ДНК (геном эквивалентов на реакцию).

Для подтверждения специфичности разработанных тест-систем сравнивали результаты по 20 положительным (CMV, EBV, HHV-6, HSV) и 20 отрицательным клиническим образцам, охарактеризованным ранее методом иммуноферментного анализа. Анализ ПЦР-систем для генодиагностики вирусов ВК, JC и TTV не проводили из-за отсутствия охарактеризованного клинического материала. Все системы продемонстрировали 100% специфичность в отношении исследованных образцов.

Создание экспрессионной плазмиды с фрагментами генома вируса гепатита С

Целевые последовательности генома вируса гепатита С были клонированы в плазмидный экспрессионный вектор, под один промотор с репортерным геном EGFP. Благодаря этому удалось получить экспериментальную экспрессионную конструкцию, позволяющую оценить эффективность ингибирования фрагментов РНК-генома гепатита С в клетках эмбриональной почки человека НЕК293Т (рис. 3).

CMV-промотор HCV EGFP

HZ....................I ...........I

Линкер

Рис. 3. Схематическое изображение синтетической конструкции, включающей CMV-промотор, фрагмент генома вируса гепатита С и последовательность репортерного белка EGFP.

Статистическая обработка данных

Частоту аллелей вычисляли по формуле:

/= n/2N,

где п - встречаемость аллеля.

Статистическую оценку результатов проводили с помощью критерия х2 с уровнем достоверности р<0,05 [Petrie А., Sabin С., 2009]. Расчет OOP и ООС проводили по формуле:

ООР(ООС) = Z W/p/,

где pi - частота встречаемости данной комбинации аллелей, a w, - коэффициент РР (относительного риска развития СПИД) или PC (относительного риска смерти в результате СПИД) для данной группы (табл. 1) [по данным Winkler С., et al. 1998].

Табл. 1. Возможные варианты генотипов по трем исследованным локусам, объединенные в четыре группы, каждой из которых соответствует общий коэффициент относительного риска развития СПИД (РР) и смерти в результате СПИД (PC). А, В и С - не протективные аллели генов CCR5, CCR2, и SDF1, соответственно; a, b и с — протективные аллели соответствующих генов. Прочерк означает любой из аллелей.

Генотип Возможное число генотипов РР PC

ААВВС- 2 1.0 1.0

а-Ь-С-

а-ВВС- 16 0.65 0.6

ААЬ-С-

ААВВсс 1 0.63 0.23

а-Ь-сс

а-ВВсс 8 0.55 0.0

ААЬ-сс

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Установление особенностей распределения маркеров генетически обусловленной предрасположенности человека к ВИЧ-инфекции/СПИД

Всплеск интереса к проблеме индивидуальной и популяционной устойчивости и восприимчивости к ВИЧ-инфекции/СПИД привел к появлению данных об отдельных вариантах генов, которые могут быть использованы в качестве надежных генетических маркеров устойчивости к заболеванию. Так, изучение ранних стадий инфицирования клеток хозяина привело к установлению роли некоторых клеточных рецепторов в механизме развития ВИЧ-инфекции/СПИД. На сегодняшний день наиболее изучен механизм развития заболевания, основанный на взаимодействии вируса с хемокиновыми рецепторами CCR5 и CXCR4 [Fauci A. et al., 1996; Dean М, et al., 1996]. Изменения в генах, кодирующих эти рецепторы, или в генах их мишеней, могут оказывать влияние на динамику развития заболевания (рис. 5).

SDF-

др120-ШЬ gp120-afc.- " Mlp-lp ' T i i RANTES

is --- if'- -----"

, M,

Г (

CD4 CCR5 CD4 CCR5

CD4CXCR4 CD4 CXCR4

Х4-ВИЧ1- блок Х4-ВИЧ1-инфекция инфекции

R5-BH41- блок R5-BH41-инфекция инфекции

Рис. 5. Схема блокирования инфекции клеток Х4 и R5 штаммами ВИЧ. Хемокин SDF1, служащий лигандом для рецептора CXCR4 блокирует инфекцию Х4-тропными штаммами ВИЧ по принципу конкурентного ингибирования. В свою очередь отсутствие рецептора CCR5 на поверхности клетки (результат делеции CCR5delta32) блокирует проникновение в клетку R5-TponHbix штаммов.

О делеции CCR5delta32, определяющей устойчитвость к ВИЧ-инфекции было сказано выше, однако полиморфизмы в генах других хемокиновых рецепторов так же могут оказывать влияние на устойчивость к заболеванию. Показано, что мутация, приводящая к замене валнна на изолейцин в первом трансмембранном домене рецептора - CCR2 (полиморфизм CCR2-64I), продлевает период между инфицированием и развитием симптомов СПИД [Ioannidis J.P., et al. 2001].

Еще одним фактором, относящимся к системе хемокинов и влияющим на устойчивость к ВИЧ, служит мутация в гене, кодирующем хемокин SDF1 (лиганд для рецептора CXCR4). У ВИЧ-инфицированных, несущих эту мутацию, позже проявляются симптомы СПИД. Протективный эффект этой мутации, в отличие от предыдущих двух, наследуется по рецессивному типу и ассоциирован с увеличением продолжительности жизни ВИЧ-инфицированных с симптомами СПИД. Наибольшее снижение риска связано с сочетанием гомозиготности по SDF1-3 'А и наличием хотя бы одного протективного аллеля по генам CCR2 и CCR5 [Winkler С., et al. 1998].

Кроме того, проведенное недавно геномное ассоциативное исследование привело к установлению SNP-полиморфизмов rs9264942 и rs2395029, расположенных в генах HLA-C и НСР5 и достоверно ассоциированных с эффектом

контролирования вирусной нагрузки у носителей минорных аллелей этих генов [Ре11ау I. ¡А а1., 2007].

Если учесть, что рассматриваемые полиморфизмы по-разному распределены в различных популяциях, можно говорить о различной естественной устойчивости к ВИЧ/СПИД в различных регионах. Этот факт отчасти может объяснять гетерогенность эпидемических показателей, а также может стать основой для разработки комплексного подхода к проблеме оценки естественной устойчивости к ВИЧ. Сравнительный популяционно-генетический анализ - наиболее адекватный способ оценки вклада наследственной составляющей в формирование устойчивости или восприимчивости популяций к ВИЧ/СПИД. В связи с этим была проведена работа по установлению встречаемости и особенностей распределения протективных генотипов и гаплотипов на территории бывшего СССР.

С помощью разработанных тест-систем были определены генотипы представителей 10 популяций по полиморфным локусам: СС115с1еНа32, ССК2-641 и ЖРУ-5 'А, а также представителей 5 популяций по локусам НСР5 гб2395029 и НЬА-С гб9264942. Результаты приведены в таблице 2 и 3.

В ходе исследования было установлено, что аллель СС115с1еиа32 наиболее представлен в выборке поморов. Здесь высока доля гомозиготных генотипов, связанных с пониженным риском инфицирования ВИЧ, а также гетерозиготных генотипов ассоциированных с положительной динамикой течения заболевания.

В изученных восточно-европейских популяциях частота аллеля ССИ5<1еиа32 совпадает со средними значениями, характерными для центральной Европы. Аллель одинаково представлен в выборках украинцев, русских из Вологодской области и гагаузов.

Наименьшая частота протективного аллеля ССЯ5ёе1(а32 была отмечена в популяциях тувинцев, казахов, киргизов и чеченцев (центрально-азиатская и северокавказская группы). Казахи и киргизы принадлежат южно-сибирской этнической группе сформированной с участием европеоидной и монголоидной рас, а тувинцы являются представителями монголоидной расы. В этих случаях представленные данные соотносятся с результатами проводимых ранее исследований, демонстрирующих низкую распространенность варианта ССЯ55с1еиа32 в популяциях азиатского региона [Би В., е! а1. 2001]. В выборках чеченцев, татар и

удмуртов отмечены пониженные частоты аллеля ССЯ5йеЫаП по сравнению с восточно-европейскими, что укладывается в общую картину распределения аллеля в популяциях Евроазиатского региона.

Таким образом, распределение аллеля ССК5йеИа32 в изученных регионах, также как и в изученных ранее популяциях Европы и Азии, характеризуется отрицательным градиентом в направлении с севера на юго-восток (рис.6).

Гетерогенность распределения протективного аллеля ССЯ5с1еНа32 на территории изученных регионов связана, в первую очередь, с участием европеоидного и монголоидного компонентов в этногенезе народов, проживающих на территории России. Полученные нами результаты подтверждают и дополняют существующие данные молекулярно-генетического анализа пространственной структуры генофонда восточно-европейских и центрально-азиатских народов [Лимборская С.А. с соавт. 2002].

Табл. 2. Встречаемость генотипов по локусам ССК5йека32, ССК2-641и.5РР1-3 'А.

Популяция п Частота генотипов (%) ССЯ5 Частота генотипов ССК2 (%) Частота генотипов БОП (%)

+/+ +Ш с1е11с1е1 ею в/А А/А ею О/А А/А

Поморы 96 67 30 . 3 82 18 0 69 28 3

Вологодцы 96 79 21 0 83 17 0 69 28 3

Гагаузы 96 78 20 2 76 23 1 60 33 7

Украинцы 96 77 21 2 82 16 2 68 30 2

Татары 96 88 И 1 89 И 0 72 28 0

Удмурты 96 87 13 0 88 11 1 72 26 2

Чеченцы 96 94 6 0 72 23 5 64 36 0

Казахи 96 94 6 0 45 47 8 78 21 1

Киргизы 96 95 5 0 54 38 8 76 24 0

Тувинцы 96 98 2 0 91 9 0 69 28 3

Табл. 3. Встречаемость генотипов по локусам НСР5 rs2395029 и HLA-C rs9264942.

Популяция п Частота генотипов (%) НСР5 ) Частота, генотипов (%) HLA-C

G/G G/T Т/Т С/С С/Т ТАГ

Поморы 80 0 5 75 10 41 29

Вологодцы 80 0 3 77 10 39 31

Псковичи 80 0 5 75 9 36 35

Украинцы 80 0 4 76 13 39 28

Белорусы 80 0 3 77 14 37 29

Рис. 6. Распределение частот аллеля CCR5delta32 характеризуется градиентом в направлении с севера на юго-восток, с максимальной частотой в популяции поморов.

Протективный эффект изученных вариантов генов CCR5, CCR2, и SDF1 носит кумулятивный характер. Наличие в конкретном геноме каждого дополнительного аллеля понижает риск развития СПИД и смерти в результате СПИД. На основе частот трехлокусных генотипов в изученных популяциях рассчитаны значения относительной опасности развития СПИД у ВИЧ-инфицированных (OOP) и смерти от СПИД (ООС). Данные представлены на рисунках 7 и 8.

В рассмотренных нами выборках значения OOP и ООС попадают в интервал 0.79-0.94 и 0.76-0.93, соответственно. В целом они соответствуют данным,

полученным для других европейских и азиатских популяций. Широкое распространение аллеля CCR2-64I в центрально-азиатской группе обусловило пониженные значения OOP и ООС. Напротив, в выборке тувинцев и популяциях Волго-Урапьской группы относительный риск демонстрирует повышенные значения, что связано с низкой частотой протективных аллелей CCR5delta32 и CCR2-641. У восточно-европейских народов и выборки чеченцев выявлен средний уровень OOP и ООС. Можно предположить, что в первом случае оказывает влияние распространенность варианта CCR5delta32, а во втором - CCR2-64I.

0,95 -0,9 0,85 0,8 -0,75 0,7

Й А А А

л з-

л X л X Ф s Ьй О а X га т л « 5 I—

0) S О га Q.

У CD га а. а. g с £

т > о S

Л О. О 2 О П

Рис. 7. Относительная опасность развития СПИД (OOP) у ВИЧ инфицированных индивидуумов в исследованных популяциях.

0,95 •

0,9 •

0,85 ■

0,8 ■

0,75 ■

0,7 •

Щд

О- Ь

га О.

S Г

ь §

0) X

с; о

Рис. 8. Относительная опасность смерти в результате СПИД (ООС) у инфицированных индивидуумов в исследованных популяциях.

)

На сегодняшний день отсутствуют данные о совместном влиянии изученных аллелей генов CCR2 и SDF1 и аллелей НСР5 rs2395029 и HLA-C rs9264942 на течение заболевания. Однако продемонстрирована независимость протективного эффекта, связаного с носительством аллелей НСР5 rs2395029 и HLA-С rs9264942 и аллеля CCR5delía32. Кроме того носители обоих изученных аллелей генов НСР и HLA-C характеризуются повышенной устойчивостью к развитию СПИД [Manen D. et al., 2009]. На основании коэффициентов РР и PC, предложенных Mannen с соавторами были рассчитаны индивидуальные риски OOP и ООС для исследованных выборок. Значения рисков варьировали в диапазоне 0,64-0,66 и 0,68-0,71, соответственно.

Полученные данные о частотах встречаемости SNP, рисках ООС и OOP могут быть использованы при проведении популяционно-генетических и молекулярно-эпидемиологических исследований, направленных на определение вклада генетического фактора в этиологию и патогенез ВИЧ в русской популяции. Для подобных исследований наличие информации о генетическом профиле контрольной группы (как правило, здоровых индивидов) достаточного объема, является залогом адекватного проведения статистической обработки и корректного результата исследования в целом. На индивидуальном уровне данные о генотипе ВИЧ-инфицированных лиц могут использоваться для оценки эффективности и корректировки применяемой терапии.

Новый подход к снижению вероятности развития радиационно-ассоциированных онкопатологий в группах повышенного риска. Роль генов иммунного ответа в развитии отдаленных последствий радиационного воздействия.

Еще одним аспектом применения современных технологий иммуногенетипирования и генодиагностики является установление связи наследуемых признаков с особенностями реакции организма на внешние воздействия (в том числе физической и химической природы), а также риском развития их осложнений. Значительный практический интерес в данной области представляет изучение влияния ионизирующего излучения на организм человека.

Развитие атомной промышленности, а также методов радиационной медицины приводит к расширению сферы контактов человека с источниками радиации. Установлено, что ионизирующее излучение является причиной многочисленных осложнений и, в частности, повышает риск развития злокачественных новообразований и нарушения функции сердечно-сосудистой системы. Кроме того известно, что реакция тканей на одинаковые дозы радиации, а также тяжесть негативных последствий облучения варьируют на индивидуальном уровне.

Негативные эффекты радиационного воздействия могут быть диагностированы месяцы или даже годы спустя после контакта с источником радиации и проявляться в виде различных патологических нарушений. Значительный интерес представляет механизм развития злокачественных новообразований на фоне низкоинтенсивного облучения. Риск развития этих осложнений определяется действием многих факторов, как внешних, так и внутренних, обусловленных особенностями метаболизма и фактором естественной наследуемой (генетической) предрасположенности к заболеванию.

В ходе исследования ассоциации наследуемых факторов с риском развития радиационно-ассоциированных патологий были разработаны тест-системы для определения кандидатных генетических маркеров, которые могли бы войти в диагностическую панель, позволяющую оценивать генетически обусловленную чувствительность тканей к радиовоздействию. Наиболее удобным маркером с точки зрения технологии и стоимости анализа являются SNP. SNP эволюционно стабильны, достаточно распространены и почти всегда биаллельны, что позволяет легко адаптировать технологию генотипирования к использованию в лечебных учреждениях и диагностические центрах.

В панель кандидатных маркеров вошли И SNP, расположенных в генах ATM (rsl801516, rs664677), TGFB1 (rs 1800469), A7?CC7(rsl799782), OGG1 (rsl052133), 1L-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135), в интроне 8q24 на 8 хромосоме (rs9642880, rs6983267, rsl447295, rsl3281615), а также 34 группы аллелей генов HLA-DRB1, DQA1 и DQB1. Продукты выбранных генов являются важными компонентами системы репарации ДНК, энергетического обмена, метаболизма липидов и поддержания постоянства катионно-анионного состава. Маркеры из локуса 8q24 были отобраны нами на основании данных ассоциативных геномных исследований,

подтверждающих их ассоциацию с повышенным риском развития злокачественных новообразований [www.genome. gov/gwastudies]

С помощью разработанных генодиагностических ПЦР-тест-систем были определены частоты встречаемости кандидатных SNP-маркеров в группах сравнения. Генотипирование по 34 группам аллелей генов HLA-DRB1, DQA1 и DQB1 проводили с помощью тест-систем, предоставленных ЗАО «НПФ ДНК-Технология». Тест-системы позволяют в режиме реального времени определять варианты генов HLA на уровне групп аллелей.

Из 11 SNP-маркеров, взятых в исследование, для четырех (rs 1801516, rs664677, rsl052133, rsl799782) в сравниваемых группах обнаружены различия в распределении (рис. 9). Минорный аллель Т варианта Aspl853Asn гена ATM (rs 1801516) реже встречается в группе RR, чем в группе Р. В то же время частота минорного аллеля Т варианта IVS22-77 (rs664677) того же гена в группе RR выше.

Еще одно отличие обнаружено для минорного аллеля G варианта Ser326Cys, расположенного в 326 кодоне гена OGG1 (rsl052133). Наличие протективного эффекта для этого маркера описывалось ранее [Агеева A.M. и соавт., 2007]. В группе RS установлено единственное отличие в распределении аллеля А гена XRCC1 (rsl799782). Частота аллеля А в данной группе достоверно ниже, чем в двух других исследованных группах. В данном случае полученные нами результаты подтверждают установленную ранее ассоциацию маркера rs 1799782 с онкозаболеваниями [Mangoni М. et al. 2011]. В настоящее время представления о роли конкретных аллелей гена XRCC1 в формировании предрасположенности к онкозаболеваниям противоречивы. Разными научными коллективами получены данные как о прямой, так и об обратной связи аллеля А с риском развития злокачественных новообразований. Результаты, полученные в настоящей работе, служат вкладом в дальнейшее развитие представлений о роли гена XRCC1 в механизме канцерогенеза.

Из 34 исследованных групп аллелей HLA класса II единственная достоверная ассоциация с признаком устойчивости к радиационному воздействию установлена для HLA-DRB1*]] (рис. 10). Помимо этого, нами обнаружены группы аллелей в генах HLA-DRB1 и HLA-DQB1, перспективные для дальнейшего исследования в более широких выборках. О значимости дальнейших исследований распределения

этих маркеров позволяют судить установленные тенденции к равномерному повышению или понижению представленности аллелей в ряду исследованных групп. Данные по распределению аллелей НЬА класса II в группах индивидуумов с повышенной или пониженной устойчивостью к радиации получены впервые.

В Группа клинического контроля (N=50) 1 I Группа популяционного контроля (N=100) В Группа радиорезистентных лиц (N=70)

АТМ (ГБ664677)

ХКСС1 (ге1799782)

Н1АО(ЧВ1*11

(гб1052133)

Гены систем репарации ДНК и регуляции клеточного цикла Ген иммунного

Рис. 9. Результаты исследования частот генетических маркеров, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к развитию онкологических заболеваний в группах лиц, подвергшихся хроническому низкодозному радиационному воздействию, а также в группах клинического и популяционного контроля.

ШШ 1«

Рис. 10. Отличия в распределении групповых специфичностей НЬА в исследованных группах.

Представленные данные позволяют говорить о влиянии генетического фактора на формирование индивидуальной радиочувствительности. Отличия в распределении маркеров, расположенных в генах репарации ДНК, подтверждают принципиальную роль компонентов этой системы в ответе тканей на радиовоздействие. Наличие достоверных отличий даже на уровне десятков образцов определяет целесообразность дальнейших исследований. Особенно интересным представляется вопрос установления популяционно-специфических отличий в распределении маркеров устойчивости и чувствительности к радиационному воздействию. Так, например, частота аллеля НЬА-ОЯВ! *11 варьирует в популяциях европейского и азиатского происхождения (табл. 4).

Табл. 4. Сравнение частот распределения групповой специфичности НЬА-ОКВ1*11 у представителей популяций европейского и азиатского происхождения [по данным сайта http://www.allelefrequencies.net].

Популяция Частота II¿Л-ПЯВ1*11

Япония 0,04

Россия 0,04

Южная Корея 0,04

Пекин 0,05

Ливерпуль 0,05

Архангельск 0,06

Австралия 0,08

Витебск 0,15

Дели 0,17

Иран 0,17

Смоленск 0,17

Львов 0,19

Центральная Италия 0,27

Северная Греция 0,28

Разработка нового подхода к мониторингу вирусной инфекции у взрослых реципиентов почечного трансплантата

Клиническая диагностика инфекций, развивающихся у реципиентов органов или клеток на фоне иммуносупрессивной терапии, является важной задачей современной трансплантологии. Общей особенностью рассмотренных в исследовании патогенов, является то, что, встречаясь в латентной форме у

большинства людей, они способны вызывать активацию инфекции у реципиентов трансплантата. Осложнения, ассоциированные с вирусными инфекциями, могут варьировать от умеренных до тяжелых (гепатит, пневмония, энцефалит, заболевания желудочно-кишечного тракта и др.) [Silkensen J.R., 2000]. Возникновение и тяжесть инфекционных осложнений являются следствием нарушения функции иммунной системы, вызванного иммуносупрессивной терапией. Дополнительными факторами риска, связанными с осложнениями иммуносупрессивной терапии, являются аутоиммунные заболевания [Yoon Н.Е., Yang C.W., 2009], а также медицинские вмешательства, ведущие к нарушению барьерных эпителиев (инъекции, катетеры, зонды).

Снижение вирусной нагрузки у пациентов возможно как за счет ослабления иммуносупрессии, так и путем введения в схему лечения противовирусных препаратов. Использование противоинфекционных препаратов часто становится причиной грибковых и других суперинфекций, при этом ослабление иммуносупрессии значительно повышает риск отторжения транспланта в связи с активацией эффекторных клеток [Massih R.C.A., Razonable R.R., 2009; Walsh Р.Т., 2004]. Баланс между иммуносупрессивными и противоинфекционными компонентами схемы ведения реципиентов транспланта труднодостижим и требует постоянного наблюдения за пациентом.

Таким образом, качественный и количественный мониторинг инфекционных агентов, представляющих опасность для жизни пациентов, является необходимым компонентом комплекса мероприятий по предотвращению негативных последствий трансплантации. Мониторинг вирусной нагрузки не только позволит эффективно бороться с инфекцией, но и может сыграть роль своеобразного маркера адекватности применяемой терапии, а также послужить основанием для индивидуальной коррекции схемы ведения пациента в посттрансплантационный период.

Целью данной работы стала разработка комплекса тест-систем, позволяющих осуществлять качественную и количественную диагностику вирусных инфекций (CMV, EBV, HHV-6, HSV, ВК, JC, TTV) в биообразцах реципиентов почечного трансплантата. Другой нашей целью стало исследование применимости показателя вирусной нагрузки в качестве маркера адекватности терапии. В ходе работы нами

было проведено сравнение различных биологических образцов (цельная кровь и моча), как материала для генодиагностики полиомавирусной инфекции.

С помощью метода ПЦР в реальном времени мы провели количественный анализ уровня вирусной ДНК (CMV, EBV, HHV-6, HSV, вирусов ВК, JC и TTV) в цельной крови 32 пациентов в динамике; из них для 24 пациентов в параллели был проведен анализ мочи на наличие полиомавирусов ВК и JC. Кроме того, у 105 реципиентов почечного трансплантата была проведена однократная оценка вирусной нагрузки. Так же, как и в случае с пациентами в динамике количественный анализ полиомавирусов проводили в двух типах биоматериалов - крови и моче. Положительным считали любой образец, для которого был обнаружен достоверный сигнал. При этом количественная оценка для образцов с вирусной нагрузкой менее 1х103 копий геномов на мл (минимальное значение линейного диапазона) не проводилась.

По меньшей мере, один из вирусов был обнаружен в крови 98% пациентов, из них два вируса у 31%, три и более у 6%. Наиболее часто встречающимся является вирус TTV(98%). Интересно отметить, что в единичных случаях отсутствия TTV отсутствуют и любые другие инфекции. В ходе анализа нами не выявлено ни одного случая инфицирования HSV. На рисунке 11 приведены данные по встречаемости вирусов CMV, EBV, HHV-6, BKV, JCV, HSV и TTV у реципиентов почечного трансплантата, изученных в настоящей работе.

0,9 0,В 0,7 0,6 0,5 0,4

0,3 0,2 0,1

п п п

EBV HHV-6 ВК

Рис. 11. Частота встречаемости вирусов в крови реципиентов почечного трансплантата (данные по 137 пациентам).

Поскольку полиомавирусы ВК и ГС локализуются в почках иммунокомпрометированных реципиентов трансплантата (редко в респираторной системе и головном мозге), нами было проведено сравнение количества детектируемых вирусных ДНК в крови и в моче. Результаты анализа представлены в таблице 5. Было выявлено достоверное превышение случаев детекции полиомавирусов в моче по сравнению с кровью.

Табл. 5. Сравнение количества детектируемых вирусных ДНК в крови и в моче 137 пациентов._

Обнаружена ДНК вируса Цельная кровь Моча

п % п %

ВК 5 3,6 39 28,5

ГС 1 0,7 32 23,4

При исследовании ДНК, полученной из образцов мочи 24 пациентов, в 11 случаях была обнаружена ДНК вируса ВК. При этом у 4 человек вирусная нагрузка составляла менее 1х103 копий ДНК вируса/мл образца, а у остальных колебалась в пределах 4х103- 4х107. Интересно, что при рассмотрении этих пациентов в динамике обнаружилось, что в четырех случаях вирусная нагрузка со временем не изменилась и осталась на первоначальном уровне менее 1x103 копий/мл. При этом у двух пациентов с повышенной вирусной нагрузкой количество вирусной ДНК уменьшилось в 50-100 раз, а у пяти увеличилось в 10-100 раз. ДНК вируса 1С была обнаружена у трех пациентов. При этом у двоих из них динамика показателей вирусной нагрузки демонстрировала тенденцию к повышению, а у одного к понижению (табл. 6).

В качестве группы сравнения исследовали образцы мочи, полученные от 17 здоровых доноров. Ни в одном случае не было выявлено присутствие ДНК вируса ВК. При этом ДНК вируса 1С в ряде случаев была выявлена

Табл. 6. Результаты определения вирусной нагрузки (полиомавирусы ВК и ГС) в образцах мочи._

п Положительные Вирусная нагрузка

Менее 10 , Кол-во Кол-во

кол-во не уменьшилось в увеличилось в

изменилось 5-10 раз 10-1000 раз

ВК 24 11 4 2 5

ГС 24 3 0 1 2

Результаты количественного анализа вирусной нагрузки СМУ, ЕВУ, ННУ-6, ВК, 1С и ТТУ в образцах крови 32 пациентов представлены в таблице 7.

Таблица 7. Динамика показателей вирусной нагрузки в образцах крови 32 реципиентов почечного трансплантата. ________

Тест Положи- <10J, <10J, <10J, кол- >10J кол- > ю-1 > 10J кол-

тельные кол-во кол-во во во не кол-во во

не умень- увеличи- измени- умень- увеличи-

измени- шилось, лось лось шилось лось

лось

HHV-6 12 1 0 10 0 1 0

CMV 10 1 5 2 0 1 1

EBV 7 1 3 3 0 0 0

ВК 4 0 4 0 0 0 0

JC 1 1 0 0 0 0 0

TT 32 2 0 1 10 13 6

ДНК вирусов HSV и JC в исследованных образцах крови обнаружено не было. Было выявлено 12 случаев инфицирования HHV-6. 10 из них были впервые детектированы при повторном анализе. Только в двух случаях удалось проследить динамику инфекции: в одном случае количественные показатели вирусной нагрузки были неизменны, и лишь у одного пациента была отмечена положительная динамика. Вирус ВК обнаружили у 4 пациентов в количестве менее 1х103 копий/мл образца. При повторном взятии материала через несколько дней ВК выявлен не был. Вирусы CMV и EBV были обнаружены в крови 10 и 7 пациентов, соответственно. При повторном анализе была отмечена, как положительная, так и отрицательная динамика показателя вирусной нагрузки. При этом следует отметить, что у пациентов с двумя и более вирусными инфекциями изменение вирусной нагрузки практически всегда было однонаправлено. Исключение составляют лишь единичные случаи, когда при общей положительной динамике повторное взятие материала выявляло новую инфекцию (чаще всего HHV-6). Вирус TTV обнаружен у всех пациентов. В силу практически 100% встречаемости, TTV является удобным маркером общего направления динамики показателя вирусной нагрузки.

Таким образом, нами разработан комплекс тест-систем для экспресс-скрининга (3-4 часа) патогенов, способных вызывать реактивацию латентных вирусных инфекций у реципиентов почечного трансплантата. Установлена высокая

чувствительность и специфичность этих систем. ПЦР в реальном времени является по сути единственной на сегодняшний день методикой, позволяющей оценивать количество вирусных частиц. Кроме того, она основана на прямой детекции нуклеиновых кислот и исключает вероятность получения ложноотрицательных результатов.

В ходе исследования нами показано, что наиболее часто встречающимся вирусом у реципиентов почечного трансплантата является вирус ТТУ. Такая распространенность делает его удобным маркером, способным отражать эффективность применяемой терапевтической схемы. Реципиент трнапслантированного органа на протяжении всего послеоперационного периода балансирует между избыточной и недостаточной иммуносупрессией, и состояние равновесия является нестабильным. Иными словами, повышенная вирусная нагрузка может означать чрезмерность иммуносупрессивного компонента терапии, а пониженная свидетельствовать о недостаточной иммуносупрессии и повышенном риске отторжения. В существующих схемах ведения пациентов противовирусный компонент часто компенсируют понижением интенсивности иммуносупрессивной терапии. И в данном случае наличие подобного биологического маркера, а также простого способа его мониторинга могло бы оказать существенную поддержку при разработке индивидуальной схемы лечения.

В частности, из применяемых сегодня многообразных иммуносупрессирующих препаратов, в максимальной степени компрометируют противовирусный иммунитет ингибиторы кальциневрина. С другой стороны известно, что кальциневриновые ингибиторы являются необходимым компонентом иммуносупрессирующего режима в раннем послеоперационном периоде и могут быть исключены из него через 2-3 года после трансплантации.

Таким образом, этот доступный и легко воспроизводимый способ оценки вирусной нагрузки дополняет имеющийся арсенал методов, используемых в трансплантологии для индивидуальной коррекции комбинации иммуносупрессивных препаратов, применяемых на разных сроках после операции.

В ходе выполнения работы показано, что рассмотренные системы дают возможность контролировать уровень вирусной нагрузки в условиях посттрансплантационной терапии в отделении органной пересадки.

Охарактеризована представленность вирусных инфекций, являющихся основным фактором риска развития тяжелых инфекционных осложнений. Во многих случаях наличия динамического показателя вирусной нагрузки, ослабление иммуносупрессивного компонента привело к понижению виремии без дополнительных противоинфекционных стимулов. Следует также отметить случаи, когда вирусная нагрузка оставалась на исходном уровне или даже демонстрировала тенденцию к прогрессированию. Это создает предпосылки для дальнейшего мониторинга и более глубокого изучения показателей, способных повлиять на такие отклонения.

Кроме того, нами исследована возможность замещения существующих способов забора материала на неинвазивные. Так, в случае с полиомавирусами нами показано, что моча не только может заменить кровь в качестве материала для генодиагностики, но и обладает по сравнению с ней большей информативностью. Выбор правильного материала для анализа, конечно, зависит от биологии вируса. Так полиомавирусная инфекция чаще всего затрагивает почки, а герпесвирусы инфицируют клетки крови.

Полученные нами данные определяют необходимость проведения крупномасштабного и длительного исследования, конечной целью которого стала бы разработка практических рекомендаций по мониторингу реципиентов почечного трансплантата, а также индивидуальному подходу к разработке и модификации существующих способов лечения.

Оценка эффективности и безопасности противовирусных препаратов

Среди новых возможностей клинической медицины, открывшихся в результате проекта «Геном человека», особое место принадлежит фармакогенетике. Фармакогенетические данные позволяют предсказать эффективность препаратов, а также оценить риск развития побочных эффектов от их приема при терапии различных заболеваний.

К сожалению, Россия не является лидером в данном направлении. В частности, несмотря на многонациональность населения, практически не исследованы особенности распределения фармакогентических маркеров в популяциях, проживающих на территории РФ. В связи с этим, установление маркеров,

ассоциированных с различными аспектами терапии социально-значимых заболеваний, а также выявление частот их распределения в русской популяции является важной задачей отечественной медицины и фармакологии. Особенно это касается таких социально-значимых заболеваний, как ВИЧ.

Единственным разрешенным к применению в медицинской практике способом лечения ВИЧ-инфекции в настоящее время является высокоактивная антиретровирусная терапия (ВААРТ). ВААРТ позволяет существенно снизить передачу ВИЧ в гетеросексуальных серодискордантных парах [Cohen J. et al., 2011]. Доконтактная профилактика с использованием антиретровирусных препаратов (Рге-Exposition Prophylactics, PrEP), наряду с анти-ВИЧ/СПИД-вакцинами, рассматривается в числе перспективных стратегий превенции ВИЧ-инфекции. Однако антиретровирусная терапия не обеспечивает удаления ВИЧ из организма инфицированного человека. Также остается открытым вопрос о безопасности препаратов, применяемых при лечении ВИЧ.

Нами установлены частоты аллелей HLA-B*57:01 и HLA-DRB1*01, ассоциированных с развитием побочных эффектов при приеме антиретровирусных препаратов в русской популяции.

Частота аллелей выбранных HLA-маркеров, установленная в выборке из 800 здоровых представителей русской популяции, составила 5% для HLA-B*57:01 и 22% для HLA-DRB*01.

Для разработанных тест-систем показана высокая эффективность и чувствительность. Аллель HLA-DRB*01 определяли методом ПЦР в реальном времени. Эта технология более удобна по сравнению с секвенированием, однако не позволяет получить необходимого уровня разрешения. В дальнейшем при создании панели маркеров, для детекции аллелей HLA возможно использование SNP-маркеров, находящихся в неравновесии по сцеплению с типируемыми аллелями [Leslie S., et al]. Этот подход позволяет использовать более удобный и дешевый метод ПЦР в реальном времени для типирования всех исследованных полиморфизмов, что создает предпосылки для внедрения разработанных фармакогенетических тестов в области практического здравоохранения.

Полученные данные о частотах встречаемости выбранных нами фармакогенетических маркеров могут быть использованы при проведении

доклинических исследований, предшествующих разработке и внедрению новых лекарственных средств. Рекомендации, основанные на популяционных данных, помогут снизить риск негативных последствий связанных с приемом препаратов. Учитывая методическую сложность формирования рандомизированных контрольных групп при проведении ряда клинических исследований, приведенные популяционные данные могут быть использованы для уменьшения размера выборки в десятки раз с сохранением статистической силы исследований. Кроме того, внедрение фармакогенетического тестирования в медицинскую практику позволит оптимизировать расходование средств в области здравоохранения.

Определение эффективности подавления экспрессии генов вируса гепатита С кандидатными препаратами миРНК

Несмотря на последние достижения в области терапии гепатита С, проблема разработки эффективного и недорогого противовирусного препарата (или вакцины) не теряет актуальности. Современные лекарственные средства, основанные на подавлении функциональной активности вирусных ферментов, недостаточно эффективны из-за изменчивости патогена, а их экономическая доступность для пациентов ограничена. Решить эту проблему позволяет реализация альтернативных подходов к терапии и профилактике гепатита С. В настоящее время все большее внимание уделяется технологиям, использующим в качестве мишени геном вируса. Репликативный цикл вируса, лежащий в основе патогенеза заболевания, контролируется генами и регуляторными участками генома. Современные биомедицинские технологии, позволяющие влиять на процесс экспрессии вирусных генов (а значит и на ключевые процессы жизненного цикла вируса), могут лечь в основу новых подходов к лечению гепатита С, а также стать перспективным направлением в области разработки противовирусных средств.

В последние годы в качестве нового способа борьбы с инфекцией все чаще рассматривают противовирусные препараты, основанные на механизме РНК-интерференции (РНКи). После его открытия в 1998 году [Fire A. et al., 1998] ученые получили относительно простой и недорогой инструмент для специфического подавления экспрессии генов. Суть процесса заключается в ингибировании трансляции за счет комплементарного связывания РНК-мишени с короткими

двуцепочечными молекулами РНК и последующей деградации РНК-мишени [Meister G., Tuschl Т., 2004]. В настоящее время самым распространенным методом инициации РНКи является введение в клетку синтетических молекул миРНК, размером 21-22 пн [Doench J. G., et al. 2003]. Теоретически можно спроектировать ингибирующую РНК к любому интересующему гену и подавить его экспрессию. Однако для того, чтобы оценивать ингибирующую активность тех или иных вариантов молекул, требуется разработка адекватной модели, позволяющей определять эффективность подавления экспрессии.

Для оценки эффективности препаратов миРНК к фрагменту генома HCV (регион 5'UTR) были созданы рекомбинантные плазмиды, содержащие общий промотор, целевой фрагмент, а также последовательность, кодирующую репортерный белок EGFP.

Рекомбинантные плазмиды, несущие выбранные фрагменты-мишени генома HCV, а также синтетические молекулы миРНК ко-трансфецировали в клетки эмбриональной почки человека НЕК293Т. Схема эксперимента по ингибированию приведена на рис. 12.

Количественную ПЦР проводили с использованием праймеров, специфичных фрагменту генов 5'UTR вируса гепатита С и лежащих «ниже» места отжига праймеров для обратной транскрипции.

На рис. 13 приведены результаты обратной транскрипции и ПЦР для тотальной РНК, полученной из культур клеток, обработанных различными молекулами миРНК, а также положительных и отрицательных контролей.

По результатам оценки уровня экспрессии можно выделить препараты миРНК siUTR72 и siUTR210, как перспективные для дальнейшего изучения их ингибирующей активности в отношении вируса гепатита С.

Таким образом, использованный в работе метод ПЦР в реальном времени с обратной транскрипцией показал высокую точность в оценке изменения уровня экспрессии вирусных белков и может быть рекомендован при проведении аналогичных исследований, как в качестве основного, так и в качестве референсного метода.

Разработанный подход к оценке эффективности препаратов миРНК является универсальным и может быть использован при оценке ингибирующих свойств

кандидатных препаратов миРНК, направленных против любых РНК-вирусов.

| СМУ-промотор| Мишень

Синтез и клонирование __ ■ ^-Ш-^миРНК

Подавление экспрессии

РНК

Белок

Рис.12. Мишени были синтезированы и клонированы под СМУ-промотором в плазмидный вектор риСНЯ ЕОРР. Благодаря этому, удалось получить рекомбинантные плазмиды, содержащие общий промотор, целевой фрагмент, а также последовательность, кодирующую репортерный белок ЕОРР. В результате котрансфекции плазмид и синтетических молекул ингибирующих РНК удалось установить препараты миРНК наиболее эффективно подавляющие экспрессию

160 140 120 100 80 60 40 20 0

з!11.4 ЫиТЯ-56 Э|1Гт-79 51иТИ-188 51ЦТГ*-214 Н

эЮРР 81иТЯ-72 зИгт-154 8!ЦТН-210 згиТ|?*280

Среднее I Среднее±ЗЕ

Рис. 13. Оценка эффективности ингибирования экпрессионной конструкции в культурах клеток, обработанных кандидатными молекулами миРНК, положительных и отрицательных контролей. Наибольшая эффективность ингибирования по результатам ПЦР в реальном времени достигнута в культурах, трансфецированных препаратами з1иТК72 и 8П1Т11210

выводы

1. Впервые установлено наличие ассоциации вариантов генов иммунного ответа, относящихся к системе HLA класса II, с риском развития радиационных осложнений онкологического генеза.

2 Обнаружены отличия в распределении SNP-маркеров rsl801516, rs664677, rsl052133 в группе лиц, подвергшихся хроническому низкодозному радиационному воздействию, а также в группах клинического и популяционного контроля. Обнаружена ассоциация SNP-маркера rs 1799782 с риском развития онкопатологий.

3. Установлено наличие межэтнического полиморфизма в частоте встречаемости аллелей, ассоциированных с устойчивостью и восприимчивостью к ВИЧ-инфекции, на территории России и сопредельных государств. Наиболее генетически устойчивы к заражению ВИЧ представители популяции русских поморов, ареал обитания которых близок к предполагаемому месту происхождения делеционного полиморфизма CCR5delta32.

4. Разработан лабораторный вариант 16 ПЦР-тест-систем, позволяющих определять аллели генов, принимающих участие в развитии иммунозависимых патологий: CCR5delta32, CCR2-64I и SDFJ-3'A ATM (rs 1801516, rs664677), TGFB1 (rs 1800469), XRCC1 (rsl799782), OGG1 (rsl052133), 1L-7 (rs2717536), IL15-RA (rs2296135). Разработанный подход к генотипированию точен, прост в применении и может быть рекомендован для использования в лабораторной практике.

5. Разработан подход к мониторингу условно-патогенных вирусов у реципиентов почечного трансплантата. Диагностика инфекций и мониторинг вирусной нагрузки у пациентов в посттрансплантационный период позволяет корректирвать план назначения противоинфекционных и иммуносупрессивных компонентов терапии, тем самым снижая вероятность развития инфекционных осложнений трансплантации.

6. Установлены частоты аллелей HLA-B*57:01 и HLA-DRB*01, ассоциированных с развитием острых осложнений у ВИЧ-инфицированных лиц, принимающих антиретровирусные препараты Абакавир и Невирапин.

7. Метод ПЦР в реальном времени может быть эффективно использован при отборе антисмысловых препаратов, обладающих противовирусной активностью в отношении вируса гепатита С.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Боринская С.А., Ребриков Д.В., Нефедова В.В., Кофиади И.А., Соколова М.В., Колчина Е.В., Куликова Е.А., Чернышов В.Н., Куцев С.И., Половников A.B., Иванов В.П., Козлов А.И., Янковский Н.К. Молекулярная диагностика и распространенность первичной гиполактазии в популяциях России и сопредельных стран. Молекулярная биология, 2006, Т.40, № 5, С. 1-6.

2. Кофиади И.А., Ребриков Д.В. Методы детекции однонуклеотидных полиморфизмов: аллель-специфичная ПЦР и гибридизация с олигонуклеотидной пробой. Генетика, 2006, Т.42, № 1, С.22-32.

3. Кофиади И.А., Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов P.M. Распределение аллелей генов CCR5, CCR2 и SDF1, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции в российских популяциях. Доклады Академии Наук, 2007, Т. 415, № 6, С. 842-845.

4. Кофиади И.А., Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов P.M. Распределение ВИЧ-протективных аллелей генов CCR5, CCR2 и SDF1 в российских популяциях. Иммунология, 2007, № 1, С. 10-12.

5. Черноусое А.Д., Петрова Т.В., Пичугина Л.В., Литвина М.М., Донецкова А.Д., Кофиади И.А., Ребриков Д.В., Апарин П.Г. Посттерапевтическая клеточная латентность ВИЧ у пациента с исходной развернутой картиной СПИДа. Иммунология, 2007, № 6, С. 327-331.

6. Деев А.Д., Панченко Е.П., Комаров А.Л., Стамбольский Д.В., Сироткина О.В., Кофиади И.А., Ребриков Д.В., Шахматова О.О. Факторы риска тромботических осложнений и прогноз у больных с хронической формой ишемической болезни сердца. Кардиология, 2009, № 11, С.4-10.

7. Кофиади И.А., Хаитов P.M., Алексеев Л.П., Сидорович И.Г., Карамов Э.В. Генетический полиморфизм человека и устойчивость к ВИЧ/СПИДу. Популяционный аспект. Иммунология, 2009, № 1, С. 196-200.

8. Кофиади И.А., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П. Частота встречаемости 65 клинически значимых однонуклеотидных полиморфизмов у здоровых представителей русской популяции. Молекулярная медицина, 2011, № 2, С.47-52.

9. Рогатых C.B., Докшукина A.A., Хайнасова Т.С., Мурадов C.B., Кофиади И.А. Использование технологии ПЦР в реальном времени для оценки эффективности

методов выделения ДНК из культур ацидофильных хемолитотрофных микроорганизмов. Прикладная биохимия и микробиология, 2011, Т. 47, № 2, С.226-230.

10. Уткин К.В., Кофиади И.А., Алексеев Л.П., Абрамов Д.Д., Батенева Е.И., Хаитов P.M., Веремеева Г.А., Площанская О.Г., Аклеев A.B., Киселев М.Ф. Однонуклеотидные ' полиморфизмы, как маркеры индивидуальной реакции на хроническое радиационное воздействие. Ядерная и радиационная безопасность,

2011, Т. 62, №4, С. 44-50.

П.Абрамов Д.Д., Кофиади И.А., Уткин К.В., Трофимов Д.Ю., Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Полиморфизм одиночных нуклеотидов в генах цитокинов и их рецепторов: биологический эффект и методы идентификации. Иммунология, 2011, №5, С. 275-280.

12. Абрамов Д.Д., Кофиади И.А., Хаитов М.Р., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Гудима Г.О., Кадочникова В.В., Гончарова Е.В., Рагимов A.A., Алексеев Л.П. Особенности полиморфизма генов, регулирующих различные компоненты иммунного ответа в русской популяции. Российский аллергологический журнал,

2012, №6, С.72-75.

13. Рогатых C.B., Докшукина A.A., Левенец О.О., Мурадов C.B., Кофиади H.A. Оценка качественного и количественного состава сообществ культивируемых ацидофильных микроорганизмов методами ПЦР-РВ и анализа библиотеки клонов. Микробиология, 2013, Т. 82, № 2, С.212-217.

14. Уткин К.В., Кофиади И.А., Батенева Е.И., Аклеев A.B., Орадовская И.В., Рагимов A.A., Викулов Г.Х., Радзивил Т.Т., Пащенкова Ю.Г., Алексеев Л.П. Установление генетических маркеров устойчивости и чувствительности человека к радиационному воздействию. Иммунология, 2013, № 2, С. 74-81.

15. Долбин А.Г., Минина М.Г., Сергеев И.В., Кофиади H.A., Хаитов М.Р., Трофимов Д.Ю., Болдырева М.Н., Алексеев Л.П. Новые возможности поиска HLA-совместимых доноров для реципиентов листа ожидания почечного трансплантата. Физиология и патология иммунной системы, 2009, № 5, С.13-16.

16. Кофиади H.A., Гончарова Е.В., Каабак М.М., Бабенко H.H., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П. Разработка нового подхода к мониторингу вирусной инфекции у

взрослых реципиентов почечного трансплантата. Физиология и патология иммунной системы, 2009, №9, С. 3-8.

17. Кофиади И.А., Кадочникова В.В., Донников А.Е. Геном человека расшифрован, что дальше? Вестник МЕДСИ, 2009, № 3, С. 33-39.

18. Кофиади И.А., Хаитов P.M., Алексеев Л.П., Сидорович И.Г., Карамов Э.В. Иммуногеномика человека: чувствительность и устойчивость к ВИЧ/СПИД. Физиология и патология иммунной системы. 2009. Т.13. № 1. С. 3-8.

19. Хаитов P.M., Кофиади И.А., Алексеев Л.П. Достижения в изучении генов иммунитета — решение проблем иммунобиобезопасности России. Медицина экстремальных ситуаций, 2009, Т.4, № 30, С. 99-108.

20. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семенов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР в реальном времени. 2009. М.: Бином.

21. Абрамов Д.Д., Кофиади И.А., Трофимов Д.Ю., Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Фундаментальные и прикладные аспекты иммуногенетики человека. Сообщение 4. Полиморфизм одиночных нуклеотидов в «не-HLA» генах иммунного ответа: биологический эффект и методы идентификации. Физиология и патология иммунной системы, 2010, Т.14, № 8, С.3-11.

22. Кофиади И.А., Кадочникова В.В., Абрамов Д.Д., Гончарова Е.В., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов P.M. Частота встречаемости 100 клинически значимых однонуклеотидных полиморфизмов у здоровых представителей русской популяции. Физиология и патология иммунной системы, 2011, № 2, С. 3-10.

23. Елов A.A., Федоров H.A., Жибурт Е.Б., Кофиади И.А., Трофимов Д.Ю. Количественная флуоресцентно-гибридизационная ПЦР на основе отечественной аппаратуры и тест-систем. Здравоохранение и медицинская техника, 2005, № 2, С. 10.

24. Sokolova М., Kofiadi I., Rebrikov D., Borodina Т., Kozlov A., Borinskaya S., Yankovsky N. DNA diagnostics of adult-type hypolactasia in populations of Russia and neighboring countries. Human Genome Meeting. Helsinki. Finland. 2006. Book of abstracts.

25. Кофиади И.А. Частоты связанных с тромбофилией аллелей генов F5, F2 и MTHFR у представителей евразийской этнической группы, проживающих на территории России и Беларуси. Материалы XVIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии, 2006, С. 14.

26. Кофиади И.А., Морозова С.А., Ребриков Д.В. Частоты аллелей генов CCR5, CCR2 и SDF1, ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции у россиян. Материалы международной конференции «Генетика в России и в мире». 2006, С. 100.

27. Kofiadi I.A., Trofimov D.Y., Gudima G.O., Alexeev L.P. Genetic susceptibility to HIV-infection in 4 populations from Russia. 16 European Congress of Immunology, 2006, Book of abstracts, P. 129.

28. Кофиади И.А., Морозова C.A., Ребриков Д.В. Распределение ВИЧ-протективных аллелей генов CCR5, CCR2 и SDF1 у россиян. Аллергология и иммунология, 2006, Т. 7, № 3, С. 403.

29. Кофиади И.А., Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Анализ распространения ВИЧ-протективных аллелей среди этнических групп, проживающих на территории России и сопредельных государств. Российский аллергологический журнал, 2007, № 3, Пр. 1, С. 10-11.

30. Kofiadi I.A., Trofimov D.Y., Rebrikov D.V. Genetic susceptibility to HIV-1 infection in Russian populations. 21 European Immunogenetics and Histocompatibility Conférence. The officiai journal of the European Fédération for Immunogenetics, 2007, P. 430.

31. Черноусов A.Д., Петрова T.B., Кофиади И.A., Апарин П.Г. Посттерапевтическая клеточная латентность ВИЧ у пациента с исходной развернутой картиной СПИДа Российский аллергологический журнал, 2007, № 3, Пр.1, С. 10-11.

32. Ребриков Д.В., Кофиади И.А., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Полиморфизм генов CCR5, CCR2 и SDF1 ассоциированных с устойчивостью к ВИЧ-инфекции среди этнических групп, проживающих на территории России и сопредельных государств. Медицинская иммунология, 2007, Т. 9, № 2-3, С. 309.

33. Кофиади И.А., Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Анализ распространения ВИЧ-протективных аллелей среди этнических групп, проживающих на территории России и сопредельных государств. Российский аллергологический журнал, 2007, № 3, Пр. 1, С.10.

34. Комаров А.Л., Шахматова О.О., Стамбольский Д.В., Ребриков Д.В., Кофиади И.А., Сироткина О.В., Миронова И.Ю., Деев А.Д., Добровольский А.Б., Панченко Е.П. Генетические полиморфизмы, ассоциированные с тромбозами и прогноз больных с хронической ИБС. Кардиоваскулярная терапия и профилактика, 2008, Т.7, № 6, Пр.1, С. 184.

35. Кофиади И.А., Ребриков Д.В. Генетическая устойчивочть к ВИЧ в популяциях России и сопредельных государств. Сборник тезисов международной конференции «Вторая конференция по вопросам ВИЧ/СПИД в Восточной Европе и Центральной Азии. 2008. M.: РОО «СПИД инфосвязь». С. 8.

36. Черноусов А.Д., Петрова Т.В., Апарин П.Г., Кофиади И.А. Сохранение эффективности терапии ВИЧ-инфекции препаратами интерферонов (клинический случай, восьмилетнее наблюдение). Сборник тезисов международной конференции «Вторая конференция по вопросам ВИЧ/СПИД в Восточной Европе и Центральной Азии. 2008. М.: РОО «СПИД инфосвязь», С. 91.

37. Кофиади И.А., Хаитов P.M., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П. Направления развития иммуногенетики в постгеномную эру. Материалы I международной научно-практической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине». 2010. М.: Парк-медиа, С. 192.

38. Abramov D., Trofïmov D., Kofiadi I., Soroka N., Alexeev L., Ragimov A. Cytokine and cytokine receptor gene polymorphism in the Russian population Tissue antigens, 2010, V. 75, № 5, P.525.

39. Рогатых C.B., Кофиади И.А. Использование технологии ПЦР в реальном времени для оценки эффективности методов выделения ДНК из культур хемолитотрофных микроорганизмов. Актуальные аспекты современной микробиологии: материалы VI молодежной школы-конференции с международным участием. М.: Макс-пресс, 2010, С. 114-116.

40. Кофиади И.А., Рогатых C.B., Мурадов C.B. Разработка генодиагностических тест-систем для определения структуры аборигенного микробного сообщества месторождения Шануч (Западная Камчатка). Сохранение биоразнообразия Камчатки и прилегающих морей: материалы XI Международной научной конференции. Петропавловск-Камчатский: Камчатпресс, 2010, С. 96-99.

41. Абрамов Д.Д., Кофиади И.А., Гудима Г.О., Шеповалова Т.Э., Кадочникова В.В., Болдырева М.Н., Алексеев Л.П. Фармакогенетика противовирусных препаратов: характеристика распределения генетических маркеров, ассоциированных с индивидуальными особенностями реакции человека на терапию вирусных инфекций в Российской популяции. Российский аллергологический журнал, 2012, № 1, С. 1012.

42. Уткин К.В., Кофиади И.А., Гудима Г.О., Веремеева Г.А., Площанская О.Г., Аклеев А.В., Абрамов Д.Д., Васильев Е.В., Алексеев Л.П. Оценка ассоциации вариантов генов иммунного ответа с формированием фенотипа, характеризующегося повышенной устойчивостью к радиационному воздействию. Российский аллергологический журнал, 2012, № 1, С. 317-318.

43. Utkin К.V., Kofiadi I.A., Goudima G.O., Bateneva E.I., Kadochnikova V.V., Boldyreva M.N., Kiselev M.F., Akleev A.V., Veremeeva G.A., Alexeev L.P. Assessing imunogenetic basis of inherited resistance to radiation: focus on HLA Class II. Tissue antigens, 2012, V. 79, № 6, P. 355.

44. Рогатых C.B., Левенец O.O., Хайнасова T.C., Кофиади И.А. Разработка тест-систем и анализ структуры сообщества ацидофильных микроорганизмов, используемых в биовыщелачивании сульфидных руд месторождения Шануч (Камчатка). Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Природные ресурсы, их современное состояние, охрана, промысловое и техническое использование». Петропавловск-Камчатский: КамчатГТУ, 2012, С. 139-142.

45. Рогатых С.В., Мурадов С.В., Кофиади И.А., Балыков А.А., Левенец О.О., Хайнасова Т.С. Применение молекулярно-генетических методов в технологии биовыщелачивания сульфидных медно-никелевых руд месторождения Шануч (Камчатка). Материалы конференции с международным участием «Никеленосные провинции Дальнего Востока». Петропавловск-Камчатский: НИГТЦ ДВО РАН, 2012, С. 139-145.

46. Khaitov М., Kofiadi I., Mazurov D., Nikonova A,. Shilovskii P. Inhibition of Hepatitis С virus RNA replication by siRNAs. 19th international symposium on hepatitis С virus and related viruses. Abstract book, 2012, P. 298.

Подписано в печать 21.03.13. Формат 60x84/16. Бумага офисная «5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 199. Отпечатано на участке множительной техники ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН 115478, г. Москва, Каширское шоссе, 24

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Кофиади, Илья Андреевич, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР «ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ» ФЕДЕРАЛЬНОГО МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОГО АГЕНТСТВА

На правах рукописи

052013$0735

Кофиади Илья Андреевич

ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ И ГЕНОДИАГНОСТИКА В БИОМЕДИЦИНЕ: ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ

АСПЕКТЫ

«03.03.03 - иммунология»

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ В РАБОТЕ СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ ПРЕДСТАВЛЕНИЙ О РОЛИ ГЕНОВ В ФОРМИРОВАНИИ ИММУНОАССОЦИИРОВАННЫХ ПРИЗНАКОВ

1.1.1 «Догеномный» период развития генетического направления в иммунологии

1.1.2 Иммуногенетика в постгеномную эру

1.2 ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНОВ ИММУННОГО ОТВЕТА И ИХ РОЛЬ В ФОРМИРОВАНИИ ЕСТЕСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ИММУНОЗАВИСИМЫМ ЗАБОЛЕВАНИЯМ

1.2.1 Роль НГА-генов в развитии предрасположенности к иммунозависимым заболеваниям

1.2.2 не-НЬА гены иммунной системы в ответе на инфекции и измененные собственные антигены

1.3 ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ЕСТЕСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ К ВИЧ-ИНФЕКЦИИ/СПИД

1.3.1 Роль НЬА в формировании генетически обусловленной устойчивости и чувствительности к ВИЧ-инфекции

1.3.2 не-НЬА гены в ответе на ВИЧ

1.3.3 Популяционный подход к изучению ВИЧ-инфекции/СПИД

1.3.4 Фармакогенетика противовирусных средств

1.4 ГЕНЫ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ В КОНТРОЛЕ КАНЦЕРОГЕНЕЗА

1.4.1 Иммунологический контроль опухолеобразования

1.4.2 Современная теория иммунологического надзора

за опухолями 67

1.5 РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА В ОТВЕТЕ НА РАДИАЦИОННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ 68

1.5.1 Эффекты радиационного воздействия 70

1.5.2 Контроль клеточного цикла 77

1.5.3 Репарация ДНК 79

1.5.4 Гены иммунного ответа в реакции организма

на облучение 81

1.6 ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

В ИММУНОЛОГИИ 86

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 90

2.1 СВЕДЕНИЯ ОБ ИССЛЕДОВАННЫХ ОБРАЗЦАХ 90

2.1.1 Установление особенностей распределения генетических маркеров, ассоциированных с устойчивостью/ чувствительностью к ВИЧ-инфекции/СПИД и препаратам

APT: характеристика групп сравнения 90

2.1.2 Установление ассоциации генетических маркеров с вероятностью развития радиационных осложнений

онкологического генеза: характеристика групп сравнения 92

2.1.3 Разработка нового подхода к мониторингу вирусной нагрузки и оценке эффективности терапии у пациентов

клиники трансплантации органов: клинический материал 93

2.1.4 Разработка лабораторного метода для оценки эффективности подавления экспрессии генов вируса гептита С кандидатными препаратами миРНК:

клетки и их источники 94

2.2 ВЫБОР ГЕНОВ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ АССОЦИАЦИИ ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ

С ВЕРОЯТНОСТЬЮ РАЗВИТИЯ РАДИАЦИОННЫХ

ОСЛОЖНЕНИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА 94

2.3 ВЫДЕЛЕНИЕ ДНК 99

2.4 ПРОВЕДЕНИЕ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР

В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ 100

2.4.1 Параметры, использовавшиеся для описания

ПЦР в реальном времени 100

2.4.2 Специфичность и чувствительность тест-систем 101

2.5 ГЕНОТИПИРОВАНИЕ 102

2.6 СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПРОДУКТОВ ПЦР 104

2.6.1 Проведение ПЦР с целью получения матрицы

для сиквенсной реакции 104

2.6.2 Проведение сиквенсной реакции 104

2.6.3 Секвенирование 105

2.7 СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ 105

2.8 СИНТЕЗ ГЕНА 107

2.9 ПРОЕКТИРОВАНИЕ И СИНТЕЗ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ МОЛЕКУЛ

КАНДИДАТНЫХ МИРНК 109

2.10 КО-ТРАНСФЕКЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ

ПЛАЗМИД И СИНТЕТИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ МИРНК 109

2.11 ОБРАТНАЯ ТРАНСКРИПЦИЯ И ПОЛИМЕРАЗНАЯ

ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ 110

2.12 СИНТЕЗ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ 111

2.13 ИСПОЛЬЗОВАННОЕ В РАБОТЕ ПРОГРАММНОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ И БАЗЫ ДАННЫХ 112

2.13.1 Программы и онлайн алгоритмы 112

2.13.2 Базы данных 112

2.14 БУФЕРНЫЕ РАСТВОРЫ 113

3. РЕЗУЛЬТАТЫ 114

3.1 РАЗРАБОТКА ЛАБОРАТОРНОГО ВАРИАНТА ГЕНОТИПИРУЮЩИХ ТЕСТ-СИСТЕМ 114

3.1.1 Генотипирующие тест-системы для определения маркеров устойчивости/чувствительности

к ВИЧ-инфекции/СПИД 116

3.1.2 Генотипирующие тест-системы для определения фармакогенетических маркеров, ассоциированных с развитием гиперчувствительности у лиц, принимающих препараты APT 118

3.1.3 Генотипирующие тест-системы для определения маркеров устойчивости/чувствительности к развитию радиационных осложнений онкологического генеза 119

3.2 ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ОБРАЗЦОВ 120

3.3 ПРОВЕРКА СООТНОШЕНИЯ ХАРДИ-ВАЙНБЕРГА В ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ 124

3.4 ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ ЧАСТОТНОГО РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАННЫХ МАРКЕРОВ В ПОПУЛЯЦИЯХ РОССИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ГОСУДАРСТВ 125

3.4.1 Популяционное распределение маркера CCR5delta32 rs333 125

3.4.2 Популяционное распределение маркера CCR2-64I rs 1799864 128

3.4.3 Популяционное распределение маркеров SDFl-3'A

rs 1801157, НСР5 rs2395029 и HLA-C rs9264942 128

3.4.4 Популяционное распределение маркеров HLA-B*57:01 hHLA-DRB1*01 129

3.4.5 Популяционное распределение маркеров

ATM (rs 1801516, rs664677), TGFB1 (rs 1800469),

XRCC1 (rs 1799782), OGG1 (rsl052133), IL-7 (rs2717536),

IL15-RA (rs2296135), rs9642880, rs6983267, rs 1447295

и rsl3281615 129

3.5 ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОТНОСИТЕЛЬНОЙ ОПАСНОСТИ РАЗВИТИЯ СПИД И СМЕРТИ В РЕЗУЛЬТАТЕ СПИД В ИССЛЕДОВАННЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ 131

3.6 АССОЦИАЦИЯ МАРКЕРОВ ГЕНОВ СИСТЕМ РЕПАРАЦИИ ДНК И ИММУННОГО ОТВЕТА

С РИСКОМ РАЗВИТИЯ РАДИАЦИОННЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКОГО ГЕНЕЗА 132

3.7 РАЗРАБОТКА НОВОГО ПОДХОДА К МОНИТОРИНГУ ВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ВЗРОСЛЫХ РЕЦИПИЕНТОВ ПОЧЕЧНОГО ТРАНСПЛАНТАТА 134

3.8 РАЗРАБОТКА ПОДХОДА К МОНИТОРИНГУ ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

НА ОСНОВЕ АНТИСМЫСЛОВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ 139

4. ОБСУЖДЕНИЕ 143

4.1 ИММУНОГЕНОТИПИРОВАНИЕ, КАК ПОДХОД К УСТАНЛЕНИЮ ЕСТЕСТВЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТИ/ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К ВИЧ-ИНФЕКЦИИ/СПИД НА ИНДИВИДУАЛЬНОМ И ПОПУЛЯЦИОННОМ УРОВНЕ 143

4.2 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ И БЕЗОПАСНОСТИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ ПРЕПАРАТОВ

С ПОМОЩЬЮ МЕТОДОВ ИМУНОГЕНОТИПИРОВАНИЯ 151

4.3 НОВЫЙ ПОДХОД К СНИЖЕНИЮ ВЕРОЯТНОСТИ РАЗВИТИЯ ОНКОПАТОЛОГИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С ОБЛУЧЕНИЕМ,

В ГРУППАХ ПОВЫШЕННОГО РАДИАЦИОННОГО РИСКА 157

4.4 КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ МОНИТОРИНГ ВИРУСНОЙ НАГРУЗКИ КАК СПОСОБ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ ТЕРАПИИ В КЛИНИКЕ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ОРГАНОВ 166

4.5 ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПОДАВЛЕНИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ ПРИ СОЗДАНИИ ПРОТИВОВИРУСНЫХ

ПРЕПАРАТОВ 171

ВЫВОДЫ 175 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 178

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 185

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 232

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 236

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ CMV - цитомегаловирус EBV - вирус Эпштейна-Барр

FDA - Федеральная администрация США по пищевым продуктам и

лекарственным препаратам

FISH - флуоресцентная гибридизация in situ

GWAS - геномное ассоциативное исследование

HHV-6 - вирус герпеса человека 6 типа

HLA - антигены тканевой совместимости человека

HSV - вирус простого герпеса

LCMV - вирус димфоцитарного хориоменингита

МСА - метилхолантрен

МНС - главный комплекс гистосовместимости

NCBI - Национальный центр биотехнологической информации США SNP - однонуклеотидный полиморфизм TCR - рецептор Т-клеток

TTV - Transfusion Transmitted Virus или Torque teño virus APT - антиретровирусная терапия ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота миРНК - малые интерферирующие РНК

МКРЗ - Международная комиссия по радиологической защите

OOP - относительная опасность развития СПИД

ООС - относительная опасность смерти в результате СПИД

ОТ - обратная транскрипция

ПНК - полинуклеотид киназа

ГТТТР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

РР - коэффициент риска развития СПИД

PC - коэффициент риска смерти в результате СПИД

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Одним из крупнейших научных достижений на рубеже XX-XXI веков стала расшифровка генома человека. В качестве новой задачи на пути практического использования полученных знаний постулируется изучение молекулярных основ изменчивости, в том числе определение роли генетического полиморфизма в формировании уникальных признаков организма. Прогресс в этой области напрямую связан с внедрением методов молекулярной генетики (Venter 2010). Применение молекулярно-генетических подходов к изучению механизмов реализации жизненно-важных функций организма уже сегодня привело к прорыву во многих областях науки и медицины (Bell 2010, Hamburg and Collins 2010).

Наиболее ярким примером проявления полиморфизма генов является иммунная система человека, и, в частности, главный комплекс гистосовместимости. Именно с исследованием системы генов HLA (Human Leukocyte Antigen), кодирующего молекулы главного комплекса гистосовместимости, была связана одна из первых международных программ в области молекулярной генетики, результаты которой были представлены на XI Международном рабочем совещании и конференции по изучению HLA (г. Йокогама, Япония, 1991 г.). На сегодняшний день эта система генов насчитывает более 8000 аллельных вариантов (по данным сайта www.hla.alleles.org).

Важнейшим достижением биомедицинской науки последних лет стало

формирование представлений о роли генетического полиморфизма на уровне

одиночных нуклеотидных замен (SNP - Single Nucleotide Polymorphism). В

настоящий момент в геноме человека насчитывается более 50 миллионов

уникальных вариантов последовательности генов человека, представленных

SNP (по данным сайта www.ncbi.nlm.nih.gov). Многие из них расположены в

так называемых не-HLA генах иммунного ответа, играющих ключевую роль

в распознавании сигналов, дифференцировке и регуляции компонентов

клеточного и гуморального иммунитета и, как следствие, в защите человека от огромного числа внешних и измененных собственных антигенов.

Нарушение функций генов иммунного ответа и их продуктов ведет к развитию тяжелых форм иммунологической недостаточности и иммунозависимым заболеваниям. В связи с этим, одной из наиболее актуальных и перспективных задач современной биомедицинской науки является расширение теоретических знаний в области иммуногенетического контроля канцерогенеза и противоинфекционного иммунитета (Hill 2001).

Одним из приоритетных направлений фундаментальных исследований в биомедицине является изучение молекулярных и генетических механизмов ВИЧ-инфекции. На сегодняшний день описано лишь два случая излечения от ВИЧ и, по крайней мере, один из них связан с иммуногенетическими особенностями носителя инфекции (Allers, Hutter et al. 2011, Cohen 2013). Так в 2006 году у ВИЧ-инфицированного пациента госпиталя Charité при Берлинском университете была диагностирована лейкемия. В целях терапии заболевания больному была проведена пересадка красного костного мозга. При этом для пересадки лечащим врачом Gero Hutter была подобрана ткань, клетки которой характеризовались гомозиготностью по делеции CCR5delta32. Ген CCR5 кодирует хемокиновый рецептор, контакт с которым необходим макрофаготропным штаммам вируса (фенотип R5) для проникновения в клетку (Feng 1996). В отличие от более распространенного полноразмерного варианта гена CCR5, ген, несущий делецию на обеих гомологичных хромосомах, не экспрессируется и рецептор CCR5 исчезает с поверхности клетки (Dean, Carrington et al. 1996). Это приводит к формированию генетически обусловленной устойчивости человека к инфицированию ВИЧ. После пересадки показатель вирусной нагрузки пациента, известного в литературе, как «берлинский пациент», понизился до недетектируемого уровня, что позволило диагностировать первый в истории исследования ВИЧ случай излечения (Hutter, Nowak et al. 2009).

Идентификация маркера CCR5delta32 и других иммуногенетических маркеров, ассоциированных с врожденной (естественной) устойчивостью к ВИЧ-инфекции, с динамикой ее прогрессии, чувствительностью к антиретровирусным препаратам может стать важным этапом при разработке эффективных стратегий превенции и терапии ВИЧ-инфекции/СПИД как на индивидуальном, так и на популяционном уровне (Cohen 2011).

Изучение меж- и внутрипопуляционного полиморфизма генов иммунного ответа имеет глубокую фундаментальную значимость. Сохранение уровня генетического разнообразия, необходимого для выживания человека в условиях агрессивной окружающей среды, решается именно на популяционном уровне. Комбинации аллелей среди представителей тех или иных этнических групп отличаются крайне выраженным разнообразием. Это определяет адаптационный потенциал человека как вида и в целом отражает эволюционную роль мутационного процесса. В связи с этим чрезвычайную актуальность для биомедицинской науки приобретает исследования, направленные на установление популяционных особенностей распределения иммуногенетических маркеров. В особенности это актуально для таких многонациональных государств, как Россия (Болдырева 2007).

Установлено, что при радиационном воздействии даже невысокой

мощности тяжесть негативных последствий облучения варьирует на

индивидуальном уровне (Crompton, Shi et al. 2001). На сегодняшний день

детально изучены патогенез, патологическая морфология и клиника

заболеваний, обусловленных патогенным действием облучения, риски их возникновения и зависимость от дозы радиации. При этом одной из важнейших, нерешенных до настоящего времени проблем, остается поиск биологических маркеров, позволяющих выявлять лиц чувствительных к радиационному воздействию (Greve, Boiling et al. 2012). Результатом этого является не прогнозируемая в настоящее время индивидуальная реакция человека на действие ионизирующего излучения, как техногенного и естественного фактора вредности.

В первую очередь это связано с отсутствием адекватной модели исследования. Эксперименты с лабораторными животными, равно как и с культурами клеток не позволяют учесть параметры индивидуальной генетической изменчивости. Поэтому для дальнейшего развития знаний и создания теоретической базы в данном направлении могут быть адаптированы современные клинико-статистические методы, позволяющие устанавливать связь индивидуальных генетических особенностей с устойчивостью или чувствительностью человека к радиационному воздействию. С фундаментальной точки зрения связь ионизирующего излучения с онкопатологиями может служить моделью при совершенствовании концепций канцерогенеза и поиске молекулярных маркеров, определяющих риск развития онкологических заболеваний (Hiño, Klein-Szanto et al. 1993, Hahn, Wojnowski et al. 1998).

Генотипирование на уровне установления аллельных вариантов генов

иммунного ответа, а также ряда других генетических систем, которые

рассматриваются в качестве мишеней неблагоприятного воздействия, может

стать перспективным подходом для оценки риска развития патологий,

ассоциированных с радиационным воздействием, в том числе, в отдаленные

периоды времени. Решение этой задачи позволит повысить эффективность

профессионального подбора, снизить смертность и раннюю инвалидизацию

персонала объектов использования атомной энергии. В то же время, поиск

путей оценки риска развития осложнений радиационного воздействия,

является важнейшим звеном в выборе и назначении эффективной приемлемой дозы при радиотерапии больных онкологическими заболеваниями, а также при радиодиагностике (Barnett, West et al. 2009).

Говоря о необходимости дальнейшего развития фундаментальных представлений иммуногенетики, не следует забывать и о преимуществах практического внедрения в биомедицине молекулярно-генетических подходов, которые имеют преимущества по сравнению с клеточными и гистологическими методами.

В частности, в связи с широким распространением и повышением эффективности антиретровирусной терапии остро встает вопрос об оценке риска развития осложнений, вызванных приемом некоторых препаратов. Так, например, широко известны примеры с развитием реакции гиперчувствительности у лиц, принимающих Абакавир (Abacavir) и Невирапин (Nevirapine) - ингибиторы протеазы ВИЧ. Наличие побочных эффектов достоверно ассоциировано с носительством аллелей HLA-B*5701 и HLA-DRB*01 (Tozzi 2010). Кроме того, с генетическим полиморфизмом связана эффективность применения антиретровирусных препаратов, препятствующих проникновению ВИЧ в клетку, в том числе основанных на блокировании рецептора CCR5. Так, препарат Маравирок (Maraviroc), одобренный в 2011 году FDA (Food and Drug Administration), оказался неэффективен для лиц, инфицированных синцитиеобразующими штаммами ВИЧ (фенотип Х4) или же его субпопуляциями, сохраняющими способность использовать рецептор CCR5 для проникновения в клетку (Hirsch, Gunthard et al. 2008). Последнее может может быть объяснено, как мутациями в гене CCR5, так и генетическим полиморфизмом генома самого вируса.

Таким образом, наряду с исследованием полиморфизма генов человека, важным направлением в сфере совершенствования методов борьбы с иммуноассоциированными заболеваниями может стать диагностика самого патогена, а также использование гено

Информация о работе

Кофиади, Илья Андреевич
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.03.03

Диссертация

Иммуногенотипирование и генодиагностика в биомедицине: фундаментальные и прикладные аспекты - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы