Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Применение анализа ультразвуковой вокализации лабораторных животных в биомедицинских и доклинических исследованиях

ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Применение анализа ультразвуковой вокализации лабораторных животных в биомедицинских и доклинических исследованиях"

ФОКИН Юрий Владимирович

На правах рукописи

ПРИМЕНЕНИЕ АНАЛИЗА УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ВОКАЛИЗАЦИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ В БИОМЕДИЦИНСКИХ И ДОКЛИНИЧЕСКИХ

ИССЛЕДОВАНИЯХ

03.03.01 - Физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 7 ФЕВ 23 ¡4

Москва - 2014

005545373

Работа выполнена в ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства».

Научный руководитель: академик РАРАН, член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор Каркищенко Николай Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Иванов Алексей Алексеевич

ФГОУ ВПО «РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева», заведующий кафедрой физиологии, морфологии и биохимии животных

доктор биологических наук, профессор Мурашёв Аркадий Николаевич

ФГБУН «Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.О. Овчинникова» РАН (филиал), руководитель лаборатории биологических испытаний

Ведущая организация: ФГБУН ГНЦ РФ Институт медико-биологических

проблем РАН

Защита состоится 14 апреля 2014 г. в 13— часов на заседании диссертационного совета Д 001.008.01 при ФГБУ «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина» РАМН (125009, г. Москва, ул. Моховая, д. 11, стр. 4).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина» РАМН.

Автореферат разослан «■/£"» февраля 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Кубряк Олег Витальевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Мелкие грызуны являются наиболее распространенными лабораторными животными, используемыми в биомедицинских исследованиях и доклинических испытаниях фармакологических средств для изучения основных механизмов, определяющих эмоциональные и мотивационные функции. Их исследование обычно опирается на изученные поведенческие особенности. Кроме того, предполагающиеся мотивационные и эмоциональные состояния, как правило, основываются на физиологических величинах - таких как уровень активности мозга, частота сердечных сокращений или секреция кортикостерона.

Помимо этих величин, информативные данные о животных могут быть получены путем измерения их вокализации, существенная часть которой представлена в ультразвуковом диапазоне. Ультразвуковая вокализация (УЗВ) является поведенчески важной, по крайней мере, по двум причинам: во-первых, она может служить мерой оценки текущего состояния животных, а во-вторых, вероятно, является важной коммуникативной особенностью, которая должна приниматься во внимание при анализе различных социальных аспектов их поведения (спаривание, кормление, агрессия, защита и т.д.) [Буреш Ян, Бурешова О., Хьюстон Дж., 1991; Каркищенко H.H., 2007; Подковкин В.Г., Иванов Д.Г., 2009; Wöhr М., Borta А., Schwarting R.K.W., 2005].

Однако в литературе содержится довольно скудное количество сведений, касающихся изучения УЗВ различных биологических объектов; все проанализированные работы были выполнены, в основном, в области зоопсихологии и фармакологии и только на мелких лабораторных животных (мышах и крысах). В связи с этим, дальнейшее изучение данного феномена как нового метода биомедицинских исследований послужило основанием для проведения диссертационного исследования.

Анализ параметров УЗВ может послужить дополнением к имеющимся методам доклинических исследований, и данное предположение было также положено в основу настоящей диссертационной работы.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состоит в изучении феномена ультразвуковой вокализации различных лабораторных животных, анализ которой может являться методом биомедицинских и доклинических исследований.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить УЗВ доступных для исследования видов, пород, линий и половозрастных групп лабораторных животных в различных физиологических и психоэмоциональных состояниях, а также при использовании лекарственных средств направленного действия.

2. Выявить информативные параметры УЗВ, служащие мерой оценки исследуемого признака.

3. Проанализировать возможность применения данного метода в биомедицинских и доклинических исследованиях.

Научная новизна диссертации

Впервые в отечественных научных работах получены данные об УЗВ разных видов лабораторных животных. В отличие от ранее опубликованных трудов, в исследования УЗВ были включены не только мыши и крысы, но и хомяки, морские свинки, кролики, мини-свиньи и высшие приматы.

Установлено, что УЗВ животных имеет свои информативные признаки в зависимости от вида, линии и возраста животных, но практически не имеет гендерных отличий.

Выявлено, что голод, жажда, иммобилизация, физическая нагрузка, электрокожное раздражение, наркоз, гипоксия, гипероксия, тревога, агрессия отражаются в УЗВ крыс, а также эффекты фармакологических средств, изменяющих нейромедиаторный пейзаж или имеющих анксиолитическое и седативное действие.

Результаты проведенных исследований позволяют рассматривать анализ УЗВ как метод оценки и коррекции состояния животных в биомедицинских и доклинических исследованиях.

Научно-практическая значимость работы заключается в развитии методической базы биомедицинских и доклинических исследований, которые будут дополнены новым методом оценки различных физиологических и психоэмоциональных состояний животных.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Вокализация в ультразвуковом диапазоне характерна мышам, крысам, хомякам, морским свинкам, кроликам, мини-свиньям и макакам резусам.

2. Информативные параметры УЗВ крыс имеют линейные и возрастные особенности. Изменение физиологического и психоэмоционального состояния крыс отражается в их УЗВ.

3. Анализ УЗВ крыс позволяет прослеживать изменение нейромедиаторного пейзажа,

анксиолитические и седативные эффекты лекарственных средств.

4. Регистрация УЗВ крыс может являться объективным методом биомедицинских и

доклинических исследований.

Апробация и внедрение результатов работы

Основные результаты диссертационного исследования были представлены в виде докладов на VII, VIII и IX Научно-практических конференциях «Биомедицина и биомоделирование»; на заседании студенческого научного общества им. Б.А. Кузнецова, РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева (2011); в виде тезисов на Московской международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (2012) и на IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» (2012).

Результаты диссертационного исследования внедрены в практику работы ФГБУН НЦБМТ ФМБА, ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 2 таблицы, иллюстрирована 53 рисунками, состоит из введения, трех глав, заключения, научно-практических рекомендаций и списка литературы, включающего 11 отечественных и 135 иностранных источников.

Публикации

По теме диссертационной работы автором было опубликовано 9 печатных работ, в том числе 6 — в изданиях, включенных в перечень ВАК.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

Место проведения и сроки

Исследования, послужившие основой для диссертационной работы, проводились в ФГБУН «Научный ценгр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» (Московская обл., Красногорский р-н, п. Светлые горы, вл. 1) в период с апреля 2010 г. по июль 2013 г.

Исследуемые объекты

Используемые в работе лабораторные животные получены из собственного поголовья НЦБМТ ФМБА, а также из филиалов «Андреевка» и «Столбовая» НЦБМТ ФМБА.

Данные по количеству и половозрастным группам представлены в табл. 1.

Таблица 1

Характеристики используемых в работе животных_

Вид, линия (порода) Количество Пол Возраст (мес.)

Крысы 330 184M+146F <1; 3; 6; 12

• линии WAG/GY 234 104M+130F 3

• линии F344/Y 8 М 3

• линии Áug/StoY 8 М 3

■ линии В Y/У 40 32M+8F <1; 3; 6; 12

■ линии HY/Y 32 24M+8F <1; 3; 6

■ популяции бесшерстных 8 М 3

Мыши линии BI0.GFP 20 10M+10F 4-6

Хомяки линии BSto 20 10M+10F 6

Морские свинки популяции цветных и 8 м 4-6

альбиносов

Кролики породы Советская шиншилла 8 м 6

Мини-свиньи светлогорской популяции 8 м 3

Обезьяны Macaca mulatto 8 м 96-120

Методика регистрации УЗВ

Ультразвуковые волны фиксировались с помощью специальных микрофонов системы Эопой-аск (Нидерланды). Данное оборудование позволяет регистрировать сигнал частотой от 20 до 100 кГц и записывать его в цифровом формате для дальнейшей обработки.

Аппаратура позволяет определить к каждой эпохе анализа частоты, представленные в ультразвуке, продолжительность и амплитуду сигнала каждой частоты.

Установка микрофонов происходила дистантно, на расстоянии 20-25 см от головы животных. Частота дискретизации составляла 200 кГц, сигнал записывался в цифровом формате.

Обработка материалов

После удаления физических артефактов (монотонных шумов) осуществляли спектральный анализ ультразвука с использованием процедуры быстрого преобразования Фурье в частотной полосе 20-100 кГц с помощью пакета программ МАТЪАВ-5.5 методом Уэлча (функция рше1сЬ). Эпоха анализа составлялаЮ мс, размерность быстрого преобразования Фурье (КШ) - 2000 интервалов. В ходе анализа спектральную плотность

мощности ультразвука (СПМ), излучаемого каждым животным, нормировали к СПМ фона окружающей среды, в результате получали вектор-строку изменений ультразвука, в котором находили максимум, приравнивая его к 100%, остальные значения приводили в соответствие с максимумом. Таким образом, значения СПМ УЗВ выражались в виде безразмерных коэффициентов (Кспм), рассчитанных как отношение СПМ к фону окружающей среды, либо в процентном соотношении. После этого находились медианы по каждой частоте, учитывая все эпохи анализа в эксперименте для каждого животного и по группам.

При исследовании видовых и половозрастных признаков животных и при проведении доклинических испытаний пептидных препаратов (выявление анксиолитического и седативного действия) общая длительность регистрации УЗВ составляла 30 минут (в состоянии спокойного бодрствования); при исследовании действия препаратов, изменяющих функции основных нейромедиаторных систем мозга, регистрация УЗВ продолжалась 15 минут; при анализе физиологических и психоэмоциональных состояний УЗВ регистрировалась в течение периода стрессового влияния, согласно методике, которая будет представлена ниже.

Моделирование физиологических и психоэмоциональных состояний (на крысах)

До начала эксперимента записывалась УЗВ опытной группы животных, которая использовалась в качестве фоновых данных.

Состояние голода и жажды создавали путем депривации корма и питьевой воды в течение 3 суток, после чего в течение 15 минут регистрировалась УЗВ животных.

Гипоксическую гипоксию и умеренную гипероксию создавали путем помещения крысы в узкую пластиковую бутылку, которую заполняли соответственно углекислым газом или кислородом. Длительность регистрации УЗВ - 15 минут.

Поместив крыс в эту же емкость, исключающую возможность каких-либо движений туловища в ней, предварительно сделав отверстие для дыхания, проводили исследование влияния иммобилизации (в течение двух часов). Регистрация УЗВ происходила параллельно.

Состояние стресса от электрокожного раздражения вызывали пульсирующим током такой величины, чтобы крыса не издавала звука в слышимом диапазоне (до 15 кГц). Стимуляцию осуществляли 10 минут, в течение которых крыса находилась под постоянным наблюдением. Данная процедура проходила в закрытой камере (30x30x40 см) с отверстиями для воздухообмена. Одновременно регистрировалась УЗВ.

С помощью этой же камеры изучалось и стрессовое влияние физической нагрузки. В течение эксперимента крыса передвигалась на вращающемся вале, покрытом мягким пористым материалом (диаметр вала 7 см, скорость вращения постепенно нарастала первые 5 минут с 9 до 12 оборотов в минуту). Вал был поднят на высоту 15 см от пола. Пол камеры состоял из стальных стержней, на которые подавалось постоянное напряжение 25-35 В (ток 1 А без учёта сопротивления кожи животных).

Длительность эксперимента составляла 40-50 минут с момента научения животного (прекращения падений с вала), окончание его определялось визуально, по снижению выносливости и физической усталости крысы, расслабляющей мышцы и падающей на электрический пол камеры. Регистрация УЗВ проводилась сразу после завершения нагрузки и через 1,5 часа восстановительного периода.

Исследование состояний тревоги и агрессии проводилось с помощью теста «Бой самцов». В начале эксперимента подбирались пары самцов, склонные к агрессивному поведению, проявляющемуся в борьбе (соперничеству) друг с другом под воздействием электрического тока Животные помещались в клетку (описана выше), на пол которой подавался ток по мере возрастания силы до момента достижения агрессивной позы (вставание самцов на задние лапы, стойка, «борьба» передними лапами), во время которой записывалась УЗВ.

Исследование УЗВ в состоянии наркоза проводилось с применением двух известных наркотизирующих препаратов. В качестве неингаляционного наркоза использовался «2Со1еШ 100» - препарат для общей анестезии, содержащий в качестве действующих веществ тилетамина гидрохлорид и золазепама гидрохлорид. Препарат вводился внутрибрюшинно, в дозе 50 мг/кг. Для ингаляционного наркоза нами был применен диэтиловый эфир.

Использованные фармакологические средства при проведении доклинических исследований с оценкой УЗВ

Изменения функций основных нейромедиаторных систем мозга для оценки их влияния на УЗВ крыс были достигнуты использованием следующих фармакологических препаратов, представленных в табл. 2.

Таблица 2

Фармакологическая коррекция функций основных нейромедиаторных __систем мозга

Нейромедиатор Препарат Доза, мг/кг Способ введения

Ацетилхолин Нив алии (Галантамин*) 1 внутрибрюшинно

Гамма-аминомасляная кислота (ГАМК) Аминалон (Аминалон*) 60 перорально

Серотонин Стимулотон (Сертралин*) 17 перорально

Дофамин Наком (Наком*) 180 перорально

Норадреналин Страттера (Атомоксетин*) 1 перорально

Примечание: * - международное название препарата.

Указанные препараты применялись однократно, анализ УЗВ осуществлялся до начала эксперимента (фоновые данные), затем через 1, 2, 4, 6 и 24 часа после введения. Контрольная группа животных получала физиологический раствор в эквивалентных объемах.

Возможность применения УЗВ в доклинической практике в ходе изучения пептидных препаратов, полученных из мозга крупных сельскохозяйственных животных и свиней, под кодовыми названиями «К», «М» и «Р» (молекулярная масса - не выше 50 кД), использовавшихся отдельно и в комплексе с препаратом «в» (молекулярная масса — до 5 кД). Введение всех препаратов осуществлялось ректально, ежедневно, в течение 21 суток. Контрольной группе животных в аналогичном режиме вводился физ. раствор. Анализ УЗВ крыс осуществлялся до начала эксперимента (фоновые данные), затем - еженедельно в течение всего курса введения препаратов.

Оценка статистической значимости и достоверности результатов исследований

Ввиду того, что в разные периоды регистрации не все животные издавали ультразвуковые сигналы (число N варьировалось), для оценки статистической значимости изменений был применен анализ АЬГОУА для несвязанных групп. Учитывали только достоверные изменения СПМ УЗВ (р<0,01). Статистическую обработку полученных результатов по группе животных проводили путем вычисления медиан частот и определения 95% доверительного интервала.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

Исследование параметров УЗВ различных лабораторных животных и выбор оптимальной модели

Видовые особенности

На данном этапе работы выявлялись характерные для различных видов лабораторных животных признаки генерируемой ими УЗВ, оценивалось общее количество сигналов за единицу времени.

В первую очередь, учитывалось количество эпизодов, в которых регистрировался ультразвук, от общей длительности исследования. Построив ряд, в котором на первом месте оказались животные, наиболее часто издававшие сигналы в ультразвуковом диапазоне, а далее - располагая исследуемых животных по убыванию вероятности регистрации ультразвука, получим следующую цепочку: хомяки —* крысы —» мыши —► морские свинки —► мини-свиньи —> кролики —* обезьяны.

Анализ СПМ ультразвука показал, что данные эксперимента можно условно разделить на 3 группы по графическому сходству изменений. Первая группа данных включает результаты, полученные от мышей. Во вторую группу мы отнесли результаты, зафиксированные у кроликов, мини-свиней и хомяков. Общность изменений также характерна и для ультразвука, излучаемого макаками резусами, крысами и морскими свинками (третья группа результатов).

Охарактеризовав животных по мощности ультразвукового сигнала и сгруппировав данные по убыванию этого признака, получим следующий ряд: морские свинки —» мини-свиньи —» кролики —► обезьяны —> крысы —» хомяки —» мыши. Таким образом, морские свинки, например, издают небольшое количество ультразвуковых сигналов в состоянии спокойного бодрствования, но они - наиболее мощные. А ультразвуковая вокализация мышей в сходном состоянии практически не выражена и отсутствует. Данный факт подтверждает имеющиеся сведения о том, что вокализация мышей обычно связана с состоянием, отличным от состояния спокойного бодрствования, размножением и т.д. (т.е. в покое не наблюдается) и условно разделяется на 2 вида - «40-кГц» и «70-кГц» -вокализация [White N.R., Prasad M., Barfïeld R.J., Nyby J.G., 1998]. Мощность УЗВ-сигнала морских свинок и мини-свиней, возможно, коррелирует с таковой звука в слышимом диапазоне в силу их видовых особенностей (достаточно «шумные» животные), встречаемости кратных частот и т.д.

Анализ СПМ ультразвука крыс подтвердил литературные данные о том, что этим животным характерна т.н. «22-кГц ультразвуковая вокализация» (диапазон 20-30 кГц) [Blanchard R.J., Agullana R., McGee L., Weiss S., Blanchard D.C., 1992; Blanchard R.J.,

Blanchard D.C., Agullana R., Weiss S.M., 1991; Brudzynski S.M., 2009; Burgdorf J., Knutson В., Panksepp J., Shippenberg T.S., 2001; Shair H.N., Brunelli S.A., Masmela J.R., Boone E., Hofer M.A., 2003], которая может являться моделью изучения тревожного состояния взрослых крыс, вызывающего страх [Sanchez С., 2003].

Таким образом, ультразвуковая вокализация в состоянии покоя характерна всем исследованным нами лабораторным животным (мыши, крысы, хомяки, морские свинки, кролики, мини-свиньи, обезьяны).

Ультразвук мышей характеризуется преобладанием частот в диапазонах 20-30 кГц и 45-60 кГц. Для кроликов, мини-свиней и хомяков характерна ультразвуковая вокализация частотой 20-25 кГц, в меньшей степени - 35 кГц; также хомяки способны излучать ультразвук частотой приблизительно 55 кГц. Основная частотная составляющая ультразвука макак резусов, крыс и морских свинок лежит в диапазоне 30-50 кГц с пиком в области 37-42 кГц.

Наиболее адекватными животными, используемыми в качестве биомоделей в экспериментах по оценке функционального состояния методом анализа УЗВ, вероятно, являются хомяки и крысы.

Линейные и половозрастные характеристики

Линейные характеристики УЗВ крыс представлены в табл. 3.

Таблица 3

Линия крыс Преобладающая частота УЗВ-сигналов, кГц

August 41

Fisher 17

Бесшерстные 17-18

Таким образом, вокализация исследованных линий крыс имеет свои информативные параметры, сходства и различия. По общей картине УЗВ крысы линий WAG/GY и Fisher весьма похожи и характеризуются преобладанием частот диапазона 3540 кГц, а у линии August и популяции бесшерстных крыс мощность УЗВ в указанном промежутке достаточно низкая и имеет тенденцию к снижению после частоты около 20 кГц.

Изучение половозрастных особенностей УЗВ выполнено на линиях крыс высоко и низко устойчивых к гипоксии (BY/Y и 1IY/Y соответственно).

Анализируя данный этап исследования, можно сделать вывод о том, что статистически значимой разницы в зависимости от пола в ультразвуковой вокализации практически не имеется.

Наиболее тревожными являются крысы линии низко устойчивых к гипоксии, особенно крысята. К 2-3-месячному (половозрелому возрасту) фактор стрессируемости и тревожности нормализуется, а по мере старения - начинает регистрироваться вновь.

Оптимальной в настоящее время моделью для данного типа исследований, основанных на анализе ультразвука, с наибольшей корреляцией в отношении человека, по всей видимости, следует считать половозрелых крыс обоих полов широко известных и используемых линий Wistar и Fisher.

Отражение физиологических и психоэмоциональных состояний в УЗ В

Следующим этапом работы было изучение УЗВ крыс Wistar в различных физиологических и эмоциональных состояниях.

Голод и жажда

Трехдневное голодание вызывает у крыс снижение максимальной СПМ, находящейся в «диапазоне комфорта» (около 40 кГц), переводя ее в диапазон 17-30 кГц, отражающий тревожное состояние животных. Также наблюдается некоторое усиление мощности УЗВ в диапазоне 50-100 кГц по сравнению с результатами фоновых исследований.

Несколько иные результаты были получены в опыте при депривации питьевой воды в течение 3 суток. Жажда вызвала снижение мощности УЗВ практически на всем анализируемом интервале. В «диапазоне комфорта», преобладающем в фоновых замерах УЗВ, СПМ достоверно снижена (практически на 80%). В диапазоне 55-100 кГц отмечается снижение УЗВ, в среднем, на 10%. Наибольшая мощность УЗВ находится на частоте около 52 кГц. Опираясь на некоторые литературные данные [Amir S., 1981], можно предположить, что мощная генерация данной частоты (около 50 кГц) УЗВ у крыс связана с дистрессом и страхом, пребыванием их в шоковом состоянии. Общее снижение мощности УЗВ, возможно, также связано и с упадком их физических сил, обезвоживанием и т.д.

Тревога и агрессия

Максимальные значения СПМ обоих самцов в тесте «Бой самцов», отражающем состояния агрессии и тревоги, приходятся на частоту около 18-20 кГц, после чего происходит планомерное снижение СПМ по мере возрастания частоты. По всей видимости, данный эффект отражает тревожное состояние, которое испытывают оба животных, находящиеся в условиях борьбы друг с другом.

Иммобилизация (обездвиживание)

При иммобилизации СПМ УЗВ крыс снижается в диапазоне 30-45 кГц. Максимальные значения СПМ приходятся на промежуток от 15 до 23 кГц. Имеется небольшое возрастание (порядка 5-7%) в области 55-55 кГц, далее картина УЗВ в исследуемом состоянии практически не отличается от таковой в фоновых измерениях.

Гипоксия игипероксия

При кислородном голодании СПМ УЗВ крыс снижается практически на всем исследуемом частотном диапазоне, кроме промежутка до 20 кГц. Наибольшее снижение наблюдается в «диапазоне комфорта» (на частоте около 42 кГц - достоверное снижение показателя более чем на 60%). Максимальные значения СПМ обнаружены на частоте около 18 кГц. Дополнительный пик имеется в районе 25-26 кГц. Наблюдаемый эффект, по всей видимости, связан с сильнейшим стрессовым влиянием гипоксии, вызывающим приближение УЗВ крыс к слышимому диапазону (и, вероятно, «крику о помощи»), что абсолютно не характерно для их обычного состояния.

Из полученных данных при гипероксии следует, что в диапазоне 30-100 кГц происходит снижение СПМ УЗВ. В «диапазоне комфорта» это снижение наиболее выражено (разница с фоновыми показателями составляет 20-50%). Вместе с тем, отмечается резкое возрастание СПМ в диапазоне 18-25 кГц (разница с фоном - 50-70%). Наблюдаемые эффекты свидетельствуют, что повышенное содержание кислорода в воздухе является для крыс стресс-фактором. Оказавшись в подобной, новой для них обстановке, животные испытывают тревогу и волнение.

Наркоз

Наркозное влияние диэтилового эфира выявило полное отсутствие УЗВ крыс при действии данного средства.

Использование препарата «2о1еШ 100» в качестве наркозного средства вызывает снижение СПМ УЗВ на всем оцениваемом промежутке на 10-15%. Однако УЗВ в состоянии наркоза по-прежнему фиксируется, максимальная его мощность отмечается в «диапазоне комфорта». Таким образом, при использовании Золетила состояние медикаментозного сна (как одного из компонентов глубокого наркоза), возможно, достигается не полностью.

Физическая нагрузка

В данной части работы наблюдается повышение СПМ УЗВ практически на всех анализируемых частотных диапазонах, кроме 30-45 кГц, где, наоборот, отмечается снижение данного показателя. Наибольшая СПМ зафиксирована в диапазоне 19-26 кГц. Дополнительный высоко амплитудный пик мощности приходится на частоту около 53

кГц. Следовательно, интенсивная физическая нагрузка, не характерная для обычной жизни исследуемых животных, является для них стресс-фактором, вызывает тревогу и беспокойство, может приводить к дистрессовому состоянию.

Электрокожное раздражение

При воздействии электрокожного раздражения в УЗВ исследуемых животных отмечается повышение СПМ в диапазоне 17-26 кГц и снижение в остальных исследуемых диапазонах. В «диапазоне комфорта» этот эффект носит достоверный характер: в области 37-45 кГц снижение составляет порядка 65-70%. На частоте около 55 кГц значения СПМ соответствуют таковым в фоновых измерениях. Резюмируя изложенные факты, можно заключить, что электрораздражение является достаточно сильным стресс-фактором для крыс и вызывает тревогу, наблюдаемую в УЗВ, которая имеет тенденцию приближения к слышимому диапазону (видимо, в силу болевых ощущений).

Степень восстановление состояния животных после прекращения стрессового воздействия отражена в табл. 4.

Таблица 4

Степень восстановления состояния животных через 1,5 ч после прекращения стрессового воздействия

Стресс-фактор Преобладающий диапазон частот, кГц Степень восстановления состояния животных

Голод 30-37 практически восстанавливается

Жажда 18-27 не восстанавливается

Иммобилизация 18-43 предположительное ослабление стресса, нормализация состояния, но сохраняется тревожность

Гипоксия 19-25 слабо восстанавливается

Гипероксия 38-43 практически восстанавливается

Физическая нагрузка 20-22 слабо восстанавливается

Электрокожное раздражение 16-18 слабо восстанавливается

Влияние на УЗВ препаратов, изменяющих функции основных ненромедпаторных систем мозга

Для оценки взаимосвязи исследуемого феномена УЗВ с основными нейромедиаторными системами был проведен анализ ее изменений при накоплении в

мозге ацетилхолина, гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), серотонина, дофамина и норадреналина.

Анализ ультразвука крыс в состоянии спокойного бодрствования (что послужило фоновыми показателями) обнаружил 2 пика на частотах около 37 и около 42 кГц.

Накопление ацетилхолина

В первые 2 часа после введения галантамина отмечается постепенное повышение спектральной плотности мощности в полосе 15-30 кГц (рис. 1).

Статистически значимо этот эффект проявляется ко второму часу после введения препарата. Кроме того, измерение через 2 часа показало достоверное увеличение Кспм в полосе 80-100 кГц. Преобладание в спектре ультразвука частот 15-30 кГц и 80-100 кГц характерно и через сутки после введения препарата. Тогда как на 4-й и 6-й час статистически значимых изменений по сравнению с фоном уже не наблюдалось.

Накопление ГАМК

Действие ГАМК выявлялось уже через час после введения препарата {рис. 2). Оно выражалось в достоверном повышении Кспм на частоте около 18 кГц, а также в полосе 78-100 кГц. Через 2 часа происходило снижение Кспм в полосе 36-45 кГц по сравнению с фоном и повышение в полосе 23-27 кГц с максимумом пика на 25 кГц (однако пик не достоверен).

Дальнейшие измерения (через 4, 6 и 24 часа) показали наличие в ультразвуке частот 26-28 кГц. Изменения Кспм других частот статистически незначимо отличаются от фона.

%

Рис. 1. Изменения факторов спектральной плотности мощности ультразвука во времени при накоплении ацегилхолина. По оси абсцисс - частота, кГц; по оси ординат -спектральная плотность мощности (Кспм), %. Жирные точки на графиках - достоверные изменения по сравнению с фоном (тест ANO VA, р<0,01).

Накопление серотонина

После накоплении в мозге серотонина (рис. 3) - так же как и при действии галантамина - наблюдались полифазные явления в УЗВ. Через 1 и 2 часа в ультразвуке преобладали частоты от 23 до 26 кГц.

Вместе с тем, наблюдалось подавление СПМ в частотах, характерных для состояния покоя (35-45 кГц). Через 4 часа к вышеуказанным изменениям добавляется достоверное повышение Кспм в полосе 75-100 кГц. Однако имеются колебания и других частот, хотя значения их спектральной мощности от фоновых значений достоверно не отличаются. Спектрограмма, обнаруженная на 6-й час после введения препарата, приблизительно соответствует таковой в исходном состоянии. Через сутки после введения препарата отмечались изменения, характерные для первых часов.

Приблизительно через 4 часа функции организма восстанавливаются, но остаточные эффекты действия медиатора можно наблюдать и на следующие сутки.

Рис. 2. Изменения факторов спектральной плотности мощности ультразвука во времени при действии ГАМК (все обозначения - как на рис. 1).

Рис. 3. Изменения факторов спектральной плотности мощности ультразвука во времени при накоплении серотонина (все обозначения - как на рис. 1).

Накопление дофамина

При накоплении дофамина в первые 4 часа происходило повышение Кспм в широких полосах 15-33 кГц и 75-100 кГц (рис. 4).

При этом уменьшались ультразвуковые колебания в диапазоне «покоя» (35-45 кГц). Через 6 часов можно было обнаружить преобладание лишь низкочастотных УЗВ-колебаний (15-30 кГц). Через сутки после введения препарата Кспм почти не отличается от фоновых значений.

Рис. 4. Изменения факторов спектральной плотности мощности ультразвука во времени при накоплении дофамина (все обозначения - как на рис.1).

Накопление норадреналина

Действие норадреналина на УЗВ исследуемых животных, вероятно, сводилось к двум этапам (рис. 5).

В первые 2 часа отмечалось нарастание СПМ колебаний отдельных частот в полосе 15-37 кГц, и ко 2-му часу данные изменения становились выраженными, что проявлялось, в частности, в формировании пика на частоте 24-25 кГц. Кроме этого, происходило повышение Кспм частотой 57, 68 кГц и целой частотной полосы 74-100 кГц. Второй этап характеризовался общим подъемом Кспм полосы 15-37 кГц, что наиболее ярко представлено при анализе изменений через 6 часов. Также наблюдалось повышение

Са моральная

плоскость мощности

(Кспм)

1

Кспм высокочастотных колебаний аналогично изменениям на 2-м часе после введения препарата. Через 24 часа статистически значимых отличий по сравнению с фоном уже обнаружено не было.

Г ИОТНОСТЬ мощности (Кепи)

40

Частота (кГц)

Временной интервал исследования

Рис. 5. Изменения факторов спектральной плотности мощности ультразвука во времени при накоплении норадренапина (все обозначения — как на рис. 1).

Преимущественная СПМ УЗВ в контрольных измерениях (рис. 6) на протяжении суток регистрировалась на частотах около 20 кГц. Через 24 часа максимум СПМ приходился на частоту около 26 кГц.

Таким образом, изменение нейромедиаторного пейзажа, обусловленное накоплением ацетилхолина, норадренапина, серотонина, дофамина и ГАМК, влияет на характер проявления УЗВ за счет преобразования частотных характеристик и их спектральной мощности.

При накоплении каждого из исследуемых нейромедиаторов изменения УЗВ были многофазными на протяжении 24 часов. По ацетилхолину и ГАМК они были практически идентичными, а по серотонину, дофамину и норадреналину - схожими, но имеющими свои особенности. Эффекты накопления ацетилхолина, серотонина и ГАМК сохранялись в УЗВ и на следующие сутки, они в значительной степени соответствовали эффектам

первых двух часов после введения препаратов, а при накоплении дофамина и норадреналина наибольшая мощность УЗВ сместилась в диапазон около 30 кГц.

Проведенное исследование позволяет заключить, что преимущественное влияние на УЗВ после изменения нейромедиаторного пейзажа, по всей видимости, оказывает серотонин, эффекты накопления которого определяют наиболее четкие и однозначные преобразования в вокализации крыс. Накопление дофамина и норадреналина, вероятно, способствует более быстрому снижению тревожности и нормализации психоэмоционального состояния животных.

Рис. 6. Изменения факторов спектральной плотности мощности ультразвука во времени в контрольных измерениях с физ. раствором (все обозначения - как на рис. 1).

Влияние нейропептидов на УЗВ. Анксиолитический и седативный эффекты

Анализ УЗВ крыс в фоновых измерениях обнаружил наибольшую мощность пиков в диапазоне 20-30 кГц, с максимумом в области ~25 кГц. Аналогичной картина УЗВ была в группе контроля - до начала эксперимента, на 7-й, 14-й и 21-й день, однако с каждой неделей наблюдалось возрастание мощности в сторону диапазона выше 30 кГц.

Эти данные согласуются с результатами, полученными нами и другими авторами ранее, и говорят о том, что частотная полоса 20-30 кГц является показателем тревожности

и беспокойства у крыс, а полоса 35-45 кГц - показателем комфортного состояния [Blanchard R.J., et al., 1991, 1992; Brudzynski S.M., 2007, 2009; Burgdorf J., et al., 2001; tCnutson В., et al., 1999, 2002; Shair H.N., et al., 2003; Sanchez С., 2003; Thompson В., et al., 2006]. Косвенно это подтверждает и смещение наибольшей мощности в сторону диапазона от 30 кГц и выше на протяжении эксперимента, что, вероятно, связано с привыканием животных к новым условиям клетки, в которой происходило исследование.

В опытных группах картина УЗВ оказалась отличной от контроля уже на первом этапе исследования, т.е. через 7 дней после введения препаратов.

Например, при анализе УЗВ группы препарата «Р» на 7-й день исследования наибольшая мощность (-70%) приходится на диапазон 37-42 кГц. СПМ в диапазоне 20-30 кГц существенно снижена по сравнению с фоновыми данными (почти на 30%).

Таким образом, снижение СПМ в «диапазоне тревоги» и повышение ее в «диапазоне комфорта» позволяет предположить, что данный препарат обладает анксиолитическим действием на крыс.

Довольно схожая картина УЗВ наблюдалась на данном этапе исследования в группе препарата «Р», вводимого в комплексе с «G». Наибольшая мощность УЗВ здесь также наблюдается в «диапазоне покоя» (на частоте около 33 кГц), а в «диапазоне тревоги» СПМ достоверно снижена почти на 50% по сравнению с фоновыми данными. В целом, действие препарата на данном этапе характеризует значительное снижение спектральной мощности по отношению к фону на всем анализируемом промежутке (в диапазоне 50-100 кГц - разница достоверна).

Аналогичные графики наблюдались в исследовании УЗВ на 7-й день эксперимента и в остальных группах препаратов.

Исследование вокализации на 14-й день эксперимента явило, в целом, схожие, но более ярко выраженные результаты.

По истечении курса введения тестируемых веществ (на 21-й день эксперимента) было сделано заключительное исследование УЗВ, отразившее стабильность наблюдаемой тенденции. Основная мощность издаваемых сигналов в этот период исследования приходится на диапазон 30-42 кГц, т.е. отражает позитивное, комфортное состояние животных. Следовательно, данный комплекс анализируемых препаратов на этом этапе исследования по-прежнему характеризуется анксиолитическим действием.

Таким образом, данным исследованием было подтверждено, что УЗВ крыс отражает различные психоэмоциональные состояния - как отрицательные (тревога, страх, стресс), так и положительные (комфорт, спокойное бодрствование). Показателем

тревожности является преобладание спектральной мощности в диапазоне 20-30 кГц, а показателем комфорта - диапазон около 35-45 кГц.

Пептиды природного происхождения способны оказывать позитивное (анксиолитическое, антифобическое, седативное) действие на крыс, которое наблюдается уже после недели введения и сохраняется, по крайней мере, в течение 21 дня инъекций препаратов. Пик указанного действия приходится, вероятнее всего, на 14-е сутки курса введения.

Предложенная модель исследования эмоционального состояния по вокализации крыс в ультразвуке может быть использована в доклинических испытаниях препаратов аналогичного действия.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что феномен ультразвуковой вокализации (УЗВ) в диапазоне 20100 кГц регистрируется у ряда лабораторных животных (мыши, крысы, хомяки, морские свинки, кролики, мини-свиньи, обезьяны) в состоянии спокойного бодрствования и может быть использован в качестве нового информативного параметра в биомедицинских и доклинических исследованиях.

2. Показано, что количественный и качественный анализ УЗВ отображает различные физиологические и психоэмоциональные состояния животных. Так, у крыс состоянию спокойного бодрствования и «зоне комфорта» соответствует диапазон 35-45 кГц, состоянию «тревоги» и болевому стрессу - диапазон 20-30 кГц. Близкие частотные характеристики были присущи также и некоторым другим животным.

3. Наиболее адекватными биомоделями для оценки функционального состояния методом УЗВ являются крысы и хомяки. УЗВ крыс имеет характерные особенности для разных линий и возрастов животных, но практически не имеет тендерных отличий.

4. По показателям УЗВ возможно дифференцировать выбор животных для корректных физиологических исследований, поскольку в покое у половозрелых (2-4 и более месяцев) крыс превалируют сигналы в диапазоне 35-45 кГц, что свидетельствует об их комфортном состоянии, тогда как у крыс в возрасте до 1,5 месяцев наблюдаются признаки постоянной тревожности, которую отражает доминирование УЗВ-сигналов в диапазоне 20-30 кГц.

5. По показателям УЗВ длительная жажда (3 суток), гипоксия, электрокожное раздражение и предельная физическая нагрузка вызывают стрессорное состояние у крыс в виде страха и тревожного ожидания, сохраняющихся в течение более полутора часов

после прекращения воздействия. В то же время, голод, иммобилизация и гипероксия, также являющиеся стресс-факторами для этих животных, быстро нивелируются после прекращения их воздействия.

6. Обнаружено, что селективное накопление в ЦНС нейромедиаторов существенно влияет на формирование УЗВ-откликов. Так, ацетилхолин повышал значения спектральной плотности мощности ультразвука в диапазоне 15-20 кГц в течение первых двух часов после изменения «нейромедиаторного пейзажа»; при накоплении ГАМК аналогичный эффект наблюдался в течение первого часа и спустя 6 часов, а через 2 часа происходило снижение УЗВ в данном диапазоне; дофамин способствовал заметному усилению УЗВ в диапазоне 15-18 кГц на протяжении 6 часов, с пиковыми значениями по прошествии 2 часов после изменения «пейзажа»; схожие эффекты были зафиксированы при накоплении норадреналина, однако пик действия приходился на шестой час. Серотонин повышал СПМ УЗВ в узком диапазоне 20-22 кГц, в течение 2 часов стабильно подавляя при этом сигналы во всех остальных исследуемых диапазонах, а через 4-6 часов картина УЗВ соответствовала таковой в фоновых измерениях.

7. Исследования влияния новых органических белково-пептидных веществ природного происхождения (молекулярной массой 5-10 кД) на УЗВ выявили преобладание и возрастание СПМ в частотном диапазоне 35-45 кГц, что позволяет предположить возможный анксиолитический эффект данных веществ на крыс.

8. Установлено, что УЗВ может служить показателем глубины наркоза и обезболивания. Эфирный наркоз полностью блокировал УЗВ-сигналы крыс, тогда как широко применяемый в ветеринарии и лабораторных исследованиях наркоз Золетил не устранял полностью чувствительность, что подтверждало обнаружение частотного диапазона 40-50 кГц, характерного для болевого синдрома.

9. Анализ УЗВ-сигналов является объективным методом оценки функционального состояния животных и получения информативных показателей лабораторных животных, а также новым подходом в биомедицинских и доклинических исследованиях.

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

По результатам проведенной работы установлено, что вокализация животных в

ультразвуковом диапазоне является объективным показателем, отражающим функциональное и психоэмоциональное состояния. На основании этого, предложенная модель может быть использована в биомедицинских и доклинических исследованиях для оценки глубины стрессорного воздействия электрокожного раздражения, жажды и голода.

гипоксии и гипероксии, физической нагрузки и других стресс-факторов для животных, с целью определить выбор модели животных для исследования, включая их возрастные и видовые особенности и т.д. Данная модель исследований, основанная на анализе вокализации животных, также является адекватным дополнительным методом при исследовании и выяснении активности биологического действия веществ различной природы.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

А ампер, единица измерения силы электрического тока

В вольт, единица измерения электрического потенциала, разности

потенциалов, электрического напряжения и электродвижущей силы

ГАМК гамма-аминомасляная кислота

кД килодальтон, атомная единица массы, 1 кД = 1000 Д

кГц килогерц, единица измерения частоты ультразвука, 1 кГц = 1000 Гц

мг миллиграмм, дольная единица измерения массы, 1 мг = 0,001 г

мс миллисекунда, единица времени, 1 мс = 0,001 с

НЦБМТФМБА ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»

СПМ, Кспм спектральная плотность мощности ультразвука, коэффициент спектральной плотности мощности ультразвука

УЗВ ультразвуковая вокализация животных

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зубалий A.M., Фокин Ю.В. Влияние различных видов наркоза на выживаемость лабораторных крыс в послеоперационный период // Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных: Мат-лы межд. научн.-практ. конф., посвящ. 80-летию каф. анатомии и гистологии с.-х. животных, 100-летию со дня рожд. проф. Н.И. Акаевского и 15-летию кинологического центра -21 мая 2009 г.: Сб. научн. тр.-Троицк: УГАВМ. - 2009. - С. 239-241.

2. Фокин Ю.В.. Каркищенко В.Н. Вокализация крыс в ультразвуковом диапазоне как модель оценки стрессового влияния обездвиживания, электрокожного раздражения, физической нагрузки и фармакодинамики лекарств // Биомеднцииа. - 2010. - X» 5. -С. 17-21.

3. Каркищенко H.H., Фокин Ю.В.. Сахаров Д.С., Каркищенко В.Н., Капанадзе Г.Д., Чайванов Д.Б. Ультразвуковая вокализация и её информативные параметры у животных и человека // Биомедицина. - 2011. - № 1. - С. 4-23.

4. Фокин Ю.В.. Сахаров Д.С. Сравнительная характеристика и возможность использования наркотизирующих препаратов Золетил 100 и диэтиловый эфир при проведении операций по вживлению ЭЭГ-электродов на крысах // Биомедицина. -2011. -№ 1.-С. 84-89.

5. Каркищенко H.H., Фокин Ю.В.. Каркищенко В.Н., Сахаров Д.С., Алимкина О.В. Роль нейромедиаторных систем мозга в генерации ультразвуковой вокализации и её корреляции с поведением животных // Биомедицина. - 2011. - № 4. - С. 8-18.

6. Каркищенко H.H., Фокин Ю.В.. Каркищенко В.Н., Касинская Н.В., Алимкина О.В. Влияние нейромедиаторных систем мозга на поведение и вокализацию крыс в ультразвуковом диапазоне: Мат-лы Московской межд. научно-практ. конф. «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 20-22 марта 2012 г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии». - РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2012. - 185 с.

7. Беляев Д.А., Пекелис М.М., Фокин Ю.В.. Казакова JI.X. Анализ некоторых физиологических и этологических характеристик бесшерстных крыс как новая модель биомедицинских исследований // Биомедицина. - 2012. - № 1. - С. 29-36.

8. Фокин Ю.В. Влияние пептидов и низкомолекулярных белков природного происхождения на вокализацию крыс в ультразвуке // Биомедицина. - 2012. - № 2. -С. 84-91.

9. Каркищенко H.H., Фокин Ю.В. Биологические модели в инновационной фармакологи» // Мат-лы IV съезда фармакологов России «Инновации в современной фармакологии» 18-21 сентября 2012 г. Республика Татарстан, г. Казань. - М.: Фолиум. - 2012. - 82 с.

Заказ № 185 от 13.02.2014г. Тираж 100 экз. ООО «Формат» ул. Прянишникова д.19а, стр.9 www.ks-format.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Фокин, Юрий Владимирович, Москва

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства России»

ПРИМЕНЕНИЕ АНАЛИЗА УЛЬТРАЗВУКОВОЙ ВОКАЛИЗАЦИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ В БИОМЕДИЦИНСКИХ И ДОКЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЯХ

Специальность 03.03.01 - Физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

академик PAP АН, член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор КАРКИЩЕНКО Николай Николаевич

Москва-2013

04201456769

На правах рукописи

ФОКИН Юрий Владимирович

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список терминов, условных обозначений и сокращений..............................4

Введение..............................................................................................................................................5

Глава 1. Обзор литературы........................................................................................................................13

1.1. Лабораторные животные и их использование в биомедицинских исследованиях и доклинических испытаниях фармпрепаратов..........13

1.2. Ультразвук и его генерация животными................................................................13

1.2.1. Физические свойства и применение ультразвука........................................................13

1.2.2. Биология ультразвука..............................................................................................................14

1.2.3. Возможные механизмы генерации УЗВ животными............................................17

1.2.4. УЗВ и ее роль в поведении животных......................................................................21

1.2.5. УЗВ как инструмент исследования лабораторных животных............21

1.2.6. Отражение позитивных и негативных эмоций в УЗВ крыс........................23

1.2.7. Нейрохимические основы УЗВ крыс................................................................................................29

1.3. Регистрация УЗВ лабораторных животных и ее характеристики.. 31

1.4. Фармакологическая коррекция психоэмоциональных состояний

и ее отражение в УЗВ лабораторных животных............................................................33

1.5. Ультразвуковые шумы в лабораторных помещениях и способы

их устранения..................................................................................................................................43

Глава 2. Материалы и методы исследований............................................................................46

2.1. Место проведения и сроки..................................................................................................46

2.2. Дизайн и организация исследования........................................................................46

2.3. Регулирующие стандарты....................................................................................................46

2.4. Исследуемые объекты............................................................................................................47

2.5. Условия кормления и содержания животных....................................................48

2.6. Методика регистрации УЗВ................................................................................................49

2.7. Моделирование физиологических и психоэмоциональных состояний (на крысах)..............................................................................................................54

2.8. Использованные фармакологические средства при проведении доклинических исследований с оценкой УЗВ................................57

2.9. Оценка статистической значимости и достоверности результатов исследований......................................................................................................59

Глава 3. Результаты исследований. Информативные параметры УЗВ............60

3.1. Исследование параметров УЗВ различных лабораторных животных и выбор оптимальной модели................................................................60

3.1.1. Видовые особенности..............................................................................................................60

3.1.2. Линейные и половозрастные характеристики....................................................67

3.2. Отражение физиологических и психоэмоциональных состояний

в УЗВ......................................................................................................................................................76

3.2.1. Голод и жажда................................................................................................................................77

3.2.2. Тревога и агрессия......................................................................................................................80

3.2.3. Иммобилизация (обездвиживание)..............................................................................81

3.2.4. Гипоксия и гипероксия..............................................................................................................83

3.2.5. Наркоз....................................................................................................................................................87

3.2.6. Физическая нагрузка..................................................................................................................................89

3.2.7. Электрокожное раздражение............................................................................................90

3.3. Влияние на УЗВ препаратов, изменяющих функции основных нейромедиаторных систем мозга....................................................................................................92

3.3.1. Накопление ацетилхолина..................................................................................................93

3.3.2. Накопление гамма-аминомасляной кислоты......................................................94

3.3.3. Накопление серотонина..........................................................................................................95

3.3.4. Накопление дофамина..............................................................................................................96

3.3.5. Накопление норадреналина................................................................................................97

3.4. Влияние нейропептидов на УЗВ. Анксиолитический и седативный эффекты....................................................................................................................................................99

Заключение........................................................................................................................................106

Научно-практические рекомендации..........................................................................108

Список литературы............................................................................................................................109

СПИСОК ТЕРМИНОВ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И

СОКРАЩЕНИЙ

кГц - килогерц, единица измерения частоты ультразвука,

1 кГц = 1000 Гц

НЦБМТ ФМБА - ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий

Федерального медико-биологического агентства России»

СПМ - спектральная плотность мощности ультразвука

УЗВ - ультразвуковая вокализация животных

ЦНС - центральная нервная система

GLP - Good Laboratory Practice, Надлежащая лабораторная

практика

F - female, самка

М - male, самец

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Мелкие грызуны являются наиболее распространенными лабораторными животными, используемыми в биомедицинских исследованиях и доклинических испытаниях фармакологических средств для изучения основных механизмов, определяющих эмоциональные и мотивационные функции. Их исследование обычно опирается на изученные поведенческие особенности. Кроме того, предполагающиеся мотивационные и эмоциональные состояния, как правило, основываются на физиологических величинах - таких как уровень активности мозга, частота сердечных сокращений или ' секреция кортикостерона.

Помимо этих величин, информативные данные о животных могут быть получены путем измерения их вокализации, существенная часть которой представлена в ультразвуковом диапазоне. Ультразвуковая вокализация (УЗВ) является поведенчески важной, по крайней мере, по двум причинам: во-первых, она может служить мерой оценки текущего состояния животных, а во-вторых, вероятно, является важной коммуникативной особенностью, которая должна приниматься во внимание при анализе различных социальных аспектов их поведения (спаривание, кормление, агрессия, защита и т.д.) [2, 4, 7, 141].

Однако в литературе содержится довольно скудное количество сведений, касающихся изучения УЗВ различных биологических объектов; все проанализированные работы были выполнены, в основном, в области зоопсихологии и фармакологии и только на мелких лабораторных животных (мышах и крысах). В связи с этим, дальнейшее изучение данного феномена как нового метода биомедицинских исследований послужило основанием для проведения диссертационного исследования.

Анализ параметров УЗВ может послужить дополнением к имеющимся методам доклинических исследований, и данное предположение было также положено в основу настоящей диссертационной работы.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы состоит в изучении феномена ультразвуковой вокализации различных лабораторных животных, анализ которой может являться методом биомедицинских и доклинических исследований.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить УЗВ доступных для исследования видов, пород, линий и половозрастных групп лабораторных животных в различных физиологических и психоэмоциональных состояниях, а также при использовании лекарственных средств направленного действия.

2. Выявить информативные параметры УЗВ, служащие мерой оценки исследуемого признака.

3. Проанализировать возможность применения данного метода в биомедицинских и доклинических исследованиях.

Объект и предмет исследования

Объектом исследования выступают физиологические механизмы «языка животных» и закономерности функционирования их нервной системы.

Предметом диссертации является разработка метода исследования и коррекции физиологических и психоэмоциональных состояний лабораторных животных на основе анализа их вокализации в ультразвуковом диапазоне.

Теоретическую и методологическую основу исследования составляют системный подход к изучению функций нервной системы лабораторных животных и комплексный анализ отечественных и зарубежных научных трудов по данной тематике. При работе над диссертацией использовались методы эксперимента, сравнения, моделирования, аналогии и проверки гипотез.

Степень научной разработанности проблемы

Немногочисленные данные о физиологических основах УЗВ были найдены в работе американских ученых-отоларингологов во главе с I. Sanders, где показано, что механизм генерации УЗВ (у крыс) связан с сокращением голосовых связок и выдыханием воздуха, как это происходит при свисте. Определенный вклад в изучение проблемы применения анализа УЗВ лабораторных животных внесли зарубежные ученые J.W. Anderson, C.V. Portfors, M. Wöhr, R.K.W. Schwarting, C. Sanchez, M.S. Blumberg, S.M. Brudzinski, Y. Liu, M. Weber, N.R. White, B.E.F. Gourbal, B. Knutson и др. Вопросами взаимодействия ультразвука с биологическими ; объектами занимались и такие отечественные ученые как, например, В1Б. Акопян и Ю.А. Ершов.

Их работы в значительной мере способствовали изучению УЗВ в области зоопсихологии и фармакологии, затрагивали анализ коммуникативных особенностей мелких лабораторных животных. Были получены частотные и спектральные характеристики ультразвука взрослых особей и , детенышей мышей и крыс, некоторые параметры УЗВ при изолированном и групповом содержании, изучалось отражение полового поведения животных на генерируемые ими УЗВ-сигналы. Также были исследованы эффекты действия на УЗВ крыс некоторых фармакологических препаратов - анксиолитиков, антидепрессантов, транквилизаторов.

Однако в трудах этих ученых не рассматриваются характеристики УЗВ других видов лабораторных животных, их породные, линейные и половозрастные особенности. Этими вопросами, а также изучением параметров УЗВ в некоторых физиологических и психоэмоциональных состояниях и при действии различных фармакологических средств, в т.ч. изменяющих нейромедиаторный пейзаж, мы впервые стали заниматься в лаборатории нейротехнологий НЦБМТ ФМБА, под руководством чл.-корр. РАМН, д.м.н., профессора H.H. Каркищенко.

Недостаточная научная проработанность проблемы обусловила необходимость практического исследования природы' феномена УЗВ животных, определила выбор цели, задач и предмета данной работы.

Информационная база исследования состоит из зарубежных и нескольких отечественных научных трудов по физиологии, зоопсихологии и фармакологии, частично описанных выше.

Научная новизна диссертации

Впервые в отечественных научных работах получены данные об ультразвуковой вокализации разных видов лабораторных животных. В отличие от ранее опубликованных трудов, в исследования УЗВ были включены не только мыши и крысы, но и хомяки, морские свинки, кролики, мини-свиньи и высшие приматы.

Учитывая количество генерируемых за единицу времени ультразвуковых сигналов, их однородность по частотным и спектральным характеристикам, а также принимая во внимание изученность данного феномена на лабораторных животных, нами было сделано заключение о том, что оптимальной биомоделыо для данного типа исследований являются половозрелые особи крыс и хомяков.

Установлено, что УЗВ животных имеет свои информативные признаки в зависимости от вида, линии и возраста животных. С половой принадлежностью частотные и спектральные характеристики УЗВ связаны незначительно.

Выявлено, что некоторые физиологические и психоэмоциональные состояния крыс, отличные от состояния спокойного бодрствования (голод, жажда, иммобилизация, физическая нагрузка, наркоз, гипоксия, тревога, агрессия и т.д.), отражаются в их вокализации в ультразвуковом диапазоне, что также наблюдается и при использовании фармакологических средств, влияющих на нейромедиаторный пейзаж или имеющих анксиолитическое, антифобическое и седативное действие.

Результаты проведенных исследований позволяют рассматривать анализ УЗВ как метод оценки и коррекции состояния животных в биомедицинских и доклинических исследованиях.

Достоверность научных положений подтверждена проведением исследования на достаточно большой выборке различных видов и групп лабораторных животных, путем сравнения теоретических и экспериментальных результатов, апробацией результатов в практике.

Научные положения, выносимые на защиту

1. Вокализация в ультразвуковом диапазоне характерна мышам, крысам, хомякам, морским свинкам, кроликам, мини-свиньям и макакам резусам.

2. Информативные параметры УЗВ крыс имеют линейные и возрастные особенности. Изменение физиологического и психоэмоционального состояния крыс отражается в их УЗВ.

3. Анализ УЗВ крыс позволяет прослеживать изменение нейромедиаторного пейзажа, анксиолитические и седативные эффекты лекарственных средств.

4. Регистрация УЗВ крыс может являться объективным методом биомедицинских и доклинических исследований.

Практическая значимость работы заключается в развитии методической базы биомедицинских и доклинических исследований, которые будут дополнены новым методом оценки различных физиологических и психоэмоциональных состояний животных.

Апробация и внедрение результатов работы

Основные результаты диссертационного исследования были представлены:

S в виде докладов на VII, VIII и IX Научно-практических конференциях «Биомедицина и биомоделирование», проходящих в НЦБМТ ФМБА в 2011, 2012 и 2013 гг. соответственно, а также на заседании студенческого научного общества имени Б.А. Кузнецова, РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 12 декабря 2011 г.; S в виде тезисов на Московской международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии», 20-22 марта 2012 г., а также на IV съезде фармакологов России «Инновации в современной фармакологии», 18-21 сентября 2012 г.

Результаты диссертационного исследования Фокина Ю.В. внедрены в практику работы ФГБУН «НЦБМТ ФМБА России», ГБОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет» Минздрава России, ГБОУ ВПО СПХФА Минздрава России.

Публикации

По теме диссертационной работы автором было опубликовано 9 работ общим объемом 63 печатных листа.

1. Зубалий A.M., Фокин Ю.В. Влияние различных видов наркоза на выживаемость лабораторных крыс в послеоперационный период // Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных: Мат-лы межд. научн.-практ. конф., посвящ. 80-летию каф. анатомии и гистологии с.-х. животных, 100-летию со дня рожд. проф. Н.И. Акаевского и 15-летию кинологического центра - 21 мая 2009 г.: Сб. научн. тр. - Троицк: УГАВМ. - 2009. - С. 239-241.

2. Фокин Ю.В., Каркищенко В.Н. Вокализация крыс в ультразвуковом диапазоне как модель оценки стрессового влияния обездвиживания, электрокожного раздражения, физической нагрузки и фармакодинамики лекарств//Биомедицина. -2010. -№ 5. - С. 17-21.

3. Каркищенко H.H., Фокин Ю.В., Сахаров Д.С., Каркищенко В.Н., '

и

Капанадзе Г.Д., Чайванов Д.Б. Ультразвуковая вокализация и её информативные параметры у животных и человека // Биомедицина. -

2011. -№ 1. -С. 4-23.

4. Фокин Ю.В., Сахаров Д.С. Сравнительная характеристика и возможность использования наркотизирующих препаратов Золетил 100 и диэтиловый эфир при проведении операций по вживлению ЭЭГ-электродов на крысах // Биомедицина. - 2011. - № 1. - С. 84-89.

5. Каркищенко H.H., Фокин Ю.В., Каркищенко В.Н., Сахаров Д.С., Алимкина О.В. Роль нейромедиаторных систем мозга в генерации ультразвуковой вокализации и её корреляции с поведением животных // Биомедицина. - 2011. - № 4. - С. 8-18.

6. Каркищенко H.H., Фокин Ю.В., Каркищенко В.Н., Касинская Н.В., Алимкина О.В. Влияние нейромедиаторных систем мозга на поведение и вокализацию крыс в ультразвуковом диапазоне: Мат-лы Московской межд. научно-практ. конф. «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 20-22 марта 2012 г.). - М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии». - РХТУ им. Д.И. Менделеева. - 2012. - 185 с.

7. Беляев Д.А., Пекелис М.М., Фокин Ю.В., Казакова JI.X. Анализ некоторых физиологических и этологических характеристик бесшерстных крыс как новая модель биомедицинских исследований // Биомедицина. -

2012.-№ 1,-с. 29-36.

8. Фокин Ю.В. Влияние пептидов и низкомолекулярных белков природного происхождения на вокализацию крыс в ультр