Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза"

0034И4 I На правах рукописи

АНТОНОВ Валерий Алексеевич

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ВНУТРИВИДОВОЕ ТИПИРОВАНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА

03.00.07 - микробиология 03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

2 6 НОЯ 2009

Волгоград-2009

003484114

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор доктор медицинских наук, доцент доктор медицинских наук, с.н.с.

Алексеев Владимир Валерьевич Замараев Валерий Семенович

Швиденко Инна Григорьевна Бойко Андрей Витальевич Пятков Владимир Анатольевич

Ведущая организация: ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспспребнадзора

Защита состоится «15>

'X 2009 г. в Ю часов на заседании диссер-

тационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

Автореферат разослан «\Ц » х 2009 г.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

старший научный сотрудник А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Burkkolderia mallei и Burkholderia pseu-domallei вызывают заболевания сап и мелиоидоз, признаваемые как самостоятельные нозологические единицы. Эти возбудители относятся ко II группе патогенности и, по мнению отечественных и зарубежных специалистов, являются потенциальными агентами биотерроризма (Wheelis М., 1998; Leha-vi О., et al., 2002; Алексеев B.B. с соавт., 2003; Bossi Р. et al., 2004; Ruppitsch W. et al., 2007). Исследовательские работы с использованием патогенных биологических агентов создают реальную опасность внутрилабораторных заражений персонала, а также угрозу аварий на объектах, где проводятся работы с патогенными микроорганизмами (Srinivasan А. et al., 2001; Currie В. J. et al., 2003).

Сегодня в мире проблема сапа не стоит так остро, как ранее, что связано с уменьшением численности лошадей, являющихся основным резервуаром этой инфекции, однако сап по-прежнему наносит значительный экономический урон в крупных животноводческих хозяйствах Турции, Ирана, Объединенных Арабских Эмиратов, Афганистана, Индии, Китая, Монголии, а также стран Африки и Латинской Америки (Aran S. et al., 1999; Anuntagool N. et al. 2002; Nierman W.C. et al. 2004; Harvey S.P. 2005; Scholz H.C. et al., 2006). Заболеваемость сапом среди людей носит, в основном, спорадический характер. В то же время, возбудитель сапа крайне опасен в лабораторных условиях. Это подтверждает трагический опыт большого количества исследователей сапа (Вышелесский С.Н., 1909; Srinivasan А. et al., 2001).

Ранее считалось, что мелиоидоз единственное заболевание, вызываемое буркхольдериями, распространение которого в природе имеет определенные географические границы: оно эндемично лишь для Австралии и стран Юго-Восточной Азии (Cravitz L. 1950; Rogul М. et al., 1970; Ширяева Д.Т. 1976). На сегодняшний день эта точка зрения изменилась. В настоящее время мелиоидоз обнаружен далеко за пределами эндемичных территорий Азии и Австралии (Cheng А. С., 2005), спорадические случаи и очаги мелиоидоза выявлены в странах Центральной и Южной Америки, Западной Африки и даже в Европе (Dance D.A., 2000; Carlson P., 2001; Heyse A.M. et al., 2003; Dance D.A. et al., 2004; Issack M.I. et al., 2005; Rolim D.B., 2005). Причем, в Сальвадоре и Чили возбудитель мелиоидоза признан как этиологический агент нозокомиальных и оппортунистических инфекций с неблагоприятным прогнозом (Cheng А. С., 2005). Большинство случаев, зарегистрированных за пределами эндемичных территорий, связано с пребыванием в Юго-Восточной Азии и Австралии туристов, имевшими прямой контакт с конта-минированной B.pseudomallei пылью или водой (Currie В. J., 2003; Dance D.A. et al., 2004; Maccanti О. et al„ 2004; Kateruttanakul P. et al., 2005; Mandjee A., 2005; Shrestha N., 2005). Риск заражения мелиоидозом увеличивается в период природных катастроф (Allworth A.M., 2005; Chierakul W. et al., 2005).

Актуальность создания эффективных средств диагностики сапа и мелиоидоза определяется реальной угрозой возникновения в любом регионе

мира неблагоприятной эпидемической ситуации по этим инфекциям в связи со значительным ростом грузо- и пассажиропотоков, появления возбудителей за счёт завоза больных животных, а также пищевых продуктов, контамини-рованных патогенными буркхольдериями. Способность к длительной бессимптомной персистенции возбудителя мелиоидоза в организме являются дополнительными причинами расширения ареала инфекции в результате миграции людей и животных с латентной формой заболевания (Koponen М.А., 1991; Riecke К. et al., 1997; Ngauy V. et al., 2005; Frangoulidis D. et al., 2007).

На сегодняшний день можно констатировать, что существующие методы обнаружения патогенных буркхольдерий оказываются недостаточно эффективными для экспресс-диагностики, а идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза по-прежнему является трудоемкой задачей. Традиционная лабораторная диагностика, направленная на выделение чистой культуры возбудителей с последующей ее идентификацией, позволяет дать положительный ответ лишь через 36-48 ч. Серологические методики дают более быстрые результаты, но обладают относительно низкой чувствительностью и недостаточной специфичностью из-за возможных перекрёстных реакций с гетероло-гичными видами микроорганизмов и антигенной вариабельности штаммов. Кроме того, диагностическая ценность иммунологических методов ограничена при выявлении патогенных буркхольдерий на ранних стадиях инфекционного процесса.

Бурное развитие молекулярно-генетических технологий и достижения современной фундаментальной науки внесли значительный вклад в совершенствование средств диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней. Изучение геномов возбудителей особо опасных инфекций, включая В. mallei и В. pseudomallei привело к созданию и широкому внедрению новых методических подходов, направленных на идентификацию и типиро-вание патогенов. Однако отсутствие общепринятых коммерческих тест-систем, предназначенных для выявления видоспецифических последовательностей ДНК и антигенов этих микроорганизмов, приводит к тому, что в рутинной практике до сих пор используют лишь микроскопию и биохимические системы идентификации подобные API 20NE (Zysk G., 2000; Cheng A. С., 2005). Молекулярно-биологические методы обнаружения патогенных буркхольдерий включают в схему лабораторной диагностики в качестве подтверждающих тестов, как правило, при положительных находках в полуавтоматических системах идентификации (Srinivasan А., 2001; Inglis T.J.J, et al., 2005).

Традиционные методы типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, основанные на культивировании микроорганизмов, изучении особенностей их метаболизма и антигенного строения, различной чувствительности к бактериофагам и антибиотикам (Манзенюк О.Ю. с соавт., 1994; Илюхин В.И. с соавт., 1995; Гришкина Т.А., 1996; Пивень Н.Н., 1997; Илюхин В.И. с соавт., 1998), отличаются ресурсоемкостью и в большинстве случаев не позволяют выявить отличия между штаммами патогенных буркхольдерий. Данные методы, основанные на изучении фенотипических свойств,

имеют существенные недостатки, связанные с относительной однородностью фенотипических свойств штаммов этих видов микроорганизмов, что определяет трудности в их инфравидовой дифференциации. В связи с этим, на сегодняшний день ни один из фенотипических маркеров не обеспечивает необходимую эффективность при расшифровке вспышек сапа и мелиоидоза.

В последние годы среди используемых методов типирования главенствующее место стали занимать молекулярно-биологические подходы. Результаты генотипирования характеризуются большей достоверностью по сравнению с морфологическими, биохимическими или иммунологическими методами дифференциации микроорганизмов (Блохина И.Н. с соавт., 1992; Tenover F.C.,1997; Шагинян И.А., 2000). Методы генетического типирования - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов, гель-электрофорез в пульсирующем электрическом поле, различные варианты полимеразной цепной реакции и мультилокусного сиквенс-типирования были адаптированы для дифференциации штаммов В. pseudomallei, выделенных из внешней среды, от животных и человека (Trakulsomboon S. et al., 1994; Haase A. et al., 1995; Trakulsomboon S. et al., 1997; Currie B.J. et al., 2000; Pitt T.L. et al., 2000), расшифровки вспышек мелиоидоза (Currie B.J. et al., 2001; Ulett G.C. et al., 2001) и оценки эффективности проводимой антибиотикотерапии (Vadivelu J. et al., 1997; Koonpaew S. et al., 2000). Следует отметить, что количество публикаций, в которых описаны методы типирования возбудителя сапа существенно меньше, чем его ближайшего «родственника» - возбудителя мелиоидоза (Harvey S.P., 2005; Chantratita N. et al., 2006;, U'Ren J.M. et al., 2007).

Применение автоматических секвенаторов и методологии биочипов позволило вплотную подойти к экспрессному секвенированию полного генома микроорганизмов. Информация, полученная при секвенировании геномов патогенных буркхольдерий, может быть использована для разработки быстрых и точных методов диагностики и дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза от близкородственных микроорганизмов, а также для внутривидового типирования этих патогенов.

До проведения полного секвенса геномов B.pseudomallei и -В. mallei лишь небольшая часть генов была клонирована и изучена их структурно-функциональная организация. Проведенные исследования геномной организации возбудителей сапа и мелиоидоза на основе секвенирования полных геномов показали наличие у них двух хромосом с функциональным разделением генов между ними (Holden М.Т. et al., 2004; Nierman W.C. et a!., 2004). Большие хромосомы кодируют функции, ответственные за основные стороны жизнеобеспечения и роста клеток, в то время как меньшие - несут вспомогательную нагрузку, заключающуюся в обеспечении адаптационных свойств микроорганизмов в части выживаемости в различных условиях окружающей среды. Первые аннотированные сиквенсы геномов В. mallei АТСС 23344 и В. pseudomallei К96243 представлены на веб-серверах (http://www.tigr.org/) и (http://www.sanger.ac.uk/). На сегодняшний день эти базы данных содержат информацию об аннотированных геномов уже 4 штаммов В. mallei и 4 штаммов В. pseudomallei.

Анализ геномных последовательностей буркхольдерий выявил множество гомологичных участков у B.pseudomallei и B.mallei, отсутствующих у близкородственного вида B.thailandensis (Holden М.Т. et al., 2004; Nierman W.C. et al., 2004). С помощью методологии секвенирования и технологии ДНК-биочипов идентифицировано большое количество открытых рамок считывания (ORF), которые делегированы (дефектны) у B.mallei и B.thailandensis в сравнении с B.pseudomallei. Как для В. mallei, так и для B.thailandensis выявлена преимущественная локализация таких генов на малой хромосоме. Как правило, они связаны с различными метаболическими и клеточными функциями, определяющими межвидовые различия (Ong С. et al., 2004; Kim H.S. et al., 2005). Причем, у возбудителя сапа отмечена высокая тенденция к потере более протяженных фрагментов хромосом. Делении затрагивают некоторые гены III типа секреции, сериновой металлопротеазы, кластеров, детерминирующих гликопротеиновую капсулу, а также продукцию и секрецию токсинов.

Расшифровка и сопоставление полногеномных последовательностей различных штаммов В. pseudomallei и В. mallei позволяет определять ДНК-маркеры (ДНК-стандарты) с которыми можно проводить сравнение остальных штаммов и изолятов с тем, чтобы делать выводы о присутствующих или отсутствующих в них последовательностях, по сравнению со стандартами.

Однако на сегодняшний день такая информация имеется лишь для нескольких штаммов из большого разнообразия диких штаммов и поиск вариабельных ДНК-маркеров для внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий проводится эмпирически.

Существующая вероятность завоза инфекций на территорию нашей страны диктует необходимость технологических разработок, удовлетворяющих задачам не только высокоэффективной идентификации, но и дифференциации штаммов B.mallei и B.pseudomallei. В настоящее время основополагающий подход к детекции и анализу возбудителей инфекций состоит в последовательном применении методов и средств диагностики, в комплексе представляющих собой единую систему, включающую специфическую индикацию, идентификацию патогена и типирование вьивленного микроорганизма. Для многих видов микроорганизмов, в том числе возбудителей особо опасных инфекций, разработаны необходимые алгоритмы идентификации и дифференциации штаммов, основанные на фенотипических и генотипиче-ских признаках. Многообразие клинических форм и отсутствие патогномо-ничных симптомов сапа и мелиоидоза практически исключают возможность постановки диагноза только на основании клинической картины, в связи с этим возрастает роль лабораторных методов в верификации диагноза. Возникающие проблемы их диагностики как в эндемичных, так и неэндемичных регионах определяют необходимость совершенствования лабораторного анализа и создания единой многоуровневой системы генодиагностики и внутривидовой дифференциации возбудителей.

Рассматривая современные методы идентификации и генотипирования штаммов патогенных буркхольдерий следует отметить, что на сегодняшний

день отсутствует оптимальная схема ускоренного выявления внутривидовых различий В. pseudomallei и В. mallei, а поиск генетических маркеров для быстрого генотипирования штаммов патогенных буркхольдерий продолжается вплоть до настоящего времени.

На основании вышеизложенного, очевидна актуальность научных исследований, направленных на более детальное изучение возбудителей сапа и мелиоидоза, их консервативных и вариабельных последовательностей с целью создания высокоэффективных генетических систем идентификации, отвечающих современным требованиям к чувствительности и специфичности диагностических тест-систем, а также разработки генотипических методов внутривидовой дифференциации штаммов B.mallei и В.pseudomallei. •

Цель работы заключалась в разработке способов генной диагностики, конструировании амплификационных тест-систем для идентификации патогенных буркхольдерий и совершенствовании схем внутривидового типиро-вания штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза с применением методов молекулярной биологии.

Задачи исследования:

1. Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных в различных генетических базах данных, с целью подбора перспективных ДНК-мишеней для генной диагностики и генетической дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза в различных вариантах ПЦР-анализа, моно- и мультилокусного сиквенс-типирования.

2. Сконструировать амплификационные тест-системы для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР, подобрать условия проведения реакции, оценить чувствительность и специфичность генодиагностических систем на широком наборе гомологичных и гетерологич-ных штаммов микроорганизмов.

3. Оптимизировать условия подготовки проб для исследования экспериментального биологического материала при различных клинических формах сапа и мелиоидоза и проб из объектов внешней среды, контами-нированных В. mallei и В. pseudomallei.

4. Оценить эффективность ДНК-зондов на основе хромосомной ДНК патогенных буркхольдерий и криптических плазмид возбудителя мелиоидоза для идентификации В. mallei и В. pseudomallei и исследования атипичных штаммов патогенных буркхольдерий методом ДНК-ДНК гибридизации.

5. С помощью молекулярно-генетических методов изучить вариабельность геномов типичных и атипичных штаммов В. mallei и В. pseudomallei при различных условиях культивирования in vitro и экспериментальной инфекции и выбрать наиболее эффективные методы генетического типирования штаммов патогенных буркхольдерий.

6. Провести сравнительный анализ эффективности фенотипических и молекулярно-биологических методов идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов В. mallei и В. pseudomallei и определить оптимальный алгоритм генодиагностики и генотипирования патогенных бурк-хольдерий.

Научная новизна:

В представленной работе впервые проведено комплексное исследование вариабельных фенотипических признаков и генотипических свойств возбудителей сапа и мелиоидоза с применением широкого спектра методов структурной геномики, позволившее решить ряд прикладных задач, направленных на совершенствование схем идентификации и генетического типиро-вания патогенных буркхольдерий.

Получены приоритетные данные об использовании нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих 23S рРНК, флагеллярного гена и orf гена III типа секреции для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза и на основе этих генов впервые сконструированы отечественные высокочувствительные и специфичные амплификационные тест-системы для генодиагностики В.pseudomallei и В. mallei.

Впервые показана возможность использования ПЦР в качестве дополнительного метода идентификации при различных формах сапа и мелиоидоза, вызванных типичными и атипичными штаммами В. pseudomallei и В. mallei.

Впервые предложены группоспецифические олигонуклеотидные затравки burtsl/burta2 для выявления триады буркхольдерий - В.pseudomallei, В. mallei и B.thailandensis, используемые в сочетании с методом ДНК-ДНК гибридизации и амплификации с произвольными праймерами для оценки генетического полиморфизма штаммов B.thailandensis, в том числе штамма B.thailandensis КМ-161, рекомендованного в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учебных занятий по идентификации ООИ методом ПЦР (патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам «Штамм бактерий Burkholderia thailandensis KM 161 - авиру-лентный имитатор возбудителя мелиоидоза» Российского агентства по патентам и товарным знакам N 2257413.от 27.07.2005 г.).

Представлены доказательства того, что алгоритмом ускоренной идентификации В. mallei и В. pseudomallei является сочетание реакции амплификации и последующего секвенирования фрагментов генов 16S рРНК, 23S рРНК, orf 13 и fliC. Для доказательства достоверности ПЦР-диагностики сапа и мелиоидоза предложено секвенирование двух локусов геномной ДНК -фрагмента гена I6S рРНК и участков генов 23S рРНК, orf 13 или fliC.

Показано, что разработанный метод выделения ДНК из объектов окружающей среды (почва, вода), искусственно контаминированных микромице-тами (патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным

знакам №2295569 от 12. 07. 2005 г.), эффективен для экстракции и очистки ДНК патогенных буркхольдерий.

Впервые предложен способ проведения плазмидного анализа для внутривидового типирования штаммов возбудителя мелиоидоза. Приоритетность исследований подтверждена патентом на изобретение «Способ выделения плазмид Burkholderia pseudomallei» Российского агентства по патентам и товарным знакам № 2218401 от 10.12.2003 г.

Оптимизированы условия проведения рестрикционного анализа ДНК возбудителя сапа и впервые оценена генетическая гетерогенность коллекционных штаммов В. mallei методом пульс-электрофореза.

Впервые проведен анализ изолятов возбудителя сапа на основе реакции амплификации с произвольными праймерами и показана высокая эффективность ПЦР-типирования штаммов В. mallei. Для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий с использованием полимеразной цепной реакции предложен оригинальный набор олигонуклеотидных затравок.

Научная новизна исследования связана с определением вариабельных нуклеотидных последовательностей и тандемных повторов коллекционных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, на основе которых возможно проведение ускоренного генетического типирования штаммов В.pseudomallei и В. mallei.

С помощью мультилокусного сиквенс-типирования и сравнительного анализа секвенированных последовательностей вариабельных участков генов «домашнего хозяйства» впервые установлено, что штаммы коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института В.pseudomallei 100, С-141, а также В.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, относятся к Юго-Восточной группе.

Проведенные исследования впервые позволили сформировать единую систему генодиагностики и генотипирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. Схема лабораторной диагностики и идентификации патогенных буркхольдерий дополнена методом ПЦР с разработанными амплификацион-ными тест-системами и впервые предложена схема быстрого внутривидового генетического типирования штаммов В. mallei и В.pseudomallei.

Разработанные методические подходы легли в основу исследований, поддержанных грантами РФФИ 04-04-96503,07-04-01568 и 07-04-08665.

Практическая ценность:

Разработанные амплификационные тест-системы в настоящее время используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ и могут быть рекомендованы для специализированных лабораторий для идентификации патогенных буркхольдерий и экспресс-диагностики сапа и мелиоидоза.' С этой целью оформлены методические рекомендации «Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза методом полимеразной цепной реакции», утвержденные директором института Н.Г. Тихоновым 29 мая 2002 г. и методические рекомендации «Использование двух пар праймеров для идентификации воз-

будителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР» (утверждены директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 10 февраля 2005 г.).

Материалы диссертационной работы использованы при оформлении пакета первичной документации: «Инструкция по изготовлению и контролю амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei» и «Инструкция по применению амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei», утверждённой директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 10 февраля 2005 г.

Методики плазмидного анализа, выделения и мобилизации внехромо-сомных репликонов В.pseudomallei, включенные в методические рекомендации «Применение мобилизации для передачи криптических плазмид B.pseudomallei в гетерологичные виды», утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ Н.Г.Тихоновым 20 апреля 1998 г. и методические рекомендации «Способ получения штамма кишечной палочки, продуцирующего белок 30 kDa, опосредованный мелиоидозной плазмидой рСМ2» (утверждены директором Волгоградского НИПЧИ Н.Г.Тихоновым. 2 марта 2000 г.) используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ в различных разделах работ при изучении патогенных буркхольдерий.

Используемый метод ДНК-гибридизации включен в схему идентификации патогенных буркхольдерий, представленную в практическом руководстве «Мелиоидоз. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998). В государственной коллекции патогенных бактерий Всесоюзного НИПЧИ «Микроб» депонированы штаммы E.coli КМ 163, 164, 165, 166, несущие в составе своего генома, фрагменты плазмиды рСМ2 возбудителя мелиоидоза, которые рекомендованы в качестве группоспецифических ДНК - зондов для идентификации патогенных буркхольдерий.

Результаты сравнительного анализа фенотипических и генотипических методов дифференциации типичных и атипичных штаммов патогенных буркхольдерий легли в основу методических рекомендаций «Постановка диагностических тестов для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза (индивидуальная карта штамма)», утвежденных директором Волгоградского НИПЧИ В.В.Алексеевым 25 июня 2003 г.

По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Молекулярно-биологические подходы к идентификации и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза», утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 06 марта 2006 г.

Предлагаемые схемы ПЦР-типирования с набором произвольных праймеров и олигонуклеотидных затравок для детекции вариабельных ам-пликонов, а также методы мультилокусного сиквенс-типирования и пульс-электрофореза используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ для сравнительного анализа музейных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и их изогенных мутантов с измененной вирулентностью и чувствительностью к антибиотикам.

Материалы диссертационной работы используются сотрудниками института в рамках учебных программ по первичной специализации и перепо-готовке специалистов - Программы курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 01.02.2001 г., Программы курсов повышения квалификации врачей - бактериологов общей медицинской сети, центров Госсанэпиднадзора и противочумных учреждений по специфической индикации и лабораторной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 28.09.1999 г., а также Программы курсов повышения квалификации медицинских работников (с высшим и средним специальным образованием) сани-тарно-карантинных пунктов и отделов (СКП и СКО), утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко. Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов I1I-VI курсов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Амплификационные тест-системы, сконструированные для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза, обеспечивают специфическую детекцию фрагментов генов 23SрРНК, флагеллярного гена (fliC) и orf гена III типа секреции патогенных буркхольдерий при исследовании методом ПЦР чистых культур и проб из объектов внешней среды, контаминиро-ванных В. mallei и B.pseudomallei, а также при генодиагностике различных форм экспериментального сапа и мелиоидоза, вызванных типичными и атипичными штаммами возбудителей.

2. Группоспецифические олигонуклеотидные затравки burtsl/burta2, обеспечивают амплификацию специфических фрагментов флагеллярного гена fliC триады буркхольдерий - B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis с чувствительностью 1x10 -1х103 м.к./мл при анализе чистых культур и биологического материала от экспериментально заражённых животных.

3. Использование двух ДНК мишеней - участков I6S рРНК и 23S рРНК, orfI3 или fliC, при сочетании ПЦР и секвенирования является способом доказательства достоверности ПЦР-диагностики, быстрой идентификации B.mallei и B.pseudomallei и их дифференциации от близкородственных видов микроорганизмов.

4. Методы пульс-электрофореза и мультилокусного сиквенс-типирования эффективны для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от штаммов В. mallei, для которых применим рестрикционный анализ ДНК в формате пульс-электрофореза. При мультилокусном сик-венс-типировании штаммы возбудителя сапа объединяются в единый си-

квенс-тип, входящий в клональный комплекс штаммов В. pseudomallei и их дифференциация невозможна. 5. Быстрое генетическое типирование штаммов возбудителя мелиоидоза обеспечивают методы амплификации полиморфной ДНК с произвольными праймерами, VNTR-анализ, Rep-ПЦР и схема типирования на основе вариабельных ампликонов, а ускоренная оценка генетической гетерогенности штаммов возбудителя сапа возможна лишь с помощью VNTR-анализа и амплификации с произвольными праймерами.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002), IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), IV межгосударственной научно - практической конференции Государств стран СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств»» (Оболенск, 2006), XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), 65-й юбилейной научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), V международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.

По теме диссертации опубликовано 83 научные работы. Материалы исследований использованы при написании трех монографий - «Мелиоидоз», под ред. Н.Г. Тихонова, Волгоград, 1995, «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму», Волгоград, 2004 и «Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство», под ред. академика РАМН, Г.Г.Онищенко,- М: ЗАО «МП Гигиена».- 2006.

Структура и объем работы

Диссертация изложена в форме монографии на 268 листах машинописного текста, состоит из введения и 6 глав, включающих описание литературных данных и результаты собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 61 рисунком. Список цитируемой литературы включает 386 источников, в том числе 82 отечественных и 304 иностранных работ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Таксономическое положение возбудителей сапа, мелиоидоза и близкородственных микроорганизмов

Патогенные буркхольдерии по многим биологическим свойствам схожи с псевдомонадами, и, по этой причине, ранее они были объединены в семейство Pseudomonadaceae, род Pseudomonas. До этого они входили в различные роды и семейства. Так, возбудитель мелиоидоза имеет более 10 синонимов - Bacterium whitmori, Bacillus whitmori, Bacillus pseudomallei, Pfeifferella whitmori, Pfeifferella pseudomallei, ActinobaciUus pseudomallei, Loefferella whitmori, Loefflerella pseudomallei, Malleomyces pseudomallei, Pseudomonas pseudomallei, Burkholderia pseudomallei.

Возбудитель сапа первое биноминальное название - Bacillus mallei получил в 1885 г. через три года после его выделения в чистой культуре F.D. Löffler и J.W. Schutz. Однако в последующие годы у этого микроорганизма, так же, как и возбудителя мелиоидоза, изменялись как таксономические позиции, так и биноминальные обозначения (Acinetobacler mallei, Loefferella mallei, ActinobaciUus mallei, Malleomyces mallei, Pfeifferella mallei, Bacillus mallei, Pseudomonas mallei, Burkholderia mallei). В самостоятельный род Burkholderia возбудители сапа и мелиоидоза, наряду с другими псевдомонадами 2-группы рРНК-ДНК гомологии, выделены на основе результатов сек-венирования генов 16S рРНК (Yabuuchi Е. et al., 1992).

Таксономическая позиция патогенных буркхольдерий на сегодняшний день определена. Однако вопросы внутриродового разграничения буркхольдерий медицинского значения продолжают интересовать исследователей до сих пор. Род Burkholderia включает 34 описанных вида (Соепуе Т. et al., 2001; Соепуе Т., Vandamme P., 2003), девять из которых известны как бактерии комплекса Burkholderia cepacia. Схожие проблемы возникли и при установлении таксономического положения мелиоидозоподобных культур -B.thailandensis (Brett P.J. et al., 1998) и В. oklahomensis (Glass M.B. et al., 2006). Сложность определения видовой принадлежности этих микроорганизмов может приводить к ошибкам их идентификации и дифференциации от В.pseudomallei (Koh Т.Н. et al., 2003; Inglis T.J.J, et al., 2005). Хотя секвениро-вание гена 16S рРНК является определяющим геном для идентификации многих видов микроорганизмов, для рода Burkholderia имеются ограничения,

обусловленные отсутствием критериев корректной дифференциации видов бактерий комплекса B.cepacia (Mahenthiralingam Е. et al., 2000). Идентификация всех 9 геномоваров этого комплекса стала возможной лишь при использовании данных секвенирования другой ДНК-мишени - гесА гена буркхоль-дерий. Однако при анализе секвенированных последовательностей и построенных на их основе филогенетических деревьев, дифференцировать возбудители сапа и мелиоидоза между собой не удалось (Payne G.W. et al, 2006).

Возбудители сапа и мелиоидоза имеют высокую степень фенотипиче-ского сходства (Anuntagool N., Sirisinha S., 2002). При изучении данных микроорганизмов методом ДНК-ДНК гибридизации в отдельных случаях степень гомологии ДНК между штаммами В.mallei и B.pseudomallei превышала внутривидовую гомологию ДНК B.pseudomallei (Rogul М. et al., 1970). О таксономической близости и идентичности рекомбинационных систем у возбудителей сапа и мелиоидоза свидетельствует и способность к взаимной трансформации на плотных средах без специальной обработки клеток для достижения компетентности (Тарасова Т.Д., Ряпис Л.А., 1983). Эти положения во многом объясняют трудности конструирования видоспецифических диагностических препаратов для возбудителя сапа.

2. Идентификация и внутривидовое типирование патогенных буркхольдерий на основе фенотипических признаков

Клиническая диагностика сапа или мелиоидоза из-за большого многообразия симптомов и быстрого течения этих заболеваний весьма затруднена (Kanai К., Deysirilert L., 1998; Dance D. А., 1991; Dance D. А., 2000; Brett P.J., Woods D.E., 2000). Полиморфизм клинических проявлений мелиоидоза настолько велик, что даже в эндемичных регионах поставить диагноз на основании клинической картины крайне проблематично. Не вызывает сомнения, что существенное увеличение числа регистрируемых в разных странах случаев сапа и мелиоидоза связано не столько с расширением ареала распространения этих инфекций в мире, сколько с хорошо налаженной в развитых странах лабораторной службой. Именно это привело к тому, что практически во всех странах Западной Европы за последние годы зарегистрированы случаи мелиоидоза среди лиц, побывавших в качестве туристов или специалистов в эндемичных зонах (Dance D. А., 2000; Cheng А. С., 2005; Fran-goulidis D. et al., 2007). В нашей стране регламентированных лабораторных исследований, направленных на выявление B.pseudomallei у туристов и лиц, прибывающих из эндемичных территорий, не проводится. Не исключено, что именно по этой причине в России не зарегистрировано ни одного случая мелиоидоза. Заболеваемость сапом среди людей носит в основном спорадический характер (Цветков Н.Е., 1947). Тем не менее, периодически появляются публикации о выделении В. mallei в клинических лабораториях Италии, Испании, США. В ряде случаев это связано с внутрилабораторным заражением, что подтверждает чрезвычайную опасность работы с культурами В. mallei.

На сегодняшний день идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза, в основном, проводится на основании фенотипических признаков. После выделения чистых культур проводят идентификацию с помощью стандартных методических приемов (Илюхин В.И. с соавт., 1983; Поповцева Л.Д. 1985; Илюхин В.И. с соавт., 1995; Inglis T.J.. et al., 2005) или полуавтоматических систем идентификации подобно API 20 NE, рекомендуемой для анализа выделенных культур (Zysk G. et al., 2000; Cheng А. С., Currie В. J., 2005).

При диагностике сапа и мелиоидоза отмечен достаточно высокий процент лабораторных ошибок идентификации возбудителей в эндемичных, а в большей степени неэндемичных регионах, в которые были завезены'эти инфекции (Inglis T.J.. et al., 2005; Inglis T.J.J, et al., 2006). Сложности идентификации патогенных буркхольдерий обусловлены перекрестными реакциями с непатогенными бактериальными видами, присутствующими в нестерильных объектах за счет идентичного биохимического профиля (Inglis T.J.J., et al„ 1998; Glass M.B., 2005), атипичной морфологии колоний некоторых штаммов B.pseudomallei (Howard К., Inglis T.J., 2003). Измененные биохимические свойства B.pseudomallei и B.mallei в автоматических системах идентификации приводят к ложноотрицательным результатам. (Becker К.Н., 1991; Inglis T.J. et al., 1998; Srinivasan A. et al., 2001).

В своей работе мы сравнили две системы идентификации - Nefermtest 24 («Lachema», Чехия) и API - 20NE («BioMerieux», Франция) со стандартными лабораторными тестами определения видовой принадлежности B.mallei и B.pseudomallei. При анализе культур возбудителя мелиоидоза на основании таблицы дифференцирования «Указателя для анализа данных» получены идентификационные коды 1156577 и 1556577 (API 20 NE), что соответствовало литературным данным (Lowe P. et al., 2002). В системе Nefermtest 24 отмечен высокий процент ошибок идентификации штаммов. Особенно принципиальными были расхождения в оценке декарбоксилаз и денитрификации, которые являются определяющими тестами при дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза от В. cepacia и псевдомонад. На основании полученных данных сделано заключение, что система Nefermtest 24 существенно уступает по своей диагностической ценности API 20NE и не может быть рекомендована для идентификации патогенных буркхольдерий. С помощью обеих тест-систем нам не удалось правильно идентифицировать ни возбудитель сапа, ни B.thailandensis. Кроме того, данные системы идентификации весьма опасны с позиций соблюдения режима работы с возбудителями ООИ (СП 1.3.1285-03), ввиду возможной аэрозолизации микробной взвеси при исследовании.

Иммунодиагностические методы применяют на различных этапах лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза и в различные сроки заболевания. Эти методы применяют и для ретроспективного серологического обследования лиц, постоянно или временно находившихся в эндемичных регионах (Ashdown L.R., 1981; Ashdown L.R. et al., 1989; Chierakul W. et al., 2005). Существующие сложности в трактовке результатов иммунодиагностических исследований могут быть связаны с регистрируемыми в ряде случаев пере-

крёстными реакциями, обусловленными антигенным родством патогенных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов - возбудителей чумы, псевдотуберкулёза, туляремии, легионеллёза (Гонтарь И.П. с соавт., 1984; Беляков В.Д. с соавт., 1990; Пивень H.H., 1987; Пивень H.H., 1997).

Лабораторная диагностика включает не только этап идентификации возбудителей, но и определение индивидуальных особенностей штаммов, что имеет значение при определении степени сходства бактериальных культур, установлении источника инфекции при эпидемиологическом анализе и расшифровке различных вспышек инфекционных заболеваний. Внутривидовая дифференциация микроорганизмов на основе культурально-морфологичес-ких, биохимических, серологических свойств, а также вирулентности, устойчивости к антибиотикам и бактериофагам используется при паспортизации как известных, так и вновь выделяемых штаммов.

Возбудители сапа и мелиоидоза являются филогенетически тесно связанными между собой видами микроорганизмов, что подчеркивают многочисленные исследования их фенотипических свойств (Cravitz L., 1950; Howe С. et al., 1971; Илюхин В.И. с соавт., 1983; Беляков В.Д. с соавт., 1990; Kanai К., 1994; Пивень H.H., 1997; Anuntagool N., Sirisinha S„ 2002). Наряду с этим им свойственна значительная однородность фенотипических признаков внутри вида, затрудняющая их интравидовое типирование, что и было выявлено в нашей работе.

Как показал, проведенный анализ фенотипических тестов 61 штамма B.pseudomallei и 14 штаммов В. mallei, имеющихся в коллекции Волгоград-НИПЧИ, лишь фаготипирование и анализ белкового спектра могут быть использованы для внутривидового типирования штаммов возбудителя мелиоидоза. Для штаммов возбудителя сапа эффективным методом дифференциации, основанным на анализе фенотипических свойств, является сравнительный электрофоретический анализ общеклеточных белков. Несмотря на выявление вариабельных биохимических признаков - окисление рамнозы, ксилозы, целлобиозы, реакции денитрификации, секреции клетками уреазы и гидролиз эскулина и различий в чувствительности к антибиотикам, эти тесты рекомендованы лишь в качестве дополнительных критериев дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий, ввиду их относительно низкой внутривидовой вариабельности.

Проведенный анализ фенотипических свойств возбудителей сапа и мелиоидоза, на основе которых проводится идентификация и внутривидовое типирование В. mallei и B.pseudomallei, свидетельствует о необходимости расширения рамок лабораторных исследований и привлечения новых методических приемов для идентификации и типирования патогенных буркхольдерий, основанных на структуре их геномов.

3. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса B.cepacia, В. tliailandensis, B.pseudomallei-like spp.

При генодиагностике и конструировании диагностических тест-систем важное значение имеет оценка их специфичности на широком наборе близкородственных и гетерологичных микроорганизмов, с которыми необходимо провести дифференциацию. Такой набор позволяет объективно оценивать диагностические возможности вновь создаваемых систем.

В первую очередь, это касается близкородственных патогенным бурк-хольдериям видов В.cepacia, B.thailandensis и мелиоидозоподобных почвенных микроорганизмов (В. pseudomallei-like spp.).

В. cepacia включена в род Burkholderia в качестве типового вида (Yabuuchi Е. et al., 1992). Детальный анализ биохимических свойств, белкового профиля и жирно-кислотного состава, а также ДНК-РНК и ДНК-ДНК гибридизация привели к выводу, что вид В. cepacia фактически состоит из близко связанных, но генетически отличных друг от друга 9 различных видов (или геномоваров). Эта группа бактерий стала упоминаться в литературе как B.cepacia комплекс (Coenye Т. et al., 2001; Lipuma J.J. et al., 2001). Геномова-ры по фенотипипическим признакам схожи между собой, но генетически это отличные друг от друга группы штаммов (Coenye Т. et al., 2001). При использовании биохимических и фенотипических тестов возникают трудности идентификации бактерий комплекса B.cepacia с микроорганизмами семейства /S-протеобактерий, включая Pandoraea и Ralstonia (Coenye Т. et al., 2001; Lipuma J.J. et al., 2001), а также достаточно часто случаются ошибки их дифференциации от B.pseudomaUei (Koh Т.Н. et al., 2003; Inglis T.J. et al., 2005).

При уточнении видовой принадлежности 25 штаммов, выделенных из различных источников и числящихся по паспортным данным в коллекционном центре Волгоградского научно-исследовательском противочумном институте как штаммы B.cepacia, нами отобрано 18 культур, соответствующих по биохимическим свойствам, включая определение лизиндекарбоксилазы, аргининдигидролазы, ONPG виду B.cepacia. В реакции амплификации с ви-доспецифическими и геномоварспецифическими праймерами (Mahenthiralin-gam Е. et al., 2000) с ДНК всех 18 штаммов нами получены положительные результаты. При ПЦР-типировании выявлено, что в коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института имеются штаммы B.cepacia принадлежащие к I (В. cepacia), II {В. multivorans), III (В. сепо-cepacia) и IV (В. stabilis) геномоварам.

К виду B.cepacia (геномовар I) принадлежат штаммы 25416,3181, 3189, 610, 611, 620, 621 и 122. Причем, штамм B.cepacia 122, до наших исследований числился в коллекционном центре как атипичный невирулентный штамм B.pseudomaUei Vang, так как в реакции ДНК-ДНК гибридизации не давал положительного сигнала радиоавтографа (Замараев B.C., 2004). Из исследуемых штаммов к виду В.multivorans (геномовар И) принадлежит один штамм B.cepacia 1934. Этот штамм в коллекции Института сыворотки (Дания) по фенотипическим характеристикам ранее числился как атипичный штамм

В.cepacia (Bremmelgaard A., 1975). Восемь штаммов отнесены нами к виду В. cenocepacia (геномовар III) и еще один (B.cepacia 8235) к B.stabilis (геномо-вар IV).

Бактерии B.thailandensis генетически и иммунологически близки к возбудителю мелиоидоза. При использовании общепринятых методов идентификации данный микроорганизм практически идентичен культурам возбудителя мелиоидоза, поэтому и предложено первоначальное наименование -B.pseudomallei-like. Основное его различие с B.pseudomallei состоит в низкой вирулентности для лабораторных животных и более высокой биохимической активности по отношению к олигосахаридам из группы пентоз (Brett P.J. et al., 1997; Brett P.J. et al., 1998). После появления публикаций о регистрации B.pseudomallei в Иране (Pourtaghva М. et al., 1975), сотрудниками Вол-гоградНИПЧИ ь ходе экспедиционных поездок в Прикаспийскую территорию Азербайджана и Туркмении было выявлено несколько десятков культур, которые вырастали на селективных средах, предназначенных для B.pseudomallei (среда Эшдауна, среда с (3-аланином и др.). Изолированные штаммы агглютинировались в титрах 1:100, 1:200 мелиоидозной агглютинирующей сывороткой, но были авирулентны для золотистых хомячков. По совокупности исследуемых фенотипических признаков изучаемые почвенные микроорганизмы отнесены нами к мелиоидозоподобным штаммам {В. pseu-domallei-like spp.) и получили рабочее название Ленкоранские штаммы.

Результаты, проведенного нами гибридизационного анализа коллекции микроорганизмов бактерий комплекса B.cepacia, мелиоидозоггодобных штаммов и B.thailandensis, подтвердили гомологию их ДНК с B.pseudomallei. С гетерологичными микроорганизмами гомология отсутствовала (рис. 1).

«¿vs; .. vnit'v. 'л ■ vrif'i'.i

A 1 2 3 4 5 6 7

• ♦ m •.,. 8 9 10 11 12 13 14

я m * « * it * * 15 16 17 18 19 20 21 22

Рис. 1. Радиоавтограф гибридизации ДНК В.рзе^ота1Ш С-141 с ДНК штаммов В.pseudomallei-like ярр. и другими гетерологичными микроорганизмами. А - радиоавтограф; Б - схема нанесения ДНК

1. B.pseudomallei С141

2. В mallei 114 - <

3. B.mallei 10230

4. B.mallei Ц5

5. B.pseudomallei 98

6. B.pseudomallei 100

7. B.pseudomallei 110

8. B.pseudomallei 114

9. B.thailandensis KM 161

.'¿.•»'¡¡■иг!':-. .

10.B.thailandensis 265 1 I.E.coli C600

12.P. aeruginosa HI 2

13.P.putida 97314

14.B.cepacia 8236

15.B.cepacia 25416 < r- v 16-22. Ленкоранские штаммы (В. pseudomallei-like spp.)

■з :vJb ■'.' v -..•

Два сапных штамма (Олоф и Конный) в реакции ДНК-ДНК гибридизации не давали положительных сигналов радиоавтографа (Замараев B.C., 2004), при использовании биохимической системы идентификации Nefermtest 24 «Lachema» (Чехия) отнесены к виду Alcaligenes (Сенина Т.В., 2004). Полученные нами данные подтвердили результаты, на основе которых эти два штамма было решено исключить из рода Burkholderia.

Таким образом, проведенные исследования позволили подобрать адекватный набор штаммов близкородственных буркхольдерий, который был использован нами при оценке специфичности сконструированных амплифика-ционных тест-систем, предназначенных для обнаружения В. mallei и B.pseudomallei.

4. Разработка молекулярно-генетических способов детекции патогенных буркхольдерий

Приоритет разработки амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза принадлежит A.E.Lew и P.M.Destnarchelier (1994), сконструировавших специфичные олигонуклео-тидные праймеры на основе гена, кодирующего синтез 23S рРНК. В последующих работах использовали ген, детерминирующий 16S рРНК (Dharakul Т. et al., 1996; Brook M.D.,1997; Woo P.C. et al., 2003) и спейсерную область между этими генами (Kunakom М„ 1995). Для повышения специфичности ПЦР рекомендовали двухстадийную ПЦР (Kunakorn М. et al., 2000; Hagen R.M. et al., 2002), рестрикцию ампликонов (Sprague L.D. et al., 2002), а также различные видоспецифические последовательности (Sermswan R.W. et al., 2000; Баннов B.A., Калачёв И .Я., 2003; Smith-Vaughan Н.С., Gal D., Lawrie P.M. et al., 2003; Neubauer H. et al., 2007) и SNP-маркеры (Bauernfeind A. et al., 1998; U'Ren J.M. et al., 2005; Wattiau P. et al., 2007). Однако, до сих пор нет единого мнения, коммерческих тест-систем, а также регламентирующих документов, определяющих обязательные ДНК-мишени и необходимые праймеры для идентификации патогенных буркхольдерий. В то же время, накоплен большой опыт, свидетельствующий о том, что применение какой либо одной пары праймеров при исследовании объектов внешней среды и проб клинического материала не обеспечивает достаточной эффективности анализа (Kunakorn М. et al., 2000; Sprague L.D. et al., 2002).

По этой причине для конструирования амплификационных тест-систем с целью генодиагностики сапа и мелиоидоза нами проведен анализ представленных нуклеотидных последовательностей патогенных буркхольдерий в различных генетических базах данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). (http://www.ebi.ac.uk/). (http://www.tigr.orgA. (http://www.sanger.ac.uk/) и выбрано семь пар праймеров на основе фрагментов гена 23S рРНК, две пары олигонуклеотидных затравок, фланкирующих участки флагеллярного гена (fliC)), и одна пара праймеров, являющихся участком гена ог/13 системы III-типа секреции (TTS1).

Семь пар праймеров были общими для B.mallei и B.pseudomallei,одна пара олигонуклеотидных затравок гомологична последовательностям триады буркхольдерий - B.mallei, B.pseudomallei, B.thailandensis и две пары -B.mallei. Дополнительно в работе использована одна пары праймеров для обнаружения B.mallei, фланкирующих участок гена 23S рРНК, обозначенная M23-2/CVMP23-1 (Bauernfeind A. et al„ 1998), и одна пара олигонуклеотидных затравок Bpsl6S-U33/Bpsl6S-OL73I (Dharakul Т. et al„ 1999),'являющихся фрагментом гена 16SpPHK (табл.1).

Таблица 1

Характеристика используемых олигонуклеотидных праймеров

Праймеры Нуклеотидные последовательности праймеров Размер ампликона Ожидаемая специфичность

23SpPHK

burk3s burk4as cgaagctgcggatgcgagctagtctc agtcgcagccaccagtttattgcaacc 615 п.н. B.mallei B.pseudomallei

burkls bnrk4as aagcctgcgaaggtgcgttgaaaagc с agtcgcagccaccagtttattgcaacc 567 п.н. B.mallei B.pseudomallei

b23s5 Ь23а6 acaaacagtcggagcctcttcg cgctctcctaccatgcgagact 666 п.н. B.mallei B.pseudomallei

b23s7 Ь23а8 gctgcggatgcgagctagtct cccccatcgcatctaacgac 266 п.н. B.mallei B.pseudomallei

b23s7 burk4as gctgcggatgcgagctagtct agtcgcagccaccagtttattgcaacc 611 п.н. B.mallei B.pseudomallei

burkls burk2as aagcctgcgaaggtgcgttgaaaagc cttccaattgctccgctcccgaagga 351 п.н. B.mallei

burk3s burk2as cgaagctgcggatgcgagctagtctc cttccaattgctccgctcccgaagga 399 п.н. B.mallei

M23-2 CVMP23-1 caccgaaactagca caccgaaactagcg 526 п.н. B.mallei

16SpPHK

Bpsl6S-U33 Bpsl6S-OL731 aagtcgaacggcagcacgg tttgctccccacgctttcg 717 п.н. B.mallei B.pseudomallei

fliC

bills bflas2 acggtctccgtcgacctcac cgttgatctgcgcaaccatc 376 п.н. B.mallei B.pseudomallei

burtsl bur(a2 acggcgtgtcgatcctgcaa gccgacctggaagctcagcg 242 п.н. B.mallei B.pseudomallei B.thailandensis

orfl3

BTTSsl BTTSas3 gactgaccgcgctcaaagccg tccggcctgacaaacgtttgg 162 п.н. B.mallei B.pseudomallei

Для каждой пары праймеров подобраны оптимальные буферные растворы, концентрации дезоксинуклеозидтрифосфатов, ионов М§ и Т^-

полимеразы, а также режимы ПЦР. При оптимизации параметров реакции амплификации с ДНК исследуемых буркхольдерий синтезировались чёткие единичные специфические ампликоны (рис.2). Эти результаты соответствовали расчетным данным, которые были получены с помощью компьютерного анализа и свидетельствовали о потенциальной пригодности выбранных нами праймеров для конструирования амплификационных тест-систем с целью идентификации В.pseudomallei и В. mallei.

123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1920 21

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов реакции амплификации фрагментов генов 23S рРНК\ fliC и or/13 В. pseudomallei, В. thailandensis и В. mallei.

I,21. Маркер молекулярных масс (леддер 100 -1000 п.н.)

2. ДНК В. pseudomallei 107, праймеры burtsl/burta2 (242 п.н.)

3. ДНК В. mallei 10230, праймеры burtsl/burta2 (242 п.н.)

4. ДНК В. thailandensis КМ 161, праймеры burtsl/burta2 (242 п.н.)

5. ДНК В. pseudomallei 107, праймеры Ь23«7/Ь23я8 (266 п.н.)

6. ДНК В. mallei 10230, праймеры b23s7/b23a8 (266 п.н.)

7. ДНК В. mallei 10230, праймеры burkls/burk2as (351 п.н.)

8. ДНК В. pseudomallei 107, праймеры bflls/bfl2a (376 п.н.)

9. ДНК В. mallei 10230, праймеры bflls/bfl2a (376 п.н.)

10. ДНК В. mallei 10230, праймеры burk3s/burk2as (399 п.н.)

II. ДНК В. pseudomallei 107, праймеры burk3s/burk4as (615 п.н,)

12. ДНК В. mallei 10230, праймеры burk3s/burk4as (615 п.н.)

13. ДНК В. pseudomallei 107, праймеры b23s7/burk 4as (611 п.н.)

14. ДНК В. mallei 10230, праймеры b23s7/burk 4as (611 п.н.)

15. ДНК В. pseudomallei 107, праймеры b23s5/b23a6 (666 п.н.)

16. ДНК В. mallei 10230, праймеры b23-s5/b23a6 (666 п.н.)

17. ДНК В. pseudomallei 107, праймеры burkls/burk4as (567 п.н.)

18. ДНК В. mallei 10230, праймеры burkls/burk4as (567 п.н.)

19. ДНК В. pseudomallei 107, праймеры BTTS-sl/BTTS-as3 (162 п.н.)

20. ДНК В. mallei 10230, праймеры BTTS-sl/BTTS-as3 (162 п.н.)

При анализе чистых культур наибольшая чувствительность реакции амплификации отмечена с праймерами Burk3s/Burk4as, b23s7/b23a8 и bflls/bflas2 (lxlO2 м.к./мл), а наименьшая с олигонуклеотидными затравками M23-2/CVMP23-1 (1x10s м.к./мл). Чувствительность праймеров Bpsl6S-U33 /Bpsl6S-OL731 и b23s7/Burk4as составила 1х104м.к./мл, а остальных исследуемых олигоиуклеотидных праймеров - 1х103м.к./мл.

Для повышения чувствительности реакции амплификации нами апробирована 2-х раундовая («гнездовая») ПЦР. В первом раунде использовали праймеры burk3s/burk4as. Во втором раунде реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза применяли праймеры b23s7/b23a8, фланкирующие фрагмент размером 266 п.н., находящийся внутри участка гена 23S РНК, синтезируемого с помощью праймеров burk3s/burk4as. В результате исследований с помощью «гнездовой» ПЦР на чистых культурах патогенных буркхольдерий удалось повысить чувствительность реакции до 101 м.к./мл.

Однако, при оценке специфичности сконструированных нами праймеров лишь три олигонуклеотидные затравки bflls/bfl2a, BTTS-sl/BTTS-as3 и b23s7/b23a8 обеспечивали специфическую детекцию возбудителей сапа и мелиоидоза. С олигонуклеотидными затравками burtsl/burta2 положительный результат реакции амплификации зарегистрирован с ДНК триады буркхольдерий - В.mallei, B.pseudomallei и B.thailandensis. При анализе гетероло-гичных микроорганизмов, в том числе бактерий комплекса В. cepacia и ме-лиоидозоподобных почвенных микроорганизмов (Ленкоранских штаммов) специфических фрагментов амплификации не выявлено.

На основе этих четырех пар олигоиуклеотидных затравок нами сконструированы четыре монолокусные амплификационные тест-системы с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза. От всех других пар праймеров нам пришлось отказаться. В отдельных случаях это было обусловлено их относительно низкой чувствительностью, отсутствием специфических ампликонов при анализе ДНК некоторых штаммов B.pseudomallei, а также ввиду наличия ложноположителъных результатов при исследовании гетерологичного микроорганизма - B.cepacia, хотя все разработанные праймеры показали свою пригодность при компьютерном анализе. При секвени-ровании фрагментов, включающих места посадки праймеров, нами выявлено несколько нуклеотидных замен в штаммах B.cepacia 8235 и 3181, которые послужили основой для формирования ложных результатов ПЦР.

При определении специфичности праймеров burkls/burk2as и burk3s/burk2as нам не удалось дифференцировать с их помощью возбудители сапа и мелиоидоза. Этот вариант реакции обладал только группоспецифи-ческой активностью, детектируя все штаммы возбудителя сапа и часть штаммов возбудителя мелиоидоза.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что результаты компьютерного анализа и исследования «¡п silico» целесообразно рассматривать как весомые, но ориентировочные данные, и для пригодности выбранных праймеров всегда необходимы исследования с широким набором как гомологичных, так и гетерологичных видов микроорганизмов.

Для оценки диагностической ценности тест-систем для выявления патогенных буркхолдерий нами проведены комиссионные испытания трех пар праймеров - bfUs/bfl2a, BTTS-sl/BTTS-as3 и b23s7/b23a8. Материалом для исследования служили 30 проб взвесей чистых культур возбудителей сапа и мелиоидоза - Burkholderia mallei (5 штаммов), Burkholderia pseudomallei (5 штаммов) с различной концентрацией клеток, также как и 22 пробы гетеро-логичных микроорганизмов - В. thailandensis (5 штаммов), В. cepacia (9 штаммов), Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella ovis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis (по одному штамму), 60 проб объектов внешней среды (вода, смывы), искусственно инфицированных Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei и 46 проб, искусственно инфицированных гетерологичными видами микроорганизмов.

С данными тремя парами праймеров результаты исследований оказались идентичными. Из 30 исследованных проб чистых культур В. mallei и B.pseudomallei в дозах от 1х102 до 1х104 м.к7мл, положительные реакции выявлены в 26 пробах (86,6 %), в том числе при концентрациях не ниже 103 м.к./мл - в 100 % проб. Из 60 исследованных проб объектов внешней среды (вода, смывы), инфицированных B.mallei и B.pseudomallei в дозах от 1х102 до 1х104 м.к./мл, положительные реакции выявлены в 52 пробах (86,6 %), в том числе при концентрациях не ниже 103 м.к./мл - в 100 % проб. При исследовании 23 проб чистых культур гетерологичных микроорганизмов и 46 проб объектов внешней среды (вода, смывы), зараженных гетерологичными микроорганизмами в дозах 1х107м.к7мл, неспецифических (ложноположитель-ных) реакций не выявлено.

Таким образом, три олигонуклеотидные затравки bflls/bfl2a, BTTS-sl/BTTS-as3 и b23s7/b23a8 обеспечивают детекцию трех различных генетических мишеней при идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза. Разработанные на их основе амплификационные тест-системы позволяют выявлять 100 % штаммов B.mallei и B.pseudomallei как в пробах чистых культур, так и пробах объектов внешней среды с пороговой чувствительностью 103 м.кУмл.

5. Использование ПЦР для выявления патогенных буркхольдерий при экспериментальной инфекции

При создании амплификационных тест-систем первичный анализ параметров их качества проводится на чистых культурах как гомологичных, так и гетерологичных видов микроорганизмов, а также контаминированных возбудителями пробах из объектов внешней среды. Однако эти результаты не дают возможности объективно оценивать диагностическую эффективность ПЦР при инфекционном процессе, вызванном изучаемыми патогенами.

В связи с этим, сконструированные нами тест-системы прошли апробацию в качестве диагностических средств при моделировании инфекционного процесса, вызванного заражением лабораторных животных как патогенными буркхольдериями, так и B.thailandensis.

При сравнительном анализе эффективности ПЦР и культурального метода выявлено, что реакция амплификации при остром мелиоидозе и сапе оказалась результативнее бактериологического метода. Достоверность различий в диагностической эффективности ПЦР и бактериологического метода (р < 0,01) подтверждено статистическим анализом полученных результатов. Выявление возбудителей с использованием ПЦР оказалось эффективным уже в первые сутки после подкожного заражения вирулентным штаммом В. mallei 10230 и B.pseudomallei 100 (в инкубационном периоде), тогда как с помощью бактериологического метода патогенные буркхольдерии выделяли лишь с 3-их сут заболеваний (рис. 3).

А Б

■ ПЦР □ Бактериологический метод

Рис. 3. Выявление возбудителей сапа и мелиоидоза с острой формой инфекции бактериологическим методом и ПЦР.

Примечание: А - мелиоидоз, Б - сап; по оси ординат - % положительных результатов.

В первые сутки наблюдения в реакции амплификации B.pseudomallei обнаруживали в 20 % образцов крови, 40 % образцов лимфатических узлов, в 20 % проб печени и селезёнки и в 10 % образцов легочной ткани, а В. mallei -в паховых лимфатических узлах (20 %), образцах печени (20 %) и в 20 % образцов крови. На 3 сутки исследования B.pseudomallei обнаруживали во всех исследуемых тканях в 100% случаев, а В.mallei - в лимфатических узлах (60%), в образцах печени (80%), селезёнки (60%), лёгких (80%), В крови зараженных животных ДНК возбудителя сапа на 3 сутки регистрировали при анализе 60 % проб, а возбудителя мелиоидоза - в 100 % случаев.

Схожие данные получены R.L.Ulrich с соавторами (2006), которым также удалось обнаружить В. mallei методом ПЦР в легких, селезенке и печени через 24 ч после аэрозольного заражения мышей линии BALB/c.

Известно, что мелиоидоз и сап могут протекать в различных формах с возможностью перехода из латентного и хронического в острое состояние и обратно. Бактериологический и биологический методы эффективны для диагностики острого сапа и мелиоидоза, но выделить возбудители при хроническом течении чаще всего не удается (Цветков Н.Е., Черняк В.З., 1947; Беляков В.Д., 1990). Выяснение особенностей персистенции патогенных бурк-хольдерий нами проведено в условиях хронизации процесса при экспериментальном заражении лабораторных животных. Хроническую форму мелиои-дозной инфекции моделировали на морских свинках с помощью аэрогенного заражения низковирулентным штаммом B.pseudomallei 56770 - 99/10 (LD50 составляла 5х105 м.к.) (Алексеев В.В. с соавт., 2000). Для моделирования сапной инфекции с длительным течением использовали ауксотрофный мутант В. mallei Ц-4 1360 со сниженной вирулентностью (LD50npH подкожном заражении для золотистых хомячков составляла 1х107 м.к.) (Шиповская Н.П. с соавт., 1983).

При использовании бактериологического метода на 3 сут после аэрогенного заражения культуру B.pseudomallei выделяли только из лёгких. Во всех остальных исследованных тканях мелиоидозный микроб обнаруживали с 20 сут вплоть до окончания срока наблюдения (38 сут). С помощью ПЦР на 3 сут после заражения, в отличие от бактериологического метода, B.pseudomallei обнаруживали в образцах лёгких, печени и селезёнки. При исследовании образцов крови, печени, селезёнки и лёгких культуральным методом положительные результаты были получены в 18% проб, а при применении ПЦР - в 33 % случаев.

При сравнительной оценке эффективности бактериологического метода и ПЦР при хронической форме сапа также установлено статистически достоверное различие в диагностической эффективности этих двух методов (р<0,001). С помощью культурального метода сапной микроб обнаруживали лишь в 1 из 200 исследованных проб (0,5 %), в то время как в реакции амплификации ДНК возбудителя сапа детектировали в 75 пробах (37,5%)

Используемые праймеры показали свою пригодность и высокую эффективность при диагностике различных форм инфекций, что явилось основанием для включения ПЦР в схему лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза.

При изучении персистенции B.thailandensis в организме зараженных лабораторных животных метод ПЦР, так же как и при подострых формах сапа и мелиоидоза, оказался более эффективным для обнаружения B.thailandensis. От морских свинок, зараженных B.thailandensis аэрогенно, в реакции амплификации с использованием праймеров burtsl/burta2 положительные результаты получены в 53 из 75 (70,6%) случаях. С помощью бактериологического метода культура B.thailandensis выделена в 9 из 75 (12%) пробах.

При секвенировании ампликонов, полученных при исследовании объектов внешней среды и проб экспериментального клинического материала, нами выявлена 100 % гомология с ДНК лишь возбудителей сапа и мелиоидо-

за. Однако для исключения возможных ложноположительных реакций и повышения специфичности идентификационных тестов необходимо использовать две ДНК мишени - участки 16SрРНК, 23SрРНК и orfl3 или fliC. Сочетание реакции амплификации и последующего секвенирования фрагментов этих генов является алгоритмом ускоренной идентификации В. mallei и В. pseudomallei и их дифференциации от близкородственных видов без проведения этапа культивирования микроорганизмов. Учитывая, что проведение идентификации на основе культурально-морфологических и биохимических признаков занимает 2-3 дня, а общее время исследований с помощью моле-кулярно-генетических методов составляет порядка 9 часов, данный алгоритм вполне оправдан. Аналогичные рекомендации по использованию нескольких ДНК-мишеней (I6S рРНК с дополнительным секвенированием гена 23S рРНК или спейсерной области 16S-23S рРНК) предложены и другими авторами для быстрой идентификации возбудителей особо опасных инфекций (Ruppitsch W. et al., 2007).

6. Совершенствование молекулярно-генетических методов внутривидового типирования возбудителей сапа и мелиоидоза

Проблемы, связанные с недостатками фенотипических методов дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий стимулировали развитие методов типирования, основанных на исследовании структуры их ДНК.

Для молекулярного типирования штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенных из окружающей среды, от человека и животных были использованы такие методы как полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (Yap Е.Н. et al., 1995), риботипирование (Desmarchelier P.M. et al., 1993; Sexton M.M., 1993; Trakulsomboon S. et al., 1997; Inglis T.J., et al., 2002; Grif K. et al., 2003 340, 353) и гель-электрофорез в пульсирующем электрическом поле (Vadivelu J. et al., 1997; Koonpaew S. et al., 2000; Cheng A.C. et al., 2005), a также RAPD (Haase A. et al., 1995) и MJICT (Godoy D. et al., 2003). Дифференциацию штаммов возбудителя сапа проводили с помощью пульс-электрофореза (Chantratita N. et al., 2006), ДНК-зондирования (Monastyrskaya G. et al., 2004; Fushan A. et al., 2005) и риботипирования (Harvey S.P., Minier J.M., 2005). Однако, публикаций, касающихся ускоренного определения штаммовой гетерогенности патогенных буркхольдерий крайне мало. По крайней мере, поиск генетических маркеров для быстрого генотипирования штаммов B.mallei продолжается вплоть до настоящего времени.

Учитывая то, что в нашей коллекции отсутствовали штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза, выделенные в период каких-либо вспышек заболеваний, в своей работе мы провели сравнительный анализ различных геноти-пических методов дифференциации коллекционных штаммов B.mallei и В.pseudomallei с целью установления степени сходства изучаемых культур и разработки оптимального алгоритма внутривидового типирования патогенных буркхольдерий. Из методов внутривидовой генетической дифференциации были использованы плазмидный анализ, монолокусное и мультилокус-

ное-сиквенс типирование, схема типирования на основе вариабельных ам-пликонов, Лер-типирование, VNTR анализ и амплификация с различными произвольными праймерами.

Все исследуемые методы оказались эффективными для дифференциации штаммов B.pseudomallei, но не для В.mallei, что связано с различной структурной и функциональной организацией геномов этих патогенов (Holden М.Т. et al., 2004; Nierman W.C. et al., 2004).

В результате проведенного плазмидного анализа нами оптимизирован метод скрининга плазмидных репликонов и выделено 4 типа штаммов B.pseudomallei, отличающихся по наличию плазмидных репликонов рРМ1, рСМ2, рСМЗ и рСМ4. В I группу отнесены штаммы, содержащие плазмиду pPMl, II группу составляют штаммы с плазмидой рСМ2, в III группу входят штаммы рСМЗ и IV группу объединены штаммы с плазмидой рСМ4. Плаз-миды сохранялись в плазмидсодержащих штаммах в условиях длительного культивирования на питательных средах и пассажах на лабораторных животных, что свидетельствовало об их стабильном наследовании (Замараев B.C., 2004). На основе собственных и литературных данных (Jigen J., Li L., 1992; Radua S. et al., 2000) плазмидный анализ рекомендован в качестве гено-типического метода дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от возбудителя сапа, в штаммах которого не обнаружены внехромо-сомные факторы наследственности не выявлены. Обнаруженные плазмиды могут выступать в качестве дополнительного критерия генотипической дифференциации штаммов и являться эпидемиологическим маркером в случае возникновении инфекционного процесса, вызванного плазмидсодержащим штаммом B.pseudomallei.

При компьютерном анализе и секвенирования участков генов 16S рРНК, 23S рРНК и fliC нам необходимо было решить две задачи. С одной стороны, определить консервативные локусы среди различных видов бурк-хольдерий и гетерологичных микроорганизмов, на основе которых мы конструировали амплификационные тест-системы, а с другой - оценить вариабельность этих генов внутри видов В.mallei и B.pseudomallei. В случае выявления нуклеотидных замен в изучаемых генах, провести типирование патогенных буркхольдерий. Однако количество таких различий оказалось недостаточным для эффективного разделения штаммов патогенных буркхольдерий ввиду выраженной гомологии геномов возбудителей. В результате кластерного анализа 30-ти штаммов возбудителя мелиоидоза и 16-ти штаммов возбудителя сапа нам удалось сформировать 3 группы штаммов В. pseudomallei и две группы В. mallei на основе фрагмента гена 16S рРНК. При сравнении нуклеотидных последовательностей целого гена I6S рРНК В. pseudomallei и В.mallei сформировано 9 и 4 группы штаммов, соответственно. На основе нуклеотидных последовательностей этого гена проведено выделение буркхольдерий в самостоятельный род бактерий (Yabuuchi Е. et al., 1992) и B.thaillandensis в отдельный вид (Brett P.J. et al., 1998), а также дифференциация возбудителя мелиоидоза от возбудителя сапа (Gee J.E. et al., 2003), что также было подтверждено при выполнении настоящей работы.

При сравнении секвенированных последовательностей фрагментов 23S рРНК В. mallei и В. pseudomallei не обнаружено ни внутривидовых, ни межвидовых отличий, за исключением двух штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенных в отдельную кластерную группу. Лишь при сравнении целого гена выявлены три нуклеотидные замены, на основе которых возможна дифференциация между собой этих двух видов микроорганизмов (Bauemfeind А. et al., 1998). Различий в нуклеотйдных последовательностях fliC генов было еще меньше. При формировании 4 кластерных групп, образованных обоими видами буркхольдерий, штаммы возбудителя сапа вошли в одну группу с В.pseudomallei.

Малое количество вариабельных последовательностей внутри выбранных генов патогенных буркхольдерий свидетельствовало о низкой эффективности этих ДНК-мишеней для генотипирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, а также определяло необходимость использования дополнительных методов дифференциации. Одним из таких методов является метод мультилокусного сиквенс-типирования, впервые предложенный D. Godoy с соавторами (Godoy D. et al., 2003) для генотипирования возбудителя мелиоидоза. Разрешающая способность МЛСТ нами оценена при анализе двух коллекционных штаммов В. mallei 10230 и V-120 и трех штаммов В. pseudomallei 100, С-141 и 107. Классификацию аллельного профиля изучаемых штаммов В.pseudomallei и В. mallei проводили путем сравнения полученных нами сиквенсов с известной базой данных МЛСТ (http://www.bpseudomallei.inlst.net) на странице Burkholderia. Распределение аллелей исследуемых штаммов В. mallei и B.pseudomallei представлено в таблице 2.

Таблица 2

Характеристика исследуемых штаммов патогенных буркхольдерий

по сиквенс-типу

Штаммы CT Локусы

ace gUB gmhD lepA UpA ttarK ndh

B.pseudomallei 107* 51 3 1 1 3 1 4 3

B.pseudomallei 100* 219 3 2 2 1 1 2

B.pseudomallei С-141* 162 3 1 4 3 I 4 1

B.pseudomallei 7641 * • 1 1 1 1 2 4 2 1

B.pseudomallei Cam70** 2 1 1 2 4 1 1 1

B.pseudomallei SID5278 * * 3 1 1 2 2 5 3 1

B.mallei 10230* 40 1 12 3 - 4 1 18 I

B. mallei V120 * 40 1 12 3 4 1 18 1

B.mallei NCTC 10248** 40 1 12 3 4 1 18 1

B.mallei NCTC 10260** 40 1 12 3 4 1 18

B.mallei NCTC 10245** 40 1 12 3 4 1 18 1

Примечание - * - результаты получены в настоящем исследовании

** - результаты приведены в работе Э.Оос1оу с соавторами (176)

Как следует из представленной таблицы, штаммы возбудителя мелио-идоза имели различные CT (сиквенс-типы), что позволяло их дифференцировать друг от друга, в отличие от штаммов В. mallei, которые имели одинаковый 40 СТ.

Использование этой технологии и алгоритма BURST (Based Upon Related Sequence Types) (Feil J.E. et al., 2004) позволило установить, что авиру-лентный штамм B.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, который получен нами от A. Bremmelgaard и числящийся в ее коллекции как атипичный штамм возбудителя мелиоидоза (Bremmelgaard А., 1975), принадлежит, наряду с анализируемыми В. pseudomallei 100 и В. pseudomallei С-141 к клональным комплексам штаммов Юго-Восточной Азии (рис. 4).

Рис. 4. Диаграмма различных СТ штаммов B.pseudomallei, выделенных в Юго-Восточной Азии (Алгоритм BURST). Стрелками отмечены СТ штаммов из коллекции ВолгоградНИПЧИ.

Полученные нами результаты и литературные данные свидетельствуют, с одной стороны, о значительно большей генетической однородности В. mallei (Godoy D. et al., 2003), а с другой, что метод МЛСТ недостаточно эффективен для внутривидового типирования возбудителя сапа и может быть использован лишь для дифференциации штаммов В. pseudomallei.

Оценка схемы типирования на основе амплификации вариабельных ампликонов (Variable Amplicon Typing Scheme), предложенной К. Duansonk с соавторами (2006), нами проведена на 18 штаммах возбудителя мелиоидоза и 4 штаммах возбудителя сапа из коллекции ВолгоградНИПЧИ.

В ходе эксперимента при анализе вариабельных продуктов амплификации (VAT), в зависимости от используемых праймеров и анализируемых

B.pseudomallei 107

B.pseudomallei С-141

B.pseudomallei 100

штаммов, зарегистрировано от 3 до 9 фрагментов ДНК размерами от 132 до 788 п.н. Исследуемые 18 штаммов возбудителя мелиоидоза по наличию вариабельных амшиконов разделены на 13 VAT типов (рис.5). Большинство вариабельных локусов, выявленных с помощью субтрактивной гибридизации и на основе которых проводится типирование штаммов возбудителя мелиоидоза (Duangsonk К. et al., 2006), отсутствуют в геномах секвенированных штаммов B.mallei, поэтому нам не удалось разделить штаммы возбудителя сапа на различные генетические группы.

04 ВЛ 02 0J

н-;—I-1-1-

j--■----B-|«i»fc»ilEilgT

_ I-S.ranlnuDe! 1 10

___В.)шЬвиш

-В.рпЬапШ! Ш

-101

--B.fttvfcwaJU CCIBMO

B.fccidMnQei C141

---DO

L-B.pnfcaalbl««[3

-:--,B.|ml«nIkll32

'B.pcvfcuIkUM ,B.)<eaim<]biltt 'В.)мЫамаВс1139 -В ./тЬчШЧЗО

<B.r>nlnulklll>

Рис. 5. Кластерный анализ VAT профилей штаммов возбудителя мелиоидоза.

Генетическая гетерогенность B.mallei была оценена нами методами ре-стрикционного анализа в формате пульс-электрофореза, VNTR-анализа и амплификации с произвольными праймерами, результаты которых позволили провести эффективную внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя сапа.

С помощью ПЭФ все исследуемые 14 штаммов возбудителя сапа разделены на 13 кластерных групп (90 % сходства). На уровне 92 % сходства каждый штамм B.mallei формировал уникальную кластерную группу (рис. 6).

Рис. 6. Электрофореграмма Xba I рестрикционных фрагментов ДНК и дендрограмма сходства штаммов В. mallei. ПЭФ в 1 % агарозном геле с окраской ДНК этидиумом бромидом.

Амплификация с произвольными праймерами (метод RAPD) является одним из наиболее простых способов дифференциации штаммов. Данный метод использован для многих микроорганизмов, в том числе B.pseudomallei (Haase A. et al., 1995; Leelayuwat С. et al., 2000). Для генотипирования штаммов В. mallei этот методический прием не применяли.

Практически во всех цитируемых работах отмечено, что метод амплификации с произвольными праймерами требует не только строгой стандартизации подготовки культур, но и условий проведения ПЦР и электрофореза. Для получения высокоинформативных и воспроизводимых ДНК-профилей нами первоначально оптимизированы параметры реакции амплификации -отработаны температурные режимы ПЦР, определены необходимые концентрации праймеров, исследуемой ДНК, Taq-полимеразы, а также режимы электрофоретического разделения фрагментов амплификации.

Детекцию фрагментов, как и в случае ПЭФ, осуществляли в автоматическом режиме программы RFLPscan 3.12 из пакета программ Gene Profiler 4.03 (CSP Inc., USA). Кластерный анализ и графическое отображение матриц коэффициентов сходства проводили при помощи программы TreeCon for Windows v.l.3b. Группирование штаммов и построение дендрограмм проводили при помощи невзвешенного парно-группового метода UPGMA (Sneath Р.Н., Sokal R.R., 1973).

Из 19 проанализированных нами произвольных олигонуклеотидных затравок, для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий экспериментально подобран набор праймеров, показавших наибольшую эффектив-

ность (табл. 3). Каждые из олигонуклеотидов или их комбинаций давали возможность обнаружить специфические микролокусы в геномах штаммов, которым свойственна различная степень нуклеотидной изменчивости на внутривидовом уровне.

Таблица 3

Набор произвольных праймеров для дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза методом КАРО

№ п/р Обозначение Последовательность Автор

1 RA GTTTCGCTCC (Wongratanacheewin S., 2000)

2 Jeffreys GGAGGTGGGCAGGAXG (Jeffreys A.J., 1985)

3 Rep CGACGCAGGC (Liu Y„ 2002)

4 PR 6 GAGACGCACA (Haase A., 1995)

5 PR 7 CAGCCCAGAG (Haase A., 1995)

6 PR 13 AGCGTCACTC (Haase A., 1995)

7 PR 16 AAGCGACCTG (Haase A., 1995)

При анализе электрофоретических профилей ДНК 14 штаммов возбудителя сапа выявлены схожие RAPD-паттерны, которые, независимо от используемых праймеров, имели коэффициент подобия более 75 %, что доказывало высокую степень однородности изучаемых штаммов В. mallei. Анализ электрофоретических RAPD - паттернов штаммов B.pseudomallei и B.thailandensis показал их более высокую полиморфность по сравнению со штаммами возбудителя сапа. Данная закономерность вполне объяснима с позиций формирования адаптационной и генетической изменчивости у этой триады буркхольдерий. Кроме того, размер геномов В. pseudomallei и B.thailandensis превышает размер генома В. mallei, что также может влиять на количество RAPD-фрагментов на электрофореграммах.

Нами выявлено, что практически любой из праймеров пригоден для видовой дифференциации патогенных буркхольдерий. Однако в зависимости от праймеров формировалось различное количество и состав кластерных групп. Образованные кластерные группы отражали гетерогенность популяций патогенных буркхольдерий, при которой каждый штамм имел свой характерный RAPD-тип. Анализ штаммов, проведенный внутри каждого кластера в отдельности, показал, что при использовании разных праймеров формируются независимые группы.

Для проведения внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа наиболее эффективны оказались праймеры Jeffreys, PR 6, PR 7 и RA, в то время как для возбудителя мелиоидоза - олигонуклеотидные затравки PR 7, PR 16, PR 13, RA и Rep. При суммировании результатов RAPD-типирования и формировании единой матрицы сходства с использованием всего набора исследуемых праймеров каждый штамм B.mallei и B.pseudomallei формировал уникальную кластерную группу, соответственно

количеству исследуемых штаммов, отражая гетерогенность популяции возбудителей сапа и мелиоидоза (рис.7).

Рис. 7. Дендрограмма сходства штаммов патогенных буркхольдерий с использованием набора произвольных праймеров

Детальный анализ геномов различных микроорганизмов, в том числе В. pseudomallei и В. mallei позволил обнаружить многочисленные повторяющиеся последовательности. Одними из них являются вариабельные тандем-ные повторы, лежащие в основе VNTR-анапиза (Keim P. et al., 2000; Farlow J. et al., 2001; Сучков И. Ю. с соавт., 2004; Цыганкова О. И. с соавт., 2006). У патогенных буркхольдерий впервые тандемный повтор размером 10 п.н., обнаружен при анализе штамма В.pseudomallei АТСС 23343 (Liu Y. et al., 2002).

В настоящем разделе работы была рассмотрена возможность использования VNTR-анализа для генотипирования коллекционных штаммов патогенных буркхольдерий. Амплификацию VNTR-локусов возбудителей сапа и мелиоидоза проводили с помощью праймеров SR1/SR5 (Liu Y. et al., 2002).

В результате амплификации во всех исследуемых штаммах возбудителей сапа и мелиоидоза синтезировались фрагменты ДНК размером от 422 до 692 п.н. (рис. 8).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

"spjs»- " ' «»¡гвИв

i fWsx.' ohH

Рис. 8. Электрофореграммы продуктов амплификации штаммов патогенных буркхольдерий с праймерами SR1/SR5.

1. В. thailandensis 264

2. В. pseudomallei 116

3. В. pseudomallei С-141

4. В. pseudomallei 130

5. В. mallei 5584/1

6. В. pseudomallei 100

7. В. mallei Загреб

8. В. mallei Z-12

9. В. mallei 11 10.5. mallei Ц-5

11 .В. mallei Будапешт

W.B. mallei 10230 12.A mallei V-120 13.5. pseudomallei 110 14.5. mallei 8 15.5. mallei Иванович 16.B.pseudomallei 134 17.5 mallei P-l

18.Плазмида pUC 19, гидролизованная эндонуклеазой рестрикции Нра II

19.Фрагменты контрольной ДНК (400, 550, 700 п.н.

На основе различий в размерах полученных ампликонов при анализе 6 штаммов В.pseudomallei и 11 штаммов 5. mallei нами идентифицировано 11 аллелей (VNTR-типов). Шесть штаммов В.pseudomallei разделены на 5 аллелей. Среди 11-ти штаммов В.mallei идентифицировано 8 аллелей с различным числом тандемных повторов. Причем, два аллеля были общими для В.mallei и В.pseudomallei.

Стабильность тандемных повторов для каждого штамма и отсутствие изменений нуклеотидных последовательностей в этом генетическом локусе после пассажей на животных, как отмечено в работе Y. Liu с соавторами (2002), свидетельствует о возможности использования данного генетического маркера в VNTR анализе В. mallei и В.pseudomallei. При этом, амплификаци-онная тест-система с праймерами SR1/SR2 пригодна для простого, быстрого и высокоспецифичного ПЦР-типирования штаммов патогенных буркхольдерий.

Обобщая полученные результаты необходимо отметить, что в основу алгоритма генодиагностики и генотипирования патогенных буркхольдерий

нами был заложен принцип дифференцированного подхода к выбору наиболее информативного метода или сочетаний молекулярно-генетических методов. Это позволило разработать единую схему идентификации и типирования В. mallei и B.pseudomallei (рис.9).

ПЦР-скрининг

Секвенирование ДНК (16S РНК, 23S РНК, orfl3,JUQ

Внутривидовое тнпирование штаммов

<

ПЦР-типирование I (VAT, VNTR, Rep-PCR, | RAPD) 1

МЛСТ, ПЭФ

Рис. 9. Схема генетической идентификации и типирования В. mallei и B.pseudomallei.

В данной схеме ПЦР-скрининг предполагает использование амплифи-кационных тест-систем со специфическими праймерами bflls/bfl2a, BTTS-sl/BTTS-as3 и b23s7/b23a8 для детекции В. mallei и B.pseudomallei. Алгоритм генодиагностики и генотипирования патогенных буркхольдерий, включает на этапе идентификации культур реакцию амплификации и секвенирование ампликонов. Для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза пригодны все используемые в работе генетические методы. Однако для ускоренного генотипирования B.pseudomallei целесообразно использовать различные варианты ПЦР-типирования (VAT, RAPD, Rep-ПЦР, VNTR). К этому следует добавить, что для дифференциации штаммов B.mallei эффективны ПЭФ, VNTR и RAPD, но быстрое генетическое типирование штаммов возбудителя сапа обеспечивают метод анализа тандемных повторов и амплификация с произвольными праймерами.

Выводы

1. Оценена сравнительная эффективность молекулярно-биологических методов идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов В. mallei и В. pseudomallei. Предложена схема лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза с включением ПЦР как на этапе идентификации чистых культур, так и анализа проб клинического материала и объектов внешней среды. Сформирована единая система генодиагностики и гено-типирования патогенных буркхольдерий.

2. На основе нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих 23S рРНК, флагеллярного гена fliC и orf гена III типа секреции, определены олигонуклеотидные праймеры, подобраны оптимальные условия, определены параметры проведения ПЦР и сконструированы амплифика-ционные тест-системы для идентификации патогенных буркхольдерий, позволяющие выявлять возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрациях 1 х 102 -1 х 103 м.к./мл.

3. Показано, что использование олигонуклеотидных праймеров burtsl/burta2, сконструированных на основе флагеллярного гена fliC, позволяет идентифицировать три вида буркхольдерий В.pseudomallei, В.mallei и B.thailandensis при анализе чистых культур и обнаруживать B.thailandensis в пробах экспериментального клинического материала при моделировании инфекционного процесса.

4. Для повышения специфичности идентификационных тестов необходимо использовать ПЦР с диагностическими праймерами, сконструированными на различные ДНК-мишени. Показано, что сочетание реакции амплификации и секвенирование ДНК мишеней - участков 16S рРНК и 23S рРНК, orf 13 или fliC является алгоритмом быстрой идентификации В. mallei и В. pseudomallei и их дифференциации от близкородственных видов микроорганизмов.

5. Установлено, что эффективными фенотипическими методами дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза являются фаготипирование и анализ белкового спектров, в то время как проведение внутривидового типирования штаммов В. mallei возможно на основе различий в спектре суммарных клеточных белков. Тесты, основанные на выявлении вариабельных биохимических признаков и различий в чувствительности к антибиотикам выступают лишь в качестве дополнительных критериев внутривидовой дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий.

6. На основе плазмидного анализа выявлено 4 группы штаммов B.pseudomallei, отличающихся по составу и размеру плазмидных репли-конов. Показано, что обнаруженные плазмиды могут выступать в качест-

ве дополнительного критерия генотипической дифференциации штаммов и являться эпидемиологическим маркером в случае возникновении инфекционного процесса, вызванного плазмидсодержащим штаммом B.pseudomallei.

7. Показана высокая эффективность метода мультилокусного сиквенс-типирования для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, позволившего установить, что анализируемые штаммы B.pseudomallei 100, С-141, а также B.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, относятся к Юго-Восточной группе. Все исследуемые штаммы В. mallei формируют единый 40 сиквенс-тип, входящий в клональный комплекс штаммов В. pseudomallei.

8. Отработаны условия проведения рестрикционного анализа ДНК штаммов возбудителя сапа, оценена их генетическая гетерогенность и показана высокая эффективность метода пульс-электрофореза для внутривидового генетического типирования штаммов B.mallei. На основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 14 штаммов возбудителя сапа с помощью кластерного анализа разделены на 13 генетических групп.

9. Показана высокая эффективность RAPD-типирования для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий. Предложен набор олигонукле-отидных затравок, обозначенных Jeffreys, PR 6, PR 7 и RA для проведения внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа и прайме-ров PR 7, PR 16, PR 13, и RA - для возбудителя мелиоидоза.

10. Выявлена эффективность схемы типирования, основанной на анализе вариабельных ампликонов, для ускоренной генетической дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от штаммов B.mallei, в геномах которых вариабельные ампликоны не выявлены. С помощью ПЦР-типирования 18 штаммов возбудителя мелиоидоза разделены на 13 генетических групп (VAT типов).

11. Установлена пригодность праймеров, фланкирующих тандемные повторы в гене, детерминирующем эстеразу патогенных буркхольдерий, для простого, быстрого и высокоспецифичного ПЦР-типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. С помощью VNTR анализа среди 11 штаммов B.mallei идентифицировано 8 аллелей с различным числом тан-демных повторов, в то время как шесть штаммов B.pseudomallei разделены на 5 аллелей.

12. Показано, что алгоритм быстрой дифференциации штаммов B.pseudomallei включает методы ПЦР-типирования, основанные на анализе вариабельных ампликонов и количества тандемных повторов, ам-

плификации ДНК с произвольными праймерами и Rep-ПЦР, в то время как быстрое генетическое типирование штаммов В. mallei обеспечивают VNTR-анализ и амплификация с произвольными праймерами.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Генетика возбудителя мелиоидоза / Меринова Л.К., Гришкина Т.А., Тарасова Т.Д., Антонов В.А. // Мелиоидоз (под ред. акад. Н.Г.Тихонова).-1995.- Волгоград.- С. 26-47.

2. Антонов В.А., Замараев B.C., Меринова Л.К. Мобилизация критических плазмид Pseudomonas pseudomallei в гетерологичные виды микроорганизмов // Экологоэпидемический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии: Тез. науч. конф., Астрахань, 1996.- С.99.

3. Денисов И.И., Андрус В.Н., Антонов В.А. Адаптация псевдомонад, имеющих клиническое значение к дезинфектантам // Экологоэпидемический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии: Тез. науч. конф., Астрахань, 1996.- С.101.

4. Антонов В.А., Замараев B.C., Захарова И.Б. Изучение гомологии плазмид возбудителя мелиоидоза // Экологоэпидемический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии: Тез. науч. конф., Астрахань, 1996.-С. 103.

5. Антонов В.А., Замараев B.C., Захарова И.Б. Плазмиды возбудителя мелиоидоза // Экологоэпидемический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии: Тез. науч. конф., Астрахань, 1996,-С.107.

6. Илюхин В.И., Антонов В.А., Гришкина Т.А. Таксономическая позиция патогенных псевдомонад // Мат. VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва. - 1997.- С.201-202.

7. Антонов В.А., Меринова Л.К., Замараев В.С, Викторов Д.В. Анализ фено-типических свойств штаммов возбудителя сапа, несущих криптические плазмиды Pseudomonas pseudomallei II Мат. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997.-С.6-7.

8. Замараев B.C., Антонов В.А. Плазмиды Pseudomonas pseudomallei Н Мат. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России, Саратов, 1997,- С.49-50.

9. Антонов В.А., Меринова Л.К., Замараев B.C., Агеева Н.П., Викторов Д.В. Фенотипические свойства возбудителей сапа и мелиоидоза, содержащих плазмидные репликоны // Проблемы санэпид охраны территории стран СНГ: Тез. науч. практич. конф., Саратов, 1998.- С.174-176.

Ю.Антонов В.А., Замараев B.C., Илюхин В.И. Группоспецифический ДНК-зонд для идентификации патогенных псевдомонад // Биотехнология .-1998.-N5.- С.75-84.

П.Антонов В..А., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Замараев B.C., Захарова И.Б., Ткаченко Г.А. Влияние R-плазмид на отдельные фенотипические признаки штаммов возбудителя сапа и мелиоидоза // Диагностика, лече-

ние и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехноло-гия.Ветеринария: Мат. юбилейной науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиологии МО РФ, Киров, 1998,- С.48-49.

12.3ахарова И.Б., Замараев B.C., Антонов В.А., Ткаченко Г.А. Конструирование интегративного вектора на основе Со1Е1-репликона для клонирования в Burkholderia pseudomallei II Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология.Ветеринария: Мат. юбилейной науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиологии МО РФ, Киров, 1998.-С.50-51.

13.3амараев B.C., Антонов В.А., Илюхин В.И., Захарова И.Б. Выделение и первичная характеристика плазмид Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei И Мол. генет. микробиол. вирусол.- 1998,- N4,- С.28-33.

14.Vicktorov D.V., Piven N.N., Zakharova LB., Plekhanova N.G., Antonov V.A. Melioidosis vaccine: some approaches to development / First Global Conference on Vaccines and Immunisation into the next millennium, Manchester, UK, 1999, p.47-48

15.Ahtohob B.A., Замараев B.C., Меринова Л.К., Илюхин В.И. Burkholderia mallei как хозяин плазмид возбудителя мелиоидоза // Scientific Journal.-1999.- N7.- р.225-226.

16.Антонов В.А., Замараев B.C., Меринова Л.К., Захарова И.Б., Ткаченко Г.А, Бахтояров Г.Н., Клонирование фрагментов криптической плазмиды возбудителя мелиоидоза // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: Тез. докл. юбилейной науч. конф., посвящ. 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии, Оболенск, 1999.- С.8.

17.Антонов В.А., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Ткаченко Г.А., Бахтояров Г.Н. Влияние плазмиды RPl::TnlO на чувствительность клеток сапного микроба к мелиоидозному бактериофагу // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: Тез. докл. юбилейной науч. конф., посвящ. 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии, Оболенск, 1999.- С.9.

18.3ахарова И.Б., Замараев B.C., Антонов В.А. Физическое картирование криптической плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза // Проблемы особо опасных инфекций.- 1999.- Вып.79,- С.159-162.

19.Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Бахтояров Г.Н. Плазмиды возбудителя мелиоидоза // Тез. конф. молодых ученых Поволжья и Северного Кавказа, Нижний Новгород, 2000,- С. 81.

20.Меринова Л.К., Антонов В.А., Замараев B.C., Викторов Д.В. Мобилизация криптических плазмид возбудителя мелиоидоза в гетерологичные виды микроорганизмов // Мол. генет. микробиол. вирусол.- 2000.- N2,- С.37-40.

21.Антонов В.А., Илюхин В.И., Замараев B.C., Трушкина М.Н. Использование плазмид возбудителя мелиоидоза в качестве ДНК-зондов для идентификации близкородственных микроорганизмов // Биотехнология .- 2000.-N4.-C.8-14.

22.Антонов В.А., Замараев B.C., Захарова И.Б., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Попов С.Ф. Изучение плазмид патогенных буркхолдерий // Природ-

но-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб.науч. тр., Волгоград, 2000.- С.41-46.

23.Илюхин В.И., Кисличкин Н.Н., Тихонов Н.Г., Плеханова Н.Г., Денисов И.И., Кисличкина И., Антонов В.А., Пивень Н.Н., Викторов Д.В., Фарбер G.M. Перспективы применения Francisella tularensis 15 (LVS) для гетеро-логичной иммунизации и создания поливалентных рекомбинантных вакцин // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб.науч. тр,-Волгоград,- 2000.- С. 100-106.

24.Antonov V.A., Zamaraev V.S., Zakharova I.B., Ilyukhin V.I. Discovery of resident plasmids among pathogenic species of Burkholderia H Scientific Joumal.-2000,- №8.- p.135-137.

25.Илюхин В.И., Будченко A.A., Антонов B.A., Сеимова И.К., Трушкина М.Н. Внутривидовое типирование штаммов возбудителей сапа и мелиои-доза // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. Реферативный сборник (под ред.В.В.Кутырева).- Саратов, 2000.- С.32-33.

26.Антонов В.А., Замараев B.C., Захарова И.Б., Илюхин В.И., Бахтояров Г.Н., Ткаченко Г.А., Алексеева В.В., Зинченко О.В. Использование плазмидно-го анализа для внутривидового типирования возбудителя мелиоидоза // Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика: Сб. науч. тр.- Астрахань, 2001.-С.273-275.

27.Будченко А.А., Илюхин В.И., Антонов В.А., Сеимова И.К., Трушкина М.Н., Меринова J1.K., Замараев B.C., Сенина Т.В. Изучение стабильности признаков, используемых для внутривидового типирования патогенных буркхолдерий И Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика: Сб. науч. тр.- Астрахань, 2001,-С.276-278.

28.Ткаченко Г.А., Антонов В.А. Замараев B.C., Илюхин В.И., Алексеева В.В., Зинченко О.В., Использование метода ПЦР для идентификации возбудителя мелиоидоза // Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика: Сб. науч. тр.- Астрахань, 2001.- С.З28-330.

29.11yukhin V.I., Senina T.S., Plekhanova N.G., Antonov V.A., Merinova L.K., Tkatchenko G.A., Zamaraeva S.V., Alekseeva V.V. Biological properties and differentiation of pathogenic species of Burkholderia I/ Natural infectious diseases. Abstract of scientific conference. Ulaanbaatar, Mongolia, 2001,- P.33-36.

30.Tkatchenko G.A., Antonov V.A., Zamaraev V.S., Ilyukhin V.I, Alekseeva V.V., Zintchenko O.V. Detection and identification of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei by PCR II Natural infectious diseases. Abstract of scientific conference. Ulaanbaatar, Mongolia, 2001,- P.68-70.

31.Илюхин В.И., Сенина T.B., Плеханова Н.Г., Антонов В.А., Меринова Л.К., Сеимова И.К. Burkholderia thailandensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция И Мол. генет. микробиол. вирусол.-2002.-N1.- С7-11.

32.Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Замараев B.C., Илюхин В.И., Алексеева В.В., Зинченко О.В. Идентификация патогенных буркхольдерий методом ПЦР // Мат. VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2002,- С.347-348.

33.Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Замараев B.C., Алексеева В.В., Илюхин В.И. Применение ПЦР при экспериментальном сапе // Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении: Сб. тр. научн.-практ. симпозиума в рамках Международной конф.«Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины», Москва, 2002.-С.310-312.

34.Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алексеева В.В., Замараев B.C., Илюхин В.И., Трофимов Д.Ю. Использование ПЦР для идентификации патогенных буркхольдерий // Генодиагностика инфекционных заболеваний: Мат. IV Всеросс. научн.-практ. конф., Москва, 2002.- С.258-259.

35.Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алексеева В.В., Замараев B.C., Илюхин В.И., Трофимов Д.Ю. Оценка возможности использования двух пар прай-меров для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза и дифференциации от Burkholderia thailandensis // Генодиагностика инфекционных заболеваний: Мат. IV Всеросс. научн.-практ, конф., Москва, 2002,- С.259-260.

36.Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Замараев B.C., Алексеева В.В., Тихонов Н.Г. Идентификация патогенных буркхольдерий методом ПЦР // Гомеостаз и инфекционный процесс: Тез. докл. III Общеросс. конф.с международным участием, Сочи, 2002.- С. 106.

37.Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алексеева В.В., Замараев B.C., Илюхин В.И. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане.- 2002,- Вып 5.- С.22-25.

38.Антонов В.А., Гришкина Т.А., Замараев B.C., Илюхин В.И. Влияние температуры культивирования на внехромосомные факторы наследственности возбудителя мелиоидоза // Журн. микробиол. эпидемиол. иммуноби-ол.- 2003.- N2.- С.3-7.

39.Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Замараев B.C., Илюхин В.И. Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции // Мол. генет. микробиол. вирусол.- 2003.- N3.- С7-11.

40.Антонов В.А., Алтухова В.В., Ткаченко Г.А , Бахтояров Г.Н., Будченко A.A., Замараев B.C., Илюхин В.И. Молекулярно-биологические методы внутривидового типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Мат. IV межгосударственной науч.- практ. конф. Государств стран СНГ, Саратов,- 2003,- С. 17-19.

41.Антонов В.А., Замараев B.C., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Илюхин В.И. Некоторые аспекты эпидемиологического надзора и профилактики возникновения мелиоидоза на территории России // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Мат. IV межгосударственной науч.- практ. конф. Государств стран СНГ, Саратов,- 2003,-

С.19-21.

42.3амараев B.C., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Илюхин В.И. ПЦР-диагностика патогенных буркхольдерий // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Мат. IV межгосударственной науч.- практ. конф. Государств стран СНГ, Саратов, 2003.-С.62-63.

43.Малахаева А.Н., Саяпина Л.В., Тихвинский М.С., Осина H.A., Шарова И.Н., Анисимова Т.Н., Адамова Г.В., Касина И.В., Савельев В.Н., Еременко Е.И., Замараев B.C., Антонов В.А. Характеристика реагентов для подготовки проб возбудителей особо опасных инфекций к анализу методом ГИДР в государственных испытаниях // Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней: Мат. IV межгосударственной науч.- практ. конф. Государств стран СНГ, 2003.- С.109-110.

44.Алексеева В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Замараев B.C., Будченко

A.A. Использование произвольных праймеров (RAPD) для внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане.- 2003.- Вып. № 1 (7).- С.49-51.

45.Алтухова В.В., Пименов Е.В., Алексеев В.В.,Чухланцев Д.А., Парамонов И.В., Маракулин И.В., Дармов И.В., Антонов В.А., Замараев B.C., Ткаченко Г.А., Илюхин В.И. Оценка возможности применения нескольких пар праймеров для идентификации патогенных буркхольдерий // Сб. науч. тр., посвящ. 75 - летию НИИ микробиологии МО РФ, Киров.- 2003,- С.20.

46.Антонов В.А., Пименов Е.В., Алексеев В.В., Чухланцев Д.А., Парамонов И.В., Маракулин И.В., Дармов И.В., Замараев B.C., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В.1 Илюхин В.И. Разработка амплификационной тест- системы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза // Сб. науч. тр., посвящ. 75 - летию НИИ микробиологии МО РФ, Киров,- 2003,- С.21-22.

47-Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Замараев B.C., Илюхин В.И., Трофимов Д.Ю. Использование ПЦР для идентификации Burkholderia mallei И Мол. генет. микробиол. вирусол.- 2004,- N1,- С12.

48.0нищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Жилина Н.Я., Субботин В.Г., Алексеев

B.В., Липницкий A.B., Метлин В.Н., Прохватилова Е.В., Храпова Н.П., Лобанов А.Н.. Пашанина Т.П., Илюхин В.И., Батманов В.П., Лозовая H.A., Лесовой B.C., Пучков; B.C., Погасий Н.И., Кулаков М.Я., Андрус В.Н., Сухов В.В., Савченко С.Т., Замараев B.C., Антонов B.A.j Тихонов С.Н., Плеханова Н.Г., Алтухова В.В., Перепелицына C.B., Попов С.Ф., Быкова О.И., Плешакова Т.В., Новицкая И.В., Викторов Д.В., Захарова И.Б., Сенина Т.В., Шумилов П.К., Жуков А.Н., Чайка А.Н И Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. - Волгоград, 2004.- 236 с.

49.Алтухова В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Плеханова Н.Г., Бахтояров Г.Н., Савченко С.С., Замараев B.C., Илюхин В.И. Генодиагностика сапа и мелиоидоза // Человек и лекарство: Мат. XI Рос. нац. конгресса, Москва, 2004.-С.417.

50.Алтухова В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Замараев B.C., Плеханова

Н.Г., Илюхин В.И. Использование ПЦР для изучения особенностей течения мелиоидозной инфекции // Медицинская микробиология - XXI век: Мат.Всерос. науч.- практ. конф. - Саратов, 2004. - С.20-22.

51.Бахтояров Г.Н., Антонов В.А., Замараев B.C., Ткаченко Г.А. Использование плазмидного анализа для внутривидового типирования штаммов буркхольдерий // Медицинская микробиология - XXI век: Мат.Всерос. науч.- практ. конф. - Саратов, 2004.- С.30-32.

52.Алтухова В.В., Антонов В.А., Голосеев Ю.А., Васильев В.П., Пивень H.H. Оценка возможности применения полиакриламидного дискового сорбента для обнаружения возбудителя мелиоидоза методом ПЦР // Генодиагностика инфекционных болезней: Сб. тр. V Всерос. науч.-практ, конф., Москва, 2004,- Т.2.- С. 156-157.

53.Антонов В.А., Алтухова В.В., Савченко С.С., Будченко A.A., Замараев

B.C., Илюхин В.И., Алексеев В.В. Оценка эффективности использования различных систем праймеров для проведения внутривидового типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза // Генодиагностика инфекционных болезней: Сб. тр. V Всерос. науч.-практ. конф., Москва, 2004.-

C.158-159.

54.Антонов В .А., Алексеев В.В., Липницкий A.B., Замараев B.C., Ткаченко Г.А, Алтухова В.В., Савченко С.С., Лесовой B.C., Гришина М.А. Стратегия и тактика конструирования амплификационных тест-систем для идентификации патогенных буркхольдерий и возбудителей особо опасных микозов / Генодиагностика инфекционных болезней // Генодиагностика инфекционных болезней: Сб. тр. V Всерос. науч.-практ. конф., Москва, 2004,- С.160-161.

55.Антонов В.А., Илюхин В.И. Молекулярно-биологические подходы к диагностике и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза // Мол. генет. микробиол. вирусол,- 2005.- N2,- СЗ-9.

56.Савченко С.С.,. Антонов В.А, Алтухова В.В., Замараев B.C. Генотипиро-вание штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза // Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Мат. VI Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, Волгоград.- 2005.- С.185-186.

57.Алтухова В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Замараев B.C. Дифференциация возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР //Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Мат. VI Межгосударственной науч.-практ. конф. государств-участников СНГ, Волгоград,- 2005,- С.203-204.

58.AHTOHOB В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Савченко С.С., Зинченко О.В., Замараев B.C., Илюхин В.И., Алексеев В.В. Использование методов генодиагностики и генотипирования для молекулярно-эпидемиологичес-кого анализа возможных вспышек сапа и мелиоидоза // Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств:

проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Мат. VI Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, Волгоград.- 2005.-С.204-206.

59.3инченко О.В., Алтухова В.В., Замараев B.C., Голосеев Ю.А., Васильев В.П., Пивень Н.Н. Обнаружение возбудителя мелиоидоза методом ПЦР с использованием магноиммуносорбентов // Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Мат. VI Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, Волгоград,- 2005.- С.239-240.

60.Антонов В.А., Зинченко О.В., Лобанов А.Н., Замараев B.C., Алексеев В.В., Трофимов Д.Ю., Гончарова Е.В., Саматов Г.А. Детекция возбудителей особо опасных инфекций в условиях автономной мобильной ПЦР-лаборатории // Генодиагностика инфекционных болезней: Мат. Рос. науч,-практ. конф., Новосибирск.- 2005.- С.88-89.

61.Антонов В.А., Зинченко О.В., Ткаченко Г.А., Замараев B.C., Алексеев

B.В., Трофимов Д.Ю., Гончарова Е.В. Гибридизационно-флуоресцентная ПЦР-тест-система для идентификации возбудителей сапа (Burkholderia mallei) и мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) I/ Генодиагностика инфекционных болезней: Мат. Рос. науч.-практ. конф., Новосибирск,- 2005.-

C.90-91.

62.Алтухова В.В., Савченко С .С., Антонов В.А., Зинченко О.В., Замараев

B.C., Абаев И.В., Печерских Э.И. Генетическое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сб. тез. науч-практ. конф. молодых ученых,- Санкт-Петербург, 2006.- С.273-274.

63. Зинченко О.В., Антонов В.А., Алтухова В.В., Замараев B.C., Трофимов Д.Ю. Конструирование гибридизационно-флуоресцентной амплификаци-онной тест-системы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза И Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сб. тез. науч-практ. конф. молодых ученых.- Санкт-Петербург, 2006,- С.274-275.

64.Антонов В.А., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Агеева Н.П., Замараев B.C., Илюхин В.И. Влияние плазмид на вирулентность и чувствительность клеток сапного микроба к мелиоидозному бактериофагу // Вестник Волгоградского Государственного медицинского Университета.- 2006,- №3,-

C.63-66.

65.Савченко С.С., АнтоновВ.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Зинченко О.В., Замараев B.C. Идентификация и генетическое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза с использованием методов секвенирования II Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств»: Мат. VII Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, Оболенск,- 2006,- С.122-123.

бб.Антонов В.А., Зинченко О.В., Ткаченко Г.А., Замараев B.C., Трофимов Д.Ю., Абрамов Д.Д. Идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией // Мат. VII Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, Оболенск.-2006.-С.176-177.

67.3инченко О.В., Антонов В.А., Замараев B.C., Голосеев Ю.А., Васильев

B.П., Ломова Л.В., Пивень H.H. Использование магноиммуносорбентов для обнаружения возбудителя- мелиоидоза в пробах почвы и молока методом ПЦР // Мат. VII Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, Оболенск.- 2006,- С.203-204.

68.0нищенко Г.Г., Кривуля С.Д., Федоров Ю.М., Субботин В.Г., Ломов Ю.М., Мишанькин Б.Н., Черепахина И.Я., Москвитина Э.А., Подосинни-кова Л.С., Рыжко И.В., Фецайлова О.П., Пухов Ю.М., Прометной В.И., Мазрухо Б.Л., Пичурина Н.Л., Шелохович А.И., Сучков И.Ю., Водопьянов

C.О., Водяницкая С.Ю., Голубев Б.П., Безсмертный В.Е., Королев Ю.С., Иванова С.М., Кутырев В.В., Куличенко А.Н., Куклев Е.В., Щербакова С.А., Осина H.A., Шарова И.А., Билько И., Красовская Т.Ю., Пионтков-ский С.А., Донская Т.Н., Самойлова Л.В., Храпова Н.П., Кулаков М.Я., Прохватилова Е.В., Илюхин В.И., Замараев B.C., Антонов В.А., Сенина Т.В., Метлин В.Н., Липницкий A.B., Алексеев В.В., Лессовой B.C., Тихонов Н.Г., Агафонов А.П., Локтев В.Б., Рябчикова Е.И., Терновой В.А., Шестопалов A.M., Щелкунов С.Н., Раевский К.К., Дармов И.В., Миронин A.B., Маракулнн И.В., Кузнецов С.Л., Крючков A.B., Федотов А.К., Елагин Г.Д., Рассанов В.П., Максимов В.А., Марков В.И., Хамитов P.A., Ус-тюшин В.Н., Богатиков Г.В., Кожевников A.B., Маркин В.А., Дмитриев

A.О., Осин Н.С., Швагер М.М., Митрофанова Т.В., Карнаухова О.В. // Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство. Под ред. академика РАМН, проф. Г.Г. Онищенко,- М: ЗАО «МП Гигиена»,- 2006.- 288 с.

69.Антонов В.А., Алексеев В.В., Липницкий A.B., Илюхин В.И., Замараев

B.C., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Гришина М.А., Савченко С.С., Зинченко О.В. Генодиагностика и генотипирование потенциальных агентов биотерроризма - возбудителей сапа, мелиоидоза и глубоких микозов // Мат. IX съезда Всерос. науч.-практ. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007,- Т.З.- С.375-376.

70.Антонов В.А., Алтухова В.В., Савченко С.С., Замараев B.C., Илюхин В.И., Алексеев В.В. Использование мультилокусного сиквенс-типирования (MLST) и амплификации с произвольными праймерами (RAPD) для дифференциации штаммов возбудителя сапа // Мол. генет. микробиол. виру-сол.- 2007.- N3.- СЗ-9.

71.Алтухова В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Зинченко О.В., Замараев B.C., Плеханова Н.Г., Илюхин В.И., Трофимов Д.Ю. Использование по-лимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции // Мол. генет. микробиол. виру-сол.- 2007.-N3,- С22-27.

72.Антонов В.А., Викторов Д.В., Алтухова В.В., Ткаченко Г.А., Савченко С.С., Захарова И.Б., Меринова Л.К., Замараев B.C. Анализ штаммов бурк-хольдерий с помощью амплификации с использованием произвольных праймеров // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Мат. VIII Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, Саратов - 2007.- С. 155-157.

73.3инченко О.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Замараев B.C. Сравнительный анализ способов выделения ДНК возбудителя мелиоидоза из конта-минированных проб почвы для проведения ПЦР // Мат. VIII Межгосударственной науч.- практ. конф. государств-участников СНГ, Саратов.- 2007,-С.210-211.

74.Савченко С.С., Антонов В.А., Алтухова В.В., Ткаченко Г.А., Зинченко О.В., Замараев B.C. Анализ штаммов патогенных буркхольдерий методами мультилокусного сиквенс-типирования и амплификации с использованием произвольных праймеров // Мат. VIII Межгосударственной науч.-прает. конф. государств-участников СНГ, Саратов.- 2007.- С.277-278.

75.Antonov V.A., Alekseev V.V., Tkachenko G.A., Altukhova V.V., Zamaraev V.S., Zinchenko O.V., Viktorov D.V., Ilyukhin V.I. and Troiimov D.Yu. Mobile PCR Laboratory for Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei detection // The 5th World melioidosis congress, Khon Kaen, Thailand, 2007.-P.88.

76.Antonov V.A. Molecular identification and typing of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei: when is enough enough? 11 The 5th World melioidosis congress, Khon Kaen, Thailand, 2007,- P.198.

77.Viktorov D.V ., Alekseev V.V., Zakharova I.B., Antonov V.A. and Merinova L.K.High-level resistance to fluoroquinolones and cephalosporins in Burkholderia pseudomallei and closely related species // The 5th World melioidosis congress, Khon Kaen, Thailand, 2007.- P.247.

78.Антонов B.A., Ткаченко Г.А., Алтухова B.B., Зинченко O.B., Савченко С.С., Замараев B.C., Илюхин В.И., Алексеев В.В. Молекулярная идентификация и типирование Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei // Молекулярная диагностика: Сб. тр. VI Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, Москва, 2007.- T.I.- С.330-332.

79.Викторов Д.В., Алексеев В.В., Захарова И.Б., Антонов В.А., Меринова Л.К. Резистентность высокого уровня к фторхинолонам и цефалоспоринам у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов // Молекулярная диагностика: Сб. тр. VI Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, Москва, 2007.- С.355-357.

80.Савченко С.С., Антонов В.А., Алтухова В.В., Ткаченко Г.А., Замараев B.C. Идентификация и дифференциация патогенных буркхольдерий на основе монолокусного секвенирования // Молекулярная диагностика: Сб. тр. VI Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, Москва, 2007,- С.398-399.

81.Шунова А.В., Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Савченко С.С. Генетическое

типирование патогенных буркхольдерий на основе вариабельных ампли-конов (Variable Amplicon Typing) // Молекулярная диагностика: Сб. тр. VI Всерос. науч.-практ. конф. с международным участием, Москва, 2007.-С.416-417.

82.Viktorov D.V., Zakharova I.B., Podshivalova M.V., Kalinkina E.V., Merinova O.A., Ageeva N.P., Antonov V.A., Merinova L.K., Alekseev V.V. High-level resistance to fluoroquinolones and cephalosporins in Burkholderia pseu-domallei and closely related species // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 2008.-N.102/S1,544-551.

83.Antonov V.A., Tkachenko G.A.,. Altukhova V.V, Savchenko S.S., Zinchenko O.V., Viktorov D.V., Zamaraev V.S., Ilyukhin V.l., Alekseev V.V. Molecular identification and typing of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei: when is enough enough? // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 2008,-N.102/S1,563-568.

АНТОНОВ Валерий Алексеевич ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ВНУТРИВИДОВОЕ ТИПИРОВАНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Бумага офсетная № 65. Гарнитура «Тайме». Тираж 100 экз. Заказ № 2331

Отпечатано в ООО «Бланк» Лиц. №3550 400131, г. Волгоград, ул. Скосырева,2а

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Антонов, Валерий Алексеевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I

ТАКСОНОМИЧЕСКОЕ ПОЛОЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА, МЕ-ЛИОИДОЗА И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

ГЛАВА II

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ВНУТРИВИДОВОЕ ТИПИРОВАНИЕ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ НА ОСНОВЕ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ ПРИЗНАКОВ

2.1. Лабораторная диагностика сапа и мелиоидоза

2.2. Вариабельные фенотипические признаки, применяемые 49 для внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий

ГЛАВА III 57 ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ БУРК-ХОЛЬДЕРИИ В. cepacia, В. thailandensis и В. psenaomallei-like spp.

3.1. Идентификация бактерий комплекса В. cepacia на основе 57 принципа полифазной таксономии

3.2. Анализ биологических свойств штаммов В. thailandensis и 62 В. pseudomallei-like spp. (Ленкоранских штаммов)

ГЛАВА IV

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДЕТЕКЦИИ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ

4.1. Перспективные ДНК-мишени для генодиагностики пато- 71 генных буркхольдерий

4.2. Конструирование амплификационных тест-систем для 82 идентификации В. mallei и В. pseudomallei.

4.2.1. Характеристика олигонуклеотидных праймеров для идеи- 82 тификации патогенных буркхольдерий, сконструированных на основе генов fliC, or/13, JöSpPHKn 23SpPHK

4.2.2. Подбор условий и оптимизация параметров реакции ам- 87 плификации

4.2.3. Определение аналитической чувствительности и специфич- 93 ности исследуемых олигонуклеотидных затравок

ГЛАВА V

ВЫЯВЛЕНИЕ БУРКХОЛЬДЕРИЙ В ОБЪЕКТАХ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ИНФЕКЦИИ МЕТОДОМ ПЦР

5.1. Эффективность амплификационных тест-систем при ис- 107 следовании объектов внешней среды, искусственно контаминиро-ванных возбудителями сапа и мелиоидоза

5.2. Выявление В. mallei и В. pseudomallei при эксперимен- 115 тальной инфекции

5.2.1. Детекция возбудителей сапа и мелиоидоза при острой фор- 116 ме инфекции

5.2.2. Обнаружение патогенных буркхольдерий при хронической 120 форме инфекции

5.2.3. Применение реакции амплификации для обнаружения 128 В. ^айапйежЬ у экспериментально заражённых животных

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ВНУТРИВИДОВОГО ТОНИРОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА

6.1. Молекулярно-биологические подходы, используемые для 131 внутривидовой дифференциации штаммов В. mallei и B.pseudomallei

6.2. Генотипирование штаммов патогенных буркхольдерий с 146 помощью секвенирования

6.2.1. Дифференциация штаммов В. mallei и В. pseudomallei на 146 основе секвенированных нуклеотидных последовательностей одиночных локусов

6.2.2. Мультилокусное сиквенс-типирование (МЛСТ) штаммов 157 возбудителей сапа и мелиоидоза

6.3. Изучение полиморфизма длины рестрикционных фраг- 170 ментов (ПДРФ) ДНК возбудителя сапа в формате пульс-электрофореза

6.4. ПЦР-типирование патогенных буркхольдерий

6.4.1. Внутривидовое типирование В. mallei и В. pseudomallei на 174 основе вариабельных ампликонов

6.4.2. Анализ генетического полиморфизма штаммов патогенных 180 буркхольдерий методом амплификации с произвольными праймерами

ГЛАВА VI

RAPD)

6.4.3. VNTR-анализ возбудителей сапа и мелиоидоза

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза"

Среди представителей рода Burkholderia особое место занимают Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei. Эти микроорганизмы относятся ко второй группе патогенности и вызывают заболевания сап и ме-лиоидоз, признаваемые как самостоятельные нозологические единицы [11]. В национальных системах классификации особо опасных бактериальных патогенов России, Великобритании, США и Канады возбудители ме-лиоидоза и сапа входят в ведущие группы по степени опасности для человека. В частности, по данным экспертов, В. pseudomallei и В. mallei являются потенциальными агентами биотерроризма [7, 111, 232, 305, 363].

Определенный потенциал опасности несут в себе интенсивно развивающиеся молекулярно-генетические технологии, которые, обеспечивая получение новых знаний о геномах возбудителей и проводимые с целью совершенствования средств диагностики, лечения и профилактики, одновременно могут выступать в качестве инструмента манипулирования с патогенами, способного повышать их болезнетворные свойства. Исследовательские работы с использованием патогенных биологических агентов создают реальную опасность внутрилабораторных заражений персонала, а также угрозу аварий на объектах, где проводятся работы с патогенными микроорганизмами [16, 136, 225, 325].

Сегодня в мире проблема сапа не стоит так остро, как ранее, что связано с уменьшением численности лошадей, являющихся основным резервуаром этой инфекции, однако сап по-прежнему наносит значительный экономический урон в крупных животноводческих хозяйствах, практикующих разведение и использование непарнокопытных животных [11, 43, 73].

В России последние вспышки сапа были зарегистрированы в период второй мировой войны. На территории СССР сап считался полностью ликвидированным. Однако в 1985 г. сотрудниками Волгоградского научноисследовательского противочумного института в г. Улан-Удэ Бурятской АССР возбудитель сапа был выделен от импортированной из Монголии лошади.

В настоящее время заболевание продолжают диагностировать в Турции, Иране, Объединенных Арабских Эмиратах, Афганистане, Индии, Китае, Монголии, на Филиппинах, а также в странах Африки и Латинской Америки [89, 92, 181, 267, 306]. Заболеваемость сапом среди людей носит, в основном, спорадический характер. В то же время, возбудитель сапа крайне опасен в лабораторных условиях. Это подтверждает трагический опыт большого количества исследователей сапа [11, 325].

Мелиоидоз впервые описан A. Whitmore и его ассистентом C.S. Krishnaswami как подобное сапу заболевание («glanders-like») в 1911 г. [365, 366]. В Тайланде и Австралии первые случаи мелиоидоза диагностированы в 1947 г. и 1950 г., соответственно [139]. В настоящее время в этих странах отмечаются самые высокие показатели заболеваемости и эти два региона являются «гиперэндемичными» по мелиоидозу.

Существует точка зрения, что серопозитивность населения Юго-Восточной Азии к мелиоидозу может быть связана с менее патогенным близкородственным микроорганизмом - В. thailandensis [32, 123, 364], широко распространенным в северных территориях Таиланда и отсутствующим в других регионах, в частности, в Австралии. Однако, несмотря на высокие показатели серопозитивности, в Таиланде смертность от мелиоидоза составляет около 50 %, а в Австралии лишь 20 % [364]. Связано ли это с предрасположенностью населения Таиланда к заболеванию или циркуляцией в этом регионе более вирулентных штаммов B.pseudomallei на сегодняшний день остается предметом дискуссий специалистов.

После того, как мелиоидоз был расценен в качестве патогена, являющегося угрозой для армейского персонала США, участвующего в военных действиях во Вьетнаме, этому заболеванию стали уделять более пристальное внимание [128, 190]. Так, за все предыдущее время до начала широкомасштабных работ по специальной программе в Таиланде было зарегистрировано всего несколько больных мелиоидозом, а при интенсивном обследовании только за один 1986 год выявлено более 800 бактериологически и серологически подтвержденных случаев заболевания [230].

Ранее считалось, что распространение мелиоидоза в природе имеет определенные географические границы: заболевание эндемично лишь для Австралии и стран Юго-Восточной Азии [38, 132, 301]. На сегодняшний день эта точка зрения изменилась. Мелиоидоз обнаружен далеко за пределами эндемичных территорий Азии и Австралии [123].

Спорадические случаи и очаги заболевания выявлены в странах Центральной и Южной Америки, Западной Африки и даже в Европе [115, 140, 141, 183, 199, 302]. Причем, в Сальвадоре и Чили возбудитель мелиоидоза признан как этиологический агент нозокомиальных и оппортунистических инфекций с неблагоприятным прогнозом [123].

Естественной средой обитания возбудителя мелиоидоза является почва и вода эндемичных регионов субтропиков. По этой причине большинство случаев, зарегистрированных за пределами эндемичных территорий, связано с пребыванием в Юго-Восточной Азии и Австралии туристов, имевшими прямой контакт с контаминированной B.pseudomallei пылью или водой [123, 135, 141, 209, 246, 250, 312]. Риск заражения мелиоидозом увеличивается в период природных катастроф. В частности, после цунами 26 декабря 2004 года при проведении ретроспективного анализа зарегистрировано как увеличение случаев мелиоидоза в южных районах Таиланда, так и повышение титра РНГА у пораженных цунами [85, 125].

К сожалению, малая осведомленность и отсутствие настороженности органов здравоохранения в отношении сапа и мелиоидоза приводит к тому, что плановых лабораторных исследований, направленных на выявление

В.mallei и B.pseudomallei или антител к этим патогенам у туристов и лиц, прибывающих из эндемичных территорий, у нас в стране не проводят.

Актуальность создания эффективных средств диагностики сапа и мелиоидоза определяется реальной угрозой их заноса на территорию России из эндемичных стран в связи со значительным ростом транспортных связей, возросшими грузо- и пассажиропотоками, расширением туристических поездок российских граждан в эндемичные регионы, привлечением иностранной рабочей силы и незаконной миграцией населения.

Появление возбудителей так же возможно за счёт завоза больных животных, учитывая, что В.mallei и B.pseudomallei являются микробами с достаточно широким спектром патогенности, а число видов животных, способных болеть сапом и мелиоидозом, гораздо шире, чем это предполагалось ранее.

Возбудитель мелиоидоза может быть завезен в Россию с почвой и водой при транспортировке экзотических животных и аквариумных рыбок, а также пищевых продуктов, контаминированных B.pseudomallei. Примером этого могут служить публикации об особенностях формирования вторичных очагов мелиоидоза во Франции, обусловленных завозом в зоопарк больной лошади Пржевальского [139]. Способность к длительной бессимптомной персистенции возбудителя в организме являются дополнительными причинами расширения ареала инфекции в результате миграции людей и животных с латентной формой заболевания [158, 220, 266, 299].

На сегодняшний день можно констатировать, что существующие методы обнаружения патогенных буркхольдерий оказываются недостаточно эффективными для экспресс-диагностики, а идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза по-прежнему является трудоемкой задачей. Традиционная лабораторная диагностика, направленная на выделение чистой культуры возбудителей с последующей ее идентификацией, позволяет дать положительный ответ лишь через 36-48 ч. Серологические методики дают более быстрые результаты, но обладают относительно низкой чувствительностью и недостаточной специфичностью из-за возможных перекрёстных реакций с гетерологичными видами микроорганизмов и антигенной вариабельности штаммов. Кроме того, диагностическая ценность иммунологических методов имеет ограничения при выявлении патогенных бурк-хольдерий на ранних стадиях инфекционного процесса.

На протяжении последнего десятилетия молекулярно-биологические технологии уверенно вошли в медицинскую практику и заняли прочные позиции в арсенале лабораторных диагностических методов исследования. В настоящее время за рубежом для детекции В.mallei и B.pseudomallei все более активно используют полимеразную цепную реакцию (ПЦР) [223, 306, 335, 337, 349]. Однако, как было отмечено в материалах пятого Всемирного конгресса по мелиоидозу, состоявшегося в 2007 г, выявление B.pseudomallei методом ПЦР в провинциальных госпиталях Таиланда не проводят. С одной стороны, это связано с отсутствием на сегодняшний день общепринятых коммерческих тест-систем, предназначенных для выявления видоспецифических последовательностей ДНК этих микроорганизмов. С другой стороны, заявляемая чувствительность предлагаемых амплификационных тест-систем не соответствует их реальной (диагностической) чувствительности [122].

Аналогичным образом выглядит ситуация с диагностическими наборами, предназначенными для выявления антител и антигенов. По этой причине в рутинной практике до сих пор используют лишь микроскопию и биохимические системы идентификации подобные API 20NE [123, 386]. Молекулярно-биологические методы обнаружения патогенных буркхоль-дерий включают в схему лабораторной диагностики в качестве подтверждающих тестов, как правило, при положительных находках в полуавтоматических системах идентификации [158, 197].

Принятые в России традиционные методы типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, основанные на культивировании микроорганизмов, изучении особенностей их метаболизма и антигенного строения, различной чувствительности к бактериофагам и антибиотикам [18, 28, 29, 30, 31, 36, 48], отличаются ресурсоемкостью и в большинстве случаев не позволяют выявить отличия между штаммами патогенных буркхольде-рий. Данные методы, основанные на изучении фенотипических свойств, имеют существенные недостатки, связанные с относительной однородностью фенотипических свойств штаммов этих видов микроорганизмов, что определяет трудности в их инфравидовой дифференциации. В связи с этим, на сегодняшний день ни один из фенотипических маркеров не обеспечивает необходимую эффективность при расшифровке вспышек сапа и мелиоидоза.

В последние годы среди используемых методов типирования главенствующее место стали занимать молекулярно-биологические подходы. Результаты генотипирования характеризуются большей достоверностью по сравнению с морфологическими, биохимическими или иммунологическими методами дифференциации микроорганизмов [12, 78, 329]. В настоящее время уже нельзя строить корректные таксономические заключения только на основе изучения одного фенотипа, необходимо их подтверждение данными геносистематики [12, 355]. Из этих теоретических выводов вытекают практические аспекты, отражающие комплексные подходы к идентификации и внутривидовой дифференциации микроорганизмов.

Методы генетического типирования - полиморфизм длин рестрик-ционных фрагментов, гель-электрофорез в пульсирующем электрическом поле, различные варианты полимеразной цепной реакции и мультилокус-ного сиквенс-типирования были адаптированы для дифференциации штаммов В. рвеис1ота1Ш, выделенных из внешней среды, от животных и человека [133, 177, 288, 339, 340], расшифровки вспышек мелиоидоза [134,

345] и оценки эффективности проводимой антибиотикотерапии [219, 353]. Следует отметить, что количество публикаций, в которых описаны методы типирования возбудителя сапа существенно меньше, чем его ближайшего «родственника» - возбудителя мелиоидоза [120, 181, 242, 350].

Из методов прямого сравнения последовательности нуклеотидов, позволяющих проводить идентификацию и дифференциацию штаммов микроорганизмов, особое место занимают методы, направленные на секвени-рование полного генома микроорганизмов.

Применение автоматических секвенаторов и методологии биочипов позволило вплотную подойти к экспрессному секвенированию полного генома микроорганизмов. Информация об их сиквенсах может быть использована для разработки быстрых и точных методов диагностики и дифференциации патогенов от их близкородственных непатогенных микроорганизмов [205, 227, 314]. Такой подход, основанный на сравнительной геномике, уже был апробирован на Зимней Олимпиаде 2002 г [227].

Изучение наиболее консервативных последовательностей позволяет устанавливать степень родства на уровне семейств, родов и видов, и как следствие — проводить идентификацию возбудителя инфекционного заболевания.

Проведение дифференциации близкородственных микроорганизмов и внутривидовое разграничение возможно при сопоставлении вариабельных последовательностей генома. Тщательный подбор ДНК-матриц по специфичности их нуклеотидных последовательностей открыло возможность конструирования тест-систем, основанных на молекулярной гибридизации с применением ДНК-зондов и амплификационных наборов для генодиагностики и генотипировании.

До проведения полного сиквенса геномов B.pseudomallei и В.mallei лишь небольшая часть генов была клонирована и изучена их структурно-функциональная организация. Проведенные исследования геномной организации возбудителей сапа и мелиоидоза на основе секвенирования полных геномов показали наличие у них двух хромосом с функциональным разделением генов между ними [186, 267]. Большие хромосомы кодируют функции, ответственные за основные стороны жизнеобеспечения и роста клеток, в то время как меньшие - несут вспомогательную нагрузку, заключающуюся в обеспечении адаптационных свойств микроорганизмов в части выживаемости в различных условиях окружающей среды. Первые аннотированные сиквенсы геномов возбудителя сапа (В. mallei АТСС 23344) и возбудителя мелиоидоза (В. pseudomallei К96243) представлены на вебсерверах (http://www.tigr.org/) и (http://www.sanger.ac.uk/). На сегодняшний день эти базы данных содержат информацию об аннотированных геномов уже 4 штаммов В. mallei и 4 штаммов В. pseudomallei.

Анализ геномных последовательностей буркхольдерий выявил множество гомологичных участков у В.pseudomallei и В. mallei, отсутствующих у близкородственного вида B.thailandensis [186, 267]. С помощью методологии секвенирования и технологии ДНК-биочипов идентифицировано большое количество открытых рамок считывания (ORF), которые делети-рованы (дефектны) у В.mallei и B.thailandensis в сравнении с В pseudomallei. Как для В. mallei, так и для B.thailandensis выявлена преимущественная локализация таких генов на малой хромосоме. Как правило, они связаны с различными метаболическими и клеточными функциями, определяющими межвидовые различия [215, 275]. Причем, у возбудителя сапа отмечена высокая тенденция к потере более протяженных фрагментов хромосом. Делеции затрагивают некоторые гены III типа секреции, сериновой металлопротеазы, кластеров, детерминирующих гликопротеи-новую капсулу, а также продукцию и секрецию токсинов.

Проведенное сравнительное исследование вирулентных и авиру-лентных культур при пассажах на животных позволило определить набор генов, потенциально имеющих отношение к вирулентности, что открывает новые перспективы в изучении и понимании генетических механизмов реализации патогенности возбудителей мелиоидоза и сапа [303]. Высказано предположение, что уменьшение размера геномов B.thailandensis и В.mallei в сравнении с B.pseudomallei играет важную роль в эволюции этих видов микроорганизмов. Данные три вида отличаются экологическими нишами, но мало что известно о молекулярных основах этих различий.

Информация, полученная при секвенировании геномов патогенных буркхольдерий, может быть использована для разработки быстрых и точных методов диагностики и дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза от близкородственных микроорганизмов, а также для внутривидового типирования этих патогенов. Так, использование технологии биологических чипов при анализе полного генома различных штаммов возбудителя мелиоидоза позволило определить 3 молекулярных субтипа B.pseudomallei из 18 исследованных штаммов. В результате сравнения этих типов между собой выявлены генетические локусы, на основе которых возможно проведение внутривидового типирования возбудителя [275].

Расшифровка и сопоставление полногеномных последовательностей различных штаммов В. pseudomallei и В. mallei позволяет определять ДНК-маркеры (ДНК-стандарты) с которыми можно проводить сравнение остальных штаммов и изолятов с тем, чтобы делать выводы о присутствующих или отсутствующих в них последовательностях, по сравнению со стандартами. Однако на сегодняшний день такая информация имеется лишь для нескольких штаммов из большого разнообразия диких штаммов и поиск вариабельных ДНК-маркеров для внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий проводится эмпирически.

В настоящее время основополагающий подход к детекции и анализу возбудителей инфекций состоит в последовательном применении методов и средств диагностики, в комплексе представляющих собой единую систему, включающую специфическую индикацию, идентификацию патогена и типирование выявленного микроорганизма.

Для многих видов микроорганизмов, в том числе возбудителей особо опасных инфекций, разработаны необходимые алгоритмы идентификации и дифференциации штаммов, основанные на фенотипических и генотипи-ческих признаках. Многообразие клинических форм и отсутствие патог-номоничных симптомов сапа и мелиоидоза практически исключают возможность постановки диагноза только на основании клинической картины, в связи с этим возрастает роль лабораторных методов в верификации диагноза.

Алгоритм проведения диагностических, лечебных и противоэпидемических мероприятий в отношении сапа и мелиоидоза описан во многих руководствах. Обобщая литературные данные можно сделать вывод, что поиски оптимальной схемы быстрого генотипирования штаммов патогенных буркхольдерий продолжаются вплоть до настоящего времени. По крайней мере, на сегодняшний день отсутствует общепринятый подход и генетические маркеры для ускоренного выявления внутривидовых различий В. pseudomallei и В. mallei.

На основании вышеизложенного, очевидна актуальность научных исследований, направленных на изучение консервативных и вариабельных последовательностей патогенных буркхольдерий с целью создания высокоэффективных генетических систем идентификации, отвечающих современным требованиям к чувствительности и специфичности диагностических тест-систем, а также разработки генотипических методов внутривидовой дифференциации штаммов В.mallei и В.pseudomallei.

Цель работы заключалась в совершенствовании схем генодиагностики и генотипирования возбудителей сапа и мелиоидоза с применением методов молекулярной биологии.

Задачи исследования:

1. Провести анализ нуклеотидных последовательностей, представленных в различных генетических базах данных, с целью подбора перспективных ДНК-мишеней для генной диагностики и генетической дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза в различных вариантах ПНР-анализа, моно- и мультилокусного сиквенс-типирования.

2. Сконструировать амплификационные тест-системы для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР, подобрать условия проведения реакции, оценить чувствительность и специфичность генодиагностических систем на широком наборе гомологичных и гете-рологичных штаммов микроорганизмов.

3. Оптимизировать условия подготовки проб для исследования экспериментального биологического материала при различных клини- < ческих формах сапа и мелиоидоза и проб из объектов внешней среды, контаминированных В. mallei и В. pseudomallei.

4. Оценить эффективность ДНК-зондов на основе хромосомной ДНК патогенных буркхольдерий и криптических плазмид возбудителя мелиоидоза для идентификации В. mallei и В. pseudomallei и исследования атипичных штаммов патогенных буркхольдерий методом ДНК-ДНК гибридизации.

5. С помощью молекулярно-генетических методов изучить вариабельность геномов типичных и атипичных штаммов В. mallei и В. pseudomallei при различных условиях культивирования in vitro и экспериментальной инфекции и выбрать наиболее эффективные методы генетического типирования штаммов патогенных буркхольдерий.

6. Провести сравнительный анализ эффективности фенотипиче-ских и молекулярно-биологических методов идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов В. mallei и В. pseudomallei и определить оптимальный алгоритм генодиагностики и генотипирования патогенных буркхольдерий.

Научная новизна:

В представленной работе впервые проведено комплексное исследование вариабельных фенотипических признаков и генотипических свойств возбудителей сапа и мелиоидоза с применением широкого спектра методов структурной геномики, позволившее решить ряд прикладных задач, направленных на совершенствование схем идентификации и генетического типирования патогенных буркхольдерий.

Получены приоритетные данные об использовании нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих 23S рРНК, флагеллярного гена и orf гена III типа секреции для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза и на основе этих генов впервые сконструированы отечественные высокочувствительные и специфичные амплификационные тест-системы для генодиагностики В.pseudomallei и В.mallei.

Впервые показана возможность использования ПЦР в качестве дополнительного метода идентификации при различных формах сапа и мелиоидоза, вызванных типичными и атипичными штаммами В. pseudomallei и В. mallei.

Впервые предложены группоспецифические олигонуклеотидные затравки burtsl/burta2 для выявления триады буркхольдерий - В.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis, используемые в сочетании с методом ДНК-ДНК гибридизации и амплификации с произвольными праймерами для оценки генетического полиморфизма штаммов B.thailandensis. Штамм B.thailandensis КМ-161 рекомендован в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учебных занятий по идентификации ООИ методом ПЦР (патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам «Штамм бактерий Burkholderia thailandensis KM 161 -авирулентный имитатор возбудителя мелиоидоза» Российского агентства по патентам и товарным знакам N 2257413.от 27.07.2005 г.).

Представлены доказательства того, что алгоритмом ускоренной идентификации В. mallei и В. pseudomallei является сочетание реакции амплификации и последующего секвенирования фрагментов генов 16SpPHK, 23S рРНК, orfl3 и fliC без проведения этапа культивирования микроорганизмов. Применение двух различных геномных локусов для амплификации ДНК патогенных буркхольдерий повышает достоверность ПЦР-диагностики и обеспечивает быструю идентификацию B.mallei и В.pseudomallei.

Показано, что разработанный метод выделения ДНК из объектов окружающей среды (почва, вода), искусственно контаминированных микро-мицетами (патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам №2295569 от 12. 07. 2005г.), эффективен для экстракции и очистки ДНК патогенных буркхольдерий.

Предложен способ внутривидового типирования штаммов возбудителя мелиоидоза на основе плазмидного анализа. Приоритетность исследований подтверждена патентом на изобретение «Способ выделения плазмид Burkholderia pseudomallei» Российского агентства по патентам и товарным знакам № 2218401 от 10.12.2003 г.

Оптимизированы условия проведения рестрикционного анализа ДНК возбудителя сапа и впервые оценена генетическая гетерогенность коллекционных штаммов B.mallei методом пульс-электрофореза.

Впервые проведен анализ изолятов возбудителя сапа на основе реакции амплификации с произвольными праймерами и показана высокая эффективность ПЦР-типирования штаммов В.mallei. Для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий с использованием полимеразной цепной реакции предложен оригинальный набор олигонуклеотидных затравок.

Определена вариабельность нуклеотидных последовательностей и тандемных повторов коллекционных штаммов возбудителей сапа и мелио-идоза, на основе которых возможно проведение ускоренного генетического типирования штаммов B.pseudomallei и В.mallei.

С помощью мультилокусного сиквенс-типирования и сравнительного анализа секвенированных последовательностей вариабельных участков генов «домашнего хозяйства» впервые установлено, что штаммы коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института B.pseudomallei 100, С-141, а также B.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, относятся к Юго-Восточной группе.

Проведенные исследования впервые позволили сформировать единую систему генодиагностики и генотипирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. Схема лабораторной диагностики и идентификации патогенных буркхольдерий дополнена методом ПЦР с разработанными ам-плификационными тест-системами и впервые предложена схема быстрого внутривидового генетического типирования штаммов В.mallei и B.pseudomallei.

Разработанные методические подходы легли в основу исследований, поддержанных грантами РФФИ 04-04-96503, 07-04-01568 и 07-04-08665.

Практическая ценность:

Разработанные амплификационные тест-системы в настоящее время используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ и могут быть рекомендованы для специализированных лабораторий для идентификации патогенных буркхольдерий и экспресс-диагностики сапа и мелиоидоза. С этой целью оформлены методические рекомендации «Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза методом полимеразной цепной реакции», утвержденные директором института Н.Г. Тихоновым 29 мая 2002 г. и методические рекомендации «Использование двух пар праймеров для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР» (утверждены директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 10 февраля 2005 г.).

Материалы диссертационной работы использованы при оформлении пакета первичной документации: «Инструкция по изготовлению и контролю амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei» и «Инструкция по применению амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei», утверждённой директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 10 февраля 2005 г.

Методики плазмидного анализа, выделения и мобилизации внехро-мосомных репликонов В.pseudomallei, включенные в методические рекомендации «Применение мобилизации для передачи криптических плазмид B.pseudomallei в гетерологичные виды», утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ Н.Г.Тихоновым 20 апреля 1998 г. и методические рекомендации «Способ получения штамма кишечной палочки, продуцирующего белок 30 kDa, опосредованный мелиоидозной плазмидой рСМ2» (утверждены директором Волгоградского НИПЧИ Н.Г.Тихоновым. 2 марта 2000 г.) используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ в различных разделах работ при изучении патогенных буркхольдерий.

Используемый метод ДНК-гибридизации включен в схему идентификации патогенных буркхольдерий, представленную в практическом руководстве «Мелиоидоз. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998). В государственной коллекции патогенных бактерий Всесоюзного НИПЧИ «Микроб» депонированы штаммы Е.соН КМ 163, 164, 165, 166, несущие в составе своего генома, фрагменты плазмиды рСМ2 возбудителя мелиоидоза, которые рекомендованы в качестве группоспецифических ДНК - зондов для идентификации патогенных буркхольдерий.

Результаты сравнительного анализа фенотипических и генотипиче-ских методов дифференциации типичных и атипичных штаммов патогенных буркхольдерий легли в основу методических рекомендаций «Постановка диагностических тестов для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза (индивидуальная карта штамма)», ут-вежденных директором Волгоградского НИПЧИ В.В.Алексеевым 25 июня 2003 г.

По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Молекулярно-биологические подходы к идентификации и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза», утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ В.В. Алексеевым 06 марта 2006 г.

Предлагаемые схемы ПЦР-типирования с набором произвольных праймеров и олигонуклеотидных затравок для детекции вариабельных ам-пликонов, а также методы мультилокусного сиквенс-типирования и пульс-электрофореза используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ для сравнительного анализа музейных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и их изогенных мутантов с измененной вирулентностью и чувствительностью к антибиотикам.

Материалы диссертационной работы используются сотрудниками института в рамках учебных программ по первичной специализации и пе-репоготовке специалистов - Программы курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской

Федерации Г.Г.Онищенко 01.02.2001 г., Программы курсов повышения квалификации врачей — бактериологов общей медицинской сети, центров Госсанэпиднадзора и противочумных учреждений по специфической индикации и лабораторной диагностике особо опасных инфекций, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения, утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 28.09.1999 г., а также Программы курсов повышения квалификации медицинских работников (с высшим и средним специальным образованием) санитарно-карантинных пунктов и отделов (СКП и СКО), утвержденной Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко. Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов III-VI курсов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту

1. Амплификационные тест-системы, сконструированные для выявления возбудителей сапа и мелиоидоза, обеспечивают специфическую детекцию фрагментов генов 23S рРНК, флагеллярного гена ifliC) и orf гена III типа секреции патогенных буркхольдерий при исследовании методом ПЦР чистых культур и проб из объектов внешней среды, кон-таминированных В. mallei и B.pseudomallei, а также при генодиагностике различных форм экспериментального сапа и мелиоидоза, вызванных типичными и атипичными штаммами возбудителей.

2. Использование двух ДНК мишеней - участков 23S рРНК и fliC или orflS повышает достоверность ПЦР-диагностики и обеспечивает быструю идентификацию В.mallei и B.pseudomallei.

3. Группоспецифические олигонуклеотидные затравки burtsl/burta2 эффективны для амплификации специфических фрагментов флагелляр-ного гена fliC триады буркхольдерий - B.pseudomallei, В.mallei и B.thailandensis при анализе чистых культур и проб биологического материала от экспериментально заражённых животных.

4. Методы пульс-электрофореза и мультилокусного сиквенс-типирования эффективны для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от штаммов В. mallei, для которых применим рестрикционный анализ ДНК в формате пульс-электрофореза. При мультилокусном сиквенс-типировании штаммы возбудителя сапа объединяются в единый сиквенс-тип, входящий в клональный комплекс штаммов В. psendomallei и их дифференциация невозможна.

5. Быстрое генетическое типирование штаммов возбудителя мелиоидоза обеспечивают методы амплификации полиморфной ДНК с произвольными праймерами, VNTR-анализ, Rep-ПЦР и схема типирования на основе вариабельных ампликонов (VAT), а ускоренная оценка генетической гетерогенности штаммов возбудителя сапа возможна лишь с помощью VNTR-анализа и амплификации с произвольными праймерами.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002), IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), IV межгосударственной научно — практической конференции Государств стран СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СЕТ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств»» (Оболенск, 2006), XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), 65-й юбилейной научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007), V международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.

По теме диссертации опубликовано 83 научные работы. Материалы исследований использованы при написании трех монографий - «Мелиои-доз», под ред. Н.Г. Тихонова, Волгоград, 1995, «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму», Волгоград, 2004 и «Специфическая индикация патогенных биологических агентов. Практическое руководство», под ред. академика РАМН, Г.Г.Онищенко.- М: ЗАО «МП Гигиена».- 2006.

Апробация диссертации состоялась на межлабораторной конференции ВолгоградНИПЧИ 8 февраля 2008 г.

Структура и объем работы

Диссертация изложена в форме монографии на 268 листах машинописного текста, состоит из введения и 6 глав, включающих описание литературных данных и результаты собственных исследований, заключения и выводов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 61 рисунком. Список цитируемой литературы включает 386 источников, в том числе 82 отечественных и 304 иностранных работ.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Антонов, Валерий Алексеевич

ВЫВОДЫ

Оценена сравнительная эффективность молекулярно-биологических методов идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов В. mallei и В. pseudomallei. Предложена схема лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза с включением ПЦР как на этапе идентификации чистых культур, так и анализа проб клинического материала и объектов внешней среды. Сформирована единая система генодиагностики и генотипирования патогенных буркхольдерий.

На основе нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих 23S рРНК, флагеллярного гена fliC и orf гена III типа секреции, выбраны олигонуклеотидные праймеры, подобраны оптимальные условия, определены параметры проведения ПЦР и сконструированы амплификационные тест-системы для идентификации патогенных буркхольдерий, позволяющие выявлять возбудителей сапа и мелиоил о доза в концентрациях 1x10 -1x10 м.к./мл.

Показано, что использование олигонуклеотидных праймеров burtsl/burta2, сконструированных на основе флагеллярного гена fliC, позволяет идентифицировать три вида буркхольдерий В.pseudomallei, В.mallei и B.thailandensis при анализе чистых культур и обнаруживать B.thailandensis в пробах экспериментального клинического материала при моделировании инфекционного процесса.

Для повышения специфичности идентификационных тестов необходимо использовать ПЦР с диагностическими праймерами, сконструированными на различные ДНК-мишени. Показано, что сочетание реакции амплификации и секвенирование ДНК мишеней - участков 16S рРНК и 23S рРНК, ог/13 или fliC является алгоритмом быстрой идентификации В. mallei и В. pseudomallei и их дифференциации от близкородственных видов микроорганизмов.

5. Установлено, что эффективными фенотипическими методами дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза являются фаготипирова-ние и анализ белкового спектров, в то время как проведение внутривидового типирования штаммов В.mallei возможно на основе различий в спектре суммарных клеточных белков. Тесты, основанные на выявлении вариабельных биохимических признаков и различий в чувствительности к антибиотикам выступают лишь в качестве дополнительных критериев внутривидовой дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий.

6. На основе плазмидного анализа выявлено 4 группы штаммов В.pseudomallei, отличающихся по составу и размеру плазмидных реп-ликонов. Показано, что обнаруженные плазмиды могут выступать в качестве дополнительного критерия генотипической дифференциации штаммов и являться эпидемиологическим маркером в случае возникновении инфекционного процесса, вызванного плазмидсодержащим штаммом В.pseudomallei.

7. Показана высокая эффективность метода мультилокусного сиквенс-типирования для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, позволившего установить, что анализируемые штаммы В.pseudomallei 100, С-141, а также В.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, относятся к Юго-Восточной группе. Все исследуемые штаммы В. mallei формируют единый 40' сиквенс-тип, входящий в клональ-ный комплекс штаммов В. pseudomallei.

8. Отработаны условия проведения рестрикционного анализа ДНК штаммов возбудителя сапа, оценена их генетическая гетерогенность и показана высокая эффективность метода пульс-электрофореза для внутривидового генетического типирования штаммов В.mallei. На основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 14 штаммов возбудителя сапа с помошью кластерного анализа разделены на 13 генетических групп.

9. Показана высокая эффективность RAPD-типирования для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий. Предложен набор олиго-нуклеотидных затравок, обозначенных Jeffreys, PR 6, PR 7 и RA для проведения внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа и праймеров PR 7, PR 16, PR 13, и RA - для возбудителя мелиоидоза.

10. Выявлена эффективность схемы типирования, основанной на анализе вариабельных ампликонов, для ускоренной генетической дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от штаммов В. mallei, в геномах которых вариабельные ампликоны не выявлены. С помощью ПЦР-типирования 18 штаммов возбудителя мелиоидоза разделены на 13 генетических группп (VAT типов).

11. Установлена пригодность праймеров, фланкирующих тандемные повторы в гене, детерминирующем эстеразу патогенных буркхольдерий, для простого, быстрого и высокоспецифичного ПЦР-типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. С помощью VNTR анализа среди 11 штаммов В.mallei идентифицировано 8 аллелей с различным числом тандемных повторов, в то время как шесть штаммов B.pseudomallei разделены на 5 аллелей.

12. Показано, что алгоритм быстрой дифференциации штаммов B.pseudomallei включает методы ПЦР-типирования, основанные на анализе вариабельных ампликонов и количества тандемных повторов, амплификации ДНК с произвольными праймерами и Rep-ПЦР, в то время как быстрое генетическое типирование штаммов В.mallei обеспечивают VNTR-анализ и амплификация с произвольными праймерами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Бурное развитие молекулярно-генетических технологий и достижения современной фундаментальной науки внесли значительный вклад в совершенствование средств диагностики, профилактики и лечения инфекционных болезней. Изучение геномов возбудителей особо опасных инфекций, включая секвенирование нуклеотидных последовательностей, привело к созданию и широкому внедрению новых методических подходов, направленных на идентификацию и типирование патогенов.

Для изучения генетических особенностей возбудителей инфекций применяются практически все методы молекулярной диагностики и внутривидовой дифференциации штаммов микроорганизмов, разработанные в мировой практике. Тем не менее, вопросы выбора оптимального алгоритма генодиагностики и генотипирования штаммов различных бактерий сохраняют свою актуальность'до сих пор.

Недостаточная защищенность человека от целого ряда природных инфекционных болезней усиливается угрозой возможного преднамеренного использования биологических агентов в целях терроризма. В этом случае, определяющее значение имеет скорость не только установления диагноза, но и расшифровки вспышки инфекции, а следовательно, и используемых методов для ускоренной идентификации и типирования патогенов.

Несмотря на то, что сап и мелиоидоз имеют определенное географическое распространение в мире, интерес к этим инфекциям обусловлен возможностью их завоза на территорию практически любых стран мира. Высокая природная резистентность к широкому спектру антимикробных соединений, а также воздействию защитных факторов иммунной системы макроорганизма определяют способность патогенных буркхольдерий к длительному, и зачастую бессимптомному, персистированию в инфицированном организме.

Учитывая отсутствие патогномоничных симптомов для сапа и ме-лиоидоза главенствующее место в их диагностике занимают лабораторные методы, направленные на выявление возбудителей или их маркеров.

На сегодняшний день идентификация возбудителей сапа и мелиои-доза, в основном, проводится на основании фенотипических признаков. После выделения чистых культур проводят идентификацию с помощью стандартных методических приемов [26, 28, 43, 52] или полуавтоматических систем идентификации подобно API 20 NE, рекомендуемой для анализа выделенных культур [123, 386]. В первых работах по использованию, полуавтоматических систем [138, 244, 334] отмечена их высокая (до 100%) эффективность идентификации возбудителя мелиоидоза. В действительности, и в большей части в отношении В.mallei, это оказалось далеко не так.

Уместно напомнить, что при диагностике сапа и мелиоидоза отмечен достаточно высокий процент лабораторных ошибок идентификации возбудителей в эндемичных, а в большей степени неэндемичных регионах, в которые были завезены эти инфекции [197, 198]. При использовании коммерческих наборов, примененных для биохимической идентификации патогенных буркхольдерий, отмечались как ложноотрицательные, так и лож-ноположительные результаты, обусловленными перекрестными реакциями с непатогенными бактериальными видами за счет идентичного биохимического профиля [171, 193]

Мы решили выяснить возможные преимущества и недостатки систем идентификации API 20 NE «BioMerieux» (Франция) и Nefermtest 24 «Lachema» (Чехия) перед стандартными лабораторными тестами определения видовой принадлежности В.mallei и B.pseudomallei.

При использовании в нашей работе культур возбудителя мелиоидоза на основании «Указателя для анализа данных» получены идентификационные коды 1156577 и 1556577 (API 20 NE), что соответствует литературным данным [244]. В тоже время, по протоколам этой системы возбудитель сапа идентифицировать не удалось. В системе Nefermtest 24 отмечен более высокий процент ошибок идентификации штаммов, что послужило поводом для отказа от ее использования при анализе штаммов патогенных буркхольдерий.

При идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза требуется соблюдения особых условий проведения работ с исследуемыми культурами [60], а по сути, ни одна из рекомендуемых полуавтоматических систем не соответствует таким требованиям ввиду возможной аэрозолизации микробной взвеси при исследовании. Одним из доказательств служит случай выделения B.pseudomallei в клинической лаборатории Лос-Анджелеса (США), после которого все сотрудники прошли серологические тесты и им назначена в качестве профилактики антибиотикотерапия [225].

Лабораторная диагностика включает не только этап идентификации возбудителей, но и определение индивидуальных особенностей штаммов, что имеет значение при определении степени сходства бактериальных культур, установлении источника инфекции при эпидемиологическом ан-нализе и расшифровке различных вспышек инфекционных заболеваний.

Из всех анализируемых нами фенотипических тестов для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий лишь фаготипирование и анализ белкового спектра могут быть рекомендованы для внутривидового типирования штаммов возбудителя мелиоидоза. Для штаммов возбудителя сапа эффективным методом дифференциации, основанным на анализе фенотипических свойств, является сравнительный электрофоретический анализ общеклеточных белков. Этот методический прием рекомендован в качестве стандарта в полифазной таксономии для анализа непатогенных буркхольдерий [355].

В обсуждении полученных результатов мы считаем необходимым остановиться на особенностях генетической организации В. pseudomallei и В. mallei, определяющих различия в тактике применения диагностических и дифференцирующих генетических тест-систем. В этом контексте заслуживают внимания работы, связанные с секвенированием полного генома возбудителей [186, 267]. В первую очередь это касается наличия двух хромосом как у B.pseudomallei, так и В.mallei. Наличие нескольких хромосом не является исключением только для патогенных буркхольдерий. Две хромосомы выявлены у B.thailandensis, а также бактерий комплекса В.cepacia. Причем у B.cenocepacia обнаружено три хросомомы, а у В. vietnamiensis -четыре [368].

До проведения полного сиквенса геномов лишь у небольшой части клонированных последовательностей возбудителей сапа и мелиоидоза была изучена их структурно-функциональная организация. Эти данные не позволяли сделать адекватные выводы о различиях или идентичности генов и их роли в биологии буркхольдерий. При проведении сравнительной и функциональной геномики на основе аннотированных последовательностей буркхольдерий получены более полновесные данные. Так, в отличие от B.pseudomallei, в генах как В.mallei, так и B.thailandensis выявлены различные нарушения рамок считывания с преимущественной локализацией таких ORF на 2-ой хромосоме. Дефекты обусловлены наличием коротких повторов (SSR), IS-элементов, фрагментов ДНК фагов, интеграз и транспо-зонов. Например, у В.mallei выявлен 171 IS — элемент, в то время как у B.pseudomallei лишь 48. Именно наличием таких последовательностей, изменяющих экспрессию генов, детерминирующих метаболические и клеточные функции, и объясняют имеющиеся фенотипические отличия этих двух микроорганизмов [186, 215, 267, 275]. Различия в геномной организации выявлены и внутри видов патогенных буркхольдерий. Так, размер генома B.pseudomallei К96243 составил 8274 МЬр, в то время, как B.pseudomallei 1710b - 8207 МЬр. Вероятно, этим и определяются выявленные нами отличия фенотипических свойств, используемых для анализа и внутривидовой дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидо-за.

Настоящая работа была предпринята для выбора оптимальных ДНК-мишеней с целью последующего создания на их основе систем для генодиагностики и внутривидового типирования патогенных буркхольдерий.

На сегодняшний день уже не принято обсуждать достоинства реакции амплификации в диагностике инфекционных заболеваний. Высокая чувствительность и специфичность самого метода ПЦР, позволяющего обнаруживать микроб независимо от этапа культивирования, по праву завоевали для него лидирующее положение.

Однако вопросы выбора ДНК-мишеней и специфичных олигонукле-отидных праймеров, являющихся основной компонентой амплификацион-ных тест-систем, сохраняют актуальность для многих патогенов, в том числе и возбудителей сапа и мелиоидоза.

При конструировании диагностических тест-систем необходим адекватный подбор близкородственных микроорганизмов, с которыми необходимо проводить дифференциацию патогенных буркхольдерий. Такой набор позволяет объективно оценивать диагностические возможности вновь создаваемых амплификационных тест-систем.

На первом этапе работы проведены исследования, направленные на уточнение видовой принадлежности атипичных штаммов патогенных буркхольдерий, а также культур, числящихся по паспортным данным в коллекционном центре Волгоградского научно-исследовательском противочумном институте как штаммы В.cepacia и B.pseudomallei-like spp.

В результате определен набор культур, состоящий из 18 штаммов микроорганизмов, относящихся к бактериям комплекса В. cepacia. Нами выявлено, что в коллекции ВолгоградНИПЧИ имеются штаммы В.cepacia принадлежащие к I (В. cepacia), II (В. multivorans), III {В. cenocepacia) и IV (В. stabilis) геномоварам.

Один мелиоидозный штамм (Vang), а также два сапных штамма (Олоф и Конный) в реакции ДНК-ДНК гибридизации не давали положительных сигналов радиоавтографа, что ставило под сомнение их видовую принадлежность [25}. При использовании биохимической системы идентификации Nefermtest 24 «Lachema» (Чехия) штаммы Олоф и Конный были отнесены к виду Alcaligenes [61]. Полученные данные подтвердили результаты, на основе которых эти два сапных штамма было решено исключить из рода Burkholderia. При проверке таксономических признаков атипичного невирулентного штамма B.pseudomallei Vang показана его принадлежность к виду В.cepacia (геномовар I).

На этом этапе исследований дополнительно изучены биологические свойства выделяемых в эндемичных по мелиоидозу регионах штаммов B.thailandensis и мелиоидозоподобных почвенных микроорганизмов и показано, что данные штаммы являются генетически и иммунологически родственными с патогенными буркхольдериями.

Вся эта коллекций штаммов была использована в последующей работе в качестве гетерологичных бактерий при оценке специфичности сконструированных амплификационных тест-систем, предназначенных для обнаружения В .mallei и B.pseudomallei.

В первых работах по использованию ПЦР для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза обсуждались вопросы о различных генетических локусах, потенциально способных выступать в качестве диагностических ДНК-мишеней. Отсутствие знаний о факторах патогенности В.mallei и B.pseudomallei предопределило разработку специфичных праймеров на основе высококонсервативных нуклеотидных последовательностей. Приоритет разработки амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза принадлежит A.E.Lew и P.M.Desmarchelier [235], сконструировавших специфичные олигонуклео-тидные праймеры на основе гена, кодирующего синтез 23 S рРНК. В последующих работах в качестве хромосомных маркеров использовали ген, детерминирующий 168 рРНК [109, 142, 374] и спейсерную область между этими генами [222]. В то же время, наряду с достоинством консервативности рибосомальных генов отмечена вероятность получения ложноположи-тельных результатов при использовании этих ДНК-мишеней, в первую очередь при исследовании материала из объектов внешней среды. По этой причине многие авторы для идентификации возбудителей сапа и мелиои-доза рекомендовали двухстадийную ПЦР [179, 222, 234], рестрикцию ам-пликонов [322], различные видоспецифические последовательности [10, 33, 265, 308, 318], а также БЫР-маркеры [98, 349, 362].

К настоящему времени накоплен большой опыт, свидетельствующий о том, что применение какой либо одной пары праймеров при исследовании клинического материала не обеспечивает достаточной эффективности анализа. В связи с этим, авторы рекомендуют использовать несколько пар праймеров [223, 322].

Развитие ПЦР технологии для идентификации и дифференциации патогенных буркхольдерий от ВЛкаИапс1ет18 базировалось на генетических отличиях этих трех видов бактерий [106, 186, 274]. С этой целью также были апробированы различные праймеры [143, 179, 333, 362]. Однако ни в одном из цитируемых источников не обнаружено данных, касающихся целенаправленной разработки праймеров для выявления этой триады буркхольдерий.

Для конструирования амплификационных тест-систем с целью генодиагностики сапа и мелиоидоза проведен анализа последовательностей различных генетических баз данных (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), (http://www.ebi.ac.uk/), (http://www.tigr.org/), (http://www.sanger.ac.uk/) и сконструировано семь пар праймеров на основе фрагментов гена 235 рРНК, две пары олигонуклеотидных затравок, фланкирующих участки флагеллярного гена (/НС)), и одна пара праймеров, являющихся участком гена orfl3 системы Ill-типа секреции (TTSJ). Причем одна пара олигонук-леотидных затравок была выбрана для детекции трех близкородственных буркхольдерий - B.thailandensis, В. pseudomallei и В.mallei. Кроме этого, проведен анализ ранее опубликованных ДНК-мишеней генов 16S и 23S РНК [98, 223].

Для каждой пары праймеров подобраны оптимальные условия ПЦР, определен уровень чувствительности и специфичности экспериментальных тест-систем как при работе с чистыми культурами гомологичных и ге-терологичных микроорганизмов, так и с пробами из объектов окружающей среды, контаминированных патогенными буркхольдериями.

Из 12 анализируемых олигонуклеотидных затравок лишь три выбраны для конструирования амплификационных тест-систем: bflls/bfl2a (fliC), BTTS-sl/BTTS-as3 (TTS1) и b23s7/b23a8 (23S РНК). С помощью данных праймеров синтезировались специфические фрагменты ДНК размером 376 п.н., 162 п.н. и 266 п.н., соответственно, при анализе лизатов клеток В.mallei и В.pseudomallei в отличие от гетерологичных микроорганизмов, в том числе B.thailandensis и В.cepacia. Чувствительность реакции составила 102-103 м.к./мл. При анализе проб из объектов внешней среды (вода, почва, продукты питания), искусственно контаминированных В.mallei и В.pseudomallei с различной концентрацией клеток чувствительность реакции составила 103-104 м.к./мл.

Группоспецифические олигонуклеотидные затравки burtsl/burta2 (fliC), сконструированные для идентификации трех видов микроорганизмов - В.pseudomallei, В.mallei и B.thailandensis обеспечивали специфическую амплификацию фрагментов ДНК размером 242 п.н. и обнаружение

2 3 микроорганизмов с чувствительностью 1x10 -1x10 м.к./мл.

На основе этих четырех пар олигонуклеотидных затравок сконструированы четыре монолокусные амплификационные тест-системы с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза.

От всех других пар праймеров пришлось отказаться. В отдельных случаях это определялось их относительно низкой чувствительностью по отношению к выбранным четырем парам праймеров, но, прежде всего, ввиду наличия ложноположительных результатов, обусловленных гомологией праймеров с ДНК гетерологичных микроорганизмов.

Необходимо отметить некоторые особенности, обнаруженные в процессе определения специфичности «отбракованных» праймеров. Все они показали свою пригодность при компьютерном анализе, но в условиях эксперимента ложноположительные реакции были отмечены при исследовании гетерологичного микроорганизма — В. cepacia. При секвенировании фрагментов, включающих места посадки праймеров, как и ожидалось, выявлено несколько нуклеотидных замен, которые послужили основой для формирования ложных результатов ПЦР.

Подобный тип неспецифических реакций, идущих в несоответствие с компьютерным анализом, случается при создании любых амплификаци-онных тест-систем. В связи с чем, исследования «in silico» целесообразно рассматривать как весомые, но ориентировочные данные, и для пригодности выбранных праймеров всегда необходимы исследования с широким набором как гомологичных, так и гетерологичных видов микроорганизмов. С другой стороны, дополнительную значимость в отношении специфичности разрабатываемых амплификационных тест-систем несут исследования нестерильных, причем, качественно различных образцов объектов внешней среды, что и было сделано в проводимой работе.

Наряду с этим, сконструированные тест-системы прошли апробацию в качестве диагностических средств при моделировании инфекционного процесса, вызванного заражением лабораторных животных как патогенными буркхольдериями, так и B.thailandensis. Все праймеры показали свою пригодность и высокую эффективность при диагностике различных форм инфекций, что явилось основанием для включения ПЦР в схему лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза.

В конечном итоге'для повышения уровня специфичности ПЦР при идентификации В. pseudomallei и В. mallei предложены две ДНК-мишени — участки 16S рРНК, 23S рРНК и orfl3 или fliC. С этой целью мы рекомендуем дополнительно проводить секвенирование ампликонов. Проведение идентификации на основе культурально-морфологических и биохимических признаков занимает 2-3 дня, а общее время проведения исследований с помощью молекулярно-биологических методов (при наличии соответствующего оборудования в лаборатории) составляет порядка 9 часов, поэтому данный алгоритм вполне оправдан. Такая схема предложена и для быстрой идентификации возбудителей особо опасных инфекций B.anthracis, В. melitensis, F.tularensis, Y.pestis и их дифференциации от близкородственных видов. В этой схеме также рекомендовано использовать две ДНК-мишени — генов 23S РНК и спейсерной области 16S-23S РНК [305].

Касаясь способов внутривидовой дифференциации, в отношении патогенных буркхольдерий задача осложнена отсутствием фагов и плазмид у возбудителя сапа и их наличием лишь в некоторых штаммах возбудителя мелиоидоза, отсутствием данных об эпидемических маркерах и генетической регуляции известных факторов патогенности этих микроорганизмов. Несмотря на расшифровку геномов В.mallei и В pseudomallei, знаний о вариабельных последовательностях, играющих значение для внутривидовой дифференциации, явно недостаточно.

Накопленные данные в части изучения геномов патогенных буркхольдерий лишь в последнее время позволили выявить несколько полиморфных или гипервариабельных локусов, используемых для ДНК-типирования и обладающих с одной стороны высокой дискриминирующей способностью, с другой — достаточной стабильностью. Примерами таких локусов являются локусы вариабельных последовательностей, тандемные повторы, служащие мишенями метода \nsiTR и инсерционные элементы, в частности 1Б, которые могут быть использованы в качестве гибридизационных ДНК- зондов в методе ПФРФ.

Очевидно, что основная проблема при генетическом типировании связана с определением возможной связи (генетического родства) изоля-тов. На сегодняшний день общепринято, что клон - это "один или более генетически идентичных микроорганизмов, происходящий от одного общего предшественника" [91, 323, 324]. Поэтому принято считать, что об изолятах, чьи профили типирования неотличимы, дается информация о том, что они представляют собой идентичный штамм. Среди ряда изолятов обычно определяют наиболее распространенный (или "модальный") типовой штамм, который считают причиной вспышки заболевания. Изоляты, отличающиеся от модального профиля на 3 и более генетических события, считаются генетически отличными и не являются частью вспышки [91, 329].

Следует признать, что на сегодняшний день не существует ни одного генотипического метода, за исключением полногеномного секвенирова-ния, способного идентифицировать конкретный штамм микроорганизма и обладающего способностью выявлять различия в клонах популяций микроорганизмов при проведении эпидемиологического анализа. Альтернативой секвенированию может выступить технология микроэррея (биочипов), однако в настоящее время этот методический прием еще далек от совершенства. По этой причине проводят сравнительный анализ различных ге-нотипических методов и выбирают оптимальный и эффективный метод, способный с большой долей вероятности подтвердить идентичность или выявить различия штаммов. Однако заключение об идентичности штаммов можно сделать лишь при анализе определенной впышки заболевания. При сравнении же изолятов, выделенных в разных регионах и из различных, объектов окружающей среды (то есть в глобальном плане), идентичность рестрикционных фрагментов при ПЭФ или ампликонов (RAPD, ML VA) у изолятов различного происхождения не обязательно будут отражать генетическое родство (идентичность) равнозначных хромосомных участков. Лишь когда наличие вспышки подтверждается результатами эпидемиологических исследований, тогда молекулярные методы типирования должны подтвердить, что изоляты, выделенные в период вспышки, представляют собой единственный штамм, послуживший ее причиной.

В работе С.М. Romero с соавторами [303] показана внутриштаммовая генетическая вариабельность В.mallei после пассажей через животных, основанная на анализе полиморфизма единичных нуклеотидных повторов (SSRs), т.е. этот метод обладает наибольшей дискриминирующей способностью. С помощью этого подхода внутриштаммовая гетерогенность популяций выявлена и , у других микроорганизмов, в частности у P.aeruginosa [315]. Однако в этом случае возникают вопросы о возможности его применения для анализа вспышек сапа и мелиоидоза. Будут ли клоны возбудителей идентичны, учитывая выявленную их генетическую изменчивость после пассажей на животных? Если клоны анализируемых штаммов генетически отличаются, то можно ли сравниваемые штаммы считать идентичными? Какие ДНК-мишени необходимо анализировать и какой уровень коэффициента вариабельности считать доказательным? Для решения этих вопросов, несомненно, необходимы дополнительные исследования.

Учитывая то, что в нашей коллекции отсутствовали штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза, выделенные в период каких-либо вспышек заболеваний, в своей работе мы провели сравнительный анализ различных генотипических методов дифференциации коллекционных штаммов В.mallei и B.pseudomallei с целью установления степени сходства изучаемых культур и разработки оптимального алгоритма внутривидового типирования патогенных буркхольдерий. Из методов внутривидовой генетической дифференциации были использованы плазмидный анализ, моноло-кусное и мультилокусное-сиквенс типирование, схема типирования на основе вариабельных ампликонов, Rep-типирование, VNTR анализ и амплификация с различными произвольными праймерами.

Все исследуемые методы оказались эффективными для дифференциации штаммов B.pseudomallei, но не для В.mallei, что связано с различной структурной и функциональной организацией геномов этих патогенов.

В результате проведенного плазмидного анализа был оптимизирован метод скрининга плазмидных репликонов и выделено 4 типа штаммов B.pseudomallei, отличающихся по наличию плазмидных репликонов рРМ1, рСМ2, рСМЗ и рСМ4. На основе собственных и литературных данных [25, 203, 292] плазмидный анализ рекомендован в качестве генотипического метода дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от возбудителя сапа, в штаммах которого не обнаружены внехромосомные факторы наследственности.

При компьютерном анализе и секвенирования участков генов 16S рРНК, 23S рРНК и fliC необходимо было решить две задачи. С одной стороны, определить консервативные локусы среди различных видов буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, на основе которых мы конструировали амплификационные тест-системы, а с другой - оценить вариабельность этих генов внутри видов В.mallei и B.pseudomallei. В случае выявления нуклеотидных замен в изучаемых генах, провести типирование патогенных буркхольдерий.

Однако количество таких различий оказалось недостаточным для эффективного разделения штаммов патогенных буркхольдерий ввиду выраженной гомологии геномов возбудителей. В результате кластерного анализа 30-ти штаммов возбудителя мелиоидоза и 16-ти штаммов возбудителя сапа нам удалось сформировать 3 группы штаммов В. pseudomallei и две группы В. mallei на основе фрагмента гена 16S рРНК. При сравнении нуклеотидных последовательностей целого гена 16S рРНК В. pseudomallei и В.mallei сформировано 9 и 4 группы штаммов, соответственно. На основе нуклеотидных последовательностей этого гена проведено выделение бурк-хольдерий в самостоятельный род бактерий [380] и B.thaillandensis в отдельный вид [106], а также дифференциация возбудителя мелиоидоза от возбудителя сапа [166], что также было подтверждено при выполнении настоящей работы.

При сравнении секвенированных последовательностей фрагментов 23S рРНК В. mallei и В. pseudomallei не обнаружено ни внутривидовых, ни межвидовых отличий, за исключением двух штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенных в отдельную кластерную группу. Лишь при сравнении целого гена выявлены три нуклеотидные замены, на основе которых возможна дифференциация между собой этих двух видов микроорганизмов [98].

Различий в нуклеотидных последовательностях fliC генов было еще меньше. При формировании 4 кластерных групп, образованных обоими видами буркхольдерий, штаммы возбудителя сапа вошли в одну группу с В.pseudomallei.

Малое количество вариабельных последовательностей внутри выбранных генов патогенных буркхольдерий свидетельствовало о низкой эффективности этих ДНК-мишеней для генотипирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, а также определяло необходимость использования дополнительных методов дифференциации.

Одним из таких методов является метод мультилокусного секвенс-типирования, впервые предложенный D. Godoy с соавторами [176] для генотипирования возбудителя мелиоидоза. Использование этой технологии позволила установить, что авирулентный штамм В.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, который получен нами от A. Bremmel-gaard и числящийся в ее коллекции как атипичный штамм возбудителя мелиоидоза [103], принадлежит, наряду с анализируемыми В. pseiidomallei 100 и В. pseudomallei С-141, к клональным комплексам штаммов Юго-Восточной Азии. В тоже время высокая дифференцирующая способность этого метода для В. pseudomallei не распространялась на штаммы возбудителя сапа, которые в базе данных MJICT (http://www.bpseudomallei.mlst.net) на странице Burkholderia принадлежат к единственному 40-му сиквенс-типу, филогенетически связанному со штаммами возбудителя мелиоидоза, что свидетельствует о значительно большей генетической однородности В. mallei.

Разделить штаммы возбудителя сапа на различные генетические группы не удалось и при использовании схемы типирования на основе вариабельных ампликонов [153], тогда как 18 коллекционных штаммов возбудителя мелиоидоза по наличию вариабельных ампликонов были сгруппированы в 13 VAT типов.

Генетическая гетерогенность В.mallei была оценена методами рест-рикционного анализа в формате пульс-электрофореза, VNTR-анализа и амплификации с произвольными праймерами, результаты которых позволили провести эффективную внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя сапа.

Метод ПЭФ для генотипирования штаммов В. mallei рекомендован N. Chantratita с соавторами [120]. В цитируемой работе ПЭФ проводили после гидролиза хромосомной ДНК эндонуклеазой рестрикции Spe I на системе CHEF-DRIII (Bio-Rad, USA). В настоящей работе в качестве ПДРФ маркеров мы использовали фрагменты ДНК, полученные с помощью гидролиза рестриктазой Xba I. Электрофоретическое разделение ДНК 14 штаммов возбудителя сапа проводили на аппарате Gene Navigator (Pharmacia Bio-thech, Sweden). При оптимизации условий подготовки культур, лизиса клеток и режимов электрофореза, нам удалось разделить все штаммы В.mallei на 14 уникальных генетических групп.

Амплификацию с произвольными праймерами (RAPD) использовали для для многих микроорганизмов [77, 91, 114, 273], в том числе B.pseudomallei [177, 231]. Для генотипирования штаммов В.mallei этот методический прием не применяли. Выявленная эффективность метода для B.pseudomallei не исключала необходимости подбора праймеров для В.mallei и стандартизации условий проведения ПЦР и электрофореза. Из 19 проанализированных произвольных олигонуклеотидных затравок в качестве рабочей коллекции был выбран набор, состоящий из семи праймеров. При их сочетании на электрофореграммах визуализировались как общие видоспецифические фрагменты, так и вариабельные регионы, на основе которых проводили внутривидовую дифференциацию штаммов B.pseudomallei и В. mallei.

Штаммы B.pseudomallei и B.thailandensis обладали большей поли-морфностью паттернов по сравнению со штаммами возбудителя сапа, но и последние удалось четко разграничить на различные группы в в зависимости от используемых праймеров. Более того, для каждого штамма получена единая матрица сходства, на основе которой каждый из 14 штаммов В.mallei и 34 штаммов Bxpseudomallei формировал уникальную кластерную группу, соответствующую количеству исследуемых штаммов.

Этот методический прием использован A. Haase с соавторами [177} для анализа штаммов B.pseudomallei, выделенных во время различных вспышек мелиоидоза. Авторы подтверждали клональность вспышек, если электрофоретические картины результатов ПЦР совпадали. При моделировании экспериментальных сапа и мелиоидоза нам также удалось идентифицировать штаммы, с помощью которых производили заражение.

В конечном итоге выявленная гетерогенность штаммов патогенных буркхольдерий по RAPD-маркерам и способность этого метода отражать различные генетические перестройки, вплоть до изменения электрофоре-тического спектра амплифицируемых фрагментов у штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза с различной устойчивостью к антибиотикам, позволяет рекомендовать набор праймеров для быстрого генетического типирования B.mallei и B.pseudomallei, в том числе для подтверждения идентичности штаммов при возможных вспышках сапа или мелиоидоза.

Детальный анализ геномов различных микроорганизмов, в том числе В. pseudomallei и В. mallei позволил обнаружить многочисленные повторяющиеся последовательности. Одними из них являются вариабельные тандемные повторы, лежащие в основе VNTR-анализа [63, 75, 154, 210]. У патогенных буркхольдерий впервые тандемный повтор размером 10 п.н., обнаружен при анализе штамма B.pseudomallei АТСС 23343 [241].

Используя данный методический подход при анализе 6 штаммов B.pseudomallei и 11 штаммов В. mallei идентифицировано 11 аллелей (VNTR-типов). Шесть штаммов B.pseudomallei разделены на 5 аллелей. Среди 11-ти штаммов B.mallei идентифицировано 8 аллелей с различным числом тандемных повторов. Причем, два аллеля были общими для B.mallei и B.pseudomallei.

Проведенный анализ 8 аннотированных геномов и контигов патогенных буркхольдерий, представленных на веб-серверах (http://www.tigr.org/) и (http://www.sanger.ac.uk/), показал наличие локусов, содержащих различное количество (от 2 до 41) тандемно организованных повторов у всех исследуемых штаммов B.pseudomallei и B.mallei. Эти повторы выявлены на малой хромосоме в гене, детерминирующем эстеразу патогенных буркхольдерий (GenBank, YP 105648). Компьютерный анализ и результаты VNTR-анализа, полученные в настоящей работе свидетельствовали о пригодности праймеров, фланкирующиех тандемные повторы в этом гене, для простого, быстрого и высокоспецифичного ПЦР-типирования штаммов патогенных буркхольдерий.

Таким образом, в результате проведенных исследований были определены оптимальные ДНК-мишени и сконструированы амплификационные тест-системы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза, разработаны методические приемы их практического применения, а также показаны эффективные методы внутривидовой дифференциации штаммов B.pseudomallei и В.mallei. В конечном итоге нам удалось сформировать единый алгоритм генодиагностики и генотипирования патогенных бурк-хольдерий, включающий на этапе идентификации культур реакцию амплификации и секвенирование ампликонов, а на этапе быстрой дифференциации штаммов ПЦР-типирование (VAT, RAPD, Rep-ПЦР, VNTR-анализ). К этому следует добавить метод пульс-электрофореза, показавший свою эффективность для обоих видов возбудителей.

Выполненный объем исследований и опыт использования методов генотипирования на моделях различных бактерий, в том числе В. pseu-domallei и В. mallei доказывает, что они должны основываться на результатах, по крайней мере, двух методов, подтверждающих друг друга. Причем, для получения более полной информации о патогене необходим комплекс методических приемов, включающих анализ генома возбудителя, изучение экспрессии генов и протеомного спектра штаммов, так как на каждом из этих уровней проявляются внутривидовые отличия, позволяющие проводить корректную идентификацию и дифференциацию штаммов патогенных буркхольдерий.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Антонов, Валерий Алексеевич, Саратов

1. Агеева Н.П., Меринова Л.К. Влияние условий скрещивания на эффективность передачи плазмиды RP4 у Pseudomonas mallei И Микробиол. журн. 1986.-N.5. -С.3-6.

2. Адамов А.К., Карпузиди К.С., Акулова Н.Ф. Антигенное строение возбудителей сапа и мелиоидоза // Генетика, биохимия и иммунохимия особо опасн. инф. -Ростов н/Д. 1967. - С.335-339.

3. Адаме М. Бактериофаги. М.: Ин. литер., 1961. - 527с.

4. Адимов Л.Б. Бактериофаг возбудителя мелиоидоза // Диагностика особо опасных инфекций: Ростов н/Д, 1986. - С.33-36.

5. Адимов Л.Б. Поливалентный мелиоидозный диагностический бактериофаг // Состояние проблемы и перспективы развития диагностики бактериальных инфекций. Матер, рабочего совещания. Оболенск, 1990.-С.72.

6. Алексеев В.В., Тихонов Н.Г, Липницкий A.B. и др. Аэрогенные инфекции в аспекте проблемы биотерроризма // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2003. - Вып. 85. - С.20-27.

7. Алтухова В.В. Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции Автореф. дис. . канд. мед. наук. Волгоград, 2005. -24 с.

8. Ашмарин А.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962.

9. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомоно-зы,- М.: Медицина, 1990.- 224 с.

10. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., Антонов A.C. Систематика бактерий (с основами геносистематики).- Н. Новгород: изд-во Нижегородского ун-та, 1992.- 171 с.

11. Будченко A.A. Сравнительный электрофоретический анализ белков патогенных псевдомонад: Автореф. дис.канд.биол.наук. Саратов, 1995. - 24с.

12. Веревкин В.В., Воложанцев Н.В., Мякинина В.П., Светоч Э.А. Влияние Гга-системы плазмид RP4 и R 68.45 на вирулентность возбудителя сапа//Вестн. Рос. Акад. мед. наук. 1997. -N.6. - С.37-40.

13. Викторов Д. В., Захарова И. Б., Меринова Л. К., Алексеев В. В. Молекулярное типирование штаммов Burkholderia pseudomallei с различной чувствительностью к антибиотикам // Мол. генет., микробиол. виру-сол.-2006.-N.1.-C.7-11.

14. Вышелесский С.Н. Случай хронического сапа у человека // Вестн. Общ. Ветеринарии. 1909. - N.5. - С. 217 -226.

15. Гонтарь И.П., Фарбер С. М., Ефременко В.И. и др. К природе антигенов Pseudomonas pseudomallei, общих для некоторых видов микроорганизмов // Микробиол., эпидемиол., иммунол. 1984. — N.3. - С.55 -57.

16. Гришкина Т. А. Явление лизогении у Pseudomonas pseudomallei и сравнительная характеристика мелиоидозных фагов // Дис.канд. мед. наук. Волгоград. - 1996. - 118 с.

17. Денисов И.И., Каплиев В.И. Уровень спонтанной фагопродукции и чувствительность к мелиоидозным фагам музейных культур Pseudomonas pseudomallei II Микробиол. журн. 1991. — N.6. - С.66-69.

18. Денисов И.И., Каплиев В.И. Получение и характеристика клонированных линий фагов Pseudomonas pseudomallei II Микробиол. журн. -1995. -N.3. С.53 - 55.

19. Домарадский И.В. О «побочных» эффектах плазмид (R-плазмиды и вирулентность) // Мол. генет. микробиол.вирусол.- 1987.- N.6.- С.3-9.

20. Жога Л.К., Илюхин В.И., Самыгин В.М. Транспортная среда для патогенных псевдомонад // Клин. лаб. диагн.- М.: Медицина.- 1995.- С.38 -40.

21. Замараев B.C., Ряпис JT.A. Влияние температуры на динамику размножения возбудителя мелиоидоза в жидкой питательной среде // Патол. физиол. особо опас. инф.- Саратов, 1981.- С.145-150.

22. Замараев B.C., Илюхин В.И., Саямов С.Р., Ряпис JI.A. JI трансформация возбудителей как один из путей реализации хронического носи-тельства бактерий рода Pseudomonas // Микробиологический журнал.-1987. —N.3. - С.91-96.

23. Замараев B.C. Разработка основ молекулярно-генетического исследования возбудителя мелиоидоза и близкородственных буркхольдерий: Автореф. дис. докт. мед. наук. Волгоград, 2004.- 46 с.

24. Илюхин В.И., Поповцева Л.Д., Пивень H.H. Идентификация Pseudomonas pseudomallei II Лаб. дело. -1983. -N.7. -С.61-62.

25. Илюхин В.И. Антигенная структура и серология псевдомонад // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол.- 1986.- N.5.- С.88-93.

26. Илюхин В.И., Замараев B.C., Каплиев В.И. Микробиология Pseudomonas mallei: таксономия и бактериологическая диагностика // Сап / Под ред. Н.Г. Тихонова. Волгоград, 1995. - С.7—19.

27. Илюхин В.И., Замараев B.C., Каплиев В.И. Микробиология, таксономия и бактериологическая диагностика Pseudomonas pseudomallei I I Мелиоидоз / Под ред. Н.Г.Тихонова. Волгоград, 1995. - С.8-26.

28. Илюхин В.И., Храпова Н.П., Замараев В.С.и др. Сап // Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Саратов, 1998 - Т.2. -С.101-114.

29. Илюхин В.И., Замараев B.C., Батманов В.П. и др. Мелиоидоз // Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Саратов, 1998 - Т.2 - С.115-143.

30. Илюхин В.И., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г. и др. Burkholderia thailan-densis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция // Мол. генет., микробиол. вирусол. 2002. - N.l. - С.7-11.

31. Кэтти Д. Антитела 2. Методы. М.: Мир. - 1991. - 250 с.

32. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии // Новосибирск. Наука.: Сиб. отд-ние, 1990. -248 с.

33. Манзенюк О.Ю., Воложанцев Н.В., Светоч Э.А. Идентификация бактерий Pseudomonas mallei с помощью бактериофагов Pseudomonas pseudomallei II Журн.микробиол. 1994. -N.3. - С.537-544.

34. Маниатис Т., Фрич Э.,Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер с англ.- М.: Мир, 1984.- 479 с

35. Мелиоидоз / Под ред. Ширяева Д.Т. -М.: Медицина. -1976. -111 с.

36. Меринова JI.K. Системы генетического обмена патогенных псевдомонад: Автореф. дис. докт. мед. наук. Волгоград, 1997.- 40с.

37. МУ 3.5.5.1034-01. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями 1 -IV групп патогенности, при работе методом ПЦР. -М.,2001.

38. МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами 1-11 групп патогенности».- М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003.

39. Нарбутович Н.И., Голосеев Ю.А., Варыханова Т.Г. Изучение свойств внеклеточной щелочной фосфатазы возбудителя мелиоидоза // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1991. - N.8. - С.9 - 11.

40. Опасные инфекционные заболевания: учебное пособие (I и II части) / Под редакцией д.м.н., проф. В.В. Алексеева. Волгоград: НП «Здоровье и экология».- 2006.- 368 с.

41. Орлова Т.М., Кудрякова Т.А., Ряпис JI.A. Черкасова JI.P. Слизистые варианты мелиоидозного микроба // Вопросы теоретической и прикладной микробиологии. Ростов-н/Д. - 1973. - С. 104-106.

42. Петере М.К. Молекулярная биология и генетика возбудителей особо опасных инфекций // Научно-тематический сборник. Саратов, 1982. -4.1 -С.53-54.

43. Пивень Н.Н. Перспективы исследований общих, перекрестнореаги-рующих и видовых антигенов у некоторых видов бактерий рода Pseudomonas II Микробиол. журн. 1987. - Т. 49, N.3. - С. 6 -10.

44. Пивень Н.Н., Смирнова В.И., Каплиев В.И. Роль поверхностных антигенов Pseudomonas pseudomallei в патогенезе мелиоидоза // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1991. - N.10. - С.8 - 12.

45. Пивень Н.Н. Антигенный анализ возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности: Автореф. дис.докт. мед. наук. Волгоград, 1997.- 41 с.

46. Платонов А.Е., Шипулин Г.А., Платонова О.В. Мультилокусное сек-венирование -новый метод генотипирования бактерий и первые результаты его применения // Генетика.- 2000.- Т.36, N.5.- С.597-605.

47. Платонов А.Е., Миронов КО., Яцышина С.Б. и др. Характеристика московских штаммов Haemophilus influenzae типа b методом мульти-локусного секвенирования-типирования // Мол. генет. микробиол. ви-русол,- 2003.- N.2.- С21-25.

48. Плеханова Н.Г. Экзопротеазы возбудителя мелиоидоза: выделение, очистка, физико-химические и иммунобиологические свойства // Дис.канд.биол. наук. Волгоград, 1995. - 123 с.

49. Поповцева Л.Д., Фарбер С.М., Луценко Л.В. К вопросу о значении экстрацеллюлярных ферментов в дифференциальной диагностике псевдомонадных инфекций // Профилактика природноочаг. инфекций. Ставрополь. - 1983. -С.38-40.

50. Поповцева Л.Д. Поиск оптимальной схемы идентификации возбудителя мелиоидоза: Дис. канд. мед. наук. Волгоград. - 1985. - 134 с.

51. Проценко O.A., Филиппов A.A., Кутырев В.В. Гетерогенность популяций штаммов возбудителя чумы по плазмидному составу // Мол. генет. микробиол. вирусол.- 1992.- N3-4.- С.20-24.

52. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа Сфера, 2003. - 305 с.

53. Рысков А.П. Геном человека // Информ. бюлл.- 1990.- N.3.- 40 с.

54. Ряпис JI.A., Ширяев Д.Т., Акулова М.Ф. О диссоциации возбудителя мелиоидоза// Пробл. особо опасных инф. 1970. -Вып.6 (16). -С. 183187.

55. Ряпис JI.A., Илюхин В.И., Вострова Е.И., Джузенов A.A. Лабораторная диагностика клинически значимых видов псевдомонад // Лаб. дело. -1988 .-N.12. С. 66 -71.

56. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03. Безопасность работы с микроорганизмами I II групп патогенности (опасности) // Госсанэпиднадзор России. - М., 2003. -103 с.

57. Сенина Т.В. Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике: Авто-реф. дис. . канд.биол.наук. -Волгоград, 2004. 22 с.

58. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas И Киев: Наукова думка, 1990. 262 с.

59. Сучков И. Ю., Водопьянов А. С., Водопьянов С. О., и др. Мультило-кусный VNTR-анализ в изучении популяционной структуры Yersinia pestis в природных очагах // Мол. генет., микробиол. вирусол. -2004.-N.4. С.19-28.

60. Тарасова Т.Д., Ряпис Л.А. Оптимальные условия трансформации у возбудителя мелиоидоза и возможность ее применения для картирования хромосомы // Мол. генет., микробиол. вирусол.- 1983,- N.3.-С.26-29.

61. Ткаченко Г.А. Конструирование амплификационной тест- системы для выявления патогенных буркхольдерий: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Волгоград, 2003. - 24 с.

62. Ткаченко Г.А., Гришина М.А., Савченко С.С., Антонов В.А. Способ выделения ДНК Coccidioides immitis для проведения полимеразной цепной реакции // Патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам №2295569 от 12. 07. 2005 г.

63. Томов А.Ц., Цветкова Е.Д., Милушева Н.М. Лизогения у рода Malleomyces // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1970. -N.8. - С.102-106.

64. Хомяков Ю.Н. Хомякова Т.И., Северин С.Е. Биологическое и медицинское значение некультивируемых форм микроорганизмов // Вестник научно-исследовательского института молекулярной медицины.2005.- Вып.5.- С. 89-107.

65. Храпова Н.П., Тихонов Н.Г., Быкова О.И. и др. Индикация возбудителя сапа методом флюоресцирующих антител // Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики особо опасн. инф. -Ставрополь, 1989. -4.2. С.115-116.

66. Храпова Н.П., Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C. и др. Иммунологическая диагностика сапа // Сап: Сб. науч.тр. Волгоград, 1995. - С.37-44.

67. Храпова Н.П., Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C. и др. Иммунологическая диагностика мелиоидоза // Мелиоидоз: Сб. науч. тр. Волгоград, 1995. -С.57-68.

68. Цветков Н.Е., Черняк В.З. Сап.- Сельхозиздат, 1947. 257 с.

69. Цыганкова Е. А. Разработка методического подхода к генетическому типированию штаммов сибиреязвенного микроба: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 2007. - 30 с.

70. Цыганкова О. И., Еременко Е. И., Рязанова А. Г., Цыганкова Е. А. Перспективы применения генотипирования Bacillus anthracis в эпидемиологическом анализе // Эпидемиология и инфекционные болезни.2006. N.l. - С.24-28.

71. Черченко И.И., Ряпйс Л.А., Илюхин В.И. и др. К поиску возбудителя мелиоидоза в некоторых районах СССР // Сб. научных работ.- Волгоград, 1979. Вып.З. - С.159-160.

72. Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций // Мол. генет. микробиол. вирусол. -1991.-N.12.- С.3-9.

73. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2000. -Том 2, N.3. - С.82-95.

74. Шиповская Н.П., Меринова Л.К., Ряпис Л.А. Свойства ауксотрофных мутантов Pseudomonas mallei II Журн. микробиол., эпидемиол., имму-нобиолог. 1983. -N.4. - С.36-39.

75. Шубин Ф.Н., Гинзбург А.Л., Китаев В.М. и др. Анализ плазмидного состава штаммов Yersinia pseudotuberculosis и его применение для ти-пирования возбудителя псевдотуберкулеза // Мол. генет., микробиол. вирусол.- 1989. -N.6. С.20-25.

76. Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Метлин В.Н. и др. Идентификация возбудителей чумы, сапа и мелиоидоза иммуноферментным методом // Диагностика и профилактика чумы, холеры, сапа и мелиоидоза. Волгоград, 1983. - С.86-87.

77. Al-Ani F.K., Al-Rawashdehl О. F., Ali А. Н., Hassan F.K. Glanders in horses: clinical, biochemical and serological studies in Iraq // Veterinarski arhiv.- 1998.- Vol.68, N.5.- P.155-162.

78. Alexander A.D., Huxsoll D.L., Warner A.R. et al. Serological diagnosis of human melioidosis with indirect hemagglutination and complement fixation tests // Appl. Microbiol. 1970. - Vol.20. - P.825-833.

79. Allworth A.M. Tsunami lung: a necrotising pneumonia in survivors of the Asian tsunami // Med. J. Aust. 2005. - Vol. 182. - P.364.

80. Altschul S. F., Madden T. L., Schaffer A. A. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. - Vol.25.- P.3389-3402.

81. Anuntagool N., Rugdech P., Sirisinha S. Identification of specific antigens of Pseudomonas pseudomallei and evaluation of their efficacies for diagnosis of melioidosis // J. Clin.Microbiol. 1993. -Vol.31. - P. 1232-123 6.

82. Anuntagool N., Aramsri P., Panichakul T. et al. Antigenic heterogeneity of lipopolysaccharide among Burkholderia pseudomallei clinical isolates // Southeast Asian J Trop Med Public Health 2000. - Vol. 31 Suppl 1. - P. 146-152.

83. Anuntagool N., Sirisinha S. Antigenic relatedness between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei II Microbiol Immunol 2002. - Vol. 46. - P.143-150.

84. Anuntagool N., Wuthiekanun V., White N.J. et al. Lipopolysaccharide heterogeneity among Burkholderia pseudomallei from different geographic and clinical origins // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2006. - Vol. 74. - P. 348 -352.

85. Arbeit R.D., Maslow J.N., Mulligan M.E. Polymerase chain reaction-mediated genotyping in microbial epidemiology // Clin. Infect. Dis. 1994. -Vol.18.- P.1018-1019.

86. Aran S., Neubauer H., Gurel A. et al. Equine glanders in Turkey // Vet. Rec. 1999. - Vol. 144. - P.255-258.

87. Ashdown L.R. An improved screening technique for isolation of Pseudomonas pseudomallei from clinical specimens // Pathology. 1979. - Vol. 11, N.2. - P. 293-297.

88. Ashdown L.R. Demonstration of human antibodies to Pseudomonas pseudomallei by indirect fluorescent antibody staining 11 Pathology. -1981. -Vol.13. -P.597-601.

89. Ashdown L.R., Guard R:M. The prevalence of human melioidosis in Northern Queeslande II Amer.J.Trop. Med.Hyg. 1984. - Vol.33, N.3. - P.474.

90. Ashdown L.R., Jonson R.W., Koehler J.M., Cooney C.A Enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of clinical and subclinial melioidosis // J. Infect. Dis. 1989. - Vol.160. - P.253-260.

91. Baldwin A., Mahenthiralingam E., Thickett K.M. et al. Multilocus sequence typing scheme that provides both species and strain differentiation for the Burkholderia cepacia complex II J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 4665-4673.

92. Bauernfeind A., Roller C., Meyer D. et al. Molecular procedure for rapid detection of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei II J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P.2737-2741.

93. Becker K.H. Untersuchungen zur abgrenzung von pseudomallei gegen andere mesophile pseudomonaden mit neuzeitlichen diagnostischen methoden. Inaugural-Dissertation. Giessen. 1981. - 189 p.

94. Birren B., Hood L., Lai E. Pulsed field gel electrophoresis: studies of DNA migration made with the programmable, autonomously-controlled electrode electrophoresis system // Electrophoresis. 1989.- Vol.10. - P.302-309.

95. Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. et al. Rapid and simple method purification of nucleic acids // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol.28, N.3. - P.495-503.

96. Bremmelgaard A. Differentiation between Pseudomonas cepacia and Pseudomonas pseudomallei in clinical bacteriology // Acta Pathol Microbiol Scand B. 1975. - Vol. 83. - P.65-70.

97. Brett P.J., Mah D.C., Woods D.E. Isolation and characterization of Pseudomonas pseudomallei flagellin proteins // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62. - P.1914-1919.

98. Brett P.J., Deshazer D., Woods D.E. Characterization of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia pseudomallei-like strains // Epidemiol Infect 1997. - Vol. 118. - P.137-148.

99. Brett P.J., De Shazer D., Woods D.E. Burkholderia thailandensis sp. nov., a Burkholderia pseudomallei-like species II Intern. J. Syst. Bacterid. 1998.-Vol.48.-P.317-320.

100. Brett P. J., Woods D.E. Pathogenesis of and immunity to melioidosis // Acta tropica. Vol.74. - 20'00. - P.201-210.

101. Brisse S., Stefani S., Verhoef J. et al. Comparative evaluation of the BD Phoenix and VITEK 2 automated instruments for identification of isolates of the Burkholderia cepacia complex II J. Clin. Microbiol.- 2002.- Vol.40, N.5.- P.1743-1748.

102. Brook M.D., Currie B., Desmarchelier P.M. Isolation and identification of Burkholderia pseudomallei from soil using selective culture techniques and the polymerase chain reaction // J Appl Microbiol 1997. - Vol. 82. - P.589 -596.

103. O.Brown N.F., LewA.E., Beacham I.R. Identification of new transposable genetic elements in Burkholderia pseudomallei using subtractive hybridisation // FEMS Microbiol. Lett. 2000.- Vol. 1983. - P.73-79.

104. Bossi P., Tegnell A., Baka A. et al. Bichat guidelines for the clinical management of glanders and melioidosis and bioterrorism-related glanders and melioidosis // Euro. Surveill 2004. - Vol. 9. - P. 17 - 18.

105. Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism // Am. J. Hum. Genet. 1980. - Vol.32. - P.314-331.

106. Burtnick M., Bolton A., Brett P. et al. Identification of the acid phosphatase (acpA) gene homologues in pathogenic and non-pathogenic Burkholderia spp. facilitates TnphoA mutagenesis // Microbiology 2001. - Vol. 147. - P. 111-120.

107. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers // Bio/Technol. 1991. - Vol.9. - P.553-557.

108. Carlson P., Seppanen M. Melioidosis presenting as urinary tract infection in a previously healthy tourist // Scand. J. Infect. Dis. 2000. - Vol. 32. - P. 92

109. CasadevaíI A., Pirofski L.-A. Host Pathogen Interactions: Basic Concepts of Microbial Commensalism, Colonization, Infection, and Disease // Inf. Immun. 2000. - Vol.68. - P.6511-6518.

110. Casse F., Boucher C.',Julliot J.S. et al Identificftion and characterisation of large plasmids in Rhizobium meliloti using agarose gel electrophoresis // J. Gen. Microbiol. 1979. - Vol.113. - P.229-242.

111. Chambón L. Serological analysis of the somatic antigen of Malleomyces pseudomallei II Ann Inst. Pasteur. Paris. -1960. -Vol.98. - P.405-415.

112. Chan C. K., Hyland R. H., Leers W. D. et al. Pleuropulmonary melioidosis in a Cambodian refugee // Can. Med. Assoc. J. 1984. - Vol.131.- P. 13651367.

113. Chantratita N., Vesaratchavest M., Wuthiekanun V. et al. Pulsed-field gel electrophoresis as a discriminatory typing technique for the biothreat agent Burkholderia mallei // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2006. - Vol. 74. - P. 345 -347.

114. Chantratita N., Wuthiekanun V., Boonbumrung K. et al. Biological relevance of colony morphology and phenotypic switching by Burkholderia pseudomallei II J. Bacteriol. 2007. - Vol. 189. - P.807-817.

115. Cheng A. C., Currie B. J. Melioidosis: epidemiology, pathophysiology, and management // Clin. Microbiol. Rev. 2005. - Vol.18, N.2. - P.383-416.

116. Cheng A.C., Day N.P., Mayo M.J. et al. Burkholderia pseudomallei strain type, based on pulsed-field gel electrophoresis, does not determine disease presentation in melioidosis I I Microbes. Infect. 2005. - Vol. 7. - P. 104 -109.

117. Chierakul W., Winothai W., Wattanawaitunechai C. et al. Melioidosis in 6 Tsunami survivors in southern Thailand // Clin. Infect. Dis. 2005. - Vol. 41. - P.982-990.

118. Chomczynski P, Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem.-1987. Vol.162, N.l. - P. 156-159.

119. Chuah S.C., Gilmore G., Norton R.E. Rapid serological diagnosis of melioidosis: an evaluation of a prototype immunochromatographic test // Pathology 2005. - Vol. 37. - P.169-171.

120. Clayton A. J., Lisella R. S., Martin D. G. Melioidosis: a serological survey in military personnel // Mil. Med. 1973. - N.138.- P.24-26.

121. Coenye T., LiPuma J.J. Henry D. et al. Burkholderia cepacia genomovar VI, a new member of the Burkholderia cepacia complex isolated from cystic fibrosis patients // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2001. - Vol.51. - P.271-279.

122. Coenye T., Vandamme P., Govan J. R. W., LiPuma J.J. Taxonomy and Identification of the Burkholderia cepacia Complex // J. Clin. Microbiol.-2001.- Vol. 39, N.10.- P. 3427-3436.

123. Coenye T., Vandamme P. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches // Environ. Microbiol. 2003. -Vol.5.-P.719-729.

124. Cravitz L., Miller W.R. Immunologic studies with Malleomyces mallei and Malleomyces pseudomallei; serological relationships between M. mallei and M. pseudomallei I I J. Infect. Dis. 1950. - Vol. 86. - P.46-51.

125. Currie B.J., Fisher D:A., Howard D.M. et al. The epidemiology of melioidosis in Australia and Papua New Guinea // Acta Trop. 2000. - Vol. 74. -P.121-127.

126. Currie B. J. Melioidosis: an important cause of pneumonia in residents of and travellers returned from endemic regions // Eur. Respir. J. 2003. -Vol.22.- P.542-550.

127. Currie B. J., Inglis T.J.J., Vannier A.M. et al Laboratory exposure to Burkholderia pseudomallei Los Angeles, California, 2003 // Morb. Mortal. Wkly. Rep. - 2004. - Vol.53. - P.988-990.

128. Dance D.A.B., Wuthiekanun V., Naigowit P. et al. Identification of Pseudomonas pseudomallei in clinical practice: use of simple screening tests and API 20NE // J. Clin. Pathol. 1989. - Vol. 42. - P.645-648.

129. Dance D. A. B. Melioidosis: the tip of the iceberg? // Clin. Microbiol. Rev.-1991.-Vol.4.-P.52-60.

130. Dance D.A.B. Melioidosis as an emerging global problem //Acta Trop. -2000.-Vol.74.-P.l 15-119.

131. Dance D.A.B., Smith M.D., Aucken H.M., Pitt T.L. Imported melioidosis in England and Wales //Research letters. 2004. - Vol.353, P.9148.

132. Dharakul T., Songsivilai S., Viriyachitra S. et al. Detection of Burkholderia pseudomallei DNA in patients with septicemic melioidosis II J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - P.609-614.

133. De Boeck K, Malfroot A, Van Schil L, et al. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex colonisation in cystic fibrosis patients I I Europ. Resp. J.-2004. Vol.23, N.6. - P.851-856.

134. De Ley J. DNA-base composition and hybridization in the taxonomy of phytopathogenic bacteria // Ann.Rev.Phytopathol.- 1968.- 6.- P.63-90.

135. Desakorn V., Smith M.D. Wuthiekanum V. et al. Detection of Pseudomonas pseudomallei antigen in urine for the diagnosis of melioidosis // Am. J. Trop.Med. Hyg. 1994. - Vol.51. - P.627-633.

136. Deshazer D. Genomic diversity of Burkholderia pseudomallei clinical isolates: subtractive hybridization reveals a Burkholderia mallei-specific prophage in B. pseudomallei 1026b // J Bacteriol 2004. - Vol. 186. - P.3938 -3950.

137. Desmarchelier P.M., Dance D.A.B., Chaowagul W. et al. Relationships among Pseudomonas pseudomallei isolates from patients- with recurrent melioidosis // J. Clin. Microbiol.- 1993.- N.31.- P. 1592-1596.

138. Diancourt L., Passet V., Verhoef J. et al. Multilocus sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates // J. Clin. Microbiol. 2005. -Vol.43, N.8.-P.4178-4182.

139. Dodin A., Fournier J. Precipitating and agglutinating antigens of Pseudomonas pseudomallei (Whitmore's B.). I. Thermostable and thermolabile complexes. Serological typing // Ann. Inst. Pasteur. 1970. -Vol.2. - P.211-221.

140. Dodin A., Ferry D. Découverte du bacilli de Whitmore en Afrique // Med. et malad. Infect. 1975. - Vol.5. - P.97-98.

141. Duangsonk K., Gal D., Mayo M. et al. Use of a variable amplicon typing scheme reveals considerable variation in the accessory genomes of isolates of Burkholderia pseudomallei II J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P. 1323-1334.

142. Farlow J., Smith K.L., Wong J. et al. Francisella tularensis strain typing using multiple-locus, variable-number tandem repeat analysis // J. Clin. Microbiol. -2001. -Vol.39, N9. P.3186-3192.

143. Feil J.E., Li B.C., Aanensen D.M. et al. eBURST: Inferring patterns of evolutionary descent among clusters of rerated bacterial genotypes from multi-locus sequence typing data // J. Bacteriol. 2004. - V.186, N.5. -P. 15181530.

144. Fournier J., Chambon L. La melioidose, maladie d'actualité et le bacilli de Whitmore // Paris: Ed. Med. Flammarion, 1958. -P.47-90.

145. Fournier J., Bussy G. Thermostable antigens of Pseudomonas pseudomallei and of Malleomyces mallei and their characteristics in common II Ann. Inst. Pasteur. (Paris). 1967. - Vol.112, N.l. - P.93-104.

146. Frangoulidis D., Schwab D., Scholz H. et al. «Imported» melioidosis to Germany -relapse after 10 years.- The 5th World melioidosis congress, November 21-23 2007, Khon Kaen, Thailand, 2007. P. 140.

147. Fredrickson J.K., Zachara J.M., Balkwill D.L. Geomicrobiology of highlevel nuclear waste-contaminated vadose sediment at the Hanford site, Washington state // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - V.70.- P.4230-4241.

148. Fritz D.L., Vogel P., Brown D.R. et al. The hamster model of intraperitoneal Burkholderia mallei (glanders) // Vet. Pathol. 1999. - Vol. 36. -P.276-291.

149. Fritz D.L., Vogel P., Brown D.R. et al. Mouse model of sublethal and lethal intraperitoneal glanders (Burkholderia mallei) II Vet. Pathol. 2000. - Vol. 37. - P.626-636.

150. Fuchs R., Rice P., Cameron G. N. Molecular biological databases -present and future // Trend. Biotechnol.- 1992. 10 (1-2). - P.2237-2239.

151. Fushan A., Monastyrskaya G., Abaev I. et al. Genome-wide identification and mapping of variable sequences in the genomes of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei // Res. Microbiol. 2005. - Vol. 156. - P. 278-288.

152. Gal D., Mayo M., Spencer E. et al. Short report: application of a polymerase chain reaction to detect Burkholderia pseudomallei in clinical specimens from patients with suspected melioidosis // Am. J. Trop. Med. Hyg. -2005.-Vol. 73. P.l 162-1164.

153. Garrity G., Jonson K.L., Bell J., Searles D.B. Taxonomic Outline of the Procaryotes. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Second Edition.-2002.

154. Gee J.E., Sacchi C.T., Glass M.B. et al. Use of 16S rRNA gene sequencing for rapid identification and differentiation of Burkholderia pseudomallei and B. mallei II J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41. - P.4647-4654.

155. Gevers D., Cohan F.M, Lawrence J.G. et al. Re-evaluating prokaryotic species // Nature Rev.- 2005.- Vol.3.- P.733-739.

156. Gilardi G.L Diagnostic Criteria for Differentiation of Pseudomonads pathogenic for man // Appl.Microbiol.-1968.-Vol. 16,N10. P.1497-1502.

157. Gilardi G.L. Characterization of Pseudomonas species isolated from clinical specimens // Appl. Microbiol. 1971. - Vol.21, N.3. - P.414-419.

158. Gilardi G.L. Pseudomonas .species in clinical microbiology 11 J. Med. -1976.-Vol. 43. P.710-715.

159. Glass M.B., Popovic T. Preliminary evaluation of the API 20NE and RapID NF plus systems for rapid identification of Burkholderia pseudomallei and B. mallei II J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P.479-483.

160. Glass M.B., Gee J.E., Steigerwalt A.G. et al. Pneumonia and septicemia caused by Burkholderia thailandensis in the United States // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P.4601-4604.

161. Glass M.B., Steigerwalt A.G., Jordan J.G. et al. Burkholderia oklahomensis sp. nov., a Burkholderia pseudomallei-like species formerly known as the

162. Oklahoma strain of Pseudomonas pseudomallei II Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2006. - Vol. 56. - P.2171-2176.

163. Gray D.I., Kroll R.G. Polymerase chain reaction amplification of the fly A gene for rapid identification of Listeria spp. //Lett Appl Microbiol. 1995. - Vol.20. - P.65-68.

164. Grif K., Dierich M.P., Much P. et al. Identifying and subtyping species of dangerous pathogens by automated ribotyping // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2003. - Vol. 47. - P.313-320.

165. Haase A., Brennan M., Barrett S. et al. Evaluation of PCR for diagnosis of melioidosis // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36. - P.1039-1041.

166. Hagen R.M., Gauthier Y.P., Sprague L.D. et al. Strategies for PCR based detection of Burkholderia pseudomallei DNA in paraffin wax embedded tissues II Mol. Pathol. 2002. - Vol. 55. - P.398-400.

167. Han O., Li L., Zhao Z. Classify species of Pseudomonas pseudomallei into serotypes II Wei Sheng Wu Xue Bao 1990. - Vol. 30. - P.393-396.

168. Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005. - Vol.44, N.l. - P.91-97.

169. Helgason E., Tourasse N.J., Meisal R., et al. Multilocus sequence typing scheme for bacteria of the Bacillus cereus group // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - Vol.70, N.l. - P.191-201.

170. Heyse A.M., Dierick J., Vanhouteghem H. et al. A case of imported melioidosis presenting as prostatitis // Infect. 2003. - Vol. 31. - P. 60 - 62.

171. Higgins D.G., Fuchs R., Stoehr P. et al. The EMBL data library // Nucl. Acids Res. 1992. - 20 (Seg.suppl.). -P.2071-2074.

172. Ho P.L., Cheung T.K., Kinoshita R. et al. Activity of five fluoroquinolones against 71 isolates of Burkholderia pseudomallei II J. Antimicrob. Chemother. 2002. - Vol. 49. - P. 1042-1044.

173. Holden M.T.G., Titball R.W., Peacock S. et al. Genomic plasticity of the causative agent of melioidosis, Burkholderia pseudomallei II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - Vol.101. - N.39. - P. 14240-14245.

174. Hongbao M. Development Application of Polymerase Chain Reaction (PCR) II J. Am. Sci. 2005. - Vol.3, N.I.- P. 1-48.

175. Howard K., Inglis TJ. Novel selective medium for isolation of Burkholderia pseudomallei// J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41. - P. 3312-3316.

176. Howe C., Sampath A., Spotnitz M. The pseudomallei group: a review // J. Infect. Dis. 1971. - Vol. 124. - P.598-606.

177. Hsueh P.R., Teng L.J., Lee L.N. et al. Melioidosis: an emerging infection in Taiwan? // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol. 7. - P.428-33.

178. Hulton C.S., Higgins C.F., Sharp P.M. ERIC sequences: a novel family of Repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhi-murium and other enterobacteria // Mol. Microbiol. 1991. - Vol.5. -P.825-834.

179. Jackman P.J.H., Feltham R.K.H., Sheath P.H.A. A program in Basic for numerical taxonomy of microorganisms based on electrophoretic protein patterns // Microbiol. Lett. 1983. - Vol.23. - P.87-92.

180. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA//Nature. 1985. - Vol.314., N.6006. - P. 67-73.

181. Jenney A.W., Lum G., Fisher D.A. et al. Antibiotic susceptibility of Burkholderia pseudomallei from tropical northern Australia and implications for therapy of melioidosis // Int. J. Antimicrob. Agents. 2001. - Vol. 17.-P. 109-113.

182. Jigen J., Li L. Study on the plasmids in Pseudomonas pseudomallei II Chin. J. Epid. 1992. - N13'.- P.452.

183. Johnson J.L., Palleroni N.G. Deoxyribonucleic acid similarities among Pseudomonas species II Int. J. Sys. Bacteriol. 1989.- Vol.39, N.3.- P.230-235.

184. Jones S.W., Dobson M.E., Francesconi S.C. et al. DNA assays for detection, identification, and individualization of select agent microorganisms // Croat. Med. J. 2005. - Vol. 46. - P. 522-529.

185. Kanai K., Deysirilert L. Pseudomonas pseudomallei and melioidosis, with special reference to the status in Thailand // Jpn. J. Med. Sei. Biol. 1988. -N.41. - P.123-157.

186. Kanai K., Kondo E. Recent advances in biomedical sciences of Burkholderia pseudomallei (basonym: Pseudomonas pseudomallei) // Jpn. J. Med. Sei. Biol. 1994. - Vol.47. - P. 1-45.

187. Kao C.M., Chen S.C., Chen Y.S. et al. Detection of Burkholderia pseudomallei in rice fields with PCR-based technique // Folia Microbiol (Praha) -2003.-Vol. 48. P.521-524.

188. Kateruttanakul P., Paovilai W., Kongsaengdao S. et al. Respiratory complication of tsunami victims in Phuket and Phang-Nga // J. Med. Assoc. Thai. -2005.-Vol. 88.-P.754-758.

189. Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., et al. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus an-thracis II J. Bacteriol. 2000. - Vol.182, N.10. - P.2928-2936.

190. Kell D.B., Kaprelyants A.S., Weichart D.H. Viability and activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical issues // Antonie Van Leeuwenhoek. 1998. - Vol.3. - P.169-187.

191. Kenna D.T., Yesilkaya H., Forbes K.J. et al. Distribution and genomic location of active insertion sequences in the Burkholderia cepacia complex // J. Med. Microbiol. 2006. - Vol. 55. - P.l-10.

192. Kersters K., Pot B., Dewettinck D. et al. Identification and typing of bacteria by protein electrophoresis // In F. G. Priest, A. Ramos-Cormenzana, and B. Tyndall (ed.), Bacterial diversity and systematics. Plenum Press, New York.- 1994.-P.51-66.

193. Kiertiburanakul S., Sungkanuparph S., Kositchiwat S., Vorachit M. Burkholderia pseudomallei'. abscess in an unusual site // J. Postgrad. Med.-2002.-Vol.48.-P.124-126.

194. Kim H.S., Schell M.A., YuY. et al. Bacterial genome adaptation to niches: divergence of the potential virulence genes in three Burkholderia species of different survival strategies // BMC Genomics. 2005. - Vol.6. - P. 174.

195. Koay A.S., Rohani M.Y., Cheong Y.M. In-vitro susceptibility of Burkholderia pseudomallei to cefoperazone-sulbactam combination // Med. J. Malaysia 1997. - Vol. 52. - P.158-160.

196. Koeuth T., Versalovic J., Lupski J.R. Differential subsequence conservation of interspersed Repetitive Streptococcus pneumoniae BOX elements in diverse bacteria// Genome Res. 1995. - Vol.5. - P.408-418.

197. Koh T.H., Ng L.S. Y., Ho J.L.F., Sng L.H. et al. Automated identification systems and Burkholderia pseudomallei 11 J. Clin. Microbiol. 2003. -Vol.41. - P.1809.

198. Koonpaew S., Ubol -M.N., Sirisinha S. et al. Genome fingerprinting by pulsed-field gel electrophoresis of isolates of Burkholderia pseudomallei from patients with melioidosis in Thailand // Acta Trop. 2000. - Vol. 74. -P.187-191.

199. Koponen M.A., Zlock D., Palmer D.L. et al. Melioidosis. Forgotten, but not gone! //Arch. Intern. Med. 1991. - Vol. 151. - P.605 - 608.

200. Kunakom M., Boonma P., Khupulsup K.et al. Enzyme-linked immunosorbent assay for immunoglobulin M specific antibody for the diagnosis of melioidosis // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol.28, N.6. - P. 1249-1253.

201. Kunakorn M., R. B. Markham R.B. Clinically practical seminested PCR for Burkholderia pseudomallei quantitated by enzyme immunoassay with and without solution hybridization // J. Clin. Microbiol. 1995.- Vol.33. -P.2131-2135.

202. Kunakorn M., Raksakait K., Sethaudom C. et al. Comparison of three PCR primer sets for diagnosis of septicemic melioidosis // Acta Trop. 2000.-N.74. - P.247-251.

203. Kuske C. R., Banton K. L., Adorada D.L. et al. Small-scale DNA sample preparation method for field PCR detection of microbial cells and spores in soil //App.Environ. Microbiol. 1998. - Vol.64, N.7. - P.2463-2472.

204. Laboratory exposure to Burkholderia pseudomallei. Los Angeles, California, 2003 // MMWR Morb. Mortal Wkly. Rep. 2004. - Vol. 53. - P.988 -990.

205. Laemmli, U. K Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 //Nature. 1970. - Vol.15, N.227. - P. 680-685.

206. Layne S.P., Beugelsdijk T.J. High-throughput laboratories for Homeland and National Security // Biosecurity and bioterrorism: biodefence, strategy, practice and science. 2003. - Vol.1, N.2. - P.123-130.

207. Lee S.W., Yi J., Joo S.I. et al. A case of melioidosis presenting as migrating pulmonary infiltration: the first case in Korea // J. Korean Med. Sci. 2005. - Vol.20. -P.139-142.

208. Leelarasamee A. Diagnostic value of indirect hemagglutination method for melioidosis in Thailand // J. Infect. Dis. Antimicrob. Agents. -1985. Vol.2. -P.214-215.

209. Leelarasamee A. Melioidosis in Southeast Asia // Acta tropica. 2000. -Vol.74.-P. 129-132.

210. Lehavi O., Aizenstien O., Katz L.H. et al. Glanders—a potential disease for biological warfare hr humans and animals // Iiarefuah. 2002. - Vol. 141 Spec. N. 119. -P.88-91.

211. Le Hello S., Currie B.J., Godoy D. et al. Melioidosis in New Caledonia // Emerg. Infect. Dis. 2005. - Vol. 11. - P.1607-1609.

212. Lew A.E., Desmarchelier P.M. Molecular typing of Pseudomonas pseudomallei: restriction fragment length polymorphisms of rRNA genes // J. Clin. Microbiol. 1993.-N.31 .-P.533-539.

213. Lew A.E., Desmarchelier P.M. Detection of Pseudomonas pseudomallei by PCR and hybridization // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 1326.

214. Li X., Hayward A.C. Bacterial whole cell protein profiles of the rRNA group II pseudomonads // J. Appl. Bacteriol. 1994. - Vol. 77. - P.308 -318.

215. Li W.H. Simple method for constructing phylogenetic trees from distance matrices // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - Vol.78. - P.1085-1090.

216. Lipuma J.J., Dulaney B.J., McMenamin J.D. et al. Development of rRNA-based PCR assays for identification of Burkholderia cepacia complex isolates recovered from cystic fibrosis patients // J. Clin. Microbiol. 1999. -Vol. 37.-P.3167-3170.

217. Lipuma J.J., Spilker T., Gill L.H. et al. Disproportionate distribution of Burkholderia cepacia complex species and transmissibility markers in cystic fibrosis // Am. J. Respir. Crit Care Med. 2001. - Vol. 164. - P.92-96.

218. Liu P.V. Analytical serology of Pseudomonadaceae II In: Analitical serology of microorganisms. Interscience Publishers, ed J. Kwapinski. 1969. -Vol.2.-P. 1-44.

219. Loffler F. Die Aetiologie der Rotzkrankheit // Arb. Kais. Gesundh. amt Berlin 1.- 1886.- P.141-198.

220. Lowe P., Engler C., Norton R. Comparison of automated and nonautomated systems for identification of Burkholderia pseudomallei II J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol.40, N.12. - P.4625-4627.

221. Maccanti O., Pardelli R., Tonziello A. et al. Melioidosis in a traveller from Thailand: case report // J. Chemother. 2004. - Vol. 16. - P.404-407.

222. Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E. et al. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol.95, N.6.-P.3140-3145.

223. Mandel M. Deoxyribonucleic acid base composition in the genus Pseudomonas II J. Gen. Microbiol. 1966. - Vol.43, N.2. - P.273-275.

224. Mandjee A. Burkholderia pseudomallei infection after travelling in Southeast Asia, case study // Med Mai Infect 2005. - Vol. 35. - P.88-90.

225. Marmur J. A procedure for isolation of deoxyribonucleic acid from micro-orcanisms // J. Mol. Biol. 1961. - Vol.3. - P.208-218.

226. Martin-Laurent F., Philippot L., Hallet S. et al. DNA extraction from soil: old bias for new microbial diversity analysis methods // App. Environ. Microbiol. 2001 - Vol.67, N.5. - P.2354-2359.

227. Mathai E., Jesudason M.V., Anbarasu A. Indirect immunofluorescent antibody test for the rapid diagnosis of melioidosis // Indian J. Med. Res. -2003.-Vol. 118.- P.68-70.

228. McCormick J.B., Weaver R.E., Hayes P.S. et al. Wound infection by an indigenous Pseudomonas pseudomallei-like organism isolated from the soil: case report and epidemiologic study // J. Infect. Dis. 1977. - Vol. 135. - P. 103-107.

229. Merritt A., Inglis T.J., Chidlow G. et al. PCR-based identification of Burkholderia pseudomallei II Rev. Inst. Med. Trop. Sao Paulo. 2006. - Vol. 48. - P.239-244.

230. Meumann E.M., Novak R.T., Gal D. et al. Clinical evaluation of a type III secretion system real-time PCR assay for diagnosing melioidosis // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P.3028-3030.

231. Miller D.N., Bryant J.E., Madsen E.L. et al. Evaluation and optimization of DNA extraction and purification procedures for soil and sediment samples // App. Environ. Microbiol. 1999. - Vol.65, N.l 1. - P.4715-4724.

232. Misener S. , Krawet S.A. Bioinformatics methods and protocols.- Humana Press Inc., 2000.- 488 p.

233. Monastyrskaya G., Fushan A., Abaev I. et al. Genome-wide comparison reveals great inter- and intraspecies variability in B. pseudomallei and B. mallei pathogens // Res. Microbiol. 2004. - Vol. 155. - P.781-793.

234. Mullis K.B., Fallona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a poly-merase-catalyzed chain reaction // Meth. Enzymol. 1987.- Vol. 155.-P.335-350.

235. Naigowit P., Kurata T., Wangroongsub P. Application of indirect immunofluorescence microscopy to colony identification of Pseudomonas pseudomallei II Asian. Pac. J. Allergy. Immunol. 1993. - Vol.11, N.2. -P.149-154.

236. Nei M., Kimur S. Molecular Evolution and Phylogenetics.- New York, 2000.- P.73-188.

237. Neubauer H., Sprague L.D., Zacharia R. et al. Serodiagnosis of Burkholderia mallei infections in horses: state-of-the-art and perspectives // J. Vet. Med. B Infect. Dis. Vet. Public Health. 2005. - Vol. 52. - P. 201 -205.

238. Neubauer H., Sprague L.D., Joseph M. et al. Development and clinical evaluation of a PCR assay targeting the metalloprotease gene (mprÄ) of B.pseudomallei I I Zoonoses. Public Health. 2007. - Vol. 54. - P.44-50.

239. Ngauy V., Lemeshev Y., Sadkowski L. et al. Cutaneous melioidosis in a man who was taken as a prisoner of war by the Japanese during World War II // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P.970-972.

240. Nierman W.C., DeShazer D., Kim H. S. et al. Structural flexibility in the Burkholderia mallei .genome // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2004. -V. 101. - N.39. - P. 14246-14251.

241. Nigg C., Ruch J., Scott E. et al. Enhance of virulence of Malleomyces pseudomallei II J. Bacteriol. 1956. - Vol.71. - P.530.

242. Norton R., Roberts B., Freeman M. et al. Characterisation and molecular typing of Burkholderia pseudomallei'. are disease presentations of melioidosis clonally related? // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998. - Vol. 20. -P: 37-44.

243. Novak R.T., Glass M.B., Gee J.E. et al. Development and evaluation of a, -real-time PCR assay targeting the type III secretion system of Burkholderia pseudomallei II J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P. 85-90.

244. Olive D.M., Bean P. Principles and Applications of Methods for DNA-Based Typing of Microbial Organisms // J.Clin. Microbiol. 1999. -Vol.37, N.6.-P.1661-1669.

245. Oliver J.D. Formation of viable but nonculturable cells // Starvation bacteria / Ed. S.Kjelleberg. New York, 1993. - P.239-272.

246. Ou K., Ong C., Koh S.Y. et al. Integrative genomic, transcriptional, and proteomic diversity in natural isolates of the human pathogen Burkholderia pseudomallei II J. Bacteriol. 2005. - Vol. 187. - P. 4276-4285.

247. Palleroni N., Doudorff M. Some properties and taxonomic subdivisions of the genus Pseudomonas II Ann.Rev. Phytopathol. 1972. - Vol.10. - P.73-100.

248. Palleroni N.J., Kunisawa R., Contopoulou R., Doudoroff M. Nucleic acid homologies in the genus Pseudomonas II Int. J. Syst. Bacteriol. 1973. -Vol.23, N.4. - P.333-339.

249. Palleroni N. Family of Pseudomonadaceae II Bergey's manual of systematic bacteriology / Ed. by Krieg N., Holt G. Baltimore, 1984. - Vol.1. - P. 141 -199.

250. Panlilio A.L., Beck-Sague C.M., Siegel J.D. et al. Infections and pseudoinfections due. to povidone-iodine solution contaminated with Pseudomonas cepacia II Clin. Infect. Dis.- 1992.- Vol. 14, N.5.- P.1078-1083.

251. Payne G.W., Vandamme P., Morgan S.H. et al. Development of a recA gene-based identification approach for the entire Burkholderia genus // Appl. Environ. Microbiol. 2005. - Vol. 71. - P. 3917- 927.

252. Payne G.W., Ramette A., Rose H.L. et al. Application of a recA gene-based identification approach to the maize rhizosphere reveals novel diversity in Burkholderia species// FEMS Microbiol. Lett. 2006. - Vol. 259. - P. 126 -132.

253. Penn C.W., Luke C.J. Bacterial flagellar diversity and significance in pathogenesis // FEMS Microbiology Letter. 1992. - Vol.100. - P.331-336.

254. Person T., Giffard P.M., Beckstrom-Sternberg S. et al. Evolutionary history of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei II The 5th World melioidosis congress, November 21-23 2007, Khon Kaen, Thailand, 2007.-P.76.

255. Picken R.N. Polymerase chain reaction primers and probes derived from flagellin gene sequences for specific detection of the agents of Lyme disease and North American relapsing fever // J. Clin. Microbiol. 1992. -Vol.30.-P.99-114.

256. Pitt T.L., Trakulsomboon S., Dance D.A. Molecular phylogeny of Burkhol-deriapseudomallei II Acta Trop. 2000. - Vol. 74. - P. 181-185.

257. Pongsunk S., Thirawattanasuk N., , Piyasangthong N. et al. Rapid identification of Burkholderia pseudomallei in blood cultures by a monoclonal antibody assay // J. Clin. Microbiol. 1999,- Vol.37. - P.3662-3667.

258. Radua S., Ling O.W., Srimontree S. et al. Characterization of Burkholderia pseudomallei isolated in Thailand and Malaysia // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2000. -Vol.38, N.3. - P.141-145.

259. Rainbow L., Hart C.A., Winstanley C. Distribution of type III secretion gene clusters in Burkholderia pseudomallei, B. thailandensis and B. mallei II J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51. - P. 374-384.

260. Ralph D., McClelland M. Arbitrary Primed PCR Methods for Studying Bacterial Diseases. Molecular Bacteriology. Protocols and Clinical Applications. Totowa: Humana Press. 1998. p. 83 - 102.

261. Ramisse V., Balandreau J., Thibault F. et al. DNA-DNA hybridization study of Burkholderia species using genomic DNA macro-array analysis coupled to reverse genome probing I I Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. -Vol. 53. - P. 739-746

262. Rattanathongkom A., Sermswan R.W., Wongratanacheewin S. Detection of Burkholderia pseudomallei in blood samples using polymerase chain reaction // Mol. Cell Probes. 1997. - Vol. 11. - P. 25-31.

263. Ridley A.M. Genomic Fingerprinting by Application of rep-PCR. Molecular Bacteriology. Protocols and Clinical Applications. Totowa: Humana Press. 1998. -P.103-117.

264. Riecke K., Wagner S., Eller J. et al. Pulmonary melioidosis in a German Southeast Asia tourist // Pneumologie.- 1997. Vol.51, N.5. - P.499-502.

265. Rivers B., Steck T.R. Viable but nonculturable uropathogenic bacteria are present in the mouse urinary tract following urinary tract infection and antibiotic therapy II Urol. Res. 2001 .- Vol. 29. - P.60-66.

266. Rogul M., Brendle J.J., Haapala D.K. et al. Nucleic acid similarities among Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas multivorans and Actinobacillus mallei //J. Bacteriol. 1970. - V.101, N.3. - P.827-835.

267. Rolim D.B. Melioidosis, northeastern Brazil // Emerg. Infect. Dis. 2005. -Vol. 11.-P. 1458-1460.

268. Romero C.M., DeShazer D., Feldblyum T., et al. Genome sequence alterations detected upon passage of Burkholderia mallei ATCC 23344 in culture and in mammalian hosts // BMC Genomics. 2006. - Vol.7. - P.228.

269. Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al. Public health assessment of potential biological terrorism agents // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol.8, N.2.- P.225-230.

270. Ruppitsch W., Stöger A., Indra A. et al. Suitability of partial 16S ribosomal RNA gene sequence analysis for the identification of dangerous bacterial pathogens // J. Appl. Microbiol.- 2007. Vol.102, N.3. - P.852-859.

271. Schwartz D.C., Cantor C.R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis // Cell. 1984. - Vol.37. - P.67.

272. Sermswan R.W., Wongratanacheewin S., Tattawasart U. et al. Construction of a specific DNA probe for diagnosis of melioidosis and use as an epidemiological marker of Pseudomonas pseudomallei H Mol. Cell Probes -1994.-Vol. 8.-P.l-9.

273. Sermswan R.W., Wongratanacheewin S., Anuntagool N. et al. Comparison of the polymerase chain reaction and serologic tests for diagnosis of septicemic melioidosis // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2000. - Vol. 63.'- P. 146.

274. Sermswan R.W., Wongratanacheewin S., Trakulsomboon S. et al. Ribotyp-ing of Burkholderia pseudomallei from clinical and soil isolates in Thailand // Acta Trop. 2001. - Vol. 80. - P.237-244.

275. Sexton M.M., Goebel L.A., Dodfrey A.J., Choawagul W. Ribotype analysis of Pseudomonas pseudomallei isolates I I J. Clin. Microbiol. 1993. — N.31.-P.238-243.

276. Shrestha N., Sharma S., Khanal B. et al. Melioidosis imported into Nepal // Scand. J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 37. - P.64-66.

277. Sirisinha S., Anuntagool N., Dharakul T. et al. Recent developments in laboratory diagnosis of melioidosis II Acta Trop. 2000. - V.74. - P.235-245.

278. Slezak T., Kuczmarski T., Ott L. et al. Comparative genomics tools applied to bioterrorism defence // Brief Bioinform. 2003. - Vol.4, N.2.- P. 133-149.

279. Smith E.E., Buckley D.G., Wu Z. et al. Genetic adaptation by Pseudomonas aeruginosa to the airways of cystic fibrosis patients // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 2006. Vol.103. - P.8487-8492.

280. Smith M.D., Angus B.J., Wuthiekanun V., White,N.J Arabinose assimilation defines a nonvirulent biotype of Burkholderia pseudomallei II Infect Immun. 1997. - Vol.65. - P. 4319-4321.

281. Smith M. D., Wuthiekanun V., Walsh A. L., Pitt T.L. Latex agglutination test for identification of Pseudomonas pseudomallei // J. Clin.Pathol. -2003. Vol.46. - P.374-375.

282. Smith-Vaughan H.C., Gal D., Lawrie P.M. et al. Ubiquity of putative type III secretion genes among clinical and environmental Burkholderia pseudomallei isolates in Northern Australia // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P.883-885.

283. Sneath P.H., Sokal R.R. Numerical taxonomy: Principles and practice of numerical classification // San Francisco: Freeman , 1973. 573 p.

284. Sonthayanon P., Krasao P., Wuthiekanun V. et al. A simple method to detect and differentiate Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailan-densis using specific flagellin gene primers // Mol. Cell Probes 2002. -Vol. 16.-P.217-222.

285. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - Vol.98. - P.503-517.

286. Spratt B.G. Multilocus sequence typing: molecular typing of bacterial pathogens in an era of rapid DNA sequencing and the internet // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - Vol.2, N.3. - P.312-316.

287. Spratt B.G. Exploring the concept of clonality in bacteria // Methods Mol. Biol. 2004. - Vol. 266. - P. 323-352.

288. Srinivasan A., Kraus C.N., DeShazer D., Becker P.M. et al. Glanders in a military research microbiologist // New Engl. J. Med. 2001. - Vol.345. - P. 256-258.

289. Stanton A.T., Fletcher W. Melioidosis and its relation to glanders // J. Hyg.-1925.-Vol.23.-P.347-363.

290. Tanphaichitra D. Introduction of Pseudomonas pseudomallei (melioidosis) antigen into the gale Salmonella typhy TY 21 vaccine strains as carriers of melioidosis antigens to the immune system // J. Cell. Biochem. 1989.-N.13. - P.246-251.

291. Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., et al. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. -P.2233-2239.

292. Thepthai C., Dharakul T., Smithikarn S. et al. Differentiation between nonvirulent and virulent Burkholderia pseudomallei with monoclonal antibodies to the Ara+ and Ara- biotypes // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2001.-Vol.65. - P.10-12.

293. Thepthai C., Smithtikarn S., Suksuwan M. et al. Serodiagnosis of melioidosis by a competitive enzyme-linked immunosorbent assay using a- lipopoly-saccharide-specific monoclonal antibody // Asian Pac. J. Allergy Immun. -2005.-Vol. 23.-P. 127-32.

294. Thibault F.M., Hernandez E., Vidal D.R. et al. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents // J Antimicrob. Chemother. 2004. - Vol. 54. - P. 1134 -1138.

295. Thibault F.M., Valade E., Vidal D.R. Identification and discrimination of Burkholderia pseudomallei, B. mallei, and B. thailandensis by real-time PCR targeting type III secretion system genes // J. Clin. Microbiol. 2004. -Vol. 42. - P.5871-5874.

296. Thomas A.D. Evaluation of the API 20NE and Microbact 24E system for the identification of Pseudomonas pseudomallei II Vet. Microbiol. 1983. -Vol.8, N.6.-P.611-615.

297. Tomaso H., Scholz H.C., Al Dahouk S. et al. Development of 5' nuclease real-time PCR assays for the rapid identification of the Burkholderiamallei!I Burkholderia pseudomallei complex // Diagn. Mol. Pathol. 2004. -Vol. 13. -P.247-253.

298. Tomaso H., Pitt T.L., Landt O. et al. Rapid presumptive identification of Burkholderia pseudomallei with real-time PCR assays using fluorescent hybridization probes // Mol Cell Probes 2005. - Vol. 19. - P.9-20.

299. Tomaso H., Scholz H.C., Al D.S. et al. Development of a 5'-nuclease realtime PCR assay targeting fliP for the rapid identification of Burkholderia mallei in clinical samples // Clin. Chem. 2006. - Vol.52. - P.307-310.

300. Towbin H., Staehelin J., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications // Proc Natl Acad Sci USA. 1979. - Vol. 76. - P.4350-4354.

301. Trakulsomboon S., Pitt T.L., Dance D.A.B., Molecular typing of Pseudomonas pseudomallei from imported primates in Britain // Vet. Rec.- 1994.-N.35. P.65-66.

302. Trakulsomboon S., Dance D.A.B., Smith M.D. et al. Ribotype differences between clinical and environmental isolates of Burkholderia pseudomallei // J. Med. Microbiol. 1-997.- N.46.- P.565-570.

303. Trevino S.R., Permenter A.R., England M.J. et al. Monoclonal antibodies passively protect BALB/c mice against Burkholderia mallei aerosol challenge // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74. - P. 1958-1961.

304. Tungpradabkul S., Wajanarogana S., Tunpiboonsak S. et al. PCR-RFLP analysis of the flagellin sequences for identification of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia cepacia from clinical isolates // Mol. Cell Probes 1999. - Vol. 13. - P.99-105.

305. Turner K.M., Hanage W.P., Fraser C. et al. Assessing the reliability of eBURST using simulated populations with known ancestry // BMC. Microbiol. 2007. - Vol. 7. - P.30.

306. Ulett G.C., Currie B.J., Clair T.W. et al. Burkholderia pseudomallei virulence: definition, stability and association with clonality // Microbes. Infect. -2001.-Vol. 3.-P.621-631.

307. Ulrich M.P., Norwood D.A., Christensen D.R. et al. Using real-time PCR to specifically detect Burkholderia mallei II J. Med. Microbiol. 2006. - Vol. 55. - P.551-559.

308. Upadhyay A., Williams C., Gill A.C. et al. Biophysical characterization of the catalytic domain of guanine nucleotide exchange factor BopE from Burkholderia pseudomallei II Biochim Biophys Acta 2004. - Vol. 1698. -P.lll - 119.

309. U'Ren J.M., Van Ert M.N., Schupp J.M. et al. Use of a real-time PCR Taq-Man assay for rapid identification and differentiation of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei II J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. -P.5771 - 5774.

310. U'Ren J.M., Schupp J.M., Pearson T. et al. Tandem repeat regions within the Burkholderia pseudomallei genome and their application for high resolution genotyping II BMC. Microbiol. 2007. - Vol. 7. - P. 23.

311. Urwin R., Maiden M.C. Multilocus sequence typing: a tool for global epidemiology // Trends Microbiol. 2003. - Vol.11. - P.479-487.

312. Vadivelu J., Puthucheary S.D., Gendeh G.S., Parasakthi N. Serodiagnosis of melioidosis in Malaysia// Singapore Med. J. 1995. - Vol.36. - P.299-302.

313. Vadivelu J., Puthucheary S.D., Mifsud A. et al. Ribotyping and DNA macrorestriction analysis of isolates of Burkholderia pseudomallei from cases of melioidosis in Malaysia // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1997. - N 91. - P.358-360.

314. Vandamme P., Mahenthiralingam E., Holmes B. et al. Identification and Population Structure of Burkholderia stabilis sp. nov. (formerly Burkholderia cepacia Genomovar IV) I I J. Clin. Microbiol. — 2000. Vol.38. -P. 1042-1047.

315. Vandamme P. // Polyphasic Taxonomy in practice: the Burkholderia cepacia challenge // WFCC Newsletter. 2002. - Vol. 34. - P. 17-24. .

316. Velianov D., Kharbov D., Dimova I. Studies of R and S forms of Pseudomonas pseudomallei. I. Morphology of colonies and virulence for albino mice and guinea pigs // Acta Microbiol. Bulg. 1982. - Vol. 11. - P. 104.

317. Velianov D., Kharbov D., Dimova I. Studies of R and S forms of Pseudomonas pseudomallei. II. In vitro susceptibility to phagocytosis by human, guinea pig and chicken peripheral blood leukocytes // Acta Microbiol. Bulg. 1982.-Vol. 11.- P.109-113.

318. Versalovic J., Kapur V., Koeuth T., et al. DNA fingerprinting of pathogenic bacteria by fluorophore-enhanced Repetitive sequence-based polymerase chain reaction // Arch. Pathol. Lab. Med. 1995. - Vol.119. - P.23-29.

319. Vesaratchavest M., Tumapa S., Day N.P. et al.Nonrandom distribution of Burkholderia pseudomallei clones in relation to geographical location and virulence I I J. Clin. Microbiol. 2006 .- Vol.44, N.7. - P.2553-2557.

320. Wajanarogana S., Sonthayanon P., Wuthiekanun V. et al. Stable marker on flagellin gene sequences related to arabinose non-assimilating pathogenic Burkholderia pseudomallei II Microbiol. Immunol. 1999. - Vol. 43. - P. 995-1001.

321. Wanvarie S. Melioidosis: certain interesting presentations and treatment // Trop. Georgr. Med. 1984. - Vol. 36. - P.165-168.

322. Wattiau P., Van H.M-, Neubauer H. et al. Identification of Burkholderia pseudomallei and related bacteria by multiple-locus sequence typing-derived PCR and real-time PCR // J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol. 45. - P. 1045-1048.

323. Wheelis M. First shots fired in biological warfare // Nature. 1998. -N.395.-P.213.

324. White N. J. Melioidosis //Lancet. 2003. - Vol.361. - P.1715-1722.

325. Whitmore A., C. S. Krishnaswami C.S. An account of the discovery of a hitherto underscribed infective disease occurring among the population of Rangoon // Indian Med. Gazette. 1912 N.47. - P.262-267:

326. Whitmore A. An account of a glanders-like disease occurring in Rangoon // J. Hyg. 1913. -N.13. - P.l-34.

327. Wiersinga W.J., Vos A.F., Beer R. et al. Inflammation patterns of different Burkholderia species further characterize virulent and avirulent strains //

328. The 5th World melioidosis congress, November 21-23 2007, Khon Kaen, Thailand, 2007.-P.217.

329. Wigley P., Burton N.F. Genotypic and phenotypic relationships in Burkholderia cepacia isolated from cystic fibrosis patients and the environment // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol.86, N.3. - P.460-468.

330. Winstanley C., Morgan J.A.W. The bacterial flagellin gene as a biomarker for detection, population genetics and epidemiological analysis // Microbiology. 1997. - Vol.143. - P.3071-3084.

331. Winstanley C., Hart C.A. Presence of type III secretion genes in Burkholderia pseudomallei correlates with Ara (-) phenotypes // J. Clin. Microbiol.2000.-Vol.38. -P.883 -885.

332. Wongratanacheewin S., Komutrin K., Sermswan R.W. Use of multiplex PCR patterns as genetic markers for Burkholderia pseudomallei U Acta Trop. 2000. - Vol. 74. - P.193-199.

333. Woo P.C., Leung P.K., Tsoi H.W. et al. Cloning and characterisation of malE in Burkholderia pseudomallei I I J. Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50.-P.330-338.

334. Woo P.C., Leung P.K., Wong S.S. et al. groEL encodes a highly antigenic protein in Burkholderia pseudomallei II Clin. Diagn. Lab. Immunol.2001.- Vol. 8. P.832-836.

335. Woods D.E., Jeddeloh J.A., Fritz D.L. et al. Burkholderia thailandensis El25 harbors a temperate bacteriophage specific for Burkholderia mallei // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P.4003 - 4017.

336. Wuthiekanun V., Dance D.A.B., Chaowagul W. et al. Blood culture techniques for the diagnosis of melioidosis // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1990. - Vol.9. - P.654-658.

337. Wuthiekanun V., Desakorn V., Wongsuvan G. et al. Rapid immunofluorescence microscopy for diagnosis of melioidosis // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2005. - Vol. 12.- P.555-556.

338. Wuthiekanun V., Chierakul W., Rattanalertnavee J. et al. Serological evidence for increased human exposure to Burkholderia pseudomallei following the tsunami in southern Thailand // J. Clin. Microbiol. 2006. - Vol. 44. - P.239-240.

339. Yang S. Melioidosis research in China // Acta Trop. 2000. - Vol. 77. - P. 157-165.

340. Yap E.N., Chan Y.C., Ti T.Y.et al. Serodiagnosis of melioidosis off Singapore by the inderect hemagglutinatiotest // Singapore Med. J. 1991. -Vol.32, N.4.-P.211-213.

341. Yap E.H., Thong T.W., Tan A.L. et al. Comparison of Pseudomonas pseudomallei from humans, animals, soil and water by restriction endonuclease analysis // Singapore Med. J. 1995. - Vol. 36. - P.60-62.

342. Yee K.C., Lee M., Chua C.T. et al. Melioidosis the great mimicker: a report of 10 cases from Malaysia // J. Trop. Med. Hyg. 1988. - Vol. 91. - P. 249-254.

343. Yu Y., Kim H.S., Chua H.H. et al. Genomic patterns of pathogen evolution revealed by comparison of Burkholderia pseudomallei, the causative agent of melioidosis, to avirulent Burkholderia thailandensis // BMC Microbiology. 2006. - Vol.6. - P.46.

344. Zysk G., Spletstosser W.D., Neubauer H.A. Review on melioidosis with special respect on molecular and immunological diagnostic techniques // Clin. Lab. -2000. Vol.46. -P.l 19-130.