Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка основ молекулярно-генетического исследования возбудителя мелиоидоза и близкородственных буркхольдерий

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Разработка основ молекулярно-генетического исследования возбудителя мелиоидоза и близкородственных буркхольдерий"

На правах рукописи

ЗАМАРАЕВ Валерий Семенович

РАЗРАБОТКА ОСНОВ МОЛЕКУЛЯРНО - ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА И БЛИЗКОРОДСТВЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ

03.00.07 - микробиология 03.00.15 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Волгоград - 2004

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные консультанты:

доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Алексеев Владимир Валерьевич доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Меринова Людмила Константиновна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Мишанькин Борис Николаевич

доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич

доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи

рС>

Защита состоится « » 2005 г в часов на

заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г.Саратов, Университетская, 46).

Автореферат разослан «

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А.А.

%00Q>~4

\ъчог

Общая характеристика работы, актуальность проблемы

Прогресс в изучении биологии микроорганизмов в значительной мере связан с развитием генетических и молекулярно-биологических исследований. Результаты их в последние годы на моделях возбудителей инфекционных заболеваний существенно расширили наше представление о роли отдельных детерминант, имеющих отношение к реализации патогенности, их первичной структуре и генетической организации, механизмах патогенеза и формирования антибиотикоустойчивости микроорганизмов, что имеет основополагающее значение для разработки эффективных средств профилактики, лечения и диагностики инфекций.

В перечне опасных инфекционных заболеваний мелиоидоз и сап всегда занимали место экзотических инфекций с ограниченным ареалом распространения (Илюхин, 1985, Беляков и др., 1990; Beeching et al., 2000). В России, как и в других странах СНГ, не было зарегистрировано до сих пор ни одного достоверного случая мелиоидоза, но существуют эндемичные очаги в странах Восточной, Средней и Юго-Восточной Азии (Иран, Индия, Турция, Вьетнам, Таиланд, Сингапур, Китай и др.), с которыми они имеют обширные экономических и культурные контакты (Dodin, Galimand, 1986; Galimand, Dodin, 1982; Kanai, Deysirilert, 1988; Yap, 1991; Li et al., 1994; Suputtamongkol et al., 1994; Lim, 2004; Rolim et al., 2004)

В 70-х годах прошлого века произошло существенное изменение точки зрения на географию и эпидемиологию этой инфекции (Dodin, Ferry, 1974; Pourtaghva et al., 1975; Dodin, Galimand, 1976). Заболевание мелиоидо-зом людей и животных и выделение культур Burkholderia pseudomallei из внешней среды в Австралии, Франции, Италии, странах Центральной и Южной Америки показали всю серьезность проблемы его диагностики и лечения при почти непредсказуемых последствиях завоза возбудителя в страны с умеренным климатом (Ashdown, 1979; Galimand, 1982; Bremmelgaard et al., 1982; Беляков и др., 1990; Dance, 2004). Повышенное внимание мировой медицинской общественности к проблеме мелиоидоза подчеркивается проведением с интервалом в 3 года международных конгрессов в Бангкоке (1998), Перте (2001) и Сингапуре (2004).

Burkholderia mallei вызывает тяжелое инфекционное заболевание у человека и широкого круга животных. ~В отличие от мелиоидоза нозоареал сапа существенно сузился и прежде широко распространенный во Франции, Германии и России, в дальнейшем был практически ликвидирован. Но в некоторых из стран, в частности, Турции, Иране, Монголии и Италии, продолжает регистрироваться (Илюхин, 1985, Мельников, 1987). Заболеваемость сапом людей отмечается редко. Большие эпидемии не наблюдаются.

Учитывая высокую инфекциозность возбудителей мелиоидоза и сапа при аэрогенном заражении, формирова ^J*|>орм инфекций, трудности их диагностики и высокую летал .носпвцед^ф^^чита&ся с мнением

С. Петербург '

о»

......* ^гг м

отечественных и зарубежных специалистов, рассматривающих возможность применения B.pseudomallei и В.mallei в качестве биологического оружия и потенциальных агентов биотерроризма категории В (Тихонов, Липницкий, 2000; Christopher et al., 1997; Dance, 2000; Rotz et al, 2002). Не являясь для России эндемичными, мелиоидоз и сап включены постановлением Правительства РФ в «Перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих».

К буркхольдериям, имеющим медицинское значение, относят также В.cepacia и B.thailandensis - бактерии, генетически и фенотипически близкие к возбудителям сапа и мелиоидоза. В. cepacia может вызывать оппортунистические заболевания у больных с иммунодефицитными состояниями, осложнять тяжелые инфекционные процессы у человека и формировать внутри-больничные инфекции (Илюхин, 1985, Govan et al., 1996; Holmes et al., 1998). Сведения о выделении B.thailandensis от больных людей отсутствуют. Однако культуры B.thailandensis, выявленные во внешней среде эндемичных территорий, практически неотличимы от возбудителя мелиоидоза при использовании стандартных микробиологических схем и иммунологических тестов, что может приводить к ложноположительной диагностике.

Возбудители мелиоидоза и сапа достаточно долго оставались в числе сравнительно малоизученных. Методические приемы работы с нуклеиновым материалом, как хромосомным, так и внехромосомным, разработаны не были. Публикации, непосредственно относящиеся к генетике возбудителей сапа и мелиоидоза, касаются, прежде всего, работ по получению у обоих видов маркированных штаммов, а также изучению генетической трансформации и коньюгации (Ряпис, 1979; Шиповская, 1983; Абаев и др., 1992; Меринова, Сеимова, 1992; Меринова, 1997). Рядом авторов показана возможность конь-югационного переноса в клетки возбудителей сапа и мелиоидоза RP4 и некоторых других плазмид Р-1 группы несовместимости (Агеева, Меринова, 1986; Анищенко, Меринова 1992). В последние годы появились первые публикации о клонировании генетического материала возбудителя мелиоидоза (Абаев и др., 1997; Cheung et al., 2002; Chin et al., 2004). Однако системы клонирования на представителях патогенных буркхольдерий и возможность использования для этих целей известных векторных молекул только апробируются. Исследования собственных плазмид возбудителя мелиоидоза были начаты в Волгоградском НИПЧИ (Петере, 1982). Единичные публикации появившиеся позже о выявлении или невыявлении плазмидных репликонов у возбудителя мелиоидоза, не давали представления о закономерностях их распространения и функциональной значимости.

Молекулярно-генетические методы, влючающие гибридизацию нуклеиновых кислот, плазмидный анализ, полимеразную цепную реакцию (ПЦР), секвенирование геномов и др., находят все большее применение для анализа микроорганизмов и разработки современных средств их идентификации (Блохина и др., 1992; Антонов, 1995; Rosselo-Mora, 2001). ДНК-ДНК гибридизация, сводящаяся к определению сходства нуклеотидных последова-

тельностей, по-прежнему считается одним из наиболее результативных как в решении спорных вопросов систематики, так и при установлении таксономического положения трудно идентифицируемых обычными методами штаммов. Существенный прорыв в изучении буркхольдерий намечается в связи с секвенированием их геномов (Jenks, 1998; Chong et al., 2004; Shazleen et al., 2004). Проведенные исследования показали наличие у возбудителей мелиои-доза и сапа двух хромосом с существенным функциональным разделением генов между ними. Анализ нуклеотидных последовательностей буркхольдерий выявил множество гомологичных участков у B.pseudomallei и В. mallei, отсутствующих у B.thailandensis (Nierman et al., 2004; Holden et al., 2004). Сравнительное исследование вирулентных и авирулентных культур позволило определить набор генов, потенциально имеющих отношение к вирулентности, что открывает новые перспективы в изучении и понимании генетических механизмов реализации патогенности возбудителей мелиоидоза и сапа.

Рассматривая современные методы идентификации буркхольдерий, следует прежде всего отметить ПЦР, применение которой открывает новые возможности для установления эпидемиологических связей, прогнозирования эпидемической ситуации при изменении свойств циркулирующих штаммов (Гинзбург, Романова, 1998). Но, поскольку в большинстве работ по разработке ПЦР-систем для исследования различных клинических образцов при диагностике мелиоидоза и сапа отмечается низкая эффективность существующих амплификационных тест-систем (Bauernfeind et al., 1998; Haase et al., 1998; Kunakorn et al., 2000; Dance et al., 2004), очевидна актуальность их дальнейшего совершенствования и развития, тем более что до настоящего времени место ПЦР - анализа в общей схеме диагностики и индикации патогенных буркхольдерий не определено.

На основании изложенного, представляется необходимым проведение научных исследований, направленных на изучение геномной организации возбудителей данных инфекций, включая анализ внехромосомных реплико-нов, выявление детерминант, ответственных за реализацию патогенности, поиск видоспецифических последовательностей и разработку современных генотипических методов идентификации.

Настоящая диссертация содержит обобщенные материалы научно-исследовательских работ, выполненных в лаборатории молекулярной биологии Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в этих направлениях.

Цель работы заключалась в молекулярно-генетическом исследова-ниии B.pseudomallei и близкородственных видов с использованием гибриди-зационного, плазмидного, рестрикционного анализа, клонирования генетических детерминант и в разработке основ генетических методов идентификации патогенных буркхольдерий.

Задачи исследования:

1. Изучить уровень внутривидовой и межвидовой гомологии ДНК буркхольдерий и оценить значение гибридизационного анализа в качестве таксономического критерия.

2. Сконструировать многофункциональные плазмидные векторы, способные реплицироваться в клетках B.pseudomallei, В mallei, E.coli, B.subtilis, оценить их стабильность в этих видах микроорганизмов в зависимости от условий селекции.

3. Получить геномные библиотеки B.pseudomallei на основе плаз-мидных векторов и провести анализ рекомбинантных клонов E.coli с целью выявления генетических детерминант, имеющих отношение к реализации некоторых биологических свойств возбудителя мелиоидоза.

4. Осуществить поиск оптимальных методов плазмидного скрининга штаммов B.pseudomallei. Изучить плазмидный спектр штаммов возбудителя мелиодоза с оценкой стабильности наследования плазмид и возможности их использования в качестве маркеров для внутривидового типирования.

5. Разработать технику препаративного выделения плазмидных ДНК B.pseudomallei, провести гибридизационный, рестрикционный анализ и физическое картирование внехросомных репликонов микроорганизма.

6. Изучить возможность экспрессии криптических плазмид B.pseudomallei в близкородственных видах буркхольдерий: провести мобилизацию плазмидных репликонов и охарактеризовать стабильность и феноти-пические проявления их в рекомбинантных штаммах.

7. Осуществить клонирование фрагментов критических плазмид возбудителя мелиоидоза и провести анализ продуктов экспрессии в клетках E.coli с целью выявления генетических детерминант, имеющих функциональное значение.

8. Оценить эффективность метода генетической трансформации для идентификации патогенных буркхольдерий и значение анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) для внутривидовой дифференциации.

9. Разработать методические подходы к генодиагностике буркхольдерий с использованием ДНК-зондов на основе фрагментов криптических плазмид возбудителя мелиоидоза и полимеразной цепной реакции на основе последовательностей гена 23S рРНК.

Научная новизна:

Проведено молекулярно-генетическое изучение В pseudomallei и других представителей Burkholderia и разработаны подходы к идентификации патогенных буркхольдерий с использованием генотипических методов. На основании гибридизационного анализа установлен высокий уровень ДНК-гомологии B.pseudomallei, В. mallei и В thailandensis как свидетельство их таксономической близости. Филогенетическое родство данных видов под-

тверждается идентичностью их рекомбинационных систем, выявленной во взаимной генетической трансформации.

Впервые проведено изучение внехромосомных репликонов B.pseudomallei. Выделены и охарактеризованы четыре типа критических плазмид возбудителя мелиоидоза, отличающихся размерами и профилями рестрикции. Плазмиды стабильно наследуются в клетках микроорганизма в процессе хранения и пассирования штаммов in vitro и in vivo, что открывает перспективы использования плазмидного анализа для внутривидового типи-рования культур.

Впервые показано, что плазмидные репликоны одного типа, выделенные из штаммов B.pseudomallei различного географического происхождения, имеют идентичные рестрикционные профили. Все типы плазмид обладают выраженной взаимной гомологией и гомологией с ДНК близкородственных буркхольдерий В. mallei и B.thailandensis, проявляя себя в реакциях гибридизации как хромосомная ДНК B.pseudomallei, что позволяет рассматривать их в качестве резидентных плазмид возбудителя мелиоидоза.

Впервые осуществлено физическое картирование плазмид возбудителя мелиоидоза рРМ1 и рСМ2. Путем маркирования и клонирования между 10-й и 12-й координатами физической карты криптической плазмиды рРМ1 локализована область начала репликации и впервые показана возможность функционирования оп-региона плазмиды возбудителя мелиоидоза в штаммах E.coli.

Впервые идентифицирована детерминанта криптической плазмиды рРМ1, локализованная между 12-й и 0-й координатами физической карты, ответственная за изменение белкового состава наружной мембраны, развитие множественной антибиотикорезистентности и формирование у рекомбинант-ного штамма E.coli капсулоподобной структуры. Установлено, что белки наружной мембраны рекомбинантных клонов, специфически взаимодействующие с иммуноглобулинами поликлональной сыворотки к клеткам B.pseudomallei, способны к ассоциации в высокомолекулярные формы.

Впервые в составе криптической плазмиды рСМ2 идентифицирован Hind III - фрагмент размером 2,471 т.п.н., детерминирующий в рекомбинант-ном штамме E.coli синтез белка с молекулярной массой -100 кДа, специфически взаимодействующий с иммуноглобулинами B.pseudomallei. Секвениро-вание и анализ с использованием программы BLAST показали наличие гомологии данного фрагмента с представленными в GenBank нуклеотидными последовательностями плазмидных репликонов pSB102 (AJ304453.1) и pIP02T (AJ297913.2), детерминирующими синтез TraS (САС79161.1) и TraR (САС82765.1) белков, соответственно.

При анализе геномной библиотеки B.pseudomallei, полученной на векторе pBR325, отобраны клоны, обладающие в клетках рекомбинантных штаммов E.coli внеклеточной протеазной и гемолитической активностями, а также внеклеточной продукцией мелиоидозных антигенов, выявляемых в реакциях иммунопреципитации и иммуноэлектрофореза фильтратов бульон-

ных культур рекомбинантных штаммов с очищенными IgG и поливалентной мелиоидозной сывороткой. С использованием мультиплексной ПЦР показано наличие в рекомбинантных штаммах дополнительного ампликона размером 375 п.н., что свидетельствует о структурной перестройки их геномов.

С помощью мобилизующей плазмиды RPl::TnlO впервые осуществлена передача криптических плазмид В pseudomallei рСМ2 и рСМЗ в штамм В.mallei Ц4, определены плазмидные профили и изучены отдельные феноти-пические свойства полученных культур. Показано опосредованное влияние криптических плазмид возбудителя мелиоидоза на вирулентность трансконьюгантов.

В репликоне рРМ1 в пределах сайтов Pst I (5.4) - Bam HI (9.3) ее физической карты идентифицирован участок, обеспечивающий гомологичную ДНК-ДНК гибридизацию с геномами буркхольдерий. Находящийся в пределах данного участка Sal GI-фрагмент размером 0.4 т.п.н., испытанный в качестве ДНК-зонда и обнаруживший гомологию только с ДНК близкородственных микроорганизмов B.pseudomallei, В. mallei и В. cepacia, был проклониро-ван в составе фагового вектора М13тр18.

Практическая ценность:

Предложены методы скрининга штаммов B.pseudomallei на наличие внехромосомных репликонов и препаративного выделения плазмид возбудителя мелиоидоза, включенные в методические рекомендации «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза», утвержденные 1 ноября 1994г. зам. председателя Госкомсанэпиднадзора России Онищенко Г.Г. и подтвержденные патентом на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам №2218401 от 10.12.2003 г.

Предложен метод идентификации бактериальных и морфологически измененных форм патогенных буркхольдерий, вошедший в практические руководства «Мелиоидоз. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998), «Сап. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998) и подтвержденный авторским свидетельством Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий № 1190638 от 16.07.82г.

Сконструирован ряд многофункциональных плазмидных векторов, способных реплицироваться в B.pseudomallei, В.mallei, E.coli, В subtil is, охарактеризована их стабильность в клетках указанных видов микроорганизмов в различных селективных условиях. Практическая значимость векторов подтверждена авторскими свидетельствами Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий № 298237 от 3.07.89 г и № 322767 от 2.01.91 г.

Разработана технология мобилизации мелиоидозных плазмид в В mallei и получен набор рекомбинантных штаммов возбудителя сапа, содержащих криптические плазмиды рСМ2 и рСМЗ B.pseudomallei, предназначенных для изучения генетических детерминант и функциональной роли данных плазмид (Методические рекомендации «Применение мобилизации для пере-

дачи критических плазмид B.pseudomallei в гетерологичные виды», утвержденные директором Волгоградского научно - исследовательского противочумного института Тихоновым Н.Г. 20 апреля 1998 г.).

Отработаны системы клонирования и методы детекции генетических детерминант возбудителя мелиоидоза в кишечной палочке. Полученные рекомбинантные штаммы E.coli, экспрессирующие отдельных хромосомные и плазмидные признаки B.pseudomallei, депонированы в государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», а также поддерживаются в коллекционном центре живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

На основе фрагмента плазмидной ДНК возбудителя мелиоидоза рРМ1 сконструирован рекомбинантный фаг М13РМ, являющийся продуцентом группоспецифического ДНК-зонда для идентификации буркхольдерий путем введении метки техникой достройки секвенационного праймера. Разработанный метод вошел в методические рекомендации: «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика сапа», утвержденные 16 марта 1995 г. зам. председателя Госкомсанэпиднадзора России Онищенко Г.Г.; «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза», утвержденные 23 сентября 1994 г. зам. председателя Госкомсанэпиднадзора России Онищенко Г.Г., а также в практические руководства «Мелиоидоз. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998), «Сап. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998).

Разработаны методические подходы к ПЦР-диганостике буркхольдерий, вошедшие в «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму» (Волгоград, 2004). Путем анализа гена 23 S рРНК проведены первичные исследования по поиску видо- и группоспецифических праймеров для выявления патогенных буркхольдерий.

Материалы диссертации используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета, а также на курсах профессиональной переподготовки «Диагностика особо опасных инфекций, индикация возбудителей особо опасных инфекций, санитарная охрана территории и противоэпидемическая защита населения», «Особо опасные инфекции для лаборантов противочумной системы Министерства здравоохранения РФ»; на курсах повышения квалификации «Противодействие биотерроризму» и «Клиническая микробиология», проводимых в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте.

Положения, выносимые на защиту

1. На основании современных молекулярно-генетических технологий, включающих гибридизационный, плазмидный, рестрикционный анализы, клонирование генетических детерминант, разработаны методические подходы к изучению геномов возбудителя мелиоидоза и родственных ему буркхольдерий В. mallei и B.thailandensis и созданию средств их идентификации и типирования.

2. Штаммы возбудителя мелиоидоза содержат четыре вида плазмид, отличающихся размерами и рестрикциоными профилями, стабильно наследующихся в процессе хранения и пассирования культур in vitro и in vivo. Данные внехромосомные репликоны можно считать резидентными для возбудителя мелиоидоза на основании идентичности профилей рестрикции плазмид одного размера, выделенных из штаммов В pseudomallei отдаленных географических регионов, отсутствия ДНК-гибридизации с гетерологичными видами микроорганизмов, выраженной гомологии всех внехромосомных репли-конов между собой, а также с ДНК B.pseudomallei и ДНК родственных буркхольдерий (при отсутствии в них плазмид).

3. Ori-регион плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза способен функционировать в клетках кишечной палочки. Клонированная в E.coli последовательность ДНК плазмиды рРМ1, локализованная в пределах 12 и О координат её физической карты, детерминирует в штаммах кишечной палочки множественную резистентность к антибиотикам, формирование капсуло-подобной структуры и синтез дополнительных белков наружной мембраны, специфически взаимодействующих с мелиоидозной сывороткой.

4. Hind III - фрагмент, размером 2,471 т.п.н., плазмиды рСМ2 возбудителя мелиоидоза детерминирует в рекомбинантном штамме E.coli синтез белка с молекулярной массой -100 кДа, специфически взаимодействующего с иммуноглобулинами B.pseudomallei. Данный фрагмент обладает гомологией с представленными в GenBank нуклеотидными последовательностями плаз-мидных репликонов pSB102 и р1Р02Т, ответственными за синтез TraS и TraR белков.

5. Критические плазмидные репликоны рСМ2 и рСМЗ B.pseudomallei мобилизуются в штаммы близкородственного вида В.mallei коньюгатив-ными плазмидами PI группы несовместимости, стабильно наследуются в трансконъюгантах, как правило,-вместе с мобилизующими плазмидами, образуя в ряде случаев делеционные варианты и оказывая опосредованное влияние на вирулентность рекомбинантных штаммов возбудителя сапа.

6. Клонированные последовательности хромосомной ДНК B.pseudomallei обеспечивают рекомбинантным штаммам Е coli внеклеточную проте-азную и гемолитическую активности, а также внеклеточную продукцию ме-лиоидозных антигенов, выявляемую в реакциях иммунопреципитации, имму-ноэлектрофореза фильтратов бульонных культур рекомбинантных штаммов с очищенными IgG и поливалентной мелиоидозной сывороткой. Мультиплекс-

ная ПЦР обнаруживает в рекомбинантных штаммах дополнительный ампли-кон размером 375 п.н.

7. B.pseudomallei обладает высокой степенью ДНК-гомологии, а также сходством рекомбинационных систем с В mallei и В thailandensis. Феномен генетической трансформации, основанный на природной трансформабельно-сти возбудителя мелиоидоза, является эффективным методом идентификации B.pseudomallei, в том числе, в случаях латентного течения мелиоидозной инфекции, а также близкородственных буркхольдерий.

8. Фрагмент плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза, находящийся в пределах сайтов Pst I (5.4) - Bam HI (9.3) ее физической карты, обладает, гомологией с геномами буркхольдерий, выявляемой в ДНК-ДНК гибридизации. Рекомбинантный фаг М13РМ, содержащий Sal GI-фрагмент гомологичного участка криптической плазмиды, является продуцентом группоспецифиче-ского ДНК-зонда для идентификации буркхольдерий.

Апробация работы

Диссертация выполнена на основе 13 государственных плановых тем, в 9 из которых соискатель являлся научным руководителем. Основные результаты диссертации изложены в 45 опубликованных работах, в том числе в двух патентах, трех авторских свидетельствах, четырех коллективных монографиях и практическом пособии по подготовке врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. Материалы диссертации были представлены на 1-ой Всесоюзной конференции «Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология» (Москва, 1982), Российской научной конференции «Генетика и биохимия вирулентности особо опасных инфекций» (Волгоград, 1992), Российской научной конференции «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней» (Ставрополь, 1993), 7-ом международном конгрессе «Бактериология и прикладная микробиология» (Прага, 1994), международном симпозиуме «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1995), международной научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова (Харьков, 1995), научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997), научно-практической конференции «Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран СНГ» (Саратов, 1998), научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария.» (Киров, 1998), научной конференции, посвященной 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии» (Оболенск, 1999), 1-й научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000), VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), научно-практическом симпозиуме в рамках международной конференции «Геномика, протеомика и

биоинформатика для медицины» (Москва, 2002), IV всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), IV межгосударственной научно-практической конференции государств стран СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003). XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), на итоговых ежегодных научных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена в форме монографии на 279 листах машинописного текста, состоит из введения и 5 глав, включающих описание литературных данных и результаты собственных исследований, заключения и выводов. Работа содержит литературные ссылки и иллюстрации в виде 22 таблиц и 90 рисунков. Указатель литературы включает 312 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Таксономия, биология и генетика буркхольдерий

Таксономическое положение B.pseudomallei и B.mallei долгое время оставалось недостаточно ясным. По основным биологическим свойствам возбудители сапа и мелиоидоза в 8-ом и 9-ом изданиях определителя Bergey были включены в род Pseudomonas довольно размытого по своим таксономическим границам семейства Pseudomonadaceae (Palleroni, 1984).

Высокую степень фенотипического сходства между возбудителями сапа и мелиоидоза подчеркивают многочисленные исследования их антигенной структуры (Беляков и др., 1990; Илюхин, 1986; Пивень 1995), жирнокис-лотных профилей (Васкоренко и др., 1992; Kanai, Kondo, 1994), белковых спектров (Будченко, 1995; Пивень, 1997). Молекулярно-генетические исследования буркхольдерий свидетельствуют о высоком уровне генетического родства и филогенетической близости патогенных B.pseudomallei и B.mallei, а также B.thailandensis.

Как показал, проведенный нами гибридизационный анализ представительной коллекции гомологичных и гетерологичных микроорганизмов, ДНК большинства штаммов Вpseudomallei, В mallei и B.thailandensis обладают выраженной взаимной гомологией (рис. 1,2).

Только три мелиоидозных штамма (125, 127, Vang) и два сапных штамма (Олоф и Конный) не давали положительных сигналов радиоавтографа, что ставило под сомнение их принадлежность к указанным видам. Проверка других таксономических признаков данных штаммов и последующие исследования с применением группоспецифических ДНК-зондов и амплифи-кационных тест-систем, подтвердили данное предположение. Менее выраженная гомология обнаруживалась со штаммами В cepacia и некоторыми, так называемыми штаммами B.pseudomallei-like spp. - интенсивность пятна ра-

диоавтографа всегда была значительно слабее в сравнении с гомологичной гибридизацией.

О

Ф О

- B.pseudomallei

- B.mallei

- P.putida

- P. aeruginosa

e ф e

- P.maltophilia

- P.fluorescens

- B. cepacia

Рис. 1. Радиоавтограф внутривидовой и межвидовой гибридизации ДНК B.pseudomallei СШ.

Рис. 2. Радиавтограф гибридизации ДНК B.pseudomallei С141 с ДНК штаммов B.thailandensis.

1 - В thailandensis 251

2 - В thailandensis 264

3- B.thailandensis 265

4- B.thailandensis 295

5 - В. thailandensis 299;

6 - В pseudomallei CI 41;

7 - E.coli C600.

Что касается псевдомонад, в состав которых долгое время входили возбудители сапа и мелиоидоза, то ДНК-ДНК гибридизация буркхольдерий с ними отсутствовала (рис. 3).

Дальнейшее исследование буркхольдерий методами секвенирования рРНК и субтрактивной гибридизации подтвердили высокий уровень генетического родства и филогенетической близости B.pseudomallei, B.mallei и В thailandensis. Так, последовательность гена 16S рРНК двух биотипов Ага+ и Ara- B.pseudomallei имела различия, но они были меньше, чем различия между другими представителями рода Burkholderia. Последовательности же гена 16S рРНК возбудителей сапа и мелиоидоза оказались идентичными (Dharakul et al., 1999).

Рис.3. Радиоавтограф внутривидовой и межвидовой гибридизации хромосомной ДНК P. aeruginosa.

• - B.pseudomallei © - P.maltophilia

О -В. mallei Ф - P.fluorescens

е - P.putida ® - В.cepacia

О - P. aeruginosa

Результаты ДНК-ДНК гибридизации близкородственных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов согласовывались с полученными другими исследователями данными о высокой гомологии представителей буркхольдерий и подтверждали условность объединении их в один род с псевдомонадами. Позже Yabuuchi et al. (1992) основываясь на результатах секвенирования генов 16 S рРНК выступили с предложением о выделении 7 видов псевдомонад второй группы рРНК-ДНК гомологии в самостоятельный род Burkholderia

Установление таксономического положения буркхольдерий имеет прямое отношение к генодиагностике, так как во многом определяет круг близкородственных и гетерологичных микроорганизмов, с которыми необходимо проводить дифференциацию, определяя специфичность вновь создаваемых систем и способов диагностики мелиоидоза и сапа.

Буркхольдерии характеризуются рядом общих признаков: грамотрица-тельные, полиморфные палочковидные бактерии, подвижные (за исключением В mallei), не образующие спор, хемоорганотрофы, аэробы, с окислительным неферментативным типом дыхания. Антигенная структура возбудителя мелиоидоза сложна. Выделяют соматический О-антиген, жгутиковый Н-антиген, слизистый М-антиген, капсульный К-антиген, О- и К-антигены, родственные одноименным антигенам возбудителя сапа. Термостабильный О-антиген обладает всеми свойствами эндотоксина грамотрицательных бактерий. Довольно подробно изучены преципитиногены В pseudomallei, референтная система которых в иммуноэлектрофорезе включает 19 антигенов, охарактеризованных по физико-химическим свойствам (Пивень, 1997). Антигенная структура возбудителя сапа изучена в основном в сравнительном аспекте с возбудителем мелиоидоза. Это объясняется практически полной тождественностью антигенного спектра этих возбудителей.

Наличие природной компетентности у возбудителя мелиоидоза позволило использовать метод генетической трансформации для картирования на хромосоме отдельных генов и различных групп сцепления генов В pseudomallei (Тарасова, Ряпис, 1983). С помощью мутагенеза, индуцированного мутагенами и тан-спозонами, получен набор полимаркированных штаммов патогенных буркхоль-дерий с зависимостью от аминокислот и азотистых оснований, а также штаммов В pseudomallei, дефектных по протеазам, антигену 8, подвижности и штаммов с измененной вирулентностью (Шиповская и др., 1983; Меринова, 1997). Возбудитель мелиоидоза может быть трансформирован плазмидными ДНК RP4, RSF1010 в системе естественной компетентности, а также посредством криотрансформа-ции или обработки клеток двухвалентными катионами (Кучеряева и др., 1989; Абаев и др., 1992, 1995). Исследована сравнительная реципиентная активность штаммов В. mallei и В pseudomallei по отношению к природным и рекомбинант-ным плазмидам. Показана возможность коньюгационного переноса в клетки возбудителей сапа и мелиоидоза RP4 и некоторых других плазмид Р-1 группы несовместимости (Агеева, 1986; Анищенко, Меринова, 1992). Плазмиды данной группы несовместимости обладают способностью к интеграции с хромосомой и могут осуществлять мобилизацию хромосомных маркеров (Меринова, Сеимова, 1992). В последние годы появился ряд публикаций о клонировании генетического материала возбудителя мелиоидоза и его экспрессии в гетерологичных видах микроорганизмов Сконструированы библиотеки геномных ДНК В psedomallei С-141 и В.mallei Ц-5 (Абаев и др., 1997).

В настоящее время состояние изученности патогенности В.pseudomallei находится в основном на уровне разрозненных экспериментальных фактов, свидетельствующих, тем не менее, что патогенез мелиоидоза определяется не каким-либо одним доминантным фактором, а является, по сути, полидетерминант-ным. Детерминанты патогенности возбудителя разделяют на три категории. Первая группа объединяет факторы, связанные с клеточной структурой, куда помимо О-антигена, фимбрий и жгутиков, входят кислая фосфатаза и экзополисаха-рид. Вторая группа включает секретируемые детерминанты - сидерофор (малле-обактин), протеазы, фосфолипазу С, каталазу, каталазу-пероксидазу, суперок-сиддесмутазу (Беляков и др., 1990). Третья - факторы, обеспечивающие сывороточную устойчивость и наличие III типа секреции. В фильтратах бульонных культур было выявлено, по меньшей мере, два термолабильных фактора с токсическим эффектом. Один из них - так называемый летальный токсин, второй -дермонекротический токсин, который по своей природе относился к протеазам и вызывал при внутрикожном введении глубокий некроз кожи и прилежащих тканей. Общепризнано, что определенную роль в патогенности возбудителя выполняет экзополисахаридная (150 кДа) капсула, обладающая явным антифагоцитарным эффектом, позволяющая бактериальным клеткам не только сохраняться, но и размножаться внутриклеточно. Описана мукоидная субстанция, несомненно, обладающая функцией защиты микробной клетки от фагоцитоза, иммуноглобулинов и других антибактериальных средств.

Секвенирование генома B.pseudomallei вызвало поток сообщений о выявлении геномных островов и целого ряда нуклеотидных последовательностей, которые обеспечивают «геномную пластичность» возбудителя, проявляющуюся в универсальных механизмах приспособляемости к внешним воздействиям и полипатогенности (Holden et al., 2004). Показано наличие двух хромосом у возбудителей мелиоидоза и сапа, а анализ геномов буркхольдерий выявил множество гомологичных участков у B.pseudomallei и B.mallei, отсутствующих у В thailandensis. Хромосомы В mallei, в отличие от B.pseudomallei, содержат большое количество IS-последовательностей, вызывающих существенные реорганизации генома, которыми, по-видимому, и объясняется имеющаяся феноти-пическая разница этих двух микроорганизмов при высокой генетической идентичности (Songsivilai et al., 1998; Nierman et al., 2004). Анализ нуклеотидных последовательностей B.pseudomallei выявил целый ряд гомологов с известными детерминантами, имеющих возможное значение для реализации патогенетических функций. Полученные данные во многом совпадают с ранее сложившимися представлениями о патогенезе мелиоидоза.

Генетическая природа лекарственной устойчивости B.pseudomallei изучена недостаточно. Устойчивость к препаратам, быстро возникающую непосредственно во время лечения, объясняют существованием системы выброса лекарственных препаратов, гомологи к которой обнаружены в геноме возбудителя мелиоидоза.

Анализ полных нуклеотидных последовательностей буркхольдерий, выполненный с использованием известных компьютерных программ в большей степени путем поиска гомологов, дает скорее предполагаемые результаты и требует дополнительных исследований и экспериментальных подтверждений. Однако полученные данные позволяют подойти вплотную к выяснению механизмов, лежащих в основе биологических особенностей патогенных буркхольдерий, в том числе таких, как лекарственная устойчивость, высокие адаптационные возможности и полипатогенность возбудителя мелиоидоза.

2. Плазмиды возбудителя мелиоидоза

Значительную роль в биологии и изменчивости у микроорганизмов играют внехромосомные факторы наследственности, обеспечивая приспособляемость к разнообразным условиям существования в природе, устойчивость к различным химиопрепаратам, катаболизм органических соединений и кодирование бактериоцинов. Плазмиды участвуют в рекомбинационных и репарационных процессах бактериальной клетки, а также детерминируют патогенные свойства возбудителей инфекционных заболеваний (Воронин, 1983; Илюхин, 1985; Куты-рев и др., 1986; Проценко и др., 1992)

В характеристике B.pseudomallei можно выделить целый ряд свойств, которые могли бы быть обусловлены внехромосомными факторами наследственности. Подверженные значительной вариабельности данные свойства подтверждают высокий потенциал изменчивости возбудителя мелиоидоза, обусловленный по мнению некоторых авторов структурно - функциональными особен-

ностями генома В pseudomallei, проявляющихся в форме мутаций или рекомби-национных механизмов с участием в том числе бактериофагов и плазмид (Беляков и др., 1990). К очевидным показателем адаптационной изменчивости, как результата эволюционно сформировавшегося способа реагирования на существование в непостоянных условиях среды обитания, можно отнести способность данного вида к росту в широком интервале температур и его полипатагенность (Замараев, Ряпис, 1982; Stocki, Woods, 2004). В pseudomallei отличает высокая усточивость к антибиотикам и химиопрепаратам, что создает серьезные проблемы при лечении этого заболевания (Мишанькин, Гольдберг, 1969; Hohl, 1986; Антонов и др., 1991; Moore et at., 2004). Ярко выражено у возбудителя мелиоидо-за и такое вариабельное свойство как морфологическая диссоциация, проявляющаяся в формировании на плотных питательных средах колоний трех типов. Механизм диссоциативного процесса до настоящего времени не ясен, хотя разными авторами и высказывались предположения либо о мутационном происхождении этого явления, либо в результате селективных процессов в антагонистической популяции. Возбудитель мелиоидоза способен использовать для роста ароматические соединения, а также обладает природной резистентностью к солям некоторых тяжелых металлов. Устойчивость к ним косвенно подтверждается и тем, что В.pseudomallei способен к росту на отдельных фракциях нефти также хорошо, как и P. aeruginosa, у которой такая способность детерминирована вне-хромосомными репликонами.

Что касается В. mallei, то диапазон его естественной изменчивости практически по всем исследованным свойствам значительно уже, чем B.pseudomallei, известного как свободноживущий вид. Возбудитель сапа в природных условиях не способен к длительному существованию вне макроорганизма. По-видимому, следствием этого являются менее выраженная резистентность данного вида к антибактериальным агентам, сужение температурного диапазона роста, низкая ферментативная активность, отсутствие фагов и ограниченный круг чувствительных животных (Беляков и др., 1990) Все это характеризует возбудитель сапа как микроорганизм со слабым уровнем приспособительных реакций.

Исследование собственных плазмид буркхольдерий было начато в Волгоградском НИПЧИ (Петере, 1982). Наличие плазмидных репликонов у возбудителя мелиоидоза было отмечено в кратком сообщении Tanphaichitra D. (1989) о передаче плазмиды В pseudomallei в Salmonella typhi и последующем серологическим выявлением у нее антигенов мелиоидозного микроба, а также в работе Jigen J. и Li L. (1992), в которой отмечен не только факт обнаружения в 7 штаммах возбудителя мелиоидоза криптической плазмиды, размером 28,44 т.п.н., но и показана связь с геграфическим регионом, в котором обнаружен плазмидсодер-жащий штамм. У В cepacia, одного из близкородственных B.pseudomallei микроорганизмов, обнаружены плазмиды биодеградации органических соединений, гербицидов, а также плазмиды, детерминирующие устойчивость к ряду неорганических соединений (Воронин, 1983; Смирнов, Киприанова, 1990). Известно, что возбудитель мелиоидоза также обладает целым рядом уникальных свойств,

позволяющих ему персистировать и даже размножаться во внешней среде (Inglis et al., 2000; Hassan et al, 2004; Tuanyok et al., 2004).

Методические приемы, направленные на изучение внехромосомных факторов наследственности у буркхольдерий оставались недостаточно разработанными. Эффективность плазмидного анализа, как известно, во многом зависит от выбранного метода выделения плазмидных ДНК, имеющего свои особенности для каждого конкретного вида микроорганизма. В основе большинства существующих методик выделения внехромосомных репликонов из бактериальных клеток лежит принцип избирательной щелочной денатурации хромосомной ДНК (Харди, 1989). Анализ литературы позволяет отметить, что однозначного мнения и рекомендаций по методам выделения плазмидной ДНК из штаммов возбудителя мелиоидоза до сих пор не существует. При использовании общепринятых методик выделения плазмид при работе с культурами B.pseudomallei первоначально нами были выявлены плазмиды возбудителя мелиоидоза только небольшого размера (рРМ1). При выделении высокомолекулярных плазмид отмечалась недостаточная чистота и плохая растворимость препаратов плазмидной ДНК, а также изменение подвижности и количества полос при электрофоретическом исследовании, что, возможно, было обусловлено существованием в клетках прочного комплекса белок - плазмидная ДНК. Отчасти, это подтверждалось значительной деградацией плазмидного материала при повторных фенольных экстракциях. Высокомолекулярные плазмиды при использовании рутинных методов выделения были обнаружены только в единичных штаммах возбудителя мелиоидоза.

С целью совершенствования методик выделения плазмидных ДНК из B.pseudomallei были апробированы различные условия подготовки культур (питательные среды, длительность и температура культивирования) и условия лизиса клеток (плотность клеточной суспензии, pH лизирующего раствора, температура, время и интенсивность механических воздействий при обработке лизата). Внесенные модификации способствовали оптимизации плазмидного скрининга, а также препаративного выделения внехромосомных репликонов из штаммов возбудителя мелиоидоза.

При проведении плазмидного анализа в штаммах B.pseudomallei, хранящихся в коллекционном центре Волгоградского НИПЧИ, было обнаружено 4 типа плазмид, отличающихся по электрофоретической подвижности, обозначенных pPMl, рСМ2, рСМЗ и рСМ4 (рис. 4, таблица 1). Плазмиды рСМЗ и рСМ4 при скрининге имели примерно одинаковую электрофоретическую подвижность и отличие между ними было выявлено только при последующем рестрикцион-ном анализе.

Рестрикционный анализ позволил определить размеры плазмид и показать идентичность профилей рестрикции плазмидных репликонов одного размера, независимо от места и времени выделения штаммов (рис. 5). Ориентировочные размеры плазмид, выявленных в штаммах B.pseudomallei, составили для pPMl - 13 т.п.н., рСМ2 - 43,5 т.п.н., рСМЗ - 168 т.п.н., рСМ4 - 160 т.п.н. Ни в одном штамме В mallei внехромосомные репликоны выявлены не были.

Рис. 4. Электрофореграмма плазмидного состава штаммов В.р$еис1ота1Ш, выделенных из различных географических регионов.

1 - В.ряеийотаНех 110 (рСМ4)Австрапия;

2 - В.рзеис1ота11е1 134 (рСМЗ)Таиланд;

3 - В рзеис1ота1Ш 118 (рСМЗ)Австралия,

4 - В ряеис1ота1Ы 111 (рСМ2)Австрапия;

5 - В ряеиЛотаНе! 56812(рСМ2)Въетнам;

6 - Врзеш1ота11е1 133(рРМ1, рСМ2)Ташанд

НшШ

НтеШ!

ЕсоШ

Рис. 5. Электрофореграмма рестрикции ДНК плазмид, выделенных из

штаммов В.ряеи<1ота11е{ различного географического происхождения.

9 -рСМ4(Австралия)

1,4,7 - ДНК X /НтсЧП,

2 - рСМ2( Австралия),

3 - рСМ2( Вьетнам),

5 - рСМЗ(Австралия),

6 - рСМЗ (Таиланд), 8 - рСМЗ(Таиланд),

Таблица 1.

Плазмидный состав штаммов Вр$еис1ота1Ш, выделенных из различных географических регионов

Штамм Место Выделения Наличие плазмид |

рРМ1 рСМ2 рСМЗ рСМ4 I

56770 Вьетнам +

56812 Вьетнам , +

56830 Вьетнам +

59214 Вьетнам +

59437 Вьетнам +

60263 Вьетнам +

60806 Вьетнам +

60913 Вьетнам +

611083 Вьетнам +

98 * +

100 * +

110 Австралия +

111 Австралия +

114 Австралия +

118 Австралия +

128 * +

129 * +

130 * +

132 Таиланд +

133 Таиланд +

134 Таиланд +

136 Таиланд +

139 Таиланд +

ВКМ-900 * +

I ССЕВ-860 * +

| % штаммов 20,0 48,0 32,0 4,0

Примечание: (*) - данные отсутствуют.

На данный момент времени эти плазмиды следует рассматривать как криптические, так как плазмидсосдержащие и бесплазмидные штаммы возбудителя мелиоидоза ничем принципиально не отличались. Не была выявлено корреляции между наличием плазмид и географическим регионом выделения штаммов возбудителя мелиоидоза. Так, плазмидная ДНК, обозначенная рСМ2, достаточно часто встречалась в штаммах ВрБвийотаНе'ь, выделенных во Вьетнаме. В то же время, данная плазмида была обнаружена в штаммах, выделенных в Австралии и Таиланде. В свою очередь, плазмида рСМЗ, выявлялась в штаммах возбудителя мелиоидоза, выделенных в Австралии и Таиланде, то есть удаленных друг от

друга географических регионах. Наличие плазмиды рРМ1 было характерно для штаммов В pseudomallei, выделенных как в Таиланде и Вьетнаме, так и в Австралии. Обращает внимание, что в штаммах, хранящихся длительное время в музейных условиях (более 20 лет), отсутствовали крупномолекулярные плазмиды рСМЗ и рСМ4.

Стабильность наследования плазмид изучали путем многократных пересевов плазмидосодержащих штаммов на плотных и жидких питательных средах, в том числе в условиях повышенной температуры, а также после пассажа на чувствительных к мелиоидозу лабораторных животных.

При клоновом анализе штаммов в течение 30 суток культивируемых на питательных средаах с ежедневным пересевом выявляли единичные клоны, лишенные искомых плазмид (от 1 до 6 %), в зависимости от исследуемого штамма возбудителя и питательной среды. При анализе плазмидсодержащих штаммов, однократно пассированных через лабораторных животных, плазмиды обнаружены во всех исследуемых клонах микроорганизма. Не исключено, что при пассаже in vivo происходит селекция клонов, содержащих плазмидную ДНК.

Известно, что размножение возбудителя мелиоидоза возможно в широком диапазоне температур от 14 до 44° С. Исходя из того, что температурный фактор может служить регулятором репликации и фенотипической экспрессии внехромосомных репликонов, была изучена способность штаммов возбудителя мелиоидоза к наследованию плазмидных ДНК в зависимости от температурных условий культивирования микроорганизма. Одновременно, учитывая наличие лизогении у части штаммов возбудителя мелиоидоза и отсутствие данных о взаимоотношения фагов с криптическими мелиоидозными плазмидами, проводили изучение спонтанной фагопродукции.

Плазмидсодержащие штаммы подвергали культивированию в течение 10 суток при 42 °С с ежедневным пересевом в жидкой питательной среде BHI («Difco», США), последующим высевом на аналогичную плотную среду и кло-новым анализом.

Как выяснилось, такой режим культивирования приводил к изменению морфологии колоний исследуемых штаммов. Отмечалось уменьшение шероховатых и увеличение мукоидных и гладких форм колоний. Кроме того, эти штаммы утрачивали способность к фагопродукции. Последующее их выращивание при 37 °С приводило к восстановлению исходного соотношения морфологических вариантов колоний и способности микробных клеток к спонтанной фагопродукции. Плазмидный скрининг указывал на сохранение плазмиды рРМ1 у 100% клонов и элиминацию плазмиды рСМ2 через 10 суток культивирования при высокой температуре - в автономном состоянии её удалось выявить лишь у единичных клонов. Следовательно, температура культивирования определяет направление диссоциативного процесса, частоту индукции профагов, а также может влиять на наследование плазмидных репликонов клетками В pseudomallei, по меньшей мере, в отношении плазмиды рСМ2. Следует отметить, что после пассажа данных штаммов, в значительной мере утративших

рСМ2, на золотистых хомячках и последующем клоновом анализе указанная плазмида была обнаружена во всех изолятах, выделенных от животных. Это опять-таки подтверждает селективность условий in vivo для плазмидосодержа-щих штаммов.

Для установления биологических особенностей плазмид и их эволюционной близости к возможному кругу хозяев, важное значение имеют знания о гомологии нуклеотидных последовательностей плазмидных репликонов с геномной ДНК вида, из которого получены плазмиды, и с хромосомной ДНК близкородственных и гетерологичных видов микроорганизмов. Исходя из этого, нами был проведен ряд экспериментов по ДНК-ДНК гибридизации с использованием в качестве ДНК-зондов нуклеотидных последовательностей плазмид возбудителя мелиоидоза.

Анализ радиоавтографов свидетельствовал, что все исследуемые плазмиды возбудителя мелиоидоза обладали взаимной гомологией (рис.6). Результаты ДНК-ДНК гибридизации плазмид pPMl, рСМ2, рСМЗ и рСМ4 были аналогичными.

Рис. 6. Радиавтограф гибридизации криптической плазмиды pPMl с

нативными плазмидами рСМ2, рСМЗ, рСМ4 и плазмидными

ДНК, выделенными из гетерологичных микроорганизмов.

1-рРМ1 (Bpseudomallei); 6- рХОЦВ anthracis);

2-pBR322 (E.coli); 7- pX02(B.anthracis);

3-pCM4 (Вpseudomallei); 8- pUBHO (B.subtilis);

4-pCM3(B pseudomallei); 9- ДНК B.mallei;

5-pCM2(B pseudomallei); 10- ДНК B.pseudomallei.

Таким образом, наличие взаимной гомологии плазмидных репликонов B.pseudomallei подтверждает генетическое родство исследуемых мелиоидозных плазмид, выделенных из различных штаммов возбудителя, отличающихся, в том числе, географическим происхождением,.

Выполняя значительную роль в обмене генетической информацией между бактериями многие плазмиды имеют широкий круг хозяев и могут быть переданы во многие бактериальные виды путем коньюгационного переноса, мобилизации или трансформации. С целью установления филогенеза криптических плазмид представлялось целесообразным определить наличие или отсутствие у

них гомологии с хромосомными ДНК буркхольдерий и гетерологичных видов микроорганизмов.

В результате исследований не было выявлено достоверной разницы в гибридизационной активности всех четырех исследованных мелиоидозных плазмид, использованных в качестве ДНК-зондов. Все плазмиды возбудителя мелиоидоза гибридизовались с геномной ДНК всех исследованных штаммов В pseudomallei, В.mallei и B.thailandensis (рис. 7). В реакции ДНК-ДНК гибридизации со штаммами В cepacia всегда отмечался менее выраженный сигнал радиоавтографа.

• • •

• • • • • •

i

* •

• • • • •

Hi f

Рис.7. Радиавтограф внутривидовой и межвидовой ДНК-ДНК - гибридизации критической плазмиды рСМ2.

I —ДНКрСМ2; 152 - B.pseudomallei 56770; 16-3-B.mallei ¡0230; 174 -B.pseudomallei 56812, 18

5-Еcolt С600, 19

6-В mallei Ц4, 20-

7-В mallei Ц5, 218- В mallei Загреб; 22-

9-Рaeruginosa 4000; 23-

10-В mallei Будапешт; 24 -

II - В mallei Иванович; 25 -

12 - В mallei Муксувар; 26 -

13 -В.серасш 25416, 2714- В. thailandensis 264, 28 -

B.thailandensis 265; В thailandensis 251; B.pseudomallei 59214; В pseudomallei 59426, B.pseudomallei 60806, В pseudomallei 60913; В pseudomallei 98, Pputida 973; P maltophilia 13637; В cepacia 8236; В pseudomallei 100; В pseudomallei 110; B.pseudomallei 111; В pseudomallei 114,

29 - B.mallei 8;

30 - B.pseudomallei 118;

31 — B.anthracis Sterne;

32 - В pseudomallei 128;

33 - B.pseudomallei 130,

34 - В pseudomallei 132,

35 - В pseudomallei 134,

36- В subtilis 168;

37- В cepacia 8237;

38- В pseudomallei 133;

39-В pseudomallei BKM-900;

40- В pseudomallei CCEB-860

Таким образом, плазмидные ДНК, обнаруженные у возбудителя мелиоидоза, в реакциях гибридизации проявляли себя также, как и хромосомная ДНК В pseudomallei. Это, с одной стороны, подтверждает генетическое родство буркхольдерий, а с другой стороны позволяет сделать предположение, что плазмидные репликоны, выявленные у возбудителя мелиоидоза, обладают филогенетической близостью с геномной ДНК B.pseudomallei Последующий гибридизаци-онный анализ Ваш HI, Pst I, Sal Gl- рестрикционных фрагментов плазмиды воз-

будителя мелиоидоза pPMl показал, что гомологичную ДНК-ДНК гибридизацию с геномами буркхольдерий обеспечивает участок данной плазмиды, расположенный в пределах сайтов Pst I (5.4) - Bam HI (9.3) ее физической карты. Обращает на себя внимание, что данный участок чрезвычайно насыщен сайтами рестрикции в инвертированном состоянии.Известно, что возбудителю мелиоидоза свойственна полилизогения. При этом круг хозяев для мелиоидозных бактериофагов совпадает с группой ДНК-ДНК гомологии криптических плазмид (Гришкина, 1996). Рестрикционный анализ (ПДРФ) позволил обнаружить достоверные различия ДНК мелиоидозных фагов и плазмид. Отрицательный результат взаимной дот-гибридизации достаточно убедительно подтвердил, что плазмиды и бактериофаги возбудителя мелиоидоза не имеют гомологии.

Таким образом, выявление плазмид в штаммах, которые длительное время хранились в условиях музея и пассировались на различных питательных средах в отсутствие селективных условий, а также выявление идентичных плаз-мидных репликонов в штаммах, выделенных в географически не связанных регионах, указывает на стабильное наследование плазмид B.pseudomallei и открывает возможности использования плазмидного анализа для внутривидового ти-пирования штаммов, позволяя дополнить паспортные данные культур возбудителя мелиоидоза сведениями о плазмидном составе.

3. Структурно-функциональная организация плазмид возбудителя мелиоидоза

Одним из первых этапов исследования плазмид является изучение их физической структуры и построение рестрикционных карт. Картирование проводили путем гидролиза ДНК плазмид единичными рестриктазами, а также комбинациями из двух ферментов в различных сочетаниях с последующим электрофо-ретическим анализом полученных фрагментов. В целях детализации структуры отдельных участков проводили рестрикционный анализ клонированных или элюированных фрагментов, а также секвенирование нуклеотидных последовательностей. Размеры фрагментов определяли с использованием внешних стандартов молекулярных масс путем компьютерной интерполяции и регрессивного анализа с использованием компьютерной программы RFLPscan, Plus Version 3.12 (CSP Inc.).

Для построения физических карт использовали метод ветвей и границ (Fitch et al., 1983). Числовые значения величин рестриктов при совместном гидролизе позволили построить набор карт парных~рестрикций, уточнить взаимное расположение сайтов узнавания и размеры получаемых фрагментов. Учитывая вычислительные трудности при прямом переборе гипотез, множественная физическая карта плазмиды рСМ2 строилась с применением специализированного программного обеспечения DNASIS for Windows Ver 2,5 (Hitachi Software Engineering Co. Ltd). Результаты этого этапа работ проверены выборочными расчетами без применения ЭВМ и визуальным анализом. В качестве дополнительных экспериментальных данных при выбраковке гипотез множественного расположения сайтов рестрикции привлечены результаты секвенирования фрагмента

pCM2 Hind III размером 2,5 т.н.п., что позволило в значительной степени уточнить параметры полученной карты. Размеры криптических плазмид рРМ1 и рСМ2 составили 12,95 и 52 т.п.н., соответственно (рис. 8).

Рис. 8. Рестрикционные карты плазмид рРМ1 и рСМ 2.

Физическое картирование плазмид возбудителя мелиоидоза открывает возможности дальнейшего изучения генетической и функциональной организации данных внехромосомных репликонов с использованием клонирования и секвенирования отдельных фрагментов, необходимых для выявления генетических детерминант и оценки их функциональной роли.

В целях локализации на физической карте плазмиды рРМ1 региона, ответственного за инициацию репликации, была получена рекомбинантная плаз-мида pSIlO, состоящая из неполного ВатШ-фрагмента ДНК рРМ1 и детерминанты резистентности к канамицину, изолированной из плазмиды pUC4K. Поскольку векторная часть рекомбинантной молекулы не содержала точку начала репликации были все основания полагать, что репликативные функции плазмиды pSIlO обеспечиваются origin, проклонированным из рРМ1. Сопоставление данных рестрикционного анализа pSI 110с физической картой критической плазмиды позволило сделать вывод о наличии в рекомбинантной плазмиде частично делегированного 5,2 т.п.н. ВатШ-фрагмента ДНК рРМ1. Размер вставки составлял около 2 т.п.н. Наличие фрагмента плазмиды рРМ1 в дальнейшем было подтверждено дот-гибридизацией (рис 10). Таким образом, была обнаружена и локализована область начала репликации рРМ1 между 10-й и 12-й координатами ее физической карты и впервые показана возможность функционирования origin собственной плазмиды B.pseudomallei в клетках Е coli.

В целях выяснения функциональной роли критической плазмиды возбудителя мелиоидоза рРМ1 был проведен анализа возможных продуктов ее экспрессии в кишечной палочке. Для получения представительной библиотеки клонировали перекрывающиеся фрагменты плазмидной ДНК, образующиеся при

Bglll Kpnl EcoRV Sail

рестрикции эндонуклеазами BamHI, Sal I, Kpn I, на мультикопийных векторах pBR322 и pUC19 (рис. 9).

При изучении рекомбинантных плазмид, охватывающих область карты pPMI с координатами 1.0 - 10.1, не удалось идентифицировать какие-либо генетические детерминанты. Попытки проклонировать BamHI- SalGI- Pstl- фрагменты плазмиды pPMI, включающие участок в пределах координат физической карты от 12.0 до 0, не увенчались успехом. Представлял интерес и тот факт, что данный участок также делетировался при получении минирепликона на основе 5.2 т.п.н. BamHI - фрагмента pPMI.

При клонировании Kpnl-фрагментов pPMI в штамме E.coli С600 в составе мультикопийного вектора pUC19 были отобраны два рекомбинантных клона, несущие плазмиды, обозначенные pSI2 и pSI4. Исследование этих клонов на чувствительность к антибиотикам показало, что, помимо детерминируемой pUC19 резистентности к ампициллину, они приобретали устойчивость к гента-мицину, канамицину и очень высоким концентрациям стрептомицина (10 мг/мл и выше). При клонировании в E.coli DH1, был отобран клон, содержащий реком-бинантную плазмиду, обозначенную pSI9. Уровень резистентности этого трансформанта к антибиотикам аминогликозидного ряда был аналогично высоким. _ Кроме того, штамм E.coli DHl(pSI 9) оказался устойчивым к офлоксацину и пефлоксацину, Е coli С600 (pSI 2) - к пефлоксацину.

Рестрикционный анализ плазмид pSI 2, pSI 4, pSI 9 после длительного хранения и пересевов рекомбинантных штаммов показал нетипичную для исходных фрагментов pPMI картину ПДРФ - произошел распад рекомбинантных плазмид с утратой вставки, а в ряде случаев наблюдалась элиминация плазмид. При этом полностью сохранялась экспрессия чужеродной для реципиентного штамма множественной лекарственной резистентности, не имеющая отношения к вектору. Это позволило предположить, что она обеспечивается детерминантой

Safl j PMI

Рис. 9. Карта-схема фрагментов pPMI, проклонированных на мультикопийных векторах pUC 19 и pBR 322.

t

pPMl, интегрировавшей в хромосому Е coli. Присутствие последовательностей рРМ1 в составе генома рекомбинантных клонов было доказано при помощи дот-

гибридизации с ДНК pPMl, меченой 32Р (рис. 10).

© © © ® © © © © © ®

Рис. 10. Радиоавтограф гибридизации ДНК pPMl с плазмидными и тотальными ДНК полирезистентных рекомбинантных штаммов E.coli.

1 -pSI 10; 5 - E.coli С 600 (pSI 4); 9 - E.coli DH1;

2 -pSI 9; 6 - pSI 4; 10- E.coli C600.

3 - E.coli С 600 (pSI 2); 7-pPMl;

4-pSI 2; 8 - pUC 19;

Результаты блот-гибридизации также показали присутствие гомологичных pPMl последовательностей в хромосоме рекомбинантных клонов кишечной палочки в области рестриктов размером 5 т.п.н. и более, что подтверждает предположение об интеграции фрагментов pPMl в хромосому кишечной палочки (рис. 11).

1 23456789 10

Рис. 11. Блот-гибридизация ДНК, выделенной из рекомбинантных штаммов Е. coli с ДНК рРМ 1, меченой 32Р.

/ - Е coli С600 (pSI 2)/ EcoR /, 6- Е coli C600/Saí 1,

2-Е coli C600 (pSI 2)/Sal Gl. 7-E coli DH 1/EcoR 1,

3-Е. coli C600 (pSI 4)/EcoR 1, 8-E. coli DH 1 /Sal 1, 4 -E coli C600 (pSI 4)/Sal I, 9-pY5/BamH 1,

5-E coli C600/EcoR I, 10-pUCl 9/BamH I

Таким образом, было установлено, что при клонировании фрагмента рРМ1, содержащего участок в пределах от 12,0 до 0 координат физической карты, рекомбинантные клоны кишечной палочки приобретают множественную лекарственную резистентность. Одновременно наблюдаются сложные рекомби-национные процессы, приводящие либо к интеграции части клонированного фрагмента в хромосомную ДНК реципиента, либо к структурными перестройками самой рекомбинантной плазмиды.

Анализ электрофореграмм общеклеточных белков в ДСН-ПААГ показал, что рекомбинантные клоны E.coli С600 и DH1 продуцируют высокомолекулярный белок 120 Юа, отсутствующий у исходных штаммов кишечной палочки и имеющийся у донорного штамма B.pseudomallei ВКМ-900. По данным электронно-микроскопических исследований наиболее выраженные изменения клеточной морфологии наблюдались у E.coli DH1 (pSI 9). По сравнению с реципи-ентным штаммом клетки рекомбинантного клона обладали хорошо заметной капсулоподобной структурой; ее величина варьировала от 40 нм при выращивании микробных клеток на плотной питательной среде, содержащей ампициллин, до 100 нм при выращивании в присутствии стрептомицина. По данным электро-форетического анализа наблюдалось значительное увеличение уровня продукции биополимера 120 kDa у E.coli DH1 (pSI 9), выращенной в присутствии стрептомицина, по сравнению с культурой, выращенной на среде с ампициллином. Дот -ИФА исходных штаммов E.coli и рекомбинантных клонов, содержащих плазмиды pSI2, pSI4, pSI9, показал, что клетки всех перечисленных выше рекомбинантных штаммов кишечной палочки специфически взаимодействовали с иммуноглобулинами поликлональной иммунной сыворотки к B.pseudomallei (рис. 12).

Рис. 12. Дот-ИФА с использованием иммуноглобулинов поливалентной иммунной сыворотки к В pseudomallei 111.

1,6- EcoliDH 1; 2, 7 - E.coli С600, 3,8- E.coli C600 (pSI2j,

4, 9 E coli С 600 (pSI4),

5, 10 - E coli DlIl(pSI9),

11 - В pseudomallei BKM 900

Данные результаты, а также выявленные изменения клеточной морфологии рекомбинантных клонов Е coli и продукция белков, отсутствующих у реци-пиентных штаммов, позволили нам сделать предварительное заключение об экспрессии клонированного в кишечной палочке генетического материала B.pseudomallei, детерминирующего, предположительно, синтез поверхностных антигенов.Идентификация антигенов, продуцируемых клетками рекомбинантных штаммов кишечной палочки, была проведена методом иммуноблотгинга с применением поликлональной сыворотки к клеткам B.pseudomallei (рис. 13). При анализе антигенного спектра препарата наружной мембраны рекомбинантного штамма E.coli DH1 (pSI 9) было выявлено 6 антигенов -120, 95, 75, 30, 27 и 23 kDa, из них 4 (95, 75, 27 и 23 ГОа) имели наибольшую интенсивность окраски. В составе препаратов общеклеточных белков рекомбинантных клонов были также отмечены антигены 120, 95, 30, 27 kDa - у клонов E.coli DH1( pSI 9), а также 120, 95, 35 kDa - у клонов E.coli С600 ( pSI 4) и E.coli С600 (pSI 2).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

120 кДа 95 кДа 75 кДа

35 нДа 27кДа

23 кДа

Рис. 13. Иммуноблоттинг общеклеточных белков и белков наружной мембраны рекомбинантных клонов с поливалентной мелиоидозной сывороткой.

1-Е coli С600, 12 - B.pseudomallei 57576,

2,3-Е coli С600 (pSI 2); 13-В pseudomallei ВКМ900,

4,5,6,7 — Е coli С600 (pSI 4); 14 - HME coli DH1 (pUC19),

8 - E.coli DH1, 15,16 - HM-E.coli DH1 (pSI 9) 9,10,11-Е.coli DH1 (pSI ЯЛ-

Дальнейший электрофоретический анализ белков наружной мембраны показал, что белки 70 - 120 kDa следует рассматривать как высокомолекулярные олигомерные формы, которые при нагревании в присутствие ß-меркаптоэтанола диссоциировали на ряд фрагментов меньшей молекулярной массы. При этом у E.coli DH1 (pSI9) отмечено преимущественное образование компонентов 23, 27,

30, 34 и 40 kDa, не имевших аналогов в составе наружной мембраны реципиент-ного штамма.

Полученные результаты позволяют сделать заключение, что на клонированном фрагменте рРМ1, локализованном предположительно между 12-й и 0-й координатами физической карты, имеется детерминанта, ответственная за изменение белкового состава наружной мембраны, развитие множественной антибио-тикорезистентности и формирование у рекомбинантного штамма Е coli капсуло-подобной структуры. Белки наружной мембраны рекомбинантных клонов, специфически взаимодействующие с иммуноглобулинами поликлональной сыворотки к клеткам B.pseudomallei, способны к ассоциации в высокомолекулярные формы.

При клонировании Sal Gl, Hind III и Bgl II- фрагментов плазмиды pCM2 в составе различных векторов в большинстве случаев отмечалась сегрегационная нестабильность рекомбинантных плазмид при культивировании штаммов в отсутствии селективных условий. Кроме того, не всегда удавалось осуществить передачу целых фрагментов. Так, при анализе рекомбинантных плазмид, содержащих Bgl И- фрагменты, не выявлялась типичная картина рестрикционного спектра. Во всех случаях были обнаружены делеционные производные искомых нуклеотидных последовательностей мелиоидозной плазмиды, хотя наличие их в составе гибридных плазмид подтверждалось результатами ДНК-ДНК гибридизации.

Приобретение рекомбинантных плазмид не вызывало изменения у рекомбинантных штаммов доступных анализу фенотипических свойств - морфологии колоний и чувствительности к антибиотикам. Но в ТИФА и реакции имму-ноблоттинга у отдельных рекомбинантов выявлено наличие антигенных детерминант возбудителя мелиоидоза. Так, штамм E.coli HB 101 (pCAV-1/l) давал четко положительную реакцию с моноклональными антителами, которые реагируют с липополисаридом, мембранными белками и, возможно, антигеном 8 возбудителя мелиоидоза. Рекомбинантный штамм E.coli HB 101 (pCAV9) дополнительно продуцировал белок с молекулярной массой -100 kDa, взаимодействующий со специфическими иммуноглобулинами, и отсутствующий у родительского штамма Е coli HB 101. Было проведено секвенирование Hind III - фрагмента плазмиды рСМ2 размером 2,471 т.п.н., входящего в состав плазмиды pCAV9. С использованием программы BLASTn (Stephen et al., 1997) в данном фрагменте были выявлены участки гомологии высокого уровня с представленными в GeñBank нуклеотидными последовательностями ~ плазмидных репликонов pSB102 (AJ304453.1) и pIP02T (AJ297913.2). Программа BLASTx показала, что данные гомологи имеют отношение к синтезу TraS белков у плазмиды pSB102 (САС79161.1) и TraR белков у плазмиды pIP02T (САС82765.1).

Таким образом, проведенные физическое картирование плазмид, клонирование отдельных фрагментов в составе мультикопийных векторов и анализ рекомбинантных клонов позволили получить некоторое представление о структурно-функциональной организации двух плазмид возбудителя мелиоидоза рРМ1 и рСМ2.

4. Плазмидные векторы и системы межвидового клонирования генетических детерминант буркхольдерий

Многофункциональные векторные системы, стабильно функционирующие в разных видах бактерий необходимы для молекулярно-биологического исследования микроорганизмов. Это позволяет изучать экспрессию исследуемых генетических детерминант в гетерологичных видах и, при необходимости, проводить комплементационный анализ. Векторные системы для клонирования и экспрессии, разработанные для кишечной палочки и других энтеробактерий основаны на репликонах с узким спектром хозяев, что создает определенные трудности при реинтродукции клонированной мелиоидозной ДНК в естественного хозяина.

Методом клонирования нами был сконструирован ряд бифункциональных векторов, способных к репликации в клетках B.pseudomallei, В.mallei E.coli, B.subtilis (таблица 2). Для создания системы двурепликоновых векторов использовали плазмиды pUC 19, pBR 322, полученные на основе ColE 1 репликона, RSF 1010, различные бациллярные плазмиды pUB 110, рСВ 200 и pPL 708.

Таблица 2

Характеристика полученных плазмидных векторов

Плазмиды Родительские плазмиды Характеристика Способность реплицироваться в видах

E.coli B.subtilis B.pseud omallei

pVA 1 RSF 1010, pBR 322 ApK, SmR Su*, 7c* + — +

pVA 4 RSF 1010, pUC 19 Ap", SmK, 7c* + — +

рАМ 4 RSF 1010, pBR 322 Ap", SmK, Tc" + — +

pVA 7 pUC 19, pUB 110 Ap", Km" + + —

рВА 2 pPL 708, pAM 4 Km11 + + —

рВАЗ pCB 20, pAM 4 ApH, Sm", Tc* EmH + + +

рАВ 5 pBR 322, pUB 110 Ap", TcKm" + + —

рАВ 55 pBR 322, pUB 110 Ap", Tc", KmR + + —

PY70 pRS 103, pPMl 7c" + -

Примечание: *) - нестабильна в клетках возбудителя мелиоидоза.

Получено несколько вариантов векторов клонирования в клетках кишечной палочки и патогенных буркхольдерий на основе плазмид RSF 1010 и pUC 19 (pVA 4), RSF 1010 и pBR 322 (pVA 1). В данных бифункциональных векторах известные ограничения для клонирования на репликоне RSF 1010 устранялись за счет достаточного набора сайтов рестрикции плазмид PBR 322 и pUC 19. Репликоны pVA 1 и pVA 4 эффективно мобилизовались в клетки возбудителей мелиоидоза и сапа с помощью плазмиды рТНЮ (температурочувстви-тельного по репликации мутанта RP4). Поддержание pVAl и pVA4 в клетках носило стабильный характер. Плазмиды рТНЮ и RP1 в свежеполученных ре-комбинантных клонах возбудителя мелиоидоза сохраняли мобилизующую ак-

тивность в отношении нетрансмиссивных репликонов pVAl и pVA4. При последующем хранении коньюгативная активность их снижалась. Тем не менее, ре-комбинантные векторы и их производные были успешно использованы нами для решения целого ряда методических проблем при изучении возможности клонирования и экспрессии в клетках патогенных буркхольдерий.

Получены бифункциональные векторы для клонирования в клетках E.coli и B.subtilis. Плазмида рВАЗ, кроме этого обладала способностью к репликации в штаммах буркхольдерий. При трансформации данных плазмид в B.subtilis рестрикционный анализ подтверждал сохранность размера химерных молекул, сайтов рестрикции и их взаимное расположение. При передаче данных плазмид в клетки E.coli после культивирования в бациллах восстанавливалась экспрессия генов антибиотикорезистентности Col El репликона и сохранялась структура гибридных молекул, что подтверждалось рестрикционным анализом.

Трансформация плазмидной ДНК у видов, обладающих естественной компетентностью, требует определенных условий: наличие мультимерных форм плазмидной ДНК и участков гомологии с хромосомой или резидентной плазми-дой (Иванов и др., 1990). Сконструированный вектор pY70 с уникальными сайтами для рестриктаз Pst I, Eco RI, Hind III содержал область начала репликации, тетрациклиновую детерминанту pBR322 и фрагмент мелиоидозной плазмиды рРМ1. Плазмида pY70 автономно реплицировалась в E.coli, но оказалась сегре-гационно нестабильной в клетках возбудителя мелиоидоза, по-видимому, из-за наличия в ее составе фрагмента рРМ1, обладающего гомологией с хромосомной ДНК возбудителя мелиоидоза и обеспечивающего интеграцию рекомбинантной плазмиды в хромосому реципиента и, в следствие этого, «спасение» тетрацикли-нового маркера. Тем не менее, данный репликон может быть использован в качестве интегративного вектора для B.pseudomallei.

Сконструированные плазмиды имеют широкий круг бактериальных хозяев и могут выступать в роли векторных плазмид при клонировании генетического материала в клетках E.coli, бациллах и буркхольдериях в целях изучения генетических детерминант возбудителей сапа и мелиоидоза, локализованных, в том числе, на критических плазмидах.

Необходимым условием исследования критических плазмид с неустановленным фенотипом является передача их в реципиентные штаммы, не обладающими таковыми. Ни в одном из исследованных штаммов В.mallei, хранящихся в коллекционном центре Волгоградского НИПЧИ, внехромосомные реплико-ны обнаружены не были. Высокий уровень родства возбудителей мелиоидоза и сапа формирует уникальную систему для изучения свойств, детерминируемых плазмидами В pseudomallei, при использовании одного из них в качестве донора, а второго - в качестве реципиента.

Донорами плазмид в настоящих экспериментах являлись штаммы B.pseudomallei 130 (RPl::TnlO, рСМЗ) и 139 (RPl::Tnl0, рСМ2). Передача плазмид осуществлялась в реципиентный штамм P.mallei Ц4 RifR. Клоны транс-коньюгантов, полученные в процессе скрещивания B.pseudomallei 130 (RPl::TnlO, рСМЗ) и P.mallei Ц4 RifR наряду с мобилизующей плазмидой со-

держали плазмиду рСМЗ. В то же время, в отдельных клонах выявлялась только мобилизуемая плазмида рСМЗ, а мобилизующая плазмида RPl::TnlO не обнаруживалась.

При анализе клонов трансконьюгантов, полученных при скрещивании B.pseudomallei 139 (RPlxTnlO, рСМ2) и P.mallei Ц4 RifR, было показано, что мобилизующая плазмида RPl::TnlO присутствовала во всех исследуемых клонах. Среди клонов, устойчивых к тетрациклину, были выявлены клоны, содержащие в автономном состоянии плазмиды RPl::TnlO и рСМ2. Трансконьюганты, содержащие в своем составе только плазмиду рСМ2, обнаружены не были (рис. 14).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15

Рис. 14. Электрофореграмма плазмидных ДНК донорного штамма B.pseudomallei 139 (рСМ2, RPl::TnlO), реципиента и трансконьюгантов В. mallei Ц4 Rif.

1 - B.pseudomallei 139 (рСМ2, RPl::Tnl0),

2-В mallei Ц4 Rif;

3-15 - B.mallei Ц4 Rif(pCM2, RPl::TnlO)

В процессе хранения и пересевов на питательных средах в рекомби-нантных клонах возбудителя сапа сохранялись все полученные от донора плаз-мидные репликоны, что свидетельствует о стабильном наследовании критических плазмид возбудителя мелиоидоза и мобилизующих плазмид природными штаммами В mallei. При анализе плазмидных ДНК из клонов, выделенных от павших животных, зараженных штаммом В mallei Ц4 Rif*1 (RPl::TnlO, рСМ 2), выявлялась структурная перестройка плазмиды рСМ 2, которая выражалась в уменьшении ее размера до 15 т.п.н. (рис. 15). Делеционный вариант pCM2-del возникал только в условиях in vivo. В процессе дальнейшего культивирования плазмида pCM2-del стабильно сохранялась и поддерживалась в штаммах в автономном состоянии, наряду с RPl::TnlO.

Для определения функциональной роли исследуемых плазмид возбудителя мелиоидоза было проведено сравнительное изучение отдельных феноти-пических свойств родительских и рекомбинантных штаммов В mallei и в первую очередь изменение чувствительности к антибиотикам, учитывая существенную разницу этого свойства у возбудителей сапа и мелиоидоза. Тем не менее, трансконьюганты В mallei, содержащие мелиоидозные плазмиды рСМ2 и рСМЗ, по фенотипическим свойствам, в том числе антибиотикоустойчивости, не отличались от родительских штаммов (таблица 3).

1 2 3 4 5

рСМ2.

pCMldel

Рис. 15. Электрофореграмма плазмидного скрининга клонов штамма В.mallei Ц4 Rif (RP1 ::Тп10,рСМ2), выделенных от павших животных.

1 - клон культивированный на питательных средах;

2,3,4 5 — клоны выделенные от павших золотистых хомячков

Выявлено влияние плазмиды рСМ2 на вирулентность трансконьюгантов В mallei. Приобретение мобилизующей плазмиды RP1 ::Тп10 приводило к полной утрате вирулентности реципиентов. В отличии от них трансконьюганты возбудителя сапа, содержащие наряду с плазмидой RPl::TnlO мелиоидозную плазми-ду рСМ 2, частично восстанавливали вирулентность для золотистых хомячков. Не исключено, что влияние мелиоидозных плазмид на свойства трансконьюгантов В mallei связано с наличием у плазмиды рСМ2 каких-либо генетических детерминант, оказывающих опосредованное влияние на вирулентность анализируемых штаммов.

Таблица 3.

Характеристика антибиотикочувствительности и вирулентности для золотистых хомячков исходных штаммов и трансконьюгантов B.pseudomallei и В.mallei

1 Штаммы МПК антибиотиков,мкг/мл ДЦ50

Gen Dox Chi Str Bis

В mallei Ц4 Rif <1 <1 10 1 <1 l,4xl02

В mallei Ц4 Rif (RPl: Tnl0) <1 <1 10 1 <1 >5,3xl08

В mallei Ц4 Rif (RPl::TnlO,pCM2) <1 <1 10 1 <1 3,2x10s

В mallei Ц4 Rif (RP1 TnlO,pCM2del) <1 <1 10 1 <\ 2,4x10s

В pseudomallei 139(pCM2) >200 1 50 >50 10 l,2xl02

В pseudomallei 13 9 (RP1: :Tn 10,pCM2) >200 25 50 >50 10 l,3xl02

Несмотря на существенный прорыв в молекулярно-биологическом изучении бактериальных и вирусных патогенов, связанный с секвенированием генома, до сих пор остаются актуальными классические молекулярно-генетические подходы, направленные на исследование генетических детерминант и их экспре-сии у различных возбудителей инфекционных заболеваний.

При анализе геномной библиотеки B.pseudomallei, полученной на основе рВЯ325, были отобраны клоны, обладающие протеазной и гемолитической ак-

тивностями. Фильтраты бульонных культур рекомбинантных штаммов образовывали области гемолиза и протеолиза на чашках с соответствующими субстратами (рис. 16).

а в

Рис. 16. Протеолитическая и гемолитическая активности фильтратов бульонных культур рекомбинантных клонов E.coli.

А - 0,25% Skim-milk (Difco); В - 4% эритроцитов человека

1 - E.coli НВ ¡01; 3-рекомбинант Е coli НВ 101/8-79;

2 - рекомбинант Е coli НВ 101/2-57; 4 - B.pseudomallei С-141

Хотя при плазмидном скрининге рекомбинантных клонов не удалось выявить различий в рестрикционной картине плазмиды pBR325 и плазмидных ДНК рекомбинантных клонов, в гибридизационных экспериментах была выявлена гомология ДНК всех рекомбинантных клонов, обладающих протеазной и гемолитической активностями, с ДНК возбудителя мелиоидоза, при отсутствии таковой с ДНК плазмиды pBR325 и исходного штамма E.coli НВ101.

В реакции иммунопреципитации поликлональные сыворотки против штамма B.pseudomallei 111 реагировали с рекомбинантными клонами, образуя зоны преципитата, которые выявлялись визуально. При сравнительном ракетном иммуноэлектрофорезе образовывались специфические дуги преципитации (ракеты) со смесью IgG мелиоидозной сыворотки, что свидетельствует о внеклеточной продукции клонированных антигенных детерминант возбудителя мелиоидоза клетками E.coli, обладающими протеазной и гемолитической активностями. В белковом спектре ряда рекомбинантных штаммов Е coli обнаруживался дополнительный белок 23 кДа, а белки с молекулярной массой 47 и 36 кДа специфически взаимодействовали в иммуноблоттинге с мелиоидозной сывороткой (рис.17, 18). Структурные различия бактериальных геномов исходного и рекомбинантных штаммов кишечной палочки подтверждались наличием" дополнительного ампликона при постановке мультиплексной ПЦР (рис.19).

Полученные рекомбинантные штаммы E.coli, обладающие протеазной и гемолитической активностями, могут быть использованы для дальнейшего изучения внеклеточных ферментов возбудителя мелиоидоза, выявления структурных генов или их фрагментов, ответственных за выражение данных признаков, и оценки их роли в патогенности В pseudomalleL__

j рос. национальна? | библиотека

{ С. Петербург '

* OS m » '

23 кДа

Рис. 17. Электрофореграмма спектра секреторных и общеклеточных белков рекомбинантных клонов Е. coli HB 101, обладающих гемолитической и протеолитической активностями.

1.3 - секреторные белки рекомбинантных клонов;

2.4 - общеклеточные белки рекомбинантных клонов;

5 - секреторные белки Е. coli НВ101;

6 - общеклеточные белки E.coli НВ101

47 кДа

ЗбкДа -► ' '

Шт

Рис. 18. Иммуноблоттинг препаратов общеклеточных белков рекомбинантных клонов E.coli HB 101, обладающих гемолитической и протеолитической активностями.

/ -Е coli HB 101/9-42, 4-Е coli HB 101/3-24;

2-Е. coli HB101, 5-E coli HB 101/3-18;

3-Е. coli HB 101/4-11, 6-B. pseudomallei C-141.

1 2 3 4 5

ЧЯЯШЩР ^РРРРЩр

<- 375 п.н

Рис. 19. Электрофореграмма мультиплексной ПЦР с ДНК рекомбинантных клонов E,coli, обладающих гемолитической и протеолитической активностями.

1 - маркер молекулярных масс (р UC19/Нра II)

2 - плазмидная ДНК pBR 325

3 - тотальная ДНК E.coli НВ101

4 - тотальная ДНКрекомбинантного клона E.coli НВ101/2-57

5 - тотальная ДНК рекомбинантного клона E.coli HBI01/8-79

5. Генетические методы идентификации патогенных буркхольдерий

Методы, основанные на анализе генома (гибридизация нуклеиновых кислот, ДНК-зондирование, плазмидный и рестрикционный анализ, полимеразная цепная реакция и др.), в настоящее время приобретают все большее значение для идентификации культур и определения таксономического положения микроорганизмов (Блохина и др., 1992; Rosselo-Mora, Amann, 2001).

Высокая степень ДНК-гомологии и сходство рекомбинационных систем буркхольдерий позволили предложить для их идентификации генетическую трансформацию. Данный феномен у B.pseudomallei и В.mallei изучен достаточно подробно (Тарасова, Ряпис, 1983; Меринова, 1997). Оба возбудителя рассматриваются как природнотрансформирующиеся виды и относятся к тем видам, у_ которых состояние компетентности клеток достигается только на плотной среде. Трансформация этого типа происходит при совместном культивировании донор-ного материала и культуры реципиента на плотной питательной среде. Метод генетической трансформации был апробирован на широком наборе штаммов буркхольдерий и гетерологичных видов микроорганизмов. В качестве реципиента использовали пуринзависимый мутанта Вpseudomallei VPA (Ряпис и др., 1979), суточную бульонную культуру которого высевали сплошным газоном на чашки с минимальной средой (Gilardi, 1989). Донорный материал готовили путем получения хлороформных лизатов из исследуемых культур, выращенных в

жидкой питательной среде (LB-бульон), которые наносили бляшками на приготовленные газоны реципиента и инкубировали при 37 °С в течение 2 суток и более. Результат считался положительным при появлении в месте нанесения бляшки колоний прототрофов. При этом контроль генетической реверсии штамма B.pseudomallei VPA не обязателен, ввиду чрезвычайно высокой стабильности у него маркера пуринзависимости. Данный метод оказался очень эффективным при изучении хронических и особенно латентных форм экспериментального мелиоидоза, сопровождающихся формированием морфологически измененных форм возбудителя, неидентифицируемых традиционными методами.

В последующем метод генетической трансформации, разработанный для В pseudomallei и В mallei, был апробирован для идентификации других близкородственных буркхольдерий, имеющих медицинское значение - В cepacia и B.thailandensis. Результаты исследования показали, что только В thailandensis может обеспечивать трансформацию мелиоидозных штаммов, хотя частота её, по сравнению с гомологичной трансформацией, была значительно ниже (таблица 4).

Учитывая полученные данные о гомологии плазмид возбудителя мелиоидоза с ДНК буркхольдерий и отсутствие таковой с другими гетерологичными видами с целью конструирования диагностического ДНК-зонда была исследована гибридизационная активность рестрикционных фрагментов криптической плазмиды рРМ1. Участок плазмиды рРМ1, обеспечивающий гомологичную ДНК-ДНК гибридизацию с геномами буркхольдерий, находился в пределах сайтов Pst I (5.4) - Ваш HI (9.3) ее физической карты (рис. 20).

Таблица 4.

Трансформация В pseudomallei хромосомными ДНК родственных буркхольдерий

I Штаммы-доноры Количество трансформантов, мл Частота трансформации по мар- | керу Pur+ на 1x10* м.к. реципиента

I B.pseudomallei С-141 2,5 х 10" 1,2 х 10 4

В. mallei Ц4 3,7 х 103 1,9 х 10 "5

I В thailandensis 251 1,5x10" 7,5 х 10 "6

j B.thailandensis 264 1,6 х 10J 8,0 х 10

j В thailandensis 295 1,2 х 10j 6,0 х 10 "6

I В cepacia AB 1934 0 0

Примечание- реципиентный штамм В pseudomallei С-141 pur90 his 107; источник ДНК — хлороформные лизаты клеток доноров; соотношение донора и реципиента 1 1

Bam HI (S 6 т п.н)

Sal Gl (2 t n h )

Bam Hl/Pst I (3 5 t n h )

Sal Gl (2.9 т.п.н.)

Sal Gl (3.6 т.п.н.)

Sal Gl (0 4 t n h.)

Рис. 20. Схема анализа гибридизационной активности фрагментов рРМ1.

Sal Gl- фрагмент плазмиды pPMl размером 0,4 т.п.н. был проклониро-ван в фаговом векторе М13шр18. Рекомбинантный фаг, обозначенный М13РМ, использовали в качестве продуцента группоспецифического ДНК-зонда для идентификации патогенных буркхольдерий. Применение рекомбинантного фага М13РМ в реакции ДНК-ДНК гибридизации исключало этап работы с заразным материалом при подготовке молекулярного ДНК-зонда, упрощало процедуру его накопления и увеличивало эффективность внесения радиоактивной метки. При введении метки техникой достройки секвенационного праймера ДНК-зонд детектировал только штаммы B.psedomallei, В. mallei и В. cepacia, аналогично результатам, полученным при использовании в качестве ДНК-зонда клонированного фрагмента, выделенного препаративно и меченого в реакции ник-трансляции.

Для выяснения возможных неспецифических реакций, возникающих при мечении векторной части полученного фага с помощью техники застройки гибридизационного праймера, изучали гомологию нуклеотидных последовательностей нативного фага М13 тр18 с геномными ДНК микроорганизмов различных видов. Было выявлено наличие гомологии генома фага с геномом B.pseudomallei и отсутствие таковой с ДНК штаммов В mallei, В cepacia. Данный факт исключил возможность использования гибридизационного праймера для мечения ДНК-зонда в связи с наличием неспецифической реакцией гибридизации, обусловленной векторной частью рекомбинантного фага. Но, с другой стороны, наличие такого коплементарного участка открывает перспективу поиска видоспецифических нуклеотидных последовательностей возбудителя мелиоидо-за и конструирования на их основе диагностических тест-систем для идентификации B.pseudomallei.

Большинство работ, связанных с конструированием ПЦР-систем для диагностики буркхольдерий, выполнено с использованием последовательностей

генов 16S и 23 S рРНК и спейсерных областей данных генов. Однако данные тест-системы страдают существенными недостатками, выражающимися в недостаточно высоких уровнях чувствительности и специфичности.

Bauernfeind A. et al. (1998) при анализе последовательностей гена 23S рРНК были обнаружены нуклеотидные отличия у возбудителей сапа и мелиои-доза, на основе которых ими подобраны предположительно видоспецифические праймеры и предложена тест-система для идентификации В.mallei. Проведенные исследования эффективности ПЦР с использованием подобранных авторами праймеров на представительном наборе гомологичных и гетерологичных штаммов показали, что система обладает весьма низкой чувствительностью: большинство типичных штаммов возбудителя сапа выявлялись в реакции амплификации только в концентрации 1х108 м.к./мл, а все штаммы B.pseudomallei также образовывали специфические ампликоны.

Путем анализа генов 23 S рРНК нами были подобраны праймеры из которых теоретически две пары предлагались для групповой идентификации B.mallei и B.pseudomallei (Burk3s-Burk4as, Burkls-Burk4as), а две другие (Burkls-Burk2as и Burk3s-Burk2as) для идентификации только B.mallei, поскольку прай-мер Burk4as являлся общим для всех исследованных буркхольдерий, праймеры Burkls и Burk3s - специфичными для возбудителей сапа и мелиоидоза, а праймер Burk2as - специфичным только для возбудителя сапа (рис.21.). Учитывая, что нуклеотидные последовательности праймеров Burkls-Burk2as и Burk3s-Burk2as локализованы внутри участка ДНК, фланкированного праймерами Burk3s-Burk 4as, данные олигонуклеотидные затравки предполагалось использовать для проведения «гнездовой» ПЦР при идентификации возбудителя сапа.

1148 1735

I- ВигкЗз -> <- Burk4as —-1

B.mallei CGAAGCTGCGGATGCGAGCTAGTCTC GGTTGCAATAAACTGGTGGCTGCGACTG

B.pseudomallei -------------------------- ----------------------------

B.multivorans --------------------Т----- ----------------------------

В. gladioli ---------------АТАТ-ТАТАТ- ----------------------------

B.vietnamiensis----------------Т---TTG-A- ----------------------------

В. cepacia ----------------Т---TTG-A- ----------------------------

1196 1521

I- Burkls -> <- Burk2as -1

B.mallei AAGCCTGCGAAGGTGCGTTGAAAAGC_ TCCTTCGGGAGCGAAGCAATTGGAAG

B.pseudomallei ----------------------------------------------------G-TC-A---С----------------

B.multivorans ---------------ТС---T----G GA------TC----------------

B. gladioli ----------------A---T----T T---A--A------------------

B.vietnamiensis----------------С---T----G --------------------------

В.cepacia ----------------С---T----G --------------------------

Рис. 21. Нуклеотидные последовательности фрагментов генов 23 S рРНК буркхольдерий на участках посадок олигонуклеотидных затравок (GenBank NCBI, National Center for Biotechnology Information, США).

При проведении ПЦР праймерами Burkls-Burk2as и Burk3s-Burk2as с чистыми препаратами ДНК В mallei были получены четкие положительные результат с формированием одиночных специфичных ампликонов соответствующих размеров, совпадающих с расчетными данными, полученными с помощью компьютерного анализа, что свидетельствовало о потенциальной пригодности выбранных праймеров для конструировании амплификационных тест-систем (рис. 22).

1 2 3 4 5

399 п.н.

351 п.н.

Рис.22. Результаты амплификации фрагментов гена 23S рРНК B.mallei.

1 - Маркер молекулярных масс (pUC 19/Нра II)

2 - B.mallei 11, праймеры Burk3s-Burk2as;

3 - B.mallei 10230, праймеры Burk3s-Burk2as, 4- B.mallei 11 .праймеры Burkls-Burk2as;

5 - B.mallei 10230, праймеры Burkls-Burk2as.

Однако при изучении специфичности исследуемых праймеров на представительном наборе штаммов буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов в обоих случаях регистрировали синтез специфических ампликонов соответствующих размеров у 9 штаммов B.pseudomallei и у 6 штаммов В cepacia. Аналогичные результаты были получены и при использовании «гнездовой» ПЦР: «внешняя» пара - Burk3s-Burk4as; «внутренняя» пара - Burkls-Burk2as. Таким образом, подобранный нами на основе гена 23 S рРНК предположительно специфичный для возбудителя сапа праймер Burk2as не обеспечивал дифференциацию буркхольдерий (B.pseudomallei, В mallei, В. cepacia), хотя чувствительность метода при использовании сконструированных праймеров была значительно выше (103 м.к.), чем в случае с праймерами М23-2 и CVMP23-1.

Применение группоспецифических в отношении патогенных буркхольдерий праймеров Burkls-Burk4as и Burk3s-Burk4as позволяло детектировать все типичные штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза. Чувствительность реакции для обоих видов микроорганизмов с праймерами Burkls-Burk4as и Burk3s-Burk4as составляла не менее lxlО1 м.к./мл. Однако при проверке специфичности данных систем с ДНК близкородственных буркхольдерий и других гетерологичных микроорганизмов в обоих случаях был зарегистрирован синтез специфиче-

ских ампликонов с двумя штаммами В. cepacia 8235 и 3181 в концентрации 1x107 М.К./МЛ.

Хотя проведенные предварительные исследования по поиску видо- и группоспецифических праймеров для выявления патогенных псевдомонад не дали ожидаемого результата, полученного в предварительных данных компьютерного анализа, они обеспечили методическую базу поиска новых праймеров для идентификации патогенных буркхольдерий, в том числе путем изучения генетических детерминант, имеющих отношение к реализации важных видовых признаков,

Заключение

Обобщены результаты молекулярно-генетического изучения возбудителя мелиоидоза и близкородственных буркхольдерий с использованием гибриди-зационного, плазмидного, рестрикционного анализа и молекулярного клонирования. Отмечено, что настоящие исследования создают методическую основу для изучения геномной организации буркхольдерий, включая анализ внехромо-сомных репликонов, выявление детерминант, ответственных за реализацию па-тогенности, поиск видоспецифических последовательностей и разработку современных генетических методов идентификации буркхольдерий.

Выводы

1. С использованием современных молекулярно-генетических методов (гибридизационного, плазмидного, рестрикционного анализа, клонирования генетических детерминант) проведено изучение геномов B.pseudomallei и родственных ей видов буркхольдерий и определены методические подходы к созданию средств их идентификации и типирования.

2. Разработаны эффективные методы плазмидного скрининга штаммов и препаративного выделения плазмидных ДНК B.pseudomallei. Впервые выявлены и охарактеризованы криптические плазмиды возбудителя мелиоидоза, обозначенные pPMl, рСМ2, рСМЗ и рСМ4. Плазмиды стабильно наследуются в процессе хранения и пассажей штаммов B.pseudomallei in vitro и in vivo, что открывает возможность использования плазмидного анализа для внутривидового типирования культур возбудителя мелиоидоза.

3. Определены размеры плазмид возбудителя мелиоидоза, показана идентичность -профилей рестрикции плазмидных репликонов одного размера, независимо от места и времени выделения культуры. Все типы плазмид обладают выраженной взаимной гомологией и гомологией с ДНК близкородственных буркхольдерий В. mallei и B.thailandensis, проявляя себя в реакциях гибридизации как хромосомная ДНК B.pseudomallei, что позволяет рассматривать их в качестве резидентных плазмид возбудителя мелиоидоза.

4. Осуществлено физическое картирование плазмид возбудителя мелиоидоза pPMl и рСМ2. Путем маркирования и клонирования локализована область начала репликации pPMl между 10-й и 12-й координатами физической карты

криптической плазмиды. Показана возможность функционирования оп-региона критической плазмиды возбудителя мелиоидоза в штаммах E.coli.

5. Путем клонирования и последующего анализа показано, что плазмида рРМ1 содержит детерминанты, ответственные за развитие множественной анти-биотикорезистентности, изменение белкового состава наружной мембраны и формирование у рекомбинантного штамма E.coli капсулоподобной структуры. Белки наружной мембраны рекомбинантных клонов специфически взаимодействуют с иммуноглобулинами поликлональной мелиоидозной сыворотки и способны к ассоциации в более высокомолекулярные формы.

6. Установлено, что Hind III - фрагмент размером 2,471 т.п.н. плазмиды рСМ2 детерминирует в рекомбинантном штамме E.coli синтез белка с молекулярной массой 100 кДа, специфически взаимодествующего с иммуноглобулинами возбудителя мелиоидоза. Секвенирование и анализ с использованием программы BLAST позволили выявить гомологию данного фрагмента с представленными в GenBank нуклеотидными последовательностями плазмидных репли-конов pSBI02 (AJ304453.1) и pIP02T (AJ297913.2), детерминирующих синтез TraS (САС79161.1) и TraR (САС82765.1) белков, соответственно.

7. Осуществлена передача критических плазмид B.pseudomallei рСМ2 и рСМЗ в штамм P.mallei Ц4 с помощью мобилизующей плазмиды RPl::Tnl0. Плазмидные репликоны возбудителя мелиоидоза стабильно наследуются в новом хозяине в условиях in vitro и in vivo. При пассаже трансконьюгантов на золотистых хомячках происходит структурная перестройка репликона рСМ2, выражающаяся в образовании делеционных вариантов. Показано опосредованное влияние плазмид возбудителя мелиоидоза на вирулентность трансконьгантного штамма возбудителя сапа.

8. Сконструирован ряд многофункциональных плазмидных векторов, способных к репликации в клетках B.pseudomallei, В mallei, E.coli, В subtilis. Охарактеризована их стабильность в клетках указанных видов микроорганизмов в различных селективных условиях. Полученные векторы могут быть использованы для изучения генетических детерминант буркхольдерий, имеющих хромосомную и плазмидную локализацию.

9. На основе вектора pBR325 получена геномная библиотека B.pseudomallei. Отобраны клоны, обладающие в клетках рекомбинантных штаммов E.coli внеклеточной протеазной и гемолитической активностями, а также внеклеточной продукцией антигенов, выявленных в реакциях иммунопреципи-тации и иммуноэлектрофореза фильтратов бульонных культур рекомбинантных штаммов с очищенными IgG и поливалентной мелиоидозной сывороткой. Мультиплексной ПЦР показано наличие в рекомбинантных штаммах дополнительного ампликона размером 375 п.н., что свидетельствует о структурной перестройки их геномов.

10. Показано, что природная трансформабельность возбудителя мелиои-доза, проявляющаяся на плотной питательной среде, позволяет использовать феномен генетической трансформации для его идентификации, в том числе в случаях латентного течения мелиоидозной инфекции, а также для идентификации близкородственных буркхольдерий В. mallei и В thailandensis, обладающих высокой степенью ДНК-гомологии и сходством рекомбинационных систем по отношению к B.pseudomallei.

11. Установлено, что гомологию с геномами буркхольдерий плазмиды рРМ1 обеспечивает фрагмент, находящийся в пределах сайтов Pst I (5.4) - Bam HI (9.3) ее физической карты. Sal Gl - фрагмент гомологичного участка размером 0,4 т.п.н. проклонирован в составе нитевидного фага М13тр18. Полученный рекомбинантный фаг М13РМ может применяться в качестве продуцента груп-поспецифического ДНК-зонда для идентификации буркхольдерий при введение метки техникой достройки секвенационного праймера.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Замараев B.C., Ряпис Л.А. Влияние температуры на динамику размножения возбудителя мелиоидоза в жидкой питательной среде // Патологическая физиология особо опасных инфекций.-1981,- Саратов,- С. 145-150.

2. Замараев B.C. Образование и персистенция морфологических вариантов возбудителя мелиоидоза в организме экспериментальных животных // Мат. I Всесоюзн. конф. «Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология».- М.,1982.- С.89.

3. Замараев B.C., Тарасова Т.Д., Антонов Ю.В. Использование трансформации для идентификации возбудителя при поиске мелиоидозной инфекции // Профилактика природноочаговых инфекций: Тез. Всесоюзн. научн.-практич.конф.- 1983.- Ставрополь,- С.352-353.

4. Антонов Ю.В., Замараев B.C., Фарбер С.М. Манифестация экспериментальной скрытой мелиоидозной инфекции // Мат. Всесоюзн. конф. «Современные аспекты профилактики зоонозных инфекций»,- Иркутск, 1984.- С.77-78.

5 Авторское свидетельство Госкомитета СССР по делам изобретений и открытий № 11906348 / Антонов Ю.В., Замараев B.C., Илюхин В.И. - Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений СССР 08.07.1985

6. Замараев B.C., Илюхин В.И., Саямов С.Р., Ряпис Л.А. JI-трансформация возбудителей как один из путей реализации хронического бактерионосительства бактерий рода Pseudomonas II Микробиол.журн.- 1987.- Т.49.-№.3.-С. 91-96.

7. Цой Т.В., Кошелева И.А., Замараев B.C. Клонирование и экспрессия гена Pseudomonas putida, контролирующего катехол-2,3-оксигеназную активность в клетках E.coli//Генетика.- 1988.-Т.24,-№.9.-С. 1550-1561.

8. Авторское свидетельство Госкомитета СССР по делам изобретений и открытий № 298237 / Замараев B.C., Илюхин В.И., Анищенко М.А. - Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений СССР 03.07.1989.

9. Авторское свидетельство Госкомитета СССР по делам изобретений и открытий № 322767 / Замараев B.C., Илюхин В.И., Анищенко М.А. - Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений СССР 02.01.1991.

10. Замараев B.C. Перспективы использования молекулярно - биологических методов для диагностики инфекционных заболеваний // Мат. Всеросс. научн. конф. «Генетика и биохимия вирулентности особо опасных инфекций»,-Волгоград, 1992,-С. 152.

11. Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза: Метод, рекомендации / Волгоградский научно-исслед. противочумный ин-т; Сост. Илюхин В.И., Замараев B.C. и др., Волгоград,- 1994,- 62 с.

12. Антонов В.А., Замараев B.C., Меринова Л.К., Захарова И.Б. Изучение крип-тических плазмид возбудителя мелиоидоза // Информ. бюлл. МНС по сан,-эпид. охране территории РФ,- Саратов, 1994.- №.3.- С.32.

13. Тимошин В.Б., Замараев B.C., Антонов В.А., Липницкий А.В. Видоспецифи-ческий ДНК-зонд для идентификации токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы.// Молекул.генетика.- 1994.-№.1.-С.30-33.

14. Zamaraev V.S., Timoshin V.B., Lipnitsky A.V. The use of DNA-probe for the detection of toxigenic strains of Bacillus anthracis // Abstract book, 7-th Internat. Congress of Bacteriology and Appl. Microbiol. Division.- Prague, July 3-rd -8th, 1994,- P.502.

15. Илюхин В.И., Агеева Н.П., Антонов В.А., Батманов В.П., Будченко А.А., Дунаев Г.С., Замараев B.C., Замарин А.Е., Ларионов Г.М., Пивень Н.Н., Яковлев А.Т., Гришкина Т.А. Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза. // Информ. бюлл. МНС по сан.-эпид. охране территории РФ.- Саратов, 1994,- №.3,- С.30.

16. Патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам № 2037520 / Тимошин В.Б., Замараев B.C., Антонов В.А.- Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений РФ 19.06.1995.

17 Илюхин В.И., Замараев B.C., Каплиев В.И. Микробиология, таксономия и бактериологическая диагностика Pseudomonas pseudomallei II Мелиоидоз / под ред. акад. Н.Г.Тихонова.-Волгоград, 1995,-С. 8-25.

18. Тимошин В.Б., Замараев B.C., Липницкий А.В. Конструирование рекомби-нантного фага fZAT6 - продуцента одноцепочечного ДНК-зонда для идентификации штаммов Bacdlus anthracis, несущих плазмиду pXOl // Биотехнология,- 1995,-№5-6,- С.6-10.

19. Лабораторная диагностика, лечение и профилактика сапа: Метод, рекомендации / Волгоградский научно-исслед. противочумный ин-т; Сост. Илюхин

B.И., Замараев B.C. и др., Волгоград,- 1995.- С.26.

20. Илюхин В.И., Замараев B.C., Каплиев В.И. Микробиология Pseudomonas mallei: таксономия и бактериологическая диагностика // Сап / под ред. акад. Н.Г.Тихонова.- Волгоград, 1995,- С. 7-18.

21. Илюхин В.И., Храпова Н.П., Замараев B.C., Батманов В.П. Сап // Практическое руководство «Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней», Саратов, 1998. -Т.2.- С 101-114.

22. Илюхин В.И., Замараев B.C., Батманов В.П., Яковлев А.Т., Пивень H.H., Дунаев Г.С., Храпова Н.П. Мелиоидоз // Практическое руководство «Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней», Саратов, 1998. -Т.2.- С 115-143.

23. Антонов В.А.,Замараев B.C., Илюхин В.И. Группоспецифический ДНК-зонд для идентификации патогенных псевдомонад // Биотехнология,- 1998.-№.5,-

C.75-84.

24. Замараев B.C., Антонов В.А., Илюхин В.И., Захарова И.Б. Выделение и первичная характеристика плазмид Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei II Мол. генет. микробиол. вирусол.- 1998.- №.4,- С.28-33.

25. Захарова И.Б., Замараев B.C., Антонов В.А. Физическое картирование крип-тической плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза. // Проблемы особо опасных инфекций.- 1999.-Вып.79.- С.159-162.

26. Антонов В.А., Замараев B.C., Меринова Л.К., Илюхин В.И. Burkholderia mallei как хозяин плазмид возбудителя мелиоидоза // Scientific Journal.-

1999.-№7,- p.225-226

27. Меринова Л.К., Антонов В.А., Замараев B.C., Викторов Д.В.. Мобилизация критических плазмид возбудителя мелиоидоза в гетерологичные виды мик-роорганизмов1 // Мол. генет. микробиол. вирусол.- 2000.- №.2,- С.37-40.

28 Антонов В.А., Илюхин В.И., Замараев B.C., Трушкина М.Н. Использование плазмид возбудителя мелиоидоза в качестве ДНК-зондов для идентификации близкородственных микроорганизмов // Биотехнология.- 2000.-№.4,- С.8-14.

29. Antonov V.A., Zamaraev V.S., Zakharova I.B., Ilyukhin V.l. Discovery of resident plasmids among pathogenic species of Burkholderia II Scientific Journal.-

2000.-№.8,- P. 135-137.

30 Антонов B.A., Замараев B.C., Захарова И.Б., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Попов С.Ф. Изучение плазмид патогенных буркхолдерий // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб.науч. тр. (под ред. Н.Г. Тихонова).- Волгоград: Изд-во «Принт», ВолГУ, 2000.- С.41-46.

31. Tkatchenko G.A., Antonov V.A., Zamaraev V.S.,.Ilyukhin V.I, Alekseeva V.V., Zintchenko O.V. Detection and identification of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei by PCR // Natural infectious diseases. Abstract of scientific conference. 6 December, 2001, Ulaanbaatar, Mongolia, 2001,- P.68-70.

32. Антонов B.A., Ткаченко Г.А., Алексеева B.B., Замараев B.C., Илюхин В.И., Трофимов Д.Ю. Использование ПЦР для идентификации патогенных бурк-хольдерий // Мат. IV Всеросс.научно-практ. конф «Генодиагностика инфекционных заболеваний»,- Москва, 2002.- С.258-259.

33. Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Замараев B.C., Илюхин В.И., Алексеева В.В., Зинченко О.В. Идентификация патогенных буркхольдерий методом ПЦР // Материалы VIII съезда Всеросс. общества эпидем., микроб, и паразитологов.- Москва, 2002,- С.347-348.

34. Захарова И.Б., Викторов Д.В., Замараев B.C. Клонирование и экспрессия 7.55 т.п.н. Kpnl фрагмента плазмиды рРМ 1 Burkholderia pseudomallei в Escherihia coli II Мол. генет., микробиол., вирусол,- 2002,- №2,- С. 19-22.

35. Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алексеева В.В., Замараев B.C., Илюхин В.И. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане,- 2002,- Вып 5,- С.22-25.

36. Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Замараев B.C., Алексеева В.В., Илюхин В.И. Применение ПЦР при экспериментальном сапе / Мат. научно-практического симпозиума в рамках международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины»,- Москва, 2002.- С.310-312.

37. Антонов В.А., Гришкина Т.А., Замараев B.C., Илюхин В.И. Влияние температуры культивирования на внехромосомные факторы наследственности возбудителя мелиоидоза // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол,-2003,-№.2,- С.3-7.

38. Антонов В.А., Алтухова В.В., Ткаченко Г.А , Бахтояров Г.Н., Будченко A.A., Замараев B.C., Илюхин В.И. Молекулярно-биологические методы внутривидового типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза // Мат. IV межгосударственной науч.-практ. конф. государств стран СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней».-Саратов, 2003.- С. 17-19.

39. Алексеева В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Замараев B.C., Будченко A.A. Использование произвольных праймеров (RAPD) для внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане,- 2003,- Вып 7.- С.49-51.

40. Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Замараев B.C., Илюхин В.И. Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции // Мол. генет. микробиол. вирусол.- 2003.- №.3.- С.7-11.

41 Замараев B.C., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Илюхин В.И. ПЦР-диагностика патогенных буркхольдерий // Мат. IV межгосударственной науч.-практ. конф. государств стран СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней».- Саратов, 2003.- С.62-63.

42. Патент на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам № 2218401 / Антонов В.А, Замараев B.C., Илюхин В.И.- Зарегистрировано в Гос. реестре изобретений РФ 10.12.2003.

43. Алтухова В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Плеханова Н.Г., Бахтояров Г.Н., Савченко С.С., Замараев B.C., Илюхин В.И. Генодиагностика сапа и ме-лиоидоза // Мат. XI Российского национального конгресса «Человек и лекарство»,- Москва, 2004.- С.417.

44. Замараев B.C. Антонов В.А. Методы обнаружения биологических поражающих агентов с помощью генодиагностики // Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму.- Волгоград.- 2004,- С. 149-170.

45. Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Замараев B.C., Илюхин В.И., Трофимов Д.Ю. Использование ПЦР для идентификации Burkholderia mallei II Мол. генет. микробиол. вирусол,- 2004,- №.1- С12-17.

Подписано к печати 11.04.2005 Формат 84x108 1/6. Объем 2 уел п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 324 Издательство Волгоградской государственной академии физической культуры

11 8 4 09

РНБ Русский фонд

2006-4 13702

>

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Замараев, Валерий Семенович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА

ТАКСОНОМИЯ, БИОЛОГИЯ И ГЕНЕТИКА БУРКХОЛЬДЕРИЙ

1.1. Геносистематика буркхольдерий.

1.2. Биологические свойства и генетика патогенных буркхольдерий

1:3- Гибридизационный анализ буркхольдерий.

ГЛАВА

ПЛАЗМИДЫ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА

2.11. Роль плазмид в биологии микроорганизмов.

2.2. Выделение плазмидной ДНК из штаммов буркхольдерий.

2.2.1. Ускоренный метод обнаружения плазмид В.рзеис1ота1Ы.

2.2.2. Препаративное выделение плазмидных ДНК В.рзеис1ота1Ы.

2.31 Плазмидныйанализ штаммов буркхольдерий.

2.3-.1. Изучение плазмидного спектра штаммов В.рБегкЛотаИег.

2.3.2. Изучение стабильности наследования плазмид В.рзеис1ота1Ш.

2.3.3. Рестрикционный анализ- внехромосомных ДНК буркхольдерий.

2.4. Изучение гомологии плазмидных ДНК.буркхольдерий.

2.4.1. Изучение взаимной гомологии плазмид возбудителя мелиоидоза.

2.4.2. Изучение гомологии плазмид возбудителя мелиоидоза с ДНК гетерологичных видов микроорганизмов.

2.4.3. Изучение гомологии ДНК криптической плазмиды рРМ1и фагов возбудителя мелиоидоза.

ГЛАВА

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ПЛАЗМИД ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА

З.Г. Физическое картирование плазмид В.ръеийотаЬШ

3.1.1. Рестрикционный анализ и построение физической карты рРМ

3.1.2. Рестрикционный анализ и построение физической карты рСМ2 . 106' 3.2 Функциональная организация плазмидВ.р$еш1ота11е

3.2.1. Локализация-области начала репликации плазмиды рРМ

3.2.2. Клонирование фрагментов плазмиды рМ1 и изучение-продуктов экспрессии.

3.2.3. Клонирование фрагментов плазмиды рСМ2 и изучение продуктов экспрессии.

ГЛАВА

ПЛАЗМИДНЫЕ ВЕКТОРЫ И КЛОНИРОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ДЕТЕРМИНАНТ БУРКХОЛЬДЕРИЙ

4:1. Получение векторов для широкого круга бактериальных хозяев:.

4.2. Передача криптических плазмид B.pseudomallei в J?, mallei.

4.2.1. Мобилизация плазмидных репликонов возбудителя мелиоидоза в штаммы возбудителя сапа.

4.2.2. Анализ плазмидных профилей и фенотипических свойств трансконьюгантов В.mallei.

4.3. Клонирование генетических детерминант B.pseudomallei

4.3.1. Конструирование и анализ геномной библиотеки на основе плазмидного вектора pBR

4.3.2. Конструирование и анализ геномной библиотеки на основе плазмидного вектора pUC 19.

4.3.3. Конструирование и анализ геномной библиотеки на основе плазмидного вектора pBR

ГЛАВА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ

5.1. Молекулярно-генетические методы дифференциации и идентификации микроорганизмов.

5.2. Генетическая трансформация как метод идентификации*.

5.3. Рестрикционный анализ (ПДРФ) микроорганизмов

5.4. Получение группоспецифического ДНК-зонда для идентификации буркхольдерий

5.4.1. Оценка гибридизационной активности рестрикционных фрагментов криптической плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза.

5.4.2. Конструирование ДНК-зонда на основе фрагмента криптической плазмиды рРМ

5.4.3. Выявление гомологии ДНК фага М13 и генома возбудителя мелиоидоза.:.

5.5. Идентификация патогенных буркхольдерий методом полимеразной цепной реакции.

5.5.1. Отработка условий постановки ПЦР.■.

5.5.2. Конструирование и анализ эффективности праймеров на основе гена

23 S рРНК.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка основ молекулярно-генетического исследования возбудителя мелиоидоза и близкородственных буркхольдерий"

Прогресс в изучении патогенности микроорганизмов в значительной мере обязан развитию генетических и молекулярно-биологических исследований. Результаты полученные последние годы на модели возбудителей инфекционных заболеваний существенно'расширили наше представление о роли детерминант, имеющих отношение к реализации* патогенности, их первичной структуре и генетической организации, механизмах патогенеза-и формирования антибиотикоустойчивости микроорганизмов, что имеет основополагающее значение для разработки эффективных средств профилактики, лечения и диагностики инфекций. Достаточно интенсивному изучению в этом направлении подвергались и возбудители особо опасных инфекций.

Вшеречне опасных инфекционных заболеваний мелиоидоз и сап всегда занимали место экзотических инфекций" с ограниченным ареалом распространения [14, 44, 133]. Burkholderia mallei вызывает тяжелое инфекционное заболевание у человека и довольно широкого круга животных. В отличие от мелиоидоза нозоареал сапа существенно сузился и прежде широко распространенный среди различных'животных во-многих странах, в том числе во Франции, Германии' и России^ в дальнейшем в большинстве стран сап был практически ликвидирован. Но в некоторых из них', в,частности, Турции, Иране, Монголии и Италии, сап продолжает регистрироваться [14, 67]. Заболеваемость сапом людей отмечается редко. Большие эпидемии не наблюдаются. На территории СССР'сап считался полностью ликвидированным.

В России, как и в других странах СНГ, не было зарегистрировано до сих пор ни одного достоверного случая мелиоидоза, но существуют эндемичные очаги в странах Восточной, Средней и Юго-Восточной^ Азии (Иран, Индия, Турция, Вьетнам, Таиланд, Сингапур, Китай и др.), с которыми имеются обширные экономических и культурные контакты [160, 168, 187, 197, 214, 215, 216, 249, 289, 309].

В 70-х годах прошлого века произошло существенное изменение точки зрения на географию и эпидемиологию этой инфекции [157, 159, 251, 253]. Заболевание мелиоидозом людей и животных и выделение культур Burkholderia pseudomallei из внешней среды в Австралии, Франции, Италии; странах Центральной и Южной Америки показали всю серьезность проблемы диагностики, лечения при почти непредсказуемых последствиях завоза возбудителя в страны с умеренным климатом [14, 129, 137, 152, 158, 167, 168, 241]. Серьезность отношения мировой медицинской общественности к проблеме мелиоидоза подчеркивается* проведением с интервалом в 3 года международных конгрессов в Таиланде (1998), Австралии (2001) и Сингапуре (2004).

Учитывая высокую инфекциозность возбудителей мелиоидоза и сапа* при аэрогенном заражении, формирование тяжелых форм инфекций, трудности их диагностики и высокую летальность, следует считаться с мнением отечественных и зарубежных специалистов, рассматривающих возможность применения В.pseudomallei и B.mallei в качестве биологического оружия и потенциальных агентов биотерроризма категории В, входящих в перечень Centers for Disease Control [110, 148, 151, 244, 268, 304]. Не являясь для России эндемичными, мелиоидоз и сап включены постановлением Правительства РФ в «Перечень заболеваний, представляющих опасность для окружающих» [75].

Таксономическое положение В.pseudomallei и B.mallei долгое время оставалось недостаточно ясным. По основным биологическим свойствам возбудители сапа и мелиоидоза в 8-ом и 9-ом изданиях определителя Bergey были включены в род Pseudomonas, довольно размытого по своим таксономическим границам семейства Pseudomonadaceae [240]. В это семейство входили микроорганизмы с ГЦ-типом в диапазоне от 58 до 71 моль%. Хотя в отдельных работах по изучению ДНК-ДНК гомологии, в том числе проведенных в нашей лаборатории, возбудители сапа и мелиои-доза не обладали таковой с большинством представителей этого рода, они были отнесены ко второй группе рРНК-ДНК гомологии псевдомонад, куда помимо них входили также пять видов фитопатогенных псевдомонад (Pseudomonas cepacia, Pseudomonas gladioli, Pseudomonas pickettii, Pseudomonas solanacearum, Pseudomonas caryophylli).

Дальнейшие исследования уровня филогенетического родства различных групп псевдомонад по результатам секвенирования нуклеотидов 16 S рРНК позволили Yabuuchi et al. (1992) выступить с предложением о выделении 7 видов псевдомонад второй группы рРНК-ДНК гомологии в самостоятельный род Burkholderia [307].

Наличие в природе бактерий, генетически и иммунологически близких к возбудителям сапа и мелиоидоза, но при этом не патогенных для, человека и животных, является давно установленным фактом [9, 136, 223, 280]. Однако лишь в последнее десятилетие, благодаря повысившемуся интересу к проблеме заболеваемости мелиоидозом в мире, изучение биологических характеристик буркхольдерий распространилось не только на клинические изоляты, но и на огромное количество культур, выделенных с помощью селективных сред из внешней среды эндемичных территорий [140, 154, 223, 301, 306]. В ходе этих исследований особое внимание уделено так называемым B.pseudomallei-like штаммам, основное различие которых с возбудителем мелиоидоза состояло лишь в авирулентности для лабораторных животных и более высокой биохимической активности по отношению к олигосахаридам из группы пентоз. Основные диагностические признаки, имеющие значение при серологической диагностике и анализе культур в дифференциальных полуавтоматических системах типа API 20 NE, у этих культур и вирулентных типичных штаммов B.pseudomallei были идентичны [140, 301].

Стабильность дифференциальных признаков (vir , ага+), в сочетании с наличием минорных различий нуклеотидных последовательностей при секвенировании фрагментов 16S рРНК, позволили P.Brett et al. (1998) выделить эти микроорганизмы в самостоятельный вид рода Burkholderia — Burkholderia thailandensis [138]. Несмотря на небольшую дискуссию, последовавшую за этой публикацией, большинство специалистов одобрили это таксономическое нововведение и в публикациях наименование B.thailandensis вытеснило* аморфное — B.pseudomallei-like spp. Необходимость изучения гено- и фенотипических свойств этого вида микроорганизма очевидна как в направлении разработки диагностических и профилактических средств, так и в плане расшифровки механизмов реализации па-тогенности близких ему возбудителей особо опасных инфекций - сапа и мелиоидоза. Так, S.L.Stocki и D.E.Woods (2004) среди большой группы исследованных генов B.thailandensis выявили два, действие которых подавлялось в присутствии арабинозы [287]. Но мнению« авторов, данные гены, имеющиеся и у B.pseudomallei, могут иметь значение в реализации патогенных функций возбудителя мелиоидоза.

Наличие у бактерий внехромосомных элементов наследственности несомненно является чрезвычайно важным фактом. Устойчивость к химическим и физическим агентам, катаболизм органических соединений и детерминация бактериоцинов, участие в рекомбинационных и репарационных процессах бактериальной клетки - только незначительный перечень известных свойств микроорганизмов обусловленных внехромосомными репликонами [20, 58, 80].

Особого внимания заслуживают плазмиды, имеющие отношение к реализации вирулентных свойств патогенных бактерий. Многоплановое и детальное изучение геномной организации Yersinia pestis позволило, в частности, дать физическую и функциональную характеристику внехромосомных элементов, имеющих существенное значение для реализации патогеннности возбудителя-чумы [60, 61, 91, 134, 162, 278]. Плазмиды, имеющие отношение к реализации патогенности, известны также у возбудителей сибирской язвы, псевдотуберкулеза, бруцеллеза, сальмонеллезов, дизентерии и др. [56, 79, 92, 123, 170, 224, 299]. Молекулярное клонирование обеспечило изучение природы и функции продуктов экспрессии выявленных детерминант, разработку на основе анализа хромосомной и плаз-мидных ДНК эффективных средств детекции штаммов методами ДНК-ДНК гибридизации и полимеразной цепной реакции [52, 87, 88, 98, 121]. Изучение' плазмид, ответственных за синтез видоспецифических антигенов, на которых основана иммунодиагностика возбудителей опасных инфекционных заболеваний, способствовало совершенствованию и конструированию принципиально новых диагностических препаратов и тест-систем. Богатый плазмидный спектр у многих видов патогенных бактерий позволяет использовать плазмидный скрининг для типированиш клинических штаммов и проведения эпидемиологического анализа*[78, 122].

Возбудители мелиоидоза и сапа достаточно долго оставались в числе-малоизученных. Методические приемы работы с нуклеиновым^ материалом, как хромосомным, так и внехромосомным, разработаны не были. Исследование собственных плазмид возбудителя мелиоидоза было начато в 80-е годы [76]. Единичные публикации появившиеся позже о выявлении или невыявлении плазмидных репликонов- у возбудителя мелиоидоза не давали представления о природном носительстве, закономерности их распространения и функциональной значимости. Наличие плазмидных репликонов у возбудителя мелиоидоза было также отмечено-в кратком сообщении Tanphaichitra D. (1989), о передаче плазмиды B.pseudomallei ъ Salmonella typhi и-последующем серологическим выявлением у нее антигенов, мелиоидозного микроба [291]. Заслуживает внимания и работа-Jigen J. и Li L. (1992), в которой отмечен не только факт обнаружения в 7 штаммах возбудителя мелиоидоза криптической плазмиды, размером 28,44 т.п.н., но и показана связь с географическим регионом, в котором обнаружен плаз-мидосодержащий штамм [193].

В недавней работе тайских ученых по исследованию геномной организации B.pseudomallei на наборе из 20 штаммов отмечено, что ни один из них не содержал ДНК плазмид [281]. Однако другими авторами в двух штаммах возбудителя мелиоидоза, выделенных в том же Таиланде, обнаружены две плазмиды небольшого размера [254].

В то же время, известно, что плазмиды широко распространены среди представителей рода Pseudomonas, в который до недавнего времени входили возбудители сапа и мелиоидоза. Достаточно хорошо изучены половые факторы, плазмиды антибиотикорезистентности и биодеградации, обеспечивающие псевдомонадам адаптацию к условиям существования в природе [21, 22]. Разнообразие биосинтетических и катаболических реакций у представителей рода Pseudomonas, широко населяющих биосферу и' принимающих активное участие в процессах минерализации органических соединений, очистке окружающей среды от загрязнений, прямо или косвенно связано с плазмидными репликонами [14, 20, 101].

У Burkholderia cepacia, одного из близкородственных B.pseudomallei микроорганизмов, обнаружены плазмиды биодеградации органических соединений, гербицидов, а также плазмиды, детерминирующие устойчивость к ряду неорганических соединений [21, 44, 93, 101, 135, 144]. Известно,' что возбудитель мелиоидоза также обладает целым рядом уникальных свойств, позволяющих ему персистировать и даже размножаться во внешней среде [179, 188, 201,297].

Публикации, непосредственно относящиеся к генетике возбудителей сапа и мелиоидоза, касаются, прежде всего, работ по получению у того и другого видов маркированных штаммов [105, 108, 119], а таюке изучению генетической трансформации [1,2, 24, 96, 102, 104, 107] и конъюгации [4, 5, 7, 68]. С помощью различных мутагенов получен набор полимаркированных штаммов В.рйеис1ота1Ш с зависимостью" от аминокислот и азотистых оснований, а также штаммов, дефектных по протеазам, антигену 8, подвижности и с измененной вирулентностью [69,* 84].

Рядом авторов показана возможность коньюгационного переноса в клетки возбудителей сапа и мелиоидоза КР4 и некоторых других плазмид 1пс Р-1 группы несовместимости [4, 7]. Плазмиды данной группы несовместимости обладают способностью к интеграции с хромосомой В.рзеис1отс11Ш и мо1ут осуществлять мобилизацию хромосомных маркеров [68, 69].

Исследование систем генетического обмена возбудителя мелиоидоза показало, что В.рзеис1ота1Ы способна к трансформации в условиях естественной компетентности. Это позволило использовать метод трансформации для изучения' генома- возбудителя' [24, 103, 106]. Исследования, направленные на изучение природной'компетентности вида, не только-расширили знания о геноме возбудителя мелиоидоза, но>и-позволили^ разработать метод идентификации патогенных буркхольдерий, основанный на генетической трансформации хромосомной ДНК [102].

В последние годы появились первые публикации о клонировании генетического материала возбудителя мелиоидоза [3, 145, 146, 290]. Однако системы клонирования на представителях патогенных псевдомонад и возможность использования для этих целей известных векторных молекул только апробируются.

Заметное место среди перспективных методов-начинают занимать генотипические методы идентификации, позволяющие детектировать определенные участки генома микроорганизма. Среди-генетических диагностических тестов наибольшее применение находят гибридизация нуклеиновых кислот, плазмидный анализ, полимеразная цепная реакция, секвени-рование и др. [8, 15, 16, 265, 267, 294, 296]. Метод молекулярной гибридизации, сводящийся к определению сходства нуклеотидных последовательностей, считается одним из наиболее результативных как в решении спорных вопросов систематики, так и при установлении таксономического положения трудно идентифицируемых обычными методами штаммов.

Гомология ДНК между близкородственными микроорганизмами может достигать очень высокого уровня. Так, например, у представителей видов Y.pestis и Yersinia pseudotuberculosis обнаружено сходство нуклео-тидных последовательностей до 80-100% [141]. Гомология нуклеотидных последовательностей ДНК B.pseudomallei и В.mallei составляет 99-100%, на основании чего некоторые авторы предлагают рассматривать их как биовары одного вида [44, 194, 236, 257, 265]. Филогенетически близкими патогенным буркхольдериям также являются В.cepacia и B.thailandensis [138, 298]. Сходные данные о высокой степени гомологии получены при анализе результатов ДНК-ДНК гибридизации и-у других микроорганизмов [16].

Наличие негомологичных участков у близкородственных видов является предпосылкой для поиска видоспецифических нуклеотидных последовательностей, на основе которых создаются диагностические ДНК-зонды, позволяющие с использованием метода ДНК-ДНК гибридизации идентифицировать микроорганизмы. С помощью ДНК-зондов можно выявлять эпидемически значимые, антибиотикорезистентные или атипичные штаммы микроорганизмов.

К настоящему моменту ДНК-зонды сконструированы для-широкого круга патогенов микробной и вирусной природы. Получены видоспецифи-ческие ДНК-зонды для- идентификации, и дифференциации возбудителей чумы, холеры, сибирской^ язвы, легионеллеза, сальмонеллеза, энтеропато-генной кишечной палочки и многих других микроорганизмов [13, 59, 62, 72, 73, 88, 109, 120, 164, 228, 270]. Первое сообщение о создании видоспе-цифического ДНК-зонда для идентификации возбудителя мелиоидоза опубликовано Sermswan R.W.et al. (1994) [274].

Революция в молекулярной, биологии, связанная- с определением нуклеотидной последовательности, привела к возникновению нового мо-лекулярно-генетического направления в диагностике инфекционных болезней - полимеразной цепной реакции (ПЦР), как одного из наиболее чувствительных, специфичных и легко применимых в лабораторной практике молекулярно-биологического метода идентификации микроорганизмов и типирования штаммов^ ПЦР открывает новые возможности для установления эпидемиологических связей, прогнозирования эпидемической ситуации при изменении свойств «циркулирующих штаммов» [29; 30, 152, 227].

Рассматривая современные методы идентификации буркхольдерий, следует отметить и методы прямого'сравнения их нуклеотидных последовательностей. Существенный прорыв,в изучении буркхольдерий намечается в.связи с секвенированием их геномов.[147, 191, 275]. Проведенные исследования геномной организации' и нуклеотидной последовательности B.psendomallei показало наличие у возбудителя- мелиоидоза двух хромосом с функциональным разделением генов между ними [183]. По мнению авторов^ геноме имеются участки сравнительно недавно приобретенные, что свидетельствует о высокой генетической'пластичности возбудителя, обеспечивающей ему полипатогенность и приспособляемость к выживанию в условиях внешней- среды [184]. Анализ геномных последовательностей буркхольдерий выявил множество гомологичных участков- у B.psendomallei и В.mallei, отсутствующих у B.thailandensis [230]: Проведенное сравнительное исследование вирулентных и авирулентных культур позволило определить набор генов; потенциально имеющих отношение к вирулентности, что открывает новые перспективы .в изучении и-понимании генетических механизмов реализации-патогенности возбудителей мелиоидоза и сапа. Информация о секвенировании генома этих микроорганизмов может быть использована для разработки быстрых и точных методов диагностики и дифференциации патогенов, от близкородственных микроорганизмов [192, 312].

Развитие эпидемиологической ситуации в России в современный условиях, по разным причинам способствующей росту инфекционной заболеваемости, а также возросший уровень экономических связей, наряду со- снижением санитарного контроля, диктуют необходимость настороженности- со стороны медицинской и ветеринарной служб нашей страны, к возможным случаям- появления такой прежде экзотической для России.инфекции как мелиоидоз.

На основании изложенного, представляется необходимым проведение научных исследований, направленных на изучение особенностей геномной организации буркхольдерий, включая анализ внехромосомных ре-пликонов, выявление детерминант, ответственных за реализацию патоген-ности, поиск видоспецифических последовательностей и разработку современных генотипических методов'идентификации.

Представленная диссертация содержит обобщенные результаты государственных тем, выполненных в лаборатории молекулярной биологии Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в этих направлениях. Вошедшие в диссертацию материалы получены как лично соискателем, так и в соавторстве с сотрудниками лаборатории, работавшими под его руководством. Некоторые эксперименты проведены совместно с сотрудниками лабораторий генетики и структурно - функционального анализа микроорганизмов.

Цель работы заключалась в молекулярно-генетическом исследова-штлгВ.рзеийотаИег и близкородственных видов с использованием гибри-дизационного, плазмидного, рестрикционного анализа, клонирования генетических детерминант и в разработке основ генетических методов идентификации патогенных буркхольдерий.

Задачи исследования:

1. Изучить уровень внутривидовой и межвидовой гомологии ДНК буркхольдерий и оценить значение гибридизационного анализа в качестве таксономического критерия.

2. Сконструировать многофункциональные плазмидные векторы, способные реплицироваться в клетках B.pseudomallei, В.mallei, E.coli, B.subtilis, оценить их стабильность в этих видах микроорганизмов в зависимости от условий селекции.

3. Получить геномные библиотеки B.pseudomallei на основе плаз-мидных векторов и провести анализ рекомбинантных клонов E.coli с целью выявления генетических детерминант, имеющих отношение к реализации некоторых биологических свойств возбудителя мелиоидоза.

4. Осуществить поиск оптимальных методов плазмидного скрининга штаммов B.pseudomallei. Изучить плазмидный спектр штаммов возбудителя мелиодоза с оценкой стабильности наследования плазмид и возможности их использования в качестве маркеров для внутривидового типирова-ния.

5. Разработать технику препаративного выделения плазмидных ДНК B.pseudomallei, провести гибридизационный, рестрикционный анализ и физическое картирование внехросомных репликонов микроорганизма.

6. Изучить возможность экспрессии криптических плазмид B.pseudomallei в близкородственных видах буркхольдерий: провести мобилизацию плазмидных репликонов и охарактеризовать стабильность и фе-нотипические проявления,их в рекомбинантных штаммах.

7. Осуществить клонирование фрагментов криптических плазмид возбудителя мелиоидоза и провести анализ продуктов экспрессии в клетках E.coli с целью выявления генетических детерминант, имеющих функциональное значение.

8; ©ценить эффективность метода генетической трансформации: для идентификации патогенных буркхольдерий и значение анализа полиморфизма. длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) для внутривидовой^ дифференциации.

9. Разработать, методические подходы к генодиагностике буркхольдерий с. использованием ДНК-зондов на основе фрагментов криптических плазмид возбудителя мелиоидоза и полимеразной цепной реакции на основе последовательностей гена 23S рРНК.

Научная новизна:

Проведено молекулярно-генетическое изучение B.psendomallei и других, представителей Burkholderia и разработаны^ подходы к идентификации; патогенных, буркхольдерий с использованием генотипических методов. На основании' гибридизационного; анализа: установлен; высокий; уровень ДНК-гомологии B.psendomallei,. В.mallei и- BJhailandensis как; свидетельство их таксономической близости. Филогенетическое родство данных видов- подтверждается идентичностью их рекомбинационных систем, выявленной во взаимной генетической трансформации-.

Впервые проведено изучение внехромосомных репликонов B.pseudomallei. Выделены и охарактеризованы четыре типа криптических плазмид возбудителя мелиоидоза, отличающихся размерами и профилями рестрикции. Плазмиды стабильно наследуются в клетках микроорганизма в процессе хранения и пассирования штаммов in vitro и in vivo, что открывает перспективы использования плазмидного анализа для внутривидового типирования культур.

Впервые показано:,, что плазмидные репликоны одного типа, выделенные из , штаммов B.pseudomallei pa3личного географического происхождения, имеют идентичные рестрикционные- профили. Все типы плазмид обладают выраженной взаимной гомологией и гомологией с ДНК близкородственных буркхольдерий В.mallei и B.thailandensis, проявляя себя в реакциях гибридизации как хромосомная ДНК B.pseudomallei, что позволяет рассматривать их в качестве резидентных плазмид возбудителя мелиоидо-за.

Впервые осуществлено физическое картирование плазмид возбудителя мелиоидоза рРМ1 и рСМ2. Путем маркирования и клонирования между 10-й и 12-й координатами физической карты критической1 плазмиды рРМ1 локализована область начала репликации и впервые показана возможность функционирования оп-региона плазмиды, возбудителя мелиоидоза в штаммах Е. coli.

Впервые идентифицирована детерминанта криптической плазмиды рРМГ, локализованная между 12-й и 0-й координатами физической карты, ответственная за изменение белкового состава наружной мембраны, развитие множественной антибиотикорезистентности и формирование у реком-бинантного* штамма E.coli капсулоподобной структуры. Установлено, что белки наружной мембраны рекомбинантных клонов, специфически взаимодействующие с иммуноглобулинами поликлональной сыворотки к клеткам B.pseudomallei, способны к ассоциации в высокомолекулярные формы.

Впервые в составе криптической плазмиды рСМ2 идентифицирован Hind III - фрагмент размером 2,471* т.п.н., детерминирующий в рекомби-нантном штамме E.coli синтез белка с молекулярной массой ~100 кДа, специфически взаимодействующий с иммуноглобулинами B.pseudomallei. Секвенирование и анализ с использованием программы BLAST показали наличие гомологии данного фрагмента с представленными в GenBank нук-леотидными последовательностями плазмидных репликонов pSB102 (AJ304453.1) и pIP02T (AJ297913.2), детерминирующими синтез TraS (САС79161.1) и TraR (САС82765.1),белков, соответственно.

При анализе геномной библиотеки B.pseudomallei, полученной на векторе pBR325, отобраны клоны, обладающие в клетках рекомбинантных штаммов E.coli внеклеточной протеазной и гемолитической активностями, а также внеклеточной продукцией мелиоидозных антигенов, выявляемых в реакциях иммунопреципитации и иммуноэлектрофореза фильтратов бульонных культур рекомбинантных штаммов с очищенными IgG и поливалентной мелиоидозной сывороткой. С использованием мультиплексной ПЦР показано наличие в рекомбинантных штаммах дополнительного ам-пликона размером 375 п.н., что свидетельствует о,структурной перестройки их геномов.

С помощью мобилизующей плазмиды RPl::TnlO впервые осуществлена передача криптических плазмид B.pseudomallei рСМ2 и рСМЗ в штамм В.mallei Ц4, определены плазмидные профили и изучены отдельные фенотипические свойства полученных культур. Показано опосредованное влияние криптических плазмид возбудителя мелиоидоза на вирулентность трансконьюгантов.

В репликоне рРМ1 в пределах сайтов Pst Г (5.4) - Ват Ш (9.3) ее физической карты идентифицирован участок, обеспечивающий гомологичную ДНК-ДНК гибридизацию с геномами буркхольдерий. Находящийся в пределах данного участка Sal GI-фрагмент размером 0,4 т.п.н., испытанный в качестве ДНК-зонда и обнаруживший гомологию только с ДНК близкородственных микроорганизмов B.pseudomallei, В.mallei и В. cepacia, был проклонирован в составе фагового вектора М13тр18.

Практическая ценность:

Предложены методы скрининга штаммов B.pseudomallei на наличие внехромосомных репликонов и препаративного выделения плазмид возбудителя мелиоидоза, включенные в методические рекомендации' «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза», утвержденные 1 ноября 1994г. зам. председателя Госкомсанэпиднадзора России Онищен-ко Г.Г. и подтвержденные патентом на изобретение Российского агентства по патентам и товарным знакам № 2218401 от 10.12.2003 г.

Предложен метод идентификации бактериальных- и морфологически , измененных форм патогенных буркхольдерий, вошедший в практические руководства «Мелиоидоз. Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998), «Сап., Лабораторная диагностика возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998) и подтвержденный авторским свидетельством Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий № 1190638 от 16.07.82г.

Сконструирован ряд многофункциональных плазмидных векторов, способных реплицироваться' в Blpseudomallei, В.mallei, E.coli, B-.subtilis, охарактеризована-их стабильность в. клетках указанных видов микроорганизмов в различных селективных условиях. Практическая значимость векторов подтверждена авторскими свидетельствами Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий №-298237 от 3.07.89 г и №-• 322767 от 2.01.91 г.

Разработана технология1 мобилизации мелиоидозных плазмид в В.mallei и получен набор рекомбинантных штаммов возбудителя сапа, содержащих криптические плазмиды рСМ2 и рСМЗ B.pseudomallei, предназначенных для изучения генетических детерминант и функциональной роли данных плазмид (Методические рекомендации «Применение мобилизации для передачи криптических плазмид B.pseudomallei в-гетерологичные виды», утвержденные директором Волгоградского научно - исследовательского противочумного института Тихоновым Н.Г. 20 апреля 1998'г.).

Отработаны-системы клонирования и методы детекции генетических детерминант возбудителя мелиоидоза в-кишечной палочке. Полученные рекомбинантные штаммы E.coli, экспрессирующие отдельных хромосомные и плазмидные признаки B.pseudomallei, депонированы в государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб», а также поддерживаются- в коллекционном центре живых культур Волгоградского научно-исследовательского противоч5^много института.

На основе фрагмента плазмидной ДНК возбудителя: мелиоидоза pPMl сконструирован рекомбинантный фаг М13РМ, являющийся, продуцентом группоспецифического ДНК-зонда для идентификации буркхоль-дерий путем введении1 метки техникой достройки, секвенационного прай-мера. Разработанный метод вошел в методические рекомендации: «Лабораторная; диагностика, лечение* и профилактика сапа», утвержденные; 16 марта 1995 г. зам. председателя Госкомсаиэпидиадзора России Онищенко F.F.; «Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза», утвержденные' 23 сентября 1994 г. зам: председателя ■Роскомсанэпиднадзо-ра России Оншценко T.F., а также в практические руководства «Мелиои-доз. Лабораторная? диагностика возбудителей особо опасных, инфекционных болезней» (Саратов, 1998), «Gan.„ Лабораторная^ диагностикам возбудителей особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 1998).

Разработаны, методические подходы к ПЦР-диганостике: буркхольде-рий, вошедшие в «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов) и эпидемиологов: по вопросам противодействия биотерроризму» (Волгоград, 2004). Путем анализа: гена 23 S pPHK проведены первичные исследования; по поиску видо- и группоспецифических праймеров для выявления патогенных буркхольдерий:

Материалы диссертации• используются при чтении;лекций и проведении практических занятий для? студентов« медико-биологического факультета Волгоградского государственного? медицинского» университета, а^ также накурсах профессиональнойшереподготовкш «Диагностика. особо>опас-ных инфекций, индикация, возбудителей; особо опасных инфекций,, санитарная охрана территории и противоэпидемическая защита населения»,. «Особо опасные инфекции для лаборантов противочумной системы Министерства здравоохранения РФ»; на курсах повышения квалификации «Противодействие биотерроризму» и «Клиническая микробиология», проводимых в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте.

Положения, выносимые на защиту

1. На основании современных молекулярно-генетических технологий, включающих гибридизационный, плазмидный, рестрикционный анализы, клонирование генетических детерминант, разработаны методические' подходы к изучению геномов возбудителя мелиоидоза и родственных ему буркхольдерий В.mallei и B.thailandensis и созданию средств их идентификации и типирования.

2. Штаммы возбудителя мелиоидоза* содержат четыре вида плазмид, отличающихся размерами и рестрикциоными профилями, стабильно наследующихся в процессе хранения и пассирования' культур in vitro и- in vivo. Данные внехромосомные репликоны можно считать резидентными для возбудителя мелиоидоза на основании1 идентичности профилей рестрикции плазмид одного размера, выделенных из штаммов B.pseudomallei отдаленных географических регионов, отсутствия ДНК-гибридизации с гетерологичными видами микроорганизмов, выраженной гомологии всех внехромосомных репликонов между собой, а также с ДНК B.pseudomallei и ДНК родственных буркхольдерий (при, отсутствии в них плазмид).

3. Ori-регион плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза способен функционировать в клетках кишечной палочки. Клонированная в E.coli последовательность ДНК плазмиды рРМ1, локализованная в пределах 12 и О координат её* физической карты, детерминирует в штаммах кишечной палочки множественную резистентность к антибиотикам, формирование капсулоподобной структуры и синтез дополнительных белков наружной мембраны, специфически взаимодействующих с мелиоидозной сывороткой.

4. Hind Ш - фрагмент, размером 2,471 т.п.н., плазмиды рСМ2 возбудителя мелиоидоза детерминирует в рекомбинантном штамме E.coli синтез белка с молекулярной массой -100 кДа, специфически взаимодействующего с иммуноглобулинами B.pseudomallei. Данный фрагмент обладает гомологией с представленными в GenBank нуклеотидными последовательностями плазмидных репликонов pSB102 и р1Р02Т, ответственных за синтез TraS и TraR белков.

5. Криптические плазмидные репликоны рСМ2 и рСМЗ B.pseudomallei мобилизуются в щтаммы близкородственного вида В.mallei коньюгативными плазмидами PI группы несовместимости, стабильно наследуются в трансконъюгантах, как правило, вместе с мобилизующими плазмидами, образуя в ряде случаев делеционные варианты и оказывая опосредованное влияние на< вирулентность рекомбинантных штаммов возбудителя сапа.

6. Клонированные последовательности хромосомной ДНК B.pseudomallei обеспечивают рекомбинантным.штаммам E.coli внеклеточную протеазную и гемолитическую активности, а также внеклеточную продукцию мелиоидозных антигенов, выявляемую в реакциях иммунопре-ципитации, иммуноэлектрофореза фильтратов бульонных культур рекомбинантных штаммов с очищенными IgG и поливалентной мелиоидозной сывороткой. Мультиплексная ПЦР обнаруживает в рекомбинантных штаммах дополнительный ампликон размером 375 п.н.

7. B.pseudomallei обладает высокой степенью ДНК-гомологии, а также сходством- рекомбинационных систем с В'.mallei и B.thailandensis. Феномен генетической трансформации, основанный на природной трансфор-мабельности возбудителя мелиоидоза, является эффективным методом идентификации B.pseudomallei, в том числе, в случаях латентного течения мелиоидозной инфекции, а также близкородственных буркхольдерий.

8. Фрагмент плазмиды pPMl возбудителя мелиоидоза, находящийся в пределах сайтов Pst I (5.4) - Ваш Ш (9.3) ее физической карты, обладает, гомологией с геномами буркхольдерий, выявляемой в ДНК-ДНК гибридизации. Рекомбинантный фаг М13РМ, содержащий Sal GI-фрагмент гомологичного участка криптической плазмиды, является- продуцентом груп-поспецифического ДНК-зонда для идентификации буркхольдерий.

Апробация работы

Диссертация выполнена на основе 13 государственных плановых тем, в 9 из которых соискатель являлся научным руководителем. Основные результаты диссертации изложены в 45- опубликованных работах, в том числе в двух патентах, трех авторских свидетельствах, двух коллективных монографиях и практическом пособии по подготовке врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму. Материалы диссертации. были представлены на. 1-ой Всесоюзной, конференции «Теоретическая и прикладная инфекционная иммунология». (Москва, 1982), Российской научной конференции «Генетика и биохимия* вирулентности особо опасных инфекций» (Волгоград, 1992), Российской научной конференции «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней» (Ставрополь, 1993), 7-ом международном конгрессе «Бактериология и прикладная микробиология» (Прага, 1994), международном симпозиуме «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 1995), международной- научной конференции, посвященной 150-летию со дня> рождения- И.И.Мечникова'(Харьков; 1995), научно-практической конференции, посвященной 100-летию образования противочумной службы России (Саратов, 1997), научно-практической конференции «Проблемы санитарно-эпидемиологической охраны территории стран СНГ» (Саратов, 1998), научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария.» (Киров, 1998), научной конференции, посвященной 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии» (Оболенск, 1999), 1-й научно-практической конференции «Генная диагностика особо опасных инфекций» (Саратов, 2000), VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), научно-практическом симпозиуме в рамках международной конференции «Геномика, протеоми-ка и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002), IV всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002), IV межгосударственной научно-практической конференции государств стран СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003). XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), на итоговых ежегодных научных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.

Объем и структура работы.

Диссертация изложена в форме монографии на 279 листах машинописного текста, состоит из введения и 5 глав, включающих описание литературных данных и результаты собственных исследований, заключения и выводов. Работа содержит литературные ссылки и иллюстрации в виде 22 таблиц и 90 рисунков. Указатель литературы включает 312 источников.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Замараев, Валерий Семенович

ВЫВОДЫ

1. С использованием современных молекулярно-генетических методов (гибридизационного, плазмидного, рестрикционного анализа, клонирования генетических детерминант) проведено изучение геномов B.pseudomallei и родственных ей видов буркхольдерий и определены методические подходы к созданию средств их идентификации и типирования.

2. Разработаны эффективные методы плазмидного скрининга штаммов и препаративного выделения плазмидных ДНК B.pseudomallei. Впервые выявлены и охарактеризованы криптические плазмиды возбудителя мелиоидоза, обозначенные pPMl, рСМ2, рСМЗ и рСМ4. Плазмиды стабильно наследуются в процессе хранения и пассажей штаммов B.pseudomallei in vitro и in vivo, что открывает возможность использования плазмидного анализа для внутривидового типирования культур возбудителя мелиоидоза.

3. Определены размеры плазмид возбудителя мелиоидоза, показана идентичность профилей рестрикции плазмидных репликонов одного размера, независимо от места и времени выделения культуры. Все типы плазмид обладают выраженной взаимной гомологией и гомологией с ДНК близкородственных буркхольдерий B.mallei и B.thailandensis, проявляя себя в реакциях гибридизации как хромосомная ДНК B.pseudomallei, что позволяет рассматривать их в качестве резидентных плазмид возбудителя мелиоидоза;

4. Осуществлено физическое картирование плазмид возбудителя мелиоидоза pPMl и рСМ2. Путем маркирования и-клонирования локализована область начала репликации pPMl между 10-й и 12-й координатами физической карты криптической плазмиды. Показана возможность функционирования ori-региона криптической плазмиды возбудителя мелиоидоза в штаммах E.coli.

5. Путем клонирования и последующего анализа показано, что плаз-мида рРМ1 содержит детерминанты, ответственные за развитие множественной антибиотикорезистентности, изменение белкового состава наружной мембраны и формирование у рекомбинантного штамма E.coli капсуло-подобной структуры. Белки, наружной* мембраны рекомбинантных клонов специфически взаимодействуют с иммуноглобулинами поликлональной мелиоидозной сыворотки и способны к ассоциации в более высокомолекулярные формы."

6. Установлено,- что Hind"III — фрагмент размером 2,471 т.п.н. плазмиды рСМ2 детерминирует в рекомбинантном штамме E.coli синтез белка с молекулярной массой 100 кДа, специфически взаимодествующего с иммуноглобулинами возбудителя мелиоидоза. Секвенирование и анализ с использованием программы BLAST позволили выявить гомологию данного фрагмента с представленными в GenBank нуклеотидными последовательностями плазмидных репликонов pSB102 (AJ304453.1) и рГР02Т (AJ297913.2), ответственных за синтез TraS (САС79161.1) и TraR (САС82765.1) белков, соответственно.

7. Осуществлена передача криптических плазмид B.pseudomallei рСМ2 и рСМЗ в штамм P.mallei Ц4 с помощью мобилизующей плазмиды RPl::Tnl0. Плазмидные репликоны возбудителя мелиоидоза стабильно наследуются в новом хозяине в условиях in vitro и in vivo. При пассаже трансконьюгантов на золотистых хомячках происходит структурная перестройка репликона рСМ2, выражающаяся в образовании делеционных вариантов. Показано опосредованное влияние плазмид возбудителя мелиоидоза на вирулентность трансконьгантного штамма возбудителя сапа.

8. Сконструирован ряд многофункциональных плазмидных векторов, способных к репликации в клетках B.pseudomallei, В.mallei, E.coli, B.subtilis. Охарактеризована их стабильность в клетках указанных видов микроорганизмов в различных селективных условиях. Полученные векторы могут быть использованы. для изучения генетических детерминант буркхольдерий, имеющих хромосомную и плазмидную локализацию.

9. На основе вектора pBR325 получена геномная^ библиотека B.pseudomallei. Отобраны клоны, обладающие в клетках рекомбинантных штаммов ,Е. coli внеклеточной'протеазной и гемолитической активностями, а также внеклеточной продукцией антигенов, выявленных в реакциях им-мунопреципитации и иммуноэлектрофореза фильтратов бульонных культур- рекомбинантных штаммов с очищенными IgG и поливалентной^ ме-лиоидозной» сывороткой. Мультиплексной ПЦР показано наличие в рекомбинантных штаммах дополнительного ампликона размером 375 п.н., что свидетельствует о структурной перестройки их геномов.

10. Показано, что природная трансформабельность возбудителям мелиоидоза, проявляющаяся нат плотной питательной среде, позволяет использовать феномен генетической трансформации длящего ¿идентификации, в том числе в случаях латентного течения мелиоидозной инфекции, а также для идентификации близкородственных буркхольдерий В.mallei и B'.thailandensis, обладающих высокой степенью ДНК-гомологии и» сходством рекомбинационных систем по отношению к B.pseudomallei.

11. Установлено, что гомологию с геномами буркхольдерий плазми-ды рРМ1 обеспечивает фрагмент, находящийся в пределах сайтов Pst I (5.4) - Bam Ш (9.3) ее физической карты. Sal Gl — фрагмент гомологичного участка размером 0,4 т.п.н. проклонирован в составе нитевидного фага М13тр18. Полученный рекомбинантный фаг М13РМ может применяться в качестве продуцента группоспецифического ДНК-зонда для идентификации буркхольдерий при-введение метки* техникой достройки секвенацион-ного праймера.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Замараев, Валерий Семенович, Саратов

1. Абаев И.В., Акимова JI.A., Шитов В.Т. и др. Трансформация патогенных псевдомонад плазмидной ДНК // Молекул, генетика.- 1992. №.3-4.- С.17-20.

2. Абаев И.В., Асташкин Е.И. Пачкунов Д.М. и др. Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei: введение и поддержание природных и ре-комбинантных плазмидных репликонов // Молекул, генетика.- 1995.-№.1.- С.28-36.

3. Абаев И.В., Померанцева О.М., Асташкин Е.И. Создание библиотек геномной ДНК Pseudomonas mallei и Pseudomonas pseudomallei. II Мол. генет., микробиол. вирусол.- 1997.- №.1.- С. 17-21.

4. Агеева Н.П., Меринова JI.K. Влияние условий скрещивания на эффективность передачи плазмиды RP4 у Pseudomonas mallei II Микро-биол.журн.- 1986.- №.5.- С.3-6.

5. Агеева Н.П., Меринова JI.K., Петере М.К. Применение плазмиды рТНЮ для получения донорных штаммов Pseudomonas mallei II Молекул. генетика.- 1989.- №.4.- С. 14-18.

6. Агеева Н.П., Меринова JI.K. Особенности наследования Тп5 клетками Pseudomonas mallei II Мат. Российской научной конференции «Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций».- Волгоград, 1992.- С.26.

7. Анищенко М.А., Меринова JI.K. Мобилизация с помощью плазмид группы несовместимости Р-1 в штаммы Pseudomonas pseudomallei и Pseudomonas mallei потенциальных векторов для клонирования ДНК //Мол. генет., микробиол. вирусол.- 1992. -№.5-6.- С.13-16.

8. Антонов В.А. Первичная характеристика плазмид возбудителя мелио-идоза: Автореф. дис. .канд. мед. наук. Саратов, 1995.- 22с.

9. Антонов В.А., Илюхин В.И., Замараев B.C., Трушкина М.Н. Использование плазмид возбудителя мелиоидоза в качестве ДНК-зондов для идентификации близкородственных микроорганизмов // Биотехнология.- 2000.-№.4.- С.8-14.

10. Ю.Антонов В.А., Гришкина Т.А., Замараев B.C., Илюхин В.И. Влияние температуры культивирования на внехромосомные факторы наследственности возбудителя мелиоидоза // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол.- 2003.- №.2.- С.3-7.

11. П.Антонов Ю:В., Поповцева Л. Д., Ярулин Р.Г. Проблемы-резистентности возбудителя мелиоидоза к антибиотикам // Антибиотики и химио-тер.- 1991.- Т.36, №¡10.- С.26-28.

12. Балахонов-С.В:, Ганин B.C., Урбанович Л.Я! и др. Сравнительное изучение различных методов определения токсигенности Vibrio cholerae II Мол. генет., микробиол. вирусол.- 1999.- №.1.- С.9-12.

13. Беляков;В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомоно-зы.- М.: Медицина, 1990.- 224 с.

14. Блохина И.Н.,Леванова Г.Ф. Геносистематика бактерий и ее'природное значение // Успехи микробиологии. М.: Наука,- 1990,- Т.24'.- С.З-25.

15. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., Антонов А.С. Систематика бактерий (с основами геносистематики) // Н.Новгород: изд-во Нижегородского унта, 1992.- 171 с.

16. Бондаренко В.М. Эволюция бактерального генома // Биохимия и био-физ. микроорганизмов.- Горький, 1982.- С.5-12.

17. Бондаренко В.М., Яблочков А.Л: Эволюция генома и генофонд бактериальных популяций // Журн. микробиол^, эпидемиол., иммунобиол. -1986. -Ж8.-С.92-99.

18. Воронин А.М., Гвоздяк Р.И., Иерепнихатка В.И. и др. Плазмиды Pseudomonas syringae II Изв. АН,СССР.- 1989.- №.6.- С.916-921.

19. Воронин А.М., Кочетков В.В., Скрябин Г,К. Группы несовместимости плазмид биодеградации- нафталина бактерий рода Pseudomonas II Генетика.- 1980.'- Т.16, №.5.- С.792-803.

20. Воронин А.М. Биология плазмид // Успехи, микробиологии.- М.: Наука, 1983.- Т.18.- С.143-163.

21. Воронин А.М., Анисимова Л.А. R-плазмиды Pseudommonas aeruginosa II Антибиотики.- 1984.-№.9.- С.678-695.

22. Будченко A.A. Сравнительный электрофоретический анализ белков патогенных псевдомонад: Автореф.дис.канд.биол.наук. Саратов, 1995.- 24с.

23. Буланцев A.JL, Лозовая H.A. Спонтанная генетическая трансформация у Pseudomonas pseudomallei // Мол. генет., микробиол. вирусол. -1985.-№.9.- С.11-15.

24. Васкоренко З.П., Фролов А.Ф., Смирнов В.В., Рубан Н.М. Жирно-кислотные профили бактерий, патогенных для человека и животных // Киев.: Наукова думка, 1992. - 264 с.

25. Гаранина С.Б. Конструирование тест — системы, основанной на поли-меразной цепной реакции, для детекции возбудителя бруцеллёза // Ав-тореф. дис. .канд. биол. наук. Саратов.- 1996.- 20 с.

26. Гинзбург A.JL, Брюханов А.Ф., Янишевский Н.В. и др. Применение метода генного зондирования для выявления эпидемически опасных штаммов холерных вибрионов // Молекул, генетика.- 1987.- №.11.-С.9-13.

27. Гинзбург A.JL, Горелов В.Н. Молекулярно-генетические методы решения задач медицинской микробиологии и эпидемиологии // Проблемы инфектологии / под ред. C.B. Прозоровского.- М.: Медицина, 1991.- С.139-149.

28. Гинзбург A.JL, Романова Ю.М. Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний // Клин. лаб. диагност.- 1998.- №.2.- С.35-39.

29. Горбунова В.Н., Баранов В.Н. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний.- СПб.: Специальная литература, 1997,- 287с.

30. Гришкина Т.А., Меринова JI.K. Выделение и характеристика умеренных фагов Pseudomonas pseudomallei II Генетика, микробиология и совершенствование методов лабораторной диагностики особо опасных инфекций.- Саратов, 1991.- С.131-135.

31. Гришкина Т.А., Меринова JI.K. Изучение спонтанной фагопродукции Pseudomonas pseudomallei и круга хозяев мелиоидозных фагов среди представителей рода Pseudomonas // Микробиол.журн.- 1993.- Т.55, №.4.- С.43-47.

32. Гришкина Т.А. Явление лизогении у Pseudomonaspseudomallei и сравнительная характеристика мелиоидозных фагов: Дис.канд. мед. наук. -Волгоград.- 1996,- 118 с.

33. Дентовская C.B., Куличенко А.Н. Использование молекулярно — генетических подходов для лабораторной диагностики бруцеллёза // Сб. науч. тр «Проблемы особо опасн. инф.» / Под ред. В.В. Кутырева.- Саратов, 1999.- С.3-11.

34. Домарадский И.В. О «побочных» эффектах плазмид (R-плазмиды и вирулентность) // Мол.генет., микробиол.вирусол.- 1987.- №.6.- С.3-9.

35. Дорофеев А.Н. Распределение животных по степени восприимчивости к сапу // Ветеринария.- 1941.- №.6. С.6-10.

36. Дубейковский A.M., Гафаров А.Б., Наумов A.B. Плазмидный контроль деградации сульфоароматических соединений штаммом Pseudomonas sp. DS 1304//Генетика.- 1992.-Т.28, №.11.-С.34-39.

37. Есикова Т.З., Гршценков В.Г., Кулаков Л.А. и др. Группы несовместимости плазмид биодеградации Е-капролактама бактерий рода Pseudomonas // Мол. генет., микробиол.вирусол.- 1990.- №.4.- С.25.

38. Замараев B.C., Ряпис J1.A. Влияние температуры на динамику размножения возбудителя мелиоидоза в жидкой питательной среде // Патологическая. физиология особо опасных инфекций.- Саратов, 1981.- С. 145-150.

39. Замараев B.C. Л-трансформация возбудителей как один из путей реализации хронического носительства бактерий рода Pseudomonas // Микробиол. журн.- 1987.- Т.49.- №.3.- С.91-96.

40. Замараев B.C., Антонов Ю.В., Илюхин В.И. Индукция морфологических вариантов возбудителя мелиоидоза в организме животных // Труды Волгоградского мед. ин-та,- Волгоград, 1981.- Т.34,- №.4.- С.55-56.

41. Иванова B.C., Лебедева С.А., Гончарова H.A., Гурлева Г.Г. Скрининг плазмид у музейных штаммов чумного микроба, выделенных из разных природных очагов // Мол. генет., микробиол. вирусол.- 1990.-№.3.- С.16-18.

42. Илюхин В.И., Лихолетов С.М., Мельников Б.И. Диффузионные камеры при работе с возбудителями особо опасных инфекций // Пробл. особо опасн. инф.- 1978.- №.4.- С. 21-24.

43. Илюхин В.И. Псевдомонадные инфекции в патологии человека // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1985.- №.2.- С. 110-114.

44. Илюхин В.И. Антигенная структура и серология псевдомонад // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1986.- №.5.- С.88-93.

45. Илюхин В.И., Батманов В.П. Клиника и лечение мелиоидоза // Мелио-идоз /Под ред. акад. Н.Г.Тихонова.- Волгоград, 1995.- С.142-161.

46. Илюхин В.И., Замараев B.C., Каплиев В.И. Микробиология, таксономия и бактериологическая диагностика Pseudomonas pseudomallei II Мелиоидоз / Под ред. акад. Н.Г.Тихонова.- Волгоград, 1995,- С.8-26.

47. Илюхин В.И., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г. и др. Burkholderia thailan-densis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция // Мол. генетика.- 2002.- №.1.- С.7-11.

48. Калина Г.П. Род Pseudomonas-, новые аспекты старой проблемы // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.- 1985.- №.5.- С.91-98.

49. Каплиев В.И., Денисов И.И., Курилов В.Я. Морфологическая характеристика слизистых вариантов Pseudomonas pseudomallei II Журн. микробиол. эпиедмиол. иммунобиол.- 1990.- №.10.- С.41-45.

50. Каминский Г.Д. Быстрые и медленные перестройки генома: молеку-лярно-генетические механизмы изменений вирулентности // Вестн. АМН СССР.- 1989.-№.11.- С.41-49.

51. Кириллина O.A. Физическое картирование ДНК плазмиды pFra чумного микроба, клонирование области, ответственной за синтез кап-сульного антигена: Автореф. дис. . канд.мед.наук.- Саратов, 1992,-19с.

52. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Д. Гловера.- М.: Мир, 1988.- 538 с.

53. Косович П.В., Прозоров-A.A. Естественная трансформация у бактерий //Молекул, генет. микробиол., вирусол.- 1990.- №.1.- С.3-6.

54. Костромина Е.А. Молекулярно-генетические- свойства штаммов холерного вибриона Эльтор с различной эпидемической значимостью: Автореф. дис. .канд. мед. наук. Саратов, 2004. - 22 с.

55. Кравцов А.Н., Корешкова Е.А., Рыжков В.Ю. Собственные плазмиды у возбудителя бруцеллеза // Мат. науч. конф. «Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней».- Ставрополь, 1993.- С.217-218.

56. Краткий определитель бактерий Берги: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Хоулта.- М.: Мир, 1980.- 496 с.

57. Кудлай Д.Г. Внехромосомные факторы наследственности бактерий и их значение в инфекционной патологии.- М.: Медицина,- 1977.- 224 с.

58. Куличенко А.Н. Конструирование молекулярно-генетических систем для детекции возбудителей особо-опасных инфекций: чумы, бруцеллеза и сибирской язвы // Автореф. дис. . докт. мед. наук. Саратов, 1995-43 с.

59. Кутырев В.В., Попов Ю.А., Проценко O.A. Плазмиды патогенности чумного микроба // Мол.генет., микробиол.вирусол.- 1986.- №.6.- С.З-10.

60. Кутырев В.В., Филиппов A.A., Шавина Н.Ю., Проценко O.A. Генетический анализ и моделирование вирулентности Yersinia pestis // Мол.генет.микробиол.вирусол.- 1989.- №.8.- С.42-47.

61. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генодиагностика и молекулярное типи-рование возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы // Мол. генет., микробиол. вирусол.- 2003.- №.1.- С.6-14.

62. Кучеряева В.Т., Анищенко М.А., Меринова JI.K. Трансформационная передача плазмиды RP4 Pseudomonas pseudomallei Н Особо опасные инфекционные заболевания. Иммунология, генетика и биологические свойства возбудителей.-Волгоград, 1989.- Вып.5.- С. 126-129.

63. Мазин A.B., Кузнеделов К.Д., Краев A.C. и др. Методы молекулярной генетики и генной инженерии.- Новосибирск: Наука, Сиб. отделение, 1990. 248 с.

64. Маниатис Т.,Фрич Э.,Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер с англ.- М.: Мир, 1984.- 479с.

65. Мелиоидоз. / Под ред.Ширяева Д.Т.- М.: Медицина, 1976.- 112 с.

66. Мельников Б.И., Пивень H.H., Яковлев А.Т. и др. К вопросу о выделении возбудителя сапа от монгольской лощади на Улан-Удэнском мясокомбинате // В сборн.: Вопросы противоэпидемической защиты.-НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.- 1987.- Вып.ЗЗ.- С.49-54.

67. Меринова JI.K. Системы генетического обмена патогенных псевдомонад: Автореф. дис. докт. мед. наук. Волгоград, 1997.- 40с.

68. Мельников Б.И., Попов С.Ф., Яковлев А.Т. и др. Капсулообразование у возбудителя мелиоидоза в; организме // Журн. микробиол.,.эпидемиол., иммунобиол. 1990. - Ж9. - С.6-10;

69. Мишанысин Б.Н., Гольдберг A.Mi Отношение к некоторым пеницил-линам и пенициллиназная активность у возбудителей сапа и. мелиоидоза" // Лекарственная* устойчивость микроорганизмов. Ереван,-1969t- С.87.

70. Монахова Е.В., Власов? В.П., Вуцан В. IT. и др. Видоспецифический ДНК-зонд для идентификации холерных вибрионов // Мол. генет., микробиол. вирусол.- 19931- №.4.-(2.8-11.

71. Нагаев И.Г., Зигангирова Н: А., Гинзбург А. Л. и др. Специфический ДНК-зонд для, детекции? Legionella pneumophilla II Мол. генетика.-1990.-№.5,- С.8-12.

72. Обеззараживание: исследуемого1 материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом Г1ЦР // Методические указания МУ 3.5.5.1034 01.

73. Об утверждении перечня социально значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих, опасность, для окружающих // Постановление: Правительства Российской Федерации №715 от 1 декабря 2004 т.

74. Петере М.К. Обнаружение собственных плазмйд у возбудителя мелиоидоза // Молекул, биол. и генетика возбудителей особо опасных инф.- Саратов, 1982.- Ч.1.- С.53-54.

75. Петере М.К., Пивень H.H., Илюхин В.И., Барков А.М. Характер: изменения антигенного спектра возбудителяшелиоидоза при пассировании на животных // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1983.' Ж8,- С. 47-49.

76. Пехов А.П. Плазмидььбактерий.- М.: Медицина,- 1986.- 224 с.

77. Пехов А.П. Несовместимость плазмид бактерий // Мол. генет. мик-робиол. вирусол.- 1983.- №.8.- С.3-12.

78. Пивеиь Н.Н., Илюхин В.И. Иммунохимический анализ термостабильных антигенов морфологических вариантов возбудителя мелиоидоза // Пробл. особо опасн. инф.- 1979,- Вып.5.- С.60-63.

79. Пивень Н.Н. Антигенная структура возбудителя мелиоидоза // Мелио-идоз / Под ред. акад. Н.Г.Тихонова. Волгоград, 1995.- С.47-57.

80. Пивень Н.Н. Антигенный анализ возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности: Автореф. дис. . докт. мед. наук. Волгоград, 1997.- 41с.

81. Плазмиды. Методы: Пер. с англ. / Под ред. К.Харди.- М.: Мир, 1989.267 с.

82. Подладчикова О.Н., Мишанькин Б.Н., Диханов Г.Г. ДНК-зонд для обнаружения Yersinia pestis и I сероварианта Yersinia pseudotuberculosis методом детекции специфических повторяющихся последовательностей //Молекул, генетика.- 1992.- №.9-10.- С.21-26.

83. Попов Ю.А. Конструирование и использование ДНК-зондов на представителях рода Yersinia II Генетика, микробиология и совершенствование методов лабораторной диагностики особо опасных инфекций.-Саратов,-1991.-C.3-13.

84. Попов Ю.А. Структурная и функциональная организация плазмид чумного микроба и генно-инженерные разработки на этой модели: Автореф. дисс. . докт. биол. наук.- Саратов,- 1991.- 45 с.

85. Попов С.Ф., Курилов В.Я., Мельников Б.И. Особенности паразитиро-вания возбудителей мелиоидоза в клетках хозяина // Журн. микро-биол., эпидемиол., иммунобиол.- 1991.- №11.- С.12-14.

86. Проценко О.А., Филиппов А.А., Кутырев В.В. Гетерогенность популяций штаммов возбудителя чумы по плазмидному составу // Мол. генет. микробиол. вирусол.- 1992.- №3-4.- С.20-24.

87. Проценко О.А., Анисимов П.И., Можаров О.Т. и др. Выявление и характеристика плазмид чумного микроба, детерминирующих синтез пестицина I, антигена фракции I и экзотоксина «мышиного» токсина // Генетика.- 1983.-Т.19, №.7-С.1081-1090.

88. Романова Ю.М. Плазмиды вирулентности бактерий рода Shigella II Мол.генет.микробиол.вирусол.- 1991.- №.6.- С.3-9.

89. Рубан E.JI. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas.- М.: Наука, 1986.- 200 с.

90. Ряпис Л.А., Илюхин В.И., Сычева Н.М. Штамм Pseudomonas pseudomallei VPA для получения диагностической мелиоидозной агглютинирующей сыворотки. Авторское свидетельство № 712999 от 05.10.79.

91. Ряпис Л.А., Илюхин В.И., Вострова Е.И., Джузепов Ф.Ф. Лабораторная диагностика клинически значимых видов псевдомонад // Лаб.дело.- 1988.- №.2.- С.66-71.

92. Ряпис Л.А., Тарасова Т.Д. Перспективы применения хромосомной трансформации для идентификации возбудителя мелиоидоза // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол.- 1988.- №.8.- С. 16-19.

93. Рысков А.П. Геномная дактилоскопия / Информ.бюллетень «Геном человека».- М.: 1990.- №.3.- С.1-40.

94. Савостина Е.П. Изучение плазмиды Са-зависимости Yersinia pestis методом рестрикционного картирования: Автореф. дис. . канд. мед. наук.- Саратов,- 1990.- 19с.

95. Саяпина Л.В. Совершенствование стандартизации и оценка качества средств диагностики особо опасных инфекций: Автореф. дис.докт. мед. наук.- Саратов, 1999.- 46с.

96. Сенина Т.В. Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике: Автореф. дисс. . канд. биол. наук.- Саратов, 2004.- 22 с.

97. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas.- Киев: Наук, думка, 1990.- 264 с.

98. Тарасова Т.Д., Замараев B.C., Антонов Ю.В. Использование трансформации для идентификации возбудителя при поиске мелиоидозной инфекции // Мат. Всес. науч.-практ. конф. «Профилактика природно-очаговых инфекций».- Ставрополь, 1983.- С.352-353.

99. Тарасова Т.Д., Ряпис Л.А. Оптимальные условия трансформации у возбудителя мелиоидоза и возможность ее применения для картирования хромосомы // Мол. генет., микробиол. вирусол.- 1983.- №.3.-С.26-29.

100. Тарасова Т.Д., Ряпис Л.А. Трансформация бактерий на плотной среде // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1983.- №.7.- С.8-13.

101. Тарасова Т.Д., Ряпис J1.A. Получение ауксотрофных мутантов возбудителя мелиоидоза // Молекул, генет. микробиол. ,вирусол.- 1984.-№.2.- С.15- 17.

102. Тарасова Т.Д., Ряпис J1.A., Меринова JI.K. и др. Использование трансформации для картирования хромосомы Pseudomonas pseudomallei II Журн. микробиол., эпидемиол. иммунобиол.- 1983—№.1.- С.33-36.

103. Тарасова Т.Д., Ряпис J1.A. Оптимальные условия трансформации у возбудителя мелиоидоза и возможность её применения для картирования хромосомы // Молекул, генет., микробиол., вирусол.- 1983.- №.3.-С.26 29.

104. Тарасова Т.Д., Антонов Ю.В. Картирование пуринзависимых мутаций у возбудителя мелиоидоза // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол.- 1984.- №.6.- С.8-12.

105. Тимошин В.Б., Замараев B.C., Антонов В.А., Липницкий A.B. Видос-пецифический ДНК-зонд для идентификации токсигенных штаммов возбудителя сибирской язвы // Мол. генет., микробиол. вирусол. -1994.-№.1.- С.30-33.

106. Тихонов Н.Г., Липницкий A.B. Биологический терроризм (проблемы противодействия) // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье. Сб. науч. тр. / Под ред. Н.Г.Тихонова. Волгоград, 2000. - С. 265 -271.

107. Ткаченко Г.А. Конструирование амплификационной тест-системы для выявления патогенных буркхольдерий: Автореф. дисс. . канд. мед. наук.- Саратов, 2003.- 20 с.

108. Томилин Н.В. Генетическая стабильность клетки.- Л.: Наука,- 1983.156 с.

109. Томов А.Ц., Цветкова Е., Милушева М. Лизогения у рода Maleomyces II Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1970.- №.8.- С. 102105.

110. Томов А.Ц. Антагонизм у бактерий из рода Malleomyces II Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1970.- №.6.- С.105-108.

111. Федоров А.Ю. Микробная деструкция компонентов сточных вод производства фенола : Автореф. дис. . канд. биол. наук.- Саратов, 1993.20 с.

112. Холловей Б.В. Генетика Pseudomonas II Молекулярные основы генетических процессов.- М.: Наука, 1981.- С.269-278.

113. Шагинян И.А., Гинцбург A.JI. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций // Молекул, генетика.- 1991.- №.12.- С.3-9.

114. Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Токарская О.Н. и др.Геномная дактилоскопия возбудителей сапронозов // Журн.микробиол.- 1991.- №.6.-С.25-29.

115. Шиповская Н.П., Меринова JI.K., Ряпис JI.A. Свойства ауксотрофных мутантов Pseudomonas mallei II Журн. микробиол. эпидемиол. имму-нобиол.- 1983.- №.4. С.36-39.

116. Шишкина О.Г. Получение видоспецифического генетического зонда на основе плазмиды, определяющей синтез антигена фракция I чумного микроба: Автореф. дис. канд. мед. наук.- Саратов, 1990.- 20с.

117. Шишкина О.Г., Попов Ю.А., Кириллина С.В. и др Конструирование видоспецифического ДНК-зонда на основе плазмиды pFra чумного микроба //Мол. генет., микробиол. вирусол.- 1991.- №.10.- С. 16-19.

118. Шубин Ф.Н., Гинзбург A.JL, Китаев В.М. и др. Анализ плазмидного состава штаммов Yersinia pseudotuberculosis и его применение для ти-пирования возбудителя псевдотуберкулеза // Мол. генет., микробиол. вирусол- 1989.- №.6,- С.20-25.

119. Яковлева О.Н., Маракуша Б.И. Биологические свойства бесплазмид-ных штаммов Salmonella typhimurium и S.dublin II Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1987.- №.6.- С.6-11.

120. Яненко А.С., Крылов В.Н., Станиславский Е.С., Холодкова Е.В. Влияние плазмид на вирулентность штаммов Pseudomonas aeruginosa в экспериментах на мышах // Журн.микробиол., эпидемиол. и иммунобиол.- 1985.-№.7.-С. 19-21.

121. Altwegg М., Hickman-Brenner F.W., Farmer J.J. Ribosomal RNA gene restriction pattern provide increased sensitivity for typing Salmonella typhi strains // J. Infect. Dis.- 1989.- V.160.- P. 145-149.

122. Anunnatsiri S., Chetchotisakd P., Mootsikapun P. et al. A Comparison Of Ceftazidime Versus Combination Ceftazidime-Trimethoprim-Sulphamethoxazole For The Treatment Of Severe Melioidosis // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.-P. 13.

123. Arima K., Beppi M. Induction and mechanisms of arsenite resistance in Pseudomonas pseudomallei II J.Bacteriol.-1964.-V.88, №.1.-P.143-150.

124. Asche V. History of Melioidosis in the northern territory of Australia // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.- P.39.

125. Ashdown L.R. Identification of Pseudomonas pseudomallei in clinical laboratory II J. Clin. Pathol.- 1979.- V.32.- P.500-504.

126. Ashdown L.R, Frettingham R. In vitro activity of various cephalosporins against Pseudomonas pseudomallei II J.Infect. Diseases.- 1984.- V.150.-P.779-780.

127. Ballard R.W., Palleroni N.J., Doudoroff M. et al. Taxonomy of the aerobic pseudomonads: Pseudomonas cepacia, P.marginata, P.allicola and P.caryophylli II J.Gen.Microbiol.- 1970.- V.60.- P.T99-214.

128. Bauernfeind A., Roller C., Meyer D. et al. Molecular procedure for rapid detection of Burkholderia mallei and Burkfiolderia pseudomallei II J. Clin. Microbiol.- 1998.- V.36, №.9.- P.2737-2741.

129. Beeching N.J., Hart C. A., Duerden I. Tropical and exotic infections // J. Med. Microbiol.- 2000:- V.49.- P.5-27.o

130. Ben-Gurion R'., ShaffermanrA. Essential virulence determinants of different Yersinia species are carried on a common plasmid// Plasmid.- 1981.- №.5.-P.183-187.

131. Bopp L.H., Chakrabarty A.M., Ehrlich H.L. Chromate resistance plasmid in Pseudomonas fluorescens II J. Bacteriol.- 1983.- V.155, №.3.- P.1105-1109.

132. Bremmelgaard A. Differentiation between Pseudomonas cepacia and Pseudomonas pseudomallei in clinical bacteriology // Acta Pathol. Microbiol. Scand.- 1975.- V.83.- №.2.- P.65-70.

133. Bremmelgaard A., Bygbjerg I., Hoiby N. Microbiological and-immunological studies in a case of human melioidosis diagnosed in Denmark // Scand. J. Infect. Dis.- 1982.- V.14.- №.4.- P.271-275.

134. Brown N.F., Beacham I.R. Cloning and analysis of genomic differences unique to Burkholderia pseudomallei by comparison with B. thailandensis II J. Med. Microbiol.- 2000.- V.49.- №.11.- P.993-1001.

135. Brubaker R.R.-The genus Yersinia: biochemistry and genetics of virulence // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 1972.- V.57.- P.l 11-158.

136. Cain R.B., Murray K., Sagoo G.S., Johnston J.B. Arylsulfonate esulfonating enzyme. A catabolic enzyme system probably specified by a plasmid // Soc. Gen. Microbiol. Proc.- 1977.- V.4.- P.99.

137. Casse F.,Boucher C.,Julliot J.S. et al Identification and characterisation of large plasmids in Rhizobium meliloti using agarose gel electrophoresis // J. Gen. Microbiol.- 1979.- V.113.- P.229-242.

138. Chakrabarty A.M. Plasmids in Pseudomonas II Ann.Rev.Genet.- 1976.-№.10.- P.7-30.

139. Cheung-T.K.M., Ho P.L., Woo P.C.Y, Yuen K.Y. et al. Cloning and Expression of Class A B-Lactamase Gene ¿/¿zAbps in Burkholderia pseu-domallei II Antimicrobial agents and Chemotherapy.- 2002.- V.46, №.4.-P.l 132-1135.

140. Chin C.Y., Sheila N., Roohaida O. Cloning, expression and purification of Burkholderiapseudomallei serine metalloprotease, SMBPF4 from local isolate // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.- P.62.

141. Chong C.E., Lim B.S., Zulkeflie Z., Rahmah M. A comparative genome study of Burkholderia pseudomallei: analysis of the virulent factors and ARAC/XYLS family transcription factors // 4th World Melioidosis. Congress 2004.- Singapur.- 2004.-P.52.

142. Christopher, G. W., T. J. Cieslak, J. A. Pavlin et al. Biological warfare: a historical perspective // JAMA.- 1997.- V.278.- P.412-417.

143. Clark P., Richmond M. Genetics and biochemistry of Pseudomonas London.: Willey Sons, 1975.- 366p.

144. Currier T.C., Morgan M.K. Plasmids of Pseudomonas syringae: evidence of a role in toxin production or pathogenicity // Can. J. Microbiol.- 1983.-V.29.- P.84-89.

145. Dance D:A.B. Melioidosis as an emerging global problem // Acta Trop.-2000.- V.74.- P.l 15-119.

146. Dance D.A.B. Recent Insights Into The Epidemiology And Distribution of Melioidosis // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.-P.10.

147. Dharakul T., Songsivilai S. Recent developments in the laboratory diagnosis of melioidosis // J. Infect. Dis. Antimicrob. Agents.- 1996.- V.13.- P.77-80.

148. De Ley J. DNA-base composition and hybridization in the taxonomy of phytopathogenic bacteria// Ann.Rev.Phytopathol.- 1968.- №6.- P.63-90.

149. De Shazer D., Brett P., Carlyon R., Woods D.E. Mutagenesis of Burkholderia pseudomallei with Tn5-OT182: isolation of motility mutants and molecular characterization of the flagellin structural gene // J. Bacte-riol.- 1997.- V.179.- P.2116-2125.

150. Dodin A., Ferry R. Recherches epidemiologiques du bacille de Whitmore en Afrique //Bull. Soc. Pathol. Exot.- 1974.- V.67.- №.2.- P.121-126.*

151. Dodin A. La melioidose: un problème mondial (Melioidosis an asian disease now a Worldproblem) // Recherche- 1976.- V.l.- №.68.- P.574-577.

152. Dodin A., Galimand M. Le bacille de Whitmore II Reel. Med. Vet. Ec. Alfort.- Paris.- 1976.- V.152.- №.5.- P.323-325.

153. Dodin A., Galimand M. Naissance vie et recul d,une maladie infectionse la melioidose en pays tempere II Arch. Inst. Pasteur Tunis.- 1986.- V.63, №.1.- P.69-73.

154. Eisenstein B.I. New molecular techniques for microbial epidemiology and the diagnosis of infectious diseases // J.Infect.Dis.- 1990.- V.161.- P.595-602.

155. Ferber D.M., Brubacer R.R. Plasmids in Yersinia pestis II Inf.Immun.-1981.- V.31.- №.2.- P.839-841.

156. Fitch W., Smith T., Ralph W. Mapping the order of DNA restriction fragment//Gene.- 1983.-Vol.22.- №.1.- P. 19-29.

157. Fitts R. Use of DNA probes in the diagnosis of infectious disease // Drug Dev. and Ind. Pharm.- 1985.- V.l 1.- №.5.- P. 1051-1057.

158. Fournier J., Chambon L. La melioidose maladie d'actualité et le bacille de Whitmore (Malleomices pseudomallei) Il Paris.: Ed.Med.Flammarion.-1958.-P. 47-90.

159. Fournier J. Les antigenes thermostables de Pseudomonas pseudomallei et de Malleomyces mallei et leurs communautés II Ann. Inst. Pasteur.- 1967.-V.l 12.-P.93-104.

160. Galimand M. Nouvel habitat de Pseudomonas pseudomallei II These Doct. de 3 cycle. Microbiología.- Universite. Paris VIL- 1979.

161. Galimand M., Dodin A. Le point sur la melioidose dans le monds // Bull. Soc. Pathol. Exot.- 1982.- V.75.- №.4.- P.375-383.

162. Garrity G., Jonson K.L., Bell J., Searles D.B. Taxonomic Outline of the Procaryotes / Bergey's Manual of Systematic Bacteriology.- Second Edition.- 2002.

163. Gemski P., Lazere J.R., Casey T., Wohlhieter J.A. Presence of a virulence-associated plasmid in Yersinia pseudotuberculosis II Infect. Immun.-1980.- V.28.- P. 1044-1047.

164. Gilardi GX. Identification of glucose nonfermenting gram negative rods // Depart. Lab. North Gen. Hosp. - New York, 1989.

165. Govan J.R.W., Hughes J.E., and Vandamme. Burkholderia cepacia: medical, taxonomic and ecological issues // J. Med. Microbiol 1996 - Vol.45-P.395-^497.

166. Haase A., Brennan M., Barrett S. et al. Evaluation of PCR for diagnosis of melioidosis //J. Clin. Microbiol.- 1998.- V.36, №.4,- P.1039-1041.

167. Haase A., Melder A., Smith-Vaughan H. et al RAPD analysis of isolates of Burkholderia pseudomallei from patients with recurrent melioidosis. // Epidemiol Infect.- 1995.- V.l 15, №.1.- P. 115-121.

168. Hansen J.B., Olsen R.H. Isolation of large bacterial plasmids and characterisation of the P2 incompatibility group plasmids pMGl h pMG5 // J.Bacteriol.- 1978.- V.135.- P.227-238.

169. Hansen J.B., Olsen R.H. Inc P-2 group of Pseudomonas a class of in-iquelli large plasmids //Nature.- 1978.- V.274.- P.715-717.

170. Hassan A.K.R., Inglis T.J J., O'Reilly L. Isolation and molecular epidemiology of Burkholderia pseudomallei from East Malaysia // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.- P 37.

171. HecklyR. Melioidosis//Nat. Res.- 1970.- V.23.- №.3.- P.8-17.

172. Highfield P.E., Dougan G. DNA probes for microbial diagnosis // Med. Labor. Sei.- 1985.- V.42.- №.4.- P.352-360.

173. Hohl P. The susceptibility of Pseudomonas pseudomallei to six lactams and five other antibiotics in vitro // Experienta.- 1986.- V.42, №.1.- P.98-102.

174. Holden M.T.G., Titball R.W., Peacock S. et al. Genomic plasticity of the causative agent of melioidosis, Burkholderia pseudomallei // Proc. Natl. Acad. Sei. USA.- 2004.- V.101.- №.39.- P.14240-14245.

175. Holden M.T.G., Parkhill J. Unravelling A versatile pathogen: the sequencing and analysis of the Burkholderia pseudomallei genome // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.-P.17.

176. Holloway B.W. Plasmids that mobilize bacterial chromosome // Plasmid.-1979.-№.2.- P.l-19.

177. Holmes A., Govan J., Goldstein R. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia: A threat to human health? // Emerg. Infect. Dis. 1998 — Vol.4, №.2.-P.221-227.

178. Howe C., Sampath A., Spotnitz M. The pseudomallei group: a review // J. Infect. Dis.- 1971.- V.124.- P.598-606.

179. Inglis T.J J., Rigby P., Robertson T.A et al. Interaction between Burkholderia pseudomallei and Acanthamoeba species results in coiling phagocytosis, endamebic bacterial survival, and escape // Infect. Immun.-2000.- V.68, №.3.- P.1681-1686.

180. Jacoby G.A., Sutton L., Knobel L., Mammen P. Properties of Inc P-2 plasmids of Pseudomonas spp. H Antimicrob. Agents Chemother.- 1983.- V.24, №.2.- P.168-175.

181. Jameson J.E. An antibiotic from Pfeifferella whitmori II J. Hyg.- 1949.-V.47.- P.142-145.

182. Jenks P. Sequencing microbial genomes what will it do for microbiology? //J. Clin. Microbiol.- 1998.-V.47.- P.375-382.

183. Jesudason M. V., Balaji V., Singhai P,K, et al. Evaluation of rapid tests to detect B.pseudomallei in blood culture broth supernatants // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.- P. 12.

184. Jigen J., Li L. Study on the plasmids in Pseudomonas pseudomallei II Chin. J.Epid.- 1992.- №.13.- P.452.

185. Johnson J.L., Palleroni N.G. Deoxyribonucleic acid similarities among Pseudomonas species II Int. J. Sys. Bacteriol.- 1989.- V.39, №.3.- P.230-235.

186. Jones A.L., Beveridge T.J., Woods D.E. Intracellular survival of Burkholderia pseudomallei II Infect. Immun 1996.- Vol.64.- P.782-790.

187. Kado C.I.,Liu S.T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids II J.Bacteriol.- 1981.- V.145.- P. 1365.

188. Kanai K., Deysirilert L. Pseudomonas pseudomallei and melioidosis, with special reference to the status in Thailand.// Jpn. J. Med. Sei. Biol.- 1988.-№.41.- P.123-157.

189. Kanai K., Kondo E. Recent advances in biomedical sciences of Burkholderia pseudomallei (basonym: Pseudomonas pseudomallei) // Jpn. J. Med. Sei. Biol.- 1994.- V.47.- P. 1-45.

190. Kasturi K.,Tamhane D.V. Growth of Pseudomonas pseudomallei and P.aeruginosa on petroleum fractions // Indian J.Exp.Biol.- 1971.- V.9, №.2.- P.235-239.

191. King C.J. Plasmid analysis and variation in Pseudomonas syringae II J.Appl.Bacteriol.- 1990.- V.67, №.5.- P.489.

192. Kinoshita R.E., Wuthiekanun V., Chan S.Y. Epidemiology of melioidosis in an oceanarium in Hong Kong: an environmental and molecular study // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.- P.36.

193. Korbsrisate S., Suwannasai N., Leelaporn A. et al. Molecular cloning and expression of fosfolipase C gene from Burkholderia pseudomallei II International Congress on Melioidosis.- Bangkok.- 1998.- P. 103.

194. Korbsrisate S., Kerdsuk P., Vanaporn M. et al. The rpoe (algu) operon plays an important role in the survival of Burkholderia pseudomallei under stress // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.- P.27.

195. Kunakorn M., Markham R.B. Clinically practical seminested PCR for Burkholderia pseudomallei quantitated by enzyme immunoassay with andwithout solution hybridization I I J. Clin. Microbiol.- 1995.- V.33.- P.2131-2135.

196. Kunakorn M., Raksakait K., Sethaudom C. et al. Comparison of three PCR primer sets for diagnosis of septicemic melioidosis // Acta Tropica.- 2000.-№.74.- P.247-251.

197. Kuzio J., Kropinski A. O-antigen convertion in Pseudomonas aeruginosa PAOl by bacteriophage D3 // J.Bacteriol.- 1983.- V.155.- P.203-212.

198. Lacobellis N.S., Morea M., Palumbo G., Sisto A. Plasmid-coded cytokinin biosynthesis by Pseudomonas amygdali II Assoc. Genet. Ital.- 1989.-№.35.- P.177-178.

199. Lalande M. Pulsed-field electrophoresis: application of a computer model to the separation of large DNA molecules // Proc. Natl. Acad. Sei.- 1987.--V.84.- P.8011-8015.

200. Layne S.P., Beugelsdijk T.J. High-Throughput Laboratories for Homeland and National Security // Biosecurity and bioterrorism: biodefence, strategy, practice and science.- 2003.- V.l.- №.2.- P.123-130.

201. Lazzaroni S., Inglis T., Currie B. The characterisation of Burkholderia pseudomallei isolates from the townsville region using pulse-field gel electrophoresis // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.-P.38.

202. Lee M.-A., Liu Y.-C. Cloning and characterization a novel protese gene from Burkholderia pseudomallei II International Congress on Melioidosis.-Bangkok.- 1998.- P.99.

203. Legroux R., Djemil K. Sur la lyse du bacille de la monve et du bacillus pyocianique // Compt.Rend. Acad.Sci. 1931.- 35p.

204. Li L., He J. Pseudomonas pseudomallei and melioidosis in China // Clin. Med. J.- 1992.- V.105.- №.5.- P.'775-779.

205. Li L., Lu Z., Han O. Epidemiology of melioidosis in China // Chung Hua Liu Hsing Ping Hsuch Tsa Chin.- 1994.- V.15.- P.292-295.

206. Lim O.P. Epidemiology Of Melioidosis In Singapore // 4th World Melioidosis Congress.- Singapur.- 2004.- P. 10.

207. Liu Y.-C-, Yap E.P.H., Yap E.H. et al. Identification and characterization of a lipase gene and its modulator from Burkholderia pseudomallei II International Congress on Melioidosis.- Bangkok.- 1998.- P.102.

208. Liu Y., Tin L.A., Loh J. et al. Multiplex PCR-based tandem repeats analysis for rapid discrimination of Burkholderia pseudomallei isolates // 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.- P.37.

209. Livermore D.M., Chan P.Y., Wong A.J.W., Leung J.K. B-lactamase of Pseudomonas pseudomallei and its contribution to antibiotic resistance // J. Antimicrob. Chemother.- 1987,- V.20.- №.3.- P.313-320.

210. Mandel M. Deoxyribonucleic acid base composition in the genus Pseudomonas II J.GenJMicrobiol.- 1966.- V.43, №.2.- P.273-275.

211. Marmur J. A procedure for isolation of deoxyribonucleic acid from micro-orcanisms //J.Mol.Biol.- 1961.- Vol.3.- P.208-218.

212. Mathew M.K., Smith C.L., Cantor C.R. High-resolution separation and accurate size determination in pulsed-field gel electrophoresis of DNA. DNA size standarts and the effect of agarose and temperature // Biochemistry (US).- 1988.- V.27.- P.9204-9210.

213. McCormick J.B., Weaver R.E., Hayes P.S. Wound infection by an indigenous Pseudomonas pseudomallei-like organism isolated from the soil case report and epidemiologic study // J. Infect. Dis.- 1977.- V.135.- №.1.-P.103-107.

214. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D., Dreier T.M. Evidence for Plasmid-Mediated Toxin Production in Bacillus anthracis II Infect.Immun.- 1983.-V.39.- P.371-376.

215. Moore R. A., DeShazer D., Reckseidler S. Efflux-mediated aminoglycoside and macrolide resistance in Burkholderia pseudomallei II Antimicrobial Agents and Chemotherapy March.- 1999.- V.43.- №.3.- P.465-470.

216. Moore R., Troung C., Woods D. E. Regulation of ß-lactamase in Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis II 4th World Melioidosis Congress 2004.- Singapur.- 2004.- P. 15.

217. Mullis K.B., Fallona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro via a poly-merase-catalyzed chain reaction // Meth. Enzymol.- 1987.- V.155.- P.335-350.

218. Nair G.B., Bag P.K., Shimada T. et al. Evaluation of DNA probes for specific detection of Vibrio cholerae 0139 Bengal II J. Clin. Microbiol. 1995. - V.33,№.8.-P.2186-2187.

219. Nakazawa T., Hayashi E., Yokota T. et al. Isolation of TOL and RP4 recombinants by integrative supression // J.Bacteriol.- 1978.- V.134.- P.270-277.

220. Nierman W.C., DeShazer D., Kim H. S. et al. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2004.- V.101.-№.39.-P. 14246-14251.

221. Norton R., Roberts B., Freeman M. Characterisation and molecular typing of Burkholderia pseudomallei'. are disease presentations of melioidosis clonally related? // FEMS Immunol. Med. Microbiol.- 1998.- V.20.- P.37-44.

222. Ogawa T., Yatome C., Idaka E. Degradation of p-aminoazobenzene by continuous cultivation of Pseudomonas pseudomallei 13 NA // J. Soc. Dyers Colour.- 1981.- V.97.- №.10.- P.435-438.

223. Owen R.J. Chromosomae DNA fingerprinting a new method of species and strain identification applicable to micro bial pathogens // J. Med. Microbiol.- 1989,- V.30.- P.89-99.

224. Palchaudhuri S., Chakrabarty A. Isolation of plasmid deoxyribonucleic acid from Pseudomonas putida // J.Bacteriol.- 1976.- V.126.- №.1.- P.410-416.

225. Palleroni N., Ballard R.W., Ralston E. et al. Deoxyribonucleic acid homologies among some Pseudomonas species II J. Bacteriol.- 1972.- V.110.-№.1.- P.1-11.

226. Palleroni N., Doudorff M. Some properties and taxonomic subdivisions of the genus Pseudomonas II Ann.Rev. Phytopathol.- 1972,- V.10.- P.73-100.

227. Palleroni N.J., Kunisawa R., Contopoulou R., Doudoroff M. Nucleic acid homologies in the genus Pseudomonas II Int.J.Syst.Bacteriol.- 1973.-V.23, №.4.- P.333-339.

228. Palleroni N.J. Introduction to the famili Pseudomonadaceae II Procariotes.-Berlin, 1981.- V.I.- P.655-665.

229. Palleroni N.J. Bergey's Mannual of systematic bacteriology.- Baltimore, 1984.-V.1.-P.140-199.

230. Paredes L., Avila R. Infectiones por Pseudomonas pseudomallei. Estudio baeteriologico y significado clinico // Rev. Med. Chile.- 1976.- V.104.-№.8.- P.531-537.

231. Puthucheary S.D. Host-pathogen interactions: Intracellular survival of Burkholderia pseudomallei II 4th World Melioidosis Congress.- Singapur.-2004.- P.28.

232. Pelt C., Verduin C.M., Goessens W.H.F. et al. Identification of Burkholderia spp. in the Clinical Microbiology Laboratory: Comparasion of Cjnventional and Molecular Methods // J. Clin. Microbiol.- 1999.- V.37, №.7.- P.2158-2164.

233. Piliouras P. Melioidosis prevention // 4th World Melioidosis Congress.-Singapur.- 2004.- P.42.

234. Piwowarski J.M., Shaw P.D. Characterization of plasmid from plant athogenic pseudomonads //Plasmid.- 1982.-№.7.-P.85-94.

235. Platonov A.E., Karan L.S., Yazyshina S.B. et al. Microheterogenicity of the Volgograd Clone of West Nile Virus // International Conference on Emerging Infectious Diseases.- Atlanta, Georgia, USA.- 2002,- P.l 12.

236. Rolim D. B., Vilar D. C. L. F., Souza A.Q. et al. First Melioidosis Outbreak In Brazil // 4th World Melioidosis Congress.- Singapur.- 2004.- P. 11.

237. Popov S., Tikhonov N., Kurilov V. Influence of capsule formation in Pseudomonas pseudomallei and Pseudomonas mallei on their relations with host cells // Immunol. Infect.Dis.- 1994.- V.4.- P. 142-145.

238. Pourtaghva M., Machoun A., Dodin A. Mise en evidence de Pseudomonas pseudomallei (bacille de Whitmore) dans la boue des rizieres iraniennes // Bull. Soc.Path. Exot.- 1975.- №.68.- P.367-370.

239. Pourtaghva M., Dodin A., Portovi M. Premier cas de melioidose pulmonale humaine en Iran // Bull. Soc. Pathol. Exot.- 1977.- V.70.- №.2.- p. 107109.

240. Propost A., Vigier M. Isolement au Tchad (Afrique centrale) de deux souches de Malleomyces pseudomallei II Ann. Inst. Pasteur.- I960.- V.98.-№.3. P.461 -463.

241. Radua S., Ling O.W., Srimontree S. et al. Characterization of Burkholderia , pseudomallei isolated in Thailand and Malaysia II Diagn. Microbiol. Infect. Dis.- 2000,- V.38;- №.3.- P.141-145:

242. Rainbow L., Hart C.A., Winstanley C. Distribution of type III secretion gene clusters in Burkholderia pseudomallei, B. thailandensis and B. mallei II J. Med. Microbiol.- 2002.- V.51.- P.374-384.

243. Rattanathongkom A., Sermswan R.W., Wongratanacheewin S. Detection of Burkholderia pseudomallei in blood samples using polymerase chain reaction //Mol. Cell. Probes.- 1997.- V.ll.- №.1,-P.25-31.

244. Ramisse V., Balandreau J., Thibault F. et al. DNA-DNA hybridization study of Burkholderia species using genomic DNA macro-array analysis coupled to reverse genome probing // Intern. J. System. Evolut. Microbiol.-2003.- V.53.- P.739—746.

245. Reckseidler S., Moor R., Woods D.E. Identification and characterization jf pilin genes in Burkholderia pseudomallei II International Congress on Melioidosis.- Bangkok.- 1998.- P.58.

246. Reckseidler S.L., Tuanyok A., Woods D.E. Genetic and functional characterization of the capsular polysaccharides of Burkholderia pseudomallei II 4th World Melioidosis Congress.- Singapur.- 2004.- P.27.

247. Redfearn M.S., Palleroni N., Stanier R.J. A comparative study of Pseudomonas pseudomallei and Bacillus mallei II J. Gen. Microbiol.- 1966.- V.43.-P:293-313.

248. Reimmann C., Rella M., Haas D.< Integration of Replication defective R68.45 like plasmids into* the Pseudomonas aeruginosa chromosome // J.Gen.Microbiol.- 1988.- V.134.- P.1515-1523.

249. Rella M. Transposon insertion mutagenesis of the Pseudomonas genome a temperature-sensitive RP1 plasmid as a vector for Tn5'derivatives: Dis. . doct. natur. Sei. Swiss. Fed.- Zurich, 1984.- 189 p.

250. Repley R., Theophilus B.D.M., Bevan I.S., Walker M.R. Fundamentals of the polymerase chain reaction: A future in clinical diagnostics? // Med. Lab. Sei.- 1992.- V.49.- P.l 19-128.

251. Rogul M., Brendle J.J., Haapala D.K. et al. Nucleic acid similarities among Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas multivorans and Actinobacillus mallei 111. Bacteriol.- 1970.- V.101, №.3.- P.827-835.

252. Rogul M., Carr S.N. Variable ammonia production among smooth and rough strains of Pseudomonas pseudomallei: resemblance to bacteriocin production // J.Bacteriol.- 1972.-V.112, №.1.-P.372-380.

253. Rosselo-Mora R, Amann R. The species concept for procariotes // FEMS Microbiol. Rev.- 2001.- V.25.- P.39-67.

254. Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al. Public health assessment of potential biological terrorism agents // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol.8, №.2.- P.225-230.

255. Royle P.L., Holloway B.W. Relationship between R and FP plasmids in Pseudomonas aeruginosa II Antimicrob. Agents Chemother.- 1980.- V.17.-№.3.- P.293-297.

256. Samadpour M., Moseley S.L., Lory S. Biotinylated DNA probes for exotoxin A and pilin genes in the differentiation of Pseudomonas aeruginosa II J.Clin. Microbiol.- 1988.- V.26.- P.2319-2323.

257. Saunders J.R., Grinsted J. Properties of RP4 an R factor wich originated in Pseudomonas aeruginosa S8 // J. Bacteriol.- 1972.- V.112.- №.2.- P.690-696.

258. Saunders N.A., Harrison T,G., Rachwalla N., Taylor A.C. Identification of species of the genus Legionella using a cloned rRNA gene from Legionella pneumophillia II J. Gen. Microbiol.- 1988.- V.134.- №.8.- P.2263-2274.

259. Sermswan R.W., Wongratanacheewin S., Tattawasart U. et al. Construction of a specific DNA probe for diagnosis of melioidosis and use as an epidemiological marker of Burkholderia pseudomallei II Mol. Cell Probes.-1994.- V.8.- №.1.- P.l-9.

260. Shazleen A., Zamrod Z., Mohamed R. Methodology for high-throughput data mining of transcription regulatory network of Burkholderia pseu-domallei II 4th World Melioidosis Congress.- Singapur.- 2004.- P 50.

261. Shively J.M., Hartsell S.E. Bacteriolysis of the pseudomonads. II. Chemical treatments affecting the lytic response // Canad. J. Microbiol.- 1964.- V.10.-№.6.- P.911-915.

262. Skurnik M. Studies on the virulence plasmids of Yersinia species II Acta Univ. Ouluen.- 1985.- A.- №.169.- P.l-61

263. Slezak T., Kuczmazski T., Ott L. et al. Comparative genomics tools applied to boiterrorism defence II Brief Bioinform.- 2003.- V.2.- №.4.- P.133-149.

264. Smith M.D., Angus B.J., Wuthiekanun V., White N.J. Arabinose assimilation defines a nonvirulent biotype of Burkholderia pseudomallei II Infect. Immun.- 1997.-V.65.-P.4319-4321.

265. Snipes K.P., Hirsh D.S., Hansen L.M., Hird D.W. et al. Use of an rRNA probe and restriction endonuclease analysis to fingerprint Pasteurella mul-tocida isolated from turkeys and wildlife // J. Clin. Microbiol.- 1989.-V.27.- P.1847-1853.

266. Songsivilai S., Neelamek M., Nuntauanuwat S.et al. Organization of Burkholderia pseudomallei chromosomes // International Congress on Melioidosis. Bangkok.- 1998.- P.55.

267. Songsivilai S., DhaRakul T. Multiple replicons constitute the 6.5-megabase genome of Burkholderia pseudomallei II Acta TRopica.- 2000.- №.74.-P. 169-179.

268. Stanier R.Y., Palleroni N.J., DoudoroffM. The aerobic pseudomonads: a taxonomic study // J. Gen. Microbiol.- 1966.- V.43.- P. 159-271.

269. Stanier R.Y. Reflexions sur la taxonomie des Pseudomonas II Bull. Inst. Pasteur.- 1976.- V.74.- P.255-270.

270. Steel J.H. Glanders // CRC Handbook series in zoonoses, section A.- 1979.-V.I.- P.339-362.

271. Stephen A., Madden T. L., Schäffer A.A. et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res.- 1997.- №.25,-P.3389-3402.

272. Stocki S.L., Woods D. E. Changes in gene expression mediated by L-arabinose in Burkholderia II 4th World Melioidosis Congress.- Singapur.-2004.-P. 19.

273. Stull T.L., LiPuma J.J., Edling Th.D. A broad spectrum probe for molecular epidemiology of bacteria: ribosomal RNA // J.Infect.Dis.- 1988.-V.157.- P.280-286.

274. Suputtamongkol Y., Hall A., Dance D. et al The epidemiology of melioidosis in Ubon Ratchatani; northeast Thailand // Int. J. Epidemiol.- 1994.-V.23.- P.1082-1090.

275. Tan B.B., Zulkeflie Z., Rahmah M. Identification and cloning of type III secretion system in Burkholderia pseudomallei II 4th World Melioidosis Congress.- Singapur.- 2004,- P.49.

276. Tanphaichitra D. Introduction of Pseudomonas pseudomallei (melioidosis) antigen into the gale Salmonella typhy TY 21 vaccine strains as carriers of melioidosis antigens to the immune system // J. Cell. Biochem.- 1989.-№.13.- P.246.

277. Taxonomic Outline of the Procaryotes Bergey's Manual of Systematic Bacteriology / Second Edition, Relies 3.0 July 2002.

278. Tenover F.C. Diagnostic deoxyribonucleic acid probes for infection diseases II Clin.Microbiol.Rev.- 1988.- V.I.- P.82-101.

279. Thomson-Carter F.M., Carter P.E., Pennington P:H. Differentiation of staphylococcal species and strains by ribosomal RNA gene restriction patterns // J.Gen. Microbiol.- 1989.- V.135.- P.2093-2097.

280. Trevors J.T. DNA probes for the detection of specific genes in bacteria isolated from the environment // Trends Biotechnol.- 1985.- V.3, №.11.-P.291-293.

281. Tuanyok A., Tom M., Dunbar J. Microarray analysis of gene expression in Burkholderia pseudomallei in response to various growth conditions // 4th World Melioidosis Congress.- Singapur.- 2004.- P.19.

282. Uchida I., Sekizaki T., Hashimoto К., Terakado N. Association of the encapsulation of Bacillus anthracis with a 60 megadalton plasmid // J. Gen. Microbiol.- 1985.- V.131.- P.363-367.

283. Walia S.K., Madhvan T. Molecular analysis of Pseudomonas aeruginosa plasmid DNA analysis: Ann. Meet. Amer. Soc. Microbiol. / Ann. Meet. Washington.- Washington, 1986.- P.151.

284. Wang D., Yap E.H. et al. Identification of a novel repetitive DNA element and its use as a molecular marker for strain typing and discrimination of ara" from ara+ Burkholderia pseudomallei isolates. // J. Med. Microbiol.- 2002.-V.51.- P.76-82.

285. Weinstock G. Genomics and bacterial patogenesis // Emerg. Infect. Dis. — 2000.- V. 6.- №.5.- P.496-505.

286. Williams P. Genetic interactions between mixed microbial populations // Phil. Trans. Roy. Sos. London.- 1982.- V.297.- P!631-639.

287. Wongratanacheewin S.,Komutrin K., Sermswan R.W. Use of multiplex PCR patterns as genetic markers for Burkholderia pseudomallei II Acta Tropica.- 2000.- V.74.- P.193-199:

288. Woods D.E. Molecular pathogenesis of Burkholderia pseudomallei II 4th World Melioidosis Congress.- Singapur.- 2004.- P.23.

289. Wuthiekanun V., Smith M.D., Dance D.A. et al. Biochemical characteristics of clinical and environmental isolates of Burkholderia pseudomallei II J.Med.Microbiol.- 1996.- V.45.- P.408-412.

290. Yap E., Chan Y, Goh К/ et al. Sudden unexplained death syndrome a new manifestation in melioidosis? // Epidemiol. Infect.- 1991.- V.107.-№.3,- P.577-584.

291. Yatome C., Ogawa T., Koda D.,Idaka E. Biodegradation of several dyes by the starved cells Pseudomonas pseudomallei II J. Soc. Fiber. Sei. Technol. Gap.- 1981.- У.37.-Ж11.- P.91-94.

292. Yatome C., Ogawa T., Idaka E. Degradation of p-aminoazobenzene by means of cell-free extracts from Aeromonas hydrophila var. 2413 and Pseudomonas pseudomallei 13NA // Eur. J. Appl. Microbiol. Biothechnol.-1981.- V.12.-№.3.- P.189-191.

293. Yoshimasa K., Hirosawa W. 11 Genbank database, National CenteR foR Biotechnology InfoRmation, Washington, DC. Genbank accession № D13048, D13049, D13050, D13051 and D13052.