Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярная детекция и типирование хромосомных β-лактамаз возбудителей мелиоидоза и сапа

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярная детекция и типирование хромосомных β-лактамаз возбудителей мелиоидоза и сапа"

Шунова Александра Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ И ТИПИРОВАНИЕ ХРОМОСОМНЫХ Р-ЛАКТАМАЗ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА И САПА

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

б ноя го!4

Волгоград-2014

005554274

005554274

Шунова Александра Владимировна

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ДЕТЕКЦИЯ И ТИПИРОВАНИЕ ХРОМОСОМНЫХ Р-ЛАКТАМАЗ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА И САПА

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

Волгоград — 2014

Работа выполнена в Федеральном казённом учреждении здравоохранения «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

доцент Викторов Дмитрий Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет имени В. И. Разумовского» Министерства здравоохранения

Российской Федерации Швиденко Инна Григорьевна

доктор медицинских наук, профессор,

заведующего отделом образовательных программ и подготовки специалистов ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб»

Роспотребнадзора Попов Юрий Алексеевич

Ведущая организация:

ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора

Защита состоится «23» декабря 2014 г. в 11:00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.06 по защите диссертаций на соискание учёной степени кандидата наук, на соискание учёной степени доктора наук при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1).

Автореферат разослан «_»_2014 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор социологических наук, профессор Г П\Ш /~\ Ковалёва Марина Дмитриевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Важным биологическим свойством патогенных буркхольдерий (Burkholderia pseudomallei, Bitrkholderia mallei) является высокая природная устойчивость к широкому спектру антимикробных соединений. Наличие этого свойства обуславливает возникновение трудностей при лечении вызываемых ими заболеваний. На сегодняшний день механизмы развития полирезистентности патогенных Burkholderia являются недостаточно исследованными.

В течение последних десятилетий накоплен довольно обширный материал об индивидуальной устойчивости буркхольдерий к антибактериальным препаратам (Антонов Ю.В. и др., 1991; Kenny D. L. et al., 1999; Moore J.E. et al., 2001; Vorachit M. et al., 2000). По данным этих исследований можно сделать вывод о том, что соединения тетрациклинового, фторхинолонового, цефалоспоринового, карбапенемового рядов в опытах in vitro проявляют выраженное ингибирующее действие на клетки патогенных видов данной группы микроорганизмов, культивируемых на искусственных питательных средах. Однако применение этих антибактериальных агентов при персистенции бактерий в организме-хозяине нередко оказывается малоэффективным (Azizi Z.A. et al., 2005; Inglis T.J. et al., 1998). Следует отметить, что буркхольдерий при культивировании на питательных средах в селективных условиях, также как и в процессе лечения, быстро приобретают резистентность к различным антибактериальным препаратам, и часто резистентность носит множественный характер (Но P.L. et al., 2002).

Сложность генетической организации данных микроорганизмов (Holden M.T.G. et al.,2004; Nierman V. et al., 2004; Rodley P.D. et al., 1995) позволяет говорить о высокой способности к адаптации их геномов и предполагать наличие различных молекулярно-генетических механизмов, с помощью которых реализуется лекарственная резистентность. Последнее является основанием для того, чтобы обозначить в качестве одного из приоритетных направлений в изучении патогенных Burkholderia исследование фундаментальных основ их устойчивости к антибактериальным агентам, в первую очередь — молекулярно-генетических механизмов формирования резистентности.

Степень разработанности темы. Антибактериальные соединения ß-лактамной группы стандартно используются в существующих схемах экстренного и пролонгированного лечения мелиоидоза и сапа. В то же время, опыт их применения в терапии больных мелиоидозом демонстрирует значительное количество случаев развития резистентности возбудителя в

ходе лечения и, нередко, фатального исхода заболевания (Chaowagul W. et al., 2000; Dance D.A.B., 2000; Dance D.A.B, et al.,2004; White N.J., 2003). Значение собственных ß-лактамаз мелиоидозного и сапного микробов в развитии устойчивости к антибиотиками ß-лактамной группы чрезвычайно мало освещены в современной научной литературе. По мнению некоторых исследователей, возрастание резистентности В. pseudomallei к ß-лактамам может быть обусловлено расширением спектра ферментной инактивации, а также снижением чувствительности лактамаз микроба к ингибиторам (Cheung Т.К.М. et al., 2002; Keith K.E. et al., 2005; Tribuddharat C. et al., 2003).

Изучение последовательностей геномов В. pseudomallei и В. mallei позволяет судить о генетическом потенциале микроорганизмов для развития устойчивости к ß-лактамным соединениям. Структурно-функциональный анализ последовательностей генов ß-лактамаз молекулярных классов А, В и D является актуальным направлением исследований для более полного понимания биологических основ устойчивости возбудителей мелиоидоза и сапа к антимикробным соединениям. Не менее важным является применение результатов такого рода исследования для совершенствования схем лечения инфекций и создания систем геномного сканирования штаммов патогенных буркхольдерий, что позволит решать практические задачи генной диагностики и молекулярно-эпидемиологического мониторинга, а также прогнозировать возможные эпидситуации, вызванные

антибиотикорезистентными штаммами буркхольдерий.

Цель работы. Конструирование олигонуклеотидных праймеров для молекулярной детекции и типирования генов ß-лактамаз патогенных буркхольдерий и анализ распространённости генов ß-лактамаз классов А, В и D в геномах штаммов В. pseudomallei, В. mallei и близкородственных видов.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ генов ß-лактамаз патогенных буркхольдерий in silico и сконструировать набор олигонуклеотидных праймеров для их детекции в полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2. Оценить диагностическую эффективность сконструированных олигонуклеотидов для исследования распространённости генов ß-лактамаз молекулярных классов А, В и D в геномах коллекционных штаммов В. pseudomallei, В. mallei и родственных буркхольдерий.

3. Осуществить подбор комбинаций праймеров для детекции и типирования генов хромосомных ß-лактамаз патогенных буркхольдерий в формате мультилокусной ПЦР.

4. Разработать алгоритм детекции и типирования нуклеотидных полиморфизмов в генах р-лактамаз патогенных буркхольдерий в формате ПЦР реального времени / плавления ампликонов высокого разрешения (high resolution melting, HRM).

Научная новизна работы. Проведена сравнительная характеристика нуклеотидных последовательностей генов хромосомных Р-лактамаз патогенных буркхольдерий и их предполагаемых продуктов с использованием биоинформационного программного обеспечения и предложен набор олигонуклеотидных праймеров для детекции генов Р-лактамаз различных молекулярных классов у В. pseudomallei и В. mallei.

Получены новые данные о распространённости детерминант Р-лактамаз молекулярных классов А, В, D в геномах штаммов В. pseudomallei, В. mallei и родственных буркхольдерий.

Осуществлён подбор наиболее эффективных комбинаций праймеров для детекции последовательностей генов Р-лактамаз патогенных буркхольдерий в формате мультилокусной ПЦР.

Разработан алгоритм детекции и типирования нуклеотидных полиморфизмов в генах Р-лактамаз патогенных буркхольдерий с использованием технологии ПЦР реального времени и плавления ампликонов высокого разрешения (high resolution melting, HRM).

По материалам проведённых исследований получены 2 патента РФ на изобретения: патент № 2413763 «Инсерционный мутант Burkholderia pseudomallei КМ31 - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной

антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий» (зарегистрирован в Госреестре изобретений РФ 10.03.2011) и патент № 2474614 «Олигонуклеотидные праймеры для детекции и типирования генов Р-лактамаз патогенных буркхольдерий» (зарегистрирован в Госреестре изобретений РФ 10.02.2013).

Теоретическая и практическая значимость работы. Материалы исследований использованы при подготовке проекта методических указаний «Порядок организации и проведения лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней», планируемых к утверждению на федеральном уровне.

Набор сконструированных в ходе работы олигонуклеотидных праймеров используется для типирования, сравнительного анализа и

экспресс-оценки спектра резистентности к антибиотикам р-лактамной группы коллекционных и мутантных штаммов В. mallei и В. pseitdomallei в лабораториях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института и в работе референс-центра по мониторингу за возбудителями сапа и мелиоидоза.

Методология и методы исследования. Данное исследование основано на проведении сравнительного анализа in silico кодирующих последовательностей геномов патогенных буркхольдерий, гомологичных известным генам р-лактамаз. При этом использовались различные базы данных и их инструментарий для проведения оценки выбранных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей. В результате был сгенерирован набор олигонуклеотидных праймеров, который также был исследован in silico в отношении возможности детекции генетических последовательностей буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов.

Оценка диагностической эффективности сконструированных олигонуклеотидов была проведена на образцах геномной ДНК с применением микробиологических и молекулярно-генетических методов анализа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Гены р-лактамаз буркхольдерий кодируют энзимы, принадлежащие к Р-лактамазам молекулярных классов А, В, D и относящиеся к 2 суперсемействам протеинов «р-лактамазы / транспептидазы» и «металло-гидролазы / оксидоредуктазы» и семействам «Р-лактамазы / D-ala карбоксипептидазы» (Р-лактамазы классов А и D), «Р-CASP РНК-метаболизирующие гидролазы», «глиоксалазы II», «PqsE- подобные металло-гидролазы», «алкилсульфатазы» и «Zn металло-Р-лактамазы» (Р-лактамазы класса В).

2. Р-лактамазы класса D встречаются лишь у В. pseudomallei и В. thailandensis, а отдельные группы металло-р-лактамаз семейств «р-CASP РНК-метаболизирующие гидролазы» распространены преимущественно у В. pseudomallei и В. mallei.

3. Сконструированный набор олигонуклеотидных праймеров bmlFl -bm4Rl, bmlF2 - bml4R2, bpslF3 - bpslR3, bpslF4 - bps8R4, bps3F5 - bps8R5 применим для детекции генов р-лактамаз патогенных буркхольдерий методом полимеразной цепной реакции с одновременным определением их принадлежности к молекулярным классам А, В и D.

4. Олигонуклеотидные праймеры, специфичные генам металло-(3-лактамаз {bpslF3-bpslR3, bpslF4-bps8R4) и оксациллиназ (bmlF2-bml4R2), позволяют дифференцировать в полимеразной цепной реакции виды буркхольдерий группы «pseudomallei» (В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis).

5. Высокоразрешающий анализ кривых плавления (HRM) амплифицированных фрагментов генов р-лактамаз молекулярных классов В и D позволяет выявлять аллельные варианты данных детерминант в штаммах буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, а также осуществлять скрининг вероятных мутантных последовательностей генов Р-лактамаз у штаммов с изменённой чувствительностью к препаратам Р-лактамного ряда.

Степень достоверности и апробация результатов. Результаты исследований по теме диссертационной работы были представлены на VI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), XIII Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2008), 66-ой Открытой научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2008), Научно-практической конференции «Инновационные технологии в лабораторной диагностике» (Волгоград, 2009), Научно-практической школе-конференции молодых учёных и специалистов Роспотребнадзора «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010), X Межгосударственной научно-практической конференции «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ» (Ставрополь, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных печатных работ, из них три статьи - в изданиях, рекомендованных ВАК, получены два патента на изобретение РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена в классической форме на 113 листах компьютерного текста, состоит из введения, 5 глав, содержащих обзор литературы по проблеме, методическую часть и экспериментальные разделы, заключения, выводов и списка использованной литературы. Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 22 рисунками. Указатель литературы включает 120 источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Все штаммы буркхольдерий предоставлены коллекционным центром ФКУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Культуры буркхольдерий выращивали на плотных питательных средах, содержащих сердечно-мозговой экстракт (BHI «Difco», США) при 37 °С в течение 1-2 суток. Для подтверждения видовой принадлежности культур В. mallei и В. pseudomallei использовали идентификационные наборы МИКРО -ЛА - ТЕСТ® - НЕФЕРМ тест 24 («Лахема», Чехия) и API 20NE («BioMerieux», Франция). Работа с микроорганизмами проводилась в соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами III групп патогенности (опасности)».

Чувствительность культур микроорганизмов к антимикробным соединениям различных классов определяли диско-диффузионным методом на пластинах агара Мюллер-Хинтон («Himedia», Индия).

Выделение геномных ДНК из исследуемых штаммов проводили методом протеиназного лизиса по протоколу фирмы Promega (Gene Print STR Systems. Technical Manual - Promega Corp. - Madison, USA), с некоторыми модификациями. Для выделения ДНК использовали культуры штаммов, выращенные на плотных питательных средах в течение 18 - 24 ч при 37 °С.

Для анализа in silico нуклеотидных последовательностей предполагаемых генов ß-лактамаз буркхольдерий использовали геномные сиквенсы В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis, представленные в Genbank NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Редактирование, первичные манипуляции с нуклеотидными и аминокислотными последовательностями, а также сравнительное сопоставление фрагментов геномных сиквенсов проводили с помощью Open Source пакетов программ Artemis v. 9.0 и ACT v. 6.0, разработанных специалистами Wellcome Trust Sanger Institute (www.sanger.ac.uk).

Принадлежность первично аннотированных и предполагаемых кодирующих последовательностей буркхольдерий к генам ß-лактамаз того или иного молекулярного класса оценивали по степени гомологии их транслированных аминокислотных последовательностей с ранее охарактеризованными ß-лактамазами различных бактериальных видов, используя алгоритм BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Предполагаемые белковые продукты кодирующих

последовательностей В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis,

гомологичные известным ß-лактамазам, дополнительно исследовали на предмет наличия специфических структурных элементов - консервативных аминокислотных мотивов, характерных для ß-лактамаз классов А, В и D. Консервативные элементы первичной структуры ß-лактамаз анализировали с использованием on-line процедур сервера ТМНММ v. 2.0 (www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) и сервиса Protein Motif Search web-сайта Comprehensive Microbial Resource (CMR, cmr.tigr.org/cgi-bin/CMR/CmrHomePage.cgi) Института Геномных Исследований TIGR (www.tigr.org).

Для постановки ПЦР и анализа кривых плавления ДНК-фрагментов использовали амплификаторы С1000 и CFX96 («BioRad», США). Программа амплификации для всех пар праймеров состояла из этапов начального прогрева проб при 94 °С - 5 мин, 35 реакционных циклов (денатурация 94 °С - 30 с, отжиг праймеров 59,9 °С - 30 с, удлинение цепи 72 °С - 45 с) и финальной элонгации 72 °С в течение 1 мин.

Объём реакционной смеси на 1 пробу составлял 25 мкл. В состав ПЦР-смеси входили праймеры в конечной концентрации 15 пМ, 1 Ед DiaTaq ДНК-полимеразы и буфер с дНТФ и MgCh («Интерлабсервис», Россия).

Анализ кривых плавления фрагментов генов ß-лактамаз проводили с использованием реагента SsoFast™ EvaGreen® Supermix («BioRad», США). Плавление проводили в интервале температур 75 - 95 °С с шагом 0,1 °С.

Продукты ПЦР анализировали в 1,5 % агарозном геле с добавлением раствора бромистого этидия (0,5 мкг/мл). Электрофорез в агарозном геле проводили с использованием трис-боратного буфера (0,089 M трис-борат,

0.089 M борная кислота, 0,002 M ЭДТА) при напряжённости электрического поля 8 В/см в течение 1 ч. Для визуализации результатов электрофореза использовали систему документации гелей «Gel Doc» («BioRad», США).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Конструирование олигонуклеотидных праймеров для ПЦР-детекции последовательностей генов ß-лактамаз патогенных буркольдерий

Выбор кодирующих последовательностей геномов Burkholderia, гомологичных известным генам ß-лактамаз, был проведён на основе анализа девяти аннотированных геномов В. pseudomallei, В. mallei и близкородственно-го непатогенного вида В. thailandensis, а также 12 частично аннотированных геномов штаммов данных видов микроорганизмов, представленных в GenBank NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) и

базе данных геномных проектов J. Craig Venter Institute (http://gse.jcvi.org/projects). Принадлежность аннотированных кодирующих последовательностей (CDS) видов буркхольдерий к генам ß-лактамаз оценивали по степени гомологии их транслированных аминокислотных последовательностей с ранее охарактеризованными ß-лактамазами различных бактериальных видов, используя алгоритм BLASTP (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi). В результате данного этапа анализа было выделено 118 хромосомных локусов буркхольдерий, содержащих кодирующие последовательности, гомологичные известным генам бактериальных ß-лактамаз. Предполагаемые белковые продукты данных CDS В. pseiidomallei, В. mallei и В. thailandensis были исследованы на предмет наличия специфических структурных элементов — консервативных аминокислотных мотивов, характерных для ß-лактамаз классов А, В и D. Данный этап анализа был проведён с использованием сервиса Protein Motif Search web-сайта Comprehensive Microbial Resource (CMR, cmr.tigr.org/cgi-bin/CMR/CmrHomePage.cgi), а также инструментария базы данных InterProScan (www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan).

В результате проведённого анализа исследуемые аминокислотные последовательности были отнесены к девяти группам гомологии, включающим энзимы, относящиеся к двум суперсемействам протеинов (ß-лактамаз / тран-спептидаз и металло-гидролаз / оксидоредуктаз). Все исследованные аминокислотные последовательности принадлежали к ß-лактамазам трёх молекулярных классов по классификации Ambler — ферментам класса А, В и D (Ambler R.P., 1969). Представители металло-ß-лактамаз (класс В) формировали несколько групп гомологии, объединяющие ферменты семейств «ß-CASP РНК-метаболизирующие гидролазы», «глиоксалазы II», «PqsE- подобные металло-гидролазы», «алкилсульфатазы» и «Zn металло^-лактамазы».

На основании проведённого анализа для дальнейшего подбора праймеров были определены 5 групп кодирующих последовательностей ß-лактамаз, относящихся к различным молекулярным классам, имеющих высокую внутригрупповую степень гомологии и отличающихся друг от друга протяжёнными участками нуклеотидных последовательностей, дающих возможность подбора дифференцирующих специфичных праймеров. Подобранные пары олигонуклеотидов были верифицированы по показателям специфичности в отношении генетических последовательностей буркхольдерий и на предмет возможного образования димеров и других неспецифических вторичных структур при помощи инструмента PrimerBlast

сервера Национального центра биоинформатики США (Ъ1СВ1, www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast). В результате были определены 5 пар олигонуклеотидов, комплементарных фрагментам генов Р-лактамаз классов А, В и Б буркхольдерий. Структура и характеристики подобранных праймеров приведены в таблице 1.

Таблица 1

Олигонуклеотидные праймеры для детекции последовательностей генов

Р-лактамаз патогенных буркхольдерий

Праймер Последовательность, 5' - 3' Генетическая мишень Локализа ЦИЯ Размер ампликона п.н.

bmlFl bm4Rl TTCCCGCGATCCGCCTGATGA CTTGTTGCCGAGCATCCATGC Р-лактамаза класса А Burkholderia mallei 70247(Genbank access. CP000547 локусВМА 10247 A1040) 41-61 нуклеотид 700-720 нуклеотид 680

bmlF2 bml4R2 ACGTTCCTCGGCGCGACGGAAAC CCGGATGATGTTTCGAGTAGCCGTG Р-лактамаза класса В Burkholderia mallei ЛТСС23344 (Genbank access. CP000011 локусВМА AO 168) 10-32 нуклеотид 337-361 нуклеотид 352

bpslF3 bpslR3 ACGGCAATTCCTCCATTGCGA CTCGTCAGGGTTGCGTCCGGAGT Р-лактамаза класса В Burkholderia pseudomallei 1106b (Genbank access. PRJNA16181 локусВиИРЭ 1106B 2313) 9-29 нуклеотид 713-735 нуклеотид 727

bpslF4 bps8R4 CGCATTCGTTTTGCTGGGTTGCAT TCTGCAGCGACGAGCCGATCCA Р-лактамаза класса D Burkholderia pseudomallei 1106b (Genbank access. PRJNA16181 локусВ1ЖР51106B 2455) 27-50 нуклеотид 445-466 нуклеотид 440

bps3F5 bpsSRS TCTGTGGCTGCTGCGCGACGAGAT GCACAGCCAGTTCGCGAGTCCGA Р-лактамаза класса В Burkholderia pseudomallei 1106b (Genbank access. PRJNA16181 noKycBURPS1106B A3704 ) 132-155 нуклеотид 299-321 нуклеотид 190

2. Анализ распространённости р-лактамаз классов А, В и Б в геномах патогенных буркхольдерий

Экспериментальная оценка эффективности сконструированных праймеров для детекции последовательностей .генов р-лактамаз в ПЦР была проведена на образцах геномной ДНК штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа, родственных видов буркхольдерий и некоторых гетерологичных микроорганизмов.

Результаты использования набора сконструированных олигонуклеотидов для ПЦР-детекции последовательностей генов р-лактамаз различных молекулярных классов приведены на рисунках 1-5.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М

Рис. 1. Детекция гена Р-лактамазы класса А в ПЦР с праймерами bmlFl-bm4Rl. Обозначения: 1 - В. pseudomallei 56830, 2 - В. pseudomallei 100, 3 - В. psendomallei 114; 4 -В. pseudomallei 135, 5 - В. pseudomallei 139, в - В. pseudomallei С141, 7 - В. thailandensis Е264, 8 - В. thailandensis Е299, 9 - В. mallei Ц-5, 10 - cepacia 25416, 11 - P. aeruginosa 215, 12 - V. cholerae 0139 Bengal, 13 - V.cholerae Ol El Tor B-139, M - ДНК ледцер с шагом 100 п.н. (100- 1000 п.н.).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 М

Рис. 2. Детекция гена р-лакгамазы класса В в ПЦР с праймерами bmlF2-bml4R2. Обозначения: 1 - В. pseudomallei 56830, 2 - В. pseudomallei 100, 3 - В. pseudomallei 114; 4 -В. pseudomallei 135, 5 - В. pseudomallei 139, 6 - В. pseudomallei С141, 7 - В. thailandensis Е264, 8 - В. thailandensis Е299, 9 - В. mallei Ц-5, 10 - В. cepacia 25416, 11 - P. aeruginosa 215, 12 - V. cholerae 0139 Bengal, 13 - V.cholerae Ol El Tor B-139, M - ДНК ледцер с шагом 100 п.н. (100 - 1000 п.н.).

Рис. 3. Детекция гена (3-лактамазы класса В в ПЦР с праймерами bps IF'3-bps 1R3. Обозначения: 1 - В. pseudomallei 56830, 2-8. pseadomallei 100, 3 - В. pseudomallei 114; 4 -В. pseudomallei 135, 5 - В. pseudomallei 139, б - В. pseudomallei С141, 7 - В. thailandensis Е264, 8 - В. thailandensis Е299, 9 - В. cepacia 25416, 10 - В. mallei Ц-5, 11 -P. aeruginosa 215, 12 - V. cholerae 0139 Bengal, 13 - V.cholerae Ol El Tor B-139, M - ДНК леддер с шагом 100 п.н. (100 - 1000 п.н.).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 М

Рис. 4. Детекция гена ß-лактамазы класса D в ПЦР с праймерами bpslF4-bps8R4. Обозначения: 1 - В. pseudomallei 56830, 2 - В. pseudomallei 100, 3 - В. pseudomallei 114; 4 -В. pseudomallei 135, 5 - В. pseudomallei 139, 6 - В. pseudomallei С141, 7 - В. thailandensis Е264, 8 - В. thailandensis Е299, 9 - В. mallei Ц-5, 10-5. cepacia 25416, 11 - P. aeruginosa 215, 12 - V. cholerae 0139 Bengal, 13 - V.cholerae Ol El Tor B-139, M - ДНК леддер с шагом 100 п.н. (100 - 1000 п.н.).

1 2 3 4 S 6 7 8 9 lO 11 12 13 M

Рис. 5. Детекция гена (i-лактамазы класса В в ПЦР с праймерами bps3F5-bps8R5. Обозначения: 1 - В. pseudomallei 56830, 2 -й. pseudomallei 100, 3 - В. pseudomallei 114; 4 -В. pseudomallei 135, 5 - В. pseudomallei 139, 6 - В. pseudomallei С141, 7 - В. thailandensis Е264, 8 - В. thailandensis Е299, 9 - В. mallei Ц-5, 10 - В. cepacia 25416, 11 - P. aeruginosa 215, 12 - V. cholerae 0139 Bengal, 13 - V. cholerae 01 El Tor B-139, M - ДНК леддер с шагом 100 п.н. (100- 1000 п.н.).

Проведённая серия экспериментов, таким образом, продемонстрировала следующее. Фрагмент гена репА размером 680 п.н. (праймеры bmlFl-bm4Rl) был обнаружен в геномах всех исследованных штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis и В. cepacia. Специфический участок гена металло-(3-лактамазы класса В (праймеры bmlF2-bml4R2) размером 352 п.н. обнаружен также только у видов буркхольдерий. Фрагмент гена металло-(3-лактамазы класса В (праймеры bpslF3-bpslR3) размером 727 п.н. отмечен только в штаммах В. pseudomallei и В. mallei. Вариант металло-Р-лактамазы (праймеры bps3F5-bps8R5, размер ампликона 190 п.н.) обнаруживается как у видов буркхольдерий, так и видов отдалённой гетерологии (V. cholerae, P. aeruginosa). Ген Р-лактамазы класса D (праймеры bpslF4-bps8R4, размер ампликона 440 п.н.) был детектирован в штаммах В. pseudomallei и В. thailandensis. Полученные результаты ПЦР-детекции последовательностей генов р-лактамаз различных молекулярных классов обобщены в таблице 2.

Учитывая то обстоятельство, что праймеры, специфичные генам металло-Р-лактамаз (bpslF3-bpslR3, bpslF4-bps8R4) и оксациллиназ (bmJF2-bml4R2) продемонстрировали возможность дифференциации между видами буркхольдерий, относящихся к группе <<pseudomallei» (В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis), представлялось перспективным использовать их в формате мультилокусной ПЦР.

Таблица 2

Детекция генов [3-лактамаз у различных видов буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов

Праймеры Виды микроорганизмов

В. pseudomallei В. mallei В. thailandensis В. cepacia P. aeruginosa V. cholerae

ß-лактамазы класса A G uenA)

bmlFl bm4Rl + + + + - -

ß-лактамазы класса В (металло-Р-лактамазы)

bm!F2 bml4R2 + + + + - -

bpslF3 bpslR3 + + - - - -

bps3F5 bps8R5 + + + + + +

ß-лактамазы класса D (oxa)

bpslF4 bps8R4 + - + - - -

Результаты ПЦР (рисунок 6) продемонстрировали одновременную детекцию трёх генетических локусов с праймерами bpslF3-bpslR3, bpslF4-bps8R4 и bmlF2-bml4R2 в штаммах В. pseudomallei, двух локусов с праймерами bps 1 F4-bps8R4 и bmlF2-bml4R2 в штаммах В. thailandensis, двух локусов с праймерами bpslF3-bpslR3 и bmlF2-bml4R2 в штаммах В. mallei и одного генетического локуса с праймерами bmlF2-bml4R2 в штаммах В. cepacia.

•SSkS _ ■ тят 1

12 3 4 M 5 6 7 8

Рис. 6. Детекция генов р-лактамаз классов В и D в мультилокусной ПЦР с праймерами bpslF3-bpslR3, bpslF4-bps8R4 и bmlF2-bml4R2. Обозначения: 1 - В. pseudomallei 56830, 2 - В. thailandensis Е264, 3 - В. mallei Ц-5; 4 - В. cepacia 25416, 5 - В. pseudomallei 139, 6 - В. thailandensis Е299, 7 - В. mallei 10230, 8 - В. cepacia 3189, М - ДНК леддер с шагом 100 п.н. (100- 1000 п.н.).

Постановка мультилокусной ПЦР на широком наборе штаммов В. pseudomallei, В.mallei, В. thailandensis и штаммов различных геномоваров cepacia-комплекса подтвердила возможность дифференциации между различными видами рода Burkholderia по набору генов (3-лактамаз классов В и D (рисунок 7).

12 3 4 5 6 7 8 9 10 М 11 12 13 14

Рис. 7. Детекция генов (3-лактамаз классов В и D в мультилокусной ПЦР с праймерами bpsIF3-bpsIR3, bpsIF4-bps8R4 и bmlF2-bml4R2. Обозначения: 1 - В. cepacia 323, 2 - В. cepacia 506, 3 - В. cepacia 1934, 4 - В. cepacia 25416, 5 - В. cepacia 3189, 6 - В. cepacia 8235, 7 - В. cepacia 8237, 8 - В. cepacia 8240, 9 - В. pseudomallei С141, 10 - V. cholerae 0139 Bengal, 11 - В. pseudomallei 56830, 12 - В. thailandensis Е264, 13 - В. mallei Ц-5, 14 - В. cepacia 25416. М - ДНК леддер с шагом 100 п.н. (100- 1000 п.н.).

Была исследована возможность использования сконструированных олигонуклеотидных затравок для детекции штаммов различных видов буркхольдерий с изменённой чувствительностью к антимикробным соединениям различных классов, включая препараты р-лактамного ряда.

Результаты электрофоретического анализа специфических ампликонов генов (3-лактамаз классов В и D, полученных в мультилокусной ПЦР с праймерами bpslF3~bpslR3, bpslF4-bps8R4 и bmlF2-bml4R2, приведены на рисунке 8.

Полученные результаты демонстрируют применимость анализируемого триплета праймеров для детекции и дифференциации не только штаммов буркхольдерий группы <<pseudomallei» дикого типа, но и их генетически изменённых вариантов - как мутантных штаммов с повышенным уровнем устойчивости к антибиотикам различных классов, так и Tn-индуцированных производных со сниженной резистентностью.

■ • -< г! ***

(Щ ЩГУЁ » Г"» Г-Ч • « Г^ Г-« V ^ „ « « «« «р» «—»

— в-° — ' — °

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Рис. 8. Детекция генов Р-лактамаз классов В и D в мультилокусной ПЦР с праймерами bpsIF3-bpslR3, bpslF4-bps8R4 и bmlF2-bml4R2. Обозначения: 1 - В. pseudomallei 57576 SMP, 2 - В. pseudomallei 57576 SMC, 3 - В. pseudomallei 57576 SMO, 4 - В. pseudomallei 57576 SMRT21, 5 - В. pseudomallei 57576 TTM6-1, 6 - В. pseudomallei 57576 TTM6-3, 7 - В. pseudomallei 57576 TTM7-1, 8 - В. pseudomallei 57576 TTM7-2, 9 - В. pseudomallei 57576 TTM9-1, 10 - В. pseudomallei 57576 TTM9-2, 11 - ДНК-ледцер 100-1000 п.н., 12 - В. pseudomallei 56770, 13 - В. pseudomallei 56770 SMPC, 14 - В. pseudomallei 56770 SMOP, 15 - В. pseudomallei 56770 SMCP, 16 - В. mallei Ц5, 17 - В. mallei Ц5 SMP, 18 - В. thailandensis E264, 19 - В. thailandensis E264 SMOP.

3. Разработка алгоритмов анализа полиморфизма генов р-лактамаз патогенных буркольдерий с использованием технологии плавления ампликонов с высоким разрешением (High Resolution Melting, HRM)

HRM-профилирование ампликонов гена Р-лактамазы класса В, амплифицированных в ПЦР спраймерами bmlF2-bml4R2, показало наличие трёх аллельных вариантов данного гена в исследованных штаммах В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis и В. cepacia (табл. 3, рис. 9). Наиболее распространённый аллель гена (HRM-кластер 01) был детектирован в штаммах В. pseudomallei как юго-восточноазиатского (Вьетнам, Таиланд), так и австралийского происхождения (В. pseudomallei 114), а также в штамме возбудителя сапа и типовом штамме рода - В. cepacia 25416 (табл. 3). В исследованных штаммах В. thailandensis был выявлен другой аллельный вариант гена (HRM-кластер 03), кроме того, в штамме В. pseudomallei 56830 был отмечен уникальный аллель данного Р-лактамазного гена (HRM-кластер 02), идентичный с наиболее распространённым аллельным вариантом по пику плавления, но дифференцирующийся по термодинамическим характеристикам региона плавления (табл. 3, рис. 9).

Таблица 3

Результаты HRM-анализа фрагмента гена р-лактамазы класса В,

амплифицированного в ПЦР с праймерами bmlF2-bml4R2_

Штамм Температура плавления, Тт Высота пика HRM кластер Процент соответствия

В. pseudomallei 56830 91,8 628,00 02 96,0

В. pseudomallei 100 91,8 777,00 01 ■ 76,0

В. pseudomallei 114 92,0 824,00 01 96,0

В. pseudomallei 135 92,2 901,93 01 87,0

В. pseudomallei 139 92,2 869,00 01 93,0

В. pseudomallei С141 92,0 804,00 01 89,0

В. thailandensis Е264 91,8 664,00 03 92,0

В. thailandensis Е299 91,8 804,98 03 96,0

В. mallei Ц-5 92,0 802,00 01 96,0

В. cepacia 25416 92,0 967,00 01 95,0

плавления (В) ПЦР-ампликонов гена |3-лактамазы класса В (праймеры bmlF2-bml4R2).

HRM-анализ последовательности гена Р-лактамазы класса В, амплифицированной в ПЦР спраймерами bmlF3-bmlR3, показал её термодинамическую однородность в исследованных штаммах В. pseudomallei и В. mallei, что даёт основание говорить о высокой мономорфности структуры данной детерминанты у патогенных буркхольдерий (табл. 4, рис. 10).

Таблица 4

Результаты HRM-анализа фрагмента гена р-лактамазы класса В, амплифицированного в ПЦР с праймерами bmlF3-bmlR3_

Штамм Температура Высота HRM Процент

плавления, Тт пика кластер соответствия

В. pseudomallei 56830 93,00 745,00 01 97,0

В. pseudomallei 100 93,00 918,00 01 97,0

В. pseudomallei 114 93,00 761,00 01 97,0

В. pseudomallei 135 93,00 631,46 01 96,0

В. pseudomallei 139 93,00 856,00 01 96,0

В. pseudomallei С141 93,00 867,00 01 97,0

В. mallei Ц-5 93,00 736,00 01 96,0

Рис. 10. Нормализованные кривые плавления (А) и дифференцирующий регион кривых плавления (В) ПЦР-ампликонов гена (3-лактамазы класса В (праймеры Ьт1р3-Ьт1113).

НКМ-профилирование нуклеотидных последовательностей

оксациллиназ (р-лактамазы класса О, оха) продемонстрировало наличие двух аллельных вариантов гена, один из которых характерен для штаммов возбудителя мелиоидоза, а другой встречается у близкородственного В. 1каИапс1ет18 (табл. 5). Оба аллельных варианта отчётливо дифференцируются как по пику плавления, так и термодинамике те^-региона (рис. 11).

Таблица 5

Результаты НЯМ-анализа фрагмента гена р-лактамазы класса Э (оха),

амплифицированного в ПЦР с праймерами Ът1Р4-ЪтШ4

Штамм Температура плавления, Тт Высота пика Кластер Процент соответствия

В. ряеис1ота11е1 56830 92,0 711,0 01 91,0

В. р$еис1ота11е1 100 92,0 835,0 01 96,0

В. ряеис1ота11е1 114 92,0 1003,0 01 96,0

В. рзеис1отаПе1 135 92,0 900,8 01 96,0

В. ряеис/отаПе! 139 92,0 948,0 01 96,0

В. рзеис1ота1Ш С141 92,0 936,7 01 93,0

В. ЛаИапс1епз1$ Е264 91,4 765,0 02 95,0

В. ЛаИапёет^з Е299 91,6 782,5 02 96,0

А В

Рис. 11. Нормализованные кривые плавления (А) и дифференцирующий регион кривых плавления (В) ПЦР-ампликонов гена Р-лактамазы класса О (праймеры Ът1Р4-Ьт8К4).

Амплифицированная с праймерами bm3F5-bm8R5 последовательность гена ß-лактамазы класса В оказалась наиболее полиморфной по своей структуре, что подтверждается выявлением семи аллельных вариантов гена (табл. 6). Более распространённые аллельные варианты выявлены в штаммах В. pseudomallei и В. thailandensis (HRM-кластеры 01 и 03); уникальные варианты нуклеотидной последовательности анализируемого фрагмента гена детектированы в штаммах В. mallei, В. cepacia, Р. aeruginosa, V. cholerae, а также в одном из штаммов возбудителя мелиоидоза (табл. 6, рис. 12). Данная разновидность ß-лактамаз, по видимому, существенно различается по нуклеотидному составу как на межвидовом, так и межродовом уровне, что видно из сопоставления их пиков плавления и дифференцирующих melt-регионов (рис. 12).

Таблица 6

Результаты HRM-анализа фрагмента гена ß-лактамазы класса В,

амплифицированного в ПЦР с праймерами bm3F5-bm8R5_

Штамм Температура плавления, Тт Высота пика Кластер Процент соответствия

В. pseudomallei 56830 89,4 580,00 01 97,0

В. pseudomallei 100 89,0 460,00 02 Н 97,0

В. pseudomallei 114 89,6 627,00 03 96,0

В. pseudomallei 135 89,8 768,00 01 92,0

В. pseudomallei 139 89,6 661,00 01 96,0

В. pseudomallei С141 89,4 675,00 01 97,0

В. thailandensis Е264 91.0 619,00 03 i 96,0

В. thailandensis Е299 90,8 619,00 03 89,2

В. mallei Ц-5 89,4 709,00 04 84,0

В. cepacia 25416 90,2 552,00 05 ■ 90,3

Р. aeruginosa 275 91,0 424,00 06 97,0

V. cholerae 0139 Bengal 86,2 622,00 07 т 97,0

Normalized, Temperature-Shifted Met Cuve Temperature-Shitted Dilerence Curve

0.8 а •о о.е s Ё 0.4 1 0.2- 0.0 •0.1 1 I" L,

^^^^ 1

V^v-... EES?©

87 88 80 90 01 02 03 Shifted Temper Ale 04 Shitted Temperalire

А В

Рис. 12. Нормализованные кривые плавления (А) и дифференцирующий регион кривых плавления (В) ПЦР-ампликонов гена (3-лактамазы класса В (праймеры ЬтЗГ5-Ьт8Я5).

4. HRM анализ полиморфизма генов р-лактамаз исходных и мутантных штаммов буркхольдерий с изменённой чувствительностью к

При HRM-профилировании ампликона гена (3-лактамазы класса В (праймеры bmlF2-bml4R2), в сравнении с соответствующими исходными штаммами, вероятные изменения нуклеотидного состава гена были выявлены в мутантных штаммах В. pseudomallei 57576 SMCP, В. pseudomallei 56770 SMOC, В. pseudomallei 56770 SMCP, а также В. mallei Ц-5 SMP (табл. 7, рис. 13). В мутантных полирезистентных штаммах, при получении которых были использованы лишь препараты фторхинолонового ряда (за исключением В. mallei Ц-5 SMP), а также инсерционных мутантах со сниженной устойчивостью изменений состава нуклеотидной последовательности гена выявлено не было (табл. 7, рис. 13).

Таблица 7

НЯМ-полиморфизмы гена р-лактамазы класса В (праймеры Ьт1Р2-Ьт14Я2)

у исходных и мутантных штаммов буркхольдерий с изменённой _чувствительностью к антибиотикам_

Штамм Кластер Процент соответствия

В. pseudomallei 57576 01 90,0

В. pseudomallei 57576 SMPC 01 96,0

В. pseudomallei 57576 SMPO 01 95,0

В. pseudomallei 57576 SMCP 02 88,0

В. pseudomallei 57576 SMRT21 01 63,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ6-1 01 97,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ6-3 01 97,9

В. pseudomallei 57576 Т ТМ7-1 01 97,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ7-2 01 98,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ9-1 01 95,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ9-2 01 94,0

В. pseudomallei 56770 01 93,0

В. pseudomallei 56770 SMPC 01 95,0

В. pseudomallei 56770 SMOC 02 90,0

В. pseudomallei 56770 SMCP 03 98,0

В. mallei Ц-5 02 56,0

В. mallei Ц-5 SMP 04 96,0

В. thailandensis Е264 01 ■ 96,0

В. thailandensis Е264 SMOP 01 1 96,0

Normalized, Temperature SWted Met Cuve

//

ч

89 SO 01 92 93 04 05

Shifted Temperatue

Temperature-Shifted Deference Сине

Shifted Temperahre

А В

Рис. 13. Нормализованные кривые плавления (а) и дифференцирующий регион кривых плавления (В) ПЦР-ампликонов гена Р-лактамазы класса В (праймеры bmIF2-bml4R2).

Анализ регионов плавления ампликонов другого варианта гена р-лактамазы класса В (праймеры bmlF3-bmlR3) в целом продемонстрировал отсутствие вариабельности структуры ДНК-фрагментов, за исключением штаммов В. pseudomallei 56770 SMPCh, аналогично вышеописанным результатам, - В. mallei Ц-5 SMP (табл. 8, рис. 14).

Таблица 8

HRM-полиморфизмы гена р-лактамазы класса В (праймеры bmlF3-bmlR3) у исходных и мутантных штаммов буркхольдерий с изменённой чувствительностью к антибиотикам

Штамм Кластер Процент соответствия

В. pseudomallei 57576 01 90,0

В. pseudomallei 57576 SMP С 0! 96,0

В. pseudomallei 57576 SMPO 01 95,0

В. pseudomallei 57576 SMCP Ol 88,0

В. pseudomallei 57576 SMRT21 01 63,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ6-1 01 97,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ6-3 Ol 97,9

В. pseudomallei 57576 Т ТМ7-1 01 97,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ7-2 Ol 98,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ9-1 Ol 95,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ9-2 Ol 94,0

В. pseudomallei 56770 01 93,0

В. pseudomallei 56770 S MPC 02 95,0

В. pseudomallei 56770 SMOC 01 П 90,0

В. pseudomallei 56770 SMCP 0! 98,0

В. mallei Ц-5 0! ■ 56,0

В. mallei Ц-5 SMP 02 96,0

Normalized, Temperature-SMled Met Cuve

Shifted Tempaíue

Temperature-Shitted DKerence Cuve

Shifted ТетрегАме

А В

Рис. 14. Нормализованные кривые плавления (А) и дифференцирующий регион кривых плавления (В) ПЦР-ампликонов гена р-лактамазы класса В (праймеры bmlF3-bmlR3).

Вероятные мутации гена детектированы в штаммах, при получении которых устойчивость к фторхинолонам использована либо как единственный (В. mallei Ц-5 SMP), либо первичный (В. pseudomallei 56770 SMPC) селективный маркер. Кандидатные мутантные последовательности оха были обнаружены лишь у клонов В. pseudomallei 57576 ТТМ9, у остальных производных последовательность гена оказалась мономорфной. HRM-профили оха полирезистентных производных штамма В. pseudomallei 56770 были идентичны с В. pseudomallei 57576 и его полирезистентными вариантами, melt-регион исходного штамма В. pseudomallei 56770 соответствовал другому кластеру (табл. 9, рис. 15).

Таблица 9

HRM-полиморфизмы гена Р-лактамазы класса D (оха) (праймеры bmlF4-bm8R4) у исходных и мутантных штаммов буркхольдерий с изменённой

Штамм Кластер Процент соответствия

В. pseudomallei 57576 01 99,1

В. pseudomallei 57576 SMPC 01 90,0

В. pseudomallei 57576 SMPO 01 98,0

В. pseudomallei 57576 SMCP 01 98,0

В. pseudomallei SI SI в SMRT21 01 99,0

В. pseudomallei 57576 TTM6-1 01 99,0

В. pseudomallei 57576 TTM6-3 01 99,0

В. pseudomallei 57576 T TM7-1 01 97,0

B. pseudomallei 57576 TTM7-2 01 95,0

B. pseudomallei 57576 TTM9-1 02 99,4

B. pseudomallei 57 576 TTM9-2 02 98,0

B. pseudomallei 56770 03 85,0

B. pseudomallei 56770 SMPC 01 99,0

B. pseudomallei 56770 SMOC 01 98,2

B. pseudomallei 56770 SMCP 01 96,0

B. thailandensis E264 04 99,2

B. thailandensis E264 SMOP 04 98,0

А В

Рис. 15. Нормализованные кривые плавления (А) и дифференцирующий регион кривых плавления (В) ПЦР-ампликонов гена р-лактамазы класса D (оха) (праймеры bmlF4-bm8R4).

Результаты HRM-анализа гена Р-лактамазы класса В (праймеры bm3F5-bm8R5) приведены в таблице 10 и на рисунке 16. HRM-профиль гена у В. pseudomallei 57576 образовывал единый кластер с мутантным штаммом В. mallei Ц-5 SMP и штаммом В. thailandensis Е264, для остальных штаммов последовательность гена мономорфна. Выраженные отличия структуры анализируемого фрагмента гена обнаружены у Тп-индуцированных производных со сниженной устойчивостью от полирезистентных вариантов (табл. 10, рис. 16).

Таблица 10

HRM-полиморфизмы гена Р-лактамазы класса В (праймеры bm3F5-bm8R5) у исходных и мутантных штаммов буркхольдерий сизмененной ___чувствительностью к антибиотикам_

Штамм Кластер Процент соответствия

В. pseudomallei 57576 02 98 0

В. pseudomallei 57576 SMPC 01 97,6

В. pseudomallei 57576 SMPO 01 ^В 98,0

В. pseudomallei 57576 SMCP 01 ^Н 97,0

В. pseudomallei 57576 SMRT21 03 ^В 98 Д)

В. pseudomallei 57576 ТТМ6-1 03 98,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ6-3 03 ^Н 98*0

В. pseudomallei 57576 Т ТМ7-1 03 ^В 99^0

В. pseudomallei 57576 ТТМ7-2 03 98,0

В. pseudomallei 57576 ТТМ9-1 03 ^Н 98^0

В. pseudomallei 57576 ТТМ9-2 03 ^И 98,0

fi. pseudomallei 56770 01 ^Н 89 0

Я pseudomallei 56770 SMPC 01 ^Н 99;'о

В. pseudomallei 56770 SMOC 01 ^В 99'о

fi. pseudomallei 56770 SMCP 01 ^В 97})

fi. mallei Ц-5 03 Щ 99s0

fi. mallei Ц-5 SMP 02 98Д)

fi. thailandensis E264 02

99,0

fi. thailandensis E264 SMOP 04 99 q

Рис. 16. Нормализованные кривые плавления (А) и дифференцирующий регион кривых плавления (В) ПЦР-ампликонов гена Р-лактамазы класса В (праймеры bm3F5-bm8R5).

Таким образом, результаты проведённых исследований демонстрируют применимость HRM-анализа детектированных в ПЦР с использованием разработанных олигонуклеотидных праймеров последовательностей генов р-лактамаз молекулярных классов В и D для выявления аллельного полиморфизма данных детерминант в штаммах различных видов буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов. Полученные данные также свидетельствуют о принципиальной возможности использования данной аналитической технологии для скрининга вероятных мутантных последовательностей генов Р-лактамаз у штаммов Burkholderia spp. с изменённой чувствительностью к антимикробным соединениям с целью их дальнейшего секвенирования и идентификации мутационных изменений. Разработанная и апробированная технология молекулярного типирования генов Р-лактамаз может, по нашему мнению, найти своё применение для расширенной генетической паспортизации штаммов патогенных буркхольдерий и формирования каталогов геномных портретов изолятов ПБА 1 - II групп патогенности.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что гены Р-лактамаз буркхольдерий кодируют энзимы, принадлежащие к р-лактама зам молекулярных классов А, В, D и относящиеся к двум суперсемействам протеинов «р-лактамазы / транспептидазы» и «металло-гидролазы / оксидоредуктазы» и семействам <ф-лактамазы / D-aia карбоксипептидазы» (Р-лактамазы классов А и D), <ф-CASP РНК-метаболизирующие гидролазы», «глиоксалазы II», «PqsE-подобные металло-гидролазы», «алкилсульфатазы» и «Zn металло-р-лактамазы» (Р-лактамазы класса В).

2. В процессе проведённых исследований определено: р-лактамазы класса D встречаются лишь у В. pseudomallei и В. thailandensis, а отдельные группы металло-р-лактамаз семейств «р-CASP РНК-метаболизирующие гидролазы» распространены преимущественно у В. pseudomallei и В. mallei.

3. Экспериментально показано, что сконструированный набор олигонуклеотидных праймеров bmlFl - bm4Rl, bmlF2 - bml4R2, bpslF3 -bpslR3, bpslF4 - bps8R4, bps3F5 - bps8R5 применим для детекции генов ß-лактамаз патогенных буркхольдерий методом полимеразной цепной реакции с одновременным определением их принадлежности к молекулярным классам А, В и D.

4. Установлено, что олигонуклеотидные праймеры, специфичные генам металло-Р-лактамаз (bpslF3-bpslR3, bps 1 F4-bps8R4) и оксациллиназ (bmlF2-bml4R2), позволяют дифференцировать в полимеразной цепной реакции виды буркхольдерий группы «pseudomallei» (В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis).

5. Исследована возможность применения высокоразрешающего анализа кривых плавления (HRM) амплифицированных фрагментов генов ß-лактамаз молекулярных классов В и D для выявления аллельных вариантов данных детерминант в штаммах буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, а также для скрининга вероятных мутантных последовательностей генов ß-лактамаз у штаммов с изменённой чувствительностью к препаратам ß-лактамного ряда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Романова A.B. Использование полимеразной цепной реакции для идентификации геномоваров Burkholderia cepacia. Актуальные проблемы экспериментальной медицины // Материалы VI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, ноябрь 2006 г., Волгоград -2006.-с.37-38.

2. Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Савченко С.С., Романова A.B. Генетическое типирование патогенных буркхольдерий на основе вариабельных ампликонов (Variable Amplicon Typing). Молекулярная диагностика // Сборник трудов VI Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, 28-30 ноября, Москва, 2007 г Т I -с. 416-417.

3. Антонов В.А., Савченко С.С., Алтухова В.В., Ткаченко Г.А., Романова A.B., Замараев B.C., Алексеев В.В. ПЦР-типирование возбудителей сапа и мелиоидоза. Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств // Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ, 30 сентября - 2 октября 2008 г., Волгоград - 2008. - с.25-27.

4. Романова A.B., Савченко С.С. Генетическое типирование патогенных буркхольдерий на основе вариабельных ампликонов (Variable Amplicon Typing) и количества тандемных повторов (Variable Tandem

Repeats). Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины // Материалы 66-ой научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием, 23-25 апреля 2008 г., Волгоград - 2008. - с.141-142.

5. Романова A.B. Идентификация и генетическое типирование бактерий комплекса Burkholderia cepacia. Актуальные проблемы экспериментальной медицины // Материалы XIII Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области, 11-14 ноября 2008 г. Волгоград - 2008. - с.52-53.

6. Тетерятникова H.H., Романова A.B., Захарова И.Б., Замараев B.C., Викторов Д.В. Молекулярная детекция и типирование ß-лактамаз Burkholderia spp. Современные технологии в совершенствовании мер предупреждения и ответных действий на чрезвычайные ситуации в области общественного здравоохранения санитарно-эпидемиологического характера // Материалы XI Межгосударственной научно-практической конференции. ООО «Приволжское издательство», Саратов — 2012. - с.219-221

7. Романова A.B., Тетерятникова H.H., Захарова И.Б., Лопастейская Я.А., Викторов Д.В. Конструирование праймеров для детекции и типирования генов ß-лактамаз патогенных буркхольдерий. Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ // Материалы X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ, Ставрополь - 2010. - с.220-221.

8. Романова A.B., Захарова И.Б., Замараев B.C., Викторов Д.В. Разработка системы молекулярной детекции и типирования генов ß-лактамаз патогенных буркхольдерий. Молекулярная диагностика // Сборник трудов VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, Москва - 2010. - том I, с.411 -413.

9. Тетерятникова H.H., Захарова И.Б., Подшивалова М.В., Романова A.B., Лопастейская Я.А., Викторов Д.В., Алексеев В.В. Молекулярная детекция интегронов класса 1 у Burkholderia pseiidomallei 11 Проблемы особо опасных инфекций, вып. 108, 2011. - с.46-49.

10. Романова A.B., Захарова И.Б., Замараев B.C., Викторов Д.В. Конструирование праймеров для детекции и типирования ß-лактамаз патогенных видов рода Burkholderia II Проблемы особо опасных инфекций, 2012, 2(112) с.59-61.

11. Захарова И.Б., Романова A.B., Тетерятникова H.H., Замараев B.C., Викторов Д.В. Молекулярное типирование и анализ полиморфизма генов ß-лактамаз патогенных видов Burkholderia II Вестник ВолгГМУ, 2012, 2(42) с.98-101.

Подписано в печать 17.10.2014. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Усл. печ. л. 1,75. Тираж 100 экз. Заказ 3800.

Л)

Изготовлено в полиграфической компании «Эль-Принт» (ИП Яковлев А. А.) Тел.: 8-906-307-2677, 8-903-328-0061, e-mail: a590061@mail.ru Ьйр://печатаем-рекламу.рф