Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антигенный анализ возбудителей мелиодиоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Антигенный анализ возбудителей мелиодиоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности"

од

ИЮЛ 1997

На правах рукописи

ПИВЕНЬ Николай Николаевич

АНТИГЕННЫЙ АНАЛИЗ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА И САПА В АСПЕКТАХ ИДЕНТИФИКАЦИИ, ДИАГНОСТИКИ И ПАТОГЕННОСТИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Волгоград - 1997

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор В.И. Илюхин.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук , профессор, ака-• демик РАЕН Г.М. Шуб.

Ведущая организация: Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт.

нии диссертационного совета Д 074.32.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г.Саратов, Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

доктор медицинских наук, профессор Т.И. Анисимова.

доктор медицинских наук, профессор В.И. Вейнблат.

Защита состоится

июня 1997 г. в/^"часов на заседа

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Корнеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Псевдомонады - микроорганизмы рода Pseudomonas, широко распространенные в природе, играют значительную роль в инфекционной патологии людей и животных (Fournier, Chambón, 1958; Ширяев, 1976; Илюхин, 1985; Беляков с соавт.,1990). Из 16 видов псевдомонад, имеющих клиническое значение, лишь P.pseudomallei, P.mallei и Р.aeruginosa имеют нозологическую самостоятельность. За счет своей естественной полипатогенности и полирезистентности эти микроорганизмы вызывают соответствующие инфекционные заболевания людей и животных различной тяжести (Ковалев, 1971; Yayanetra at al., 1974; Shaefer at al., 1983; Nestorescu et al., 1985). Остальные псевдомонады способны приводить к развитию нозокомиальных или оппортунистических инфекций, частота которых в последнее время заметно возросла (Илюхин, 1985; Rodriguexat al., 1995).

Значимость проблемы мелиоидоза за последние десятилетия возросла не только для традиционно эндемичных регионов Юго-Восточной Азии, Северной Австралии и Западной Африки, но и в связи с завозами возбудителя мелиоидоза в районы, где он раньше не регистрировался. Случаи заболевания мелиоидозом имели место в Америке (Северная, Центральная, Южная), Азии (Турция, Иран, Южный Китай), Европе (Англия, Франция, Германия, Дания, Нидерланды) (Propost, Yigier, 1960; Dodin, Ferry, 1974; Dodin, 1976; Galimand, 1979; Bloch at al. 1981; Li L., He J, 1992). Все это указывает на существующую реальную опасность завоза в Россию этого опасного возбудителя из эндемичных районов. Отсутствие средств специфической профилактики мелиоидоза, а также выраженная резистентность ко многим химиотерапевтическим средствам, требует пристального внимания к этому своеобразному и изменчивому микроорганизму, прежде всего с диагностических позиций.

Следует отметить, что ввиду недостаточно четкой нацеленности медицинских учреждений на диагностику мелиоидоза, нет абсолютной гарантии в отсутствии случаев этого заболевания в нашей стране среди лиц, прибывших из эндемичных по мелиоидозу стран. Косвенным подтверждением подобной версии могут служить результаты обширных целенаправленных исследований по выявлению мелиоидоза, проведенных в Таиланде. При интенсивном обследовании только за 1986 год зарегистрировано более 800 бактериологически и серологически подтвержденных случаев мелиоидоза, хотя до этого момента за все предыдущее время было зафиксировано всего лишь три случая этого заболевания (Kanai, Deysirilert, 1988). При этом было установлено, что основной причиной нескольких десятков так называемого

"неожиданного необъяснимого смертельного синдрома" также является мелиоидоз (Yap etal.,1991).

В отличие от мелиоидоза нозоареал сапа существенно сузился, однако сама болезнь не ликвидирована. Сап прежде был широко распространен среди различных животных во многих странах, в том числе во Франции, Германии и России. В дальнейшем в странах Европы и Азии сап лошадей был практически ликвидирован, но в некоторых из них, в частности Турции, Иране, Монголии и Италии, сап продолжал регистрироваться (Беляков, 1990). На всей территории бывшего СССР сап считался полностью ликвидированным. Однако целенаправленные исследования, проведенные специалистами ВолгНИПЧИ на мясокомбинате г. Улан-Удэ в 1984 - 1985 годах, позволили из двухсот забитых лошадей, импортированных из Монголии, в трех обнаружить специфические сапные антигены и антитела. Более того, в одном случае был выделен типичный, вирулентный штамм P.mallei (Мельников с соавт., 1987). Данный факт также дает основание полагать, что диагностика сапа находится не на должном уровне, так как все лошади из Монголии официально подвергались обязательной трехкратной аллергической пробе с маллеином и постановке РСК.

В связи с изложенным, становится очевидной актуальность создания надежных средств как для иммунодиагностики мелиоидоза и сапа, так и для их специфической профилактики.

При диагностике инфекционных заболеваний, наряду с бактериологическими методами, все более широкое применение находят иммунологические приемы. С одной стороны, они направлены на идентификацию и дифференциацию возбудителей, с другой - выявление специфической иммунологической перестройки и оценку степени излеченности макроорганизма (Ashdown, 1981). Для достижения этого необходимы знания антигенной структуры соответствующих микроорганизмов, включающие информацию о наличии общих, перекрест-нореагирующих и видовых антигенов.

В отношении возбудителей мелиоидоза и сапа сведений об их антигенной организации явно недостаточно. Существующие на сегодняшний день препараты для иммунодиагностики мелиоидоза и сапа конструировались эмпирически, без достаточных знаний антигенной организации указанных микроорганизмов. Вследствие этого у P.pseudomallei и P.mallei не изучены парциальные антигенные комплексы и не оценена их структурно-функциональная значимость. Отсутствуют разработки высокоэффективных средств не только для серологической идентификации и дифференциации этих возбудителей, но и для иммунодиагностики мелиоидоза и сапа. До сих пор не ясна роль отдельных биополимеров в патогенезе этих инфекций, что в свою очередь является одним из основных сдерживающих факторов при конструировании специфических химических вакцин.

ЦЕЛЬ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ заключалась в изучении антигенной структуры P. pseudomallei и P. mallei, обнаружении, выделении и иммунохимической характеристике биополимеров, играющих определенную роль в идентификации, диагностике и патогенезе мелиоидоза и сапа.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ были следующими:

1) изучить антигенный состав возбудителей мелиоидоза и сапа, а также антигенные взаимоотношения некоторых клинически значимых псевдомонад;

2) разработать технологию выделения и очистки антигенных комплексов возбудителей мелиоидоза и сапа, имеющих отношение к диагностике и развитию патогенетических механизмов инфекционного процесса;

3) определить значимость отдельных антигенов P.pseudomallei и P.mallei в идентификации этих возбудителей и сконструировать на их основе высокоэффективные диагностические препараты;

4) оценить иммунный ответ макроорганизма при экспериментальном мелиоидозе и сапе, а также возможность использования выявленных иммунологически активных антигенов для установления проявлений гуморального и клеточного звеньев иммунитета;

5) изучить роль экстрацеллюлярных и поверхностных антигенов в реализации вирулентных свойств возбудителей мелиоидоза и сапа;

6) выявить и изучить биополимеры P.pseudomallei, индуцирующие протективный эффект при экспериментальном мелиоидозе и сапе.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Изучена антигенная структура возбудителей мелиоидоза и сапа, впервые разработана антигенная схема P.pseudomallei, показана антигенная взаимосвязь некоторых клинически значимых псевдомонад.

На основе анализа антигенного строения возбудителей мелиоидоза и сапа определены антигенные комплексы, играющие ведущую роль при идентификации этих возбудителей. Показана целесообразность применения выявленных биополимеров в качестве основы при получении высокоэффективных иммуноглобулнновых препаратов для серологической идентификации.

Выделен, очищен и изучен поверхностный антиген 6 гликолипо-протеиновой природы - один из основных биополимеров, определяющих видовую принадлежность возбудителей мелиоидоза и сапа, а также разграничение штаммов P. pseudomallei на серовары.

Определен комплекс антигенов возбудителя мелиоидоза (6+d), стабильно индуцирующих гуморальный иммунный ответ у лабораторных животных при экспериментальном мелиоидозе и сапе.

Выделены, очищены и изучены три экзопротеазы возбудителя мелиоидоза, установлены их физико-химические и иммунобиологические свойства.

Выявлен, выделен и охарактеризован поверхностный гликопро-

теиновын антиген 8 - один из ключевых факторов вирулентности возбудителей мелиоидоза и сапа, патогенное действие которого опосредовано его антифагоцитарнымн свойствами.

Установлена химическая гетерогенность антигена 8, а также им-муногенность его отдельных фракций при экспериментальном мелиои-дозе и сапе.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена следующими авторскими свидетельствами и патентами на изобретение:

1) авторское свидетельство N 1218526 от 15.11.85г."Способ получения мелиоидозной преципитирующей сыворотки";

2) авторское свидетельство N 286000 от 01.12.88г;

3) авторское свидетельство N 310869 от 02.04.90г;-

4) авторское свидетельство N 1621229 от 15.09.90г."Способ получения мелиоидозного аллергена";

5) авторское свидетельство N 1741323 от 15.02.92г."Способ получения мелиоидозного антигенного комплекса";

6) патент на изобретение N 2004250, март 1994г."Способ выделения Агб возбудителя мелиоидоза";

7) патент на изобретение N 2004251, март 1994г."Способ выделения Аг8 возбудителя мелиоидоза";

8) положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке N 95181635/13(020200) "Способ получения экзопротеаз возбудителя мелиоидоза" от 20.06.96;

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ. Материалы диссертационного исследования использованы при составлении инструктивно-методических документов:

1) методические рекомендации "Референтная система антигенов возбудителя мелиоидоза и их иммунохимическая идентификация" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 24.09.80г.);

2) методические рекомендации "Лабораторная диагностика мелиоидоза" (Утверждены зам.нач. ГУКИ Минздрава СССР О.Г.Имамалиевым 28.09.80г.);

3) методические рекомендации "Способ выделения и дифференциации возбудителя мелиоидоза из различных объектов при помощи плотной среды с мелиоидозной преципитирующей антисывороткой" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 10.12.80г.);

4) методические рекомендации "Схема идентификации возбудителя мелиоидоза" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 16.07.82г.);

5) методические рекомендации "Схема идентификации псевдомонад, имеющих медицинское значение" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 22.12.86г.);

6) инструкция по изготовлению и контролю на диагностикум полигрупповой эритроцитарный чумной, сапной, мелиоидозный, ту-ляремийный, бруцеллезный иммуноглобулиновый сухой с ингредиен-

тамн (Утверждена КВС', февраль 1987г.);

7) инструкция но изготовлению и контролю на иммуноглобулины полигрупповые чумные, сапные, мелиоидозные, туляремийные, бруцеллезные, сибиреязвенные (антиспоровые, люминесцирующие сухие) (Утверждена КВС, февраль, 1987г.);

8) методические рекомендации по получению и применению мелиоидозного аллергена (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 14.02.90г.);

9) методические рекомендации "Получение и применение антигенного мелиоидозного диагностикума" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 10.07.90г.);

10) методические рекомендации "Разработка способов получения и тестирования некоторых факторов патогенности возбудителя мелио-идоза" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 19.12.90г.);

11) методические рекомендации "Применение неконкурентного твердофазного радиоиммунологического анализа для обнаружения антител при мелиоидозе" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 25.04.91г. и вошли в сборник "Современные методы диагностики ООИ и способы их применения" под редакцией Зыкина Л.Ф. и Ко-ровкина С.А. - Саратов, - 1992 г., утвержденный зам.нач. ГЭУ МЗ

. СССР Г.Г.Онищенко 25.09.91г.);

12) методические рекомендации по очистке Агб и Аг8 возбудителя мелиоидоза методом аффинной хроматографии на колонках с мо-ноклональными иммуносорбентами (Утверждены нач. ГЭУ МЗ СССР М.И.Наркевичем 28.¡0.91г.);

13) экспериментально-производственный регламент на иммуноглобулины полигрупповые чумные, сапные, мелиоидозные, туляремийные, бруцеллезные, сибиреязвенные (антиспоровые) люминесцирующие, сухие (Утвержден директором Ставропольского НИПЧИ 07.12.92г.);

14) временная фармакопейная статья на иммуноглобулины полигрупповые чумные, сапные, мелиоидозные, туляремийные, бруцеллезные, сибиреязвенные (антиспоровые) люминесцирующие сухие (Утверждена директором института "Микроб" 09.02.93г.);

15) инструкция по применению иммуноглобулинов диагностических флуоресцирующих чумных, сапных, мелиоидозных, ту-ляремийных, бруцеллезных, сибиреязвенных сухих (Утверждена зам.министра здравоохранения РФ М.Москвичевым, февраль, 1993г.);

16) методические рекомендации "Лабораторная диагностика,лечение и профилактика мелиоидоза" (Утверждены зам.пред. Гос-комсанэпиднадзора РФ Г.Г.Онищенко 01.10.94г.);

17) методические рекомендации "Выделение, очистка и детекция антигена 8 возбудителя мелиоидоза" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 15.02.94г.);

18) методические рекомендации "Экзопротеазы возбудителя ме-

лиоидоза: выделение, очистка и их обнаружение" (Утверждены директором ВолгНИ ПЧИ 15.02.94 г.);

19) методические рекомендации "Лабораторная диагностика, лечение и профилактика сапа" (Утверждены зам.пред. Госкомсанэпид-надзора 1'Ф Г.Г.Онищенко 16.03.95г.);

20) методические рекомендации "Получение и использование латскспых иммуноглобулиновых диагностикумов для идентификации некоторых патогенных псевдомонад" (Утверждены директором ВолгНППЧИ 12.12.95г.).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной научной конференции "Молекулярная биология, генетика и иммунология возбудителей ООИ" (Ростов-на-Дону, 1984г); на Всесоюзной научной конференции специалистов ПЧУ (Иркутск, 1984); на Всесоюзной научной конференции "Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций (Ставрополь, 1986); на итоговой научной конференции "Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики ООИ (Ставрополь, 1989); на Всесоюзной научной конференции "Современные направления создания медицинских диагностикумов" (Москва, 1990); на Российской научной конференции "Г'енетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций (Волгоград, 1992); на институтских и межлабораторных конференциях ВолгНИПЧИ (1983-1994), на юбилейной конференции ВолгНИПЧИ (Волгоград, 1995).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 43 статьи, получено 5 авторских свидетельств, 2 патента на изобретение и положительное решение о выдаче патента на изобретение. Материалы диссертации вошли в 2 коллективные монографии.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Работа изложена на 296 страницах машинописи, иллюстрирована 45 рисунками, 36 таблицами. Состоит из введения, 1 главы обзора литературы, 7 глав собственных исследований, заключения, выводов.

Список используемой литературы включает 148 работ отечест венных и 283 работы иностранных авторов.

ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1) новые данные по научной обоснованности принципов выбора антигенных структур P.pseudomallei, P. mallei и некоторых условнопа-тогенных псевдомонад с целью последующей разработки средств идентификации и дифференциации этих микроорганизмов;

2) результаты изучения антигенной структуры возбудителя ме-лиоидоза и создание его антигенной схемы, позволяющей проведение иммунохимической идентификации каждого входящего в нее антигенного комплекса;

3) разработка средств выявления иммунологической перестройки макроорганизма при мелиоидозной и сапной инфекциях, основанная

на анализе антигенов, адекватно отражающих специфический ответ гуморального и клеточног о звеньев иммунитета;

4) доказательства прямой связи вирулентных свойств возбудителей мелиоидоза и сапа с экспрессией поверхностного гликопротеино-вого антигена 8, обладающего выраженной антифагоцитарной активностью;

5) новые данные по протективному эффекту, достигаемому при иммунизации животных отдельными фракциями Аг8 возбудителя мелиоидоза при экспериментальном мелиоидозе и сапе.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследований

В работе использовали 32 штамма P.pseudomallei, выделенных из различных источников на территории Азии, Африки, Австралии и Европы. Видовая принадлежность культур подтверждена исследованиями, выполненными по схеме Gilardi (1971). Отдельные штаммы со сниженной вирулентностью, не укладывающиеся в классификацию биохимической идентификации, были подвергнуты молекулярнобио-логическим тестам по установлению гомологии их ДНК (ГЦ-тип, трансформация, гибридизация) (Поповцева, Пивень, 1984; Замараев, 1990).

Следует отметить присутствие в коллекции культур двух ави-рулентных для лабораторных животных штаммов. Это атипичный штамм pJ 54(107), присланный из Дании A.Bremmelgaard, и авиру-лентный штамм (VPA), селекционированный в Волгоградском НИПЧИ и предоставленный В.И. Илюхиным из его личной коллекции. Штаммы австралийского происхождения получены из личной коллекции L.Ashdown. Используемая в исследованиях коллекция возбудителя сапа насчитывала 13 культур, выделенных в странах Европы и Азии, а также на территории СССР в г.Улан-Удэ (В-120) от лошади, импортированной из МНР.

В работе также применяли штаммы условнопатогенных псевдомонад - P.aeruginosa 4000, PAO-I, H-I, Н-2; Н-3; P.fluorescens 540, В 1602, Н 2763, А 4125, 896, 894; P.putida 1608, 3200; P.cepacia 3181, 8235, 8236, 8237, 8238, 8239, 8240, 25416; P.stutzeri 271, 903, 4136; P.maltophilia 13637; P.desmolytica 557; P.radiobacter 559. Кроме этого, были использованы штаммы почвенных псевдомонад, выделенные нами при использовании селективных для P.pseudomallei сред в г. Ленкорани (Азербайджан) и г. Батуми (Аджария), относящиеся к роду Pseudomonas, но не поддающиеся идентификации до вида. Биомассу возбудителей мелиоидоза и сапа, а также близкородственных псевдомонад получали на мясо-пептонном бульоне и мясо-пептонном ага-

pe ("Difco",CLLI А) с 4% глицерина.

Биохимическую идентификацию проводили при помощи определения основных родовых и видовых признаков: оксидазная и ката-лазная активность; окисление и ферментация глюкозы; наличие декар-боксилазы лизина и дегидролазы аргинина; окисление углеводов: ксилозы, лактозы, мальтозы; наличие желатиназы; рост возбудителя при 42°С и денитрификация (Илюхин с соавт., 1983). Чувствительность микроорганизмов к химиотерапевтическим средствам устанавливали при помощи определения минимальных подавляющих концентраций методом 2-х кратных серийных разведений в агаре Мюллера-Хинтона ("Difco").

Исследования по выделению и химическому анализу антигенных комплексов выполнены совместно с к.х.н. В.И. Смирновой. При получении антигенов применяли метод водносолевой экстракции (Захарова, Косенко, 1982), экстракции с использованием трихлорук-суснои кислоты (Staub, 1965), диэтиленгликоля и формамида (Fuller, 1938). Экстракцию формамидом проводили в нашей модификации, которая заключалась в экстрагировании при температуре 20°С.

Углеводы определяли по Dubois (1956), белки по Lowry (1951) и Bradford (1976), липиды по Van N LazarofT (1973), нуклеиновые кислоты по Спирину (1958). Для мечения дансилхлоридом (ДНХ) использовали антигенные препараты, растворенные в 0. 1 М трис-HCl буфере pH 8.0 с 5% додецилсульфата натрия (ДСН) в концентрации 2 мг/мл, которые инкубировали при различных температурных режимах и экспозициях (25°С, 100°С - 2 мин; 100°С - 5 мин; 100°С - 10 мин). Каждую пробу метили ДНХ ("Serva",ФРГ) по Tijsen (1981) с последующим осаждением меченого антигена 5М NaCl. Качественный состав антигенных комплексов определяли тонкослойной хроматографией на бумаге и пластинках "Silufol" ("Avalier", ЧССР). 'Н-ЯМР спектр углеводов регистрировали на приборе "Brucher Physics WM-25 (ФРГ) в D2O при 60°С. Последовательность моносахаридных остатков устанавливали, определяя ядерные эффекты Оверхаузера (Чижов, Шашков, 1985) в 'Н-ЯМР спектре с использованием программы "Brucker NOE MULT".

Антигенные препараты анализировали в системе вертикального электрофореза по Laemmli (1970). Окраску проводили кумасси G-250, "Stain all." ("Serva", ФРГ) (Остерман, 1981), а также щелочным раствором нитрата серебра (Sammons, 1981). Изоэлектрофокусирование проводили на пластинках геля с амфолинами "LK.B Ampholine PAGplates" с широким диапазоном pH 3.5 - 9.5.

Определение молекулярных масс (м.м.) и фракционирование исследуемых антигенов осуществляли с помощью гель-хроматографии (ГХ). Для этой цели применяли следующие гели: Sephadex G-25, G-100, Sepharose 2В ("Pharmacia", Швеция), Ultrogel - АсА-22, АсА-34, АсА-44, АсА-54 ("LKB", Швеция), а также TSK HW 60F и 65F.

("Toyopearl", Япония). Исследования проводили по методикам Де-термана (1970). Для ионообменной хроматографии (ИОХ) использовали анионо- и катионо-обменникн: ДЕАЕ-Sephadex А-25, А-50 и СМ-Sephadex С-50 ("Pharmacia"). Формы зарядки были разными в зависимости от целей исследования.

Иммуноэлектрофорез (ИФ) выполняли на 1% агарозе (Мг= 0.13) с использованием трис-барбиталового буфера pH 8.6 с ионной силой I - 0.02. Перекрестный ИФ проводили по методике Weeke (1973). Иммуноблотинг антигенных препаратов проводили с использованием общих, адсорбированных иммунных сывороток, а также монокло-нальных антител (МКА), любезно предоставленных д.м.н. Н.П. Храповой. С этой целью иммуноглобулины (Иг) метили щелочной фосфа-тазой или пероксидазой (Кэтти, 1991). Электрофорез образцов в ДСН-ПААГе и перенос на мембрану проводили по Towbin (1979). Обработку мембраны нммуноферментным конъюгатом и последующую визуализацию осуществляли по методике, предложенной Tsang (1983).

РА, МФА, РСК л ТИФА ставили общепринятыми способами. РИГА и РАЛ ставили в полистироловых пластинках микрометодом в объеме 25 мкл. В качестве разводящей жидкости использовали 0.1 М раствор NaCl pH 7.0 и яичный стабилизатор (Ерохин с соавт., 1989).

Реакцию фагоцитоза изучали на перитонеальных макрофагах морских свинок и белых мышей (Васильева с соавт., 1979). Функциональную активность фагоцитов также изучали при помощи хемилю-минесцентного теста (Allen, 1977).

Подсчет радиоактивности препаратов проводили в жидкостном сцинтилляционном счетчике RackBeta 1217 ("LKB-Wallack", Швеция) с использованием программы ДРМ - расчет истинных распадов изотопа в минуту.

Электронномикроскопические исследования были выполнены совместно с к.м.н. В.И. Каплиевым. Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-2128, которые последовательно контрастировали в спиртовом растворе уранилацетата и водном растворе цитрата свинца (Venable, Coggeshall, 1965) и просматривали в электронном микроскопе YEM-100 SX ("Jeol", Япония).

Полученные в ходе экспериментальных исследований данные подвергали статистической обработке для определения их достоверности и сравнения показателен (Лакин, 1990). Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки не превышала 0.05 (Р<0.05) контроля, взятого в процентах. Статистическую обработку также осуществляли с помощью непараметрических критериев Уилкоксона-Манна-Уитни и критерия знаков (Гублер, Генкин, 1962).

Расчет LDw проводили по Керберу (Ашмарин, Воробьев, 1962). Индекс завершенности фагоцитоза (ИЭФ) определяли по формуле, предложенной Г.И. Васильевой с соавт. (1979).

Результаты исследований

Изучение антигенной организации возбудителей мелиоидоза и сапа, а также некоторых условнопатогенных псевдомонад в гетероло-гичной системе антиген-антитело с использованием перекрестного ИФ выявило, что Р.рзеис1ота11е1 и Р.ша11е1 наиболее близки по антигенному составу с Р.серааа, что согласуется с данными биохимической и генетической систематизации этих видов (СПагсН, 1971; РаИегош, 1972; УаЬиисЫ е1 а!., 1992). В отличие от них, Р.аепщтоБа, Р-ПиогеБсепБ и Р.вШгеп были отнесены к другой группе микроорганизмов, характеризующихся наличием у них общих, перекрестнореа-гирующих и видовых антигенов. Применение последних в качестве основы иммунодиагностическнх средств сделало возможным проведение эффективной идентификации этих псевдомонад.

По результатам анализа антигенного состава репрезентативной коллекции штаммов возбудителя мелиоидоза была разработана его антигенная схема. Каждый антигенный комплекс охарактеризован по степени подвижности в электрическом поле, терморезистентности, молекулярной массе и химической природе. В общей сложности было выявлено 19 антигенных комплексов, условно обозначенных нами арабскими цифрами и буквами английского алфавита (рис.1). Применение этой схемы для антигенного анализа Р.рзеи<1ота11е1 и Р.та11е1 подтвердило их близкое родство, а исходные физико-химические характеристики биополимеров, входящих в схему, предопределили технологические пути их выделения и очистки. +

Рис. 1. Антигенная схема возбудителя мелиоидоза.

Необходимо отметить, что спустя более десяти лет после разработки нами антигенной схемы, Ьегтето§ко1с}ш М а1. (1991) было выявлено у возбудителя мелиоидоза 20 антигенных комплексов.

В связи со значимостью экзопротеаз в проявлении вирулентных свойств микроорганизмов была разработана технология выделения этих ферментов у Р.р5еис1ота11е1. В результате проведенных исследо-

ваний удалось подобрать оптимальный штамм-продуцент, отработать условия статического культивирования на жидких питательных средах (L-бульон, 48 ч, 37°С), а также разработать высокочувствительную и простую систему обнаружения суммарной протео-литической активности на основе 1.5% агаризованных пластинок с 0.5% сухого молока, 2 мМ фосфорно-кислого калия и 1 мМ хлористого кальция. Использование этой. , системы позволило наряду с P.pseudomallei выявить экзопротеазы и у P.mallei. Ферментативная активность возбудителя сапа оказалась заметно ниже по сравнению с таковой возбудителя мелиоидоза. Индекс ферментативной активности протеаз у P.mallei варьировал от 1.5 до 2.8, а у P.pseudomallei -5.2-8.8.

Выделение и очистка экзопротеаз P.pseudomallei была осуществлена путем осаждения их из фильтрата бульонной культуры при 80% насыщении сульфатом аммония с последующей хроматографией сырца на Sephadex G-100, ДЕАЕ-Sephadex А-50 в С1-форме и СМ-Sephadex С-50 в Na-форме. В результате очистки на ионообменниках было выделено три экзопротеазы, обозначенные нами как протеазы I, II и III с изоэлектрическими точками 9.50, 8.50, 7.35, соответственно. Степень чистоты выделенных ферментов была подтверждена результатами диск-электрофореза в ПААГе. Молекулярная масса экзопротеаз, установленная электрофорезом в ДСН-ПААГе, составила для протеазы I - 40.0 kD, протеазы II - 33.0 kD и протеазы III - 29.5 kD. Выделенные экзопротеазы обладали выраженной протеолитической активностью, а протеаза III определена как низкоактивная эластаза. Все три фермента в ИФ с иммунной кроличьей сывороткой, полученной против комплекса протеаз, формировали преципитаты с умеренной катодной подвижностью.

Кроме внеклеточных антигенов нами были получены также некоторые поверхностные биополимеры, представляющие, на наш взгляд, определенный интерес. Выделение Агб вызвано тем, что он является ответственным за разграничение мелиоидозных штаммов на серовары и определенным образом связан с реализацией вирулентных свойств P.pseudomallei. Наиболее эффективным способом экстракции Агб был определен метод, включающий в себя ультразвуковую дезинтеграцию клеток с последующим переосаждением сырца Агб органическими растворителями. Дальнейшая хроматография сырца, предусматривающая ГХ на TSK HW 65F и ИОХ на ДЕАЕ-Sephadex А-25 в фосфатной форме, позволила получить достаточно очищенный препарат Агб. Этот антиген был также приготовлен при помощи аффинной хроматографии на иммуносорбенте с МКА к Агб. Анализ очищенного антигена в ИФ, ИЭФ, в диск-электрофорезе в ПААГе и иммунобло-тинге показал, что он имеет сложную структуру и состоит из высокомолекулярного (500 kD, pl 6.4) и низкомолекулярного (25 kD, pl 3.6) компонентов. При помощи иммуноблотинга Агб с использованием

МКА было установлено, что эти два компонента являются носителями одних и тех же антигенных эпитопов. Химический анализ Агб показал, что он состоит из 70% углеводов, 16% белков и 14% липидов. Изучение его элементного состава позволило выявить 4.62% азота, 40.10% углерода и 8.37% водорода. Инфракрасная спектроскопия подтвердила наличие гидроксильной и карбонильной групп, т.е. присутствие в составе Агб углеводного и белкового компонентов. Результаты ДСН-электрофореза в 15% ПААГе показали, что Агб является фрагментом ЛИС возбудителя мелиоидоза. Об этом свидетельствует его значительная молекулярная масса, химический состав, а также типичное для Л ПС расположение структурных компонентов на электро-фореграммах, окрашенных серебром.

Скрининг имеющихся в нашем распоряжении музейных культур Р.р$еи(1ота11е1 и Р.таМ выявил, что поверхностный Аг8 продуцировался типичными вирулентными штаммами этих возбудителей и, как правило, не обнаруживался у культур со сниженной вирулентностью. В связи с этим несомненный интерес представляло детальное изучение этого биополимера. Исходные параметры Аг8, полученные при им-мунохимической идентификации, определили технологические пути его выделения и очистки. С этой целью было апробировано несколько методов получения сырца Аг8 (ультразвуковая обработка биомассы, шуттелирование в течение 24 ч, экстракция ТХУ, диэтиленгликолем и формамидом), из которых наиболее эффективным был признан фор-мамидный (20°С, 24 ч). Хроматография формамидного экстракта, осуществленная по схеме: ИОХ на ДЕАЕ-Берйаскх А-25 в фосфатной форме и ГХ на ТБК Н\У 65Р, позволила получить Аг8 в очищенном виде. Антиген 8 также был приготовлен с помощью аффинной хроматографии на основе адсорбированных Иг и МКА к Аг8 с использованием активированной цианбромидом 8ерЬаго5С-4В. Препараты Аг8, выделенные методами ИОХ и аффинной хроматографии, были исследованы в ИФ, ИЭФ, в диск-электрофорезе в ПААГе и иммуноблотин-ге. Было установлено, что Аг8 представлен одной диффузной полосой, расположенной на границе разделяющего и формирующего геля. При ИЭФ зона фокусировки Аг8 соответствовала р1 в области рН 6.8 - 7.3. Анализ этих данных позволил предположить, что Аг8 представляет собой гетерополимер с разветвленной структурой, большой молекулярной массой (800 к О) и слабым электрическим зарядом. Изучение химического состава очищенного Аг8 показало, что он содержит в своем составе 90% углеводов и 10% белков. Его элементный анализ позволил выявить 2.17% азота, 46.40% углерода и 8.09% водорода. Инфракрасное спектральное исследование Аг8 подтвердило его углеводно-белковую структуру. Анализ моносахаров полисахаридной части Аг8 выявил наличие в его составе глюкозы, рамнозы, фукозы, метилированных альдогексоз, аминосахара и неидентифицированных фосфосахаров. Сравнительный анализ данных ДСН-ПААГ электрофо-

реза ВСЭ, ЛПС P.pseudomallei и P.mallei, а также Аг8 позволили сделать предположение о том, что углеводная часгь последнего весьма близка к структуре О-полисахарида Л ПС.

В данной диссертационной работе систематизированы сведения, касающиеся основных антигенных комплексов, имеющих непосредственное отношение к идентификации P.pseudomallei и P.mallei. Проведенные серологические и иммунохимические исследования с использованием РА, РДД, ИФ, РНГА, МФА и стандартных диагностических препаратов отечественного и импортного производства позволили установить, что из всего многообразия антигенных структур возбудителя мелиоидоза только Агб, Аг8 и Ard играют существенную роль при идентификации P.pseudomallei и P.mallei. Для получения высокоактивных и специфичных поликлональных сывороток лучшим сырьем признана фракция ВСЭ, приготовленная при 50% насыщении сульфатом аммония. При этом способе удается получить сыворотки с высоким содержанием Иг к Агб, Аг8 и Ard.

С целью идентификации и полуколичественного определения Аг8 и экзопротеаз были сконструированы соответствующие диагно-стикумы на основе адсорбированных Иг к Аг8 и комплексу экзопротеаз P.pseudomallei. Анализ результатов, полученных при помощи РНГА, РАЛ и ТИФА, свидетельствовал о достаточной чувствительности и высокой специфичности данных тест-систем. Эри-троцитарные и латексные диагностикумы выявляли 140 и 180 нг/мл Аг8 и экзопротеаз, соответственно. Иммуноферментная тест-система имела чувствительность 70 нг/мл при детекции Аг8 и 80 нг/мл - экзопротеаз. Скрининг близкородственных псевдомонад на наличие Аг8 показал, что ни одна из них не имела антигенов, вступающих в специфическую реакцию с этими диагностикумами, в том числе и P.cepacia. Это свидетельствует о строгой группоспецифичности Аг8, что можно использовать как дополнительный признак при дифференциации P.pseudomallei и P.mallei от условнопатогенных псевдомонад. Тест-системы для обнаружения экзопротеаз P.pseudomallei также проявили высокую специфичность при дифференциации возбудителей мелиоидоза и сапа от ряда близкородственных псевдомонад (табл.1).

Лабораторная диагностика мелиоидоза, наряду с бактериологическими методами идентификации культур, предусматривает и выявление иммунологической перестройки макроорганизма. Ретроспективная диагностика мелиоидоза у переболевших или инфицированных животных и людей предусматривает применение РСК, РНГА и ТИФА. Однако диагностическая ценность этих иммунологических реакций незначительна, т.к. далеко не всегда удается определить наличие специфических Иг в сыворотках заведомо инфицированных или больных лабораторных животных. Иммунохимическая идентификация антигенных комплексов, к которым, в основном, выявлялись Иг в исследуемых сыворотках инфицированных лабораторных животных,

позволила сделать заключение о том, что наиболее стабильная продукция антител происходит к Агб и Ard. Сравнительное испытание

Таблица 1.

Выявление антигена 8 и экзопротеаз у псевдомонад

Вид микрорганизма PH ГА ТИФА

Аг8 Протеазы Аг8 Протеазы

P.pseudomallei:

100 lxlO6 1х106 1х103 1x104

111 1 х 105 1 х 105 lxlO3 lxlO3

57576 1 х 105 1 х 103 lxlO3 lxlO3

С-141 1 х I О6 1 х 106 1 х 106 1 х 106

P.mallei 10230 1х107 1 х Í О7 1 х 107 1 х 10б

P.aeruginosa: - - - -

4000 - - - -

Н-2 - - - -

P.cepacia: - - - -

413 - - - -

8240 - - - -

P.fluorescens 2763 - - - -

P.stutzeri 4136 - - - -

разработанных на их основе антигенных диагностикумов с экспериментально-производственными сериями мелиоидозных и сапных эри-троцитарных диагностикумов установило явное преимущество первых. Это в полной мере проявилось при исследовании сывороток лабораторных животных, зараженных возбудителями мелиоидоза и сапа (золотистый хомячок, белая мышь, морская свинка и белая крыса). Ди-агностикумы, сконструированные на основе Агб и А^, обладали высокой специфичностью и чувствительностью. Титры РИГА и РАЛ находились в пределах 1:160 - 1:2400, в то время как производственные серии диагностикумов в 40% случаев вообще не обнаруживали Иг, а титры, отмеченные в РИГА, составляли в основном 1:10 - 1:20, т.е. были ниже диагностических (рис.2).

Результаты успешного применения антигенного комплекса для иммунодиагностики мелиоидоза и сапа предопределили возможность увеличения чувствительности метода детекции Иг с помощью РИА. С этой целью был разработан неконкурентный твердофазный вариант РИА, позволяющий проводить не только эффективную диагностику,, но и дифференциацию сероваров по составу специфических Иг. РИА позволил выявлять антитела у инфицированных животных в 70.4% случаев. При тестировании сывороток больных животных этот показатель увеличился до 90.6%. В ходе сравнительного исследования

эффективности РИА, РИГА и ТИФА установлено преимущество первого метода.

1000- /

900- р. 1

800- Ш.

700- / щ -г' ы

О Положительные находки □ Среднегеометрические титры

ЬОО- К* \ Г

400- / я..- <

300-

200- /

100- ] .7

0-

АМЭД АСЭД ЭД(Аг6+с!) ЛД(Аг6+ф

Рис.2. Эффективность антигенных диагностикумов.

Примечания: АМЭД- мелиоидозный эритроцитарный диагностикум; АСЭД- сапной эритроцитарный диагностикум; ЭД- эритроцитарный диагностикум на основе Аг6+с1; ЯД- латексный диагностикум на основе Аг6+(±

Как известно, перестройку клеточного звена иммунной системы макроорганизма при инфеционных заболеваниях обычно выявляют при помощи бактериальных аллергенов, полученных различными способами из микробных клеток. Применительно к мелиоидозу и сапу такими аллергенами являются "уитморин" (мелиоидин) и коммерческий "маллеин". Это практически единственные препараты для аллергоди-агностики, которые, к сожалению, обладают низкой эффективностью' и выраженным дермонекротическим действием (Ширяев, 1976). Приготовление указанных аллергенов до сих пор базируется на концепции "стареющих" культур в условиях длительной инкубации микроорганизмов в жидкой питательной среде, что приводит к аутолитической деструкции антигенных структур. Учитывая полученные данные по продукции специфических Иг в организме восприимчивых к мелиоидозу лабораторных животных к антигенам 2,3,6,(1^,), мы попытались использовать этот группоспецифический иммунологически активный антигенный комплекс в целях аллергодиагностики мелиоидоза и сапа. Было установлено, что при оптимальной разрешающей дозе 25 мкг белка аллерген обладал более высокой (90 - 95%) эффективностью в сравнении с коммерческим маллеином (25 - 40%) при выявлении ГЗТ у лабораторных животных, инфицированных как Р.р5еи(1ота11е1, так и Р.ша11е1. Предложенный мелиоидозный аллерген отличался высокой

специфичностью, не обладал токсичностью, дермонекротическим и сенсибилизирующим действием.

Известно, что внеклеточные и поверхностные биополимеры принимают активное участие в реализации вирулентных и патогенных свойств псевдомонад, имеющих клиническое значение (Mohr at al., 1990; Deretic at al., 1991; Kao at al., 1992; Oshima at al., 1993; Crevel at al., 1994). Вместе с тем возбудители мелиоидоза и сапа в этом плане остаются наименее изученными. В связи с этим были исследованы отдельные иммунобиологические свойства экзопротеаз возбудителя мелиоидоза. Установлено, что все протеазы являются термолабильными и обладают способностью гидролизовать казеин молока, альбумин, желатин, а протеаза III - и эластин. Ферменты лизировали эритроциты человека, барана, кролика, морской свинки и белой мыши.

Таблица 2.

Дифференциальные признаки экзопротеаз возбудителя мелиоидоза

Признак Экзо прот еазы

I II III

Молекулярная масса (кО) 40.0 33.0 29.5

Изоточка (р1) 9.50 8.50 7.35

Оптимум действия (рН) 8.2 7.8 7.2

Гидролиз казеина (желатина) + + +

Гидролиз эластина - - +

Гемолиз эритроцитов м.свинки + + +

Гемолиз эритроцитов барана + - +

Гидролиз гемоглобина + - +

Дермонекроз для м.свинки + - +

Токсичность для б.мышей - - +

Вместе с тем протеаза И, в отличие от протеаз I и III, не лизировала эритроциты барана и не гидролизовала гемоглобин (табл.2). Дальнейшее изучение биологических свойств экзопротеаз показало, что протеазы I и III (2 - 4 мкг) обладают дермонекротической активностью на модели морской свинки. Инокуляция протеазы II приводила только к гиперемии и отеку кожи животного. Протеаза III отличалась от других ферментов токсичностью для белых мышей. Введение им 100 мкг эластазы вызывало гибель 50%, а 200 мкг - 80% животных. Экзопро-теазы возбудителя мелиоидоза обладали заметными иммуногенными свойствами при однократной иммунизации белых мышей за 14 суг до заражения их клетками гомологичного штамма, увеличивая выживаемость животных в 2,5 - 4,0 раза. Протективный эффект отмечен при иммунизации протеазами I и III. При этом средняя продолжительность жизни опытных животных возростала, соответственно, на 36,1

и 66,1%. Полученные результаты позволяют выделить экзопротеазы возбудителя мелиоидоза как один из факторов патогенности этого микроорганизма. Представляется перспективным дальнейшее изучение протеаз в качестве протективных антигенов.

Для оценки значимости Агб и Аг8 в реализации вирулентных и патогенных свойств нами проведен цикл исследований, направленных на селекцию антигенных вариантов Р.рзешЗотаПеь дефектных по этим антигенам. Селекционная работа, проведенная с использованием жидкой питательной среды с Иг к Агб, позволила получить набор субкультур, не синтезирующих Агб. Однако большинство из них проявили нестабильность признака дефектности и реверсировали к исходному фенотипу. В связи с этим, получить достоверных различий по

Рис.3. Вирулентность Р.р$еис1ота11е1 для золотистых хомячков в ЬОзд.

Примечания: Мутант - варианты , дефектные поАг8; 100, 111,114-но-мера штаммов.

уровню вирулентности не удалось. Тем не менее, отмечено укорочение более чем в 2 раза сроков жизни белых мышей, зараженных вариантами с резко сниженной продукцией Агб, в сравнении с контрольной группой животных. Это в определенной мере согласуется с нашими данными о повышении вирулентности возбудителя мелиоидоза при пассировании его на белых мышах, приводящей к редукциин Агб (Петере с соавт., 1983). Изучение вирулентности стабильных вариантов возбудителя мелиоидоза, дефектных по Аг8, выявило ее снижение.

Для золотистых хомячков показатель ЬБ» увеличился в зависимости от используемых мутантов в диапазоне от 15 до 20 ООО раз по сравнению с контрольной группой животных. При этом отмечено значительное удлинение продолжительности их жизни (6-15 раз) (рис.3). Для белых мышей антигенные варианты оказались авирулентными при дозе заражения 1х107м.к. Единичные случаи реверсии субкультур к исходному фенотипу сопровождались полным восстановлением их исходных вирулентных свойств. У дефектных по Аг8 вариантов Р.ша11е1, полученных аналогично Р.рБеиёошаНе!, также установлена их авирулентность для золотистых хомячков. Введение им дозы 1х107м.к. не приводило к гибели животных, причем исходная вирулентность сапного штамма находилась на уровне ЬЭзо 2x105 м.к.

Учитывая значимость указанных антигенных комплексов, были предприняты исследования, направленные на установление локализации Агб и Аг8 в микробной клетке. Электронноиммуноцитохи-мическими исследованиями было установлено, что Агб расположен непосредственно на наружной мембране клеточной стенки Р.рзеис!ота11е1. Антиген 8 входит в состав мощного диффузного кап-сулоподобного образования клеток возбудителя мелиоидоза. Полученные результаты позволяют определить Агб и Аг8 как поверхностные структуры микробной клетки.

Исходя из данных, что Аг8 является составной частью капсуло-подобного образования, нами была предпринята попытка доказательства возможного участия этого антигенного комплекса в адгезии клеток Р.рзеис1ота11е1 и Р.таПек Проведенные исследования адгезивных свойств возбудителей мелиоидоза и сапа на модели нативных эритроцитов золотистых хомячков, белых мышей, морских свинок, кроликов и человека не установили специфической рецепции. Причем отсутствие адгезии было присуще как диким, так и дефектным по Аг8 культурам Р.р5еис1ота11е1 и Р.таПек Вместе с тем, эритроциты белых крыс проявляли способность агглютинироваться клетками антигенных вариантов Р.рзеис1ота11е1 с нарушенным синтезом Аг8. Возможно, что отмеченная адгезия обусловлена фимбриальными образованиями микробной клетки, которые "обнажились" при нарушении синтеза поверхностного Аг8. С помощью меченных радионуклидами клеток возбудителей мелиоидоза и сапа были изучены их адгезивные свойства на модели трахеального эпителия золотистых хомячков, белых мышей и морских свинок. Было показано, что Р.рБеисЬтаНе! обладает более выраженной специфической адгезией по сравнению с Р.таПек Предварительная обработка трахеи углеводами, соляной кислотой, периодатом натрия, фосфолипазой С и нейраминидазой позволила предположить, что мишенью-рецептором эпителия трахеи лаборатор- . ных животных, чувствительных к мелиоидозу, является субстрат углеводной природы (рис.4). Сравнительное изучение адгезивных свойств диких штаммов Р.рзеис1ота11е1 и их антигенных вариантов,

дефектных по Аг8, не позволило выявить достоверно значимых различий между ними. По-видимому, ответственными компонентами за проявление адгезивных свойств возбудителя мелноидоза, кроме фим-брий, являются поверхностные капсулоподобные структуры, обладающие гидрофобными свойствами. У P.mallei адгезивная функция менее выражена, что обусловлено, вероятно, другим типом адгезии этого микроорганизма.

-1-1-г-

Аг8 Глюкоза HCL Трипсин Периодат Нейрамин

Рис.4. Адгезия P.pseudomallei на трахеальном эпителии, обработанном некоторыми веществами.

Учитывая, что Аг8 является поверхностным гликопротеном, было исследовано влияние его на фагоцитабелыюсть P.pseudomallei. Изучение процесса фагоцитоза in vitro на перитонеальных макрофагах лабораторных животных (золотистый хомячок, белая мышь, морская свинка) выявило различия во взаимодействии с исходными и дефектными по Аг8 клетками. У вирулентных штаммов наблюдалось интенсивное размножение возбудителя внутри фагоцитов, что уже через 3 - 5 ч приводило к частичной, а через 24 ч к полной деструкции макрофагов. В отличие от типичных штаммов, их антигенные варианты с нарушенным синтезом Аг8 активно переваривались внутри макрофагов и не вызывали деструктивных изменений фагоцитов в течение срока наблюдения (24 ч) (рис.5 ). Разница по фагоцитабель-ности была выше у мутантных клеток, особенно она значительна после 5 ч инкубации. Внесение в реакционную смесь Иг к Аг8 приводило к специфической опсонизации, проявляющейся в повышенной способности макрофагов поглощать клетки. Следует отме-

тить, что значение фагоцитарного индекса для возбудителя сапа значительно ниже в сравнении с возбудителем мелиоидоза, однако

Г 30 -25

I 2

Время (час)

Рис.5. Фагоцитабельность Р.рзеис1ота11еь

разница в фагоцитабельности исходных и дефектных клеток Р.ша11е1 не меньшая, чем для Р.рзеиёошаНе!. Опсонизация Иг к Аг8 в этом случае приводила к резкому подъему поглощения макрофагами как диких, так и мутантных клеток, что, вероятно, связано с разницей в антигенной организации изучаемых штаммов. Необходимо подчеркнуть, что внесение в реакционную смесь Аг8 в концентрации 10 мкг/мл оказывала также антифагоцнтарное действие. Возбудитель сапа имеет не только сниженное количество Аг8, но и, по-видимому, модифицированные поверхностные антигены, вследствие чего разница в опсонизи-рующем эффекте дикого штамма и его авирулентных вариантов незначительна.

Несмотря на то, что Аг8 является одним из ключевых факторов патогенности, предпринятое впоследствии изучение его иммуногенных свойств показало практически полное отсутствие специфической защиты чувствительных к мелиоидозу лабораторных животных при заражении их вирулентными штаммами Р.р5еис1ота11е1. Вышеизложенное побудило нас к изучению структурных и функциональных особенностей этого значимого в патогенезе мелиоидоза и сапа сложного биомолекулярного комплекса. Методом ЯМР-спектроскопии было

установлено, что полисахаридная часть Аг8 представляет собой гомо-полимер, состоящий из ацетилнрованной 6-дезокси-Д-манногептозы. Первичная характеристика структурных компонентов белковой природы с применением ДНХ и ДСН при 100" С позволила выявить в Аг8 ряд мономерных белков с м.м. от 12 до 120 к О. Электрофоретическое исследование Аг8 в ДСН-ПААГе с последующей дифференциальной . окраской геля показало наличие высокомолекулярного глнкопротеина массой 200 кЭ и ряда белков с м.м. в диапазоне 25 - 60 кО. Иммуно-аиализ Аг8, проведенный при помощи иммуноблотинга с использованием МКА и поликлональных адсорбированных Иг к Аг8, позволил установить, что МКА взаимодействовали только с гликопротеином 200 кО, а адсорбированные Иг, кроме того, выявляли антигенные комплексы с м.м. 25 и 34 кО. Причем антигенный эпитоп, взаимодействующий с МКА, выявлен в углеводной части гликопротеина 200 кЭ. Приведенные результаты исследований позволяют рассматривать Аг8 как гетерогенный химический комплекс, углеводная часть которого представлена гомополимером 6-дезокси-Д-манногептозы. Белковый компонент этого биополимера включает в себя набор белков с м.м. от 12 до 120 кО. Последние с углеводсодержащими компонентами формируют антигенные структуры, входящие в состав Аг8: гликопротеин 200 кО и протеины с м.м. 25 и 34 кО.

В связи с вышеизложенным, для оценки иммуногенности Аг8 был подвергнут фракционированию на отдельные составляющие при помощи ГХ и ИОХ. В результате было получено пять фракций Аг8: А,В,С,0,Е, характеризующихся различной молекулярной массой, электрическим зарядом и весовым соотношением углеводов и белков. Из фракции А гидролизом в 0,005М ЫаОН и последующей хроматографией были получены фракции А| и Аг. Результаты изучения иммуногенности фракций А, В, С и О Аг8 на белых мышах показали, что две из них (А и О) обладали выраженным протективным эффектом. Так, двукратная иммунизация антигенами (20 мкг) с неполным адъ-ювантом Фрейнда сопровождалась выживанием 90% (фракция А) и 40% (фракция О) животных при заражении их 30 ЬОм Р.р5еис1ота11е1 100. В случае применения фракций В и С отмечалась 100% гибель белых мышей. Исследование протективных свойств фракций Аг8 было продолжено на белых крысах, как более резистентных к мелиоидозу. Иммунизация в дозе 100 мкг двукратно с неполным адьювантом Фрейнда и последующим заражением 13 ЬО^ Р.р5еис1ота11е1 100 показала, что наибольшим протективным эффектом обладали фракции А, О и Е. Максимальный процент выживших животных составил 66.7, а увеличение срока средней продолжительности жизни - 70.6% (рис.6). Фракции В, С, А] и А2, содержащие в своем составе гликопротеин 200 кО, не защищали в должной мере белых крыс от заражения возбудителем мелиоидоза. Наиболее иммуногенные фракции О и Е характеризовались значительным содержанием белкового антигена с молеку-

лярной массой 34 кЭ и крупного биополимера в зоне старта, а также отсутствием гликопротеина 200 кО. Обращает на себя внимание тот факт, что протеин 34 кО обнаруживался во всех фракциях, а антиген 30 кО только во фракции А. Иммуногенный эффект фракций А и О был также получен на морских свинках. При заражении их дозой 100 ЬОм Р.рзеис1ота11е1 100 выжило, соответственно, 60 и 50% животных. Данные по протективносги отдельных фрагментов Аг8 были также

Рис. 6. Иммуногенность фракций Аг8 для белых крыс.

получены и на модели сапной инфекции. Иммунизация золотистых хомячков фракциями Би Ее последующим заражением их Р.ша11е1 Ц5 (100 ЬЭз«) защищала 40 - 50% взятых в опыт животных.

В заключение необходимо отметить, что проведенные исследования позволили осветить ряд вопросов, касающихся антигенной организации Р.рБеийошаНе! и Р.ша11е1, серологической дифференциации этих возбудителей и некоторых условнопатогенных псевдомонад, а также эффективной иммунодиагностики мелиоидозной и сапной инфекций. Определено значение основных экстрацеллюлярных и поверхностных биополимеров в патогенезе мелиоидоза и сапа. Выделены и очищены отдельные антигенные структуры, обусловливающие вирулентные свойства Р.р$еис1ота11е1 и Р.таМ, изучены их структурные особенности и функциональная значимость. Установлена выраженная иммуногенность некоторых поверхностных биополимеров Р.р$еис1ота11е1, представляющихся перспективными для создания эффективных средств специфической профилактики мелиоидоза и сапа.

ВЫВОДЫ

1. Выявлены видовые и перекрестнореагирующие антигены патогенных и условнопатогенных псевдомонад. Показана их антигенная взаимосвязь и перспектива создания на основе видовых антигенов средств серологической идентификации P.pseudomallei, P.mallei, P.aeruginosa, P.fluorescens, P.cepacia, P.stutzeri. Предложена схема антигенной структуры возбудителя мелиоидоза.

2. Разработана оптимальная технология выделения и очистки отдельных антигенных комплексов возбудителя мелиоидоза, имеющих значение в иммунодиагностике и патогенности P.pseudomallei и P.mallei. Получены, очищены и изучены Агб и Аг8. комплексный препарат Агб+d, а также три экзопротеазы: протеаза I с pi 9.50, проте-аза II cpl 8.50 и протеаза III (эластаза) с pi 7.35.

3. Показано, что лучшим сырьем для конструирования эффективных мелиоидозных и сапных иммуноглобулиновых диагностикумов являются иммунные сыворотки к фракции ультразвуковых дезинтегра-тов клеток P.pseudomallei и P.mallei, полученной при 50% насыщении сульфатом аммония. Данный препарат содержит в своем составе семь антигенных комплексов, из которых три - Ar6,Ar8,Ard, являются ведущими при идентификации этих микроорганизмов.

4. Установлено, что синтез специфических иммуноглобулинов лабораторных животных, зараженных возбудителем мелиоидоза, происходит преимущественно на Агб и Ard. Разработанные на основе этих антигенов суспензионные диагностикумы выявляли мелиои-дозные и сапные иммуноглобулины у большинства инфицированных животных (90%) в титрах 1:160 - 1: 2 400 в отличие от экспериментально-производственных препаратов, которые только в 60% случаев обнаруживали антитела в титрах 1:10 - 1:20. РИА был более эффективным в сравнении с РИГА, ТИФА и позволял надежно детектировать специфические иммуноглобулины в 90,6% случаев.

5. Использование комплексного антигенного препарата P.pseudomallei, включающего в себя Ar2,3,6,d,gj, в качестве мелиои-дозного аллергена обеспечивало надежную детекцию иммунной перестройки клеточного звена иммунитета у инфицированных P.pseudomallei и P.mallei лабораторных животных. По эффективности предложенный мелиоидозный аллерген (90 - 95%) значительно превышал коммерческий маллеин (25 - 40%) и отличался отсутствием токсического и дермонекротического действия.

6. Экзопротеазы возбудителя мелиоидоза характеризовались вы-

раженной гидролитической активностью по отношению к казеину, альбумину, желатину, гемоглобину. Протеазы I и II оказались нетоксичными, однако первая из них обладала дермонекротическим действием и заметным протектнвным эффектом. Протеаза III отличалась эластазной активностью, токсичностью, дермонекротическим эффектом и проявляла протективные свойства.

7. Доказана поверхностная локализация Агб и Аг8 в клетках P.pseudomallei. Агб обнаруживается на наружной мембране клеточной стенки и представляет собой гликолипопротеин с молекулярной массой 500 kD. Аг8 входит в состав капсулоподобного образования микробной клетки и по химической природе является гликопро-теином с молекулярной массой 800 kD.

8. Выявлено, что элиминация Агб из клетки приводит к определенному повышению вирулентности P.pseudomallei. Наличие или отсутствие этого биополимера является важным признаком в разграничении штаммов возбудителя мелиоидоза на азиатский и австралийский серовары и может использоваться в качестве эпидемиологического маркера.

9. Возбудитель мелиоидоза обладает специфической адгезией к трахеальному эпителию чувствительных к мелиоидозу лабораторных животных, в то время как у возбудителя сапа это свойство выражено слабо. Адгезия типичных штаммов P.pseudomallei обусловлена, вероятно, не столько фимбриями, сколько взаимодействием внеклеточного материала с рецепторами клеток-мишеней углеводной природы.

10. Установлено, что одним из ведущих факторов вирулентности возудителей мелиоидоза и сапа является Аг8, патогенное действие которого обусловлено его выраженным антифагоцитарным действием. Выявлена химическая гетерогенность Аг8, в его структуре обнаружены гомополимер б-дезокси-О-манногептозы и группа мономерных белков с молекулярными массами от 12 до 120 kD.

11. Иммунизация лабораторных животных отдельными фракциями Аг8, содержащими в своем составе белковые антигены с молекулярными массами 30 и 34 kD, с последующим их заражением высоковирулентными штаммами P.pseudomallei и P.mallei, позволила достичь выраженного протективного эффекта, сопровождающегося выживанием животных в 40 - 90% случаев.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. Пивень H.H., Илюхин В.И. Иммунохимический анализ термостабильных антигенов морфологических вариантов возбудителя ме-лиоидоза//Пробл. особо опасных инф,- Саратов,- 1979,- Вып.5,-С.60-63.

2. Пивень H.H. Молекулярно-весовые характеристики термостабильного антигенного комплекса возбудителя мелиоидоза//Пробл. особо опасных инф.- Саратов.- 1979,- Вып.5.- С.64-66.

3. Пивень H.H., Илюхин В.И. Антигенный спектр возбудителя мелиоидоза в иммуноэлектрофорезе//В кн.: Особо опасные и редко встречающиеся тропические инфекции:Тез. докл.- Волгоград.- 1980.-С.56-57.

4. Пивень H.H., Илюхин В.И. Антигенная структура возбудителя мелиоидоза//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.- 1981. - N 4. - С.78-82.

5. Илюхин В.И., Поповцева Л.Д., Пивень H.H. Идентификация возбудителя мелиоидоза//Лабор. дело.-1983,- N 7.- С.61-62.

6. Петере М.К., Пивень H.H., Илюхин В.И., Барков A.M. Характер изменений антигенного спектра возбудителя мелиоидоза при пассировании на животных//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол,-1983,-N 8,-С.47-49.

7. Поповцева Л.Д., Пивень H.H. Применение методов молекулярной биологии в таксономии патогенных псевдомонад// В кн.: Молекул. биология, генетика и иммунология возбудителей ООИ: Тез. докл. Всесоюзной конф,- Ростов-на-Дону,- 1984,- С.50-52.

8. Пивень H.H., Илюхин В.И., Поповцева Л.Д. Способ получения мелиоидозной преципитирующей сыворотки'7/Авторское свидетельство N 1218526 от I5.II.85r.

9. Пивень H.H., Илюхин В.И., Антонов Ю.В., Яковлев А.Т. Иммунологические аспекты диагностики мелиоидоза//В кн.: Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инф.: Тез. докл. Всесоюзной конф,- Ставрополь,- 1986,- Ч. II,- С.31-33.

10. Замарин А.Е., Медведев О.Ю., Пивень H.H. Возможность

использования преципитирующих сывороток для идентификации близкородственных псевдомонад//В кн.: Актуальные вопросы экспериментальной клинич. и профилакт. медицины: Тез. докл. облает, конф. молод, ученых и врачей.- Волгоград.- 1987,- С.20.

11. Мельников Б.И., Пивень H.H., Яковлев А.Т. и др. К вопросу о выделении возбудителя сапа от монгольской лошади на Улан-Удэнском мясокомбинате//В кн.: Вопросы противоэпидемической защиты." Москва,- 1987,- НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи,- Вып.ЗЗ,- С.49-54.

12. Пивень H.H. Перспективы исследований общих, перекрест-нореагирующих и видовых антигенов у некоторых видов бактерий рода Р5еи0ошопаз//Микробиол. журн.- 1987,- N 3.- С.6-10.

13. Пивень H.H., Илюхин В.И., Рыбкин B.C. Поиск основных антигенных комплексов, перспективных для создания средств серологической диагностики сапа и мелиоидоза//В кн.: Вопросы противоэпидемической защиты,- Москва,- 1987,- НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи.-Вып.ЗЗ,- С.39-40.

14. Манолов А.Д., Лопаткин О.Н., Высочинская H.H., Пивень H.H. и др.//Авторское свидетельство N 286000 от 01.12.88.

15. Замарин А.Е., Пивень H.H., Мананков В.В. Поиск оптимального набора антигенов возбудителей сапа и мелиоидоза, пригодных для получения высокоэффективных группоспецифических антисыворо-ток//В кн.: Сборник научных работ,- Волгоград.- 1989.- Вып.4,-С.230-233.

16. Мананков В.В., Манолов А.Д., Волков Е.А., Высочинская H.H., Жаркова С.Ф., Пивень H.H. и др. Сравнительное изучение специфической активности полигрупповых и моносывороток в процессе иммунизации животных антигенами возбудителей чумы, сапа, мелиоидоза, туляремии и бруцеллеза//В кн.: Актуальные вопросы эпиде-миол., профилакт. и диагност. ООИ: Тез. докл. итоговой научн. конф.- Ставрополь,- 1989,- Ч.1.- С.175-177.

17. Меринова Л.К., Пивень H.H., Замараев B.C. и др. Получение маркированных штаммов возбудителя мелиоидоза и сапа//В кн.: Сборник научных работ,- Волгоград,- 1989,- Вып.4,-С.57-62.

18. Новицкая И.В., Тихонов Н.Г., Храпова Н.Г., Пивень H.H. и др. Оценка возможности применения мышиных моноклональных антител с целью серопрофилактики и серотерапии экспериментального мелиоидоза//В кн.: Особо опасн.инф. заболев.: иммунология, генетика

и биологические свойства возбудителей.- Волгоград,- 1989.- Вып.5,-С.154-163.

19. Пивеиь H.H., Подзолкова Г.Г., Закревский В.И. и др. Оптимизация условий накопления и детекции внеклеточных протеаз возбудителя мелиоидоза//В. кн.: Сборник научных работ,- Волго-

1 град.- 1989,- Вып.4,- С.106-110.

20.Пивень11.H., Смирнова В.И. Выделение, очистка и химический состав поверхностного полисахаридного антигенного комплекса возбудителя мелиоидоза//В кн: Сборник научных работ.- Волгоград.- 1989,- Вып.4,- С.111-117.

21. Замарин А.Е., Ливень H.H. Способ получения мелиоидозного аллергена//Авторское свидетельство N 1621229 от 15.09.90.

22. Лихолетов С.М., Дурихина Е.К., Сорокин В.Ю., Пивень H.H. // Авторское свидетельство N 310869 от 02.04.90.

23. Пивень H.H., Подзолкова Г.Г., Закревский В.И. и др. Проте-азы патогенных псевдомонад: выделение и очистка//В кн.: Тез. докл. VI Всероссиского съезда микробиол., эпидемиол. и паразитол.- Нижний Новгород.- 1991,-Т.Н.-С.122-123.

24. Пивень H.H., Смирнова В.И., Каплиев В.И. и др. Поверхностный гликопротеиновый антиген 8, как один из факторов пато-генности возбудителя мелиоидозаУ/В кн.: Тез. докл. VI Всероссиского съезда микробиол., эпидемиол. и паразитол,- Нижний Новгород.-1991,- T.II.-C. 194-195.

25. Пивеиь H.H., Смирнова В.И., Каплиев В.И. и др. Роль поверхностных антигенов Pseudomonas pseudomallei в патогенезе мелио-идоза//Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.- 1991,- N 10,- С.8-12.

26. Викторов Д.В., Пивень H.H., Смирнова В.И. Анализ состава термостабильного антигена 8 Pseudomonas pseudomallei методом им-муноблотинга//В кн.: Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций.- Волгоград.- 1992.-С.82.

27. Вязьмина Т.Н., Тихонов Н.Г., Лесовой B.C., Пивень H.H., Фарбер С.М. Патоморфология экспериментального мелиоидоза в зависимости от антигенного строения возбудителя//В кн.: Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций.- Волгоград,- 1992,-С.84.

28. Каплиев В.И., Замараев B.C., Пивень H.H. Адгезивные свойства возбудителя мелиоидоза//В кн.: Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций,-Волгоград.-1992.-С.86.

29. Каплпев В.И., Пивень H.H., Храпова Н.П. Непрямой нмму-нопероксидазный метод определения локализации антигенов возбудителя мелиоидоза на ультраструктурном уровне с помощью монокло-нальных антител//Микробиол. журн,- 1992,- N 1.- С.68-71.

30. Пивень H.H., Замарин А.Е. Способ получения мелиоидозного ' антигенного комплекса//Авторское свидетельство N 1741323 от

15.02.92г.

31. Пивень H.H., Ларионов Г.М., Ямщиков С.Н. и др. Селекция антигенных вариантов возбудителя мелиоидоза и определение их ви-рулентности//В кн.: Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций,- Волгоград.- 1992.-C.114.

32. Пивень H.H., Смирнова В.И., Подзолкова Г.Г., Васильев В.П. Некоторые иммунобиологические свойства антигена 8 Pseudomonas pseudomallei//B кн.: Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций.- Волгоград,- 1992.-С.115.

33. Плеханова Н.Г., Викторов Д.В., Пивень H.H., Нарбутович Н.И. Некоторые свойства экзопротеаз возбудителя мелиоидоза//В кн.: Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций,- Волгоград,- 1992,- С.117.

34. Смирнова В.И., Храпова Н.П., Пивень H.H. и др. Выделение поверхностных антигенов Pseudomonas pseudomallei методом аффинной хроматографии с использованием моноклональных антител//В кн.: Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций,- Волгоград.- 1992,-С.129.

35. Замарин А.Е., Илюхин В.И., Пивень H.H., Яковлев А.Т. Перспективы конструирования препаратов для иммунодиагностики ме-лиоидоза//В кн.: Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезней.-Ставрополь,- 1993,- С.203-204.

36. Смирнова В.И., Викторов Д.В., Пивень H.H. и др. Гетерогенность структуры антигена 8 возбудителя мелиоидоза//В кн.: Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций,- Саратов,- 1993,- С.122-123.

37. Коваленко A.A., Ливень H.H., Смирнова В.И. Изучение функциональной активности перитонеальных макрофагов белых мышей к отдельным фракциям антигена 8 возбудителя мелиоидо-за//Информацион. бюллетень,- Саратов.- 1994.- Вып.З,- С.38.

38. Новицкая И.В., Рыбкин B.C., Фарбер С.М., Пивень H.H. Поли- и моноклональные антитела в качестве средств специфической профилактики мелиондозной инфекцин//В кн.: Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний.- Ставрополь,-1994,-С.231.

39. Пивень H.H., Манолов А.Д., Зыкин Л.Ф. и др. Иммунодиагностика мелиоидоза при помощи твердофазного варианта радиоим-мунолоческого анализа (РИА)//Журн., эпидемиол., микробиол., иммунобиол,- 1994,- N 3,- С.69-73.

40. Плеханова Н.Г., Коваленко A.A., Пивень H.H. и др. Выявление экзопротеаз возбудителя мелиоидоза методами РИГА и ТИ-ФА//Информацион. бюллетень,- Саратов,- 1994,- Вып.З,- С.34.

41. Плеханова Н.Г., Пивень H.H., Смирнова В.И., Викторов Д.В. Разработка способа выделения и очистки экзопротеаз возбудителя ме-лиоидоза//Информацион. бюллетень.-Саратов,- 1994,-С.39.

42. Смирнова В.И., Коваленко A.A., Пивень H.H. и др. Использование РНГА, ТИФА и латексагглютинации для детекции антигенов возбудителя мелиоидоза//Информацион. бюллетень,-Саратов,- 1994,-Вып.З,- С.34-35.

43. Смирнова В.И., Коваленко A.A., Пивень H.H. и др. Выявление антигена 8 возбудителя мелиоидоза в РНГА и ТИ-ФА//Матер.конф. Военно-медицинской академии.- Санкт-Петербург,- 1994.-С.133.

44. Смирнова В.И., Пивень H.H., Плеханова Н.Г., Подзолкова Г.Г. Оптимизация технологии получения антигена 8 возбудителя ме-лиоидоза//Информацион. бюллетень,- Саратов.- 1994.-С.33-34.

45. Храпова Н.П., Смирнова В.И., Пивень H.H., Прохватилова Е.В. Способ выделения Аг8 возбудителя мелиоидоза//Патент на изобретение N 2004251, март ¡994.

46. Храпова Н.П., Смирнова В.И., Пивень H.H., Прохватилова Е.В. Способ выделения Агб возбудителя мелиондоза//Патент на изоб-

ретение N 2004250, март 1994.

47. Викторов Д.В., Будченко A.A., Пивень H.H., Илюхин В.И. Сравнительное изучение белковых спектров возбудителей мелиоидоза и сапа с использованием компьютерного аналнза//Информацион. бюллетень,- Саратов,- 1995.- Вып.4.- С.66.

48. Плеханова Н.Г., Пивень H.H., Илюхин В.И. и др. Получение и использование латексных иммуноглобулиновых диагностикумов для идентификации некоторых патогенных псевдомонад//Информацион. бюллетень,- Саратов,- 1?95,- Вып.4.-С,22.

49. Пивень H.H., Смирнова В.И., Викторов Д.В. и др. Иммуно-генность и гетерогенность поверхностного антигена 8 Pseudomonas pseudomalleiy/Журн., микробиол., эпидемиол., иммунобиол.- 1996.- N 4.- С.75-78.

50. Плеханова Н.Г., Пивень H.H., Илюхин В.И. и др. Разработка иммунодиагностических средств идентификации и дифференциации клинически значимых псевдомонад//Вкн. Эколого-эпидемиологичес-кий надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикас-пии.- Астрахань.- 1996,-С. 125-127.