Особенности экспериментального легочного мелиоидоза, вызванного штаммами Burkholderia pseudomallei с различным антигенным составом

Перепелицына, Светлана Валерьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Особенности экспериментального легочного мелиоидоза, вызванного штаммами Burkholderia pseudomallei с различным антигенным составом
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Особенности экспериментального легочного мелиоидоза, вызванного штаммами Burkholderia pseudomallei с различным антигенным составом"

00347011Ь На правах рукописи

ПЕРЕПЕЛИЦЫНА Светлана Валерьевна

ОСОБЕШЮСТИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЛЕГОЧНОГО МЕЛИОИДОЗА, ВЫЗВАННОГО ШТАММАМИ ВиЯКНОЬОЕША Р$Е1!ООМАЫЕ1 С РАЗЛИЧНЫМ АНТИГЕННЫМ СОСТАВОМ

03.00.07 - микробиология

- 1 ОКТ 2009

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации из соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Волгоград-2009

003478116

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор

Алексеев Владимир Валерьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Швидепко Инна Григорьевна

Ведущая организация:

ФГУ «№48 Центральный научно-исследовательский институт Минобороны России»

Защита диссертации состоится 28 октября 2009 г. в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

доктор медицинских наук, профессор Девдариани Зураб Лсванович

Автореферат разослан «_.. сентября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

А.А.Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Всемирная организация здравохранения (ВОЗ) прогнозирует увеличение заболеваемости мелиоидозом и связывает это, в частности, с увеличением посещаемости эндемичных по инфекции областей [Wilson D.R. et al., 1993]

Мелиоидоз отличается многообразием клинических проявлений, поэтому даже в эндемичных регионах первичный диагноз редко бывает верным. Легочная форма этого заболевания занимает особое место, так как характеризуется тяжелым течением и высокой летальностью. Не исключено, что больные с мелиоидозной пневмонией, интенсивно выделяющие инфект в окружающую среду, представляют эпидемическую опасность [Borgherini G. et al., 2006; Currie B.J. et al., 2000; Puthucheary S.D. et al., 2001].

О том, что органы дыхания могут являться первичными воротами инфекции при мелиоидозе в естественных условиях, накоплено достаточно фактов. Указанный механизм заражения рассматривают как равнозначный или второй по значению после чрескожного. Вероятно, этим можно объяснить тот факт, что в странах Юго-Восточной Азии легочный мелиоидоз - наиболее распространенная форма заболевания, хотя чаще всего путь инфицирования остается неустановленным [Christenson В. et al., 2003; Elliott J.H. et al., 2005; LeeS.W. etal., 2005].

Вторая возможная причина появления больных с легочной формой ме-лиоидоза - аварийные ситуации в специализированных учреждениях научного или иного профиля, осуществляющих работу с возбудителем. По различным оценкам, причиной 65-80 % случаев внутрилабораторного заражения являются аэрогенные инфекции, вызванные соответствующими возбудителями, в том числе BurkhoUeria pseudomallei и Burkholderia mallei [Leelarasamee A., 1998; Pospisil L., 2000]. В таких случаях неизбежно появление больных с легочными формами инфекции, сопровождающимися, как правило, тяжелой клинической картиной.

И, наконец, третий аспект проблемы - преднамеренное создание бактериального аэрозоля. Возбудитель мелиоидоза по многим свойствам отвечает требованиям, предъявляемым к вероятным биологическим поражающим агентам (БПА) [Guilhot A. et al., 2005; Keluangkhot V. et al., 2005; Warawa J. et al., 2002; Wittig M.B. et al., 2006].

Указанные обстоятельства объясняют необходимость разработки средств защиты от легочного мелиоидоза, которые, как известно, должны базироваться на знании особенностей механизма развития заболевания. Эти вопросы в определенной степени решены для инфекции, вызванной типичными по антигенному составу штаммами возбудителя мелиоидоза, однако, не изучены при использовании для заражения микроба с измененной антигенной структурой. Ранее было установлено, что утрата возбудителем мелиоидоза одного из признаков, детерминирующего натогенность - поверхностного биомолекулярного комплекса, обозначенного как антиген 8 (Аг8) [Пивень H.H., Илюхин В.И., 2000], с которым связывают антифагопитарную активность микроба, приводит к авирулентности возбудителя для относительно резистентных к мелиоидозу белых мышей и крыс при парентеральных способах инфицирования [Алексеев В.В., 2001]. Однако, при аэрогенном заражении Аг8" вариантами микроба, данные экспериментальные модели проявляли чувствительность к инфекции, что определило целесообразность проведения дальнейших исследований особенностей развития и протекания инфекционных процессов, вызванных атипичными формами микроба [Алексеев В.В., 2000; Алексеев В.В., 2002]. Исследования такого рода, по нашему мнению, представляют как теоретический интерес в плане оценки патогенетической роли отдельных факторов вирулентности микроба и исследования механизмов адаптации микробных клеток атипичных штаммов в условиях макроорганизма, так и имеют важное практическое значение, поскольку могут дать сведения, необходимые для дальнейшего совершенствования тактики защитных мероприятий, в том числе схемы лабораторной диагностики заболевания.

Цель работы - изучение особенностей течения экспериментального легочного мелиоидоза при аэрогенном заражении штаммами Burkholderia pseadomallei с различным антигенным составом. Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель легочного мелиоидоза на белых крысах при аэрозольном заражении штаммом В. pseudomallei, дефектным по синтезу Аг8.

лиоидоза у белых крыс при аэрогенном заражении дефектным по Аг8 штаммом В. рэеийотЫЫ.

3. Провести сравнительный анализ продукции внеклеточных гидролаз типичными и атипичными штаммами В. раеш1ота11е1 на различных стадиях инфекционных процессов у экспериментальных животных, зараженных подкожным и аэрогенным методами.

4. Исследовать вариабельность антигенного состава типичных и атипичных штаммов В. рзеис1ота1Ш, изолированных от животных с различным клиническим течением и на отдельных стадиях заболевания.

5. Оценить эффективность имеющихся средств иммунодиагностики для исследования проб биологического материала от животных, экспериментально инфицированных типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.

Научная новизна

В ходе выполнения диссертационной работы получены новые сведения о механизмах развития легочного мелиоидоза белых крыс, вызванного штаммами возбудителя с различной антигенной структурой: охарактеризованы па-толого-анатомические и патоморфологические изменения макроорганизма при инфекционном процессе, исследованы особенности диссеминации атипичного штамма возбудителя мелиоидоза в ходе экспериментальной инфекции, изучены особенности взаимодействия микроба с клетками системы мо-нонуклеарных фагоцитов в легких экспериментальных животных.

Получены новые сведения об особенностях экспрессии генов цитоки-нового ответа клеток иммунной системы экспериментальных животных в ходе инфекционного процесса, вызванного штаммами В. рзеис1ота1Ш различной вирулентности и Burk.hold.eria Йа/'/алЛяда.

Показано значение секретируемых микробом гидролаз различной субстратной специфичности в развитии экспериментальной аэрогенной инфекции, вызванной штаммом В. рзеи<1ота1Ы с атипичной антигенной структурой.

Показаны различия в качественном и количественном составе отдельных антигенных комплексов возбудителя (Аг8, белки внешней мембраны) в ходе инфекционного процесса, вызванного штаммами В. рзеийотаНег различной вирулентности.

По материалам проведенных исследований получен патент на изобретение № 2257413 «Штамм бактерий В. thailandensis КМ-161 - авирулентный имитатор возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован 27.07.2005 г.). Практическая значимость

1. Определены технические и биологические условия воспроизведения на белых крысах легочного мелиоидоза в острой форме с атипичным течением и доброкачественным исходом заболевания. Экспериментальные модели могут быть использованы для решения различных вопросов биологии возбудителя и проблем прикладного характера, связанных с разработкой средств специфической профилактики и совершенствованием лабораторной диагностики. Материалы исследования составили основу «Методических рекомендаций по экспериментальному моделированию легочного мелиоидоза, вызванного атипичным штаммом Pseudomonas pseudomalki» (утверждены директором Волгоградского НЙП-ЧИ 23.12.2001)

2. Установлено, что утрата мелиоидозным микробом способности синтезировать Аг8 не приводит к полной потере возбудителем вирулентности при аэрогенном способе инфицирования, а развитие заболевания, вызванного атипичными вариантами возбудителя, определяют продуцируемые микробом экзофсрмситы. Выявленные особенности течения заболевания могут явиться основой для коррекции тактики диагностических и профилактических мероприятий при легочной форме мелиоидоза.

3. Показана эффективность тест-системы иммуноферментной для обнаружения антигенов мелиоидоза, разработанной в Волгоградском научно-исследовательском институте, для исследования проб биологического материала от животных, экспериментально инфицированных типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.

4. Совокупность полученных результатов может быть использована для планирования дальнейших исследований по изучению патогенетической роли отдельных биополимеров возбудителя мелиоидоза.

5. Материалы исследования вошли в «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму» (Волгоград, 2004 г.).

Положения, выносимые на защиту

1. Разработанная экспериментальная модель легочного мелиоидоза белых крыс с использованием аэрозоля штамма В. pseudomallei 100-16-1, дефектного по синтезу Аг8, позволяет исследовать особенности течения мелиоидозной инфекции, вызванной атипичными вариантами возбудителя.

2. Продукция клетками В. pseudomallei обладающего антифагоцитарной активностью антигена 8 и внеклеточных протеаз является определяющим фактором диссеминации микроба в организме аэрогенно инфицированных животных и соответствующих патоморфологических изменений в органах и тканях макроорганизма.

3. Продукция внеклеточных гидролитических ферментов клетками атипичных по антигенной структуре вариантов В. pseudomallei является ведущим фактором, определяющим способность возбудителя к выживанию в инфицированном макроорганизме.

4. Анализ экспрессии генов цитокинов Thl- и ТЬ2-профилей клеточного ответа может быть информативным инструментом исследования процессов стимуляции различных звеньев иммунной системы при анализе особенностей течения инфекции, вызванной штаммами В. pseudomallei различной вирулентности.

5. Вариабельность экспрессии мажорных поверхностных антигенов у культур В. pseudomallei, выделенных от животных с различными клиническими формами инфекции, и увеличение уровня продукции антигенов 39, 42 и 90 - 120 kDa у изолятов В. pseudomallei от животных с развившейся острой формой инфекции свидетельствует о патогенетической значимости обозначенных биополимеров.

6. Тест-система иммуноферментная для обнаружения антигенов сапа и мелиоидоза эффективна для серологической диагностики инфекции, вызванной типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.

Апробация работы

тической конференции «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), научных конференциях ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ 2003 - 2007 гг.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 116 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 219 работ, в том числе 46 отечественных и 173 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 5 таблицами и 12 рисунками.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе в 4 журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов кандидатских диссертаций.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы п методы.

В работе использовали штаммы возбудителя мелиоидоза: В. ряешЗота-1Ш 100 - вирулентный с полноценной антигенной структурой; В. рьеийотсАЫ 100-16-1 - дефектный по продукции Аг8 мутант, полученный методом селекции; В. рзеис1ота11е1 56770 99/10 - дефектный по продукции поверхностных протеинов и внеклеточной протеазной активности. Использовали также штамм В. йшИстйет'и Е299, авирулентный для лабораторных животных (табл.1).

Штаммы В. р$еис1ота1Ш и В. 1каИапс1ет13 культивировали на мясо-пеп-тонном агаре (МПА) и мясо-пептонном бульоне (МПБ) с добавлением 4 % глицерина, бульонных и агаризованных средах на основе кислотного и ферментативного гидролизата казеина и дрожжевого экстракта (АГК). Использо-

вали также питательные среды фирмы (США). Культуры инкубирова-

ли при 37 °С в течение 24 - 48 ч.

Таблица 1

Вирулентность штаммов для экспериментальных животных при подкожном

заражении

Штамм Зол.хом. Вирулентность, Белые мыши ¿0, м.к. Белые крысы

B.pseudomallei 100 <1x10 <1x10 2x10'

B.pseudomaUei 100-16-1 1,5х105 >1x10' 5x104

B.pseudomallei 56770 99/10 lxl0J >lxl0s > 1х107

B.thailandensis E299 - - -

Примечание: ЛДт штамма В.ряеис1ота1Ш 100-16-1 для белых крыс при аэрозольном заражении, установленная входе данного исследования составила 1,2 х К? ж.м.к.

Работа проводилась в соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами 1-11 групп патогенности (опасности).

Аэрогенное заражение белых крыс осуществляли на динамической горизонтальной установке при скорости воздушного потока 0.16 и 0.5 м/с. Использовали пневматический распылитель конструкции В.В. Симонова с диаметром воздушного сопла 0.6 и 0.8 мм при давление сжатого воздуха 49.05 кПа с производительностью по жидкости 1.5 и 8.0 мл/мин., по воздуху - 30 л/мин.. Бактериальные суспензии готовили на сахарозо-глицериновой смеси из односуточных агаровых культур, выращенных на АГК. Для контроля доз отбирали пробы аэрозоля из камеры с помощью микроциклонов МЦ-2 с последующим высевом сорбирующей жидкости на чашки с АГК. Показатель ЛД5о определяли по методу Масальцева.

Патоморфологическое и электронно-микроскопическое исследования проводили в разные сроки после заражения животных общепринятыми методами [Алексеев, Курилов, Савченко, 1992].

Ферментативную активность бульонных культур исследуемых штаммов определяли, используя метод диффузии в плотной среде на основе 1.5 % Вас-to-agar (Difco, США), с добавлением 2 мМ КН2Р04, 1 мМ СаС12 и соответствующих субстратов. В лунки диаметром 5 мм на пластинах агара вносили по 100 мкл исследуемых суточных бульонных культур микроорганизмов и инкубировали при 37 °С в течение 24 ч. Результаты оценивали в единицах индекса гидролиза субстрата - отношения диаметра зоны гидролиза к диаметру лунки. Для выявления протеолитической активности использовали 0.5 % Skim milk (Difco, США), гемолитической - 1 % взвесь эритроцитов человека.

Коллагеназную и эластазную активности - по гидролизу 1 мг субстрата в 1 мл бульона. Дермонекротическую активность определяли на морских свинках, для чего в депиллированный участок области спины внутрикожно вводили 0.1 мл суточной бульонной культуры штамма. Реакцию учитывали через 24 ч.

Для получения антигенов суспензию бактериальной культуры подвергали воздействию охлажденным ацетоном в течение 24 ч. После проверки стерильности клетки осаждали центрифугированием. Сухую бакмассу суспендировали в фосфатно-солевым буфере рН 7.0 в соотношении 20 мг клеток на 1 мл буфера и обрабатывали на ультразвуковом дезинтеграторе (Artek, США) при мощности 60 Вт на льду.

Получения гипериммунных сывороток проводили путем внутрикож-ных инъекций антигенного материала с полным здыовантом Фрейида. Каждый из двух циклов иммунизации включал 4 паравергебральных инъекции препаратов с интервалом 5 сут между ними и 24 сут между циклами. В качестве животных-продуцентов использовали кроликов породы «Шиншилла» и козлов, которым вводили препарат из расчета 1 и 15 мг на одну инъекцию, соответственно. Взятие кропи проводили на 7-е сутки после заключительной инъекции.

Иммунофермсптпые конъюгаты готовили по стандартным методикам на основе IgG фракций иммунных сывороток; в качестве ферментной метки использовали щелочную фосфатазу (Sigma,США) и пероксидазу хрена (Sigma, США).

Проведении твердофазного иммуноферментного анализа проводили общепринятым методом, используя стандартные 96-луночные планшеты Dynatech (Flow Laboratories, США). Для выявления антигенов в бактериальных взвесях пластины сенсибилизировали смесью моноклональных антител, для определения антител - растворами специфических антигенов. Наряду с опытными реакциями ставили контроли: с заведомо известным антигеном -положительный контроль, контроль субстрата и конъюгата - отрицательные контроли.

Для реакции иммунодиффузии в геле использовали 1 % агар Noble (Difco, США) в фосфатном буфере рН 7.2. Пластинки агара с преципитатом окрашивали спиртовым раствором Кумасси R-250 (Serva, Германия).

Иммуноэлектрофорез проводили в 1 % агарозном геле, приготовленный на трис-барбиталовом буфере рН 8.6. В качестве контрольного препарата

применяли смесь человеческого альбумина, окрашенного бромфеноловым синим, и циаикобаламина. После инкубации с иммунной сывороткой в течение 24 - 72 ч, гели отмывали в фосфатном буфере рН 7.2 с 0.02 % азида натрия, высушивали и окрашивали.

Для проведения иммуноблоттинга получали препараты общеклеточных белков, лизируя клетки суточной агаровой культуры в буфере (0.0625 М Трис-НС1 рН 6.8, 2 % SDS, 5 % р-меркаптоэтанол, 10 % глицерин) при 100 °С в течение 10 мин. Выделение клеточных мембран осуществляли методом Hancock, Nikhaido (1978). Электрофорез в полиакриламидном геле с додецил-сульфатом натрия (SDS-PAGE) проводили по Laemmli (1970). Электрофоре-тический перенос белков из полиакриламидного гелей на нитроцеллюлозные мембраны с размером пор 0.22 и 0.45 мкм проводили по Towbin (1979), используя в качестве буфера для переноса 25 тМ Трис рН 8.3, 192 тМ глицин, 0.1% SDS, 7% метанол. Для детекции антигенов в иммуноблоттинге применяли адсорбированные поликлональные кроличьи IgG к комплексу Аг8 В. pseu-domallei и поликлональные кроличьи IgG к мембранным белкам В. pseudoma-llei. В качестве субстратов использовали 3,3- диаминобензидин (Fluka, Германия) и бром-хлор-индолил-фосфат, BCIP (Sigma, США).

Для проведения анализа экспрессии цитокинов беспородных белых мышей массой заражали внутрибрюшинно дозами 1 х103 м.к. для мелиоидозных штаммов и 1x10® м.к. в случае В. thailandensis. В различные сроки после заражения асептически забирали селезенку. Фрагмент органа объемом 3-5 мм3 подвергали воздействию гуанидинтиоцианата (Интерлабсервис, Россия) в течение 40 мин при 65 °С. РНК выделяли с использованием набора реагентов «Рибо-сорб» (Интерлабсервис, Россия) согласно рекомендациям производителя. Для очистки от примесей геномной ДНК образцы обрабатывали ДНКазой RQI (Promega, США), свободной от РНКаз. Для синтеза кДНК проводили реакцию обратной транскрипции при 37 °С в течение 60 мин с применением набора «Реверта» (Интерлабсервис, Россия). 5 мкл продуктов реакции ампли-фицировали на программируемом тсрмоциклере «Терцик» (ДНК-технология, Россия) с использованием праймеров и режимов амплификации, описанных в работе Ulett G. С., et al (2000). Продукты амплификации анализировали в денатурирующем 6 % полиакриламидном геле с 7.0 М мочевины, гели окрашивали нитратом серебра по Bassam, et al (1991).

Полученные в ходе экспериментальных исследований данные подвергали статистической обработке для определения их достоверности и сравнения показателей. Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки не превышала 0,05 (Р<0,05). Статистические методы включали определение средних геометрических титров, их статистическую достоверность и доверительные интервалы, получаемых в каждой серии опытов. Расчет 1Л)5о проводили по Керберу [Ашмарин, 1962].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальный легочный мелиондоз, вызванный штаммами В. р$сш\ота1Ы с различным антигенным составом. Выбор белых крыс для моделирования легочного мелиоидоза определялся тем, что на данной модели возможно воспроизвсдсиис нескольких клинических форм инфекции, учитывая относительную резистентность белых крыс к мелиоидозу. Кроме того, известная схожесть результатов изучение фагоцнгабелыюсти мелиоидозного микроба в тсст-систсмах макрофагов человека и белой крысы, позволяет рассматривать данную модель как наиболее адекватную естественным условиям аэрогенного заражения, по-видимому, наиболее распространенного в природе [Ширяев Д.Т., 1976].

При аэрогенном заражении животных равными дозами типичного и дефектного по антигенной структуре штаммов возбудителя мелиоидоза (4х103 ж.м.к.) наблюдали существенные различия в клиническом течении заболевания. У белых крыс, аэрогенно зараженных штаммом В. раеис1ота11е1100, развивалась острая форма мелиоидоза с характерными особенностями развития инфекционного процесса. Инфекционный процесс протекал по типу септицемии с развитием гнойной бронхопневмонии. Средняя продолжительность жизни составила 5-7 дней. Летальность составляла 100 %. Результаты изучения диссеминации клеток вирулентного штамма в организме белых крыс при аэрогенном заражении приведены в таблице 2.

При аэрогенном заражении белых крыс антигенным вариантом В. р$еи-с1ота1Ш 100-16-1 дозой 4х103 ж.м.к. инфекционный процесс ограничивался в основном поражением легких без выраженных признаков септицемии и специфических поражений паренхиматозных органов, характерных для мелиоидоза. Формирование очагов воспаления в легочной ткани, а также увеличение регионарных лимфоузлов и селезенки регистрировали на вторые сутки после

заражения. На 5 - 7 сутки в легких формировались обширные некротические очаги, вплоть до образования гнойной сливной пневмонии, что приводило к гибели примерно 10% животных на 5 - 16 сутки после инфицирования. При вскрытии белых крыс после 20 суток наблюдения очаги воспаления в легких переходили в стадию организации.

Таблица 2

Результаты бактериологического исследования внутренних органов белых крыс в различные сроки после аэрогенного заражения В. ряеийота-1Ш100 (АД 4 X103 ж.м.к.)_____

Исследуемы» материал Сроки исследования

12 ч 1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут

Паховые л/у - - - 40,0 80,0 100,0

Подмышечные л/у - ■ 40,0 100,0 100,0

Подчелюстные л/у - ■ 60,0 80,0 100,0

Паратрахеальные л/у - 40,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Трахея 100,0 60,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Лёгкие 40,0 60,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Кровь - 80,0 80.0 80,0 100,0

Печень - - 40,0 60,0 80,0 80,0

Селезёнка - 60,0 60,0 80,0 80,0

Почки - - 40,0 40,0 60,0 60,0

Мочевой пузырь - - - 20,0 40,0 40,0

Пршечания: в графах - процент положительных результатов бактериологического исследования.

Закономерность распространения клеток возбудителя при заражении атипичным штаммом В. рьеийопЫШ 100-16-1 была иной (табл. 3). В течение пяти дней после заражения возбудитель локализовался преимущественно в месте аппликации инфекта и регионарных лимфоузлах, что указывало на его более низкую инвазивность. Бактериемия была слабо выражена и обнаруживалась лишь у части павших животных в терминальной стадии заболевания.

Использование более высокой дозы атипичного штамма В. рхгийотаИг'г 100-16-1 (1х107 ж.м.к.) для аэрогенного заражение белых крыс приводило к развитию острого лёгочного мелиоидоза с генерализованной диссеминацией и интенсивным размножением специфической микрофлоры в органах экспериментальных животных с последующей их гибелью на 4 - 6 сутки (табл. 4).

Таблица 3

Динамика распространения В. рзеийотсЛШ 100-16-1 в организме белых крыс после аэрогенного заражения (АД 4x10' ж.м.к.)

Исследуемый материал Сроки исследования, сут

1 2 3 5 г 7 10 12 16 20

Паховые л/у - - - - - - -

Подмышечные л/у - - - - - - - - -

Подчелюстные л/у - - - ■ - - - -

Паратрахеальные л/у 40,0 60,0 80,0 - - - - -

Трахея 40,0 60,0 60,0 - - ■

Лёгкие 40,0 60,0 80,0 100,0 80,0 40.0 40,0 10,0

Кровь - - 40,0 20,0 - - ■

Печень - ■ - - - -

Селезёнка - - - - - - - - -

Почки - - - - - - - - -

Мочевой пузырь - - - - - - - - -

Примечания: в графах - процент положительных результатов бактериологического исследования.

Таблица 4

Выделение В. р5еи<1ота11е1100-16-1 из органов белых крыс в различные сроки после аэрогенного заражения (АД 1 X10'ж.м.к)

НсследуемыИ Сроки исследования, сут

материал 1 2 3 4 5

Паховые л/у - 20,0 40,0 80,0 100,0

Подмышечные л/у 40,0 60,0 80,0 80,0 100,0

Подчелюстные л/у 40,0 60,0 80,0 100,0 100,0

Паратрахеальные л/у 80,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Трахея 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Лёгкие 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Кровь 80,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Печень 80,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Селезёнка 80,0 100,0 100,0 100,0 100,0

Почки 20,0 60,0 80,0 100,0 100,0

Мочевой пузырь 20,0 „„1М-. ^ 80,0 100,0 100,0

Примечания: в графах — процент положительных результатов бактериологического исследования.

Иммунохимический анализ культур В. ряеис1ота11е'1 100-16-1 , выделенных от павших животных, на содержание Аг8 показал отсутствие его продукции клетками микроорганизма, что свидетельствовало об отсутствии реверсии изолятов к исходному фенотипу.

Аэрогенный мелиоидоз, вызванный полноценным и дефектным по антигенной структуре штаммами, характеризовался значительными отличиями в патоморфологических проявлениях. Для острой формы при заражении диким штаммом было характерно резкое расстройство гемодинамики в виде полнокровия и гемморагий, выраженные дистрофические процессы в паренхиматозных органах, наличие типичных, преимущественно экссудативного характера, гранулём в печени и селезёнке с выраженными дегенеративными изменениями в составляющих их клетках и обширными воспалительными и некротическими очагами в лёгочной ткани. Резко выраженная гипоплазия лимфоидной ткани селезёнки свидетельствовала о подавлении инфектом иммунных процессов организма-хозяина.

Особенности патоморфогенеза инфекции, вызванной дефектным по Аг8 штаммом возбудителя (доза 4 х 103ж.м.к.), состояли в отсутствии специфических гранулём в печени и селезёнке, в преобладании продуктивных воспалительных процессов в лёгких, в выраженных иммуноморфологических изменениях в селезёнке. У большинства животных некроз клеток альвеолярного эпителия отсутствовал. Основные патологические изменения протекали в виде бронхопневмонии, которая по срокам возникновения и по характеру течения отличалась от «классической» мелиоидозной пневмонии. Даже при заражении дозой 107ж.м.к., как правило, не наблюдалось развития в печени воспалительных явлений с элементами некроза.

При электронно-микроскопическом исследовании ультратонких срезов повреждённых участков лёгких выявлено, что клетки типичного штамма В. р.чеис1отаПе1 100 способны к выраженному капсулообразованию и мало подвержены завершенному фагоцитозу, в отличие от клеток атипичного штамма В. рзеис1ота1Ш 100-16-1. По-видимому, отсутствие экспрессии антигена 8 у последнего является причиной снижения продукции капсульного вещества, что приводит к завершенному фагоцитозу значительной части клеток атипичного штамма.

В целях изучения процессов активации клеток иммунной системы экспериментальных животных, инфицированных штаммами различной вирулентности, проводили исследование экспрессии генов цитокинов ТЫ (ШЫ-у) и ТЬ2 (1Ь-4,1Ь-10) - профилей иммунного ответа и макрофагстимулиру-юще-го интерлейкина 12 (1Ь-12) у белых мышей при экспериментальной инфекции.

Заражение животных проводили полноценным в антигенном отношении вирулентным штаммом возбудителя мел нон доза В. рхеис/о/паНе/ 100, дефектным по продукции экзопротеаз и ряда поверхностных белков инерционным мутантом В. рхешЬтиНе! 56770 99/10, и близким возбудителю мели ой доза в антигенном отношении, но анирулептным для биологических моделей, В. 1}шИапс1етЬ Е299. Полученные результаты свидетельствовали о существенных различиях в экспрессии генов цитокинов на данных моделях (рис. 1).

1234 1134 1234 1234 1234

А — w w . _ * { * i b * 1

g »r» •w ~ • 1 '- ОС - ■ Я» V * «ИМ >.-

0---- ... Г2 .J яя ( < ua* W * V » i ■

р-акгин IFM-v IL-12 IL-4 1L-10

Рис. I. Уровни мРМК ft-яктлиа м цитоки новых генов iijin инфищфоизгши мьгшеП ä.pseutlomaHei 100 (Л); B.pseudomatiei 5677t) 99/Hl (Ii) и B.thaHandensis E299 (С). Забор мявриш через: 1 - ti часов; 2 - 1 сутки; 3-3 суток; 4-6 суток.

Профили экспрессии ни токи новых генов, характерные для полноцепного ТЫ-типа клеточного ответа наблюдались лишь у животных, инфицированных В, thailandensis и мутантным штаммом вшбуднте-яя мелиоидтаа. Инфекционный процесс, вызванный В. pseudomallei 100, напротив* характеризовался ранним снижением продукции цитокинов, стимулирующих клеточное звено иммунитета (IFN-y, I[.-12), и возрастанием количества мРНК IL-iO к поздним срокам наблюдения, что, является свидетельством иигибирования различных звеньев межклеточных взаимодействий и процессов фагоцитоза.

Изучение активности внеклеточных ферментов возбудителя ме-лиоидоза на различных стадиях инфекционного процесса. Для оценки роли эксграце л л юля рных ферментов в патогенезе меяиоидозной инфекции были изучены количественные показатели активности комплекса экстрацеллюляр-ных ферментов у типичного и лишенного Аг8 штаммов возбудителя, изолированных на разных стадиях развития экспериментального мелиоидоза при различных способах заражения.

У культур вирулентного штамма В.pseudomallei 100. выделенных от белых крыс при подкожном заражении, оротеолитическая активность новыша-

лась в 2-4 раза в период острой фазы заболевания, затем показатели протео-лиза снижались до исходных величин (рис. 2).

Подкожное заражение

Аэрогенное заражение

исхсгднн г ir

' CJ1 í'.yt исюднэч 1 с,-

Протеопитическая активность

i Суг г чу» 1 tyi I <г вд мщки 1

Гемолитическая активность

Гис.2 Динамика ферментативной активности чюлятов штамма В0еи<{ота11а 1Ш), выделенных от белых крыс.

При изучении гемолитических свойств культур вирулентного штамма, выделенных от белых крыс при подкожном заражении уже через сутки намечалась выраженная тенденция к уменьшению активности ферментов, которая на восьмой день составила по индексу гемолиза (^ИГ) 0.25, Хгеом 6.0 х Ю'\ при этом, соответствующие показатели клеток исходного штамма были равны 0.3 и 1.2 X КГ1. Способность изолятов В.ряеис1ота11е1 100 гидролизовать коллаген и эластин также заметным образом снижалась (до 25 - 30 %) к поздним срокам инфекции. Дерм о некротическая активность выделенных культур, напротив, возрастала по сравнению с исходным штаммом. Диаметр зон инфильтрата увеличивался через 48 часов в 2 - 3 раза, что согласовалось с возрастанием п р отео л и ти ч е с ко й активности культу ральных фильтратов в тс же сроки.

При аэрогенном заражения животных штаммом В,р$еш1отаИег 100 увеличение ферглентативпой активности и зол я то в возбудители мелиоидоза было более выраженным, чем при подкожном способе инфицирования. Максимальный подъём протеолигической активности на 3 - 4 сутки совпадал с

периодом разгара заболевания. Динамика изменения гемолитической активности, имела, во многом, аналогичный характер. Активность эластазы и способность к расщеплению коллагена увеличивались менее значительно (на 18-20 %), но также соответствовал 4 суткам заболевания,

Протеолитическая активность исходной культуры В р$еис1ота1!е1 100-!б-1 (Аг8') была несколько выше, чем у штамма дикого типа В. рзеиёотаИт 100 {1цИП 0.41 и 0.3, соответственно), V культур, выделенных от белых крыс после аэрогенного заражения В. р$еис/ота[кЧ 100-16-1 дозой 4 х 103 ж.м.к,, через сутки протеолитическая активность превышала исходный уровень в 5 раз, и этот уровень сохранялся в течение всего периода ост рой формы инфекционного процесса (рис 3), Максимальный подъём гемолитической активности отмечали через сутки и до пятого дня заболевания, 1§ИГ составлял 0.48 — 0-54, что в среднем превышало соответствующие показатели исходного штамма к 7 - 10 рад. Гемолитическая. эяастазная и тадлагеказная активности также значительно повышались в разгар болезни.

Подкожное заражение (5 х Ю'ж.м.к.) Аэрогенное заражение (4 х 10! ж.м.к.)

исходим 1 с г ,Ч:: 3 еэт ;вл ' "м 1к-'

Прстеолитическая активность

¡'ни. 3. Динамика притеолотической активности пзолятов цггамма В, рхеш1о»шНе\ 10(1-1 й-1, выделенных от белых крыс.

При подкожном способе заражения белых крыс штаммом В. рзеЩ&та-\Ы 100 16-1 дозой 5 х 10" ж.м.к, у нзолятов, выделенных в течение 1 - 5 суток, протеолитическая активность не изменялась. Динамика данной ферментативной активности возбудителя соответствовала слабовыраженной картине патологоанатомичееких изменений внутренних органов и их незначительной бактериальной обсеменённости, Изменение продукции гемолизинов при подкожном заражении белых крыс у выделенных в разные сроки культур 5. рхеи-дотаШх 100-16-1 носили волнообразный характер с незначительным лодъ-

омом на вторые сутки. Эластазная и коллагеназная активности в эшг период заметно снижались. Дерм он екроти ч е с кая активность увеличивалась незначительно, примушественно у культур, выделенных в первые сутки.

При использовании больших аспирашюнпых доз штамма В. рзеиёота-1Ш 100-16-1 (1х)07м.к.) п ротсоляти чес кая активность клеток возрастала более чем в 10 раз уже в 1 сутки инфекции, а гемолитическая - более чем в 20 раз на 2 сутки (рис 4). В эти же сроки коллагеназная и эластазная активности достигали максимума и сохранялись вплоть до терминальной стадии заболевания.

ЮТ lip

Pile. 4. Динамики протеолнтнческой активности В.pseudomallei 100-16-1 при аэрогенном заражении белых крыс илоте 1\10т ж.м.к.

Таким образом, аэрозольное заражение сопровождалось значительным увеличением активности ферментов как при использовании сублеталыюй, так и летальной заражающих доз, свидетельствуя о том, что, по-видимому, легочная ткань обеспечивает наиболее благоприятные условия для реализации таких важных факторов патогенеза возбудителя мелиоидоза. как экстра-целлюлярные ферменты.

Анализ антигенной изменчивости В. pseudomallei при различных формах экспериментальной инфекции. Для оценки возможной антигенной изменчивости в ходе инфекционного процесса было проведено исследование антигенного спектра тотальных лизатов клеток, а также препаратов клеточных мембран у исходных штаммов В. pseudomallei 100 и 100-16-1 и культур, выделенных от экспериментальных животных при различных способах и дозах заражения (рис. 5).

А (белые крысы) В (морские свинки)

Рис. Антигенные спектры (Л) » экспрессия антигенов клеточных мембран (В) исходных штаммов В.р1еиёотЫШ я культур, выделенных от зараженных животных. [Ьгчуииб.юниш с С адсорбированной сыворш ни к комплексу Л ¡¡К.

А; 1 - В.рзеиЛотЫШ 1001 исходный; 2 - В.р^еисЬтаНе! 100, острая аэрогенная инфекция (4 \ К^ж.м.к.); 3 - В.ржиЛитаНе! 100-16-1, Исходный; 4 ■ В.р$еш1ош11е) 100-16-1, доброкачественная аэрогенная инфекция (4 >; Ю'ж.м.к,).

В: I Я. р!с'и<1ота11е1 100, исходный; 2-Й. ряем1ота1Ш 100, острая аэрогенная инфекция (4 х Ю'ж.м.к.); 3 — В. рхеи4ота1Ш 100, острая инфекция, подкожное заражение (4 к Ю'ж.М.к.; 4 - В. р.чеи(1ата1Ш 100-16-1, ИСХОДНЫЙ; 5,7 - К. рхешЗотаНе! 100-16-1, острая дар?генная инфекция (4 х Ю'ж.м.к,); 6,8,У В. рзешЬзтЫЩ 100-16-1, острая инфекция, подкожно г заражение (I х I 0"ж.м.к.),

Анализ антигенного с покер а тотальных лизатов клеток показал повышение уровня продукции антигена 200 кОа у культур, выделенных от животных зараженных типичным штаммом В. р$еш1ота1Ш 100, и отсутствие его у культур В. рзеис/отаЦеI 100-16-1, сохраняющим дефект продукции данного антигена. Сколько-нибудь выраженного изменения продукции других общеКлеточных белков у культур, выделенных от зараженных животных, обнаружено не было.

Иммуноблоттинг препаратов клеточных мембран показал, что у культур штамма В. рхешкятИдЖ 100, выделенных, от животных с острой формой инфекции как при аэрозольном, так и при подкожном заражении, сохранялся высокий уровень продукции Мембранных белков 39, 42 и 90 кОа, характерный для исходной культуры. При этом практически не выявлялась экспрессия мембранного белка размером ПО кра, хорошо выраженная у исходного штамма.

Штамм В. ряеийотсЛ-Ы 100-16-1 характеризовался изначально сниженным уровнем экспрессии мембранных антигенов размером 42 и 90 Ша и отсутствием продукции белка размером 110 кОа. У культуры В. рьеМотаИе'г 100-16-1, выделенной от животного с доброкачественным течением аэрозольной инфекции, наряду с существенным снижением продукция белка размером 39 Ша, наблюдали появление выраженной экспрессии белка 42. При подкожном заражении данным штаммом картина была несколько иной: значительно увеличивалась продукция белков размером 39, 42 кБа и выявлялась экспрессия антигена 90 кБа. Это свидетельствуют о выраженной антигенной изменчивости штамма В. ряеис1ота1Ш 100-16-1 в ходе инфекционного процесса, как при аэрозольном, так и при подкожном заражении.

В целях оценки эффективности использования имеющихся стандартных средств иммунодиагностики возбудителя мелиоидоза применительно к штаммам микроорганизма с атипичной антигенной структурой, были проведены исследования проб биологического материала, взятых в различные сроки от животных, инфицированных штаммами В. р$еис1ота1Ы 100 и 100-16-1, с использованием иммунодиагностического препарата «Тест-системы имму-ноферментной для обнаружения антигенов сапа и мелиоидоза».

В пробах органов от животных с острой аэрогенной формой заболевания, зараженных типичным штаммом В. рзеийотаИег 100, детекция антигенов была положительной, начиная с 2 суток и далее в течение всего срока наблюдения (табл.5). При моделировании острой формы инфекции с подкожным заражением, положительные пробы отмечены в более поздние сроки, на 7 - 9 сутки наблюдения.

Анализ проб от животных, зараженных штаммом В. ръеийотайе! 10016-1 показал, что в случае аэрогенного заражения инфицированных животных с развившейся в дальнейшем острой формой заболевания с доброкачественным течением, положительные результаты ТИФА также отмечались в ранние сроки (3 сутки и далее).

Таблица 5

Результаты ТИФА при исследовании суспензий внутренних органов белых крыс в различные сроки после аэрогенного заражения В. рзеийота-1М100 (АД 4 Х103 ж.м.к.) н В. р$еис!ота11а 100-16-1 (ЛД 4х103 ж.м.к.).

Исследуемый материал Сроки исследования

12 ч 1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут

Паховые л/у -/- -/- -/- +/- +/-

Подмышечные л/у -/- +/- +/+

Подчелюстные л/у +/- +/- +/+

Паратрахеальные л/у -/- +/- +/+ +/+ +/+

Трахея -/- +/- +/+ +/+

Лёгкие -/- +/- +/+ +/+ +/+

Кровь -/- -/- +/- +/- +/+ +/+

Печень -/- +/- +/- +/-

Селезёнка -/- -/- +/- +/- +/- +/-

Почки -/- -/- -/- +/- +/- +/-

Мочевой пузырь -/- -/- +/- +/-

Примечания: В графах приведена качественная характеристика специфического выявления антигенов типичного /атипичного штамма.

Таким образом, использованный иммунодиагностический препарат показал достаточную эффективность детекции клеток типичного и атипичного вариантов микроба в пробах биологического материала при экспериментальной инфекции, что указывает на возможность его использования для лабораторной диагностики инфекции, вызванной атипичными штаммами возбудителя мелиоидоза.

ВЫВОДЫ

1. Разработана экспериментальная модель острой формы легочного мелиоидоза с доброкачественным течением у белых крыс с использованием аэрозоля штамма Я рвеийота11е1100-16-1, дефектного по синтезу Аг8.

2. К особенностям процесса диссеминации типичного вирулентного штамма В. р$еийота1Ы в организме белых крыс при аэрогенном способе инфицирования следует отнести локализацию микроба в трахее, легких, затем - в регионарных лимфоузлах, развитие бактериемии на 2-3

сутки и последующее интенсивное размножение клеток возбудителя во внутренних органах.

3. Показано, что при аэрогенном инфицировании животных сублетальными дозами В. рзеис1ота11е1100-16-1 (Аг8") возбудитель преимущественно локализуется в месте аппликации (трахея) и регионарных лимфоузлах. Слабо выраженная бактериемия обнаруживается у 40 % животных; размножение возбудителя в органах системы мононуклеарных фагоцитов отсутствует.

4. Выявлены особенности патоморфологической картины инфекционного процесса у белых крыс при заражении дефектным по Аг8 штаммом возбудителя мелиоидоза В. р$еи<1ота1Ш 100-16-1, заключающиеся в отсутствии специфических мелиоидозных гранулём в печени и селезёнке во все сроки наблюдения и преобладании продуктивных процессов в легочной ткани, направленных на отграничение и рассасывание очагов воспаления.

5. Установлена ведущая роль внеклеточных гидролитических ферментов в развитии острого лёгочного мелиоидоза с доброкачественным течением у белых крыс, вызванного антигенным вариантом В. р$еи(1ота11о.'1 10016-1. Выявлено, что протеолитическая активность клеток атипичного штамма возрастает более чем в 10 раз, а гемолитическая - более чем в 20 раз в 1-2 сутки инфекционного процесса, при этом коллагеназная и эластазная активность клеток атипичного штамма сохраняется вплоть до терминальной стадии заболевания.

6. Показано, что профили экспрессии цитокиновых генов, характерные для полноценного ТЫ-типа клеточного ответа наблюдаются только при инфицировании животных штаммом В. thailandensis и мутантиым штаммом возбудителя мелиоидоза со сниженой вирулентностью. Инфекционный процесс, вызванный вирулентным штаммом В. рзе^ота-11е-1, характеризуется ранним снижением продукции цнтокинов и возрастанием количества мРНК 1Ь-10 к поздним срокам наблюдения.

7. Выявлена вариабельность и отличия экспрессии ряда поверхностных антигенов у культур типичного вирулентного штамма В. pseudomallei 100 и дефектного по продукции антигена 8 штамма В. рзе^отаНег 10016-1, выделенных от экспериментальных животных при различных способах инфицирования и клинических формах инфекции.

8. Показано, что «Тест-система иммуноферментная для обнаружения антигенов сапа и мелиоидоза», разработанная в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте, эффективна для выявления дефектных по Аг8 штаммов возбудителя мелиоидоза в пробах биологического материала от экспериментально инфицированных животных.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Алексеев В.В., Вязьмина Т.Н., Плеханова Н.Г., Алексеева В.В., Замараева C.B., Попов С.Ф., Кашшев В.И. Особенности патогенеза экспериментального мелиоидоза, вызванного штаммами B.pseiidomallei с различным антигенным составом / Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2001. -В.2 (82). -С.95-98.

2. Алексеев В.В., Илюхин В.И., Плеханова Н.Г., Сенина Т.В., Тихонов С.Н., Перепелицына C.B. Перспективы применения Burkholderia thailandensis и Franc isclla tillarais is 15 НИИГЭ для иммунизации при буркхольдериозах / Проблемы особо опасных инфекции.- Саратов, 2004 г.- В.88,- С.56-57.

3. Алексеев В.В., Пивень H.H., ХраповаН.П., Викторов Д.В., Каплиев В.И., ПлехановаН.П, Пучков B.C., Прохватилова Е.В., Замараева C.B. Изучение адаптационной изменчивости атипичных штаммов Pseudomonas (Burkliolderia) psciidomallei при экспериментальном легочном мелиоидозе / Методические документы и отчеты по сан-эпид. охране территории РФ // Информационный сборник. - Саратов, 2001, - С.39-40.

4. Алексеев В.В., Пивень H.H., Плеханова П.Г., Храпова Н.П., Викторов Д.В., Кивокурцева Т.Ю., Замараева C.B., Вязьмина Т.Н. Адаптационные изменения продукции капсульиого гликопротеина Burkholderia pseudoma-llei в макроорганизме / Поволжский экологический вестник - Волгоград, 2003. - В.9. - С.241-243.

5. Алексеев В.В., Пивень H.H., ПлехановаН.П, Викторов Д.В., Перепелицына C.B., Каплиев В.И. Методические рекомендации по моделированию на морских свинках мелиоидозной инфекции, вызванной Burkholderia pseu-domallei с изменённой продукцией экзопротеаз / Методические документы и отчёты по сан.-эпид. охране территорий РФ.- Саратов, 2003.- С.18.

6. Алексеев В.В., Плеханова Н.Г., Каплиев В.И., Перепелицына C.B., Кивокурцева Т.Ю. Изучение продукции экзопротеаз Biirkholderia pseudomallei при аэрогенной мелиоидозной инфекции / Сборник научных трудов, посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 2003 . - С. 105.

7. Алексеев В.В., Плеханова Н.Г., Кивокурцева Т.Ю., Замараева C.B., Пивень H.H., Викторов Д.В. Механизм патогенности Burkholderia pseudomallei с различным антигенным составом при экспериментальном мелиоидозе / Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. - 2003.- №6-С. 15-20.

8. Алексеев В..В., Тихонов Н..Г., Вязьмина Т..Н., Плеханова Н..Г., Демедюк Е.А., Пивень H.H., Попов С.Ф., Замараева C.B.., Каплиев В.И., Пучков

B.C., Викторов В.В. Патогенетическое действие и механизмы адаптации антигенных вариантов Burkholderia pseudomallei при экспериментальном мелиоидозе / Природноочаговые инфекции в Нижнем Поволжье. - Волгоград, 2002 г. - С. 12-19.

9. Алексеев В.В., Тихонов Н.Г., Плеханова Н.Г., Кивокурцева Т.Ю., Замараева C.B. Экологические аспекты механизма адаптации возбудителя мелио-идоза / Поволжский экологический вестник. - Волгоград, 2003.- В.9.-

C.203-207.

Ю.Замараева C.B., Алексеев В.В., Плеханова Н.Г., Каплиев В.И., Пучков B.C. Роль отдельных факторов патогенности Burkholderia pseudomallei при экспериментальной мелиоидозной инфекции / Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. -Москва, 2002.-С. 170.

ll.IIuykhin V.l., Senina T.V., Plekhanova N.G., Antonov V.A., Merinova L.K., Tkatchenko G.A., Zamaraeva S.V., Alekseeva V.V. Biological properties and differentiation of pathogenic species of genus Burkholderia II Natural infectious diseases. Abstracts of scientific conference 6 december 2001. - Ulaanbaatar, 2001.-P.33-35.

12.Каплиев В.И., Замараева C.B., Алексеева В.В., Попов С.Ф. Электронно-микроскопическое исследование взаимодействия возбудителя мелиоидоза с клетками макроорганизма / Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика: Сб.научн.трудов, поев. 100-летию Астраханской противочумной станции. -Астрахань, 2001,- С.224.

13.Перепелицына C.B., Алексеев В.В., Захарова И.Б., Плеханова Н.Г, Викторов Д.В., Дифференциальная экспрессия генов цитокинов при инфицировании мышей штаммами Burckholderia pseudomallei и Burkholderia thai-landensis Н Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств.- Оболенск, 2006.- С.157-158.

14.Плеханова Н.Г., Алексеев В.В., Каплиев В.И., Вязьмина Т.Н., Перепелицы-на C.B. Изучение роли отдельных факторов патогенности Burcholderia pseudomallei в развитии экспериментального легочного мелиоидоза / Медицинская микробиология - XXI век: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Саратов, 2004. - С179-181.

15.Плеханова Н.Г., Алексеев В.В., Вязьмина Т.Н., Каплиев В.И., Перепелицы-на C.B., Попов С.Ф. Изучение роли отдельных факторов патогенности Burkholderia pseudomallei в развитии экспериментального лёгочного мелиоидоза / Методические документы и отчёты по сан.-эпид. охране территорий РФ.- Саратов, 2003.- С.51.

16.Плеханова Н.Г., Алексеев В.В., Кивокурцева Т.Ю., Псрепелицына C.B., КаплневВ.И., Вязьмина Т.Н., Попов С.Ф. Методические рекомендации по моделированию на морских свинках лёгочного мелиоидоза, вызванного Burkholderia pseudomallei 100-16-1 (Ar 8-) / Методические документы и отчёты по сан.-эпид. охране территорий РФ,- Саратов, 2003.- С.18.

17.Плеханова Н.П, Алексеев В.В., Пнвень H.H., Агеева Н.П., Каплиев В.И., Викторов Д.В., Перепелицына C.B. Сравнительное изучение состава и свойств гидролитических экзоферментов типичных и атипичных штаммов Burckholderia pseudomallei / Медицинская микробиология - XXI век: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Саратов, 2004. - С.181-183.

18.Попов С.Ф., Алексеев В.В., Пнвень H.H., ПлсхановаН.Г., Алексеева В.В., Замараева C.B., Каплиев В.И. Элскгроппо-,микроскопическое изучение взаимодействия штаммов возбудителя мелиоидоза с различной антигенной структурой и фагоцитирующих клеток лёгкого при аэрогенном заражении / Проблемы особо опасных инфекций. - Саратов, 2001. - В.2 (82). -С.112-115.

19.Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму / Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Жилина П.Я., Субботин В.Г., Алексеев В.В., Липницкий A.B., Метлин В.Н., Прохватилова Е.В., Храпова Н.П., Лобанов А.Н., Пашанина Т.П., Илюхин В.И., Батманов В.П., Лозовая H.A., Лесовой B.C., Пучков B.C., Погасий Н.И., Кулаков М.Я., Андрус В.Н., Сухов В.В., Савченко С.Т., Замараев B.C., Антонов В.А., Тихонов С.Н., Плеханова Н.Г., Алтухова В .В., Перепелицына C.B., Кивокурцева Т.Ю., Попов С.Ф., Быкова О.И., Плешакова Т.В., Новицкая И.В., Викторов Д.В., Захарова И.Б., Сенина Т.В., Шумилов П.К., Жуков А.Н., Чайка А.Н. - Волгоград, изд-во «Радуга», 2004.- 236с.

ПЕГЕПЕЛИЦЫНА Светлана Валерьевна

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЛЕГОЧНОГО МЕЛИОИДОЗА, ВЫЗВАННОГО ШТАММАМИ ВНЫШОШЕЮА РХЕОООМАИЕ! С РАЗЛИЧНЫМ АНТИГЕННЫМ СОСТАВОМ

Автореферат

Подписано в печать 21,09.2009. Формат 60x84/16

Гарнитура Тайме. Печать офсетная. Усл. псч. л. 1,4. Тираж ¡00за. Заказ 93932.

ООО «Арт линия» 400131, Волгоград, ул. Скосырева, 5

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Перепелицына, Светлана Валерьевна

Список сокращений Введение

Глава 1. Клиника, лабораторная диагностика и патогенез ме- 13 лиоидозной инфекции

1.1. Клинические проявления и особенности лабораторной диаг- 13 ностики мелиоидоза

1.2. Основные факторы патогенности Burkholderiapsendomallei 28 Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Штаммы возбудителя мелиоидоза, питательные среды, лабо- 40 раторные животные

2.2. Аэрогенное заражение животных возбудителем мелиоидоза

2.3. Техника исследования биологического материала

2.4. Определение активности ферментов возбудителя мелиоидоза

2.5. Иммунохимический анализ антигенных комплексов и от- 43 дельных биополимеров возбудителя мелиоидоза

2.6. Анализ экспрессии генов цитокинов

2.7. Статистическая обработка результатов исследований

Глава 3. Экспериментальный легочный мелиоидоз, вызванный штаммами В. pseudomallei с различным антигенным составом

3.1. Моделирование легочного мелиоидоза и сравнительная ха- 48 рактеристика экспериментальных моделей инфекции

3.2. Особенности диссеминации антигенных вариантов В. pseudo- 51 mallei при легочном мелиоидозе

3.3. Патоморфология экспериментального мелиоидоза крыс, вы- 55 званного типичным и атипичным штаммами возбудителя

3.4. Особенности взаимодействия антигенных вариантов В. рзеи- 60 с1ота11е1 с клетками системы мононуклеарных фагоцитов экспериментальных животных

3.5.Сравнительная характеристика процессов активации клеток 62 иммунной системы экспериментальных животных, инфицированных штаммами В. рБеис1ота1Ш и В. thailandensis

Глава 4. Изучение активности внеклеточных ферментов возбу- 68 дителя мелиоидоза на различных стадиях инфекционного процесса

4.1. Ферментативная активность вирулентного штамма В. рБеи- 68 ¿ота11е1 при различных формах экспериментальной инфекции

4.2. Активность экстрацеллюлярных ферментов штамма В. рБеи- 72 с1ота1Ш, дефектного по продукции Аг8, при экспериментальном мелиоидозе

Глава 5. Анализ антигенной изменчивости В. ряеийотсйШ при 76 различных формах экспериментальной инфекции

5.1. Вариабельность антигенного состава типичных и атипичных 76 штаммов В. рБеийотаИегъ ходе инфекционного процесса

5.2 Твердофазный иммуноферментный анализ в лабораторной диагностике экспериментального мелиоидоза, вызванного штаммами с различным антигенным составом Заключение

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Особенности экспериментального легочного мелиоидоза, вызванного штаммами Burkholderia pseudomallei с различным антигенным составом"

Актуальность

В последние годы интерес исследователей к мелиоидозу значительно возрос, что объясняется расширением ареала инфекции, связанным с изменяющимися климатическими условиями, глобальным потеплением и другими природными факторами, способствующими появлению этой опасной инфекции на ранее неэндемичных территориях и формированию вторичных очагов [85, 86].

Материалы научной периодики последнего времени свидетельствуют о заметном подъеме заболеваемости мелиоидозом в эндемичных по данной инфекции регионах мира - странах Юго-Восточной Азии (Вьетнам, Камбоджа, Малайзия, Сингапур, Таиланд), северных областях Австралии, Индии, Китае [79, 80, 210, 215, 216]. Спорадические случаи заболевания регистрируются в тропических областях Америки и Африки, Филиппин, Мексики, Папуа Новой Гвинеи [88, 158, 173]. Так, например, в Таиланде причиной 20 % всех случаев бактериальной пневмонии и 40 % летальных исходов от острой септицемии является мелиоидозная инфекция [156]. Приведенные сведения свидетельствуют о том, что в указанных регионах мелиоидоз занимает одно из ведущих мест в структуре инфекционной патологии и смертности.

Для России мелиоидоз не является эндемичным заболеванием и относится к числу «экзотических инфекций». Однако, наличие обширных экономических и культурных контактов со странами Юго-Восточной Азии, Индостана, Центральной Америки и Южной Америки, Африки, а также существование эндемичных очагов В. р8еис1ота1Ш на сопредельных территориях (Иран, Китай), требует готовности медицинской и ветеринарной служб страны к возможным случаям появления этого заболевания.

Мелиоидоз отличается многообразием клинических проявлений, поэтому даже в эндемичных регионах первичный диагноз редко бывает верным. До подтверждения бактериологическим методом, больных мелиоидо-зом зачастую лечат под диагнозом лихорадки, флегмоны, фарингита, пневмонии, туберкулеза, артрита, холецистита, малярии [132, 217]. Легочная форма этого заболевания занимает особое место, так как характеризуется тяжелым течением и высокой летальностью. Не исключено, что больные с мелиоидозной пневмонией, интенсивно выделяющие инфект в окружающую среду, представляют эпидемическую опасность [68, 84, 182].

О том, что органы дыхания могут являться первичными воротами инфекции при мелиоидозе в естественных условиях, накоплено достаточно фактов. Указанный механизм заражения рассматривают как равнозначный или второй по значению после чрескожного. Вероятно, этим можно объяснить тот факт, что в странах Юго-Восточной Азии легочный мелиоидоз -наиболее распространенная форма заболевания, хотя чаще всего путь инфицирования не был установлен [82, 100, 131,160, 176]:

Вторая возможная причина появления больных с легочной формой мелиоидоза - аварийные ситуации в специализированных учреждениях научного или иного профиля, осуществляющих работу с возбудителем. По различным оценкам, 65-80 % внутрилабораторной заболеваемости составляют аэрогенные инфекции, вызванные соответствующими возбудителями, в том числе В. pseudomallei и В. mallei [155, 180]. В таких случаях неизбежно появление больных с легочными формами инфекции, сопровождающимися, как правило, тяжелой клинической картиной.

И, наконец, третий аспект проблемы - преднамеренное создание бактериального аэрозоля. Возбудитель мелиоидоза по многим свойствам отвечает требованиям, предъявляемым к вероятным биологическим поражающим агентам (БПА) [145, 207, 212]. Анализ материалов Второй обзорной конференции стран - участниц Конвенции (1986 г.), первого в США симпозиума по биотерроризму (1999 г.), позволяет оценить реальность возникновения такой ситуации, а возможные последствия подобных акций легко прогнозируются.

Эти вопросы в определенной степени решены для инфекции, вызванной типичными по антигенному составу штаммами возбудителя мелиоидоза, однако, не изучены при использовании для заражения микроба с измененной антигенной структурой. Ранее было установлено, что утрата возбудителем мелиоидоза одного из признаков, детерминирующего патогенность — поверхностного биомолекулярного комплекса, обозначенного как антиген 8 (Аг8) [34], с которым связывают антифагоцитарную активность микроба, приводит к авирулентности возбудителя для относительно резистентных к мелиоидозу белых мышей и крыс при парентеральных способах инфици рования [1,4]. Однако, при аэрогенном заражении Аг8" вариантами микроба, данные экспериментальные модели проявляли чувствительность к инфекции, что определило целесообразность проведения дальнейших исследований особенностей развития и протекания инфекционных процессов, вызванных атипичными формами микроба [1, 2, 4]. Исследования такого рода, по нашему мнению, представляют как теоретический интерес в плане оценки патогенетической роли отдельных факторов вирулентности микроба и исследования механизмов адаптации микробных клеток атипичных штаммов в условиях макроорганизма, так и имеют важное практическое значение, поскольку могут дать сведения, необходимые для дальнейшего совершенствования тактики защитных мероприятий, в том числе схемы лабораторной диагностики заболевания.

Цель работы - изучение особенностей течения экспериментального легочного мелиоидоза при аэрогенном заражении штаммами ВигккоЫепа рзеис1ота1Ш с различным антигенным составом.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель легочного мелиоидоза на белых крысах при аэрозольном заражении штаммом В. р$еис1ота1Ш, дефектным по синтезу Аг8.

2. Дать сравнительную характеристику легочной инфекции, вызванной типичным и атипичным штаммами мелиоидозного микроба. Сформулировать основные закономерности механизма развития легочного мелиоидоза у белых крыс при аэрогенном заражении дефектным по Аг8 штаммом В. ряеис1ота11е1.

3. Провести сравнительный анализ продукции внеклеточных гидролаз типичными и атипичными штаммами В. р$еис1ота1Ы на различных стадиях инфекционных процессов у экспериментальных животных, зараженных подкожным и аэрогенным методами.

4. Исследовать вариабельность антигенного состава типичных и атипичных штаммов В. р$еис1ота11ец изолированных от животных с различным клиническим течением и на отдельных стадиях заболевания.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые:

1. Разработана экспериментальная модель легочного мелиоидоза на белых крысах с атипичным течением острой формы заболевания и доброкачественным исходом.

2. Получены новые сведения о механизмах развития легочного мелиоидоза белых крыс, вызванного штаммами возбудителя с различной антигенной структурой: охарактеризованы патологоанатомические и патоморфологические изменения макроорганизма при инфекционном процессе, исследованы особенности диссеминации атипичного штамма возбудителя мелиоидоза в ходе экспериментальной инфекции, изучены особенности взаимодействия микроба с клетками системы мононуклеарных фагоцитов в легких экспериментальных животных.

3. Получены новые сведения об особенностях экспрессии генов цито-кинового ответа клеток иммунной системы экспериментальных животных в ходе инфекционного процесса, вызванного штаммами В. рзеис1ота1Ш различной вирулентности и В. 1ИаИапс1еп818.

4. Показано значение секретируемых микробом гидролаз различной субстратной специфичности на развитие экспериментальной аэрогенной инфекции, вызванной штаммом В. ряеи(1ота1Ш с атипичной антигенной структурой.

5. Показаны различия в уровне продукции отдельных поверхностных антигенов у штаммов В. р8еийота11е1, выделенных в различные сроки от экспериментальных животных (белых крыс и морских свинок) с различными способами инфицирования и клиническими формами.

6. По материалам проведенных исследований получен патент на изобретение № 2257413 «Штамм бактерий В. 1каИапс1ет18 — авирулент-ный имитатор возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован 27.07.2005г.).

Практическая ценность.

1. Определены технические и биологические условия воспроизведения на белых крысах легочного мелиоидоза в острой форме с атипичным течением и доброкачественным исходом заболевания. Экспериментальная модель могут быть использованы для решения различных вопросов биологии возбудителя и проблем прикладного характера, связанных с разработкой средств специфической профилактики и совершенствованием лабораторной диагностики. Материалы исследования составили основу «Методических рекомендаций по экспериментальному моделированию легочного мелиоидоза, вызванного атипичным штаммом Pseudomonas pseudomallei» (утверждены директором Волгоградского НИПЧИ 23.12.2001)

2. Установлено, что утрата мелиоидозным микробом способности синтезировать Аг8 не приводит к полной потере возбудителем вирулентности при аэрогенном способе инфицирования, а течение заболевания, вызванного атипичными вариантами возбудителя, определяют продуцируемые микробом экзоферменты. Выявленные особенности инфекционного процесса могут явиться основой для коррекции тактики диагностических и профилактических мероприятий при легочной форме мелиоидоза.

3. Показана эффективность тест-системы иммуноферментной для обнаружения, антигенов мелиоидоза, разработанной в Волгоградском научно-исследовательском институте, для исследования проб биологического материала от животных, экспериментально инфицированных типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.

5. Материалы исследования вошли в «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия^ биотерроризму» (Волгоград, 2004 г.).

Диссертация выполнена в рамках 8 плановых научноисследовательских тем ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная экспериментальная модель легочного мелиоидоза белых крыс с использованием аэрозоля штамма В. ряеис1ота1Ш 10016-1, дефектного по синтезу Аг8, позволяет исследовать особенности течения мелиоидозной инфекции, вызванной атипичными вариантами возбудителя.

2. Продукция клетками В. р$еис1ота1Ш обладающего антифагоцитарной активностью антигена 8 и внеклеточных протеаз является определяющим фактором диссеминации микроба в организме аэрогенно инфицированных животных и соответствующих патоморфологиче-ских изменений в органах и тканях макроорганизма.

3. Продукция внеклеточных гидролитических ферментов клетками атипичных по антигенной структуре вариантов В. рБеийотсЛЫ является ведущим фактором, определяющим способность возбудителя к выживанию в инфицированном макроорганизме.

4. Анализ экспрессии генов цитокинов ТЫ- и ТЬ2-профилей клеточного ответа может быть информативным инструментом исследования процессов стимуляции различных звеньев иммунной системы при анализе особенностей течения инфекции, вызванной штаммами В. ряеис1ота11е1 различной вирулентности.

5. Вариабельность экспрессии мажорных поверхностных антигенов у культур В. ряеис1ота1Ы, выделенных от животных с различными клиническими формами инфекции, и увеличение уровня продукции антигенов 39, 42 и 90 - 120 Ша у изолятов В. р8еи<Лота1Ш от животных с развившейся острой формой инфекции свидетельствует о патогенетической значимости обозначенных биополимеров.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной научно-практической конференции «Problems of biological and ecological safety» (Оболенск, 2000), IV межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), VII Межгосударственной научно-практической' конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации, международного значения в общественном здравоохранении- в решениях Санкт-Петербургского саммита- «Группы восьми» и санитарная охрана территорию государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), VIH' Межгосударственной, научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в- государствах-участниках СНГ» (Саратов; 2007), научных конференциях ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ 2003 - 2007 гг.

Структура и объём диссертации

Диссертация-изложена на 116 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 219 работ, в том числе 46/отечественных и 173 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 5 таблицами-и 12 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Перепелицына, Светлана Валерьевна

выводы

1. Разработана экспериментальная модель острой формы легочного мелиоидоза с доброкачественным течением у белых крыс с использованием аэрозоля штамма В. р8еис1ота1Ш 100-16-1, дефектного по синтезу Аг8.

2. К особенностям процесса диссеминации типичного вирулентного штамма В. рБеис1ота11е1 в организме белых крыс при аэрогенном способе инфицирования следует отнести локализацию микроба в трахее, легких, затем - в регионарных лимфоузлах, развитие бактериемии на 2-3 сутки и последующее интенсивное размножение клеток возбудителя во внутренних органах.

3. Показано, что при аэрогенном инфицировании животных сублетальными дозами В. р8еис1ота1Ш 100-16-1 (Аг8~) возбудитель преимущественно локализуется в месте аппликации (трахея) и регионарных лимфоузлах. Слабо выраженная бактериемия обнаруживается у 40 % животных; размножение возбудителя в органах системы мононукле-арных фагоцитов отсутствует.

4. Выявлены особенности патоморфологической картины инфекционного процесса у белых крыс при заражении дефектным по Аг8 штаммом возбудителя мелиоидоза В. рБеис1ота11е1 100-16-1, заключающиеся в отсутствии специфических мелиоидозных гранулём в печени и селезёнке во все сроки наблюдения и преобладании продуктивных процессов в легочной ткани, направленных на отграничение и рассасывание очагов воспаления.

5. Установлена ведущая роль внеклеточных гидролитических ферментов в развитии острого лёгочного мелиоидоза с доброкачественным течением у белых крыс, вызванного антигенным вариантом В. рвеи-с1ота1Ш 100-16-1. Выявлено, что протеолитическая активность клеток атипичного штамма возрастает более чем в 10 раз, а гемолитическая — более чем в 20 раз в 1 -2 сутки инфекционного процесса, при этом коллагеназная и эластазная активность клеток атипичного штамма сохраняется вплоть до терминальной стадии заболевания.

6. Показано, что профили экспрессии цитокиновых генов, характерные для полноценного ТЫ-типа клеточного ответа наблюдаются только при инфицировании животных штаммом В. 1каПапс1ет18 и мутант-ным штаммом возбудителя мелиоидоза со сниженой вирулентностью. Инфекционный процесс, вызванный вирулентным штаммом В. рйеийотаИег, характеризуется ранним снижением продукции цито-кинов и возрастанием количества мРНК 1Ь-10 к поздним срокам наблюдения.

7. Выявлена вариабельность и отличия экспрессии ряда поверхностных антигенов у культур типичного вирулентного штамма В. рБеи-(1ота1Ш 100 и дефектного по продукции антигена 8 штамма В. рэеи-с1ота1Ш 100-16-1, выделенных от экспериментальных животных при различных способах инфицирования и клинических формах инфекции:

8. Показано, что «Тест-система иммуноферментная для/ обнаружения антигенов сапа; и мелиоидоза», разработанная в; Волгоградском? на- . учно-исследовательском противочумном институте; эффективна для выявления дефектных по Аг8 штаммов возбудителя мелиоидоза в пробах , биологического материала от экспериментальное инфицированных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лёгочная форма мелиоидоза - один из наиболее распространённых клинических вариантов инфекции, который характеризуется тяжестью, высокой летальностью и трудностью лечения. Есть основания считать, что лёгочная ткань имеет повышенную чувствительность к возбудителю мелиоидоза, а в совокупности с тем, что входными воротами для инфекта является весь дыхательный тракт, а не отдельные участки, понятна та легкость, с которой происходит аэрогенное заражение людей и животных в природных и экспериментальных условиях [31].

Указанные обстоятельства объясняют необходимость разработки адекватных мер защиты, которые, как известно, должны базироваться на знании особенностей механизма развития заболевания. Эти вопросы интенсивно разрабатываются в научных лабораториях ряда стран, объектом исследования в которых являются типичные вирулентные штаммы В. р8еис1ота11е1. Вместе с тем, допускается, что мелиоидозный микроб может персистировать в изменённых формах (например, клоны с измененной антигенной структурой), способных вызывать атипичное клиническое течение инфекции [1,4, 15]. Ранними исследованиями установлено, что утрата способности продуцировать поверхностный Аг8 приводит к авирулентно-сти возбудителя для резистентных к мелиоидозу белых мышей и крыс [34]. Однако, при аэрогенном способе инфицирования, белые крысы оказались чувствительными к заражению. Это определило целесообразность изуче

4 ния экспериментальной мелиоидозной инфекции, возникающей после аэрогенного заражения дефектным по Аг8 штаммом В. рзеис1ота11е1 с целью анализа особенностей течения вызываемой им инфекции, что, возможно, может послужить основой для корректировки тактики лечебных, профилактических и диагностических мероприятий при мелиоидозе.

В связи с вышеизложенным было проведено сравнительное изучение патогенетического действия штаммов возбудителя мелиоидоза с раз-• личным антигенным составом при аэрогенном заражении экспериментальных животных. В качестве биологической модели использовались белые крысы. Экспериментально установленная величина ЛД50 при заражении животных атипичным штаммом В. ряеис1ота11е1 100-16-1, составила 1,2 х 105 ж.м.к., что значительно превышало тот же показатель для исходного штамма В. ряеис1ота11е1 100 (ЛД5о =3x10 ж.м.к.). При заражении белых крыс равноэффективными дозами типичного и атипичного (Аг8 ) штаммов возбудителя мелиоидоза наблюдали существенные различия в клинил ческом течении заболевания. Если у животных, заражённых дозой 4x10 : ж.м.к. штаммов В. ряеис1отаЦе1100, возникала острая форма лёгочного мелиоидоза, приводящая через 5-7 сут к 100 % гибели животных, то у крыс, зараженных штаммом В. рзеис1ота1Ш 100-16-1 в той же дозе наблюдали доброкачественное течение острой инфекции, ограничивающееся в основном поражением легких без выраженных признаков септицемии, заканчивающееся выздоровлением до 90% особей.

При заражении экспериментальных животных большими дозами (1x10 ж.м.к.) атипичного штамма В. ряеис1ота11е1 100-16-1, лёгочный ме-лиоидоз протекал по такой же схеме, как и при инфицировании вирулент-: ным штаммом возбудителя. Характеризовался обширной обсемененностью практически всех органов (даже более интенсивной, чем у типичного штамма) и выраженными некротическими измененими в печени.

Иммунохимический анализ на наличие Аг8 у культур В. ряеис1ота11е1 100-16-1, выделенных от павших животных, показал отсутствие реверсии изолятов к исходному фенотипу.

Исследования динамики распространения клеток штамма дикого типа и его антигенного варианта в макроорганизме показали существенные различия. К особенностям процесса диссеминации вирулентного штамма в организме белых крыс можно отнести следующее: локализация микроба в трахее, легких, затем - в регионарных лимфоузлах, развитие бактериемии на 2-3 сутки, попадание в органы системы мононуклеарных фагоцитов и последующее интенсивное размножение клеток возбудителя во внутренних органах с максимальными показателями обсемененности к моменту гибели животных. У больных животных специфическая микрофлора выделялась не только из крови и мочи, но и из слюны.

При небольших дозах заражения (4x10 ж.м.к.) штаммом В. рБеи-. с1ота11е1 100-16-1 закономерность распространения клеток была иной. В течение пяти дней после заражения возбудитель локализовался в месте аппликации инфекта и регионарных лимфоузлах, что указывало на его более низкую инвазивность. Бактериемия была слабо выражена и обнаруживалась у 40 % животных лишь в терминальной стадии заболевания, при этом, в моче возбудитель не выявлялся. Несмотря на наличие элементов воспаления в печени, размножение возбудителя в органах системы мононуклеарных фагоцитов отсутствовало. При доброкачественном течении острой инфекции выраженные патоморфологические изменения наблюдались . только в лёгких, что подтверждалось соответствующими исследованиями.

Таким образом, диссеминация клеток штамма В. рзеис1ота11е1 10016-1 (Аг8") у белых крыс при лёгочном мелиоидозе определялась дозой заражения, что естественно. А отсутствие Аг8, по—видимому, не оказывало существенного влияния на этот процесс при больших заражающих дозах.

Сравнительное изучение патоморфогенеза мелиоидозной инфекции, вызванной полноценным и дефектным по Аг8 штаммами, показало значительные отличия в ее морфологических проявлениях. При аэрогенном заражении штаммом В. рБеис1ота1Ш 100 у белых крыс развивалась острая « лёгочная форма мелиоидоза, для которой было характерно: резкое расстройство гемодинамики в виде полнокровия и гемморагий; выраженные дистрофические процессы в паренхиматозных органах; наличие типичных, преимущественно экссудативного характера, гранулём в печени и селезёнке с выраженными дегенеративными изменениями в составляющих их клетках. В лёгочной ткани патология характеризовалась обширными воспалительными очагами, где преобладали процессы альтерации, экссудации, некроза и деструкции. Резко выраженная гипоплазия, а у некоторых животных аплазия лимфоидной ткани в селезёнке свидетельствовала о подавлении инфектом иммунных процессов и неспособности организма-хозяина сопротивляться инфекции.

Патоморфологическая картина у белых крыс, заражённых дефектным по Аг8 штаммом возбудителя мелиоидоза В. pseudomallei 100-16-1 в дозе 4.8 х 10 м.к., была иной по сравнению с изменениями внутренних органов животных, инфицированных полноценным штаммом. Отличия заключались в отсутствии специфических мелиоидозных гранулём в печени и селезёнке во все сроки исследования; в особенностях проявления воспаления в лёгких, где продуктивные процессы, направленные на отграничение и рассасывание очагов, превалировали над деструктивными; иммуно-морфологических изменениях в селезёнке, которые отражали напряжённость иммунных процессов и соответственно способность организма бороться с инфекцией.

Выявленные особенности патоморфологических изменений легочной ткани аэрогенно инфицированных животных в целом согласуются с известными картинами патоморфогенеза легочной формы мелиоидоза людей [47, 64, 68, 81, 134, 188], что свидетельствует в пользу адекватности выбранных экспериментальных моделей.

Электронно-микроскопические исследования показали, что дефектные по Аг8 клетки В. pseudomallei были подвержены завершённому фагоцитозу, в отличие от клеток вирулентного штамма. Отсутствие экспрессии Аг8 клетками В. pseudomallei 100-16-1 сопровождалось выраженным снижением процесса капсулообразования in vivo. Следует отметить роль капсульных полисахаридных антигенов патогенных буркхольдерий, которые, как было отмечено ранее, являются ведущим фактором устойчи-. вости микробов к воздействию ферментного комплекса фаголизосом клеток макроорганизма [171, 187]. При этом, штаммы В. pseudomallei и В. mallei, дефектные по продукции биополимеров капсулы, демонстрировали значительное снижение вирулентности для различных экспериментальных моделей, и, как следует из данных электронно-микроскопических исследований, были более подвержены завершенному фагоцитозу [76, 95, 167].

Таким образом, полученные результаты подтверждают значение касульного Аг8 в развитии комплекса патоморфологических изменений при различных клинических формах проявления мелиоидозной инфекции , и свидетельствуют о значимости данного антигена в реализации патогенных свойств В. pseudomallei.

Учитывая отличия в патогенезе легочного мелиоидоза, вызванного типичным и мутантным штаммами В. pseudomallei, возникает вопрос о механизмах реализации патогенных свойств штаммом В. pseudomallei 100-161, лишенным одного из главных факторов вирулентности. Естественно было предположить активацию у микроба других патогенетических значимых механизмов, определяющих способность инфекта противостоять действию различных звеньев иммунной системы макроорганизма и колонизи-, ровать органы и ткани организма-хозяина. В первую очередь, мы обратили внимание на способность клеток микроорганизма продуцировать комплекс внеклеточных гидролаз, которые, как известно, выполняют функцию адаптации возбудителя мелиоидоза к изменяющимся условиям обитания [4].

Секретируемые В. pseudomallei ферменты демонстрируют протеоли-тическую и гемолитическую активность, выраженный дермонекротиче-ский эффект [35]. Характерной особенностью экзопротеаз В. pseudomallei является способность гидролизовать компоненты соединительной ткани эластин и коллаген, при этом особое место в развитии патологических явлений при мелиоидозе отводят эластазе Mr 29.5 kDa, которая существенно влияет на процесс инвазии микроба, а также обладает выраженной,способностью расщеплять эластин лёгочной ткани. Вероятно, этим фактором можно объяснить высокий тропизм мелиоидозного микроба к лёгким [15, 21,115].

Для оценки роли экстрацеллюлярных ферментов в патогенезе ме-лиоидозной инфекции были изучены количественные показатели активности комплекса протеаз у типичного и лишенного Аг8 штаммов возбудите, ля, изолированных на разных стадиях развития экспериментального ме-лиоидоза, при различных способах заражения.

У культур В. pseudomallei 100, выделенных от белых крыс при подкожном заражении дозой lx 106 ж.м.к., протеолитическая активность повышалась в 2 - 4 раза в период острой фазы заболевания (2-3 сут), а к 5 суткам показатели протеолиза снижались до исходных величин. Активность комплекса внеклеточных ферментов в отношении ряда субстратов (эритроциты, коллаген, эластин) in vitro уменьшалась, хотя дермонекротическое воздействие in vivo, при этом, несколько возрастало.

При подкожном заражении белых крыс штаммом В. pseudomallei 100 в более высокой дозе (5 х 10 ж.м.к.) отмечали значительное увеличение активности бактериальных ферментов, причём динамика данного увеличения соответствовала стадиям развития инфекционного процесса. После 48-часового периода адаптации, по мере развития патологических явлений в макроорганизме, наибольшие показатели активности ферментов были зарегистрированы на 3 - 4 сутки, в разгар заболевания. о

При подкожном заражении белых крыс дозой 5x10 ж.м.к. штаммом В. pseudomallei 100-16-1, лишенным Аг8, динамика ферментативной ак-. тивности возбудителя соответствовала слабовыраженной картине патоло-гоанатомических изменений внутренних органов и их незначительной бактериальной обсеменённости: протеолитическая и гемолитическая активности практически не отличались от исходного уровня, эластазная и колла-геназная активности заметно снижались, а дермонекротическая активность увеличивалась незначительно, примущественно у культур, выделенных в первые сутки.

Таким образом, анализ активности внеклеточных ферментов типичных и атипичных культур возбудителя мелиоидоза при подкожном заражении показал, что полноценный по антигенному составу штамм при благоприятных для микроба условиях реализует весь потенциал патогенетических механизмов и активизирует все факторы патогенности, которые способствуют повышению инвазии микробных клеток на ранних стадиях развития заболевания. При этом утрата возбудителем мелиоидоза Аг8 не компенсируется значительным усилением ферментативной активности, так как, возможно, уже в первые часы после заражения происходит интенсивное блокирование бактерий клетками СМФ.

При аэрогенном заражении белых крыс штаммом В. pse.udoma.llei 100 о , дозой 4x10 культуры, выделенные от животных имели в 5 раз более высокий уровень протеолитической активности, чем исходный штамм. Гемолитическая, эластазная и коллагеназная активности возрастали незначительно. Максимальный уровень активности бактериальных ферментов отмеча-' ли в разгар заболевания, начиная с 3 суток. Дермонекротической пробы, в отличие от культур, выделенных при подкожном заражении, имели не только зону воспаления, но и зону некроза диаметром до 5 мм.

Нарастание ферментативной активности изолятов при аэрогенном о заражении белых крыс дозой 4x10 ж.м.к. штамма В. р8е^ота1Ш 100-161, дефектного по продукции Аг8, было более выраженным. Имея и без того более высокий по сравнению с типичным штаммом исходный уровень ] протеолитической и гемолитической активностей, на 2 сут после заражения изоляты более чем в 5 раз повышали протеолитическую активность и в 7-10 раз - гемолитическую. Также наблюдали резкое повышение коллагеназной и эластазной активностей, обеспечивающих полный гидролиз субстратов. Динамика изменения дермонекротической пробы соответствовала таковой при заражении типичным вирулентным штаммом.

Увеличение аспирационной дозы при заражении белых крыс штаммом В. рзеийотаИеЬ 100-16-1 до 7107ж.м.к., привело к существенному увеличению протеазной (в 10 раз), гемолитической (в 20 раз) активностей уже на 1 — 2 сутки после инфицирования. В эти же сроки коллагеназная и эластазная активности достигали максимума и сохранялись вплоть до терминальной стадии заболевания.

Таким образом, как в условиях аэрогенного, так и подкожного заражения активировался комплекс внеклеточных энзимов. Штамм В. рзеи-с1ота1Ы 100-16-1 (Аг8"), обладающий заметно большей исходной протео-литической и гемолитической активностью, чем вирулентный штамм В. р8еис1ота11е1 100, продемонстрировал более выраженное возрастание способности экстрацеллюлярных ферментов гидролизовать соответствующие субстраты при аэрогенном заражении. Данный факт свидетельствует о том, что механизм проявления вирулентных свойств возбудителя может быть реализован только в условиях благоприятных для жизнедеятельности патогенных микроорганизмов, которые, в частности, существуют в лёгочной ткани и, таким образом, способ заражения атипичным штаммом В. ръеи-с1ота11е1 100-16-1(Аг8") определяет течение и исход инфекционного процесса в эксперименте.

Учитывая существенную разницу в ферментативной активности при аэрозольном заражении у типичного штамма и штамма, лишенного Аг8, можно рассматривать активизацию внеклеточных энзимов у последнего как один из компенсаторных механизмов реализации патогенности.

Важная роль поверхностных антигенов и секреторных протеаз В. рвеис1отаПе1 в патогенезе мелиоидоза подтверждается также результатами сравнительного изучения процессов активации клеток иммунной системы экспериментальных животных,' инфицированных штаммами В. рБеи-с1ота11е1 и В. ЖаИапс1еп818 различной вирулентности. При выполнении данного раздела исследований мы использовали полноценный в антигенном отношении вирулентный штамм возбудителя мелиоидоза, дефектный по продукции экзопротеаз инсерционный мутант В. р8еис1ота1Ы 56770 99/10 и близкий возбудителю мелиоидоза в антигенном отношении, но авиру-лентный для различных биологических моделей, В. МаИапс1еп515.

Учитывая, что цитокины являются важнейшими иммунорегулятор-ными детерминантами, определяющими характер течения инфекции, были проанализированы различия в экспрессии- генов цитокинов ТЫ (ШЫ-у) и ТЪ2 (1Ь-4, 1Ь-10) - профилей иммунного ответа и макрофаг-стимулирующего интерлейкина 12 (1Ь-12) у белых мышей при экспериментальной инфекции, вызванной соответствующими штаммами.

Известны два основных типа цитокинового ответа при развитии инфекции. ТЫ-цитокиновый профиль, ключевыми компонентами которого являются П^-у, 1Ь-2, ЮТ-Р, и последующая индукция макрофаг-стимулирующего 1Ь-12, приводит к активации профессиональных фагоцитов и возрастанию резистентности макроорганизма к инфекционному агенту, тогда как ТЬ2-цитокиновый ответ, характеризующийся преимущественной продукцией 1Ь-4,1Ь-5,1Ь-6,1Ь-10 и 1Ь-13, напротив, ведет к снижению активности клеточного звена иммунитета [208].

Для сравнительного анализа особенностей клеточного иммунного ответа макроорганизма на инфекцию, вызванную штаммами буркхольде-рий с различным патогенетическим потенциалом использовали полуколичественный метод оценки уровня соответствующих матричных РНК в реакции обратной транскрипции с последующей амплификации (ОТ-ПЦР) [200, 201, 222].

Полученные при выполнении данного раздела результаты свидетельствовали о существенных различиях в экспрессии генов цитокинов при инфекции мышей, вызванной штаммом В. pseudomallei дикого типа, мутантом, недостаточным по продукции экзопротеаз и авирулентным В. thailandensis. Профили экспрессии цитокиновых генов, характерные для полноценного Thl-типа клеточного ответа наблюдались лишь у животных, инфицированных В. thailandensis, и, в несколько меньшей мере, при заражении мутантным штаммом возбудителя мелиоидоза. Инфекционный про: цесс, вызванный В. pseudomallei 100, напротив, характеризовался ранним снижением продукции цитокинов, стимулирующих клеточное звено иммунитета (IFN-y, IL-12), и возрастанием количества мРНК EL-10 к поздним срокам наблюдения, что, по-видимому, является свидетельством ингиби-рования различных звеньев межклеточных взаимодействий и процессов фагоцитоза. Ключевая роль проинфламматорных цитокинов и IL-12 в формировании определенного уровня устойчивости макроорганизма к ме-лиоидозной инфекции отмечалась неоднократно [118, 150, 190]; обнаруженные нами различия в экспрессии данных цитокинов у животных, ин-' фицированных вирулентным штаммом и вариантом, дефектным по продукции экзопротеаз, таким образом, еще раз подтверждают значимость последних в патогенезе мелиоидозной инфекции. Отметим также очевидную перспективность использования данного методического подхода для изучения особенностей патогенеза буркхольдериозов и иммунного ответа макроорганизма на молекулярном уровне.

Изменения экспрессии поверхностных биополимеров клетки является одним из важнейших адаптационных механизмов различных бактериальных патогенов в ходе инфекционного процесса. Выраженные изменения антигенного спектра инфекта при персистировании в организме-хозяине были отмечены у Legionella pneumophila [125], видов Streptococcus [148], Escherichia [151], Salmonella [103], Mycobacterium [113], Neisseria [137] и ряда других грамположительных и грамотрицательных патогенов.

В данном аспекте возбудитель мелиоидоза является пока еще весьма малоизученным видом. Хотя, судя по некоторым данным, антигенная изменчивость В. pseudomallei, проявляющаяся в ходе инфекционного процесса, представляет собой, скорее правило, чем исключение. Так, в исследовании структуры и антигенных свойств ЛПС клинических изолятов возбудителя мелиоидоза было отмечено, что в процессе персистенции микроба в организме больных имеет место заметное изменение антигенного спектра данной поверхностной структуры [55]. Вообще, судя по данным анализа геномной организации патогенных буркхолдерий, эти микроорганизмы обладают разнообразными генетическими механизмами контроля изменения уровня экспрессии селективно значимых поверхностных антигенных комплексов. Упомянем здесь, в частности, механизмы регуляции ^ экспрессии значимых в патогенетическом отношении биополимеров В. pseudomallei и В. mallei, связанные с изменениями соответствующих регу-ляторных геномных последовательностей [73, 172].

Нами было проведено изучение изменений в уровне продукции отдельных поверхностных антигенов у штаммов В. pseudomallei, выделенных в различные сроки от экспериментальных животных (белых крыс и морских свинок) с различными способами инфицирования и клиническими формами заболевания. Для анализа продукции поверхностных антигенов использовали иммуноблоттинг с IgG адсорбированной кроличьей сыворотки к комплексу Аг8 В. pseudomallei. Был исследован антигенный спектр тотальных лизатов клеток, а также препаратов клеточных мембран штаммов В. pseudomallei.

Иммуноблоттинг суммарных клеточных антигенов В. pseudomallei 100 и его авирулентного производного В. pseudomallei 100-16-1, выделенных из легких белых крыс с различными клиническими формами аэрогенной инфекции с использованием IgG адсорбированной кроличьей сыворотки к комплексу Аг8, показал значительное повышение уровня продукции антигена 200 kDa (основного структурного компонента комплекса Аг8) у штамма дикого типа, изолированного от животного с развившейся острой формой легочной инфекции. Отметим также, что культура штамма В. pseudomallei 100-16-1, выделенная от животного с доброкачественным течением инфекции, сохраняла дефект продукции антигена 200 kDa.

Иммуноблоттинг препаратов клеточных мембран культур выявил увеличение уровня продукции мембранных белков 27, 42 и 90 kDa и заметное снижение экспрессии мембранного белка 110 kDa у культур штамма В. pseudomallei 100 от животных с острой формой инфекции.

Штамм В. pseudomallei 100-16-1 (Аг8"), изначально характеризовался сниженным уровнем продукции, мембранных антигенов 42 и 90 kDa и отсутствием экспрессии белка 110 kDa. У культур В. pseudomallei 100-16-1, выделенных от животного с доброкачественным течением аэрозольной инфекции, наряду с существенным снижением продукция белка размером 39 kDa, наблюдали появление выраженной экспрессии белка 42. При острой инфекции после подкожного заражения этим же штаммом картина была несколько иной: значительно увеличивалась продукция белков размером 39, 42 и выявлялась экспрессия антигена 90 kDa. Отличия от типичного штамма заключались только в отсутствии экспрессии продукции белка * 110 kDa.

Во многом сходные результаты были получены при анализе изменений продукции антигенов клеточных мембран у культур В. pseudomallei 100, выделенных от инфицированных внутрибрюшинно белых крыс. Нами было отмечено увеличение уровня продукции мембранных протеинов 27, 39, 42 и 90 - 120 kDa у культур штамма, выделенных от животных с развившейся острой формой инфекции.

Заключительным этапом исследований была оценка эффективности использования имеющегося коммерческого иммунодиагностического препарата «Тест-системы иммуноферментной для обнаружения антигенов сапа и мелиоидоза» для исследования проб биологического материала, взятых в различные сроки от животных, экспериментально инфицированных типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.

В пробах органов от животных с острой аэрогенной формой заболевания, зараженных типичным штаммом В. р8вис1ота11е1 100, детекция антигенов была положительной, начиная со 2 суток и далее в течение всего срока наблюдения. При моделировании острой формы инфекции с под. кожным заражением, положительные пробы отмечены в более поздние сроки, на 7 - 9 сутки наблюдения.

Анализ проб от животных с острой и хронической формами мелиоидоза, вызванного штаммом В. ряеийотсЛШ 100-16-1 показал, что в случае аэ-рогенно инфицированных животных с развившейся в дальнейшем острой формой заболевания, положительные результаты ТИФА также отмечались в ранние сроки (3 сутки и далее).

Таким образом, «Тест-система иммуноферментная для обнаружения антигенов сапа и мелиоидоза» может использоваться для детекции атипич-. ного вариантов возбудителя мелиоидоза, лишенных Аг8, в пробах биологического материала при экспериментальной инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Перепелицына, Светлана Валерьевна, Саратов

1. Алексеев В.В, Кивокурцева Т.Ю., Замараева C.B. Экологические аспекты механизма адаптации возбудителя мелиоидоза // Поволжский экологический вестник. Волгоград, 2002. - В.9. - С. 203 - 204.

2. Алексеев В.В., Тихонов Н.Г., Вязьмина Т.Н. Патогенез, патологическая анатомия и патологическая морфология мелиоидоза // Ме-лиоидоз: Сб. науч.тр. Волгоград, 1995. - С.91 - 119.

3. Аксёнов М.Ю., Гинсбург A.JI. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. - №4. -С. 3-8.

4. Антонов Ю.В., Илюхин В.И., Поповцева Л.Д. Чувствительность псевдомонад к современным антибактериальным препаратам // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - Т.36, № 1. - С. 14 - 16.

5. Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В. и др. Использование ПЦР для идентификации Burkholderia mallei Н Мол. генет., мик-робиол., и вирусол. 2004. - № 1. - С. 12 - 17.

6. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Гос изд-во мед. лит. 1962.- 181 с.

7. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдо-монозы // М.: Медицина. 1990. - 138 с.

8. Вертиев Ю.В. // Журнал микробиол., эпидемиол., иммунобиол.-1987. № 3. - С.86-93.

9. Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Смирнова В.И. Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций // Материалы Российской научной конференции Волгоград, 1992. - 82 с.

10. Вязьмина Т.Н., Тихонов H.F., Лесовой B.C. Патоморфология экспериментального мелиоидоза в зависимости от антигенного строения возбудителя // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Волгоград, 1992. - 84 с.

11. Изучение особенностей патогенеза экспериментального лёгочного при заражении штаммами B.pseudomallei, обладающими различными свойствами. Отчёт о НИР (заключительный) / Волгоградский н.-и. противочумный институт. Руководители Алексеев

12. B.В., Вязьмина Т.Н. Волгоград, 1998. - ГР 01.9.50001.341. - 48 с.

13. Илюхин В.И., Авчукова Л.В. Гемолизины патогенных псевдомонад // Особо опасные инфекционные заболевания;, диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей. Сб. на-уч.тр. Волгоград, 1990. - Вып.4. - С. 89 - 91.

14. Илюхин В.И., Батманов В.П. Клиника и лечение мелиоидоза // Мелиоидоз: Сб. науч.тр. Волгоград, 1995. - С.142 - 147.

15. Илюхин В.И., Замараев B.C., Батманов В.П. и др. Мелиоидоз // Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. -Саратов, 1998 Т.2 - С.115 - 143.

16. Илюхин В.И., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г. Burkholderia thailan-densis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция // Мол. генет., микробиол., вирусол. 2002. - №1.1. C.7-11.

17. Илюхин В.И., Храпова П.Н., Замараев B.C. Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней // Сап Саратов, 1998 -Т.2.-С. 101 - 114.

Информация о работе

Перепелицына, Светлана Валерьевна
кандидата медицинских наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Особенности экспериментального легочного мелиоидоза, вызванного штаммами Burkholderia pseudomallei с различным антигенным составом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы