Протективные свойства мелиоидозных моноклональных антител

Дрефс, Наталья Михайловна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Протективные свойства мелиоидозных моноклональных антител
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Протективные свойства мелиоидозных моноклональных антител"

На правах рукописи

я/-

□03067259

ДРЕФС Наталья Михайловна

ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА МЕЛИОИДОЗНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Волгоград 2006

003067259

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор

Храпова Наталья Петровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Девдариани Зураб Леванович доктор биологических наук Карпунина Лидия Владимировна

Ведущая организация: Ставропольский НИПЧИ

Защита состоится -f¿ [МАРТА 2007г. в « /3с» часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб»

Автореферат разослан « Ц УХреьрцля 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Слудский А.А.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Мелиоидоз - особо опасная инфекция людей и животных, регистрируемая в эндемичных регионах Юго-Восточной Азии и Австралии (Smith M.D.et al., 1995, Dance D.A., 2000, Puthucheatry S.D., Vadivelu J., 2002).

Возбудитель заболевания Burkholderia pseudomallei выделяют из внешней среды регионов, расположенных в зоне 20° севернее и южнее экватора (Sexton М.М. et al., 1993, Brook M.D. et al., 1997, Trakulsomboon S. et al., 1999). Инфицирование происходит при попадании микроорганизма в раны или повреждения кожи, а также при вдыхании, контаминированной им пыли (Leelarasamee A., Bovornkitti S., 1989; Hirst H.G.et al., 1992; Leakey A.K. et al., 1998).

Частота возникновения заболеваний мелиоидозом существенно выше в Юго-Восточной Азии и северных провинциях Австралии по сравнению с другими регионами приэкваториальной зоны (Chaowagul W. et al., 1989; Leelarasamee A., Bovornkitti S., 1989; Dance D.A., 1991, Currie B.J. et al., 1993, Coenye Т., LiPuma J.J., 2003). Наиболее высокий уровень заболеваемости отмечен в ряде районов Таиланда, где В pseudomallei является причиной 20 % септицемии и приблизительно 40-70 % летальных исходов вследствие бактериального сепсиса (Chaowagul W. et al., 1989, Dance D.A., 1991; Puthucheatry S.D., Vadivelu ]., 2002).

Группами риска приобретения мелиоидоза считают лиц, временно находившихся в эндемичных регионах (туристов, бизнесменов, представителей воинских контингентов) (Dance D.A., 1990, Yabuuchi Е., Arakawa М., 1993).

Вопросы защиты населения от инфицирования В pseudomallei приобретают все большую актуальность не только в зонах ее эндемичного распространения, но и в странах, где наличие этой инфекции ранее не отмечали. Это связано с возросшим уровнем миграции населения, интенсификацией туристических и деловых поездок, повышающих вероятность завоза инфекции в различные страны, в том числе в Россию, из зон ее распространения.

Наибольшую опасность появления массовых заболеваний людей связывают с угрозой возникновения чрезвычайных ситуаций, обусловленных применением потенциальных биологических агентов, в число которых входит и возбудитель мелиоидоза [Руководство ВОЗ, 2001, Coenye Т., LiPuma J.J., 2003].

В pseudomallei вызывает целый спектр многообразных клинических форм заболевания, трудно поддающихся лечению, характеризующихся высокими показателями рецидивирования, несмотря на длительное лечение, и высоким уровнем летальности (Smith M.D. et al., 1987, Leelarasamee A., Bovorukitti S., 1989, White N.J. et al., 1989, Punyagupta S., 1989, Chaowagul W. et al., 1993, Yabuuchi E., Arakawa M„ 1993, Ip M.L.et al., 1995, Sirisinha S.et al., 2000, Currie B.J. et al., 2002, Puthucheatry S.D., Vadivelu J., 2000, 2002, Samuel M., Ti T.Y. 2002).

Средства специфической профилактики мелиоидоза отсутствуют (Brett P. J., Woods D. Е., 2000). Поиск альтернативных средств профилактики и лечения мелиоидоза ведется постоянно. Предметом обсуждения специалистов все чаще становятся вопросы использования иммуноглобулиновых препаратов для пассивной защиты от инфицирования В. pseudomallei (Bryan L.E. et al., 1994, Brett P.J. et al., 1994, Brett P.J.,Woods D.E., 1996).

Сведения о протективном потенциале мелиоидозных антител ограничены, а их роль в защите от В. pseudomallei до конца не определена (Charuchai-montri С. et al., 1992, Pethanjanapong V. et al., 1992, Chenthamazakshan V. et al., 2001). Практически важной представляется проблема использования для создания пассивного иммунитета высокоактивных моноклональных антител (МКА) заданной специфичности (Новицкая И.В. с соавт., 1989, 1994, 1995, Тихонов Н.Г. с соавт., 1991, Brett P.J., 1997, Steinmetz I. et al., 2002, Jones S. et al., 2002, Bottex C. et al., 2005).

Принимая во внимание важность проблемы защиты населения от мелиоидоза, в том числе вопросов серопрофилактики и серотерапии этой инфекции, было определено направление исследований по изучению роли антител в защите макроорганизма от В. pseudomallei в эксперименте.

Цель работы - изучение протективного потенциала поли- и моноклональных иммуноглобулинов против антигенов Burkholderia pseudomallei, экспонированных на поверхности бактерий.

Задачи исследования:

1) тиражирование in vitro и in vivo гибридом-продуцентов МКА к антигенам В pseudomallei, накопление препаративных количеств МКА, их характеристика;

2) получение высокоактивных поликлональных кроличьих антител к антигенам В. pseudomallei и определение спектра их специфической активности;

3) оценка бактериостатических свойств мелиоидозных поли- и моноклональных антител различной эпитопной направленности и разработка теста задержки роста В pseudomallei, предварительно опсонизированных антителами, на плотной питательной среде;

4) оптимизация условий постановки опсоно-фагоцитарной реакции на этапах оценки протективного потенциала МКА различной эпитопной направленности, изучение влияния опсонизации В. pseudomallei на антифагоцитарную активность микробных клеток возбудителя мелиоидоза;

5) изучение протективных свойств мелиоидозных МКА in vivo.

Научная новизна

Получены новые данные о роли гуморальных антител в защите макроорганизма от возбудителя мелиоидоза. Проведено комплексное исследование протективных свойств поликлональных и моноклональных иммуноглобулинов, взаимодействующих с антигенами, локализованными на поверхности В. pseudomallei, изучено влияние антител различной эпитопной направленности на процесс иммунного фагоцитоза, представлены доказательства эффективности пассивной защиты мышей от экспериментального мелиоидоза.

Впервые определены оптимизированные условия оценки бактериостати-ческого потенциала мелиоидозных антител в тесте задержки роста бактерий на плотной питательной среде. Показано, что предварительная опсонизация В psendomallei антителами приводит к нарушению функций роста и размножения микроорганизмов.

Оптимизированы условия постановки опсоно-фагоцитарной реакции с применением широкого набора МКА различной эпитопной направленности, позволяющей исследовать один из механизмов иммунного фагоцитоза при экспериментальном мелиоидозе. Установлено, что предварительная опсонизация В. pseudomallei моноклональными антителами снижает антифагоцитарную активность бактерий, приводя к увеличению числа поглощенных клеток по сравнению с контролем, повышает активность фагоцитов мыши. Проведен сравнительный анализ различных типов МКА в блокировании эпитопов, экспонированных на поверхности микробных клеток В. pseudomallei, выявлены те варианты МКА, использование которых в данной реакции, обеспечивает эффективность процесса поглощения тест-объектов фагоцитами мыши в первые три часа после заражения.

Показано, что превентивное введение моноклональных иммуноглобулинов различной эпитопной направленности оказывает существенное влияние на течение экспериментального мелиоидоза. Эффективность превентивного введения in vivo моноклональных иммуноглобулинов в режиме экстренной профилактики зависит от особенностей штамма В. pseudomallei и от величины инфицирующей дозы. Установлено, что ряд МКА, взаимодействующих с эпи-топами Аг 8, Аг 6 и эпитопами, экспонированными как на Аг 8, так и Аг 6, достоверно увеличивают сроки средней продолжительности жизни экспериментальных животных и повышают показатели выживаемости особей до 50 -100 %.

Практическая ценность

Полученные данные представляют интерес для сотрудников специализированных лабораторий, занимающихся вопросами иммунопрофилактики особо опасных инфекционных заболеваний, и могут быть использованы в научно-исследовательской работе при разработке профилактических средств защиты от В, pseudomallei.

Тест задержки роста бактерий, предварительно опсонизированных антителами, адаптирован к работе с возбудителем мелиоидоза. Условия проведения исследования, направленного на оценку бактериостатического потенциала МКА различной эпитопной направленности, отражены в «Методических рекомендациях по оценке бактериостатических свойств мелиоидозных моноклональных антител in vitro» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 27.12.2000 г., протокол № 14 и утверждены директором института). Предлагаемый способ рекомендован в качестве дополнительного метода исследования, позволяющего достаточно просто произвести отбор различных типов МКА, взаимодействующих с эпитопами, экспонированными на поверхности микробных клеток В. pseudomallei, блокирование которых иммуногло-

булинами в присутствии или отсутствии комплемента приводит к нарушению функций роста и размножения В pseudomallei in vitro. Получаемые сведения о бактериостатическом потенциале МКА узкой специфичности облегчают целенаправленный отбор средств пассивной защиты от возбудителя мелиоидоза.

Оптимизированные условия постановки опсоно-фагоцитарной реакции, обобщенные в «Методических рекомендациях по применению опсоно-фагоцитарной реакции для оценки превентивного потенциала МКА различной эпитопной направленности» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 23.06.2004, протокол № 6 и утверждены директором института), позволяют исследовать один из механизмов иммунного фагоцитоза при экспериментальном мелиоидозе. Данный способ пригоден для анализа уровня функциональной активности фагоцитов хозяина в отношении В. pseudomallei, предварительно инкубированных с антителами.

Практически значимыми являются характеристики индивидуальных образцов моноклональных антител, применявшихся в работе, в части их бакте-риостатического потенциала, эффективной опсонизации В pseudomallei, снижающей антифагоцитарную активность бактерий, и способности защищать от патогена при введении их мышам в режиме экстренной профилактики. Апробированные схемы пассивной иммунизации животных могут быть востребованы профильными специалистами при разработке средств защиты от возбудителя мелиоидоза.

Материалы диссертационной работы включены в цикл лекций по диагностике, лечению и профилактике особо опасных инфекций на курсах подготовки специалистов: «Курсы первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям» при ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Опсонизация микробных клеток В. pseudomallei антителами нарушает их функции роста и размножения. Критерием эффективности опсонизации В. pseudomallei антителами in vitro служит относительный показатель подавления роста бактерий на плотной питательной среде.

2. Дополнительным способом отбора образцов иммуноглобулинов, рассматриваемых в качестве средств пассивной защиты от экспериментальной инфекции, является определение показателей бактериостатической активности антител в тесте задержки роста В pseudomallei, опсонизированных антителами, на плотной питательной среде.

3. Опсоно-фагоцитарная реакция, адаптированная к работе с В pseudomallei, позволяет оценивать функциональную активность фагоцитов мыши в отношении возбудителя мелиоидоза, предварительно опсонизированного антителами in vitro.

4. Применение МКА различной эпитопной направленности в режиме экстренной профилактики инфекции изменяет течение экспериментального

мелиоидоза, увеличивая сроки средней продолжительности жизни животных и процент выживших особей в опытных группах по сравнению с контролем. Эффективность превентивного введения МКА in vivo зависит от их протек-тивного потенциала, особенностей штамма В pseudomallei и инфицирующей дозы патогена.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 15 рисунками и 17 таблицами. Состоит из введения, обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения и выводов. Список использованных источников литературы включает 177 работ (40 отечественных и 137 зарубежных).

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (г. Москва, 2001 г), конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ (г. Киров, 2003 г), на Российской научно-практической конференции с международным участием «Роль клинической микробиологии в профилактике внутрибольничных инфекций» (г. Москва, 26-27.10.2004 г.), конференции молодых ученых Волгоградского НИПЧИ (18.06.2004 г.), итоговой научной конференции Волгоградского НИПЧИ (27.05.2005 г.), VI-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (13-14.09. 2005 г.) и VIl-й Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (3-5.10.2006 г., г. Оболенск).

Публикации

Основные положения диссертации отражены в 16 печатных работах.

Основное содержание работы

Материалы и методы исследований. В работе использованы: 1) музейные штаммы возбудителя мелиоидоза В. pseudomallei 100, С-141, 56830 из коллекционного центра института; 2) линии мышиных перевиваемых гибридных клеток-продуцентов МКА против поверхностно локализованных антигенов В pseudomallei из коллекции лаборатории иммунодиагностики и биотехнологии института, постоянно сохраняемые в жидком азоте при - 196 °С; 3) лабораторные животные из питомника Волгоградского НИПЧИ (12 кроликов породы «Шиншилла», массой 2,5-3 кг, 800 белых мышей аутбредных массой 18-20 г обоих полов, и 150 белых мышей линии BALB/c, массой 1216 г обоих полов).

Водорастворимые антигены В. pseudomallei (ВСЭ) готовили из обеззараженных ацетоном сухих клеток методом водно-солевой экстракции. Аф-финно очищенные антигены Аг 8 (гликопротеин капсульной субстанции) и

Аг 6 (в составе ЛПС) были предоставлены сотрудниками лаборатории иммунодиагностики и биотехнологии.

Источником поликлональных мелиоидозных антител являлись гипериммунные кроличьи сыворотки, полученные после проведения двум группам животных 2 циклов иммунизации обеззараженными взвесями B.pseudomallei 100 и С141 соответственно.

МКА накапливали в препаративных количествах после размораживания 13 различных гибридом-продуцентов и проведения всех последовательных этапов их тиражирования in vitro и in vivo (Храпова Н.П. с соавт., 1997). Для культивирования клеток использовали среду RPMI-1640 (ф. Gibco), эмбриональную телячью сыворотку (ф. HyClone) и пластиковую посуду (ф. Nunc). Антителопродукцию контролировали с помощью непрямого варианта ТИФМ. Твердую фазу (поливинилхлоридные пластины) нагружали ВСЭ возбудителя мелиоидоза. Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов мыши для ТИФМ готовили по методу Н.Ф.Янкиной, Л.И. Ванеевой (1985).

Поли- и моноклонапьные иммуноглобулины выделяли из гипериммунных кроличьих сывороток и асцитических жидкостей мышей соответственно по методу осаждения белка сульфатом аммония при 50 % насыщения (О'Веггу Р.А., 1964). Все образцы иммуноглобулинов стерилизовали мембранной фильтрацией (0,45ц), определяли концентрацию белка в них, ампулировали и хранили при - 20 °С до момента использования.

Специфическую активность поликлональных иммуноглобулинов определяли в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА), непрямом методе флуоресцирующих антител (НМФА) и непрямом варианте твердофазного иммуно-ферментного метода (ТИФМ). Активность МКА контролировали в ТИФМ и НМФА.

Бактериостатические свойства мелиоидозных поли- и моноклональных антител в отношении бактерий В. pseudomallei 100, C-14I, 56830 определяли в тесте задержки их роста на плотной питательной среде (Дрефс Н.М. с соавт., 2000). Бактерии опсонизировали антителами in vitro (по 5, 25 или 50 мкг на 100 м.к.) в течение 30, 60 и 90 мин при 37 °С, при наличии/отсутствии в реа-гентной смеси комплемента, затем по 100 микробных клеток из каждого варианта опыта высевали на три чашки Петри с МПА с 5 % глицерина, рН 7,2. Высев интактных бактерий (100 м.к.) на среду выращивания являлся контролем ее качества. Посевы инкубировали при 37 °С в течение 1-2 сут. После учета КОЕ производили расчет относительных показателей числа выросших колоний по сравнению с контролем (%).

Характер взаимодействия фагоцитов мышей с бактериями В pseudo-mallei 100, С-141, 56830, опсонизированными антителами, определяли с помощью комбинированного варианта опсоно-фагоцитарной реакции, состоявшего из последовательных этапов: in vitro (опсонизация B.pseudomallei антителами) - in vivo (заражение мышей взвесями опсонизированных бактерий) - in vitro (взятие крови, инкубация индивидуальных образцов крови с тест-объек-

тами, приготовление мазков-препаратов, их окрашивание и просмотр). В качестве тест-объектов для поглощения фагоцитами хозяина применяли микроорганизмы (Candida albicans) или латексные частицы.

При микроскопировании окрашеных мазков определяли соотношение полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) с фагоцитированными микробами и без них, а также число фагоцитированных частиц в 100 фагоцитах и производили расчет процента активных фагоцитов (АФ), фагоцитарного индекса (ФИ), фагоцитарного числа (ФЧ) и индекса насыщения фагоцитов микрообъектами (ИНФ). Индекс насыщения фагоцитов микрообъектами рассчитывали по формуле (ФИГ ФИз): ФИ]. Положительные значения ИНФ свидетельствовали о повышении уровня активности фагоцитов мыши, отрицательные значения ИНФ - о его понижении.

Оценку протективности МКА in vivo в режиме экстренной профилактики мелиоидоза осуществляли, моделируя инфекционной процесс на аутбред-ных мышах. Группам мышей (по 6 особей) за 2 ч до заражения внутрибрю-шинно вводили индивидуальные образцы МКА в дозе 1 мг/мышь. Дополнительная группа мышей получала препарат сравнения - иммуноглобулины, выделенные из сыворотки интактных животных. Через 2 ч животных внутри-брюшинно заражали В pseudomallei, используя дозы от 10 LD50 до 50 LDSo-Срок наблюдения за животными составлял 30 сут. После завершения опыта производили расчет показателей средней продолжительности жизни (СПЖ) и % выживших животных в каждой из групп. Использовали также показатель «процент защиты», согласно которому увеличение выживаемости на 20 % и более в опытной группе относительно показателя выживаемости животных, получавших препарат сравнения, позволяет считать испытуемый препарат эффективным средством (Таран Т.В., 2004).

Статистическую обработку результатов, полученных при выполнении работы, проводили с помощью методов вариационной статистики (Ашмарин И. П., Воробьев А. А., 1962), а также компьютерной программы « STATISTICA 6.0».

Основные результаты исследования и их обсуждение

Опсонизация патогенных микроорганизмов антителами является одним из наиболее важных механизмов защиты макроорганизма.

Для изучения опсонизации B.pseudomallei антителами in vitro были выполнены эксперименты по оценке влияния этого процесса на функциональное состояние микробов, в частности на их способность расти и размножаться на плотных питательных средах. Для этого был использован тест задержки роста бактерий на плотной питательной среде после предварительной инкубации бактерий трех различных штаммов В pseudomallei с поли- и моноклональны-ми антителами. На модели возбудителя мелиоидоза такие исследования были проведены впервые.

Результаты контроля специфической активности образцов поли- и моно-клональных антител, использованных в работе, представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1 - Специфическая активность поликлональных антител

Наименование сывороток Титр антител в

РИГА ТИФМ НМФА

Сыворотка диагностическая мелиоидозная кроличья (серия 5223) против антигенов В рзеис!ота11е1 100 6,4 КГ4 МО"6 1,6 -10'3

Сыворотка диагностическая мелиоидозная кроличья (серия 5504) против антигенов В р$еи<1ота11е1 С-141 1,6 Ю"4 МО"5 1,6-Ю-3

Таблица 2 - Свойства мелиоидозных МКА, использованных в работе

Наименование Эпитопная направленность МКА Результаты проверки приготовленных образцов МКА

МКА РИД3 НМФА6 ТИФМ (титры)

Оп 1 группа специфичности - взаимо- + + 1 10"4- 1 10"'

ю2 действуют с эпитопами, экспониро- + + 1,2 Ю-2

2А6 ванными на Аг 8 (гликопротеине) + + 110"5

2Н7 В. рзеис!ота11е1 + + I 10"7 ыо-'-но-6

ММРрш2 + +

2Р„ II группа - против эпитопов на Аг 6 + + МО"6- 1-Ю"'

(фрагменте ЛПС) + + МО"6

2А8 + + 1-Ю"6

]>5 III группа - против эпитопов, об- + + МО"*' МО'^-МО"6

208 щих для Аг 8 и Аг 6 + +

1р4 + + 4-10"'

1Е10 1Угруппа - против эпитопов на КС, + + 110"'

2Е5 но не Аг 8 и не на Аг 6 + + МО"5-! 10"6

а - контроль видовой принадлежности и гомогенности препарата, 6 - контроль взаимодействия с антигенами поверхности м.к в разведении 1 10"3

Установлено, что предварительная опсонизация бактерий антителами приводила к замедлению темпов роста В р$еис1ота11е'1 на плотной питательной среде. Сравнительный анализ относительных показателей числа выросших колоний в опытных и контрольных чашках показал, что все типы антител обладали определенным уровнем бактериостатической активности. Ее проявления, обусловленные взаимодействием с эпитопами на поверхности микробных клеток, зависели от концентрации иммуноглобулинов, особенностей штаммов В. рьеийотсйЫ, времени предварительной опсонизации, а в ряде случаев и от присутствия комплемента.

Поликлональные сыворотки, содержащие гетерогенный пул антител к антигенам В. pseudomallei, проявили себя как относительно слабые реагенты в тесте задержки роста бактерий на плотной питательной среде.

Бактериостатический потенциал МКА, взаимодействующих с эпитопа-ми Аг 8, и МКА против эпитопов Аг 6 в составе ЛПС В pseudomallei, был значительно выше, чем поликлональных иммуноглобулинов. Получены доказательства того, что эффективное блокирование поверхностно локализованных эпитопов, приводящее к нарушению темпов роста бактерий, может быть достигнуто в результате экспериментального подбора индивидуальных образцов моноклональных иммуноглобулинов, взаимодействующих с эпитопами антигенов, отнесенных к факторам вирулентности возбудителя мелиоидоза (Аг 8 и Аг 6).

Наиболее эффективными опсонинами, действие которых реализовалось в подавлении роста 50 % бактерий и более, высеянных на плотную питательную среду, являлись МКА I (Gn и ММРрт-2) и II (2Fn и 2Ag) групп специфичности против эпитопов Аг 8 и Аг 6 соответственно.

Использование МКА узкой специфичности позволило получить новые данные об их бактериостатическом потенциале, а также подтвердить наличие штаммовых отличий в спектре поверхностных антигенов В pseudomallei.

Так, при работе с высоковирулентным штаммом В pseudomallei 100 для проявления бактериостатической активности МКА Gn и ММРрш-2 обязательным было присутствие С' в реагентной смеси на этапе предварительной опсо-низации бактерий. В то же время, МКА 2Fn и 2А8 реализовывали свой бактериостатический потенциал и без С'.

Эффективно опсонизировать В pseudomallei С-141 удавалось лишь в единичных случаях, используя МКА Gn в дозах 25-50 мкг на 100 м.к., времени контакта не менее 60 мин, вне зависимости от присутствия С'.

Подавление роста (на 50 % и более) микробных клеток В pseudomallei 56830 регистрировали после их контакта с МКА Gn, MMPpm-2 в диапазоне концентраций антител от 5 до 50 мкг на 100 м.к., вне зависимости от присутствия С' и при длительности контакта от 30 до 90 мин. Бактериостатическая активность МКА 2Fn была выявлена при концентрации антител не менее 25 мкг на 100 м.к., времени контакта - 60-90 мин, вне зависимости от присутствия С'. МКА 2А8 были малоэффективными опсонинами В. pseudomallei 56830

Результаты одного из экспериментов с использованием МКА в концентрации 50 мкг/100 м.к. представлены графически на рисунке 1.

При выполнении данного раздела были получены приоритетные данные об эффективном способе оценки бактериостатической активности антител in vitro. Установлено, что показатели специфической активности антител в общепринятых серологических тестах не могут служить критерием отбора таких вариантов антител, которые обладают выраженным бактериостатическим потенциалом. Для оценки эффективности опсонизации микробных клеток В pseudomallei in vitro необходимо проводить индивидуальное тестирование каждого образца МКА, определяя показатели задержки роста бактерий на

плотной питательной среде с учетом факторов времени, концентрации антител и наличия/отсутствия С'.

мим

□ ■ - положительный результат

- отрицательный результат ■ (подавление роста бактерий на

50 % и более)

Рисунок 1 Относительные показатели (%) бактериостатической активности антител, использованных для оп-сонизации В pseudomallei 100 (концентрация иммуноглобулинов 50 мкг на 100 м к , время контакта - 30, 60 и 90 мин , МКА -2А8, 2А6, 2F11, Gl 1, РрМш2, К - нормальный мышиный иммуноглобулин)

В целом, для изучения бактериостатических свойств мелиоидозных МКА различной эпитопной направленности впервые был предложен и апробирован тест задержки роста В. pseudomallei на плотной питательной среде, позволяющий вести целенаправленный отбор таких вариантов моноклональ-ных иммуноглобулинов, которые эффективно блокируют поверхностно локализованные эпитопы биополимеров, отнесенных к факторам вирулентности возбудителя мелиоидоза. Оптимизированные условия его воспроизведения и критерии оценки получаемых результатов явились основой для составления «Методических рекомендаций по оценке бактериостатических свойств мелиоидозных МКА in vitro» (Дрефс Н.М. с соавт., 2000).

Предлагаемый способ рекомендован в качестве дополнительного теста исследования при идентификации тех сайтов связывания на поверхности микробных клеток В pseudomallei, блокирование которых иммуноглобулинами приводит к нарушению функций роста и размножения данного микроорганизма. В случае работы с панелями МКА данный методический прием позволяет достаточно быстро проводить скрининговые исследования по отбору индивидуальных образцов иммуноглобулинов с высокими показателями бактериостатической активности для их последующего тестирования в качестве средств пассивной защиты от возбудителя мелиоидоза.

Известно, что гуморальные антитела, опсонизирующие микроорганизмы, участвуют в реализации механизмов иммунного фагоцитоза - одного из

ключевых звеньев в патогенезе инфекционного процесса. В макроорганизме микробы с выраженной антифагоцитарной активностью успешно уклоняются от фагоцитирования ПМЯЛ и макрофагами, но после опсонизации антителами становятся доступными для поглощения фагоцитами хозяина.

При мелиоидозе роль иммуноглобулинов в опсонизации бактерий изучена недостаточно полно. Перспективным направлением в идентификации биополимеров В ръеийотсйЫ, ответственных за антифагоцитарную активность, признано использование МКА разноэпитопной направленности с целью блокирования гомологичных им участков поверхностных структур клетки, и последующего изучения опсонизированных бактерий во взаимодействии с фагоцитами хозяина. С появлением МКА в арсенале средств детекции единичных эпитопов стало возможным проведение экспериментов по обнаружению тех участков структурных компонентов микробной клетки, блокирование которых снижает антифагоцитарный потенциал исследуемых микроорганизмов.

Использование комбинированного варианта опсоно-фагоцитарной реакции позволило оценить характер взаимодействия опсонизированных антителами бактерий с фагоцитами мыши с одновременным определением эффектов опсонизации микрообъекта и его поглощения фагоцитом.

Обнаружено, что предварительная опсонизация В ряеис1ота11е1 антителами поликлональной мелиоидозной сыворотки лишь незначительно понижала антифагоцитарную активность микробов, о чем свидетельствовала недостаточная для насыщения микрообъектами фагоцитов концентрация поликло-нальных антител к антигенам, экспонированным на поверхности В. р$еис1ота1Ш.

Предварительная опсонизация В. р$еис!ота11е\ мелиоидозными МКА снижала антифагоцитарную активность бактерий. Была определена их сравнительная эффективность в блокировании эпитопов, экспонированных на поверхности микробных клеток трех штаммов В р$еис1ота1Ш, и выявлены варианты МКА, обеспечивающие максимальное поглощение фагоцитами тест-объектов, о чем свидетельствовали положительные значения ИНФ.

В этих опытах определена зависимость результатов реакции от индивидуальных особенностей использованных в ней штаммов В. ръеийотаНег, что подтвердило наличие штаммовых отличий в спектрах поверхностных антигенов данного микроорганизма. Установлено также, что степень активизации поглотительной функции фагоцитов крови коррелирует с вирулентностью штамма, взятого для моделирования инфекционного процесса.

Наибольшим потенциалом в снижении антифагоцитарной активности поверхностных биополимеров клеток В р$еийота\1е\ 100, В рхеийотЫЫ С-141 и В. рзеис1ота1Ш 56830 обладали антитела, взаимодействующие с эпито-пами Аг 8 и Аг 6: для В. рвеМота\Ы 100 - МКА I (Ррт2, Ю2) и II (Щ, 2Р„) групп специфичности, а также нормальные иммуноглобулины мыши; для В р$еи<1ота\Ы С-141 - МКА II (1РЬ 2РП) группы специфичности и нормальные иммуноглобулины мыши; для В р$еис1ота11е1 56830 - МКА I (вц) группы специфичности. В то же время, отмечено, что не все эпитопы, узнаваемые МКА и экспонированные на Аг 8 и Аг 6, ответственны за антифагоцитарную

активность микробных клеток и противодействие фагоцитозу in vivo (рис.2, 3, 4).

Нормальные иммуноглобулины мыши (препарат сравнения) также снижали антифагоцитарную активность В pseudomallei, что было обусловлено присутствием в препарате кросс-реактивных антител к непатогенным псевдомонадам (фоновых антител).

На основе обобщенных экспериментальных данных были разработаны "Методические рекомендации по применению опсоно-фагоцитарной реакции для оценки превентивного потенциала МКА различной эпитопной направленности", предназначенные для сотрудников специализированных лабораторий (Дрефс Н.М., 2004). Практическое значение имеют данные, позволяющие судить о наиболее значимых из поверхностно локализованных биополимеров (Аг 8 и Аг 6) с точки зрения перспектив их включения в экспериментальные комбинированные вакцинные препараты, предназначенные для специфической защиты от В pseudomallei.

Наиболее полное представление о протективном потенциале мелиоидоз-ных МКА было получено при анализе результатов их применения при экспериментальной инфекции, обусловленной заражением белых мышей В pseudomallei.

При воспроизведении острой формы мелиоидоза у мышей, зараженных высоковирулентным штаммом В pseudomallei 100, установлено, что результаты экстренной профилактики инфекции зависели как от величины инфицирующей дозы патогена, так и от эпитопной направленности иммуноглобулинов, использовавшихся в работе. Так, показатели эффективности применения 12 различных вариантов МКА I-IV групп специфичности для экстренной профилактики осгрого мелиоидоза у мышей, зараженных дозой 12 LD50 В. pseudomallei 100, варьировали в широком диапазоне значений. Три варианта МКА (I, II и IV групп специфичности) из 12 образцов, отобранных для работы, оказались неэффективными средствами профилактики: показатели сроков СПЖ в этих группах не имели достоверных отличий от контроля заражения (р>0,05). В то же время, введение препарата сравнения (нормальных мышиных иммуноглобулинов) обеспечивало 25 % выживаемость животных в группе, достоверно увеличивая срок СПЖ в 1,4 - 2,3 раза по сравнению с контролем заражения (р<0,05).

ЛтРрт2 />1(32;, ¡>№1 2Р11 '9""С

в11 2Н7 ° .К,-

Рисунок 2 Фагоцитарная активность ПМЯЛ мышей, зараженных бактериями В рвеискнпаПе! 100, опсонизированных МКА различной эпитопной специфичности

' 5 2Р11 'ИКМС

,1тРрт: 102 Л»",,

Рисунок 3 Фагоиитарная активность ПМЯЛ мышей, зараженных бактериями В р$еис1ота1!е1 С141, опсонизиро ванных МКА различной эпитопной специфичности

у:ем; ,

С~, V л , 1Р1 . ' ——'—- ' «*" 1

• к.-

Рисунок 4 Фагоцитарная активность ПМЯЛ мышей, зараженных бактериями В р$еидоша11е1 56830, опсовизированных МКА различной эпитопной специфичности

К - контроль заражения

Применение остальных вариантов МКА (9 из 12) обеспечивало достоверное увеличение сроков СПЖ в соответствующих опытных группах по сравнению с контролем (р<0,05). При этом показатели выживаемости животных составили для биомоделей, получавших МКА I группы специфичности (G[i, 2A6,1G2), 50 %, 83,3 % и 83,3 % соответственно, сроки СПЖ достоверно отличались от СПЖ животных контрольной группы (р<0,05). Превентивное введение МКА Gn увеличивало продолжительность жизни мышей в 2,2 - 3,4 раза. При использовании МКА 2А6 этот показатель был равен 4,4 - 4,8 раза, МКА 1G2 - 4,4 - 4,9 раза (для вероятности 95 %).

Применение МКА II группы специфичности (2Ag и 2Fn) повышало выживаемость животных до 100 % и 83,3 % соответственно. Сроки продолжительности жизни при введении МКА 2Ag увеличивались в 4,4 - 5,1 раз, а при введении МКА 2Fn - в 4,1 - 4,4 раза.

Эффективными средствами оказались также МКА III группы специфичности (1F4,1F5 и 2G8) против эпитопов, входящих в состав как Аг 8, так и Аг 6. Пассивное введение этих вариантов МКА привело к 83,3 %, 100 % и 83,3 % выживаемости животных в соответствующих группах, увеличив сроки продолжительности жизни в 3,7 - 4,4, 4,4 - 5,1 и 4,1 - 4,4 раза соответственно. МКА IV группы специфичности (1Е)0) обеспечивали выживаемость 33,3 % животных в группе.

Согласно показателю "процент защиты" эффективными средствами серопрофилактики являлись 8 вариантов моноклонапьных иммуноглобулинов: МКА I (Gii, 2А6, 1G2), II (2А8, 2Fn) и III (1F4,1F5, 2G8) групп специфичности.

Анализ данных, полученных с вышеназванными образцами антител, взаимодействующих с эпитопами на поверхности бактерий, и их сравнение с показателями активности МКА в иммунодиагностических реакциях подтвердили отсутствие корреляции между показателями серологической активности и протективностью in vivo. Тот факт, что показатели активности МКА в общепринятых серологических реакциях недостаточно информативны для подбора средств пассивной защиты от В pseudomallei, был отмечен и при анализе результатов экспериментов по изучению бактериостатического потенциала МКА и их способности блокировать эпитопы, ответственные за антифагоцитарные свойства микробов. Полученные нами данные согласуются с мнением Barclay G.R. et al. (1986) о том, что результаты оценки серологической активности МКА и показатели протективности этих антител могут не совпадать.

При повышении заражающей дозы В pseudomallei 100 до 40 LD50 применение МКА за 2 ч до заражения достоверно удлиняло сроки СПЖ в 7 из 12 опытных групп, но при относительно невысоком проценте выживших особей: 16,6 - 33,3 %. При этом эффективными средствами экстренной профилактики оказались лишь три варианта МКА (2F, ь 1F4, 1F5). Их применение способствовало повышению показателей продолжительности жизни мышей в 1,6 - 2,8, 1,6 - 2,8 и 2,1 - 2,7 раза соответственно. Введение же нормальных иммуноглобулинов мыши (препарат сравнения) было не эффективным. Гибель животных регистрировали в сроки, практически, не отличавшиеся от показателя

СПЖ в контрольной группе (р>0,05). Данные этих двух опытов представлены на рисунке 5.

Рисунок 3 )■; фе~: .'hi 'Г-.С1..-.I: :1! > нвслспии МКЛ мьшам, зараженным 12 I X ! i и -J: l.Ds:, (2}

li-psetidomallci 100 К докфшц w-

Модель острого мелиоидоза представляет огромный интерес с точки зрения изучения возможности применения средств пассивной защиты от возбудителя мелиоидоза при разработке тактики предупреждения последствий биотеррорнстических атак. Эти данные ценны и для перспективного планирования экспериментальных исследований по созданию таких препаратов. Из сегодняшний день важно то, что были получены доказательства эффективности применения мелиоидозиых М К А, взаимодействующих с эпигонами гл и ко протеи на и ЛПС, локализованными на поверхности бактериальной клетки, способных существенно удлинять сроки СПЖ по сравнению с контролем, в ряде случаев до 4-5 раз. Они подтверждают опубликованные сведения об успешном применении МКА против экзопо.писахарида и ПС-фрагмента ЛПС В. pseudomalki для продления сроков СПЖ и повышения показателей выживаемости экспериментальных животных (Brett PJ. et al., 1997; Steinmetz 1. et al,: 2000; Jones S. et al., 2002).

При работе с менее вирулентными штаммами В. pseudomalki С-141 и 56S30 экспериментальная инфекция имела черты хронической патологии: по истечении 30 суток в контрольных группах выживали 33-50% животных.

Профилактическое введение мышам, зараженным как 15 LD5o, так и 30 LD^ii. pseudomalki С-141, нормального мышиного иммуноглобулина в установленном режиме серопрофилактики не оказывало влияния на сроки СПЖ и показатели выживаемости по сравнению С контролем заражения (р>0,05). В первом опыте с использованием штамма В. pseudomalki С-141 эффективными

средствами защиты являлись 8 из 12 использованных вариантов моноклональ-ных иммуноглобулинов 1-1У групп эпитопной направленности. Введение МКА вц, 2А6, 2А8, 2Р1Ь 1Рь 2С8, 2Е5,1Е10 повышало показатель выживаемости животных, зараженных 15 ЬО50 В. рьеис1ота1к1 С-141 до 83 %. Во втором опыте при двукратном повышении заражающей дозы В рьеийотсйЫ С-141 только МКА ММРрш-2 и 2А6 против эпитопов Аг 8 и МКА 2РП, взаимодействующие с эпитопами Аг 6, достоверно удлиняли сроки СПЖ мышей. Эти варианты МКА соответствовали характеристике: эффективные средства защиты от инфекции.

В опыте с заражением мышей 50 ЬО50 В р.чег^отаИег 56830 выявлено, что МКА I группы специфичности (ММРрт-2) способствовали повышению показателя выживаемости до 83 % против 33 % в контроле заражения и 33 % в группе «препарат сравнения». При введении МКА II группы специфичности (2А8, 2Рц, 1Р)) этот показатель был равен 83 %, 83 %, 100% соответственно, МКА III группы специфичности (1Р4, 1Р5) - 100 % и 83 % соответственно, МКА IV группы специфичности (2Е5,1 Еш) -100 % и 83 % соответственно.

Анализ результатов всех проведенных экспериментов с использованием трех различных штаммов В р$еис1ота11е[ позволил установить, что в качестве средств экстренной профилактики экспериментального мелиоидоза наиболее перспективными образцами МКА с высокими показателями протективности обладают МКА вп, 2РП и 2А8 Использование показателя «процент защиты» наряду с традиционными критериями оценки результатов опытов (сроки СПЖ, выживаемость животных в группах) позволило расширить представление о МКА различной эпитопной направленности как об эффективных средствах защиты от инфекции (табл. 3).

Таблица 3 - Сводные данные о реализации протективного потенциала мелиои-дозных МКА различной эпитопной направленности в условиях экстренной профилактики экспериментальной инфекции мышей

Моноклональные % защиты животных при заражении

антитела В р5еис/ота11е! 100 В рзеш1ота11е1 С-141 В рзеис/отаНе! 56830

12 Шзд 40 ЬО50 15 ЬОзо 30 Ш50 50 1.1)50

1 ММРрш-2 - - 16,7 - 50

О,, 25 - 50 33,3 33,3

2А6 58,3 16,6 50 33,3 16,6

Ю2 58,3 16,6 16,7 - 33,3

II 2А8 75 16,6 50 - 66,6

2Рп 58,3 33,3 33,3 33,3 50

1И, - 16,6 50 16,6 50

III 1Р4 58,3 33,3 16,7 - 66,6

1И5 75 33,3 16,7 - 50

2С8 58,3 16,6 50 16,6 16,6

IV 2Е5 - - 50 16,6 66,6

1Ею 8.3 16,6 50 - 50

В последнее время в связи с обсуждением целесообразности использования специфических антител для создания пассивного иммунитета, защищающего макроорганизм от патогена, ряд авторов высказывают суждение о более высоком потенциале МКА как средства профилактики инфекции нежели как средства лечения заболевания (Cross А., 1995; Casadevall А., 1996; Jones S. et al., 2002). Представленные в настоящей работе экспериментальные данные, особенно в части защиты животных от острого мелиоидоза, могут служить демонстрацией эффективности профилактического применения мелиоидозных МКА. Учитывая способность B.pseudomallei длительное время сохраняться в фагоцитах (Pier G.B. et al., 1989; Jones A.L. et al., 1996; Pruksachartvuthi S. et al., 1990), использование МКА с высокими показателями протективного потенциала в режиме экстренной профилактики в качестве средств, предупреждающих колонизацию внутриклеточной ниши, может явиться важным звеном в общей схеме профилактических мероприятий, направленных на уменьшение последствий инфицирования возбудителем мелиоидоза.

Таким образом, в соответствии с целью и задачами работы было выполнено комплексное исследование по изучению протективных свойств мелиоидозных монокпональных антител, взаимодействующих с эпитопами, локализованными на поверхности микробных клеток В pseudomallei.

Были получены приоритетные данные о бактериостатическом потенциале МКА различной эпитопной направленности, о влиянии опсонизации B.pseudomallei этими антителами in vitro на функциональное состояние бактерий, регистрируемое по показателям задержки их роста на плотной питательной среде, новые данные о роли моноклональных иммуноглобулинов в реализации процесса иммунного фагоцитоза in vivo и в предупреждении развития экспериментальной инфекции при условии превентивного введения животным МКА, узнающих эпитопы на антигенах, относящихся к факторам вирулентности возбудителя мелиоидоза (Аг 8, Аг 6).

Выводы

1. Опсонизация микробных клеток В pseudomallei антителами in vitro приводит к задержке и подавлению роста бактерий на плотной питательной среде. Бактериостатический потенциал моноклональных иммуноглобулинов, взаимодействующих с эпитопами Аг 8 и Аг 6 выше, чем поликлональных антител. Способность МКА подавлять рост микробных клеток В. pseudomallei in vitro зависит от их эпитопной направленности, концентрации иммуноглобулинов, длительности их контакта с бактериями, особенностей штамма В pseudomallei и, в ряде случаев, присутствия комплемента.

2. Для оценки эффективности опсонизации микробных клеток В pseudomallei in vitro впервые предложен тест задержки роста бактерий (50 % и более) на плотной питательной среде. Тестирование индивидуальных образцов

антител с учетом факторов времени контакта бактерий с антителами, концентрации иммуноглобулинов, наличия или отсутствия комплемента в реагентной смеси является дополнительным способом отбора образцов специфических иммуноглобулинов, рассматриваемых в качестве потенциальных средств пассивной защиты от возбудителя мелиоидоза.

3. Предварительная опсонизация В pseudomallei поликлонапьными антителами частично снижает антифагоцитарную активность бактерий, способствует повышению активности фагоцитов. Моноклональные антитела против эпитопов Аг 8 (МКА Gn, ММ Ppm-2), Аг 6 (MKAlFt, 2Fn) эффективно блокируют гомологичные сайты связывания поверхностных структур клетки, обладающих антифагоцитарной активностью, обеспечивают активизацию процесса иммунного фагоцитоза.

4. Превентивное внутрибрюшинное введение моноклональных иммуноглобулинов в дозе 1 мг на мышь за 2 часа до заражения животных повышает показатели выживаемости особей в опытных группах до 50-100 % и удлиняет сроки средней продолжительности жизни животных, в ряде случаев до 4-5 раз.

5. Разработанный режим превентивного введения МКА оказывает существенное влияние на течение экспериментального мелиоидоза, в том числе острой инфекции, моделируемой при заражении белых мышей высоковирулентным штаммом В pseudomallei 100 в диапазоне доз заражения 10-40 LD50.

6. Моноклональные антитела, взаимодействующие с эпитопами, локализованными на поверхности В. pseudomallei, эффективно опсонизирующие бактерии, понижающие их антифагоцитарный потенциал, являются прототипами средств экстренной профилактики мелиоидоза. В использованной панели моноклональных иммуноглобулинов такими свойствами обладают МКА I (Gn, MM Ppm-2) и II (2Fn, 2А8) групп специфичности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Дрефс Н.М. Факторы, участвующие в опсонизации микроорганизмов // Поволжский экологический вестник. - Волгоград, 1998 г.- Вып. 5 - С. 27-29.

2. Плеханова Н.Г., Жукова С.И., Пивень H.H., Дрефс Н.М., Оценка иммуно-тропных и иммуногенных свойств поверхностных антигенов Burkholderia pseudomallei // В реф. сб.: Метод, документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ,-Саратов, 1999.-С. 14.

3. Дрефс Н.М., Рыбкин B.C., Храпова Н.П. Участие поликлональных и моноклональных антител в опсонизации возбудителя мелиоидоза и развитии экспериментальной инфекции. // В реф. сб.: Метод, документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ. - Саратов, 2000. -С.37.

4. Авророва И.В., Пивень H.H., Рыбкин B.C., Викторов Д.В., Жукова С.И., Дрефс Н.М. Иммуногенная и протективная активность поверхностных антигенных структур Burkholderia pseudomallei // В сб. науч. тр.: Природно-

го

очаг, особо опасные инфекции на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика. - Астрахань, 2001. - С. 220-223.

5. Дрефс Н.М., Храпова Н.П., Рыбкин B.C., Прохватилова Е.В., Елизаров В.В. Оценка участия поли- и моноклональных антител в опсонизации возбудителя мелиоидоза // В сб. науч. тр.: Природноочаг. особо опасные инфекции на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика. - Астрахань, 2001.-С. 267-269.

6. Дрефс Н.М., Храпова Н.П., Прохватилова Е.В., Елизаров В.В. Оценка уча-

стия поли- и моноклональных антител в опсонизации возбудителя мелиоидоза // Тез. докл.: Матер. IX Рос. нац. конгресса «Человек и лекарство». -Москва, 2001.-С.15.

7. Пивень H.H., Рыбкин B.C., Плеханова Н.Г., Жукова С.И., Викторов Д.В., Дрефс Н.М. Иммунотропные и иммуногенные свойства поверхностных и мембранных антигенов Burkholderia pseudomallei // Журн. микробиол., эпи-демиол., иммунобиол. -2001. -№1. -С.29-33.

8. Drephs N.M. The estimation of polyclonal and monoclonal antibodies in opsonization of a melioidosis stimulus // Natural infectious diseases. - Ulaanbaator, 2001.-P. 25-28

9. Дрефс H.M., Храпова Н.П., Прохватилова E.B. Оценка роли поли- и моноклональных иммуноглобулинов в защите от экспериментального мелиоидоза // Сб. науч. тр., посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. -Киров, 2003.-С.27

10. Дрефс Н.М., Храпова Н.П., Рыбкин B.C. Оценка бактериостатических свойств мелиоидозных моноклональных антител in vitro (методические рекомендации) // В реф. сб.: Метод, документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ. - Саратов, 2003. -С.13-14.

11. Дрефс Н.М., Храпова Н.П., Жукова С.И. Роль опсонинов в защите экспериментальных животных от Burkholderia pseudomallei // Тез. докл. науч.-практич. конф. с междунар. участием "Роль клинической микробиологии в профилактике внутрибольничных инфекций". - Москва, 2004. - С. 43-44.

12. Дрефс Н.М., Храпова Н.П., Жукова С.И., Прохватилова Е.В. Методические рекомендации по применению опсонофагоцитарной реакции для оценки превентивного потенциала моноклональных антител различной эпитопной направленности // В реф. сб.: Метод, документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ. - Саратов, 2004. - С.20.

13. Дрефс Н.М., Храпова Н.П., Жукова С.И., Прохватилова Е.В. Роль опсонинов в защите макроорганизма от Burkholderia pseudomallei // В реф. сб.: Метод. документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории РФ. - Саратов, 2004.-С.42-43.

14. Дрефс Н.М., Храпова Н.П., Жукова С.И Применение опсоно-фагоцитарной реакции для оценки превентивного потенциала мелиоидозных моноклональных антител различной эпитопной направленности // Мат. Vl-й Меж-гос. науч.- практ. конфер. государств -участников СНГ (13-14.09.2005 г.). -Волгоград, 2005. - С.139-141.

15. Пивень H.H., Авророва И.В., Алексеев В.В., Жукова С.И., Ломова Л.В., Дрефс Н.М. Фагоцитарная тест-система для первичной оценки иммуноген-ности капсульных антигенов Burkholderia pseudomallei // Мат. VI-й Меж-гос. науч.- практ. конфер. государств - участников СНГ (13-14.09. 2005 г.). -Волгоград, 2005.- С.170-171.

16. Храпова Н.П., Алексеев В.В., Дрефс Н.М., Жукова С.И. Экстренная профилактика острого мелиоидоза в эксперименте //Материалы VII Межгосуд. науч.-практич. конф. государств-участников СНГ (3-5.10, ). - Оболенск, 2006.- С.165-166.

ДРЕФС Наталья Михайловна

ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА МЕЛИОИДОЗНЫХ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

03.00.07 - микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная №1-65гр. Печать офсетная . Тираж 100 экз. Заказ № 2099

Отпечатано ООО «Бланк» Лиц. №3550 г. Волгоград ул. Скосырева 2а

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дрефс, Наталья Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Механизмы иммунитета при мелиоидозе.

1.2. Роль антител в защите макроорганизма от ме-лиоидозной инфекции.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микроорганизмов.

2.2. Экспериментальные животные.

2.3. Клеточные линии.

2.4. Питательные среды.

2.5. Антигены.

2.6. Сыворотки интактных и иммунных животных.

2.7. Моноклональные антитела.

2.8. Тест-система для скрининга МКА.

2.9. Получение поли- и моноклональных иммуноглобулинов.

2.10. Методы контроля серологической активности антител.

2.11. Определение бактериостатической активности антител.

2.12. Опсоно-фагоцитарная реакция.

2.13. Оценка протективности иммуноглобулинов in vivo.

2.14. Статистические методы обработки результатов опытов.

Глава 3. Серологическая и бактериостатическая активность ме-лиоидозных поли- и моноклональных иммуноглобулинов.

3.1. Специфическая активность мелиоидозных иммуноглобулинов.

3.2. Бактериостатические свойства поли- и моноклональных антител.

Глава 4. Изучение характера взаимодействия опсонизированных антителами бактерий с мышиными фагоцитами.

Глава 5. Эффективность применения мелиоидозных МКА различной эпитопной направленности для защиты от инфекции

Введение Диссертация по биологии, на тему "Протективные свойства мелиоидозных моноклональных антител"

Мелиоидоз - особо опасная инфекция людей и животных, регистрируемая в эндемичных регионах Юго-Восточной Азии и Австралии, обусловленная инфицированием грамотрицательной бактерией Burkholderia pseudomallei [71,72, 96,109,143,144,154].

Возбудитель заболевания выделяют из внешней среды (рисовые плантации, стоячие водоемы, влажная почва) регионов, расположенных в зоне 20° севернее и южнее экватора [59, 81, 82, 109, 115, 128, 144, 151]. Инфицирование происходит при попадании микроорганизма в раны или повреждения кожи, а также при вдыхании контаминированной им пыли [95, 98, 108, 109].

Частота возникновения заболеваний мелиоидозом существенно выше в Юго-Восточной Азии и северных провинциях Австралии по сравнению с другими регионами приэкваториальной зоны [68, 71, 109, 115, 165]. Наиболее высокий уровень заболеваемости отмечен в ряде районов Таиланда, где эта инфекция является важной составляющей показателей заболеваемости и смертности населения, нанося ущерб, как здоровью людей, так и экономике страны [71]. Так, в северо-восточном Таиланде, В pseudomallei является причиной 20 % септицемий и приблизительно 40 % летальных исходов вследствие бактериального сепсиса, а в некоторых областях, несмотря на проводимое лечение, этот показатель достигает 70% [115, 143].

Немногочисленные случаи заболевания зарегистрированы на Филиппинах, Папуа Новой Гвинее, в Африке, Америке (Северной, Центральной, Южной), Азии (Турции, Иране, Китае), Европе (Англии, Франции, Германии, Дании, Нидерландах) [52, 77, 78, 87, 112, 135]. Известны единичные случаи внутрилабора-торного заражения, а также случаи инфицирования вьетнамских ветеранов, у которых симптоматика заболевания появилась после их возвращения на родину [90, 113].

Установлено, что вероятность приобретения мелоидоза за пределами эндемичных территорий чрезвычайно низка [96]. Группами риска приобретения ме-лиоидоза считают лиц, временно находившихся в эндемичных регионах (туристов, бизнесменов, представителей воинских контингентов) [14, 70]. За последние десятилетия значимость проблемы мелиоидоза возросла ввиду интенсификации процессов миграции населения, туристических и деловых поездок, повысивших риск завоза возбудителя этого опасного инфекционного заболевания из зон его распространения в различные страны, в том числе и в Россию. Пристальное внимание к возбудителю мелиоидоза связано также с тем, что, по данным экспертов, он является потенциальным агентом биотеррористических актов [18, 68].

В. р5еис1ота11е1 вызывает целый спектр многообразных клинических форм заболевания, включая субклиническую, острую локализованную, легочную, сеп-тицемическую, хроническую гранулематозную формы [98,109,140,149,176].

Наиболее частыми проявлениями этой инфекции являются субклинические и бессимптомные формы мелиоидоза [44, 109, 143]. Возбудитель может оставаться в латентном состоянии в клетках-мишенях макроорганизма длительное время до манифестации клинических проявлений [116, 114].

Патогенез мелиоидоза сложен, особенно в части развития острой и хронической инфекции, и до сих пор не вполне понятен [95, 108, 143, 169]. В связи с этим, исследования по углубленному изучению механизмов иммунитета при ме-лиоидозе, выявлению и идентификации факторов вирулентности В.рзеис1ота1Ш расширяются. Большое внимание уделяют вопросам изучения антигенного спектра В.рБеЫотаИег, основных факторов вирулентности этого патогена, оценке биологической значимости тех компонентов микробной клетки, которые в макроорганизме индуцируют образование антител, развитие клеточного иммунитета по типу немедленной или замедленной гиперчувствительности, формируют иммунологическую память, вызывают иммунологическую толерантность [23, 45, 74, 98,133,139, 150,166, 167].

Выраженная картина мелиоидоза характеризуется высоким уровнем смертности, слабым ответом на проводимую антибиотикотерапию и высокими показателями рецидивирования заболевания несмотря на длительное лечение [93, 141]. Даже при ранней постановке диагноза и своевременно начатой антибиотикотера-пии уровень летальности высок [93, 117, 143, 147]. Традиционные антимикробные средства, включенные в рекомендуемые схемы лечения, приводят лишь к снижению показателей смертности [109, 153]. Трудности эффективного лечения мелиоидоза обусловлены высоким уровнем резистентности этого микроорганизма ко многим химиотерапевтическим препаратам и способностью В. pseudomallei не только длительно сохраняться в фагоцитах, но и размножаться в них, оставаясь недоступным для средств фармакотерапии [117,153].

В то время, как В.pseudomallei все чаще признается основной причиной инфекционной заболеваемости и смертности в регионах, где этот микроорганизм эндемичен, лицензированные вакцинные препараты, предназначенные для защиты населения от данного микроорганизма, отсутствуют [58].

Эти факты являются основанием для поиска альтернативных средств и способов лечения и профилактики мелиоидоза, в частности выбора препаратов пассивной защиты от инфекции и средств специфической стимуляции иммунитета при этом заболевании. Предметом обсуждения специалистов все чаще становятся вопросы использования иммуноглобулиновых препаратов для профилактики мелиоидоза [54, 55,122].

Сведения о протективном потенциале мелиоидозных антител ограничены, а их роль в защите от инфекции до конца не определена [42, 76, 170]. Для решения этой проблемы практически важными являются данные об эффективности использования для этих целей высокоактивных, гомогенных по составу и свойствам моноклональных антител (МКА) узкой специфичности [19, 25, 31, 39, 46, 56, 124, 163]. Применение таких препаратов расширяет представление о результативности блокирования тех эпитопов антигенных комплексов, которые обладают антифагоцитарной функцией и обеспечивают микробной клетке уклонение от механизмов защиты макроорганизма. Анализ этих данных открывает новые возможности для совершенствования схем патогенетического лечения мелиоидоза.

Принимая во внимание важность проблемы защиты от мелиоидоза, в том числе вопросов серопрофилактики и серотерапии этой инфекции, было определено направление исследований по изучению роли антител в защите макроорганизма от В. pseudomallei в эксперименте.

Целью работы являлось изучение протективного потенциала поли- и моноклональных иммуноглобулинов против антигенов Burkholderia pseudomallei, экспонированных на поверхности бактерий

Задачи исследования:

1. Тиражирование in vitro и in vivo гибридом-продуцентов МКА к антигенам В. pseudomallei, накопление препаративных количеств МКА, их характеристика.

2. Получение высокоактивных поликлональных кроличьих антител к антигенам В. pseudomallei и определение спектра их специфической активности.

3. Оценка бактериостатических свойств мелиоидозных поли- и моноклональных антител различной эпитопной направленности и разработка теста задержки роста В. pseudomallei, предварительно опсонизированных антителами, на плотной питательной среде.

4. Оптимизация условий постановки опсоно-фагоцитарной реакции на этапах оценки протективного потенциала МКА различной эпитопной направленности, изучение влияния опсонизации В. pseudomallei на антифагоцитарную активность микробных клеток возбудителя мелиоидоза.

5. Изучение протективных свойств мелиоидозных МКА ín vivo.

Научная новизна

Впервые определены оптимизированные условия оценки бактериостатиче-ского потенциала мелиоидозных антител в тесте задержки роста бактерий на плотной питательной среде. Показано, что предварительная опсонизация В. pseudomallei антителами приводит к нарушению функций роста и размножения микроорганизмов.

Оптимизированы условия постановки опсоно-фагоцитарной реакции с применением широкого набора МКА различной эпитопной направленности, позволяющей исследовать один из механизмов иммунного фагоцитоза при экспериментальном мелиоидозе. Установлено, что предварительная опсонизация В. pseudomallei моноклональными антителами снижает антифагоцитарную активность бактерий, приводя к увеличению числа поглощенных клеток по сравнению с контролем, повышает активность фагоцитов мыши и в ряде случаев приводит к завершению процесса насыщения фагоцитов тест-объектами. Определена сравнительная эффективность различных типов МКА в блокировании эпитопов, экспонированных на поверхности микробных клеток В. pseudomallei, выявлены те варианты МКА, использование которых в данной реакции, обеспечивает завершенность процесса поглощения бактерий фагоцитами мыши в первые три часа после заражения.

Показано, что превентивное введение моноклональных иммуноглобулинов различной эпитопной направленности оказывает существенное влияние на течение экспериментального мелиоидоза. Эффективность превентивного введения in vivo моноклональных иммуноглобулинов в режиме экстренной профилактики зависит от особенностей штамма В. pseudomallei и от величины инфицирующей дозы. Установлено, что ряд МКА, взаимодействующих с эпитопами Аг 6, Аг 8 и эпитопами, экспонированными как на Аг 6, так и Аг 8, достоверно увеличивают сроки средней продолжительности жизни экспериментальных животных и повышают показатели выживаемости особей до 50 - 100 %.

Практическая ценность

Оптимизированные условия постановки опсоно-фагоцитарной реакции, обобщенные в «Методических рекомендациях по применению опсоно-фагоцитарной реакции для оценки превентивного потенциала МКА различной эпитоп-ной направленности» (рассмотрены ученым советом Волгоградского НИПЧИ 23.06.2004, протокол № 6 и утверждены директором института), позволяют исследовать один из механизмов иммунного фагоцитоза при экспериментальном мелиоидозе. Данный способ пригоден для анализа уровня функциональной активности фагоцитов хозяина в отношении В. рвеийотаИег, предварительно инкубированных с антителами, а также оценки характера фагоцитарного процесса, в том числе завершенности этапа поглощения микрообъектов фагоцитами хозяина.

Практически значимыми являются характеристики индивидуальных образцов моноклональных антител, применявшихся в работе, в части их бактериоста-тического потенциала, эффективной опсонизации В. рзеис1ота1Ш, снижающей антифагоцитарную активность бактерий, и способности защищать от патогена при введении мышам в режиме экстренной профилактики. Апробированные схемы пассивной иммунизации животных могут быть востребованы профильными специалистами при разработке средств защиты от возбудителя мелиоидоза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Опсонизация микробных клеток В. р8еис1ота1Ш антителами нарушает их функции роста и размножения. Критерием эффективности опсонизации

В. pseudomallei антителами in vitro служит относительный показатель подавления роста бактерий на плотной питательной среде.

3. Опсоно-фагоцитарная реакция, адаптированная к работе с В. pseudomallei, позволяет оценивать функциональную активность фагоцитов мыши в отношении возбудителя мелиоидоза, предварительно опсонизированного антителами in vitro.

4. Применение МКА различной эпитопной направленности в режиме экстренной профилактики инфекции изменяет течение экспериментального мелиоидоза, увеличивая сроки средней продолжительности жизни животных и процент выживших особей в опытных группах по сравнению с контролем. Эффективность превентивного введения МКА in vivo зависит от их протективного потенциала, особенностей штамма В. pseudomallei и инфицирующей дозы патогена.

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Дрефс, Наталья Михайловна

ВЫВОДЫ

1. Опсонизация микробных клеток В. pseudomallei антителами in vitro приводит к задержке и подавлению роста бактерий на плотной питательной среде. Бактериостатический потенциал моноклональных иммуноглобулинов, взаимодействующих с эпитопами Аг 8 и Аг 6 выше, чем поликлональных антител. Способность МКА подавлять рост микробных клеток В. pseudo-mallei in vitro зависит от их эпитопной направленности, концентрации иммуноглобулинов, длительности их контакта с бактериями, особенностей штамма В. pseudomallei и, в ряде случаев, присутствия комплемента.

2. Для оценки эффективности опсонизации микробных клеток В. pseudomallei in vitro впервые предложен тест задержки роста бактерий (50 % и более) на плотной питательной среде. Тестирование индивидуальных образцов антител с учетом факторов времени контакта бактерий с антителами, концентрации иммуноглобулинов, наличия или отсутствия комплемента в реа-гентной смеси является дополнительным способом отбора образцов специфических иммуноглобулинов, рассматриваемых в качестве потенциальных средств пассивной защиты от возбудителя мелиоидоза.

3. Предварительная опсонизация В. pseudomallei поликлональными антителами частично снижает антифагоцитарную активность бактерий, способствует повышению активности фагоцитов. Моноклональные антитела против эпитопов Аг 8 (МКА G,b ММ Ррш-2), Аг 6 (MKA1F,, 2FU) эффективно блокируют гомологичные сайты связывания поверхностных структур клетки, обладающие антифагоцитарной активностью, обеспечивают активизацию процесса иммунного фагоцитоза.

5. Разработанный режим превентивного введения МКА оказывает существенное влияние на течение экспериментального мелиоидоза, в том числе острой инфекции, моделируемой при заражении белых мышей высоковирулентным штаммом В. рзеис1ота1Ш 100 в диапазоне доз заражения 10-40 ЬБ50.

6. Моноклональные антитела, взаимодействующие с эпитопами, локализованными на поверхности В. ряеис1отаНе1, эффективно опсонизирующие бактерии, понижающие их антифагоцитарный потенциал, являются прототипами средств экстренной профилактики мелиоидоза. В использованной панели моноклональных иммуноглобулинов такими свойствами обладают МКА I (вц, ММ Ррш-2) и II (2Рц, 2А8) групп специфичности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Вопросы защиты населения от инфицирования возбудителем мелиоидоза, ВигккоШепа рвеи<1ота1Ы, приобретают все большую актуальность не только в зонах его эндемичного распространения (регионы Юго-Восточной Азии, северные провинции Австралии), но и в странах, где наличие этой инфекции ранее не отмечали. Это связано с возросшим уровнем миграции населения, интенсификацией туристических и деловых поездок, повышающих вероятность инфицирования лиц, временно находящихся на вышеназванных территориях, и завоза инфекции в различные страны, в том числе в Россию, из зон ее распространения. Наибольшую опасность появления массовых заболеваний людей связывают с угрозой возникновения чрезвычайных ситуаций, обусловленных применением потенциальных биологических агентов, в число которых входит и возбудитель мелиоидоза [18]. Ввиду отсутствия средств специфической профилактики мелиоидоза, значительных трудностей диагностики самых разнообразных форм заболевания и его лечения, прогнозируемые ситуации требуют высокой степени готовности медицинских служб к минимизации последствий инфицирования В. ряеийотаПег.

Как отмечают специалисты, накопившие большой опыт работы с больными мелиоидозом в стационарах Юго-Восточной Азии, даже при ранней постановке диагноза и своевременно начатой антибиотикотерапии показатели летальности больных мелиоидозом остаются недопустимо высокими [93, 147], применяемые антимикробные средства комбинированного лечения приводят лишь к снижению показателей смертности [109] и, несмотря на длительную терапию, не исключают возможности рецидивов заболевания [93, 141]. Основными причинами этого считают высокий уровень резистентности В. р8еис1ота1Ш ко многим химиотерапев-тическим препаратам, а также способность данного патогена не только длительно сохраняться в фагоцитах, но и размножаться в них, оставаясь практически недоступным для средств фармакотерапии [64, 159].

Все эти факты стимулируют поиск альтернативных средств и способов профилактики и лечения мелиоидоза.

В последние годы в связи с разработкой стратегии защиты населения при угрозе биотеррористических атак вновь активно обсуждают перспективы применения средств немедленной (пассивной) защиты от патогенов [63]. Преимуществом применения специфических антител для создания пассивного иммунитета у лиц, находившихся в зоне биотеррористической атаки, является то, что иммуног-лобулиновые препараты обеспечивают немедленное развитие напряженного иммунитета в течение нескольких недель. Кроме того, они, как правило, обладают минимальной токсичностью и не повреждают клетки макроорганизма.

Применение иммуноглобулиновых препаратов особенно важно в тех случаях, когда речь идет об инфекциях, для которых не существует средств специфической защиты и ограничен перечень препаратов для их длительного и эффективного лечения. В таких случаях применение антител для немедленной защиты (пассивная иммунизация) будет трудно переоценить [63,177].

Перспективы использования специфических антител для профилактики мелиоидоза также являются предметом обсуждения специалистов [25, 46, 124] Практически важной представляется проблема использования для этих целей высокоактивных, гомогенных по составу и свойствам моноклональных антител (МКА), обладающих узкой специфичностью. Это связано с тем, что на сегодняшний день они представляют собой наиболее точный инструмент для блокирования и идентификации поверхностно локализованных эпитопов, обеспечивающих В. pseudomallei способность уклоняться от механизмов иммунной системы хозяина.

Принимая во внимание актуальность проблемы защиты от возбудителя мелиоидоза, в том числе вопросов серопрофилактики и серотерапии этой инфекции, была определена цель настоящей работы: изучение протективного потенциала поли- и моноклональных иммуноглобулинов против антигенов B.pseudomallei, экспонированных на поверхности бактерий, и выполнены ряд задач, связанных с изучением in vitro бактериостатических свойств мелиоидозных поликлональных антител и МКА различной эпитопной направленности, исследованием механизмов иммунного фагоцитоза с помощью опсоно-фагоцитарной реакции и оценкой протективного потенциала МКА in vivo.

Объектами исследования являлись музейные штаммы B.pseudomallei 100, С-141, 56830 и мелиоидозные поли- и моноклональные антитела. Критериями отбора антител, накопленных в препаративных количествах, служили показатели их специфической активности в отношении как растворимых, так и ассоциированных с клеткой антигенов, локализованных на поверхности B.pseudomallei.

Одна из задач настоящей работы состояла в изучении роли антител в опсо-низации B.pseudomallei in vitro. Необходимо было выяснить влияет ли и в какой степени опсонизация данного микроорганизма антителами на его функциональное состояние, в частности на способность бактерий, опсонизированных антителами, расти и размножаться на плотных питательных средах. Впервые в практике работы с возбудителем мелиоидоза был использован тест задержки роста бактерий на плотной питательной среде после предварительной инкубации В. pseudo-mallei с антителами. Оптимизацию условий его постановки проводили с учетом времени предварительной инкубации В. pseudomallei с поли- и моноклональными иммуноглобулинами (30, 60, 90 мин), концентрации иммуноглобулинов в реа-гентной смеси (5, 25, 50 мкг антител на 100 м.к.) и наличия или отсутствия в ней комплемента. Положительным результатом теста считали подавление роста 50 % бактерий и более.

Установлено, что предварительная опсонизация В. pseudomallei антителами приводила к замедлению темпов роста микробов на плотной питательной среде. Сравнительный анализ относительных показателей числа выросших колоний в опытных и контрольных чашках показал, что все типы антител обладали определенным уровнем бактериостатической активности, в том числе и нормальные мышиные иммуноглобулины. Поликлональные сыворотки с гетерогенным набором антител к антигенам В. рвеийотсйЫ проявили себя как относительно слабые реагенты в тесте задержки роста клеток В.р$еис1ота1Ш. Даже сыворотка против антигенов высоковирулентного штамма Л. ръеийотсЛЫ 100 с наиболее высокими показателями серологической активности и обладавшая более широким набором опсонинов, взаимодействующих с поверхностно локализованными биополимерами, чем сыворотка против антигенов В. ряеис1ота1Ш С-141, проявляла свою бактериостатическую активность эпизодически и только при работе со штаммами В. рБеис1ота1Ш 100 и 56830.

В то же время, бактериостатический потенциал ряда МКА, взаимодействующих с эпитопами на гликопротеине капсульной субстанции (Аг 8) и МКА против эпитопов Аг 6 в составе ЛПС В. рвеЫотсйЫ, был значительно выше, чем поликлональных иммуноглобулинов. Эффективность подавления роста микроорганизмов зависела от эпитопной направленности МКА, от особенностей использованных штаммов В. р8еис1ота1Ш, времени предварительной инкубации микробов с антителами перед высевом на чашки, а в ряде случаев и от присутствия комплемента в реагентной смеси на этапе предварительной инкубации бактерий с антителами. Блокирование эпитопов на поверхности В. рьеи<1ота1Ы существенно влияло на темпы роста бактерий, ингибируя рост 50 % клеток и более.

Результаты опытов с использованием МКА позволили получить доказательства того, что эффективное блокирование поверхностно локализованных эпитопов, приводящее к нарушению темпов роста бактерий, может быть достигнуто в результате экспериментального подбора индивидуальных образцов моно-клональных иммуноглобулинов, которые взаимодействуют с эпитопами антигенов, отнесенных к факторам вирулентности возбудителя мелиоидоза (Аг 8 и Аг 6).

Наиболее эффективными опсонинами, действие которых реализовалось в подавлении роста 50 % бактерий и более, высеянных на плотную питательную среду, являлись МКА I (Gn и ММРрш-2) и II (2Fn и 2А8) групп специфичности, взаимодействующие с эпитопами Аг 8 и Аг 6 соответственно.

Использование МКА узкой специфичности в тесте подавления роста бактерий на плотной питательной среде позволило не только получить их новые характеристики в части бактериостатического потенциала, но и и выявить отличия в эффективности опсонизации микробных клеток различных штаммов В pseudo-mallei этими антителами.

Так, при работе с высоковирулентным штаммом В. pseudomallei 100 для проявления бактериостатической активности МКА Gn и ММРрт-2 обязательным было наличие С' в реагентной смеси на этапе предварительной опсонизации бактерий. В то же время, МКА 2Fn и 2А8 реализовывали свой бактериостатический потенциал и без С'.

Подавление роста (на 50 % и более) микробных клеток В. pseudomallei 56830 регистрировали после их контакта с МКА Gn, MMPpm-2 в диапазоне концентраций антител от 5 до 50 мкг на 100 м.к., вне зависимости от присутствия С' и при длительности контакта от 30 до 90 мин. Бактериостатическая активность МКА 2Fn была выявлена при соблюдении следующих условий: концентрация антител - не менее 25 мкг на 100 м.к., время контакта - 60-90 мин, вне зависимости от присутствия С'. МКА 2А8 были малоэффективными опсонинами В. pseudomallei 56830.

Необходимо также отметить, что при выполнении данного раздела было установлено, что показатели специфической активности антител в общепринятых серологических тестах не могут служить критерием отбора таких вариантов антител, которые обладают выраженным бактериостатическим потенциалом. Для оценки эффективности опсонизации микробных клеток В. pseudomallei in vitro необходимо проводить индивидуальное тестирование каждого образца МКА, определяя показатели задержки роста бактерий на плотной питательной среде с учетом факторов времени, концентрации антител и наличия/отсутствия С'.

В целом, для изучения бактериостатических свойств мелиоидозных МКА различной эпитопной направленности впервые был предложен и апробирован тест задержки роста В. pseudomallei на плотной питательной среде, позволяющий вести целенаправленный отбор таких вариантов моноклональных иммуноглобулинов, которые эффективно блокируют поверхностно локализованные эпитопы биополимеров, отнесенных к факторам вирулентности возбудителя мелиоидоза. Оптимизированные условия его воспроизведения и критерии оценки получаемых результатов явились основой для составления "Методических рекомендаций по оценке бактериостатических свойств мелиоидозных МКА in vitro".

Предлагаемый способ рекомендован в качестве дополнительного теста исследования при идентификации тех сайтов связывания на поверхности микробных клеток В. pseudomallei, блокирование которых иммуноглобулинами приводит к нарушению функций роста и размножения данного микроорганизма. В случае работы с панелями МКА данный методический прием позволяет достаточно быстро проводить скрининговые исследования по отбору индивидуальных образцов иммуноглобулинов с высокими показателями бактериостатической активности для их последующего тестирования в качестве средств пассивной защиты от возбудителя мелиоидоза.

Известно, что гуморальные антитела, опсонизирующие микроорганизмы, участвуют в реализации механизмов иммунного фагоцитоза - одного из ключевых звеньев в патогенезе инфекционного процесса. В макроорганизме микробы с выраженной антифагоцитарной активностью успешно уклоняются от фагоцитирования полиморфноядерными лейкоцитами и макрофагами, но после опсониза-ции антителами становятся доступными для поглощения фагоцитами хозяина.

При мелиоидозе роль иммуноглобулинов в опсонизации бактерий изучена недостаточно полно. В исследованиях, проводившихся ранее, чаще всего анализировали способность поликлональных сывороток или иммуноглобулинов, изолированных из них, стимулировать активность фагоцитов в отношении В pseudo-mallei [24, 162]. Вследствие того, что эти препараты представляют собой смесь гетерогенных по составу и специфической активности антител, интерпретация результатов исследований с точки зрения идентификации антигенов, обусловливающих антифагоцитарные свойства микробных клеток на уровне индивидуальных эпитопов, была затруднена. Лишь с появлением МКА в арсенале средств детекции единичных эпитопов стало возможным проведение экспериментов по обнаружению тех участков структурных компонентов микробной клетки, блокирование которых снижает антифагоцитарный потенциал исследуемых микроорганизмов.

Изучение фагоцитарных функций ПМЯЛ и макрофагов хозяина, их функциональной активности до и после контакта с патогенами осуществляют с привлечением различных методических приемов, моделируя процесс иммунного фагоцитоза in vitro, in vivo, или используют комбинированные тесты (in vitro-in vivo-in vitro) с одновременным определением эффектов опсонизации микрообь-екта и его поглощения фагоцитом.

В настоящей работе была использована опсоно-фагоцитарная реакция в ее комбинированном варианте, позволяющая оценить характер взаимодействия оп-сонизированных антителами бактерий с фагоцитами мыши.

При этом было обнаружено, что предварительная опсонизация В pseudo-mallei антителами поликлональной мелиоидозной сыворотки лишь незначительно понижала антифагоцитарную активность микробов. Несмотря на зарегистрированное повышение активности фагоцитов, увеличение числа поглощенных микрообъектов по сравнению с контролем, стадия насыщения фагоцитов тест-объектами в течение первых трех часов после заражения животных не завершалась, ИНФ имел отрицательные значения, что свидетельствовало о том, что в препарате поликлональных антител концентрация иммуноглобулинов к антигенам, экспонированным на поверхности микробных клеток В. ряеис1ота1Ш, была недостаточной для эффективного снижения их антифагоцитарной активности.

В отличие от поликлональных антител моноклональные иммуноглобулины оказывали существенное влияние на результаты опсоно-фагоцитарной реакции. Ввиду того, что в качестве инструмента блокирования эпитопов были использованы МКА, отчетливо проявлялась зависимость результатов реакции от индивидуальных особенностей использовавшихся в ней штаммов В. ряеис1ота1Ш, что подтверждало наличие штаммовых отличий в спектрах поверхностных антигенов данного микроорганизма.

При анализе результатов проб «контроль заражения» установлено, что степень активизации поглотительной функции фагоцитов крови коррелировала с вирулентностью штамма, применявшегося для моделирования инфекционного процесса. В опытных пробах предварительная инкубация В. ряеис1ота11е1 с мелиои-дозными МКА снижала антифагоцитарную активность бактерий, приводила к увеличению числа поглощенных микрообъектов по сравнению с контролем и в ряде случаев - к завершению процесса насыщения фагоцитов тест-объектами.

На основании данных, полученных с ПМЯЛ и макрофагами мышей, зараженных В. рзеис1ота1Ш, предварительно опсонизированными МКА различной эпитопной направленности, была определена их сравнительная эффективность в блокировании эпитопов, экспонированных на поверхности микробных клеток трех штаммов В. р8еийота1Ш, и определены те варианты МКА, использование которых в данной реакции, обеспечило завершенность процесса поглощения микрообъектов фагоцитами в первые три часа после заражения. Все это свидетельствовало о том, что эффективная предварительная опсонизация антителами микроорганизмов, применявшихся для заражения мышей, приводила к снижению антифагоцитарной активности В рзеийотсЛЫ и в последующем способствовала поглощению большего числа тест-объектов фагоцитами мыши. Положительные значения ИНФ указывали на завершение процесса насыщения фагоцитов микрообъектами.

Наибольшим потенциалом в снижении антифагоцитарной активности поверхностных биополимеров клеток В. pseudomallei 100, В. pseudomallei С-141 и В pseudomallei 56830 обладали антитела, взаимодействующие с эпитопами Аг 8 и Аг 6: для В. pseudomallei 100 - МКА I (Ppm2, 1G2) и II (lFb 2Fn) групп специфичности, а также нормальные иммуноглобулины мыши; для В pseudomallei С-141 - МКА II (1F], 2Fn) группы специфичности и нормальные иммуноглобулины мыши; для В. pseudomallei 56830 - МКА I (Gn) группы специфичности. В то же время, отмечено, что не все эпитопы, узнаваемые МКА и экспонированные на Аг 8 и Аг 6, ответственны за антифагоцитарную активность микробных клеток и противодействие фагоцитозу in vivo.

Что касается способности нормальных иммуноглобулинов мыши снижать антифагоцитарную активность В pseudomallei то, по всей видимости, она была обусловлена возможным присутствием в этом препарате антител к непатогенным псевдомонадам (фоновых антител), перекрестно взаимодействующих с поверхностными антигенами буркхольдерий.

На основе обобщенных данных проведенных экспериментов были разработаны "Методические рекомендации по применению опсоно-фагоцитарной реакции для оценки превентивного потенциала МКА различной эпитопной направленности", предназначенные для сотрудников специализированных лабораторий. Практическое значение имеют данные, позволяющие судить о наиболее значимых из поверхностно локализованных биополимеров (Аг 8 и Аг 6) с точки зрения перспектив их включения в экспериментальные комбинированные вакцинные препараты, предназначенные для специфической защиты от В. pseudomallei.

Следует подчеркнуть, что наиболее полное представление о протективном потенциале мелиоидозных МКА было получено при анализе результатов их применения при экспериментальной инфекции, обусловленной заражением белых мышей В.рБеийотаХЫ.

Протективный потенциал 12 индивидуальных образцов моноклональных иммуноглобулинов разноэпитопной направленности оценивали после их введения белым мышам в режиме экстренной профилактики мелиоидозной инфекции за 2 ч до заражения. Препаратом сравнения являлись иммуноглобулины сыворотки крови интактных животных. Критериями оценки эффективности применения антител в качестве средств защиты от инфекции служили показатели сроков СПЖ мышей опытных и контрольных групп, процент выживших животных в группах и процент защиты при введении различных образцов моноклональных иммуноглобулинов.

При воспроизведении острой формы мелиоидоза у мышей, зараженных высоковирулентным штаммом В. р8еис1ота1Ш 100, установлено, что результаты экстренной профилактики инфекции зависели как от величины инфицирующей дозы патогена, так и от эпитопной направленности иммуноглобулинов, использовавшихся в работе. Так, показатели эффективности применения различных вариантов МКА 1-1У групп специфичности для экстренной профилактики острого мелиоидоза у мышей, зараженных дозой 121Ю5о В. р$еис1ота1Ш 100, варьировали в широком диапазоне значений. Три варианта МКА (I, II и IV групп специфичности) из 12 образцов, отобранных для работы, оказались неэффективными сред-твами профилактики: показатели сроков СПЖ в этих группах не имели достоверных отличий от контроля заражения (р>0,05). В то же время, введение препарата сравнения (нормальных мышиных иммуноглобулинов) обеспечивало 25 % выживаемость животных в группе, достоверно увеличивая срок СПЖ в 1,4 - 2,3 раза по сравнению с контролем заражения (р<0,05). Применение остальных вариантов МКА (9 из 12) обеспечивало достоверное увеличение сроков СПЖ в соответствующих опытных группах по сравнению с контролем (р<0,05). При этом показатели выживаемости животных составили для опытных групп, получавших МКА

I группы специфичности (Gn, 2A6,1G2), 50 %, 83,3 % и 83,3 % соответственно, МКА II группы специфичности (2А8 и 2Fn), - 100 % и 83,3 % соответственно, МКА III группы специфичности (1F4, 1F5 и 2G8), - 83,3 %, 100 % и 83,3 % соответственно, МКА IV группы специфичности (1Е10) обеспечивали выживаемость 33,3 % животных в группе. Согласно показателю "% защиты" эффективными средствами серопрофилактики являлись 8 вариантов моноклональных иммуноглобулинов: МКА I (Gn, 2А6, 1G2), II (2Ag, 2Fn) и III (1F4, 1F5, 2G8) групп специфичности.

Анализ данных, полученных с вышеназванными образцами антител, взаимодействующих с эпитопами на поверхности бактерий, и их сравнение с показателями активности МКА в иммунодиагностических реакциях подтвердили отсутствие корреляции между показателями серологической активности и протектив-ностью in vivo. Факт того, что показатели активности МКА в общепринятых серологических реакциях недостаточно информативны для подбора средств пассивной защиты от В pseudomallei, был отмечен и при анализе результатов экспериментов по изучению бактериостатического потенциала МКА и их способности блокировать эпитопы, ответственные за антифагоцитарные свойства микробов (главы 3 и 4). Полученные нами данные согласуются с мнением Barclay G.R. et al. о том, что результаты оценки серологической активности МКА и показатели про-тективности этих антител могут не совпадать [65].

При повышении заражающей дозы В. pseudomallei 100 до 40 LD50 применение МКА за 2 ч до заражения достоверно удлиняло сроки СПЖ в 7 из 12 опытных групп, но при относительно невысоком проценте выживших особей: 16,6 - 33,3 %. При этом эффективными средствами экстренной профилактики оказались лишь три варианта МКА (2Fn, 1F4, 1F5). Их применение способствовало повышению показателей продолжительности жизни мышей, в 1,6 - 2,8, 1,6 -2,8 и 2,1 - 2,7 раза соответственно. При этом введение нормальных иммуноглобулинов мыши (препарат сравнения) было не эффективным. Гибель животных регистрировали в сроки, практически, не отличавшиеся от показателя СПЖ в контрольной группе (р>0,05).

Сравнительный анализ данных этих двух опытов показал, что при увеличении дозы заражения животных более, чем в три раза, профилактическое введение

1 мг МКА на мышь оказалось недостаточным для получения результатов, сопоставимых с результатами предыдущего опыта, несмотря на то, что доза МКА, применявшаяся в работе, соответствовала нижнему порогу оптимальных значений доз, используемых для серопрофилактики и серотерапии мелиоидоза. В рамках настоящей работы опытов с варьированием профилактических доз МКА не проводили. Однако, известно, что они могут быть увеличены, но не более, чем до

2 мг на мышь, так как при более высокой нагрузке белка возможен падеж животных, не связанный с заражением В. р8еис1ота1Ш [19].

Модель острого мелиоидоза представляет огромный интерес с точки зрения изучения возможности применения средств пассивной защиты от возбудителя мелиоидоза при разработке тактики предупреждения последствий биотеррористических атак. Эти данные ценны и для перспективного планирования экспериментальных исследований по созданию таких препаратов. На сегодняшний день важно то, что были получены доказательства эффективности применения мелио-идозных МКА, взаимодействующих с эдитопами гликопротеина и ЛПС, локализованными на поверхности бактериальной клетки, способных существенно удлинять сроки СПЖ по сравнению с контролем, в ряде случаев до 4-5 раз. Они подтверждают опубликованные сведения об успешном применении МКА против эк-зополисахарида и ПС-фрагмента ЛПС В. рзеис1ота1Ш для продления сроков СПЖ и повышения показателей выживаемости экспериментальных животных [19, 56, 83,124].

При работе с менее вирулентными штаммами В. рйеис1ота1Ш С-141 и 56830 экспериментальная инфекция имела черты хронической патологии: по истечении 30 суток в контрольных группах выживали 33-50% животных.

Профилактическое введение мышам, зараженным как 15 1Л350, так и 30 ЬО50 В. р$еис1ота1Ш С-141, нормального мышиного иммуноглобулина в установленном режиме серопрофилактики не оказывало влияния на сроки СПЖ и показатели выживаемости по сравнению с контролем заражения (р>0,05). В первом опыте с использованием штамма В. ряеис1ота1Ш С-141 эффективными средствами защиты являлись 8 из 12 использованных вариантов моноклональных иммуноглобулинов 1-1У групп эпитопной направленности. Введение МКА вц, 2А6 ,2А8, 2 Бц, №^208, 2Е5,1Ею повышало показатель выживаемости животных, зараженных 15 Ы)50 В. р8еис1ота1М С-141 до 83 %. Во втором опыте при двукратном повышении заражающей дозы В. р8еис1ота1Ш С-141 только МКА ММРрт-2 и 2А6 против эпитопов Аг 8 и МКА 2¥и, взаимодействующие с эпитопами Аг 6, достоверно удлиняли сроки СПЖ мышей. Эти варианты МКА соответствовали характеристике: эффективные средства защиты от инфекции.

В опыте с заражением мышей 50 ЬО50 В. ряеис1ота11е1 56830 выявлено, что МКА I группы специфичности (ММРрт-2) способствовали повышению показателя выживаемости до 83 % против 33 % в контроле заражения и 33 % в группе «препарат сравнения». При введении МКА II группы специфичности (2А8, 2¥\\, этот показатель был равен 83 %, 83 %, 100% соответственно, МКА III группы специфичности (1Р4, 1Р5) - 100 % и 83 % соответственно, МКА IV группы специфичности (2Е5> 1Ею) - 100 % и 83 % соответственно. Необходимо отметить, что четкой взаимосвязи между изотипом МКА и их протективным потенциалом в проведенных экспериментах не выявлено.

Анализ результатов всех проведенных экспериментов с использованием трех различных штаммов В. р8еис1ота1Ш позволил установить, что в качестве средств экстренной профилактики экспериментального мелиоидоза наиболее перспективными образцами МКА с высокими показателями протективности обладают МКА вц, 2Рц и 2А8 Использование показателя «% защиты» наряду с традиционными критериями оценки результатов опытов (сроки СПЖ, выживаемость животных в группах) позволило расширить представление о МКА различной эпитопной направленности как об эффективных средствах защиты от инфекции. Применение моноклональных иммуноглобулинов, взаимодействующих с эпитопами на Аг 8 и Аг 6, в режиме экстренной профилактики оказывало существенное влияние на течение экспериментального мелиоидоза, приводило к достоверному увеличению СПЖ экспериментальных животных и к повышению показателя выживаемости особей (от 50 до 100 %).

В последнее время в связи с обсуждением целесообразности использования специфических антител для создания пассивного иммунитета, защищающего макроорганизм от патогена, ряд авторов высказывают суждение о более высоком потенциале МКА как средства профилактики инфекции нежели как средства лечения заболевания [62, 69, 124]. Представленные в настоящей работе экспериментальные данные, особенно в части защиты животных от острого мелиоидоза, могут служить демонстрацией эффективности профилактического применения мелиоидозных МКА. Учитывая способность B.pseudomallei длительное время сохраняться в фагоцитах [102, 106, 139], использование МКА с высокими показателями протективного потенциала в режиме экстренной профилактики в качестве средств, предупреждающих колонизацию внутриклеточной ниши, может явиться важным звеном в общей схеме профилактических мероприятий, направленных на уменьшение последствий инфицирования возбудителем мелиоидоза.

Таким образом, в соответствии с целью и задачами работы было выполнено комплексное исследование по изучению протективных свойств мелиоидозных моноклональных антител, взаимодействующих с эпитопами, локализованными на поверхности микробных клеток B.pseudomallei.

Были получены приоритетные данные о бактериостатическом потенциале МКА различной эпитопной направленности, о влиянии опсонизации В pseudo-mallei этими антителами in vitro на функциональное состояние бактерий, регистрируемое по показателям задержки их роста на плотной питательной среде, новые данные о роли моноклональных иммуноглобулинов в реализации процесса иммунного фагоцитоза in vivo и в предупреждении развития экспериментальной инфекции при условии превентивного введения животным МКА, узнающих эпи-топы на антигенах, относящихся к факторам вирулентности возбудителя мелиои-доза (Аг 8, Аг 6).

Полученные данные являются доказательствами перспективности использования МКА, взаимодействующих с эпитопами на Аг 8 и Аг 6, экспонированными на поверхности микробных клеток, для защиты от мелиоидозной инфекции, а также позволяют судить о наиболее значимых из поверхностно локализованных биополимеров с точки зрения их включения в экспериментальные комбинированные вакцинные препараты, рассматриваемые в качестве средств специфической защиты от возбудителя мелиоидоза.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дрефс, Наталья Михайловна, Волгоград

1. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях // Л., 1962. 180с.

2. Белобородов Б. Б., Ветвицкая И. М. Современная концепция применения иммуноглобулинов для внутривенного введения при сепсисе и септическом шоке // Инфекции и антимикробная терапия. 2001. - Т. 3. - № 1. - С. 14 -15.

3. Биосинтез антигена 8 в процессе культивирования Burkholderia pseudomallei и B.mallei / Самыгин В.М., Храпова Н.П., Спиридонов В.А., Степин A.A. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.- 2001. № 4. - С. 50 -52.

4. Изучение иммуногенных и иммунотропных свойств кислого экзополисаха-рида Pseudomonas pseudomallei: Отчет о НИР (заключит.) / Вологогр. н. и. (НИ) противочум. ин-т. - Волгоград, 1994. - № ГР 01.9.20 006776 - 32с.

5. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля. М. - Медицина, 1987. - 472с.

6. Иммуномодулирующая активность актопротекторов при экспериментальном мелиоидозе / Жукова С.И., Рыбкин B.C., Фарбер С.М. и др. // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций: Матер. Рос. науч. конф. Саратов, 1993. - С. 118-119.

7. Иммунология мелиоидоза / Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C., Жукова С.И. и др. // Мелиоидоз: Сб. науч. тр. Под ред. Н.Г. Тихонова Волгоград, 1995. - С. 119-142.

8. Иммунологическая диагностика мелиоидоза / Храпова Н.П., Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C. и др. // Мелиоидоз: Сб. науч. тр. Волгоград, 1995. - С. 57-68.

9. Иммунобиологические свойства капсульного вещества Burkholderia pseu-domallei / Попов С.Ф., Тихонов Н.Г., Пивень H.H. и др.// Журн. микро-биол., эпидемиол., иммунобиол.- 2002. № 6. - С.60 - 64.

10. Каплиев В.И., Пивень H.H., Храпова Н.П. / Определение локализации антигенов возбудителя мелиоидоза на ультраструктурном уровне с помощью моноклональных антител // Микробиол. журн. 1992. - Том 54. - № 1. -С.85 - 89.

11. Кислый экзополисахарид возбудителя мелиоидоза / Денисов И.И. Илюхин В.И., Храпова Н.П. и др. // Журн. микробиол. эпидемиол., иммунобиол. -1995. -№ 6. С.16-17.

12. Лобанов А.Н. Ранняя лабораторная диагностика сапа и мелиоидоза и прогнозирование их исхода: Автореф. дис. к. м. н. Саратов, 1992. - 17 с.

13. Мелиоидоз // Сб. науч. тр. Под ред. Н.Г. Тихонова. Волгоград: Ниж.-Волж. кн. изд-во, 1995. - 224с.

14. Новицкая И.В., Храпова Н.П. Моноклональные антитела в ранней диагностике и комплексном лечении сапа и мелиоидоза в эксперименте // Акт. пробл. ветеринарии: Матер, междунар. конф. Барнаул, 1995. - С.89.

15. Организация ликвидации медико-санитарных последствий биологических, химических и радиационных террористических актов: Практическое руководство // Москва, ФГУ «ВЦМК «Защита». 2005. - 328 с.

16. Оценка продукции капсульного гликопротеинового комплекса Burkholderia pseudomallei при мелиоидозной инфекции / Плеханова Н.Г., Алексеев В.В., Пивень H.H. и др. // Пробл. особо опасных инфекций. Вып. 87. - 2004. -С.65-66.

17. Патогенез экспериментального легочного мелиоидоза у белых крыс / Алексеев В.В., Савченко С.Т., Яковлев А.Т. и др. // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций: Матер. Рос. науч. конф. Волгоград, 1992. - С. 179.

18. Патогенез, патологическая анатомия и патологическая морфология мелиоидоза / Алексеев В.В., Тихонов Н.Г., Вязьмина Т.Н. с соавт. // Мелиоидоз: Сб. науч. тр. Волгоград, 1995. - С.91 -119.

19. Пивень Н. Н. Антигенный анализ возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности: Дис. д. м. н./-Волгогр. н.-и. (НИ) противочум. ин-т., 1997. 296 с.

20. Поверхностный гликопротеиновый антиген 8 как один из факторов патогенности возбудителя мелиоидоза / Пивень H.H., Смирнова В.И., Каплиев

21. В.И. и др.// Тез. докл. 6-ого Всерос. съезда микробиол., эпидемиол. и пара-зитол. М., 1991. - Т. 2.-С.194- 195.

22. Попов С.Ф. с соавт. Popov S., Kurilov V., Iakovlev V. Pseudomonas pseu-domallei and Pseudomonas mallei are capsule forming bacteria // Zh Microbiol Epidemiol Immunobiol. 1995. - № 5. - P.32 - 36.

23. Ройт А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология / Пер. с англ. М: Мир, 2000. -592с.

24. Роль поверхностных антигенов Pseudomonas pseudomallei в патогенезе ме-лиоидоза / Пивень H.H., Смирнова В.И., Каплиев В.И. и др. // Журн. микробиол. эпидемиол., иммунобиол. -1991. № 10. - С. 8 -12.

25. Роль опсонинов в защите макроорганизма от Burkholderia pseudomallei: Отчет о НИР (заключит.) / Вологогр. н. и. (НИ) противочум. ин-т. - Волгоград, 2004. - № ГР 01.20.02 06198 -46с.

26. Серопрофилактика экспериментального мелиоидоза / Тихонов Н.Г., Храпова Н.П., Новицкая И.В и др. // Акт. вопр. профилактики особо опасных инфекционных заболеваний: Тез. докл. Межвед. науч. конф. Киров, 1991. - С.78 - 79.

27. Создание люминесцирующих и иммуноферментных диагностических препаратов на основе сапных и мелиоидозных моноклональных антител:

28. Отчет о НИР (заключит.) / Волгогр. н и. (НИ) противочум. ин-т. - Волгоград, 1997.- № ГР 01.9.50 001333.-73 с.

29. ТУ 42 КВС 176-80 «Сыворотки моноспецифические против IgG, IgM, IgA мыши, кроличьи сухие». Утверждены КВС 20 февраля 1980 г.

30. Ультраструктурно-иммунохимическое изучение капсулы патогенных буркхольдерий / Пивень Н.Н., Алексеев В.В., Попов С.Ф и др. // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол.- 2005. № 5. - С. 19-24.

31. Участие поликлональных и моноклональных антител в опсонизации возбудителя мелиоидоза и развитии экспериментальной инфекции: Отчет о НИР (заключит.) / Волгогр. н.- и. (НИ) противочум. ин-т. Волгоград, 2000.- № ГР 01.9.90 002311-36с.

32. Храпова Н.П. с соавт. Khrapova N.P., Tikhonov N.G., Prokhvatilova Y.V. Detection of glycoprotein of Burkholderia pseudomallei // Emerg. Infect. Dis. -1998. V.4, № 2. - P. 336-337.

33. Цецхладзе H.C. Активная и пассивная иммунизация и ее сочетанное применение с антибактериальными препаратами при экспериментальной чуме: Автореф. дис.к. б. н. -Ростов-н/Д, 1998. -20 с.

34. Янкина Н.Ф., Ванеева Л.И. Разработка метода получения конъюгатов пе-роксидазы с антииммуноглобулином для иммуноферментного анализа // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1985, № 1. - С. 35 - 40.

35. An acute septic course of melioidosis after a stay in Thailand / Koch F. W., Zoller M., Pankow W. et al. // Deisch. Med. Wochenschr. 1997. -V. 122, № 5. -P. 122- 126.

36. Antilipopolysaccharide II: an antibody protective against fatal melioidosis / Charuchaimontri C., Suputtamongkol Y, Nilakul C. et al. // Clin. Infect Dis. -1999.-№29.-P. 813-818.

37. Arabinose assimilation defines a nonvirulent biotype of Burkholderia pseudo-mallei / Smith M.D., Angus В .J., Wuthiekanun V., White N.J. // Infect. Immun.- 1997.-№65.- P.4319 4321.

38. Ashdown L.R., Guard R.W. The prevalence of human melioidosis in northern Queensland // Amer. J. Trop. Med. Hyg. 1984,- V.33, № 3.- P. 474 - 478.

39. Ashdown L.R., Koechler J. M. Production of hemolisin and other extracellular enzymes by clinical isolates of Pseudomonas pseudomallei // Clin. Microbiol. -1990.- V. 28. P. 2331 -2334.

40. Attempted passive prophylaxis with a monoclonal anti-Burkholderia pseudo-mallei exopolysaccharide antibody in a murine model of melioidosis / Bottex C., Gauthier Y.P., Hagen R.M. et. al. // Immunopharmacol Immunotoxicol. 2005.- V.27, № 4. P.565 - 583.

41. Battershill J. L., Speert D. P., Hancock E. W. Use of monoclonal antibodies to protein F of Pseudomonas aeruginosa as opsonins for phagocytosis by macrophages // Inf. Immun. 1987. - V. 55, № 10. - P. 2531 - 2533.

42. Baumgartner J.D. Monoclonal anti-endotoxin antibodies for the treatment of gramnegative bacteremia and septic shock // Eur. J. Clin. Microbiol.& Infect. Dis. -1990. -V. 9, № 10. P. 711 - 716.

43. Beharra A.A., Iandolo J.J., Chapes S.K. Staphylococcal enterotoxins bind H-2Db molecules on macrophages // Proc Natl Acad Sei USA. 1995. - № 92. - P.6294 - 6298.

44. Biochemical characteristics of clinical and environmental isolates of Pseudomonas pseudomallei / Wuthiekanum V., Smith M.D., Dance D.A. et al. // J. Med. Microbiol. 1996. - № 45. - P. 408 - 412.

45. Bishop 0., Orr T., Barrell P. F. Phagocytosis and killing of Pseudomonas aeruginosa by mouse polymorphonuclear leucocytes in vitro promoted by antiserum to the slime glycoprotein // Inf. Immun. 1982. - V. 37, № 1. - P. 378 - 381.

46. Bloch M., Soundy G., Gusman A. Infections por Pseudomonas otras que la aeruginosa // Rev. Inst. Invest. Med. 1981. - V. 10, № 2. - P. 164 - 189.

47. Boulnois G.J., Roberts I. S. Genetics of capsular polysacharide production in bacteria // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. - V. 150. - P.l - 18.

48. Brett P.J., Mah D.C., Woods D.E. Isolation and characterization of Pseudomonas pseudomallei flagellin proteins // Infect. Immun. 1994. - № 62. - P. 1914 -1919.

49. Brett, P.J., Woods, D.E. Structural and immunologic characterization of Burkholderia pseudomallei O-polysacharide-flagellin protein conjugates // Infect. Immun. 1996. - № 64. - P. 2824 - 2828.

50. Brett, P.J., DeShazer, D., Woods, D.E. Characterization of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia pseudomallei like strains // Epidemiol. Infect. -1997.-№ 118.-P.137- 148.

51. Brett P.J., DeShazer D., Woods D.E. Burkholderia thailandensis sp. nov., a Burkholderia pseudomallei like species // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1998. - № 48.- P.317 - 320.

52. Brett P.J., Woods D.E. Pathogenesis of and immunity to melioidosis // Acta Trop. 2000. - V.74, № 2 - 3. - P. 201 - 210.

53. Brook M.D., Currie B., Desmarchelier P.M. Isolation and identification of Burkholderia pseudomallei from soil using selective culture techniques and the polymerase chain reaction / J. Appl. Microbiol. 1997. - V. 82, № 5. - P. 589 -596.

54. Burkholderia pseudomallei infection in the Singapore armed forces from 1987 to 1994 an epidemiological review / Lim M.K., Tan E.H., Soh C.S., Chang T.L. // Ann. Acad. Med. Singapore. - 1997. -V. 26., № 1. - P. 13 -17.

55. Casadevall A, Schraff M. Return to the past: the case for antibody-based therapies in infectious diseases // Clin Infect Dis. 1995. - № 21. - P. 150-161.

56. Casadevall A. Antibody-based therapies for emerging infectious diseases // Emerg. Infect. Dis. 1996. - № 2. - P.200 - 208.

57. Casadeval A. Passive antibody administration (immediate immunity) as a specific defense against biological weapons // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V.8, N.8. -P. 833 - 841.

58. Ceftazadime vs. amoxicillin / clavulanate in the treatment of severe melioidosis / Suputtamongkol Y., Rajchanuwong A., Chaowagul W. et al. // Clin. Infect. Dis. 1994. - № 19. - P.846 - 853.

59. Characterization of mouse monoclonal antibodies produced by immunization with single serotype component of a polyvalent Pseudomonas aeruginosa vaccine / Barclay G.R., Yap P.L., McClelland D.B. et al. // J. Med. Microbiol. -1986. V. 21. - P.87-90.

60. Characterisation of an acapsular mutant of Burkholderia pseudomallei identified by signature tagged mutagenesis / Atkins T., Prior R., Mack K. et al. // J. Med Microbiol 2002. - № 51. - P. 539 - 547.

61. Characterization of the capsular polysaccharide of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei 304b / Masoud H., Ho M., Schollaardt T., Perry M.B. // J. Bacterid. 1997. - № 179. - P.5663 - 5669.

62. Coenye T., LiPuma J.J. Molecular epidemiology of Burkholderia species/ Front Biosci. 2003, № 1. - P. 55 - 67.

63. Cross A. Intravenous immunoglobulins to prevent and treat infectious diseases // Immunobiology of proteins and peptides VIII. New York: Plenum Press -1995.

64. Dance D.A. Melioidosis // Rev. Med. Microbiol.- 1990. № 1 - P. 143 - 150.

65. Dance D.A. Melioidosis: the tip of the iceberg? // Clin. Microbiol. 1991. -Rev.4. - P. 52 - 60.

66. Dance D.A. Melioidosis is an emerging global problem / Acta Trop. 2000. -V.74, № 2-3. P. 115 -119.

67. Dannenberg A.M., Scott E.M. Melioidosis: pathogenesis and immunity in mice and hampsters. 1. Studies with virulent strains of Maleomyces pseudomallei // J Exp. Med. 1958. - № 107. - P. 153 - 164.

68. DeShazer D., Brett P., Woods D. E. The type II O-antigen moiety of Burkholderia pseudomallei lipopolysaccharide is required for serum resistance and virulence //Mol. Microbiol. 1998.-V. 30.-P.1011 -1081.

69. Dodin A., Ferry D. Recherches epidemiologiques du bacille de Whitmore en Afrique // Bull. Soc. Pathol. Exot. 1974. - V.67, № 2 - P. 121-126.

70. Dodin A. La melioidose: un probleme mondial. (Melioidosis an asian disease now a Worldproblem) // Recherche. 1976. - V. 7, № 68. - P.574 - 577.

71. Drevets D.A., Campbell P.A. Roles of complement and complement receptor type 3 in phagocytosis of Listeria monocytogenes by inflammatory mouse peritoneal macrophages // Infect. Immun. -1991. № 59. - P. 2645 - 2652.

72. Egan A.M., Gordon D.L. Burkholderia pseudomallei activates complement and is ingested but not killed by polymorphonuclear leukocytes// Infect. Immun. -1996.-№64.-P. 4952-4959.

73. Ellison D.W., Baker H.J., Mariappan M. Melioidosis in Malaysia. I. A method for isolation of Pseudomonas pseudomallei from soil and surfase water // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1969. - № 18. - P. 694 - 697.

74. Epidemiology of arabinose assimilation in Burkholderia pseudomallei isolated from patients and soil in Thailand / Trakulsomboon S., Vuddhakul V., Tharavi-chitkul P. et. al. // Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1999. - V.30, № 4.-P.756-759.

75. Exopolysaccharides of Burkholderia pseudomallei / Steinmetz I., Nimtz M., Wray V. et al. // Acta Tropica. 2000. - № 74. - P.211 - 214.

76. Fatal human melioidosis in south-eastern Queensland / Scott I.A., Bell A.M., Staines D.R. // Med. J. Aust. 1997. - V. 166, № 4. - P. 197 -199.

77. Fearon D.T. Identification of the membrane glycoprotein that is the C3b receptor of the human erythrocyte, polymorphonuclear leukocyte, B lymphocyte and monocyte // J. Exp. Med. 1980. - № 152. - P.20 - 30.

78. Functionally active monoclonal antibody that recognizes an epitope on the O side chain of Pseudomonas aeruginosa immunotype-1 lipopolysaccharide / Stoll B. J., Pollack M., Young L. S. et al // Inf Immun. 1986. - V. 53, № 3.- P. 656662.

79. Galimand M. Nouvel habitat de Pseudomonas pseudomallei // These Doct. de 3 cycle. Microbiología. Universite. Paris VII. - 1979. - 315 pp.

80. Goding J. W. Monoclonal antibodies: principles and practice // Acad. Press. -1986.-315 pp.

81. Gordon D.L., Johnson G.M., Hostetter M.K. Ligand-receptor interactions in the phagocytosis of virulent Streptococcus pneumoniae by polymorphonuclear leukocytes // J. Infect. Dis. 1986. - № 154. - P.619 - 626.

82. Green R.N., Tuffneil P.G. Laboratory acquired melioidosis // Am. J. Med. 1968.-№44.- P.599-605.

83. Hall B.F., Joiner K.A. Strategies of obligate intracellular parasites for evading host defences // Immunol. Today. -1991. № 12. - P. A22 - A27.

84. Half-life of the maternal IgGl allotype in infants / Sarvas H, Seppala I, Kurrikka S. et al // J Clin Immunol.- 1993. -№ 13.-P.145 -151.

85. Halving of mortality of severe melioidosis by ceftasidime / White N.J., Dance D.A.B., Chaowagul W. et al. // Lancet. -1989. № 2. - P. 697 - 701.

86. Hancock R. W., Mutharia L. M., Mouat E. C. The immunotheiapeutic potential of monoclonal antibodies against Pseudomonas aeruginosa protein F // Eur. J. Clin. Microbiol. 1985. - V. 4. - P. 224 - 227.

87. Hirst R.G., Indriana J., Cocciolone R.A. An introduction to melioidosis. Innate resistance and acquired immunity to Pseudomonas pseudomallei // Aust. Biol. -1992. № 5. - P.203 - 213.

88. Howe C., Sampath A., Spotnitz M. The pseudomallei group: a review // J. Infect. Dis. 1971.- № 124. - P. 598 - 606.

89. Human monoclonal antibody with protective activity for Escherichia coli Kl and Neisseria meningitidis group B infections / Raff H. V., Devereux D., Shuford W. et al.// J. Infect. Dis. 1988. - V.157. - № 1. - P.l 18 -128.

90. Human melioidosis: and emerging medical problem / Smith C.J., Allen J.C., Embi M.N. et al. // MIRCEN J. 1987. - № 3. - P. 343 - 366.

91. Human monoclonal antibodies that protect mice against challange with Pseudomonas aeruginosa / Zweerink H. J., Gammon H., Hutchinson C. et al. // Inf. Immun. 1988. - V. 56, № 8. - P. 1873 - 1879.

92. Identification of protective outer membrane antigens of Brucella ovis by passive immunization of mice with monoclonal antibodies / Bowden R.A., Estein S.M., Zygmunt M.S. et al. // Microbes Infect. 2000. - № 2. - P. 481 - 488.

93. Inhibition of macromolecular synthesis in cultured macrophages by Pseudomonas pseudomallei exotoxin / Mohamed R., Nathan S., Embi N. et al. // Microbiol. Immunol. 1989. - № 33. - P. 811 - 820.

94. In vitro and in vivo activity of polyclonal and monoclonal human immunoglobulins G, M and A against Pseudomonas aeruginosa lipopolysaccharide / Pier G. B., Thomas D., Small G. et al. // Inf. Immun. -1989. V.57, № 1. - P. 174 -179.

95. In vitro and in vivo immunobiological properties of murine monoclonal antiBrucella antibodies / Adone R, Ciuchini F, Pistoia C, Piccininno G. // Appl Microbiol Biotechnol. 1994. - № 40. - P. 818 - 821.

96. Joiner K.A., Brown E.J., Frank M.M. Complement and bacteria: chemistry and biology in host defense // Annu. Rev. Microbiol. 1984. - № 2 - P. 461 -491.

97. Joiner K.A. Complement evasion by bacteria and parasites // Annu. Rev. Microbiol. 1988.-№42-P. 201 -230.

98. Jones A.L., Beveridge T.J., Woods D.E. Intracellular survival of Burkholderia pseudomallei // Infect. Immun. 1996. - № 64. - P. 782 - 790.

99. Kaufmann S.H.E. Immunity to intracellular bacteria // Annu. Rev. Immunol. 1993.-№ 11.-P. 129- 163.

100. Leakey A.K., Ulett G.C., Hirst R.G. BALB/c and C57BL/6 mice infected with virulent Burkholderia pseudomallei provide contrasting animal models for the acute and chronic forms of human melioidosis // Microb. Pathog. 1998. - V.24, № 5. - P.269 - 275.

101. Leelarasamee A., Bovornkitti S. Melioidosis: review and update // Rev. Infect. Dis. 1989. - № 11. - P. 413 - 425.

102. Lederberg J, Shope R, Oaks S. Emerging Infections // Washington: National Academy Press. 1992.

103. Lemley P.V., Amanatides P., Wright D.C. Identification and characterization of a monoclonal antibody that neutralizes ricin toxicity in vitro and in vivo // Hybridoma 1994. - № 13. - P.417 - 422.

104. Li L., He J. Pseudomonas pseudomallei and melioidosis in China // Clin. -1992. V. 105, № 5. - P. 775-779.

105. Mackowiak P.A., Smith J.W. Septicemic melioidosis: occurrence following acute influenza A six years after exposure in Vietnam // JAMA 1978. -№ 240. - P.764 - 766.

106. Mays E.E., Ricketts E.A. Melioidosis: recrudescence associated with bronchogenic carcinoma twenty-six years following initial geographic exposure // Chest. 1975. - № 68. -P.261 - 263.

107. Melioidosis: a major cause of community-acquired septicemia in northeastern Thailand / Chaowagul W., White N.J., Dance D.A.B et al. // J. Infect. Dis. -1989.-№ 159.-P. 890-899.

108. Melioidosis: forgotten, but not gone / Koponen M.A., Zlock D., Palmer L., Merlin T.L. // Arch. Intern. Med. 1991. - № 137. - P.605 - 608.

109. Melioidosis: acute and chronic disease, relapse and re-activation / Currie B.J., Fisher D.A., Anstey N.M. et al. // Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2000. - V.94, №3.-P.301 -304.

110. Multifactorial pathogenic mechanisms of Burkholderia pseudomallei as suggested from comparison with Burkholderia cepacia / Wongwanich S., Cho-tanachan P., Kondo E., Kanai K. // Southeast Asian J. Trop. Med. Pub. Health -1996.-№27.-P. Ill -118.

111. O'Berry P.A. A comparison of 3 metods of serum fractionation in the preparation of vibrio fetus fluorescent antibody conjugates // Am. J. Vet. Res. 1964. - V.25. -P.1669-1672.

112. Passive immune protection by Herpes implex virus-specific monoclonal antibodies and antibody-resistant mutants altered in pathogenicity / Kiimel G., Kaerner H. C., Levine M. et al. // J. Virol. 1985. - V. 56, № 3. - P. 930-937.

113. Passive protection of diabetic rats with antisera specific for the polysaccharide portion of the lypopolysaccharide isolated from Pseudomonas pseudomallei / Bryan L.E., Wong S., Woods D.E. et al.// Can. J. Infect. Dis. 1994. - V.5. -P. 170-178.

114. Passive protection by polyclonal antibodies against Bacillus anthracis infection in guinea pigs / Little S.F., Ivins B.E., Fellows P.F., Friedlander A.M. // Infect Immun. 1997. - № 65. - P.5171-5175.

115. Passive protection against Burkholderia pseudomallei infection in mice by monoclonal antibodies against capsular polysccharide, lipopolysccharide or proteins / Jones S., Ellis J., Russel P. et al. // J. Med. Microbiol. 2002. -V. 51. -P.1055-1062.

116. Payne N.R., Horwits M.A. Phagocytosis of Legionella pneumophila is mediated by human monocyte complement receptors // J. Exp. Med. 1990 -№ 166.-P. 1377-1389.

117. Pier G.B. Rationale for development of immunotherapies that target mucoid Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis patients // Behr. Inst Mitt. -1997.-V. 98.- P.350-360.

118. Pigott J.A., Hochholzer L. Human melioidosis. A histopathologic study of acute and chronic melioidosis // Arch. Pathol. 1970. - № 90. - P. 101 - 111.

119. Pitt T.L. Pseudomonas mallei and Pseudomonas pseudomallei // In: Topley and Wilson's Principles of bacteriology, virology and immunity. Systematic bacteriology. London, Edward Arnold. - 1990. - V. II, 8th edn. - P.265-273.

120. Pitt T.L., Aucken H., Dance D.A. Homogeneity of lipopolysaccharide antigens in Pseudomonas pseudomallei // J. Infect. 1992. - № 25 - P. 139 - 146.

121. Polyclonal and monoclonal antibody therapy for experimental Pseudomonas aeruginosa pneumonia/ Pennington J. E., Small G. J., Lostrom M. E., Pier G. B. // Inf. Immun. 1986. - V. 54, №1. - P. 239 - 244.

122. Poxton I.R., Arbuthnoff J.P. Determinants of bacterial virulence // In: Topley and Wilson's Principles of bacteriology, virology and immunity. London, Edward Arnold.- 1990,- V. I, 8th edn. - P. 332 - 351.

123. Principles and practice of infectious diseases / Densen P., Mandell G.L., Bennett J.E., Dolin R // Complement. Churchill Livingstone. - 1995. - P. 58 -78.

124. Production and characterization of a protease from Pseudomonas pseudomallei / Sexton M. M., Jones A. L., Chaowagul W., Woods D. E. // Clin. Microbiol. -1994.-V. 40.-P. 903 -910.

125. Propost A., Vigier M. Isolement au Tchad (Afrique centrale) de deux souches de Malleomyces pseudomallei // Ann. Inst. Pasteur. 1960. - V. 98, № 3. -P. 461 -463.

126. Protection against infection with Neisseria meningitidis group B serotype-specific monoclonal antibody / Brodeur B. R., Larose Y., Tsang P. et al. // Inf. Immun. 1985. - V. 50, № 2. - P. 510 - 516.

127. Protection of mice from fatal bubonic and pneumonic plague by passive immunization with monoclonal antibodies against the Fl protein of Yersinia pestis / Anderson G.W., Worsham P.L., Bolt C. et al. // Am J Trop Med. 1997. -№56.-P. 471-473.

128. Pruksachartvuthi S., Aswapokee N., Thakerngpol K. Survival of Pseudomonas pseudomallei in human phagocytes // Med. Microbiol. 1990. - V. 31. - P. 109-114.

129. Pulmonary melioidosis / Ip M., Osterberg L.G., Chau P.Y., Raffln T.A. // Chest. 1995. - № 108. - P.1420 - 1424.

130. Punyagupta S. Melioidosis review of 686 cases and presentation of a new clinical classification // In: Melioidosis Proceedings of National Workshop on Melioidosis.- Bangkok, Thailand. 1989. - P. 217 - 229.

131. Purification and characterization of a cytotoxic exolipid of Burkholderia pseudomallei / Haubler S., Nimtz M., Domke T. et. al. // Infect. Immun. 1998. -№66.-P.1588- 1593.

132. Puthucheatry S.D., Vadivelu J. Human melioidosis / Singapore University Press. 2002. - 95 p.

133. Quantitative recovery of Burkholderia pseudomallei from soil in Thailand / Smith M.D., Wuthiekanun V., Walsh A.L., White N.J. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1995. - № 89. - P. 488 - 490.

134. Outer-membrane protein- and rough lipopolysaccharide-specific monoclonal antibodies protect mice against Brucella ovis / Bowden R A., Cloeckaert A , Zygmunt M.S., Dubray G. // J Med Microbiol 1995. - № 43. - P. 344 - 347.

135. Razak N., Ismail G. Interaction of human polymorphonuclear leukocytes with Pseudomonas pseudomallei // J. Gen. Appl. Microbiol. 1982. - № 28. - P.509-518.

136. Recent developments in laboratory diagnosis of melioidosis / Sirisinha S , Anuntagool N., Dharakul T. et al. // Acta Tropica. 2000. - № 74 - P. 235 - 245.

137. Reckseidler-Zentero S.L., DeVinney R., Woods D.E. The capsular polysaccharide of Burkholderia pseudomallei contributes to survival in serum by redusing complement factor C3b deposition // Infect. Immun. 2005. - V. 73, № 2.-P. 1106-1115.

138. Relapse in melioidosis : incidence and risk factors / Chaowagul W., Suput-tamongkol Y., Dance D.A.B, et al. // J. Infect. Dis. 1993. - № 168. - P. 11811185.

139. Resistance of Pseudomonas pseudomallei to normal human serum bactericidal action / Ismail G., Razak N., Mohamed R. et al. // Microbiol. Immunol. -1988.-№32.-P. 645-652.

140. Ribotype analysis of Pseudomonas pseudomallei isolates / Sexton M.M., Goebel L.A., Godfrey A.J. et al. // J. Clin. Microbiol. 1993. - № 31. - P. 238 -243.

141. Salyers A.A., Whitt D.D. Bacterial pathogenesis: a molecular approach // ASM Press, Washington, D.S. 2002. - № 2. - P. 115 -130.

142. Samuel M., Ti T.Y. Intervention for treating melioidosis / Cochrane Database Syst. Rev. 2002.-№4.

143. Sanford J.P. Principles and Practice of Infectious Diseases / In: Mandell G.L., Douglas Jr, R.G., Bennett J.E. (Eds.) // Churchill Livingstone, New York. -1990.- P. 1692 1696.

144. Saxen H. Mechanizme of the protective action of anti-Salmonella IgM in experimental mouse salmonellesis // J. General Microbiol. 1984. - V. 130. -P. 2277-2283.

145. Schlesinger L.S , HorwitzA. Phagocytosis of leprosy bacilli is mediated by complement receptors CR1 and CR3 on human monocytes and complement component C3 in serum // J. Clin. Invest. 1990. - № 85. - P. 1304 - 1314.

146. Shedding of lypopolysaccaride and 200-kDa suface antigen during the in vitro growth of virulent Ara" and avirulent Ara+ Burkholderia pseudomallei / Anuntagool N., Panichakul T., Aramsri P., Sirisinha S. // Acta trop. 2000.-№74.-P.221 -228.

147. Shigeoka A. O., Jensen C. L., Pincus S. H. Absolute requirement for complement in monoclonal IgM antibody-mediated protection against experimental infection with type III group B streptococci // J. Infect. Dis. -1984. V.150, № 1. - P. 63-70.

148. Silbermann M.H., Gyssens I. C., Endtz H.P. et al. Two patients with reccurent melioidosis after prolonged antibiotic therapy // Scand. J. Infect. Dis. 1997. -V. 29, № 2. -P. 199-201.

149. Sokol P. A. Suface expression of ferripyochelin-binding protein is required for virulence of Pseudomonas aeruginosa // Inf. Immun. 1987. - V. 55, № 9. -P. 2021 -2025.

150. Song Yang. Damages must had occurred on the outer membrane of Burkholderia pseudomallei after exposure to normal sera // Intern. Congress on Melioidosis. Bangkok, Thailand. - 1998. - P. 118.

151. Specificity and functional activity of anti-Burkholderia pseudomallei polysaccharide antibodies / Ho M., Schollaardt T., Smith M. D. et al. // Inf. Immun. -1997. V. 65. - № 9. - P. 3648 - 3653.

152. Steinmetz I, Rohde M., Brenneke B. Purification and characterisation of an exopolysaccharide of Burkholderia ( Pseudomonas) pseudomallei // Infect Immun. 1995.-№ 63.-P. 3959 - 3965.

153. Structural characterization of the lipopolysaccharide O-antigens of Burkholderia pseudomallei / Perry M. B., Maclean L. L., Schollaardt T. et al. // Infect. Immun. 1995. -V. 63. - P. 3348 - 3352.

154. The 1990-1991 outbreak of melioidosis in the Northern Territory of Australia: clinical aspects / Currie B., Howard D., Nguyen V.T. et. al.// Southeast Asian J Trop Med Public Health. 1993. - V.24, № 3. - P. 436 - 443.

155. Toxin production by Burkholderia pseudomallei strains and correlation with severity of melioidosis/ Haase A., Janzen J., Barrett S., Currie B. // Med. Microbiol.-1997,- V. 46.-P. 557-563.

156. Toxigenic properties of Pseudomonas pseudomallei extracellular products / Ismail G., Embi M. N., Omar 0., Razak N. // Trop. Biomed. 1987. - № 4. -P. 101 - 110.

157. Tumor necrosis factor in septicemic melioidosis / Suputtamongkol Y., Kwia-kowski Y.D, Dance D.A.B et al. // J. Infect. Dis. 1992. - № 165. - P. 561 -564.

158. Ulett G.C., Ketheesan N., Hirst R.G. Macrophagelymphocytic interactions mediate anti-Burkholderia pseudomallei activity // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998. - № 21. - P. 283 - 286.

159. Use of endotoxin antigens in enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of B.pseudomallei infection (melioidosis)/ Petkanjanapong, V., Naigowii, P., Kondo, E., Kanai, K. // Asian Pacific J. Allergy Immunol. 1992. - № 10. -P. 145- 150.

160. Van Oss C. J. Phagocytosis: an overview // Methods Enzymol. 1986. -№132.- P. 3-15.

161. Vizcaino N., Fernandez-Lago L. Protection and suppression of the humoral response in mice mediated by a monoclonal antibody against the M epitope of Brucella// FEMS Immunol Med Microbiol. 1994. - № 8. - P. 133 - 139.

162. Wolinsky J. S., Waxham M. N., Server A. C. Protective effects of glycopro-tein-specific monoclonal antibodies on the couse of experimental mumps virus meningoencephalitis // J. Virology. 1985. - V.53, № 3. - P. 727 - 734.

163. Wong K.T., Puthucheary S.D., Vadivelu J. The histopathology of human melioidosis // Histopathology. 1995. - № 26.- P.51-55.

164. Woods D.E., Jones A.L., Hill P.J. Interaction of insulin with Pseudomonas pseudomallei // Infect. Immun. 1993. - № 61. - P.4045 - 4050.

165. Yabuuchi E., Arakawa M. Burkholderia pseudomallei and melioidosis: be aware in temperate area // Microbiol. Immunol. 1993. - № 37. - P. 832 - 836.

166. Zeitlin L., Cone R.A., Whaley K.J. Using monoclonal antibodies to prevent mucosal transmission of epidemic infectious disiases // Emerg. Infect. Dis.-1999. -V.5, № 1.- P.54-64.

Информация о работе

Дрефс, Наталья Михайловна
кандидата биологических наук
Волгоград, 2006
ВАК 03.00.07

Диссертация

Протективные свойства мелиоидозных моноклональных антител - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно