Стимуляция иммуногенных и протективных свойств антигенов возбудителя мелиоидоза цитокинами

Демьянова, Ольга Борисовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Стимуляция иммуногенных и протективных свойств антигенов возбудителя мелиоидоза цитокинами
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Стимуляция иммуногенных и протективных свойств антигенов возбудителя мелиоидоза цитокинами"

На правах рукописи

ДЕМЬЯНОВА ОЛЬГА БОРИСОВНА

СТИМУЛЯЦИЯ ИММУНОГЕННЫХ И ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА ЦИТОКИНАМИ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

003477800

г. Волгоград 2009 г.

003477800

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор ' Алексеев В.В.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Щуковская Т.Н.

кандидат медицинских наук,

доцент Пронина Е.А.

Ведущая организация: ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится ССТЗ 1Ь%2009 г. в"( I/ часов на заседании

диссертационного совета Д 208.078.01 пЬ защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

Ао"

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб».

Автореферат разослан « /У »¿№7^2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

старший научный сотрудник А.А. Слудский

Актуальность проблемы. Мелиоидоз - заболевание, вызываемое Burkholderia pseudomallei, относится к группе особо опасных инфекций и характеризуется высокой летальностью. Возбудитель мелиоидоза распространен в странах Юго-Восточной Азии и Австралии, хотя немногочисленные случаи мелиоидозной инфекции зарегистрированы на Филиппинах, Папуа Новой Гвинее, в Африке, Америке, Азии и Европе (Currie B.J. et al., 2000; Cheng A.C., Currie B.J., 2005). В современных условиях проблема мелиоидоза актуальна и для России в связи с ростом туризма, расширением культурных и экономических связей нашей страны с эндемичными по мелиоидозу регионами. Кроме того, возбудитель мелиоидоза, по данным международных экспертов, входит в список возможных агентов биотерроризма (Соепуе Т., Li-Puma J.J., 2003).

Несмотря на многолетние исследования по созданию химической мелиоидозной вакцины, эффективный профилактический препарат на сегодняшний день отсутствует, что связано как с низкой протективностыо различных мелиоидозных антигенов, так и с недостаточной изученностью механизмов иммунитета при мелиоидозе. Работами последнего десятилетия показана определяющая роль поверхностных антигенных комплексов возбудителя мелиоидоза в формировании резистентности к инфекции (Викторов Д.В., 1997; Пивень Н.Н., Илюхин В.И., 1981), однако их протективные свойства были недостаточными в защите от вирулентных мелиоидозных штаммов. В свете этих данных особую актуальность приобретает поиск новых иммуностимулирующих препаратов, а также разработка современных подходов к проблеме иммунорегуляции при мелиоидозе, в частности, изучение воздействия цитокинов на иммуногенные и протективные свойства антигенов В.pseudomallei.

В зарубежной литературе имеются работы, посвященные роли отдельных цитокинов в развитии инфекционного процесса при мелиоидозе. В частности, показано, что определение в крови уровней ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-6, ИЛ-10 имеет прогностическое значение для исхода мелиоидозной инфекции (Lauw F.N. et al., 1999; Simpson A.J. et al., 2000). Изучены количественные показатели различных цитокинов при остром и хроническом экспериментальном мелиоидозе у мышей, показана взаимосвязь высоты бактериемии с пиком продукции цитокинов клетками селезенки (Barnes J.L. et al., 2004). Многие исследователи указывают на важную роль ТЫ- цитокинов, отвечающих за формирование клеточного иммунитета, в патогенезе мелиоидоза (Barnes J.L. et al., 2004; Ketheesan N. et al., 2002), а также ранних провоспали-тельных цитокинов (Ulett G.C. et al., 2000).

Следует отметить, что все имеющиеся работы по изучению цитокинов при мелиоидозе посвящены их значению в инфекционном процессе, в то время как публикации о влиянии цитокинов на иммуногенные и протективные свойства мелиоидозных антигенов в процессе иммунопрофилактики мелиоидоза в доступной литературе отсутствует. Кроме того, достаточно важ- ¡ V'

' J

ньм, с научной и практической точки зрения, является изучение корреляционных связей между способностью мелиоидозных антигенов индуцировать продукцию определенных цитокинов и их протективными свойствами. Данное направление в изучении свойств антигенов В. pseudomallei при их скрининге на предмет отбора потенциальных компонентов химической вакцины, остается пока не исследованным.

Цель работы - повышение иммуногенных и протективных свойств антигенов B.pseudomallei цитокинами.

Задачи исследования:

1. Разработать модельную систему in vitro оценки токсичности антигенов B.pseudomallei с целью их использования для индукции цитокинов

2. Изучить биологическую активность цитокинов лимфоцитов и макрофагов, индуцированных антигенами буркхольдерий in vitro

3. Изучить взаимосвязь биологической активности монокинов и лим-фокинов с иммуногенными и протективными свойствами антигенов-индукторов

4. Исследовать влияние монокинов и лимфокинов на иммунный ответ экспериментальных животных к антигенам возбудителя мелиоидоза

5. Изучить возможность потенцирования специфического иммунитета к мелиоидозу препаратами рекомбинантных цитокинов

6. Разработать схему применения рекомбинантных цитокинов для стимуляции первичного и вторичного иммунного ответа к антигенам B.pseudomallei.

Научная новизна

Впервые определена взаимосвязь между цитокинивдуцирующей активностью антигенов буркхольдерий и их защитными свойствами, которая позволяет проводить скрининг протективных антигенов в клеточной системе in vitro по биологической активности лимфокинов и монокинов, индуцированных антигенами. На основе выявленных закономерностей разработан новый способ оценки уровня протективности мелиоидозных антигенов на культуре клеток L-929 по степени цитотоксической активности ФНО-oi монокинов, индуцированных антигенами in vitro.

Разработан новый чувствительный метод оценки токсичности мелиоидозных антигенов на инфузориях Paramecium caudatum по угнетению их выделительной функции, который характеризуется высокой чувствительностью, простотой, быстротой исполнения и возможностью регистрации токсического эффекта на физиологическом уровне. Данный метод позволяет быстро определять оптимальные дозы антигенов для индукции цитокинов in vitro.

Впервые показана возможность усиления иммуногенных и протективных свойств мелиоидозных антигенов с помощью лимфокинов и монокинов. Определена целесообразность применения монокинов для стимуляции первичного иммунного ответа, а лимфокинов - вторичного, что обеспечивает адекватную стимуляцию механизмов неспецифической резистентности и специфического Т-клеточного иммунитета.

Впервые показана возможность повышения иммуногенных и протек-тивных свойств мелиоидозных антигенов при их совместном применении с рекомбинантными цитокинами. Отмечена необходимость применения для стимуляции первичного иммунного ответа цитокинов, стимулирующих неспецифические клеточные реакции макроорганизма, а для повышения вторичного ответа — цитокинов, преимущественно влияющих на специфический Т-клеточный иммунный ответ. Разработан новый способ повышения протек-тивности мелиоидозных антигенов рекомбинантными цитокинами, основанный на применении ИФН-у при первичной иммунизации антигенами и ИЛ-2 - при вторичной.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена:

- патентом на изобретение № 2281507 от 10.08.2006 г. «Способ оценки токсичности бактериальных антигенов» (авторы: Жукова С.И., Аделыиин Ф.К., Храпова Н.П., Пивень H.H., Прошина О.Б., Засядкина A.B., Плеханова Н.Г.);

- патентном на изобретение № 2354400 от 10.05.2009 г. «Способ оценки уровня протективности мелиоидозных антигенов» (авторы: Прошина О.Б., Жукова С.И., Храпова Н.П., Авророва И.В., Пивень H.H., Ломова JI.B.).

По материалам диссертации направлена в Роспатент заявка на изобретение «Способ повышения протективности мелиоидозных антигенов цитокинами» № 2008127677 от 7.07.2008 г. (авторы: Жукова С.И., Демьянова О.Б., Авророва И.В., Алексеев В.В., Храпова Н.П., Ломова Л.В.).

Практическая ценность

По материалам исследования составлены:

1. «Методические рекомендации по изучению цитокининдуцирующей активности мелиоидозных антигенов» (утверждены директором института 21.12.2005г.), в которых приведены методические приемы, позволяющие определять показатели цитокининдуцирующей активности антигенов, коррелирующие с их защитными свойствами: фагоцитарную активность макрофагов под действием лимфокинов, степень экспрессии Fc-рецепторов на поверхности нейтрофилов под действием монокинов и уровень цитотоксической активности ФНО-а монокинов на перевиваемой клеточной линии мышиных фибробластов L-929. Предложенные методы позволяют проводить скрининг мелиоидозных антигенов на протективность без значительных временных и материальных затрат, связанных с иммунизацией и заражением животных при определении протективности в стандартном тесте активной защиты на животных.

2. «Методические рекомендации по применению цитокинов для усиления иммунного ответа при мелиоидозе» (утверждены директором института 24.12.2008 г.), в которых изложены методические приемы по использованию препаратов рекомбинантных цитокинов ИФН-у и ИЛ-2 для стимуляции иммунного ответа на мелиоидозные антигены в экспериментах на мышах и крысах и приведены тесты оценки клеточного и гуморального иммунитета,

по которым можно определять степень воздействия препаратов на иммунную систему животных.

Полученные данные представляют интерес для сотрудников научно-исследовательских лабораторий, занимающихся вопросами иммунопрофилактики особо опасных инфекций, и могут быть использованы при разработке средств защиты от мелиоидоза.

Материалы диссертационной работы включены в цикл лекций по диагностике, лечению и профилактике особо опасных инфекций на курсах первичной специализации врачей и биологов по особо опасным инфекциям при ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Протективность мелиоидозных антигенов связана с их цитокининду-цирующей активностью , в отношении макрофагов и лимфоцитов: выраженностью экспрессии Fc-рецепторов на поверхности нейтрофилов под влиянием монокинов, степенью цитотоксичности ФНО-а монокинов для фибробластов L-929 и фагоцитарной активностью макрофагов под действием лимфокинов.

2. Предложен метод оценки уровня протективности антигенов B.pseudomallei на культуре клеток L-929 по степени цитоксического действия ФНО-а монокинов, индуцированных антигенами in vitro, позволяющий проводить предварительную оценку защитных свойств антигенов без существенных временных и материальных затрат.

3. Для индукции цитокинов in vitro необходимо использовать адекватные дозы мелиоидозных антигенов, не оказывающие повреждающего действия на иммунокомпетентные клетки. Разработан высокочувствительный способ оценки токсичности антигенов на инфузориях Paramecium caudatum, позволяющий определять минимальную токсичность на физиологическом уровне по угнетению выделительной функции простейших.

4. С целью оптимальной стимуляции механизмов клеточного иммунитета первичную иммунизацию антигенами возбудителя мелиоидоза целесообразно сочетать с введением монокинов, а вторичную - лимфокинов.

5. Рекомбинантные цитокины могут быть использованы для повышения иммуногенных и протективных свойств антигенов B.pseudomallei. Оптимальной схемой стимуляции иммунного ответа на мелиоидозные антигены является использование при первичной иммунизации ИФН-л/, а при вторичной -Ш1-2.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на конференции молодых ученых Волгоградского НИПЧИ (18.06.2004 г.), итоговой научной конференции Волгоградского НИПЧИ (27.05.2005 г.), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопас-

ности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (1314.09.2005 г, г. Волгоград), VII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников СНГ» (3-5.10.2006 г., г. Оболенск), IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ» (30.09 -2.10.2008 г., г. Волгоград).

Публикации: Основные положения диссертации отражены в 16 печатных работах, из них 5 - в ведущих рецензируемых научных изданиях.

Структура и объем работы: диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 рисунками и 18 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Список использованных источников литературы включает 200 работ (99 отечественных и 101 зарубежных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на беспородных белых мышах и крысах и мышах линии BALB/c. Для заражения животных использовали высоковирулентный штамм B.pseudomallei 100 и умеренно вирулентный штамм B.pseudomallei 115. В качестве индукторов цитокинов использовали водно-солевые экстракты буркхольдерий: ВСЭ-С-141 (ВСЭ клеток умеренно вирулентного штамма B.pseudomallei С-141); ВСЭ-100 (ВСЭ клеток высоковирулентного штамма B.pseudomallei 100) и ВСЭ-251 (ВСЭ клеток B.thailandensis 251 - непатогенного близкородственного вида буркхольдерий), а также поверхностный ме-лиоидозный комплекс Агб+d (смесь двух антигенов белковополисахаридной природы Агб и Ard), выделенный из B.pseudomallei 57576.

В опытах по определению токсичности микробных антигенов на разных типах клеток использовались следующие антигенные комплексы: ВСЭ B.pseudomallei С-141, ВСЭ B.mallei В-120, ВСЭ B.thailandensis, ультразвуковые дезинтеграты клеток возбудителей чумы Y.pestis 358/80 и сапа - B.mallei Ц-5, а также фракция V по Бейкеру из ВСЭ Y.pestis 231, токсин из V.cholerae («Serva») и актиномицин С {«Serva»).

В работе использованы две перевиваемые клеточные линии: мышиных фибробластов L-929 и овариальной опухоли китайского хомячка СНО К-1. Кроме того, была использована культура инфузорий Paramecium caudatum. Токсичность микробных антигенов на клеточных линиях оценивали по показателю ЦТЕ 50 - концентрации антигена, вызывающий гибель 50 % клеток в лунке (Сальникова О.И., 1994). Показатель ЦТЕ 50 при оценке токсичности антигенов на инфузориях обозначал концентрацию антигена, снижающую на

50 % число сокращений в мин выделительных вакуолей инфузорий по сравнению с контролем.

В качестве продуцентов цитокинов (монокинов и лимфокинов) были использованы макрофаги (Мф) перитонеального экссудата (ПЭ) и лимфоциты селезенки мышей BALB/c, которые инкубировались вместе с антигенами буркхольдерий (10 мкг/мл) в полной питательной среде RPMI-1640 в течение 24 ч (при получении монокинов) или 48 ч (при получении лимфокинов).

Биологическую активность полученных in vitro лимфокинов изучали на Мф мышей BALB/c. Определяли: 1 - воздействие лимфокинов на экспрессию Fc-рецепторов (FcR) на поверхности Мф, 2 - способность вызывать реакцию исчезновения Мф из брюшной полости (РИМ), 3 - влияние на фагоцитарную активность Мф. Об экспрессии FcR судили по розеткообразованию с эритроцитами барана (ЭБ), опсонизированными противоэритроцитарными кроличьими антителами (ЕА) (Родионов C.B. с соавт., 1988). Интенсивность РИМ, являющейся моделью ГЗТ in vitro, оценивали цо индексу исчезновения Мф (ИИМ) (Васильева Г.И. с соавт., 1988). Фагоцитарную активность Мф изучали хемилюминесцентным методом (Любимов Г.Ю. с соавт,, 1992).

Биологическую активность монокинов изучали на нейтрофилах (Нф) ПЭ мышей BALB/c. Определяли: 1 - способность монокинов модулировать хемотаксическую активность Нф и 2 - влияние монокинов на экспрессию FcR на поверхности Нф. Кроме того, определяли активность ФНО-а монокинов на фибробластах L-929. Хемотаксис Нф определяли в опытах на мышах BALB/c через 4 ч после внутрибрюшного введения монокинов, вычисляли индекс активации Нф (ИАН) (Васильева Г.И. с соавт., 2002). Цитотоксиче-скую активность ФНО-а определяли на клетках L-929, используя модифицированный метод Fisch H., Gifford G.E. (1983). Активность ФНО-а выражали в количестве единиц активности, которое соответствует величине, обратной титру разведения монокинов, обеспечивающему 50 % гибель клеток в лунке (ЦТЕ 50).

В экспериментах были использованы следующие коммерческие препараты рекомбинантных цитокинов, выпускаемые НИИ особо чистых препаратов (Санкт-Петербург) и ООО «Биотех» (Санкт-Петербург): беталейкин (ИЛ-lß), ронколейкин (ИЛ-2), интераль (ИФН-а) и ингарон (ИФН-у).

Иммуногенные свойства ВСЭ буркхольдерий изучали в опытах на белых мышах, которых иммунизировали подкожно 30 мкг (по белку) ВСЭ в смеси с гидратом окиси алюминия (до конечной концентрации 1,2 мг/мл) двукратно с интервалом 10 сут. При использовании в качестве иммуногена мелиоидозного комплекса Агб+d его вводили мышам в дозах 30 и 50 мкг (крысам - 150 мкг), подкожно, без адъюванта, двукратно, с интервалом 10 сут. Одновременно с иммунизацией вводили подкожно цитокиновые препараты либо однократно (лимфокины и монокины), либо троекратно (в день введения антигена и в последующие 2 сут) - препараты рекомбинантных цитокинов. Монокины и лимфокины, полученные in vitro, вводили в объеме 100 мкл. Рекомбинантный ИФН-а вводили мышам в дозе 400 ME, ИЛ-1 вво-

дили мышам в дозе 0,4 нг, крысам - 6 нг, ИЛ-2 вводили мышам в дозе 0,6 мкг, крысам - 10 мкг, ИФН-у - мышам - 8 ME, крысам -120 ME, Суммарные цитокины (лимфокины и монокины) вводили совместно с первой и второй иммунизацией. Рекомбинантными цитокинами ИЛ-1, ИФН-а и ИФН-у стимулировали первичный иммунный ответ, ИЛ-2 - вторичный.

В динамике иммунного ответа у животных определяли показатели клеточного и гуморального иммунитета: фагоцитарную активность Мф, экспрессию FcR на Мф и Нф, уровень ГЗТ по отекогенному эффекту после введения сенсибилизированным животным разрешающей дозы антигенов в подушечку задней лапки (Попова А.Е., 1980). Иммунотропные свойства антигенов буркхольдерий оценивали по их способности вызывать неспецифическую (поликлональную) активацию лимфоцитов селезенки мышей, продуцирующих IgM к ЭБ в тесте определения антителообразующих клеток (АОК) методом локального гомолиза в геле по Jerne N.R. et al. (1974).

При изучении протективности антигенов иммунизированных животных заражали на 21 сут после первичной иммунизации B.pseudomallei 115 или B.pseudomallei 100. Спустя 30 сут определяли показатели летальности: процент павших животных и среднюю продолжительность жизни (СПЖ).

В опытах на крысах изучали влияние иммунизации антигенами B.pseudomallei в сочетании с цитокинами на биохимические показатели крови в конце периода иммуногенеза, используя автоматический биохимический анализатор («Biochem Analette», США).

Статистический анализ результатов исследований осуществляли с определением средних величин и доверительных интервалов для уровня досто-вености 95 % по Фишеру-Стьюденту (Ашмарин И.П., Воробьев A.A., 1962), а также с использованием непараметрического критерия Вилкоксона (Гублер Е.В., Генкин A.A., 1973). При обработке данных по гуморальному иммунному ответу определяли среднегеометрические титры антител.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На первом этапе исследования были изучены суммарные фракции ци-токинов - монокины и лимфокины, полученные in vitro на культурах Мф и спленоцитов мышей BALB/c. Для индукции цитокинов в данных клеточных системах были подобраны нетоксичные дозы мелиоидозных антигенов, не нарушающие жизнедеятельности клеток в процессе культивирования.

Нами была проведена серия экспериментов по подбору адекватной модели для тестирования токсичности антигенов. В этом качестве были испытаны перевиваемые клеточные линии фибробластов мыши L-929, овари-альной опухоли китайского хомячка СНО К-1 и инфузории Paramecium caundatum. Было показано, что по степени чувствительности к токсическому действию бактериальных антигенов клетки-мишени располагались следующим образом: СНО К-1 (наиболее чувствительные), инфузории Paramecium caundatum, фибробласты L-929. Нами предложен новый метод оценки токсичности микробных антигенов на инфузориях по критерию снижения на

50% числа сокращений их выделительных вакуолей, который позволяет определять токсичность на физиологическом уровне, без морфологических изменений в клетках. Данный метод тестирования токсичности характеризуется высокой чувствительностью, простотой и быстротой исполнения.

Биологическая активность полученных in vitro лимфокинов и монокинов при индукции их ВСЭ буркхольдерий (В. pseudomallei С-141, В. pseudo-mallei 100, В. thailandensis 251) была изучена на Мф и Нф мышей BALB/c.

Изучение способности монокинов, полученных под воздействием антигенов буркхольдерий, оказывать регуляторное воздействие на хемотаксис Нф показало, что ВСЭ-С-141 в качестве индуктора не отличался от ВСЭ-251. Более выраженной хемотаксической активностью обладали цитокины Мф, стимулированных ВСЭ-100 (ИАН=3,23) (табл. 1).

Таблица 1

Биологическая активность монокинов мышей BALB/c, индуцированных

антигенами буркхольдерий__

Показатель

Индукторы

Физраствор (контроль)

ВСЭ B.pseudomallei С-141

ВСЭ B.pseudomallei 100

ВСЭ

В.thailandensis 251

Индекс активации нейтрофилов (усл. ед.)

2,92 !

3,23 *

2,73 *

Число нейтрофилов с FcR (% ЕА-РОК)

28±0,6

58±1,4 *

62±2,2 *

34±2,1

Цитотоксическая активность ФНО-а в отношении фибробластов L-929 (ед. актив.)

32*

128 1

16*

Примечание: контролем при изучении экспрессии БсЯ и активности ФНО-а на клетках Ь-929 служило воздействие на клетки-мишени контрольного супернатанта, полученного при инкубации лимфоцитов и макрофагов мышей с физраствором;

* - различия с контролем статистически достоверны (р< 0,05).

Изучение цитотоксичности ФНО-а в супернанантах Мф, стимулированных антигенами буркхольдерий, на клетках Ь-929 показало, что в моно-кинах, индуцированных ВСЭ-100, активность ФНО-а была максимальной (128 ед. актив.). Уровни активности ФНО-а в монокинах, полученных при

воздействии ВСЭ-С-141 и ВСЭ-251, были ниже (32 и 16 ед. актив, соответственно).

Монокины, индуцированные ВСЭ-С-141 и ВСЭ-100, усиливали экспрессию РсЯ на поверхности Нф, а активность монокинов, индуцированных ВСЭ-251, существенно не отличалась от контрольных цифр.

При изучении регуляторного влияния лимфокинов, образовавшихся под воздействием ВСЭ буркхольдерий, на фагоцитарную активность Мф установлено, что цитокины, стимулированные ВСЭ-100, в наибольшей степени повышали фагоцитарную активность Мф (КС= 4,94 ± 0,9, в контроле 1,33± 0,4; р< 0,05). Лимфоциты, примированные ВСЭ-С-141, также продуцировали цитокины, существенно стимулирующие фагоцитоз Мф (КС= 4,13± 0,8, р< 0,05). Наименьшей стимулирующей активностью обладали лимфокины, полученные с помощью ВСЭ-251 (табл.2).

Таблица 2

Влияние лимфокинов, индуцированных антигенами буркхольдерий, на функциональную активность макрофагов

Характеристики макрофагов Индукторы

Физраствор (контроль) ВСЭ В.рзеис1ота1Ш С-141 ВСЭ В.р$еис1ота11е'1 100 ВСЭ Вл}гаИапс1еп$1$ 251

Число макрофагов с РсЯ (% ЕА-РОК) 32±1,8 39±2,8 47±2,9 * 49±3,6 *

Индекс исчезновения макрофагов (%) 1,8 8,0 * 13,8* 11,1 *

Хемилюминес-ценция (коэффициент стимуляции) 1,33±0,4 4,13±0,8 * 4,94±0,9 * 3,34±0,6

Примечание: см. примечание к табл. 1.

Оценка влияния лимфокинов на содержание Мф в ПЭ показала, что введение иммунизированным мышам лимфокинов, стимулированных любым из трех антигенных комплексов, сопровождалось реакцией исчезновения Мф из ПЭ (РИМ), уровень которой был невысоким. Несколько более выраженную РИМ обусловливали лимфокины, стимулированные ВСЭ-100 (ИИМ=13,8%), однако различия с другими индукторами цитокинов были несущественными (р>0,05).

Показано, что ВСЭ-100 и ВСЭ-251 вызывали индукцию лимфокинов, повышающих экспрессию БсЯ на Мф, а ВСЭ-С-141 был в этом отношении не активен.

Изучение протективных свойств ВСЭ буркхольдерий показало, что ВСЭ-100 был наиболее протективным, он защищал 50% животных от 5 ЛД50 умеренно вирулентного штамма В. р$еис1ота1Ш 115, ВСЭ-С-141 защищал 40% животных, а ВСЭ-251 - всего 22%.

Анализ полученного экспериментального материала позволяет констатировать взаимосвязь между цитокининдуцирующей активностью антигенных комплексов буркхольдерий и их протективными свойствами. Установлена зависимость между уровнем активности лимфокинов, модулирующих фагоцитарную способность Мф, и степенью протективности антигена - индуктора лимфокинов. Отмечена прямая взаимосвязь между степенью экспрессии БсЯ на поверхности Нф под влиянием монокинов и защитными свойствами антигена-индуктора. Выявлена взаимосвязь между способностью антигенов буркхольдерий активировать ФНО-а монокинов и их защитными свойствами. Таким образом, защитные свойства антигенов буркхольдерий зависят от их способности индуцировать выработку цитокинов, стимулирующих клеточное звено иммунитета.

Изучение взаимосвязи протективности с иммуногенными и иммуно-тропными свойствами мелиоидозных антигенов показало, что защитные свойства ВСЭ буркхольдерий коррелируют с уровнем фагоцитарной активности Мф иммунизированных животных и выраженностью митогенного действия антигенов на В-лимфоциты.

В экспериментах на мышах были изучены иммуномодулирующие свойства монокинов и лимфокинов в отношении влияния на иммунный ответ к поверхностному мелиоидозному комплексу Аг6+с1 (далее - Аг). В этой серии опытов были использованы монокины и лимфокины, полученные в результате примирования Мф ПЭ и лимфоцитов селезенки мышей ВАЬВ/с данным антигенным комплексом.

Было показано, что на 10 сут после первичной иммунизации применение монокинов в большей степени стимулировало экспрессию Рс!1 на Мф и Нф, фагоцитарную активность Мф и уровень ГЗТ по сравнению с иммунизацией Аг без цитокинов (р<0,05), чем использование лимфокинов. Напротив, после вторичной иммунизации (на 18 сут наблюдения) наиболее выраженная активность клеточного иммунитета и макрофагального звена по сравнению с контролем отмечена у животных, которым двукратно вводили Аг и лимфокины (р<0,05).

Титр специфических антител на 18 сут был наибольшим в группе животных, которьм вводили вместе с Аг монокины (1:371), несколько меньший титр антител определялся в сыворотках мышей, иммунизированных Аг в сочетании с лимфокинами (1:199), и еще более низкий - у мышей, получавших только Аг (1:158).

Изучение протективности поверхностного мелиоидозного комплекса на мышах показало, что использование для стимуляции иммунного ответа лимфокинов способствовало повышению на 26 % выживаемости животных от 10 ЛД50 В. pseudomallei 100 по сравнению с контролем, в то время как совмещение иммунизации с введением монокинов или иммунизация только Аг практически не защищали мышей.

Таким образом, повышение протективности мелиоидозных антигенов в группе мышей, получавших Аг и лимфокины, коррелировало, по нашим данным, с более высокими показателями клеточного иммунитета перед заражением. Применение монокинов при первичном иммунном ответе приводило к возрастанию показателей клеточного иммунитета, в то время как использование монокинов, содержащих набор провоспалительных цитокинов, запускающих первую фазу иммунного ответа,. для стимуляции вторичного ответа на антиген, по-видимому, приводило к дисбалансу цитокинов и не способствовало адекватному повышению клеточного иммунитета при вторичном ответе, что приводило, в конечном итоге, к снижению протективности антигенов, так как защита при мелиоидозе связана преимущественно с клеточными механизмами (Илюхин В.И., Мельников Б.Н., 1980; Hague A. et al., 2006). Дополнительным подтверждением преобладающего значения клеточных факторов в противоинфекционном иммунитете при мелиоидозе является и тот факт, что продукция специфических антител в наших опытах не коррелировала с уровнем протективности.

. Поскольку лимфокины и монокины являются суммарными фракциями, содержащими несколько компонентов, при их использовании трудно оценить влияние отдельных важнейших цитокинов на иммуногенез. В связи с этим в следующей серии экспериментов мы изучали влияние на иммунный ответ монопрепаратов рекомбинантных цитокинов.

Рекомбинантные цитокины - это современные биотехнологические продукты, генно-инженерные аналоги эндогенных цитокинов. За последние два десятилетия клонированы гены большинства цитокинов и получены рекомбинантные аналоги, полностью повторяющие биологические свойства природных молекул (Кетлинский С.А.,1993).

В экспериментах на белых мышах и крысах нами была изучена возможность усиления иммунного ответа к антигенному комплексу Агб+d препаратами рекомбинантных цитокинов: ИЛ-1, ИЛ-2, ИФН-а, ИФН- у. Показано, что при стимуляции только первичного иммунного ответа применение ИФН-у в наибольшей степени повышало показатели клеточного иммунитета и макрофагально-фагоцитарного звена, на втором месте по способности активировать данные показатели иммунитета был ИЛ-1 и на последнем - ИФН-а. При изолированном использовании ИЛ-2 для стимуляции вторичного иммунного ответа показатели фагоцитарной активности ПМ, уровня ГЗТ и экспрессии FcR на фагоцитах были близки к аналогичным показателям в группе мышей, получавших ИЛ-1 при первичной иммунизации.

Наиболее высокие показатели клеточного иммунитета были зарегистрированы при стимуляции первичного и вторичного иммунного ответа по схемам: ИФН-у + ИЛ-2 и ИЛ-1 + ИЛ-2. В частности, на 1В сут наблюдения фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов (ПМ) мышей, получавших при первичной иммунизации вместе с Аг ИФН-у, а при вторичной -ИЛ-2, в 3,46 раза превосходила соответствующий показатель животных, иммунизированных только Аг, при стимуляции мышей по схеме ЙЛ-1 + ИЛ-2 индекс стимуляции (ИС) фагоцитарной активности ПМ составлял 1,98; при применении одного из цитокинов {ИЛ-1, ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-2) ИС колебался от 0,76 до 1,38 (рисЛ).

Рис. 1. Стимулирующее действие цитокинов на фагоцитарную активность ПМ иммунизированных мышей на 18 сут наблюдения

Подобная же закономерность прослеживалась и в отношении стимуляции сочетаниями цитоетгаов экспрессии РсК. на фагоцитах и уровня реакции ГЗТ (рис.2,3).

Рис, 2. Сравнительная активность цитокннов при стимуляции экспрессии РсЕ? на макрофагах и нейтрофилах иммунизированных мышей на 18 сут наблюдения

Рис.з. Влияние рекомбинантных цитокинов на уровень ГЗТ иммунизированных мышей на 18 сут наблюдения

При анализе гуморального иммунного отйета было показано, что титр специфических антител на 18 сут наблюдения при использовании рекомбинантных цитокинов был существенно выше такового у животных, иммунизированных только Аг (1:320 против 1:67), однако различий между разными схемами стимуляции с использованием одного или двух цитокиновых препаратов, выявлено не было.

Известно, что при конструировании вакцинных препаратов необходимо учитывать не только иммуногенные, но и иммунотропные свойства антигенов, то есть их способность неспецифически воздействовать на иммуноком-петентные клетки, модулируя, таким образом, их активность в сторону повышения или понижения. При изучении влияния рекомбинантных цитокинов на иммунотропные свойства мелиоидозного антигенного комплекса Агб-rd в опытах на мышах BALB/c было показано, что введение мышам вместе с Аг ИЛ-1 в 6,9 раза (р<0,05) увеличивало способность Аг вызывать неспецифическую (поликлон альную) активацию В-клеток, продуцирующих ígjvl к эритроцитам барана, а использование ЙФН-а увеличивши число антителообра-зующих клеток селезенки (АОК), продуцирующих антиэритроцитарные антитела, в 3,8 раза (р<0,05). При изолированном применении (без цитокинов) Аг незначительно (в 1,3 раза) по сравнению с контролем (интактные животные) увеличивал число АОК к ЭБ. При вторичной иммунизации Аг не оказывал заметного иммунотропного влияния на В-клетки селезенки мышей BALB/c. Однако, в группах животных, получавших вместе с Аг ИЛ-2 или ИЛ-1+ ИЛ-2, зарегистрировано существенное увеличение числа АОК (в 5 и 7,6 раз соответственно, р<0,05), что свидетельствует об увеличении митоген-ной активности мелиоидозных антигенов под влиянием этих цитокинов (рис.4).

i к

а <

о с

10д4-

Первичный иммунный Вторичный иммунный

ответ ответ

Рис.4, Влияние рекомбинантных цитокинов на иммунотропные свойства мелиоидозных антигенов при первичном и вторичном иммунном ответе

шШН шИФН-а

О АГ

Анализ данных о воздействии рекомби нантных цитокинов на протек-тивные свойства мелиоидозного комплекса Агб+й показал, что стимуляция первичного и вторичного иммунного ответа способствовала более высоким показателям выживаемости и СПЖ по сравнению с воздействием цитокинами только на первичный (ИЛ-1, ИФН-а, ИФН-у) или только на вторичный (ИЛ-2) ответ. Наиболее эффективной схемой стимуляции оказалась схема ИФН-у+ИЛ-2, обеспечившая 50% выживаемость мышей от 15 ЛД50 В.рвеиёотаНег 100 (р<0,05). Аналогичная стимуляция первичного и вторичного ответа ИЛ-1+ИЛ-2 способствовала выживаемости 43 % мышей (р<0,05). Показатели СПЖ при двойном воздействии цитокинами в данных группах достоверно превышали СПЖ контрольных животных (р<0,05) (табл.3).

Таблица 3

Влияние цитокиновых препаратов на протективность мелиоидозных ____ антигенов для мышей____________

Препараты Летальность при заражении B.pseudomallei 100

15 ЛДда 150 ЛДж

пало/взято % павших СПЖ пало/взято % павших СПЖ

Аг 12/14 86 8,5 13/15 87 6,6

Аг+ИЛ-1 10/13 77 8,9 11/13 85 6,9

Аг +ИЛ-2 9/11 82 8,1 10/11 91 6,1

Аг + ИФН-у 10/15 67 10,4* 14/15 93 8Д

Аг+ И Л-1+ИЛ-2 8/14 57* 11,7* 12/15 80 10,4*

Аг+ИФН-у+ИЛ-2 5/10 50* 12,4* 8/10 80 10,5*

Контроль (интактные) 10/10 100 6,3 10/10 100 5.8

Примечание: иммунизирующая доза Аг - 50 мкг (двукратно); *-различия с контролем статистически достоверны (р<0,05).

В экспериментах на крысах показано, что двукратная иммунизация по 150 мкг Агб+d без адътованта не защищала животных от 32 ЛДм высоковирулентного штамма B.pseudomallei 100. В результате воздействия на первичный иммунный ответ ИФН-у или ИЛ-1, а на вторичный - ИЛ-2 единичные крысы выживали (10-20 %), а показатели СПЖ значимо превосходили СПЖ контрольной группы (р<0,05), при этом более эффективной оказалось схема стимуляции ИФН-у + ИЛ-2. Повышение показателей клеточного иммунитета на 18 сут наблюдения было более выраженным также при использовании схемы стимуляции ИФН-у + ИЛ-2. Так, хемилюминесцентный ответ ПМ крыс, стимулированных по схеме ИФН-у + ИЛ-2, превышал таковой в группе животных, иммунизированных только Аг, в 1,84 раза (по схеме ИЛ-1 + ИЛ-2 - в 1,53 раза) (рис.5), уровень ГЗТ - в 2,28 раза (по схеме ИЛ-1 + ИЛ-2 - в J ,76 раза) (рис.6).

120 КО

юо

эо

> 80 Е

с то

X „ л 60

I 50

10 го ю о

Рис.5.Фагоцитарная активность ПМ крыс, получавших рекомбмнантные цитокины изолированно и в сочетании с мелиондозными антигенами

№

5. зо £

|25

П £

515 10 5 0

АГ+и»и-у+ил-г

АГ+ИЛ-1+НЛ-2

Контр ель | '

АГ+ИЛ-1+ИЛ-2

Рис. в. Влияние различных схем стимуляции иммунитета цитокинами на уровень ГЗТ у крыс

Биохимический анализ крови крыс в конце периода иммуногенеза показал, что ни двукратное введение мелиоидозных антигенов или цитокино-вых препаратов, ни совместное воздействие цитокинами и антигенами не вызывало заметных изменений в концентрациях основных биохимических составляющих крови (AJIT, ACT, общего белка, билирубина, глюкозы, холестерина, триглицеридов, мочевины, креатинина), то есть существенно не отражались на биохимическом гомеостазе животных.

Подводя итог экспериментам на мышах и крысах по определению наиболее эффективной схемы стимуляции цитокинами иммунного ответа на ме-лиоидозные антигены, следует констатировать, что таковой схемой является ИФН-у + ИЛ-2. Поскольку иммунитет при мелиоидозе связан, как было отмечено, с клеточными факторами защиты, становится понятным, что повышение протективности мелиоидозных антигенов возможно при максимальном вовлечении в процесс иммуногенеза различных субпопуляций Т-клеток. Подобное действие, по-видимому, обеспечивалось в наших опытах ИФН-у, который на самых ранних этапах иммунной перестройки стимулирует неспецифические клеточные реакции, прежде всего, за счет активации макрофагов, а также усиливает иммунологические реакции с участием Т-хелперов. По данным ряда авторов, несмотря на открытие в последние годы множества новых цитокинов, ИФН-у остается главным медиатором клеточного иммунитета (Афанасьев С.С. с соавт., 2005; Железникова Г.Ф. с соавт., 2007). Многочисленные иммунологические исследования показали исключительную роль этого цитокина в защите от целого ряда инфекций (Ершов Ф.И., 1996). Дополнительная стимуляция вторичного иммунного ответа на мелиоидозные антигены ИЛ-2, являющимся преимущественно Т-клеточным ростовым фактором, способствовала формированию специфического иммунитета за счет активации процессов пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов (Ярилин А.А., 1997).

Таким образом, препараты рекомбинантных цитокинов, воздействующие преимущественно на механизмы клеточного иммунитета, могут быть использованы для повышения иммуногенности и протективности антигенов возбудителя мелиоидоза. При этом для стимуляции первой фазы иммунного ответа целесообразно применять ИФН-у, инициирующий неспецифические клеточные факторы защиты, а для усиления вторичного иммунного ответа использовать ИЛ-2, стимулирующий механизмы специфического клеточного иммунитета.

Выводы:

1. Антигены возбудителя мелиоидоза обладают цитокининдуцирующей активностью в отношении макрофагов и лимфоцитов. Для индукции моно-кинов и лимфокинов in vitro необходимо использовать нетоксичные дозы антигенов, не оказывающие повреждающего действия на иммунокомпетентные клетки. Способ оценки токсичности антигенов на инфузориях Paramecium caudatum по угнетению их выделительной функции позволяет определять

токсичность на физиологическом уровне, отличается простотой и высокой чувствительностью.

2. Протективность антигенов B.pseudomallei находится в прямой корреляционной зависимости от фагоцитарной активности макрофагов иммунизированных животных и степени митогенного действия антигенов на В-димфоциты.

3. Установлена взаимосвязь между протективностью и цитокининду-цирующей активностью антигенов буркхольдерий, а именно: степенью экспрессии Fc-рецепторов на нейтрофилах под влиянием монокинов, уровнем активности лимфокинов, модулирующих фагоцитарную способность макрофагов, и степенью цитотоксичности ФНО-а монокинов на фибробластах L-929.

4. Применение монокинов способствует более выраженной стимуляции клеточных факторов иммунитета при первичной иммунизации мелиоидоз-ными антигенами, а использование лимфокинов - при вторичной.

5. Рекомбинантные цитокины ИЛ-1, ИЛ-2, ИФН-а, ИФН-у обладают способностью повышать клеточный и гуморальный иммунный ответ к антигенам B.pseudomallei и усиливать их поликлональную активность в отношении В-клеток.

6. Оптимальной схемой стимуляции иммунного ответа на антигены возбудителя мелиоидоза является применение при первичной иммунизации ИФН-у, активирующего неспецифические клеточные факторы защиты, а при вторичной - ИЛ-2, регулирующего клеточные механизмы специфического иммунитета.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Жукова С.И., Адельшин Ф.К., Храпова Н.П., Пивень Н.Н., Прошина О.Б., Засядкина А.В., Плеханова Н.Г. Оценка токсичности антигенов буркхольдерий на разных типах клеток II Вестник ВолГМУ. - 2005. - №1. -С.16-19.

2. Жукова С.И., Адельшин Ф.К., Храпова Н.П., Пивень Н.Н., Авророва И.В., Прошина О.Б., Засядкина А.В. Использование инфузорий Paramecium caudatum для оценки токсичности антигенов возбудителей особо опасных инфекций // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2005. - №5. - С.81-84.

3. Новицкая И.В., Прошина О.Б., Жукова С.И., Зимина И.В. Использование инфузорий Paramecium caudatum для выявления токсичности дрожже-подобных грибов рода Candida // Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Матер. VI Межгосудар. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. -Волгоград, 2005.-С.163-164.

4. Прошина О.Б., Жукова С.И., Пивень Н.Н., Храпова Н.П., Авророва И.В., Дрефс Н.М., Засядкина А.В., Кувшинова А.Д. Взаимосвязь между про-

тективностыо антигенов буркхольдерий и их цитокининдуцирующей активностью // Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Матер. VI Межгосу-дар. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Волгоград, 2005. -С.174-175.

5. Прошина О.Б., Жукова С.И., Адельшин Ф.К., Храпова Н.П., Пивень H.H., Авророва И.В., Засядкина A.B., Плеханова Н.Г. Токсические свойства водно-солевых экстрактов буркхольдерий // Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: Матер. VI Межгосудар. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. -Волгоград, 2005. - С.175-176.

6. Прошина О.Б., Жукова С.И., Пивень H.H., Храпова Н.П., Авророва И.В., Дрефс Н.М. Сравнительная характеристика цитокининдуцирующей активности буркхольдерий различных видов // Вестник ВолГМУ. - 2006. - №2 (18).-С.44-46.

7. Прошина О.Б., Жукова С.И., Пивень H.H., Храпова Н.П., Авророва И.В., Дрефс Н.М., Засядкина A.B., Кувшинова А.Д. Цитокининдуцирующая активность антигенов буркхольдерий // Цитокины и воспаление. - 2006. -Т.5, №4. -С.22-25.

8. Прошина О.Б., Жукова С.И., Пивень H.H., Храпова Н.П., Авророва И.В., Дрефс Н.М. Цитокининдуцирующая активность мелиоидозных антигенов как показатель их защитных свойств // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: Матер. VII Межгосудар. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Оболенск, 2006.-С. 158-159.

9. Прошина О.Б., Жукова С.И., Пивень H.H., Храпова Н.П., Авророва И.В., Засядкина A.B., Дрефс Н.М. Методические рекомендации по изучению цитокининдуцирующей активности мелиоидозных антигенов // Метод, документы и отчеты по сан.-эпид. охране территории Российской Федерации: Рефератов. сб. - Саратов, 2006. - С.12.

10. Способ оценки токсичности бактериальных антигенов: Пат. № 2281507 Рос. Федерации: МПК G01 33/483 / Жукова С.И., Адельшин Ф.К., Храпова Н.П., Пивень H.H., Прошина О.Б., Засядкина A.B., Плеханова Н.Г.; заявитель и патентообладатель - Волгоград, науч.-иссл. противочум. инс-т. -№ 2004133598/15; заявл. 17.11.2004; опубл. 10.08.2006, Бюл. № 22.

11. Демьянова О.Б., Алексеев В.В., Жукова С.И., Храпова Н.П., Авророва И.В., Ломова Л.В., Дрефс Н.М. Влияние лимфокинов и монокинов мышей на иммуногенность мелиоидозных антигенов // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Госу-

дарств: Матер. IX Межгосудар. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С.64-66.

12. Жукова С.И., Демьянова О.Б., Авророва И.В., Алексеев В.В., Хра-пова Н.П., Ломова Л.В. Повышение иммуногенности и протективности ме-лиоидозных антигенов цитокинами // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств: Матер. IX Межгосудар. науч.-практ. конф. государств-участников СНГ. - Волгоград, 2008. - С.73-75.

13. Демьянова О.Б., Жукова С.И., Алексеев В.В., Храпова Н.П., Авророва И.В., Ломова Л.В., Дрефс Н.М. Методические рекомендации по применению цитокинов для усиления иммунного ответа при мелиоидозе // Метод, документы и отчеты по сан.-эпид. охране территории Российской Федерации: Реферат, сб. - Саратов, 2008. - С.11.

14. Жукова С.И., Демьянова О.Б., Храпова Н.П., Алексеев В.В., Авророва И.В., Ломова Л.В., Дрефс Н.М. Изучение возможности использования цитокинов для стимуляции иммунного ответа при мелиоидозе // Метод, документы и отчеты по сан.-эпид. охране территории Российской Федерации: Реферат, сб. - Саратов, 2008. - С.47-48.

15. Жукова С.И., Демьянова О.Б., Алексеев В.В., Авророва И.В., Храпова Н.П., Ломова Л.В. Стимуляция иммунного ответа к мелиоидозу препаратами рекомбинантных цитокинов // Цитокины и воспаление. - 2009. - №1. -С.32-35.

16. Способ оценки уровня протективности мелиоидозных антигенов: Пат. № 2354400 Рос. Федерации: МПК А61К 39/02 I Прошина О.Б., Жукова С.И., Храпова Н.П., Авророва И.В., Пивень H.H., Ломова Л.В.; заявитель и патентообладатель Волгоград. науч.-иссл. противочум. ин-т.

№ 2007143804/13; заявл. 26.11.2007; опубл. 10.05.2009, Бюл. №13.

ДЕМЬЯНОВА ОЛЬГА БОРИСОВНА

СТИМУЛЯЦИЯ ИММУНОГЕННЫХ ИПРОТЕКТИВНЫХ свойств АНТИГЕНОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА ЦИТОКИНАМИ

03.00.07-микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Формат 60x84 1/16. Печать офсетная. Бумага офсетная № 65. Гарнитура «Тайме». Тираж 100 экз. Заказ № 2310

Отпечатано с готового оригинал-макета

в ООО «Бланк» Лиц. №3550 400131, г. Волгоград, ул. Скосырева, 2а

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Демьянова, Ольга Борисовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Антигены Burkcholderia pseudomallei и перспективы разработки на их основе препаратов для специфической профилактики мелиоидоза

1.2 Общее представление в системе цитокинов. Цитокины в патогенезе мелиоидозной инфекции.

1.3 Рекомбинантные цитокины: применение в инфекционной патологии

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Штаммы буркхольдерий, питательные среды.

2.2 Антигенные комплексы.

2.3 Экспериментальные животные.

2.4 Перевиваемые клеточные линии, инфузории.

2.5 Методы получения лимфокинов и монокинов.

2.6 Методы изучения биологической активности лимфокинов и монокинов.

2.7 Препараты рекомбинантных цитокинов.'.43*

2.8 Оценка иммуногенности и протективности антигенов.

2.9 Статистическая обработка результатов.

Глава 3. ЦИТОКИНИНДУЦИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА.

3.1 Тестирование токсичности антигенов на разных типах клеток

3.2 Биологическая активность монокинов и лимфокинов.

3.3 Иммуногенные, иммунотропные и цитокининдуцирующие свойства антигенов и их взаимосвязь с протективностью.

Глава 4. ВЛИЯНИЕ МОНОКИНОВ И ЛИМФОКИНОВ НА ИММУНОГЕННЫЕ И ПРОТЕКТИВНЫЕ СВОЙСТВА МЕЛИОИ-ДОЗНЫХ АНТИГЕНОВ.

4.1 Динамика иммунного ответа на мелиоидозные антигены при совместной иммунизации с лимфокинами и монокинами.

4.2 Протективные свойства мелиоидозных антигенов при изолированном и совместном с лимфокинами и, монокинами применении

Глава 5. СТИМУЛЯЦИЯ ИММУНОГЕННЫХ И ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ МЕЛИОИДОЗНЫХ АНТИГЕНОВ РЕКОМБИ-НАНТНЫМИ ЦИТОКИНАМИ.

5.1 Влияние рекомбинантных цитокинов на первичный и вториный иммунный ответ к мелиоидозным антигенам.

5.2 Воздействие рекомбинантных цитокинов на иммунотропные свойства мелиоидозных антигенов.

5.3 Протективность мелиоидозных антигенов при их совместном применении с рекомбинантными цитокинами.

5.4 Подбор оптимальной схемы стимуляции иммуногенных и про-тективных свойств мелиоидозных антигенов коммерческими препаратами рекомбинантных цитокинов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Стимуляция иммуногенных и протективных свойств антигенов возбудителя мелиоидоза цитокинами"

Мелиоидоз — заболевание, вызываемое Burkholderia pseudomallei, относится к группе особо опасных инфекций и характеризуется высокой летальноj стью. Возбудитель мелиоидоза распространен в странах Юго-Восточной Азии и Австралии, хотя немногочисленные случаи мелиоидозной инфекции зарегистрированы на Филиппинах, Папуа Новой Гвинее, в Африке, Америке, Азии и Европе [122, 133]. Заболевание, вызываемое В. pseudomallei, протекает в разнообразных клинических формах, включая субклиническую, острую локализованную, легочную, септицемическую и хроническую [177, 180]. В современных условиях проблема мелиоидоза актуальна и для России в связи с ростом туризма, расширением культурных и экономических связей нашей страны с эндемичными по мелиоидозу регионами. Кроме того, возбудитель мелиоидоза, по данным международных экспертов, входит в список возможных агентов биотерроризма [59, 126].

Проблема борьбы с мелиоидозом осложняется также отсутствием средств специфической профилактики. Как известно, несмотря на многолетние исследования по созданию химической мелиоидозной вакцины, эффективный профилактический препарат на сегодняшний день отсутствует, что связано как с низкой протективностью различных мелиоидозных антигенов, так и с недостаточной изученностью механизмов иммунитета при мелиоидозе. Работами последнего десятилетия показана определяющая роль поверхностных антигенов возбудителя мелиоидоза в формировании резистентности к инфекции [9, 63], однако их протективные свойства были недостаточными в защите от вирулентных мелиоидозных штаммов. В свете этих данных особую актуальность приобретает поиск новых иммуностимулирующих препаратов, а также разработка современных подходов к проблеме иммунорегуляции при мелиоидозе, в частности, изучение воздействия цитокинов на иммуногенные и протективные свойства антигенов В.pseudomallei.

В зарубежной литературе имеются работы, посвященные роли отдельных цитокинов в развитии инфекционного процесса при мелиоидозе. В частности, показано, что определение в крови уровней ФНО-а, ИФН-у, ИЛ-6, ИЛ-10 имеет прогностическое значение для исхода мелиоидозной инфекции [132, 175]. Изучены количественные показатели различных цитокинов при остром и хроническом экспериментальном мелиоидозе у мышей, показана взаимосвязь высоты бактериемии с пиком продукции цитокинов. клетками селезенки [104]. Многие исследователи указывают на важную роль Thl- цитокинов, отвечающих за формирование клеточного иммунитета, в патогенезе мелиоидоза [104, 130], а также ранних провоспалительных цитокинов [132, 197].

Однако, следует заметить, что все имеющиеся работы по изучению цитокинов при мелиоидозе посвящены их значению в инфекционном процессе, в то время как публикаций о влиянии цитокинов на иммуногенные и протективные свойства мелиоидозных антигенов в процессе иммунопрофилактики инфекции в доступной литературе нам обнаружить не удалось. Кроме того, достаточно важным, с научной и практической точки зрения, является изучение корреляционных связей между способностью мелиоидозных антигенов индуцировать продукцию определенных цитокинов и их протективными свойствами. Данное направление в изучении свойств антигенов В. pseudomallei при их скрининге на предмет отбора потенциальных компонентов химической вакцины остается пока не исследованным.

Цель работы: повышение иммуногенных и протективных свойств антигенов В.pseudomallei цитокинами.

Задачи исследования:

3. Изучить взаимосвязь биологической активности монокинов и лимфо-кинов с иммуногенными и протективными свойствами антигенов-индукторов

Научная новизна

Впервые определена взаимосвязь между цитокининдуцирующей активностью антигенов буркхольдерий и их защитными свойствами, которая позволяет проводить скрининг протективных антигенов в клеточной системе in vitro по биологической активности лимфокинов и монокинов, индуцированных антигенами. На основе выявленных закономерностей разработан новый способ оценки уровня протективности мелиоидозных антигенов на культуре клеток L-929 по степени цитотоксической активности ФНО-а монокинов, индуцированных антигенами in vitro.

Впервые показана возможность повышения иммуногенных и протективных свойств мелиоидозных антигенов при их совместном применении с реком-бинантными цитокинами. Отмечена необходимость применения для стимуляции первичного иммунного ответа цитокинов, стимулирующих неспецифические клеточные реакции макроорганизма, а для повышения вторичного ответа — цитокинов, преимущественно влияющих на специфический Т-клеточный иммунный ответ. Разработан новый способ повышения протективности мелиои-дозных антигенов рекомбинантными цитокинами, основанный на применении ИФН-у при первичной иммунизации антигенами и ИЛ-2 — при вторичной.

Приоритетность выполненных исследований подтверждена:

- патентом на изобретение № 2281507 от 10.08.2006 г. «Способ оценки токсичности бактериальных антигенов» (авторы: Жукова С.И., Аделыиин Ф.К., Храпова Н.П., Пивень Н.Н., Прошина О.Б., Засядкина А.В., Плеханова Н.Г.);

- патентом на изобретение № 2354400 от 10.05.2009 г. «Способ оценки уровня протективности мелиоидозных антигенов» (авторы: Прошина О.Б., Жукова С.И., Храпова Н.П., Авророва И.В., Пивень Н.Н., Ломова Л.В.).

По матералам диссертации направлена в Роспатент заявка на изобретение «Способ повышения протективности мелиоидозных антигенов цитокинами» № 2008127677 от 7.07.2008 г. (авторы: Жукова С.И., Демьянова О.Б., Авророва И.В., Алексеев В.В., Храпова Н.П., Ломова Л.В.).

Практическая ценность

По материалам исследования составлены:

1. «Методические рекомендации по изучению цитокининдуцирующей активности мелиоидозных антигенов» (утверждены директором института 21.12.2005г.), в которых приведены методические приемы, позволяющие определять показатели цитокининдуцирующей активности антигенов, коррелирующие с их защитными свойствами: фагоцитарную активность макрофагов под действием лимфокинов, степень экспрессии Fc-рецепторов на поверхности ней-трофилов под действием монокинов и уровень цитотоксической активности ФНО-а монокинов на перевиваемой клеточной линии мышиных фибробластов L-929. Предложенные методы позволяют проводить скрининг мелиоидозных антигенов на протективность без значительных временных и материальных затрат, связанных с иммунизацией и заражением животных при определении протективности в стандартном тесте активной защиты на животных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Протективность мелиоидозных антигенов связана с их цитокининду-цирующей активностью в отношении макрофагов и лимфоцитов: выраженностью экспрессии Fc-рецепторов на поверхности нейтрофилов под влиянием мо-нокинов, степенью цитотоксичности ФНО-а монокинов для фибробластов L-929 и фагоцитарной активностью макрофагов под действием лимфокинов.

5. Рекомбинантные цитокины могут быть использованы для повышения иммуногенных и протективных свойств антигенов В.pseudomallei. Оптимальной схемой стимуляции иммунного ответа1 на мелиоидозные антигены является использование при первичной иммунизации ИФН-у, а при вторичной — ИЛ-2.

Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 116 страницах машинописного текста, иллюстрирована 11 рисунками и 18 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения и выводов. Список использованных источников литературы включает 200 работ (99 отечественных и 101 зарубежных).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Демьянова, Ольга Борисовна

ВЫВОДЫ

1. Антигены возбудителя мелиоидоза обладают цитокининдуцирующей активностью в отношении макрофагов и лимфоцитов. Для индукции монокинов и лимфокинов in vitro необходимо использовать нетоксичные дозы антигенов, не оказывающие повреждающего действия на иммунокомпетентные клетки. Способ оценки токсичности антигенов на инфузориях Paramecium caudatum по угнетению их выделительной функции позволяет определять токсичность на физиологическом уровне, отличается простотой и высокой чувствительностью.

2. Протективность антигенов В.pseudomallei находится в прямой корреляционной зависимости от фагоцитарной активности макрофагов иммунизированных животных и степени митогенного действия антигенов на В-лимфоциты.

3. Установлена взаимосвязь между протективностью и цитокининдуцирующей активностью антигенов буркхольдерий, а именно: степенью экспрессии Fc-рецепторов на нейтрофилах под влиянием монокинов, уровнем активности лимфокинов, модулирующих фагоцитарную способность макрофагов, и степенью цитотоксичности ФНО-а монокинов на фибробластах L-929.

4. Применение монокинов способствует более выраженной стимуляции клеточных факторов иммунитета при первичной иммунизации мелиоидозными антигенами, а использование лимфокинов - при вторичной.

5. Рекомбинантные цитокины ИЛ-1, ИЛ-2, ИФН-а, ИФН-у обладают способностью повышать клеточный и гуморальный иммунный ответ к антигенам В.pseudomallei и усиливать их поликлональную активность в отношении В-клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Мелиоидоз — особо опасное заболевание людей и животных, вызываемое B.pseudomallei. Инфекция эндемична для тропических и субтропических регионов Юго-Восточной Азии и Северной Австралии, однако в связи с постоянно расширяющимися международными контактами вполне может быть завезена в Россию. Актуальность проблемы мелиоидоза связана также с тем, что, по мнению международных экспертов, В. pseudomallei входит в перечень возможных агентов биотерроризма [70].

Специфическая профилактика мелиоидоза пока не разработана, прежде всего, потому, что механизмы иммунитета при этой инфекции остаются недостаточно ясными [27, 165]. Протективность большинства изученных антигенов возбудителя мелиоидоза является недостаточной для создания эффективного профилактического препарата, способного обеспечить высокий уровень невосприимчивости к заражению B.pseudomallei [9, 63]. В связи с этим, остается актуальной проблема повышения иммуногенных и протективных свойств антигенов возбудителя мелиоидоза. Современным подходом к решению данной проблемы является использование цитокиновых препаратов, обладающих преимущественно селективным действием на отдельные субпопуляции иммунокомпе-тентых клеток.

Рядом зарубежных исследователей показана важная роль провоспали-тельных цитокинов и Thl-цитокинов в развитии устойчивости к B.pseudomallei, а также прогностическая значимость определения концентраций в крови ИЛ-6, ИЛ-8, ФНО-а, ИЛ-1 для исхода заболевания [132, 142, 158, 169, 175, 176, 197].

Необходимо отметить, что все имеющиеся работы по изучению цитокинов при мелиоидозной инфекции посвящены их значению в инфекционном процессе, в то время как в доступной литературе отсутствуют публикации о роли цитокинов в процессе иммунопрофилактики мелиоидоза.

Вместе с тем, изучение цитокининдуцирующей активности мелиоидозных антигенов представляет не только научный, но и практический интерес, особенно при установлении корреляционных связей между способностью антигенов индуцировать продукцию определенных цитокинов и их протективными свойствами. Данное направление в изучении свойств мелиоидозных антигенов при их скрининге на предмет отбора протективных компонентов, потенциально пригодных для конструирования химической вакцины, остается не исследованным.

Не менее важным представляется изучение возможности цитокинов стимулировать иммунный ответ к мелиоидозным антигенам в процессе иммунопрофилактики, учитывая низкую протективность антигенных препаратов B.pseudomallei [9, 33, 63]. Как известно, в настоящее время цитокины достаточно широко используются в качестве средств иммунотерапии при различных патологических состояниях, которые сопровождаются иммунной недостаточностью. Рекомбинантные цитокины применяют для усиления действия антибактериальных, противовирусных и других средств при различных инфекционных и соматических заболеваниях: сепсисе различной этиологии, микотических инфекциях, хламидийной инфекции, туберкулезе, герпесе, онкологических заболеваниях [30, 81, 84, 92, 118].

В последние годы появляются единичные сообщения о применении цитокинов в качестве иммуноадъювантов при вакцинопрофилактике некоторых инфекций [1]. В отношении мелиоидоза подобных исследований по применению цитокинов для стимуляции иммуногенных свойств антигенов B.pseudomallei не проводилось, что и определило цели и задачи данной диссертационной работы.

Целью работы являлось повышение иммуногенности и протективности антигенов B.pseudomallei цитокинами.

На первом этапе исследования были изучены суммарные фракции цитокинов - монокины и лимфокины. Известно, что монокины (продукты моноцитов и макрофагов) и лимфокины (продукты лимфоцитов) являются наиболее значимыми в противоинфекционном иммунитете цитокинами [80]. Макрофаги ответственны за локализацию и уничтожение возбудителя в месте внедрения, а также за переработку антигенного материала и представление его лимфоцитам для формирования специфического клеточного или гуморального иммунного ответа. Провоспалительные цитокины макрофагов (ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а, хемо-кины) играют основную роль в развитии воспаления и инициации механизмов специфического иммунитета [40]. Важная роль лимфокинов в иммунитете связана с тем, что они формируют иммунный ответ по клеточному или гуморальному типу в зависимости от преимущественной активации Т-лимфоцитов — хелперов первого или второго типа [48, 49, 193].

Лимфокины и монокины в наших опытах были получены in vitro на культурах мышиных макрофагов и спленоцитов. Для индукции цитокинов в данных клеточных системах были подобраны .нетоксичные дозы мелиоидозных антигенов, не нарушающие жизнедеятельности клеток в процессе культивирования. Нами была проведена серия экспериментов по подбору адекватной модели для тестирования токсичности антигенов. В этом качестве были испытаны перевиваемые клеточные линии фибробластов мыши L-929, овариальной опухоли китайского хомячка СНО К-1 и инфузории Paramecium caudatum. Было показано, что по степени чувствительности к токсическому действию бактериальных антигенов клетки-мишени располагались следующим образом: СНО К-1 (наиболее чувствительные), инфузории P.caudatum, фибробласты L-929. Нами предложен новый метод оценки токсичности микробных антигенов на инфузориях по критерию снижения на 50% числа сокращений их выделительных вакуолей, который позволяет определять токсичность на физиологическом уровне, без морфологических изменений в клетках. Данный метод характеризуется высокой чувствительностью, простотой и быстротой исполнения.

Биологическая активность полученных in vitro лимфокинов и монокинов при индукции их ВСЭ буркхольдерий (В. pseudomallei С-141, В. pseudomallei 100, В. thailandensis 251) была изучена на макрофагах и нейтрофилах мышей BALB/c.

Показано, что ВСЭ-100 и ВСЭ-251 вызывали индукцию лимфокинов, повышающих экспрессию FcR на Мф, а лимфокины, индуцированные ВСЭ-С-141, обладали этим свойством в значительно меньшей степени. Монокины, индуцированные ВСЭ-С-141 и ВСЭ-100, усиливали экспрессию FcR на поверхности

Нф, а активность монокинов, индуцированных ВСЭ-251, существенно не отличалась от контрольных цифр.

Изучение цитотоксичности ФНО-а в супернанантах Мф, стимулированных антигенами буркхольдерий, на клетках L-929 показало, что в монокинах, индуцированных ВСЭ-100, активность ФНО-а была максимальной (128 ед. актив.). Уровни активности ФНО-а в монокинах, полученных при воздействии ВСЭ-С-141 и ВСЭ-251, были ниже (32 и 16 ед. актив, соответственно).

При изучении регуляторного влияния лимфокинов, образовавшихся под действием ВСЭ буркхольдерий, на фагоцитарную активность Мф установлено, что цитокины, стимулированные ВСЭ-100, в наибольшей степени повышали фагоцитарную активность Мф (КС=4,94±0,9; в контроле 1,33±0,4, р<0,05). Лимфоциты, примированные ВСЭ-С-141, также продуцировали цитокины, существенно стимулировавшие фагоцитоз Мф (КС=4,13±0,8, р<0,05). Наименьшей стимулирующий активностью обладали лимфокины, полученные с помощью ВСЭ-251.

Изучение протективных свойств ВСЭ буркхольдерий показало, что ВСЭ-100 был наиболее протективным, он защищал 50% животных от 5 ЛД50 умеренно вирулентного штамма В. pseudomallei 115, ВСЭ-С-141 защищал 40% животных, а ВСЭ-251 - всего 22%.

Установлена зависимость между уровнем активности лимфокинов, модулирующих фагоцитарную способность Мф, и степенью протективности антигена-индуктора лимфокинов. Отмечена прямая взаимосвязь между степенью экспрессии FcR на поверхности Нф под влиянием монокинов и защитными свойствами антигена-индуктора. Выявлена взаимосвязь между способностью антигенов буркхольдерий активировать ФНО-а монокинов и их защитными свойствами.

Таким образом, защитные свойства антигенов буркхольдерий зависят от их способности индуцировать выработку цитокинов, стимулирующих клеточное звено иммунитета. Полученные нами данные согласуются с известным положением о доминирующей роли клеточных факторов иммунитета в защите от мелиоидозной инфекции [27, 104, 181].

Изучение взаимосвязи протективности с иммуногенными и иммунотроп-ными свойствами мелиоидозных антигенов показало, что защитные свойства ВСЭ буркхольдерий коррелируют с уровнем фагоцитарной активности Мф иммунизированных животных и выраженностью митогенного действия антигенов на В-лимфоциты.

В экспериментах на мышах были изучены иммуномодулирующие свойства монокинов и лимфокинов в отношении влияния на иммунный ответ к поверхностному мелиоидозному комплексу Агб+d. В этой серии экспериментов были использованы монокины и лимфокины, полученные в результате прими-рования ПМ и лимфоцитов селезенки мышей BALB/c данным антигенным комплексом.

Было показано, что на 10 сут после первичной иммунизации применение монокинов в большей степени стимулировало экспрессию FcR на Мф и Нф, фагоцитарную активность ПМ и уровень ГЗТ по сравнению с иммунизацией Агб+d без цитокинов (р<0,05), чем использование лимфокинов. Напротив, после вторичной иммунизации (на 18 сут наблюдения) наиболее выраженная активность клеточного иммунитета и макрофагального звена отмечена у животных, которым двукратно вводили Агб+d и лимфокины.

Титр специфических антител на 18 сут был наибольшим в группе животных, которым вводили вместе с Агб+d монокины (1:371), несколько меньший титр антител определялся в сыворотках мышей, иммунизированных Агб+d в сочетании с лимфокинами (1:199), и еще более низкий - у мышей, получавших только Агб+d (1:158).

Изучение протективности мелиоидозного комплекса Агб+d на мышах показало, что использование для стимуляции иммунного ответа лимфокинов способствовало повышению на 26 % выживаемости животных от 10 ЛД50 В. pseudomallei 100 по сравнению с контролем, в то время как совмещение иммунизации с введением монокинов или иммунизация только Агб+d практически не защищали мышей.

Таким образом, повышение протективности мелиоидозных антигенов в группе мышей, получавших Агб+d и лимфокины, коррелировало, по нашим данным, с более высокими показателями клеточного иммунитета перед заражением. Применение монокинов при первичном иммунном ответе увеличивало показатели клеточного иммунитета, в то время как использование монокинов, запускающих первую фазу иммунного ответа, для стимуляции вторичного ответа на антиген, по-видимому, приводило к дисбалансу цитокинов и не способствовало адекватному повышению клеточного иммунитета, что приводило к снижению протективности антигенов, так как защита при мелиоидозе связана преимущественно с клеточными механизмами [29, 33, 63]. Дополнительным подтверждением преобладающего значения клеточных факторов в противоин-фекционном иммунитете при мелиоидозе является и тот факт, что продукция специфических антител в наших опытах не коррелировала с уровнем протективности.

Поскольку лимфокины и монокины являются суммарными фракциями, содержащими несколько компонентов, при их использовании трудно оценить влияние отдельных важнейших цитокинов на иммуногенез. В связи с этим в следующей серии экспериментов мы изучали влияние на иммунный ответ монопрепаратов рекомбинантных цитокинов.

За последние два десятилетия клонированы гены большинства цитокинов и получены рекомбинантные аналоги, полностью повторяющие биологические свойства природных молекул [42]. Препараты рекомбинантных цитокинов нашли применение в практической медицине в лечении больных инфекционными заболеваниями, злокачественными новообразованиями, аплазией кроветворения, различными видами иммунопатологии [83, 156, 185]. В последние годы появляются сообщения о стимуляции рекомбинантными цитокинами иммунного ответа при вакцинации против некоторых инфекций в эксперименте [1]. В отношении мелиоидозной инфекции подобные сведения в отечественной и зарубежной литературе отсутствует.

В экспериментах на белых мышах и крысах нами была изучена возможность усиления иммунного ответа к антигенному комплексу Агб+d препаратами рекомбинантных цитокинов: ИЛ-1 (беталейкин), ИЛ-2 (ронколейкин), ИФН-а (интераль), ИФН- у (ингарон).

Показано, что при стимуляции только первичного иммунного ответа применение ИФН-у в наибольшей степени повышало показатели клеточного иммунитета и макрофагально-фагоцитарного звена, на втором месте по способности активировать данные показатели был ИЛ-1 и на последнем - ИФН-а. При изолированном использовании ИЛ-2 для стимуляции вторичного иммунного ответа показатели фагоцитарной активности ПМ, уровня ГЗТ и экспрессии FcR на фагоцитах были близки к таковым в группе мышей, получавших ИЛ-1 при первичной иммунизации.

Наиболее высокий уровень клеточного иммунитета был зарегистрирован при стимуляции первичного и вторичного иммунного ответа по схемам: ИФН-у + ИЛ-2 и ИЛ-1 + ИЛ-2. В частности на 18 сут наблюдения фагоцитарная активность ПМ мышей, получавших при первичной иммунизации вместе с Агб+d ИФН-у, а при вторичной — ИЛ-2, в 3,46 раза превосходила соответствующий показатель животных, иммунизированных только Агб+d, при стимуляции мышей по схеме ИЛ-1 + ИЛ-2 индекс стимуляции (ИС) фагоцитарной активности ПМ составлял 1,98; при применении одного из цитокинов (ИЛ-1, ИФН-а, ИФН-у, ИЛ-2) ИС колебался от 0,76 до 1,38. Подобная же закономерность прослеживалась и в отношении стимуляции сочетаниями цитокинов экспрессии FcR на фагоцитах и уровня реакции ГЗТ.

Уровень гуморального ответа мышей на мелиоидозные антигены при использовании рекомбинантных цитокинов к концу периода иммуногенеза был существенно выше такового у животных, иммунизированных только Агб+d, однако различий между разными схемами стимуляции с использованием одного или двух цитокиновых препаратов выявлено не было.

Микробные антигены с выраженными митогенными свойствами, как правило имеют в своем составе ПАМС - патоген-ассоциированные молекулярные структуры, которые распознаются Toll - подобными рецепторами, широко представленными на клетках системы врожденного иммунитета — макрофагах, дендритных клетках, моноцитах, нейтрофилах, а также на В- и Т - лимфоцитах [79]. По современным представлениям, активация системы врожденного иммунитета подобными микробными антигенами способна создать быструю защиту от любого патогена [79, 93].

При изучении влияния рекомбинантных цитокинов на иммунотропные свойства мелиоидозного антигенного комплекса Агб+d в опытах на мышах BALB/c было показано, что введение мышам вместе с Агб+d ИЛ-1 в 6,9 раза (р<0,05) увеличивало способность Агб+d вызывать неспецифическую (поликлональную) активацию В-клеток, продуцирующих IgM к эритроцитам барана, а использование ИФН-а увеличивало число АОК селезенки в 3,8 раза (р<0,05). При изолированном применении (без цитокинов) Агб+d незначительно (в 1,3 раза) по сравнению с контролем (интактные животные) увеличивал число АОК к ЭБ. При вторичной иммунизации Агб+d не оказывал заметного иммунотроп-ного влияния на В-клетки. Однако, в группах животных, получавших вместе с Агб+d ИЛ-2 или ИЛ-1+ ИЛ-2, зарегистрировано существенное увеличение числа АОК (в 5 и 7,6 раз соответственно, р<0,05), что свидетельствует об увеличении митогенной активности мелиоидозных антигенов под влиянием этих цитокинов.

Анализ данных о воздействии рекомбинантных цитокинов на протектив-ные свойства мелиоидозного комплекса Агб+d показал, что стимуляция первичного и вторичного иммунного ответа способствовала более высоким показателям выживаемости и СПЖ по сравнению с воздействием цитокинами только на первичный (ИЛ-1, ИФН-а, ИФН-у) или только на вторичный (ИЛ-2) ответ. Наиболее эффективной схемой стимуляции оказалась схема ИФН-у+ ИЛ-2, обеспечившая 50% выживаемость мышей от 15 ЛД50 В.pseudomallei 100 (р<0,05). Аналогичная стимуляция первичного и вторичного ответа ИЛ-1+ИЛ-2 способствовала выживаемости 43 % мышей (р<0,05). Показатели СПЖ при двойном воздействии цитокинами в данных группах достоверно превышали СПЖ контрольных животных (р<0,05).

При использовании для повышения иммунного ответа только одного ци-токинового препарата более эффективным было применение ИФН-у: 33 % выживших мышей и существенное удлинение сроков СПЖ (р<0,05). В группах мышей, получавших вместе с Агб+d ИЛ-1, ИФН-а или ИЛ-2, выживаемость не превышала 6-23 %, а СПЖ мало отличалась от СПЖ в контрольной группе.

Учитывая более высокую эффективность использования для усиления иммунного ответа двух цитокиновых препаратов по сравнению с одним, показанную нами в экспериментах на мышах, в опытах на крысах - экспериментальной модели, наиболее приближенной к человеку по чувствительности к возбудителю мелиоидоза — были испытаны схемы двойной стимуляции иммунного ответа (ИЛ-1 + ИЛ-2 и ИФН-у + ИЛ-2).

В экспериментах на крысах показано, что воздействие на первичный иммунный ответ к Агб+d ИФН-у или ИЛ-1, а на вторичный — ИЛ-2 способствовало существенному увеличению показателей СПЖ зараженных крыс по сравнению с СПЖ контрольных животных (р<0,05), при этом более эффективной оказалась схема стимуляции ИФН-у + ИЛ-2. Повышение показателей клеточного иммунитета на 18 сут наблюдения было более выраженным также при использовании схемы стимуляции ИФН-у +ИЛ-2. Так, хемилюминесцентный ответ ПМ крыс, стимулированных по схеме ИФН-у + ИЛ-2, превышал таковой» в группе животных, иммунизированных только Агб+d, в 1,84 раза (по схеме ИЛ-1 + ИЛ-2 - в 1,53 раза), уровень ГЗТ - в 2;28 раза (по схеме ИЛ-1 + ИЛ-2 -в 1,76 раза);

Биохимический анализ крови крыс в конце периода иммуногенеза показал, что ни двукратное введение мелиоидозных антигенов или цитокиновых препаратов, ни совместное воздействие цитокинами и антигенами не вызывало заметных изменений в концентрациях основных биохимических составляющих крови (АЛТ, ACT, общего белка, билирубина, глюкозы, холестерина; триглице-ридов, мочевины, креатинина), то есть существенно не' отражались на биохимическом гомеостазе животных.

Подводя итог экспериментам на мышах и крысах по определению наиболее эффективной схемы стимуляции цитокинами иммунного ответа на мелиои-дозные антигены, следует констатировать, что таковой схемой является ИФН-у + ИЛ-2. Поскольку иммунитет при мелиоидозе связан, в основном, с клеточными. факторами защиты [33], становится понятным, что повышение протективности1 мелиоидозных антигенов возможно при максимальном вовлечении в f процесс иммуногенеза различных субпопуляций Т-клеток. Подобное действие, по-видимому, обеспечивалось в наших опытах ИФН-у, который на самых ранних этапах иммунной перестройки стимулирует неспецифические клеточные реакции, прежде всего, за счет активации макрофагов, а также усиливает иммунологические реакции с участием Т-хелперов. По данным ряда авторов, несмотря на открытие в последние годы множества новых цитокинов, ИФН-у остается главным медиатором клеточного иммунитета [17, 37]. Многочисленные иммунологические исследования показали исключительную роль этого цито-кина в защите от целого ряда инфекций [16, 110, 115]. Установлена закономерность между слабой системной продукцией ИФН-у и неблагополучным течением вирусных, бактериальных и протозойных инфекций [17]. Дополнительная стимуляция вторичного иммунного ответа на мелиоидозные антигены ИЛ-2, являющимся преимущественно Т-клеточным ростовым фактором, способствовала формированию специфического иммунитета за счет активации процессов пролиферации и дифференцировки Т-лимфоцитов [32, 98]. Как известно, ИЛ-2 проявляет разнообразные прямые и опосредованные эффекты в отношении функциональной активности различных клеток: Т-хелперов, цитотоксических Т-лимфоцитов, естественных киллеров, моноцитов, гранулоцитов, В-клеток [80, 88, 129].

Полученные нами данные об эффективности применения ИФН-у и ИЛ-2 для формирования протективного иммунитета при специфической профилактике мелиоидоза вполне согласуются с сообщениями многих авторов о важной защитной роли этих цитокинов и в процессе мелиоидозной инфекции. Резистентность к развитию острой формы мелиоидоза при заражении B.pseudomallei напрямую зависит, как полагают зарубежные исследователи, от уровня продукции ИФН-у в ранние сроки после инфицирования [158, 169, 189]. Защитная роль ИЛ-2, как одного из главных компонентов Thl-цитокинов, ориентирующих иммунный ответ по клеточному типу, в процессе мелиоидозной инфекции также отмечена в работах многих исследователей [130, 132, 175, 181].

Результаты выполненного исследования могут быть использованы при разработке средств специфической профилактики мелиоидозной инфекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Демьянова, Ольга Борисовна, Саратов

1. Авдеева Ж.И., Алпатова И.А., Медуницын Н.В. Препараты системы цитокинов // Цитокины и воспаление. 2002. —Т.1, №2. - С.33.

2. Активность протеазы штаммов псевдомонад, выделенных из различных источников / Бродинова И.С., Лучина Г.Я., Аджиева П.Н. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1981. -N.10. — С.54-57.

3. Алексеев В.В., Калей Г.М., Локтионов A.M. Идентификация антигенов некоторых клеточных структур возбудителя мелиоидоза методом двухмерного иммуноэлектрофореза // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1984. - № 1. - С.62-65.

4. Анциферова М.А., Казаков А.А., Александров Г.А. Местные и системные эффекты интерлейкина 8 // Цитокины и воспаление. 2002. — Т.1, №2. — С.65.

5. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л. - 1962. — 180с.

6. Басек Т.С., Елькин А.В., Кноринг Б.Е. Результаты применения ронколей-кина в хирургии фиброзно-кавернозного туберкулеза легких // Современная фармакотерапия: цитокины: Матер, науч.-практ. конф., Минск, Бел-ГИУВ. Минск, 2000. - С.26-30.

7. Беталейкин в комплексной терапии инфильтративного туберкулеза легких / Арчакова Л.И., Павлова М.В., Иванова Л.А. и др. // Цитокины и воспаление. 2002. - Т. 1, № 2. - С. 106.

8. Викторов Д.В. Анализ белкового и антигенного состава штаммов Pseu-domonas pseudomallei различной вирулентности// Автореф. . дис. канд.биол. наук. Саратов. - 1997. — 20с.

9. Влияние интерлейкина 1 р на течение экспериментальной клебсиеллезной инфекции/ Ценева Г.Я., Демакова Т.Е., Симбирцев А.С. и др. // Цитокины и воспаление. 2002. - Т.1, №2. - С. 134.

10. Выявление повышенной чувствительности замедленного типа к чумному микробу в реакции исчезновения макрофагов / Васильева Г.И., Дорошенко Е.П., Киселева А.К. и др. // Иммунология. 1988. - №6. - С.82-84.

11. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. М: Медицина," 1973. -141с.

12. Денисов И.И. Полисахаридный компонент слизи Pseudomonas pseudomallei // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 1985. — № 11. С.23-26.

13. Догель В.А. Зоология беспозвоночных // М.: «Высшая школа», 1975. — С.70.

14. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и при патологии. — М.: Медицина, 1996.-240с.

15. Железникова Г.Ф., Иванова В.В., Скрипченко Н.В. Уникальная защитная роль гамма- интерферона при острых инфекциях у детей // Мед. иммунол. 2007. —Т.9, №2-3. - С.223.

16. Жукова С.И., Авророва И.В., Рыбкин B.C. Стимуляция иммунитета к ме-лиодозу микробными полисахаридами и пептидами // Тез. докл. Международ. симпозиума по иммунореабилитации. — Санкт-Петербург, 1995. -С.130.

17. Заболотных Н.В. Цитокины в патогенезе и лечении экспериментальноготуберкулеза // Цитокины и воспаление. 2002. - Т.1, №2. - С. 113-114.

18. Зависимость действия иммуномодуляторов от циркадных ритмов активности иммунной системы / Кирилличева Г.Б., Пронин А.В., Батурина И.Г. и др. // Тез. докл. I Съезда иммунологов России. Новосибирск, 1992. -С.210.

19. Изучение иммуногенности мембранных белков возбудителя мелиоидоза / И. Калачев, А. Байдусь, О. Иванова и др. // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инф. — Саратов, 1993. С. 119-120.

20. Изучение иммуностимулирующего и ранозаживляющего действия реком-бинантного интерлейкина 8 человека / Анциферова Н.А., Варюшина Е.А., Александров Г.В. и др.// Цитокины и воспаление. 2003. - Т.2, №3. - С.39-40.

21. Изучение противоинфекционного защитного действия рекомбинантного интерлейкина -1 бета на модели летальной бактериальной инфекции / Зе-зюлин П.Н., Минаева Е.Н., Синкевич И.Е. и др. // Мед. иммунол. 2005. -Т.7, №2-3. - С.299.

22. Изучение связей между параметрами токсичности химических веществ для инфузорий Tetrahymena pyriformis и животных / Этлин С.Н., Лахони-на Г.М., Ирлина И.С. и др. // Гигиена и санитария. 1987. - №9. - С.80-82.

23. Илюхин В.И. Фагоцитабельность Pseudomonas pseudomallei // Журн. мик-робиол., эпидемиол., иммунобиол. 1978. — № 2. — С.130-132.

24. Илюхин В.И. Антигенная структура и серология псевдомонад // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1979. - № 5. - С.88-93.

25. Илюхин В.И., Мельников Б.Н. Постинфекционный иммунитет при мелиоидозе // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1980. — № 4. — С.87-90.

26. Илюхин В.И., Поповцева Л.Д, Пивень Н.Н. Идентификация возбудителя мелиоидоза /Лаб. дело. 1983. — N.7. - С.61-62.

27. Иммуногенность и гетерогенность поверхностного антигена 8

28. P.pseudomallei / Пивень H.H., Смирнова В.И., Викторов Д.В. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. — № 4. — С.75-78.

29. Иммунокоррекция ронколейкином в терапии микозов / Романюк Ф.П., Антонов В.Б., Смирнов М.Н. и др. // Человек и лекарство: Тез. докл. V Российского национал, конгресса. — М., 1998. — С.309.

30. Иммунокоррекция ронколейкином при туберкулезе легких / Кноринг Б.Е., Елькин А.В., Смирнов М.Н. и др. // Проблемы туберкулеза. 1999. - № 5. - С.26-29.

31. Иммунология инфекционного процесса / Под ред. В.И. Покровского, С.П. Гордиенко, В.И. Литвинова. М.: Медицина, 1993. - 306 с.

32. Иммунология мелиоидоза / Тихонов H.F., Рыбкин B.C., Жукова С.И. и др. // Мелиоидоз: Сб. научн. трудов Волгоград, н.-исслед. противочумн. инта. Волгоград: Нижневолжское книжное изд-во, 1995. - С. 119-141.

33. Иммунореабилитация при лечении инфекционных больных / Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Бабаянц А.А. и др. // Аллергология и-иммунология. -2000. Т.1, №2. — С.6-7.

34. Индикация цитотоксического действия некоторых факторов патогенности возбудителя чумы и холеры с помощью Texrahymena pyriformis / Храм-ченкова Т.А., Громова О.В., Киреев М.Н. и др. // Пробл.особо опасных инф. Саратов, 2000. - №1. - С. 109-113.

35. Интерферонотерапия инфекционных заболеваний — состояние проблемы и перспективы / Афанасьев С.С., Алешкин В.А., Воробьев А.Н. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2005. №6. — С.94-99.

36. Использование метаболических иммунокорректоров для стимуляции иммунитета при некоторых особо опасных инфекциях / Жемчугов В.Е., Жукова С.И., Дятлов И.А. и др. // Вестник ВолГМУ. 2004. - № 12. - С.29

37. Исследование иммуномодулирующей активности имидазолсодержащих полиэлетролитов / Манько В.М., Руднева Т.Б., Гаджиев Р.И. и др. // Иммунология. 1990. - № 5. - С.63-66.

38. К механизму влияния интерлейкина -1 на уровень глюкокортикоидов в крови / Рыбалкина Е.Г., Салаи К., Корнева Е.А. и др. // Пробл. эндокринологии. 1990. - Т.36, №2. - С.73-76.

39. Кетлинский С.А. Перспективы клинического применения рекомбинантных цитокинов // Вестн. РАМН. 1993. - №2. - С.11-18.

40. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Цитокины мононуклеарных фагоцитов в регуляции воспаления и иммунитета // Иммунология. — 1995. — №3. — С.30-44.

41. Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуно-модуляторы. Санкт-Петербург: Гиппократ, 1992. — 255с.

42. Клиническая иммунология / Под. ред. А.В. Караулова. М: Медицинское информационное агентство, 1999. - 606с.

43. Колосков А.В. Мегакариоциты и фиброз костного мозга // Гематология и трансфузиология. 1997. - Т.42, № 1. - С.29-31.

44. Комбинированная терапия хронического вирусного гепатита С с использованием беталейкина и интерферона-а / Кабанова В.И., Романова Е.С., Кузнецов Н.И. и др. // Цитокины и воспаление. 2002. - Т. 1, № 2. — С.116.

45. Кондратенко И.В. Интерлейкин-2 и его роль в развитии иммунодефици-тов и других иммунопатологических состояний // Иммунология. — 1992. — №4. С.6-10.

46. Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Бабаянц А.А. Концепция иммунокоррекции при многофакторных состояниях, инфекционных и онкологических заболеваниях // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. - №5. — С.104-110.

47. Лобзин Ю.В., Захаренко С.М., Позняк А.Л. Опыт применения интерлей-кина-2 (ронколейкина) в клинике инфекционных болезней // Современная фармакотерапия: цитокины: Матер, науч.-практ. конф., Минск, БелГИУВ. -Минск, 2000.-С.8-13.

48. Медуницын Н.В. Повышенная чувствительность замедленного типа / М.: Медицина, 1983. 164с.

49. Методы получения рекомбинантных белков цитокинов. IV. Ренатурация рекомбинантного человеческого интерлейкина-3 / Тихонов Р.В., Печенов С.Е., Гуревич А.И. и др. // Биоорганическая химия. — 2001. — Т.27. - С.40-44.

50. Нейростим-новый отечественный лекарственный препарат на основе рекомбинантного G-CSF человека / Пустошикова Л.А., Романов В.П., Наза-рикова Н.И. и др. // Цитокины и воспаление. — 2002. — Т.1, №2. — С.38.

51. Нейтрофилокин индуцированная активность вакцинного штамма чумного микроба / Иванова И.А., Васильева Г.И., Беспалова И.А. и др. // Пробл. особо опасных инф. - 1997. - С.212.

52. Неспецифические иммуностимуляторы / Под. ред. Л. Иегера // Клиническая иммунология и аллергология. — М: Медицина, 1990. Т.З. - С.465-473.

53. Новые аспекты в лечении прогрессирующего туберкулеза легких / Иванова Л.А., Чужова П.М., Арчакова Л.И. и др. // Современная фармакотерапия: цитокины: Матер, науч.-практ. конф., Минск, БелГИУВ. — Минск,2000.-С.31-37.

54. Организация ликвидации медико-санитарных последствий биологических, химических и радиационных террористических актов: Практическое руководство // Москва, ФГУ «ВЦМК «Защита». 2005. - 328 с.

55. Пальцев М.А., Иванов А.А. Межклеточные взаимодействия. М.: Медицина, 1995.-224с.

56. Перераспределение субпопуляций перитонеальных макрофагов, несущих Fc-рецепторы, под влиянием иммуномодулятора / Родионов С.В., Щербу-хин В.В., Николаева Е.Н. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммуноби-ол. 1988. -№1. -С.97-107.

57. Петяев И.М., Кульберг А.Я., Сычева И.М. Регуляция Fc рецепторами метаболизма активированного кислорода перитонеальных макрофагов // Иммунология. - 1988.- №1. - С.35-37.

58. Пивень Н.Н. Антигенный состав возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности // Автореф. . дис. докт. мед. наук. Волгоград, 1997. - 32с.

59. Пивень Н.Н., Илюхин В.И. Иммунохимический анализ термостабильных антигенов морфологических вариантов возбудителя мелиоидоза // Пробл. особо опасных инф. 1979. - Вып.5. - С.60-63.

60. Пивень Н.Н., Илюхин В.И. Антигенная структура возбудителя мелиоидоза // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1981. - № 4. - С.78-82.

61. Плеханова Н.Г. Экзопротеазы возбудителя мелиоидоза: выделение, очистка, физико-химические и иммунобиологические свойства // Дис. . канд. биол. наук. — Волгоград, 1995. 123с.

62. Попов С.Ф., Курилов В.Я., Мельников Б.И. Особенности паразитирова-ния возбудителя мелиоидоза в клетках хозяина // Ж. микробиол., эпиде-миол. и иммунобиол. — 1991. -№ 10.-С.12-14.

63. Попова А.Е. Методические рекомендации по определению отекогенного эффекта на белых мышах. Волгоград: Нижневолжское книжное изд-во, 1980.-18с.

64. Потапнев М.П. В-лимфоциты. Цитокинобразующая функция // Иммунобиология. 1994. - № 4. - С.4-8.

65. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму / Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Жилина H.JI. и др. Волгоград: Нижневолжское книжное издательство, 2004. - С.25.

66. Производство и анализ рекомбинантных цитокинов / Ищенко A.M., Соловьева Л.Я., Антипова Т.О. и др. // Цитокины и воспаление. 2002. - Т.2, №2.-С. 120.

67. Протеазы патогенных псевдомонад: выделение и детекция / Пивень Н.Н., Подзолкова Г.Г., Закревский В.И. и др. // Тез. докл. VI Всероссийского съезда микробиол., эпидемиол. и паразитол. Нижний Новгород, 1991. — Т.З. - С.122-123.

68. Протективность поверхностных белков в сочетании с иммуномодулято-рами при экспериментальном мелиодозе / Жукова С.И., Авророва И.В., Рыбкин B.C. и др. // Матер. Юбилейной науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. Киров, 1998. - С.98.

69. Ребенок Ж.А. Современные тенденции антибиотикотерапии // Иммунологи, аллергология, инфектология. 2000. - № 3. — С. 125-126.

70. Руководство по инфекционным болезням / Под. ред. Ю.В. Лобзина. -СПб: Фолиант, 2000. 936с.

71. Сальникова О.И. Тестирование и изучение токсинов холерного вибриона в культуре монослойных клеток // Дис. . канд. биол. наук. — Ростов-на-Дону, 1994.- 184с.

72. Семенов Б.Ф., Зверев В.В. Концепция создания быстрой иммунологической защиты от патогенов // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2007. №4. — С.93-100.

73. Симбирцев А.С. Цитокины новая система регуляции защитных реакций организма // Цитокины и воспаление. - 2002. - Т.1, №1. - С.9-15.

74. Системные и местные воспалительные реакции как показатель депрессии иммунитета и их коррекция комплексом цитокинов первой фазы иммунного ответа / Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Никулина Д.Н. и др. // Цитокины и воспаление. — 2002. Т.1, №2. - С.35.

75. Смирнов М.Н., Егорова В.Н. Ронколейкин — эффективный иммуномоду-лятор для лечения иммунодефицитов различной этиологии // Человек и лекарство: Тез. докл. III Российского национал, конгресса. — М., 1996. -С.294.

76. Смирнов М.Н., Малинин В.В., Кетлинский С.А. Терапия вторичных им-мунодефицитных состояний пептидными биорегуляторами / Иммуноде-фицитные состояния. Под ред. B.C. Смирнова, И.С. Фрейдлина. Санкт-Петербург: Фолиант, 2000. - С.477-533.

77. Современная фармакотерапия: цитокины // Мат. науч.-практ. конф., Минск, БелГИУВ. Минск, 2000. - 47с.

78. Состояние и перспективы разработки химической вакцины против сапа и мелиоидоза / Жукова С.И., Пивень Н.Н., Рыбкин B.C. и др. // Матер, науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России. Саратов, 1997. - Т.1. - С.211-212.

79. Сравнительная оценка моно- и нейтрофилокининдуцирующей активности Yersinia pestis / Васильева Г.И., Иванова И.А., Беспалова О.А. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2002. — №3. — С.39-45.

80. Фрейдлин И.С., Кузнецова С.А. Иммунные комплексы и цитокины // Мед. иммунология. 1999. - Т. 1, № 1-2. - С.27-36.

81. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. — М.: Медицина, 2000. 432с.

82. Хемилюминесценция перитонеальных макрофагов при действии макро-фаг-активирующего фактора / Любимов Г.Ю., Зенков Н.Г., Вольский Н.Н. и др. // Иммунология. 1992. - №1. - С.40-43.

83. Цикуниб А.Д. Определение эндогенной интоксикации по токсикоурии с использованием Tetrahymena pyriformis // Клин. лаб. диагностика. 2001. — №6. - С.50-52.

84. Ширинский B.C. Иммуностимулирующие препараты — проблемы скрининга и применения // Тез. докл. I Съезда иммунологов России. — Новосибирск, 1992. С.558-559.

85. Шляпников С.А., Бубнова Н.А., Ерюхин И.А. Принципы цитокиновой терапии сепсис синдрома // Вестн.хирургии им. И.И. Грекова. - 1997. — Т.156, №2. - С.51-54.

86. Экспериментальное изучение иммунотропной активности нового лекарственного препараты кемантана / Арцимович Н.Г., Фадеева Т.А., Галу-шинаТ.С. и др. // Иммунология. 1990. -№ 6. - С.21-23.

87. Эффективность и перспективы исследования живых вакцин для профилактики мелиоидоза / Илюхин В.Н., Кисличкин Н.Н., Меринова JI.K. и др. // Ж. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1999. - № 2. - С.49-51.

88. Эффективность терапии и влияние интерлейкина -2 (ронколейкина) на иммунологические показатели больных хроническим гепатитом / Журкин

89. A.Т., Фирсов C.JL, Хомченко И.В. и др. // Ронколейкин рекомбинантный интерлейкин -2 человека. Терапия вторичных иммунодефицитных состояний: Матер, науч.-практ. конф. - СПб, 2000. - С. 18-22.

90. Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Рыбкин B.C. Иммуноферментный анализ в микробиологии. Саратов, 1990. - 108с.

91. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии // Иммунология. 1997. — №5. - С.7-14.

92. Ярулин Р.Г. Молекулярная организация и иммунохимические свойства липополисахарида возбудителя мелиоидоза // Дис. . канд. биол. наук. -Волгоград, 1990. 129с.

93. A critical role for neutrophils in resistance to experimental infection with Burkholderia pseudomallei / Easton A., Hague A., Chu K. et al. // J. Infect. Dis. 2007. - V.195, N.l. — P.99-107.

94. A model of immunity to Burkholderia pseudomallei: unique responses following immunization and acute lethal infection / Ulett G.S., Labrooy J.T., Currie

95. B.J. et al. // Microbes Infect. 2005. - V.7, N.l 1-12. -P.1263-1275.

96. A randomized controlled trial of granulocyte colony-stimulating factor for the treatment of severe sepsis due to melioidosis in Thailand / Cheng A.C., Lim-mathurotsakul D., Chierakul W. et al. // Clin. Infect. Dis. 2007. - V.45, N.3, -P.308-314.

97. Abbas A.K., Murphy K.M., Sher A. Functional diversity of helper T lymphocytes // Nature. 1996. - V.3 83. - P.787-793.

98. Adaptive immunity in melioidosis: a possible role for T cells in determining outcome of infection with Burkholderia pseudomallei / Barnes J.L., Warner J., Melrose W. et al. // Clin. Immunol. -2004. V.l 13, N.l. -P.22-28.

99. Adjunctive granulocyte colony-stimulating factor for treatment of septic shock due to melioidosis / Cheng A.C., Stephens D.P., Anstey N.M. et al. // Clin. Infect. Dis. 2004. - V.38, N.l. - P.32-37.

100. Analogous Cytokine Responses to Burkholderia pseudomallei strains contrasting in virulence correlate with partial cross-protection in immunized mice / Glen C., Ulett G.C., Ketheesan N. // Infect. Immun. 2002. - V.70, N.7. -P.3953-3958.

101. Avrorova I.V., Zhukova S.I., Bakulina H.G. Immunomodulating activity of maleinic anchidride in experimental melioidosis // Inf. J. Immunorehabilit. -1994.-N.l.-P.395.

102. Baggiolini M., Dewald В., Moser B. Human chemokines: an update // Annu. Rev. Immunol. 1997. - V.15. -P.675-705.

103. Belardelli F. Role of interferons and other cytokines in the regulation of the immune response // APMIS, 1995. V.103, N.3. - P.161-179.

104. Bendtren K. Cytokines and natural regulators of cytokines // Immunol, lett. — 1994.-N.43.-P.il 1-123.

105. Beurler В., Milsark J.W., Cerani A. Cachectin tumor necrosis factor: production, distribution and methabolic fate in vivo // J.Immunol. 1985. - V.135. -P.3972-3977.

106. Beutler B. The history, properties and biological effects of cachectin // Biochemistry. 1988. - V.27, N.2. - P.7575-7582.

107. Beutler В., Gerami A. The common mediator of shock, cahexia and tumor necrosis. // Dixon FS, ed. Advances in immunology. New-York: Acad. Press, 1988. V.42. - P.213-231.

108. Biondillo D.E., Konicek S.A., Iwamoto G.K. Interferon-y regulations of inter-leukin 6 in monocytic cells // Amer. J. Phisiol. 1994. - V.267, N.5. - P.564-568.

109. Burkholderia pseudomallei aerosol infection results in differential inflammatory responses in BALB/c and C57B1/6 mice / Tan G.Y., Liu Y., Sivalingam S.P. et al. // J. Med. Microbiol. 2008. - V.57, N.4. - P.508-515.

110. Burkholderia pseudomallei in reinfection of T cells leads to T cells costimula-tion partially provided by flagellin / Ye Z., Lee C.M., Sun G.W. et al. // Infect. Immun. 2008. - V.76, N.6. - P.2541-2550.

111. Characterization of a murine model of melioidosis: comparison of different stratus of mice / Hoppe I., Brenneke В., Rohde M. et al. // Intect. Immun. — 1999. V.67, N.6. - P.2891-2900.

112. Characterization of tumor necrosis factor-alpha inhibitor activity in cancer patients /Martinez N., Charles Т., Vaillant P. et al. // Ann. J. Resp. Cell. Mol. Blot. 1992.- V.5,N.5.-P.510-515.

113. Cheng A.C., Currie B.J. Melioidosis: epidemiology, pathophysihology and management// Clin. Microbiol. Rev. -2005. -N.18. -P.383-416.

114. Cheng A.C., Dasari P., Currie B.Y. Granulocyte colony-stimulating factor and in vitro whole blood model of melioiodosis // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2004. - V.23, N.3. - P.205-207.

115. Chong K.T. Prophyctic administration of interleukin-2 protects mice from letal challenge with gram-negative bacteria // Infect. Immun. 1987. - V.56, N.3. -P.668-673.

116. Cloning of cDNA for human T-cell replacing factor (interleukin-5) and comparison with the murine homologue / Azuma C., Tanabe Т., Konishi M. et al. // Nucl. Acids. Res. 1986. - V. 14, N.22. -P.9149-9158.1 9 ft

117. Coenye Т., LiPuma J.J. Molecular epidemiology of Burkholderia species / Front Biosci. 2003. - N. 1. - P. 55-67.

118. Cp G — modified plasmid DNA encoding flagellin improves immunogenicity and provides protection against Burkholderia pseudomallei infection in BALB/c mice / Chen Y.S., Hsiao Y.S., Lin H.H. et al. // Infect. Immun. 2006. -V.74, N.3. - P. 1699-1705.

119. Cytokines in hemopoesis, oncology and immunology / Freund M., Link H., Schmidt R.E., eds. // Berlin: springer-verlag, 1994. 71 lp.

120. Del Prete G., Maggi E., Romagnani S. Human Thl and Th2 cells: functional properties, mechanisms of regulation and role in disease // Lab. Invest. — 1994. — V.70. — P.299-306.

121. Demonstration of a cell-mediated immune response in melioidosis / Ketheesan N., Barnes J.L., Ulett G.C. et al. // J. Infect. Dis. 2002. - V.186, N.2. - P.286-289.

122. Dodin M. Les antigens vaccinante // Bordsaux Med. 1979. - V.2, N 5. -P.229-301.

123. Elevated plasma concentrations of interferon (IFN)-gamma and IFN-gamma-inducing cytokines interleukin (IL)-18, IL-12 and IL-15 in severe melioidosis / Lauw F.N., Simpson A.J., Prins J.M. et al. // J. Infect. Dis. 1999. - V.180, N.6. -P.1878-1885.

124. Endemic melioidosis in tropical northern Australia: a 10 years prospective study and review of the literature / Currie B.J., Fisher D.A., Howard D.M. et al. // Clin. Infect. Dis. 2000. - V.34, N.4. - P.981-986.

125. Endogenous interleukin-18 improves the early antimicrobial host response in severe melioidosis / Wiersinga W.J., Wieland C.W., van der Windt G.J. et al. // Infect. Immun. 2007. - V.75, N.8. - P.3739-3746.

126. Enhanced resistance of mice to bacterial infection induced by recombinant human interleukin-la / Ozaki Y., Ohashi Т., Minamy A. et al. // Infect. Immun. -1987. V.55, N.6. - P.1436-1440.

127. Evaluation of human cytokine production and effects of pharmacological agents in a heterologous system in vivo / Griswold D.E., Hillegass L.M., O'Leary-Bartus J. et al. // J. Immunol. Meth. 1996. - V.195, N.l-2. - P.l-5.

128. Fisch H., Gifford G.E. In vitro production of rabbit macrophage tumor cell cy-totoxin // Int.J.Cancer. 1983. - V.32, N.l. - P. 105-112.

129. G-CSF-immunotherapy for treatment of acute disseminated murine melioidosis / Powell K., Ulett G., Hirst R., Norton R. // FEMS Microbiol. Lett. 2003. -V.224, N.2. -P.315-318.

130. Heckly R. Properties of Malleomyces pseudomallei anatoxins // Bacteriol. Proc. 1958.-N.72.-P.79.

131. Heckly R. Toxins of Pseudomonas // Microbiol. Toxins. New York London. - 1970. — V.3. - P.473-505.

132. Herzog C., Muller W. Interleukin-1 und tumor nekrose-faktor // Ztschr. Pheu-matol. 1987. - Bd.46, H.5. - P.213-219.

133. High-throughput mRNA profiling characterized the expression of inflammatory molecules in sepsis caused by Burkholderia pseudomallei / Wiersinga W.J., Dessing M.C., Kager P.A. et al. // Infect. Immun. 2007. - V.75, N.6. -P.3074-3079.

134. Hildebrand G., Nig J., Seys Y. Differentiation between pathogenic mechanisms of early and late phase of endotoxin shock // Amer. J. Physiol. — 1966. — V.210, N.6. -P.1451-1460.

135. Hobby G.L., Lenert T.F. Cross immunity between mycobacterial and pseudomonas pseudomallei infections in mice // Amer. Rev. Resp. Dis. 1971. -V.103, N.4. -P.569-571.

136. Human interleukin-7: molecular cloning and growth factor activity on human and murine B-lineage cells / Goodwin R.C., Lupton S., Schmierer A. et al. // Proc. nat. Acad. Sci. USA. 1989. - V.86, N. 1. - P.302-306.

137. Human natural killer cells: origin, clonality, specifity and receptors // Moretta L., Ciccione E., Mingare M. et al. // Adw. Immunol. 1994. - V.55. - P.341-380.

138. Identification of a distinct low-affinity receptor for human interleukin-4 on pre-B cells / Fanslow W., Spriggs M., Rauch C. et al. // Blood. 1993. - V.81. -P.2998-3005.

139. Immunogenicity and anti-Burkholderia pseudomallei activity in BALB/c mice immunized with plasmid DNA encoding flagellin / Chen Y.S., Hsiao Y.S., Lin H.H. et al. // Vaccine. 2006. - V.24, N.6. - P.750-758.

140. Induction of multiple chemokine and colony-stimulating factor genes in experimental Burkholderia pseudomallei infection / Barnes J.L., Ulett G.C., Kethee-san N. et al. // Cell Biol. 2001. - V.79. - P.490-501.

141. Inflammation patterns induced by different Burkholderia species in mice / Wie-ringa W.J., de Vos A.F., de Beer R. et al. // Cell Microbiol. 2008. - V.10, N.l. -P.81-87.

142. Isolation and characterization of a human interleukin cDNA clone, homologous to mouse B-cell stimulatory factor-1, that expresses B-cell and T-cell stimulating activities // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1986. - V.83, N.16. - P.58935898.

143. Isolation and characterization of the outer-membrane proteins of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei /Gotoh N., White N., Chawaqul W. et al. // J. Microbiol. 1994. - V.140. - P.797-805.

144. Jacobson E.L., Pilaro F., Smith K.A. Rational interleukin-2 therapy for HIV positive individuals; daily low doses enhance immune function without toxicity //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. - V.93, N.19. - P.10405-10410.

145. Knawli L.A., Hu P., Epstein A.L. Cytokine, chemokine and co-stimulatory fusion proteins for the immunotherapy of solid tumors // Handb. Exp. Pharmacol. 2008. - V.181. - P.291-328.

146. Koo G.C., Gan Y.H. The innate interferon gamma response of BALB/c and C57B1/6 mice in vitro Burkholderia pseudomallei infection // BMC Immunology. 2006. - N.7. - P. 19.

147. Koricl M.J. The role of immune responses in the pathogenesis of hepatitis С virus infection // J. vir. Hepat. 1997. - V.4, S.2. - P.31-41.

148. Korl S., Lian S.L. Use of interleukin-2 and macrophages to treat herpes simplex virus infection in neonatal mice // J. Infect. Dis. 1988. - V.156, N.6. -P.l 187-1192.

149. Kradelund L., Nybrol O. Culturability and expression of outer membrane proteins during carbon nitrogen of Pseudomonas fluorescens DF57 and Pseudomonas putida DF14 // App. Environ. Microbiol. 1994. - N.60. - P.2912-2943.

150. Kurtz R.S., Roll J.T., Czuprinski C.J. Recombinant human interleukin-la enhances anti-Listeria resistance in both genetically resistance and susceptible strains of mice // Immunol. Lett. 1988. - V. 18, N.l. - P.289-292.

151. Lee J.D. IL-4 inhibits the expression of TNF-a and -p, IL-lp and 6 and IFN-y // Immunol. Cell Biol. 1995. - V.73, N.l -P.57-58.

152. Mary S., Seffel L., Albert D. Handbook of human immunology. New York: CRC Press LLC, 1997. - P.233-266.

153. Melioidosis: insights into the pathogenicity of Burkholderia pseudomallei /

154. Wiersinga W.J., van der Poll Т., White N.J. et al. // Nat. Rev. Microbiol. -2006. N.4. - P.272-282.

155. Model of differential susceptibility to mucosal Burkholderia pseudomallei infection / Lio В., Koo G.C., Yap E.H. et al. // Infect. Immun. 2002. - V.70, N.2. - P.504-511.

156. Molecular cloning and expression of human tumor necrosis factor and comparison with mouse tumor necrosis factor / Marmenout A., Fransen L., Tavernier T. et al. // Europ. J. Biochem. 1985. - V. 152, N.l. - P.515-522.

157. Nelson M., Prior J.L. Evaluation of lipopolysaccharid and capsular polysaccharide as subunit vaccines against experimental melioidosis // J. Med. Microbiol.- 2004. V.53", N. 12. - P. 1177-1182.

158. Obligatory role of gamma interferon for host survival in a'murine model of infection with Burkholderia pseudomallei / Santanirand P., Harley V.S., Dance D.A.B. et al. // Infect. Immun. 1999. - V.67. - P.3593-3600.

159. Oppenheim J. Signals and receptors involved' in recruitment of inflammatory cells // J. Biol. Chem.—1995. V.270. -P.l 1703-11706.

160. Oppenheim J., Feldman M. Cytokine references. London. Academic. Press, 2000. - 2015p.

161. Paulus W. How are cytokines activated in heart failure // Eur. J. Heart Failure.- 1999. V.l. —P.309-312.

162. Plague-forming cells: methodology and theory / Jerne N.R., Henry G., Nordin A.A. et al. // Transpl.Rev. 1974. - V.l8. - P. 130-131.

163. Pobins H.I., Grosen E. Whole body hyperthermia induction of soluble tumor necrosis factor receptors: implication for rheumatoid diseases // J. Rheumatol.- 1999. V.26, N.12. -P.2513-2516.

164. Pulmonary melioidosis / Ip M., Osterberg L.G., Chau P.Y. et al. // Chest. -1995. -N.108. — P.1420-1424.

165. Randomized, double-blind, placebo-controlled trial of granulocyte colony-stimulating factor in patients with, septic shock / Stephens D.P., Thomas J.H., Higgins A. et al. // Crit. Care Med. 2008. - V.36, N.2. - P.448-454.

166. Recombinant human interleukin-la: purification and biological characterization // J. Immunol. 1986. - V.136, N.7. - P.2492-2497.

167. Relapse in melioidosis: incidence and risk factors / Chaowagul W., Suputtamongkol Y., Dance D.A.B. et al. // J. Infect. Dis. 1993. - N.168. - P. 11811185.

168. Role of T cells in innate and adaptive immunity against murine Burkholderiapseudomallei infection / Haque A., Easton A., Smith D. et al. // J. Infect. Dis. —2006. V. 193, N.3. - P.370-379.i

169. Romagnani S. The Thl/Th2 paradigms // Immunol. Today. 1997. - V.18.-P.263-266.

170. Ross G.D., Newmann S.L. Regulation of macrophage functions by complement, complement receptors and JgG-Fc receptors // The reticuloendothelial system.V.6. Immunology. New York, London: Plenum Press, 1984. - P.173-200.

171. Ruscetti F.W., Gallo R.C. Human T-lymphocyte growth factor: regulation of growth and function of T-lymphocytes // Blood. 1981. - V.57, N.3. - P.379-394.

172. Smith K.A. Rational interleukin-2 therapy // Cancer J. Sci. Am. 1997. - V.3. — S.l. — P.137-140.

173. Stephens D.P., Fisher D.A., Currie B.Y. An audit of the use of granylocyte colony-stimulating factor in septic shock // Intern. Med. J. 2002. - V.32, N.4.1. Р.143-148.

174. Street N., Mosmann Т. IL-4 and IL-5: The role of multifunctional cytokines and their peace in the network of cytokine interactions // Biotherapy. — 1990.-N 2. -P.347-362.

175. Tanphaichitra D., Stahel R., Shan R. Melioidosis: current therapy and cellular immunity//J. Inf. Dis. 1980. -N.2. -P.1016-1018.

176. The CXC chemokines gamma interferon (IFN-gamma) — inducible protein 10 and monokine induced by IFN-gamma are released during severe melioidosis / Lauw F.N., Simpson A.J., Prins J.M. et al. // Infect. Immun. 2000. - V.68. -P.2034-2042.

177. The synergistic anti-proliferative effect of y-interferon and human lymphotoxin / Lee S.H., Aggarwal В., Rinderknecht E. et al. // J. Immunol. 1987. - V.133, N.3. -P.1083-1086.

178. Thomson A. The cytokine handbook. San Diego: Acad. Press. — 1994: -P.750.

179. Tinelli R., Alonso J.M. Infection by Pseudomonas pseudomallei in mice: protective effect of an acellular extract // Med. Mai. Infect. 1978. - V.8, N.l 1. -P.522-525.

180. Tufano M.A., Cipollero I.N., de L'Ero G. Antimicrobial agents induce monocytes to release IL-la, IL-6 and TNF, and induce lymphocytes to release IL-4 and IFN-g // Immunopharmacol. Immunotoxicol. 1992. - V.14, N.4. - P.769-782.

181. Tumor necrosis factor in septicemic melioidosis / Suputtamongkol Y., Kwiatkowski D., Dance D.A.B. et al. // J. Infect. Dis. 1992. - V.165. -P.561-564.

182. Two types of murine helper t-cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activitie and secreted proteins // J. Immunol. 1986. - V.136. — P.2348-2357.

183. Ulett G.C., Ketheesan N., Hirst R.G. Cytokine gene expression in innately susceptible BALB/c mice and relatively resistant C57BL/6 mice during infectionwith virulent Burkholderia pseudomallei // Infect. Immun. 2000. - V.69. -P.2034-2042.

184. Ulett G.C., Ketheesan N., Hirst R.G. Proinflammatory cytokine mRNA responses in experimental Burkholderia pseudomallei infection in mice // Acta Trop. 2000. - V.74, N.2-3. - P.229-234.

185. Vidal W., Pancod J., Botter G. Activite immunosuppressive des toxines de Pseudomonas aeruginosa et Pseudomonas pseudomallei // Rev. Sci. Lab. -1992. V.239, N.20. - P.78-89.

186. Warawa J., Woods D.E. Melioidosis vaccines // Expert. Rev. Vaccines. — 2002. V. 1, N.4. - P.477-482.

187. Xiao B.G., Lu C.Z., Lin H. Cell bilody and clinical promise of G-CSF: immu-nomodulation and neuroprotection // J. Cell Mol. Med. 2007. - V.l 1, N.6. -P.1272-1290.

Информация о работе

Демьянова, Ольга Борисовна
кандидата медицинских наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Стимуляция иммуногенных и протективных свойств антигенов возбудителя мелиоидоза цитокинами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы