Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ белкового и антигеного состава штаммов PSEUDOMONAS PSEUDOMALLEI различной вирулентности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ белкового и антигеного состава штаммов PSEUDOMONAS PSEUDOMALLEI различной вирулентности"

, . — С', "

i J v 2 4 ФЕВ 1ЯЯ7

На правах рукописи

ВИКТОРОВ Дмитрий Викторович

АНАЛИЗ БЕЛКОВОГО И АНТИГЕННОГО СОСТАВА ШТАММОВ PSEUDOMONAS PSEUDOMALLEI РАЗЛИЧНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ. 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1997

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском проти

вочумном институте.

Научный руководитель: кадндат медицинских наук, старший

научный сотрудник H.H. Пивень

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, академик АЕН,

профессор Г.М. Шуб доктор биологических наук, старшин научный сотрудник A.A. Щербаков

Ведущая организация: Ростовский противочумный

научно-исследовательский институт

Защита состоится " $ " .-<ч4<>г^..-?. 1997 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 по защите диссертаций на соискание* ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071 г.Саратов, Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан * 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Корнеев Г.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Аэробные бактерии рода Pseudomonas в последнее время стали предметом пристального и систематического изучения, поскольку широко распространены в природе, являются важным звеном в трофических цепях биоценозов и играют значительную роль в инфекционной патологии человека (Ширяев Д.Т., 1976; Ковалев Г.К., 1979; Илюхин В.И., 1985; Беляков В.Д. и др., 1990).

Из имеющих клиническое значение псевдомонад к патогенным относят Pseudomonas pseudomallei и Pseudomonas mallei, таксономически близкородственные виды, вызывающие опасные заболевания человека и широкого круга животных - мелиоидоз и сап. Проблема мелиоидоза, по оценкам специалистов, сейчас значима не только для традиционно эндемичных регионов, но и для ряда областей, где заболевание ранее не регистрировалось (Dodin A., Ferry D., 1975; Dodin А., 1976; Paredes L., Avila R., 1976; Galimand M., Dodin A., 1982; Ashdown L., Kochler J., 1990).

Биомолекулярные основы вирулентности Pseudomonas pseudomallei - одно из наименее освещенных направлений в изучении данного микроорганизма. К настоящему времени имеются сведения о патогенетической роли отдельных клеточных и экстрацеллюлярных биополимеров возбудителя мелиоидоза (Hildebrand G. et al., 1963; Илюхин "В.И., 1985; Ashdown L., Kochler J., 1990; Пивень H.H., 1995; Плеханова Н.Г., 1995; Тихонов Н.Г. и др., 1995). Однако, данных их детального анализа современными методами электрофоретических и нммунохи-мических исследований в доступной литературе нами обнаружено не было.

Цель работы: Выявление и характеристика биополимеров Pseudomonas pseudomallei, связанных с вирулентностью данного микроорганизма.

Задачи исследования:

1. Провести электрофоретическнй и иммунохимичесхий анализ биополимеров штаммов возбудителя мелиоидоза различной вирулентности.

2. Выявить биополимеры, продукция которых коррелирует с уровнем вирулентности штаммов Р.рзеиёошаИе!, изучить их физико-химические и иммунохимические свойства.

3. Изучить протективные свойства отдельных биополимеров и оценить перспективу их использования в качестве компонентов химической вакцины.

Научная новизна.

Впервые с помощью электрофоретического и иммунохимического анализа выявлены биополимеры, уровень продукции которых коррелирует с уровнем вирулентности возбудителя мелиоидоза.

Установлено, что клетки вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза продуцируют высокомолекулярные гликопротеины, входящие в состав поверхностного антигенного комплекса.

В составе клеточных оболочек вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза определены пять мажорных белков, два из которых жестко связаны с пептидогликаном.

Показаны протективные свойства высокомолекулярных глико-протеинов и пептндогликан-связанных белков клеточной оболочки при иммунизации животных и последующей экспериментальной ме-лиондозной и сапной инфекции.

Практическая ценность. Материалы диссертации использованы при составлении следующих инструктивно-методических документов: 1. Методические рекомендации "Анализ электрофореграмм общеклеточных белков патогенных псевдомонад с применением компьютерных программ" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 14.06.94г.).

2. Методические рекомендации "Получение и использование ла-тексных иммуноглобулиновых диагностикумов для идентификации некоторых патогенных псевдомонад" (Утверждены директором Волг НИПЧИ 12.12.95г.).

Апробация работы. Материалы диссертации были обсуждены на Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций (Волгоград, 1992), институтских и межлабораторных конференциях ВолгНИПЧИ (IS91-1994), а также на юбилейной конференции ВолгНИПЧИ (Волгоград, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, отражающих основное ее содержание.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Результаты сравнительного электрофоретического и иммунохнми-ческого анализа белков Pseudomonas pseudomallei различной вирулентности.

2. Сведения о составе, физико-химических и иммунохнмических свойствах поверхностных биополимеров возбудителя мелиоидоза.

3. Новые данные о протектизном эффекте некоторых белков клеточной оболочки Pseudomonas pseudomallei при экспериментальном мелио-идозе и сапе.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 108 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных исследований, иллюстрированных 3 таблицами и 23 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя по 199 литературным источникам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе были использованы 17 штаммов Pseudomonas pseudo-mallei дикого типа различного географического происхождения, 6 му-тантных низковирулентных штаммов, полученных в ВолгНИПЧИ, а также коллекционные штаммы следующих видов: - Pseudomonas mallei, P. cepacia, P. aeruginosa, P. fluorescens, P. maltofilia, P. putida, P. stutzeri, Escherichia coli. Культуры возбудителя мелиоидоза и других микроорганизмов выращивали на питательном агаре ("Pifco", США) или в питательном бульоне ("Difco"), с добавлением глицерина до 4%.

Для получения препаратов общеклеточных белков клетки лизи-ровали в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) по Laemmli U.K. (1979). При использовании высушенной ацетоном бакмассы применяли предварительную ультразвуковую дезинтеграцию. Поверхностные биополимеры P. pseudomallei получали по методике, рекомендованной Н.Н.Пивнем (1995). Клеточные оболочки P.pseudomallei выделяли по модифицированным нами методам Hancock R.E.W., Nikaido Н. (1978), Frazier C.R., Royt P.W. (1986). Концентрацию белка определяли стандартными методами Lowry О. et at. (1951) и Bradford М.М. (1976).

Были использованы следующие варианты электрофореза белков: а) в полиакриламидном геле с ДСН (ПААГ-ДСН) по Laemmli U.K. (1979); б) диск-электрофорез по Davis B.J. (1959); в) изоэлектрнческое фокусирование (ИЭФ) по Ригетти (1986). Электрофоретнческий перенос биополимеров из ПААГ на нитроцеллюлозные (НЦ) мембраны проводили методами Towbin Н. et at. (1979), Tsang У. et at. (1983).

Гипериммунные козлиные и кроличьи сыворотки получали при иммунизации животных антигенами P.pseudomallei двумя циклами с интервалом 24 сут. Протективные свойства биополимеров P. pseudo-mallei при экспериментальном мелиоидозе и сапе изучали на белых мышах, белых крысах и золотистых хомячках. Контрольные и опытные группы состояли из 10 животных.

Иммуносорбцию сывороток проводили на иммобилизованных в ПААГ клетках низковирулентных мутантных штаммов P.pseudomallei. Выделение иммуноглобулинов (Иг) и приготовление иммунофермент-ных конъюгатов осуществляли согласно рекомендациям Кэтти Д. (1991). Включение 1J51 в Иг проводили по J1. А. Остерману (1983). Ди-агностикум латексный иммуноглобулиновый получали по методике С.К. Александер и др. (1990).

При постановке реакции иммунодиффузии в геле (РИД) и имму-ноэлектрофореза (ИФ) использовали методы, описанные X. Фримелем (1979).

Дот-ИФА и нммуноблоттинг на НЦ- мембранах проводили по методам, рекомендованным Финдлей Д. (1990), Towbin Н. et al. (1979), TsangV.etal. (1983).

Денситометрию электрофорефамм осуществляли при помощи сканирующей системы GS300/360 ("HSI", США). Статистический анализ денситограмм проводили методами, описанными Socal R., Sneath Р. (1963), Бейли Н. (1970), Богословским Н. и др. (1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

До настоящего времени детального ")лектрофоретического и им-мунохимического сравнительного анализа биополимеров Pseudomonas _pseudomallei с различной вирулентностью не проводилось. Одним из направлений нашей работы являлась стандартизация условий и приемов сопоставления белковых электрофореграмм и иммуноэлектрофо-реграмм различных штаммов возбудителя мелноидоза. При сопоставлении электрофоретических треков в ДСН - ПААГ нами применялась процедура выравнивания соответствующих денситограмм по идентичным пикам локального участка с пересчетом значений Rr всех точек участка, реализованная в виде программного модуля. Обработка оцифрованных денситограмм при помощи алгоритма фильтра сколь-

зящего среднего (Фрейзер П., 1990) позволяла выявлять и идентифицировать фракции на электрофореграммах с высоким уровнем фонового окрашивания, а также разграничивать фракции с близкими значениями Rf. Точное определение молекулярных масс белков проводилось по рассчитанным функциям зависимости Rf и Мг на различных участках денситограмм. Вычисление мер близости денситограмм с учетом Rr и площадей пиков и дальнейший кластерный анализ матрицы коэффициентов корреляции позволял разделять исследуемый набор белковых спектров на компактные ограниченные группы по критерию максимального сходства. С применением вышеописанных приемов компьютерной обработки денситограмм, было оценено влияния плотности геля, времени и параметров электрофореза на воспроизводимость эксперимента. На примере ДСН-ПААГ электрофореза клеточных белков P.pseudomallei 111 в гелях постоянной, линейной и экспоненциальной концентраций ПААГ выявлены оптимальные для сравнительного анализа и расчета Мг участки электрофореграмм. Наиболее оптимальным для серийных сопоставлений протеинограмм P. pseudomallei являлось применение 10-11 % ДСН-ПААГ. Электрофорез в гелях линейных и экспоненциального градиентов концентраций ПААГ позволял с высокой точностью идентифицировать и анализировать биополимеры P.pseudomallei близких значений Rr, однако степень воспроизводимости результатов оказалась ниже, чем при использовании гелей постоянной концентрации.

Для изучения антигенных спектров штаммов P.pseudomallei с различной вирулентностью были получены несколько тест-систем на основе Иг козлиных сывороток к P.pseudomallei 100 и 111, Иг сывороток, адсорбированных клетками низковирулентных штаммов (P.pseudomallei 100-16-1, 111-6-1), Иг кроличьей сыворотки к поверхностному полисахаридно-белковому антигенному комплексу P.pseudomallei 111, а также МКА к Аг8 (В.В. Свиридов. Н.П. Храпова. 1987). В качестве

метки применялась щелочная фосфатаза. Иммуноферментные тест-системы на основе Иг общих и адсорбированных сывороток к клеткам P.pseudomallei, по данным дот-ИФА, оказались наиболее приемлемы для изучения особенностей общего антигенного спектра и отдельных антигенных комплексов штаммов возбудителя мелиоидоза различной вирулентности. Данные тест-системы показали наибольшую специфичность при детекции типичных патогенных псевдомонад. Взаимодействия с клетками гетерологичных видов практически не наблюдалось. Результаты оценки чувствительности и специфичности различных Иг в дот-ИФА были использованы при разработке латекных иммуноглобулиновых диагностик-умов для экспресс-детекции патогенных псевдомонад.

Был проведено сопоставление спектров общеклеточных белков 17 штаммов P.pseudomallei дикого типа с различным уровнем вирулентности для лабораторных животных, 6 ннзковнрулентных мутантов, а также 5 высокозирулентных пассированных на животных культур возбудителя мелиоидоза. Полученные ДСН-ПААГ электрофореграммы содержали от 45 до 50 индивидуальных фракций с молекулярной массой в интервале 12 - 200 kD. По данным кластерного анализа (взвешенный парно-групповой метод, WPGMA), штаммы P.pseudomallei формировали группу по степени сходства протеинограмм на -уровне 90 %, с тремя подгруппами на уровне 95 % сходства, объединяющими, как правило, штаммы единого географического происхождения (рис. 1). Полученные данные согласовались с ранее опубликованными результатами использования белковых электрофореграмм при таксономической дифференциации различных видов Pseudomonas (Kersters К., 1980; Jackman Р., 1985; Волчкевич Ж.А., 1990; Будченко A.A., 1995).

Были определены две области протеинограмм P.pseudomallei с

* Í S • У $ У 1* 11 ir и 1? к ^- -г— -J В

11 1* 21 II п г* ti }( п i* 90 -h- J—' 85 °/о

Рис. 1 Дендрограммы сходства протеинограмм штаммов P.pseudo-mallei различной вирулентности и гетерологичных видов. А - белки Mr 12 - 200 kD; В - белки Мг 70 - 200 kD. Цифрами обозначены штаммы: 1 - P.pseudomallei 59361; 2 - 56830; 3 - 56830*; 4 - 56770; 5 - 56770*; 6 -С-141; 7 - С-141*; 8 - 60631; 9 - 60631*; 10 - ВКМ900; 11 - ССЕВ860; 12-57576; 13- 100; 14-100-6-1; 15-100-16-1; 16- 139; 17-98; 18-97; 19- 111; 20- 111-6-1; 21 - 111-7-1; 22 - 114; 23 - 114-7-1; 24 - 114-15-1; 25 - 128; 26 - 129; 27 - 130; 28 - 130*; 29 - P.mallei 10230; 30 - Ц-5; 31 -P.cepacia 25416; 32 - P.aeruginosa PAQ-1; 33 - E.coli C-600; * - пассированный на животных.

наибольшим уровнем вариабельности по числу и концентрациям белков - участок диапазона Мг от 18 до 45 kD и высокомолекулярная область от 70 до 200 kD. Анализ степени сходства высокомолекулярной зоны протеинограмм показал максимальные значения мер близости для низковирулентных мутантов и отличный от проведенного на осно-

ве общего набора белков характер групшгрования изучаемых штаммов в целом (рис. 1). Низковирулентные мутанты возбудителя мелиоидоза характеризовались уменьшением числа и концентраций высокомолекулярных белков (Мг 100-200 кР), а также снижением концентраций отдельных белков в областях Мг 59 - 95 кБ и 20 - 45 кЭ (рис. 2). У пас-

«ч kD ~ 170

95

«И Ми «V «■ М Мм ttw t'-ä W •«- V»

- . — '' ГС £2

ft» m* fem к». w ^ »■»

Wi —: w« ^ ^ .

— • •»«• >• - —► •

fc» Ot v. к N i», -

¿:з Г j t* П — «н -w-

В

с»

•»>f W «км '—- sQ r»s »M i-J

^ *■! SS----34

fei»« — 4M

' "Mi. «л» I

wm гч

^ ».» «г*

•25

5П —£

»»

12 3 4 5 « 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 1» 20 2122 23 24 25 2« 27 28

Рис. 2 Электрофореграммы общеклеточных белкоз штаммов P.pseu-

domallei различной вирулентности з 10 % ДСН-ПААГ. ~ . Цифрами обозначены штаммы: 1 - P.pseudomailei 59361; 2 - 56830; 3 - 56830*; 4 - 56770*; 5 - 56770; 6 -С-141; 7 - С-141*; 8 - 60631*; 9 - 60631; 10 - ВКМ900; 11 - CCEBS60; 12 - 57576; 13 - 100; 14 - 100-6-1; 15 -100-16-1; 16 -139; 17 - 98; 18 - 97; 19-111; 20- 111-6-1; 21 -111-7-1; 22- 114; 23 - 114-7-1; 24 - 114-15-1; 25 - 128; 26 - 129; 27 - 130; 28 - 130*; * - пассированный на животных.

сированных на животных штаммов наблюдалась выраженная гиперпродукция биополимероз Мг 170, 59, 52 кБ (рис. 2). количественная оценка изменения уровня экспрессии отдельных биополимеров у

штаммов с различной вирулентностью проводилась путем рассчета и сопоставления площадей соответствующих пиков денситограмм. По нашим данным, у низковирулентных мутантов Р.р5еис1ота11е1 наблюдалось снижение продукции биополимеров Мг 170, 120, 95, 83, 79, 73, 59, 52, 34 кЭ в 15 - 100 раз, по сравнению с исходными штаммами. При возрастании вирулентности в результате пассажа культуры на экспериментальных животных наблюдалось 5 - 50 кратное возрастание концентрации фракций электрофореграмм с Мг 120 - 170 кЭ и 59, 52, 34 кО.

Изучение антигенного состава штаммов возбудителя мелиоидоза методом иммуноблоттинга показало, что все вирулентные штаммы Р.р5еис1ота11е} продуцируют антигены Мг 120 - 170 кЭ (рис. 3). Данный набор высокомолекулярных антигенов был отмечен также у вирулентных штаммов возбудителя сапа, за исключением биополимера 170 кО. У низковирулентных мутантов обоих видов уровень экспрессии этих антигенов, а также антигенов Мг 30 - 35 кБ был значительно снижен (рис. 3). Число и количественная выраженность антигенов Мг 120 - 170 и 30 - 35 кО оказались значимыми признаками, по данным статистического анализа, при дифференциации штаммов Р.рзеи<1ота11е1 различной вирулентности (рис. 4).

Полученные данные, по нашему мнению, позволяют говорить о связи вирулентных свойств Р.р$еис1отаИе5 и продукции белков вышеназванных Мг с антигенными свойствами в клетках возбудителя.

Мечение интактных клеток последующий электрофорез клеточных лизатов в ДСН-ПААГ и радиавтография гелей позволили установить, что отличия спектров поверхностных белков у штаммов различной вирулентности имели тот же характер, что и при сопоставлении общеклеточных белков (рис. 5). Данный факт свидетельствовал о

\kD VI 70

4120

• 59

<*sa --3j

>1 ■ n

~~ 22

12 34 56789 10 II

Рис. 3 Иммуноблоттинг общеклеточных белков различных видов Pseudomonas с Иг, очищенными иммуносорбцией на м.к. P.pseudomallei 111-6-1. Цифрами обозначены штаммы: P.pseudomallei: 1 - 100; 2 - 100-16-1; 3 - 111; 4 - 111-6-!; 5 - С-141; 6 - С-141*; P.mallei: 7 -10230; 8 - 10230-163; 9 - Ц-5; Р.сетаск: 10 - 25416; P.aeruginosa: 11 - РАО-1. * - пасс!ф0занный на животных.

*

Ю 1»

Рис. 4 Дендрсграмма мер сходства антигенных спектров различных видов Pseudomonas при использовании адсорбированных Иг к P.pseudomallei 111. Цифрами обозначены штаммы: P.pseudomallei: 1 -100; 2 - 100-16-1; 3 -111; 4 -111-6-1; 5 - С-141; 6 -С-141*; P.mallei: 7-10230; 8- 10230-163;9-Ц-5; P.cepacia: 1025416; P.acrugmosa: 11 - РАО-1; * - пассированный на животных.

Im

-1-

тв м м **

локализации биополимеров, связанных с вирулентностью, в поверхностных структурах клетки Р.р5еи<1ота11ек

ИФ очищенных ГХ водно-солевых экстрактов вирулентного Р.р5еис1ота11е1 111 и авирулентного мутанта 111-6-1 с использованием иммунной сыворотки к вирулентному штамму показал, что общими были катодподвижные антигены, тогда как дуга преципитата в электронейтральной зоне иммунофореграммы отмечена только у Р.рзеиёо-ша11е1 111. Данный биополимер имел, по данным ГХ, молекулярную массу 750 - 800 кБ и характеризовался весовым соотношением углевода к белку 8:1. Неденатурирующий диск-электрофорез высокомолекулярного антигена в 7% ПААГ показал в его составе фракцию с Мг порядка 400 кО преимущественно углеводной природы. Иг сыворотки к Р.рзеис1ота11е1 111 в иммуноблоттинге взаимодействовали с данной фракцией, а также с более высокомолекулярным комплексом, не мигрирующим в разделяющем геле. ИЭФ в 1,5 % агарозном геле в интервале рН 3-10 показало, что изоэлектрнческая точка выявленного биополимера находилась в области 7,0-7,2. Структурные составляющие высокомолекулярного биополимера более детально были охарактеризованы при предварительном мечении препарата дансилхлоридом и последующем ДСН-ПААГ электрофорезе, а также при дифференциальном окрашивании гелей серебром. Установлено, что под воздействием ДСН происходит диссоциация высокомолекулярного комплекса на ряд гликопротеинов Мг 120 - 200 кЭ и белки Мг 20 - 60 кО, в более низкой по сравнению с глнкопротеинами концентрации (рис. 6).

При сопоставлении ДСН-ПААГ электрофореграмм препаратов клеточных оболочек были определены 5 мажорных белков Мг 22, 30, 34, 52, 59 кО, характерных для всех вирулентных штаммов Р.р5еис1ота11ек Полученные нами результаты в определенной мере согласуются с данными о белковом составе клеточной оболочки штам-. мов Р.рзеиёотаПа, выделенных в различных географических регионах

*

¡,¿3 ' *">«• — »■• »-•■• «■ в»« .

• . ■ «»-п. 170

ЪЪ |Г? 823 т»----59

«к» си* СИ г?" «я»

1- ш* К Г"3 Г51 ^ ел

! I*. ййЗ ьз ^ Г \

а . а о- а оо

«м» Юм дач» <*«» —-_ 22

! } I. * о»»

; *: [ -4 ..........•••

— — .га«.

1 234567 89 10 И

Рис. 5 Электрофореграммы поверхностных белков Р.рБе^отаИе^мече-нных |251, з 10 % ДСН-ПААГ. Цифрами обозначены штаммы: 1 - 100; 2- 100-16-1; 3- 111; 4- 111-6-1; 5- С-141; 6- С-141*; 756830; 8 - 56830*; 9 - 130; 10 - 130*; 11 - 139*; ** - пассированный на животных.

О

О ->

■<¡4

с

'"1

->

1 ' - ^ : Л '<

А

.45 34

В

Рис. 6 Изучение биополимерного состава высокомолекулярного поверхностного антигена Р.р5е1^ота11е1 111 в ДСН-ПААГ электрофорезе при мечении ДНХ (А) и окрашивании серебром (В). Обозначения: - белки; <=> - гликопротеины; *> - полисахариды.

(Калачев И. и др., 1993; во^Ь N. е1 а!., 1994). Пассированный высоковирулентный вариант штамма С-141 характеризовался наибольшей концентрацией указанных белков. В составе клеточных оболочек низковирулентных Р.р5еи(1ота11е! 100-16-1 и 111-6-1 белок 30 кЭ отсутствовал, а белки 22 и 34 кБ отмечены в более низкой концентрации по сравнению с вирулентными штаммами (рис. 7). Из выявленных структурных белков клеточной оболочки, два (Мг 30 и 34 кО) оказались связанными прочной ковалентной связью с пептидогликаном. Разрыв данной связи был возможен только при температурах от 80° до 100°С в присутствие 2-меркаптоэтанола и ДСН.

ко

59 52

«Г -— Щ? I*

«каш» 22

Рис. 7 Белковый состав клеточных оболочек Р.р$еис1ота11е1 различной вирулентности в 10 % ДСН-ПААГ. Цифрами обозначены штаммы: 1 -100; 2 -100-16-1;3-111;4- 111-6-1; 5-С-141; 6 - С-141*; * - пассированный на животных.

Сравнительная оценка протективного эффекта выявленных поверхностных биополимеров была проведена на модели экспериментальной мелиоидозной и сапной инфекции белых мышей, золотистых хомячков и белых крыс. Были использованы высокомолекулярные гликопротеины, очищенные ГХ и ИОХ, а также электрофоретически очищенные белки клеточной оболочки Мг 30 и 34 kD P.pseudomallei III. Иммунизация животных очищенным ГХ материалом клеточной оболочки, содержащим два мажорных белка Мг 30 и 34 kD и их высокомолекулярный комплекс с пептидогликаном, обеспечивали частичную защиту (на уровне 30%) при 100% табели контрольной группы животных. Сходные результаты удалось получить при использовании в иммунизации белка Мг 34 kD. В этом случае наблюдалась 30% и 40% выживаемость животных, зараженных P.pseudomallei 100 и P.mallei Ц5 соответсвенно. Препарат, полученный ИОХ и содержащий в качестве основных компонентов гликопротеин 120 kD и белки 30 и 34 kD, показал наиболее выраженный протективный эффект - 40% и 66,7% выживания иммунизированных групп белых мышей и белых крыс при заражении P.pseudomallei 100.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что изменение вирулентности Pseudomonas pseudomallei сопровождается прямо зависимым изменением уровня продукции поверхностных антигенов гликопротеиновой и белковой природы в клетках возбудителя. Полученные данные существенно дополняют представления о биомолекулярных основах вирулентности P.pseudomallei и могут послужить основой для дальнейшего изучения структурных особенностей н поиска генетических детерминант отдельных факторов патоген-ности возбудителя мелиоидоза.

ВЫВОДЫ.

1. Разработка и применение методов компьютерной информационной обработки денситограмм, вычисления их мер сходства, расчета элек-трофоретической подвижности и молекулярных масс позволили стандартизовать систему сравнительного анализа электрофореграмм биополимеров различных штаммов Р.рзеискзтаНек

2. Электрофоретический и иммунохимический анализ общеклеточных белков штаммов Р.р$еис1ота11е1 различной вирулентности выявил существенные межштаммовые отличия по числу и концентрациям биополимеров с молекулярными массами 100 - 200 кй и 20 - 45 кО. Продукция антигенов 120 - 170 и 30 - 35 кО в клетках возбудителя мелиоидоза коррелирует с уровнем вирулентности штаммов, снижаясь у низковирулентных и увеличиваясь у высоковирулентных, в том числе у пассированных на животных культур.

3. Антигены 120 - 170 кЭ, характерные для вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза, по своей химической природе являются глнко-протеинами и входят в состав поверхностного высокомолекулярного гетерополимерного комплекса с массой 800 кВ.

4. В состав клеточных оболочек вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза входят 5 мажорных белков с молекулярными массами 22, 30, 34, 52, 59 кЭ. Белки 30 и 34 кЭ образуют мультимерный комплекс с пептидогликаном оболочки, диссоциирующий при температуре свыше 80"С в присутствие додецилсульфата натрия и меркапто-этанола. Низковирулентные штаммы Р. рвеидотаМ отличаются сниженной продукцией белков оболочки 30 и 34 кЭ.

5. Гликопротеин 120 кБ и белки клеточной оболочки 30 и 34 кО обладают заметным протективным эффектом, проявляющемся в выживании 30 % - 60 % иммунизированных животных при экспериментальном мелноидозе и сапе.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. .

1. Будченко A.A., Викторов Д.В. Белковый спектр патогенных псевдомонад, выращенных на различных питательных средах. //Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. - Материалы Российской конференции. - Волгоград, 1992. - С.74.

2. Будченко A.A., Викторов Д.В. Компьютерный анализ изоэлектро-фореграмм клеточных белков (антигенов) микроорганизмов рода Pseudomonas. //Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. - Материалы Российской конференции. - Волгоград, 1992. -С.75.

3. Будченко A.A., Викторов Д.В. Система анализа белковых спектров псевдомонад. //Информ. бюлл. Проблемной комиссии по эпидемиологии и микробиологии ООИ. - Саратов, 1993. - С.24-25.

4. Будченко A.A., Викторов Д.В. Влияние состава лизирующего раствора на электрофоретическое разделение общеклеточных белков псевдомонад. //Материалы межгосударственной научно-практической конференции. - Ставрополь, 1994. - С. 167.

5. Викторов, A.A. Будченко. Сравнительное изучение протеинограмм патогенных псевдомонад с использованием компьютерного анализа. //Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. - Материалы Российской конференции. - Волгоград, 1992. - С.31.

6. Викторов, A.A. Будченко. Анализ электрофореграмм • общеклеточных белков патогенных псевдомонад с применением компьютерных программ. //Информ. бюлл. Проблемной комиссии по эш'ще-миологии и микробиологии ООИ. - Саратов, 1995. - С. 23.

7. Викторов Д.В., Пивень H.H., Смирнова В.И. Анализ состава термостабильного антигена 8 Pseudomonas pseudomallei методом имму-ноблоттинга. //Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. - Материалы Российской конференции, - Волгоград, 1992. - С. 82.

8. Гетерогенность структуры антигена 8 возбудителя мелиоидоза. /В.И. Смирнова, Д.В. Викторов, H.H. Пивень и др. //Материалы Российской научной конференции. - Саратов, 1993. - С. 122.

9. Сравнительное изучение белковых спектров возбудителен мелиоидоза и сапа с использованием компьютерного анализа. /Д.В. Викторов, A.A. Будченко, H.H. Пизень и др. //Информ. бюлл. Проблемной ко-

миссии по эпидемиологии и микробиологии ООИ. - Саратов, 1995. -С. 66-67.

Ю.Электрофоретический анализ экстрацеллюлярных антигенов патогенных псевдомонад. /А.А. Будченко, А.Е. Замарин, Д.В. Викторов и др. //Материалы Российской научной конференции. - Саратов, 1993. -С.269.