Фенотипическая и генотипическая характеристика мутантов патогенных видов рода Burkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам

Молчанова, Елена Владимировна

Автореферат диссертации по теме "Фенотипическая и генотипическая характеристика мутантов патогенных видов рода Burkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам"

МОЛЧАНОВА Елена Владимировна

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

МУТАНТОВ ПАТОГЕННЫХ ВИДОВ РОДА виККНОЮЕША С ИЗМЕНЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К АНТИБИОТИКАМ

03.02.03 - микробиология 03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

! А ДПР 2011

Волгоград-2011

4843860

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор доктор биологических наук, доцент

Меринова Людмила Константиновна Викторов Дмитрий Викторович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна доктор медицинских наук Микшис Наталья Ивановна

Ведущая организация - ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Защита состоится «20» апреля 2011 г. в «10.00» часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный инстшут «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека» (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб».

Автореферат разослан «/&> 2011

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Слудский А. А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Возбудители мелиоидоза (Burkholderia pseudomallei) и сапа {Burkholderia mallei) являются известными патогенными видами рода Burkholderia. Их роль в инфекционной заболеваемости человека и некоторых животных рассматривается, главным образом, в связи с существованием эндемичных районов, появлением завозных случаев инфекций, а также потенциальной опасностью преднамеренного использования этих микроорганизмов в качестве агентов биотерроризма [Dance А., 2000; Соепуе Т., Li-Puma J.J., 2003; Inglis T.J., Rolim D.B., Sousa A.Q., 2006].

В последнее время отмечено повышение интереса к другим, имеющим медицинское значение, филогенетически родственным В. pseudomallei и В. mallei микроорганизмам комплекса Burkholderia cepacia - оппортунистическим патогенам, поражающим больных муковисцидозом и грануломатозом и нередко становящимся причиной развития тяжелого cepacia-cиндрома у лиц со сниженным иммунитетом [Holmes A., Govan J., Goldstein R., 1998; Ple-sa M., Kholti A., Vermis K., et al., 2004].

Как возбудители мелиоидоза и сапа, так и В. cepacia, с некоторыми отличиями, характеризуются высокой природной резистентностью к ингибиторам, в том числе к антибактериальным препаратам, используемым для лечения. Особенности организации геномов обеспечивают патогенным Burkholderia spp. значительные возможности для адаптации в различных неблагоприятных условиях, позволяя им с достаточной легкостью повышать резистентность в процессе лечения и формировать штаммы с множественной лекарственной устойчивостью [Ciss M.F., Dian Y.D., Sow A.I. et al, 1998; Kenny D.J. Russel P., Rogers D. etal, 1999].

Показано, что множественная лекарственная резистентность бактерий обусловлена функционированием различных молекулярных механизмов, таких как модификация мишеней, снижение общей проницаемости клеточной оболочки за счет изменения экспрессии поровых белков наружной мембраны, активный транспорт из клетки антимикробных соединений и т.д. [Li X.Z., Nikaido Н., 2004].

Изучение механизмов формирования резистентности является важным направлением в исследованиях биологии представителей рода Burkholderia. Оно представляет перспективу для решения целого ряда научно-практических задач, направленных на оценку значения измененной чувствительности штаммов в развитии инфекционного процесса, установление связи резистентности с вирулентными и персистентными свойствами микроорганизма, поиск оптимальных путей преодоления устойчивости к антибактериальным средствам, разработку новых способов лечения и профилактики инфекционных заболеваний и т.д. Одновременно определение молекулярных маркеров, ассоциированных с теми или иными типами резистентности, может занять важное место в эпидемиологическом мониторинге этих патогенов.

Необходимой моделью для оценки особенностей природной резистентности микроорганизмов и изучения молекулярно-генетических механизмов, лежащих в ее основе, являются экспериментально полученные штаммы, устойчивые к антибиотикам различных групп. Селекция таких штаммов и их последующее изучение составляли основу настоящей работы.

Цель работы заключалась в изучении основных закономерностей формирования резистентности множественного типа у В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia.

Задачи исследования:

1. Дать сравнительную характеристику природной чувствительности к антибактериальным препаратам патогенных буркхольдерий и исследовать особенности формирования у них антибиотикорезистентности; получить коллекцию мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia с маркерами резистентности/чувствительности к антибиотикам групп фтор-хинолонов и цефалоспоринов.

2. Оценить участие в формировании резистентности механизмов, связанных с проницаемостью наружных мембран (изменение уровня анти-биотикоустойчивости в присутствии блокатора мембранных каналов и продукции некоторых внеклеточных ферментов).

3. Провести сравнительный анализ продукции компонентов системы мембранного транспорта у мутантов буркхольдерий с различными фенотипами резистентности к антибиотикам.

4. Определить вирулентность мутантов с измененной чувствительностью к антибиотикам для экспериментальных животных и разработать метод ее оценки на модели простейших.

5. Охарактеризовать генетический полиморфизм резистентных мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia с использованием метода RAPD, анализа фрагментов ДНК, гомологичных генам интеграз и изучить изменчивость пориновых генов с помощью ПЦР.

Научная новизна. Впервые проведено сравнительное исследование особенностей формирования резистентности к антибиотикам классов фтор-хинолонов и цефалоспоринов у патогенных филогенетически родственных видов Burkholderia (В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia). Установлено, что направленно селекционированные мутанты (SMR) этих микроорганизмов с маркерами резистентности к пефлоксацину, офлоксацину и цефтазидиму, приобретают фенотип множественной устойчивости к препаратам других классов высокого уровня.

Оформлен патент на изобретение «Инсерционный мутант Burkholderia pseudomallei КМЗ1 - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности

у патогенных буркхольдерий» (заявка №2009141036 от 5 ноября 2009 г., положительное решение о выдаче патента от 13 октября 2010 г.).

На основании изучения устойчивости к антибиотикам в присутствии блокатора мембранных каналов - верапамила и секреции внеклеточных ферментов дана предварительная оценка возможных механизмов формирования множественной резистентности, связанных с процессами проницаемости клеточных мембран.

У мутантов всех трех видов Burkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам проведен сравнительный анализ продукции компонентов системы мембранного транспорта и секреции и обнаружены различия в профилях белков наружных мембран, варьирующие при изменении резистентности к ингибиторам.

Для определения вирулентности мутантных штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia в качестве альтернативной модели впервые предложен вид простейших Paramecium caudatum и осуществлено моделирование локального инфекционного процесса (феномен Штрауса), вызываемого В. cepacia, на золотистых хомячках. Установлено, что развитие исследуемых типов резистентности или повышенной чувствительности приводит к снижению вирулентности мутантов для данных моделей.

Впервые изучен генетический полиморфизм мутантов патогенных видов Burkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам с использованием метода RAPD и проведен анализ изменчивости пориновых генов методом ПЦР. Показано, что штаммы В. pseudomallei, резистентные к пеф-локсацину, офлоксацину, цефтазидиму (SMR), образовывали две группы сходства, отдельные от групп, объединяющих транспозонные мутанты (ТТМ) этого вида, чувствительные к антибиотикам.

На основании результатов анализа аллельного полиморфизма пориновых генов орсР1/отр39, показавшего модификацию их структуры у SMR-штаммов В. mallei и В. cepacia, высказано предположение о возможной роли полифункциональных поринов ОрсР1/Отр39 в формировании у патогенных буркхольдерий множественной резистентности. Роль порина OpcPl В. cepacia в развитии резистентности подтверждена комплементацией дефекта по продукции белка при трансформации по признаку устойчивости с выявлением специфического ПЦР-продукта, соответствующего последовательности орсР1/отр39 генов.

Практическая ценность. Получена коллекция мутантов В.pseudomallei, В. mallei, В. cepacia, включающая штаммы как с фенотипом множественной резистентности, так и штаммы с множественной чувствительностью к антибиотикам, предназначенных для изучения молекулярно-генетических механизмов резистентности и вирулентности буркхольдерий. Мутанты В. cepacia 25416 SMR2 (CfzRPfxR) и В. cepacia 25416 NSP депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского

НИПЧИ «Микроб», ГКПБ с присвоенными номерами В. cepacia КМ 197 и В.cepacia КМ 196 соответственно.

Модель простейших (P. caudatum), предложенная для ускоренного определения вирулентности, и мутантные штаммы используются в работе профильных лабораторий ВолгоградНИПЧИ при изучении вирулентности и способности к персистированию патогенных буркхольдерий.

Материалы диссертационной работы вошли в раздел методических указаний МУК 4.2.2495-09 «Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам», утвержденных Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 1 апреля 2009 г. (с введением в действие 1 июня 2009 г.).

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Полученные методом направленной селекции мутантные SMR-штаммы В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia, резистентные к фторхинолонам (пефлоксацину, офлоксацину) и цефалоспоринам (цефтазидиму), характеризуются стабильным наследованием приобретенных признаков с развитием перекрестной устойчивости к антибиотикам других классов.

2. Мутанты патогенных буркхольдерий с множественной устойчивостью к антибиотикам отличаются измененной проницаемостью клеточных мембран, что фенотипически проявляется в снижении продукции внеклеточных ферментов и изменении резистентности к антибактериальным препаратам при воздействии на клетки верапамила, блокирующего мембранные каналы.

3. У резистентных мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia наблюдается варьирование состава мажорных протеинов наружных мембран с возрастанием экспрессии ряда белков, при этом у мутантов В. cepacia с повышенной чувствительностью происходит снижение продукции протеинов (Мг 21, 27, 71, 110 kDa) и отсутствие экспрессии порина Mt 36 kDa(OpcPl).

4. Развитие у буркхольдерий измененной чувствительности к антибиотикам, приводит к снижению вирулентности мутантных штаммов для лабораторных животных (белых мышей, золотистых хомячков) и простейших вида P. caudatum.

5. В развитии резистентности множественного типа у патогенных буркхольдерий принимает участие порин наружной мембраны ОрсР1/Ошр39, что подтверждается наличием модификаций в структуре пориновых генов орсР11отр39 резистентных штаммов. При трансформации мутантов В. cepacia с повышенной чувствительностью к антибиотикам, дефектных по гену opcPl, наблюдается компенсация признака сниженной резистентности, восстановление геномной последовательности, соответствующей орсР1/отр39 и продукция белка Мг 36 kDa.

Апробация работы. Основные материалы диссертации были представлены на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); V Международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2008); а также на ежегодных итоговых научных конференциях ВолгоградНИПЧИ (2002-2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 2 - в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций, 1 - в зарубежной печати.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 127 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, иллюстрированных 14 таблицами и 33 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 232 литературных источника (38 отечественных и 194 иностранных авторов).

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе были использованы штаммы В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia дикого типа различного происхождения, хранящиеся в коллекционном центре культур ВолгоградНИПЧИ. Культуры микроорганизмов инкубировали при 32 °С, 37 °С в течение 24 - 72 ч на плотных и в жидких питательных средах, приготовленных на основе кислотного гидролизата казеина и дрожжевого экстракта, а также на питательных средах фирмы "Difco", (США) - L, Nutrient, Muller Hinton.

Минимальные подавляющие концентрации (МПК) антибактериальных препаратов определяли методом кратных разведений на плотных питательных средах [МУК 4.2.1890 - 04,2004].

Для получения мутантных штаммов буркхольдерий, обладающих повышенной устойчивостью к антибиотикам пефлоксацину, цефтазидиму, оф-локсацину, канамицину и хлорамфениколу, дикие штаммы микроорганизмов пассировали на плотных питательных средах с добавлением антибиотиков в повышающихся концентрациях. Для получения чувствительных мутантов В.cepacia использовали химический мутагенез, воздействуя И-метил-К'-нитро-1Ч-нитрозогуанидшюм (НГ) [Меринова JI.K., Пивень H.H., Замараев B.C., 1990]; для получения чувствительных штаммов В. pseudomallei - транс-позонный мутагенез [Меринова Л.К., Тимофеева Е.В., Сеимова И.К., 1997].

Ферментативную активность определяли на плотных питательных средах, содержащих необходимые субстраты: раствор "Skim milk", лецитин, "Twin 80" ("Difco", США).

При выделении клеточных мембран использовали методические приемы Hankock, Nikhaido [Hancock R, Nikaido H, 1978]. Для приготовления рабочих растворов применяли реактивы категории "аналитический" ("Serva", Германия и "LKB", Швеция). Определение концентрации белка проводили по методу Bredford [Bredford М.М., 1976] на фотоколориметре (КФК - 2МП, Россия) и спектрофотометре (СФ-46, Россия).

Анализ препаратов белков проводили с помощью оборудования для вертикального электрофореза ("HSI", США). Для приготовления гелей применяли стандартный набор реактивов "ультрачистый" и "аналитический", ак-риламид, метиленбисакриламид, ТЕМЕД, персульфат аммония (PSA), доде-цилсульфат натрия (SDS), ("Serva", Германия).

Для электрофореза использовали SDS-полиакриламидные гели (10 -11 % полиакриламид; 0,1 % SDS), приготовленные по методу Laemmli [Laemmli U.K., 1970]. Электрофорез проводили при стабилизированном токе 5-8 тА в течение 18 ч или 30 тА в течение 4,5 - 5,0 ч. Для контроля скорости фракционирования в образцы вносили 0,004 % бромфенолового синего ("Serva", Германия). В качестве эталонов молекулярных масс использовали наборы маркерных белков 10-78 KÜa, ("LKB", Швеция) и 25 - 92,5 KDa,

("Serva", Германия). Для окрашивания белковых фракций использовали спиртово-водные или водные растворы кумасси бриллиантового синего (СВВ), G-250 или R-250, ("Serva", Германия), согласно стандартным методикам [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., 1984].

Выделение хромосомной ДНК производили по методу Маниатис [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., 1984]. Амплификацию исследуемых последовательностей проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) по программе: начальный прогрев 95 °С 5 мин, 35 реакционных циклов (94 °С 30 с, 57 °С 30 с, 72 °С 60 с), финальная элонгация 72 °С 10 мин. Электрофоретический анализ ПЦР-ампликонов проводили в 1,5 - 2% агарозных гелях, окрашивая ДНК этидиум бромидом.

Для анализа конформационного полиморфизма одноцепочечных фрагментов ДНК (SSCP, single strand conformation polymorphism) продукты ПЦР объемом 5 мкл смешивали с равным объемом денатурирующего раствора (95% формамид, 0,05 % бромфеноловый синий, 0,05 % ксиленцианол), инкубировали 2 мин при 94 °С на водяной бане, охлаждали на льду и подвергали электрофорезу в 10 % полиакриламидном геле с 10 % глицерина, термоста-тируемом при 10 °С. Гели окрашивали нитратом серебра [Bassam B.J., Caeta-no-Annoles G., Gresshoff P.M., 1991] и анализировали характер миграции одноцепочечных и двухцепочечных фрагментов ДНК в образцах (SSCP-профиль).

Для амплификации полиморфных регионов геномной ДНК буркхоль-дерий использовали рекомендованный Leelayuwat 10-членный праймер 5'-GTTTCGCTCC-3' [Leelayuwat С., Romphruk A., Lulitanond A. et al., 2000]. Амплификацию участков хромосом, гомологичных последовательностям генов интеграз/транспозаз, проводили с праймерами 5'-CCTCCCGCACGATGATC-3' и 5'-TCCACGCATCGTCAGGC-3\ специфичными фрагменту гена intll, консервативному у различных грамотрицатель-ных бактерий [Martinez-Freijo Р., Fluit A., Schmitz F. et al., 1998; Bennett P.M., 1999]. Электрофорез ДНК проводили в 6 % полиакриламидном геле, которые визуализировали окраской серебром [Bassam В .J., Caetano-Annoles G., Gres-shoffP.M., 1991].

Программное обеспечение RFLPscan 3,12 (CSP Inc., USA) и Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA) использовали для обработки ДНК - профилей и кластерного анализа. Группирование матрицы дистанций несоответствия (dd), где dd (х,у) = (число x¡ □ y¡)/i, проводили с использованием невзвешенного парно-группового метода, UPGMA [Sneath Р.Н., Sokal R.R., 1973].

Для проведения трансформации компетентность реципиентных чувствительных культур В. cepacia индуцировали, применяя систему СаСЬ и метод замораживания-оттаивания при -40 °С и в жидком азоте [Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д., 1984].

Вирулентность штаммов буркхольдерий определяли на лабораторных животных - золотистых хомячках и беспородных белых мышах, которых заражали внутрибрюшинно 24-часовыми культурами В. pseudomallei,

B.mallei в дозах 1*103 - 1><104 м.к. и учитывали динамику гибели в группах. Острую форму инфекции, вызываемую В. cepacia, моделировали с использованием иммунодепрессантов при заражении дозой 5><108 м.к.

Фитопатогенность штаммов В. cepacia определяли по методу, описанному Wigley и Burton [Wigley P., Burton N.E., 1999].

Для определения вирулентности на модели простейших P. caudatum культуры исследуемых штаммов в концентрации 1><107м.к./мл соединяли в соотношении объемов 1:10с культурой инфузорий и переносили на предметное стекло с лункой для микроскопирования, изолировали покровным стеклом, фиксированным вазелиновым маслом. Время гибели 100% простейших определяли при световой микроскопии препаратов, начиная от контакта с культурами бактерий до полного прекращения подвижности инфузорий [MP №ЦОС ПВ Р 005-95; Прошина О.Б., Замарина О.В., Жукова С.И. с соавт., 2005].

Результаты исследовании

1. Получение штаммов патогенных буркхольдерий с измененной чувствительностью к антибиотикам

Была создана коллекция, полученных методом направленной селекции, мутантных штаммов буркхольдерий филогенетически родственных видов SMR-типа, которая включала мутанты В, pseudomallei, В. mallei и В. cepacia, резистентные к пефлоксацину и цефтазидиму, а также штаммы В. cepacia, устойчивые к канамицину и хлорамфениколу. Мутантные штаммы отличались последовательностью селектированных маркеров, способом получения и уровнем приобретенной резистентности и показывали ее повышение в несколько раз в сравнении с исходными культурами дикого типа.

Помимо устойчивых мутантов, мы получили с помощью транспозон-ного или химического мутагенеза штаммы, утратившие исходную резистентность к одному или к ряду антибиотиков. В частности, был селекционирован штамм В. pseudomallei 57576 SMRT21, обладающий чувствительностью к цефтазидиму, и мутанты В. cepacia 25416/8235 NSP/NSK, характеризующиеся чувствительностью множественного типа.

2. Фенотипическая характеристика мутантов с измененной чувстви-

тельностью к антибиотикам

Определение перекрестной резистентности у SMR-мутантов, устойчи-

вых к пефлоксацину, офлоксацину и цефтазидиму, показало, что она сфор-

мировалась к препаратам различных классов, что характеризовало ее как

множественную (рис. 1,2).

Chi

Arrp

Str

■ W.t ЭМ!*! 5МЯ2

Рисунок 1. Перекрестная резистентность мутантов штамма В. /кеиЛотаПе! 57576

Обозначения: \V.t- - дикий тип; БМЮ -штаммы, резистентные к пефлокса-цину, цефтазидиму; -штаммы, резистентные к цефтазидиму, пефлок-садину; Атр - ампициллин; СЫ - хлорамфеникол; - стрептомицин.

Chi Amp Tet

м25416 W.t 8235 W.t 25416 SMR1 8235 SMR1

Рисунок 2. Показатели множественной лекарственной резистентности штаммов В. cepacia

Обозначения: W.t. - дикий тип; SMR1 - штаммы, резистентные к пефлокса-цину, цефтазидиму; Amp - ампициллин; Chi - хлорамфеникол; Tet - тетрациклин.

Было установлено, что в зависимости от последовательности маркеров, наблюдается некоторое варьирование характера перекрестной устойчивости. Так, мутантные штаммы буркхольдерий с фенотипом SMR1 (Pfxtzf8) чаще приобретали дополнительную резистентность к хлорамфениколу и ампициллину, с фенотипом SMR2 (Czf^Pfx1*) - к ампициллину и стрептомицину.

При этом, штаммы В. cepacia, отобранные на хлорамфениколе, характеризовались устойчивостью не только к этому препарату, но и к пефлокса-цину. Фенотип резистентности к цефтазидиму, напротив, выявлялся у штаммов с маркером KanR. Можно предположить, что существует тенденция взаимосвязи развития указанных типов перекрестной устойчивости друг от друга в направлении: Chi - Pfx и Kan - Cfz, когда повышение резистентности к одному препарату ведет к возрастанию МПК другого (рис.3). Подобная тенденция в развитии устойчивости множественного типа у В. cepacia была

11

описана в работах Rajyaguru, Muszynski [Rajyaguru J.M., Muszynski M.J., 1998].

Одновременно нужно отметить, что для штаммов В. cepacia с маркерами ChlR или KanR общий уровень перекрестной устойчивости был ниже, чем у мутантов, устойчивых к пефлоксацину или цефтазидиму. В свою очередь, среди последних, штаммы, полученные на средах с постепенно возрастающими концентрациями антибиотиков отличались также более низким общим уровнем множественной резистентности по сравнению со штаммами, выделенными другим способом.

Рисунок 3. Зависимость уровня резистентности штаммов В. cepacia от первоначального фенотипа антибиотикоустойчивости

Обозначения: W.t. - дикий тип; SMRA11 - штамм, резистентный к хлорам-фениколу; SMRA12 - штамм, резистентный к канамицину; Pfx - пефлокса-цин; Cfz - цефтазидим.

Для предварительной оценки возможных механизмов, посредством которых формируется устойчивость у Burkholderia spp., мы использовали один из известных приемов преодоления множественной резистентности, обусловленной multidrug efflux pumps, который заключается в блокировании мембранных каналов клеток бактерий, в частности В. pseudomallei [Moore R.A., Woods D.E., 1998].

В наших исследованиях для блокирования мембранных каналов был использован верапамил, с помощью которого выявлялось изменение динамики чувствительности к антибиотикам у мутантов В, pseudomallei, В. mallei и В. cepacia в зависимости от селектированных фенотипов на основании сравнения выживаемости культур на средах с возрастающими концентрациями гентамицина и некоторых других антибиотиков без и в присутствии данного блокатора.

Прежде всего, было установлено, что верапамил практически не изменяет уровень резистентности к гентамицину и хлорамфениколу дикого штамма В. cepacia АТСС 25416,

В отличие от этого, у дикого штамма В. pseudomallei 56770 в присутствии верапамила наблюдалось отчетливое снижение устойчивости, проявляющееся в уменьшении числа жизнеспособных клеток на 20 - 40%.

Полирезистентные мутанты показали различное отношение к блокирующему действию верапамила. Так, на среде с верапамилом штаммы В. cepacia и В. pseudomallei, устойчивые к пефлоксацину и цефтазидиму, снижали резистентность к гентамицину и хлорамфениколу, тогда как штаммы устойчивые к цефтазидиму и пефлоксацину отчетливо повышали ее (рис.4).

а Ь с d

Рисунок 4. Влияние верапамила на чувствительность к антибиотикам резистентных мутантов В. pseudomallei SMR-типа

Обозначения, ось ординат - количество колониеобразующих единиц (%); а -В. pseudomallei 56770 SMR1 (PfxRCfzR); b - В. pseudomallei 57576 SMR1 (PfxRCfzR); с - В. pseudomallei 56770 SMR2 (CfzRPfxR); d - B. pseudomallei 57576 SMR2 (CfzRPfxR)

Таким образом, установленные различия находятся у обоих видов буркхольдерий в связи с последовательностью селектированных маркеров: если первым был маркер устойчивости к пефлоксацину, а вторым к цефтазидиму, то в присутствии верапамила резистентность культур увеличивалась, если же первым являлся маркер цефтазидимрезистентности, а вторым пеф-локсацинустойчивости, то такие мутанты демонстрировали снижение выживаемости,

Резистентные SMR мутанты В. mallei Ц-5, как и чувствительные В. cepacia 25416 NSP/NSK, показали лишь снижение резистентности в присутствии верапамила независимо от приобретенного фенотипа.

Поскольку формирование антибиотикорезистентности связано с комплексным изменением процессов клеточного транспорта и характера секреции, то у мутантных штаммов буркхольдерий можно было ожидать изменения в продукции некоторых внеклеточных ферментов. Определение протео-литической, липазной и лецитиназной активностей установило, что резистентные мутанты В. pseudomallei и В. cepacia отличались от штаммов дикого типа. В наибольшей степени у них отмечалось варьирование продукции экзопротеаз. При этом штаммы В. cepacia 25416 NSP с фенотипом множественной чувствительности к ряду антибиотиков показали отсутствие всех трех исследованных типов ферментативной активности. Полученные результаты мы интерпретировали как наличие модификации у мутантов как в проницаемости, так и в мембранном транспорте по сравнению с исходными культура-

13

ми, что, в свою очередь, позволяло предположить изменение в экспрессии белков наружных мембран.

Участие поринов и белков с транспортной функцией в развитии резистентности к антибиотикам было показано рядом исследователей [Nikaido H., 1989; Godfrey A.J, Wong S., Dance D.A. et al, 1991; Paulsen I.T, Brown M.H., Skurray R.A, 1996; Mine T, Monta Y, Kataoka A, 1999; Moore A, DeShazer D, Reckseidler S. et al, 1999; Vorachit M, Chongtrakool P, Arkomsean S. et al, 2000; Pages J.M., Masi M„ Barbe J, 2005].

Проведенное нами сравнение профилей белков наружных мембран полирезистентных штаммов всех трех видов (Я pseudomallei, В. mallei, В. cepacia) выявило определенные различия в их экспрессии. Так, мутанты В. pseudomallei и В. mallei SMR-типа характеризовались в основном некоторым повышением продукции отдельных мембранных белков с Мг21, 27, 39 и 71 kDa. При этом у резистентных штаммов В. mallei было отмечено уменьшение продукции протеина цитоплазматической мембраны Mr 110 kDa, в то время как у мутантов В. pseudomallei, наоборот, некоторое повышение экс-пресии данного белка (рис. 5).

1 2 f T kDa

— I <-110

27 4— 21

Рисунок 5. SDS-PAGE белков клеточных мембран полирезистентных штаммов В. mallei.

Обозначения штаммов: 1 - В. mallei Ц-5 W.t, 2 - В. mallei Ц-5 SMR1 *(PfxRCfzR), 3 - В. mallei Ц-5 SMRll*(PfxRCfzR), 4 - В. mallei Ц-5 SMR2*(CfzRPfxR).

Что касается В. cepacia, то спектр белков наружной мембраны мутантов, резистентных к канамицину и хлорамфениколу, в наименьшей степени отличался от такового дикого штамма. Более значительное снижение экспрессии отдельных мембранных белков (Мг 21, 27, 36 kDa) у штаммов В. cepacia 25416 SMR2 (CfzRPfxR), В. cepacia 25416 SMR3 (CfzR) или наоборот, повышение экспрессии целого ряда отдельных мембранных протеинов (Мг 21, 36, 71, 150, 200 kDa) у мутантных штаммов В. cepacia SMR111 - 116

(PfxR - PfxRCfzR) можно расценивать как преобладание различных механизмов формирования устойчивости: снижение проницаемости клеточной оболочки или экспрессия multi-drug efflux pumps. У чувствительных мутантов выявлялись дефекты в продукции отдельных мажорных белков с Мг 27 и 71 Ша - у В. pseudomallei и Мг 36 kDa - у В. cepacia.

В связи с формированием антибиотикорезистентности штаммы В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia изменяли, наряду с указанными признаками, также и вирулентность, определение которой проводили на различных лабораторных моделях (экспериментальных животных - золотистых хомячках и белых мышах - а также простейших P. caudatum).

В результате было установлено, что резистентные мутанты всех трех видов снизили вирулентность по сравнению с исходными штаммами. Однако высокоустойчивые штаммы В. pseudomallei и В. mallei со сниженной вирулентностью остаются опасными, так как обладают способностью к длительному внутриклеточному выживанию на фоне антибиотикотерапии и перси-стенции на протяжении многих лет, что при снижении иммунитета приводят к развитию острой формы инфекции. Что касается В. cepacia, то острую форму инфекции моделировали с применением иммунодепрессантов, что вызывало гибель белых мышей, в среднем, в течение 3-5 суток при заражении культурами диких штаммов в высоких дозах (5Х108), тогда как животные, инфицированные культурами резистентных мутантов, оставались живыми в срок наблюдения 21 день (табл. 1).

Таблица 1.

Вирулентность штаммов В. cepacia для белых мышей при заражении в комбинации с иммунодепрессантом

Штамм Иммунодепрессант Средняя продолжительность жизни, сут

В. cepacia АТСС 25416 гидрокортизон 4±1

В. cepacia 323 циклофосфамид 3±1

В. cepacia 423 гидрокортизон 3±1

В. cepacia 25416 SMR1 гидрокортизон 21

циклофосфамид 21

В. cepacia 25416 SMR116* гидрокортизон 21

Примечания: SMR1, SMR116* - штаммы, резистентные к пефлоксацину, цефтазидиму.

Хроническая форма инфекции, вызываемая В. cepacia была наглядно продемонстрирована у золотистых хомячков в виде феномена Штрауса, описанного при мелиоидозе и сапе. Клинические изоляты В. cepacia показывали более высокий уровень вирулентности в сравнении с ризосферными штаммами.

Для оценки патогенности полученных мутантных штаммов всех трех видов мы использовали в качестве альтернативной модели P. caudatum - ин-

фузорию-туфельку (табл.2). Одновременно с результатами, полученными на лабораторных животных, модель простейших показала, что приобретение резистентности (или чувствительности) ведет к снижению вирулентных свойств. При этом, показатели вирулентности штаммов имели прямую корреляцию с таковыми, полученными на моделях золотистых хомячков и белых мышей.

Таблица 2.

Взаимодействие патогенных видов ВигкИоЫепа с инфузориями

Штаммы Фенотип Время жизни инфузорий, мин

Е. сой Oil дикий тип 45

В. cepacia АТСС 25416 дикий тип 6

В. cepacia 25416 SMR116* Р&кС£гк 18

В. cepacia 25416 SMR2 СГгкРГхк >60

В. cepacia 25416 NSP РГх'Те^Кап'СЬГтаг5 45

В. pseudomallei 56770 дикий тип 3

В. pseudomallei 56770 SMR1 9

В. pseudomallei 56770 SMR2 ССЛТх1* 30

В. pseudomallei 56770 SMR4 ОГхкС£гк 6

В. mallei Ц-5 дикии тип 45

В. mallei Ц-5 SMR1* РйЛТг* 60

В. mallei Ц-5 SMR2* СГгкРГхк >90

Следует также отметить, что с помощью лабораторных животных нам не удалось выявить штаммовые различия в уровне вирулентности резистентных культур В. cepacia, тогда как модель простейших это четко выявляла. Интересен и тот факт, что мутант В. cepacia 25416 SMR112*, полученный отбором в процессе смены селективного фактора (пефлоксацина на цефтази-дим) характеризовался более высоким уровнем вирулентности для парамеций, по сравнению с исходным штаммом В. cepacia 25416 SMRU1*, устойчивым к пефлоксацину.

3. Генетический анализ множественной резистентности

Генетическую гетерогенность штаммов буркхольдерий с различными фенотипами устойчивости к антибиотикам для предварительной оценки общности или различия механизмов реализации того или иного спектра резистентности исследовали с использованием методов типирования, основанных на амплификации полиморфных и специфических последовательностей хромосомной ДНК буркхольдерий (RAPD), а также анализа конформационного полиморфизма денатурированных одноцепочечных участков ампликонов последовательности поринового гена орсР1/отр39 (SSCP).

Сравнение RAPD-профилей штаммов В. pseudomallei, резистентных к фторхинолонам и цефтазидиму и транспозонных ТТМ-мутантов В. pseudo-

mallei со сниженной устойчивостью к этим антибиотикам обнаружило распределение их в обособленные друг от друга группы сходства. В целом же развитие данных селектированных фенотипов патогенных видов буркхоль-дерий по-видимому сопровождалось сходными геномными перестройками у мутантов внутри каждой из групп. Последнее подтверждалось и при исследовании фингерпринтов фрагментов ДНК, содержащих последовательности интеграз, показавшем фактическую идентичность этих профилей у двух из трех изученных SMR-штаммов В. pseudomallei.

Довольно четкое возрастание экспрессии мажорного порина наружных мембран Мг 39 kDa (Omp39) у полирезистентных мутантов В. pseudomallei и его аналога Мг 36 kDa (OpcPl) у полирезистентных штаммов В. cepacia, а также наличие дефекта, как в его экспрессии, так и в детерминирующей его геномной последовательности у чувствительных мутантов В. cepacia, позволили предположить возможную роль данного белка как компонента транспортной системы в формировании устойчивости к рассматриваемым группам антимикробных соединений.

Мы исследовали наличие возможных мутационных изменений в последовательности генов орсР1/отр39 буркхольдерий при формировании различных фенотипов антибиотикорезистентности (рис. 6).

Рисунок 6. ПЦР-SSCP последовательности гена орсР1/отр39 у исходных штаммов и полирезистентных мутантов В. cepacia и В. mallei. Электрофорез в 10 % полиакриламидном геле при 10°С.

Обозначения: 1 - В. cepacia 25416 SMR1; 2 - В. cepacia 25416 SMR2; 3 -В. cepacia 8235 SMR1; 4 - В. cepacia 8235 SMR2; 5 - В. cepacia 25416 SMRA11; 6-В. cepacia 25416 SMRA12; 7-5. cepacia 25416 SMRA13; 8 -В. cepacia 8235 SMRA11; 9 - В. cepacia 8235 SMRA12; 10 - В. cepacia 8235 SMRA13; 11-5. mallei Ц-5; 12 - В. mallei Ц-5 SMR1*; 13 - В. mallei Ц-5 SMR11 *; 14 - В. mallei Ц-5 SMR2*.

Проведенный ПЦР-SSCP анализ последовательности поринового гена орсР1/отр39 показал отчетливые мутационные изменения у двух резистентных производных В. mallei Ц-5 SMR11* (PfxRCfzR) и В. mallei Ц-5 SMR2* (CfzRPfxR), треки 13, 14, что выражалось в изменении у них электрофорети-ческой подвижности как двуцепочечных, так и одноцепочечных фрагментов ДНК относительно соответствующих фрагментов штамма дикого типа. Одновременно у большинства резистентных мутантов В. cepacia наблюдается вариабельность SSCP-профиля в виде изменения числа и электрофоретиче-

17

ской подвижности продуктов частичной реассоциации одноцепочечных фрагментов ДНК. Последнее также может быть следствием мутаций гена типа единичных нуклеотидных замен, не приводящих к изменениям пространственной структуры анализируемого фрагмента. Точное определение типа и характера мутаций поринового гена орсР1/отр39 при формировании устойчивости к антибиотикам требует определения нуклеотидных последовательностей ампликонов с атипичными SSCP-профилями.

Таким образом, проведенное исследование показало модификацию структуры пориновых генов орсР1/отр39 у штаммов В. cepacia и В. mallei с повышенной устойчивостью к антибиотикам, что может быть свидетельством определенной функциональной значимости этих мажорных поринов в реализации резистентности.

Для оценки влияния порина ОрсР1/Отр39 на устойчивость к антибиотикам мы провели комплементацию дефекта последовательности орсР1/отр39 с помощью трансформации у мутантов В. cepacia 25416 NSP и NSK с фенотипом множественной чувствительности, утративших способность к синтезу порина OpcPl.

Трансформация мутантов В. cepacia 25416 NSP/NSK, чувствительных к антибиотикам, как гомологичной ДНК, так и гетерологичной последовательностью гена отр39 В. pseudomallei комплементировала признак сниженной резистентности к антибиотикам. При этом у трансформантов выявлялась исследуемая геномная последовательность орсР1/отр39 и восстанавливалась продукция белка-порина OpcPl (рис. 7, 8).

kDa

Рисунок 7. SDS-PAGE белков наружной мембраны трансформантов В. cepacia 25416 NSPT.

Обозначения: 1 - В. cepacia АТСС 25416, 2 -5. cepacia 25416 NSP, 3 - В. сера-cia 25416 NSPT-1,4-5. cepacia 25416 NSPT-2, 5-5. cepacia 25416 NSPT-3.

Рисунок 8. ПЦР-анализ пориновых генов отр39 и opcPl с праймерами bpsomp39s - bpsomp39as. Электрофорез в 1.5 % агарозном геле. Обозначения: 1 - В. pseudomallei 140; 2 - В. cepacia АТСС 25416; 3-5. cepacia 25416 NSK; 4 - В. cepacia 25416 NSK XI.

Таким образом, отличительные черты полирезистентных мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia, выявленные при изучении их фенотипов и генотипов, позволили установить основные закономерности и оценить некоторые принципиально возможные механизмы, посредством которых формировалась устойчивость. Представленные данные могут найти развитие в дальнейших исследованиях молекулярно-генетических основ резистентности у этих видов микроорганизмов, а также оказаться полезными в разработке перспективных средств лечения инфекций, вызываемых патогенными бурк-хольдериями.

ВЫВОДЫ:

1. Получена коллекция мутантных штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia с измененной чувствительностью к антибиотикам, состоящая из SMR-мутантов с селектированными признаками устойчивости к пефлокса-цину, офлоксацину, цефтазидиму и штаммов чувствительных к антибиотикам этих классов. Штаммы В. cepacia 25416 SMR2 (Cfe Pfx ) и В. cepacia 25416 NSP с множественной чувствительностью к антибиотикам депонированы в ГКПБ с присвоенными номерами КМ 197 и КМ 196 соответственно.

2. Установлено, что у всех трех видов буркхольдерий резистентность SMR-типа носит множественный характер, формируется с участием процессов снижения проницаемости клеточных мембран и сопровождается варьированием белковых профилей. Резистентные SMR-мутанты отличаются, главным образом, повышением экспрессии мажорных протеинов с Мг 27, 39, 71, 110 kDa, тогда как штаммы В. cepacia NSP-типа с множественной чувствительностью имеют сниженную продукцию этих белков и отсутствие экспрессии порина OpcPl.

3. Показано, что развитие у В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia измененной чувствительности к антибиотикам приводит к снижению вирулентности мутантных штаммов для лабораторных животных. Данные по предвари-

тельной оценке вирулентности, полученные с использованием альтернативной модели простейших (P. caudatum), коррелируют с показателями вирулентности резистентных штаммов В. pseudomallei для белых мышей и В. mallei для золотистых хомячков.

4. Установлено, что для RAPD-профилей и фингерпринтов фрагментов ДНК, содержащих интегразу патогенных видов Burkholderia, характерна межвидовая вариабельность, тогда как у производных отдельного вида RAPD-профили более консервативны. При этом резистентные SMR-мутанты В. pseudomallei и чувствительные транспозонные мутанты оказались распределенными в обособленные друг от друга группы сходства, что свидетельствует об однотипном характере перестроек их геномов, связанных с формированием соответствующих фенотипов.

5. В формировании множественной резистентности буркхольдерий показано участие порина ОрсР1/Отр39. Чувствительные мутанты NSP-типа В. cepacia, утратившие белок OpcPl, были дефектны по кодирующей последовательности этого порина. При трансформации чувствительных мутантов по признаку резистентности гомологичной ДНК и гетерологичной последовательностью отр39 В. pseudomallei наблюдали восстановление фенотипа резистентности, продукции белка OpcPl и выявляли детерминирующую его геномную последовательность.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Калинкина Е.В., Викторов Д.В., Меринова JI.K. Характеристика штаммов Burkholderia cepacia, резистентных к цефалоспоринам и фторхино-лонам // Санитарная охрана территорий государаств - участников Содружества Независимых Государств: проблемы безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях. Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. - Волгоград. - 2005. - С. 147 - 148.

2. Калинкина Е.В., Сеимова И.К., Меринова O.A., Викторов Д.В., Меринова Л.К. Мутанты Burkholderia cepacia с множественной резистентностью к антибиотикам // Бюллетень Волгоградского научного центра РАМН. -2006. - №3. - С.25 - 27.

3. Калинкина Е.В., Сеимова И.К., Меринова O.A., Викторов Д.В., Меринова Л.К. Мутанты Burkholderia cepacia резистентные к антибиотикам // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины. Сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых. - Санкт-Петербург. - 2006. - C.277 - 278.

4. Калинкина Е.В., Сеимова И.К., Меринова O.A., Агеева Н.П., Викторов Д.В., Лобойко А.Д., Меринова Л.К. Применение модели простейших для определения вирулентности штаммов патогенных Burkholderia с множественной резистентностью к антибиотикам // ММСП и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-

участников Содружества Независимых Государств. Материалы VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. - Саратов. - 2007. - С.212 - 214.

5. Сенина Т.В, Лобойко А.Д, Калинкина Е.В. Алгоритм идентификации Burkholderia cepacia. Вестник Российской военно-медицинской академии- 2008. - № 2 (22). - С.201 - 202. (Журнал из перечня ВАК)

6. Калинкина Е.В., Меринова О.А., Агеева Н.П., Лобойко А.Д, Викторов Д-В, Меринова Л.К. Фенотипическая характеристика штаммов патогенных Burkholderia, резистентных к цефалоспоринам и фторхинолонам. Пробл. особо опасных инф. - 2008. - №1. - С. 32 - 34. (Журнал из перечня ВАК)

7. Калинкина Е.В, Меринова О.А, Захарова И.Б, Викторов Д.В, Меринова Л.К. Трансформация чувствительных к антибиотикам мутантов Burkholderia cepacia по признаку резистентности // Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств. Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. - Волгоград. - 2008. - С.85 - 86.

8. D.V. Viktorov, I. В. Zakharova, M.V. Podshivalova, E.V. Kalinkina, О.А. Merinova, N.P. Ageeva, V.A. Antonov, L.K. Merinova, V.V. Alekseev Highlevel resistance to fluoroquinolones and cephalosporins in Burkholderia pseudo-mallei and closely related species // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. - 2008. - Vol. 102:51.-P. 544-551.

9. Молчанова Е.В, Захарова И.Б, Меринова О.А., Агеева Н.П, Викторов Д.В. Полиморфизм генов мажорного порина орсР1/отр39 у мутантов патогенных буркхольдерий с повышенной резистентностью к антибиотикам // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ. Материалы X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. - Ставрополь. - 2010. - С. 212 - 213.

10. Трушкина М.Н, Шубникова Е.В, Молчанова Е.В, Викторов Д.В. Изучение факторов, влияющих на объективную оценку чувствительности патогенных буркхольдерий к химиопрепаратам // Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения государств-участников СНГ. Материалы X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. - Ставрополь. - 2010. - С. 234 -235.

11. Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, ме-лиоидоз) к антибактериальным препаратам: Методические указания / Они-щенко Г.Г, Илюхин В.И, Андропова Н.В, Сенина Т.В, Калинкина Е.В. и др. - М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. -2010.-59 с.

Подписано к печати 14.03.2011. Формат 60x84 1/16. Гарнитура Times, Печать офсетная. Объем 1,4 усл.п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 15172. Отпечатано ООО «Арт линия», г. Волгоград, ул. Скосырева, 5.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Молчанова, Елена Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Таксономия и генетическая организация патогенных видов 13 Burkholderia

1.2. Патогенные свойства В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia

1.3. Резистентность патогенных видов Burkholderia к антибиоти- 26 кам; механизмы формирования антибиотикорезистентности

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы и питательные среды

2.2. Антибактериальные препараты. Методы оценки чувстви- 37 тельности

2.3. Метод направленной селекции

2.4. Химический мутагенез

2.5. Транспозонный мутагенез

2.6. Определение ферментативной активности культур

2.7. Методы анализа белков

2.8. Методы генетического анализа

2.9. Определение вирулентности 45 2.10. Статистическая обработка результатов

Глава 3. ПОЛУЧЕНИЕ ШТАММОВ ПАТОГЕННЫХ

БУРКХОЛЬДЕРИЙ С ИЗМЕНЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К АНТИБИОТИКАМ

3.1. Направленная селекция мутантов В. pseudomallei, В. mallei, 47 В. cepacia, резистентных к антибиотикам

3.2. Выделение антибиотикочувствительных мутантов буркхоль- 53 дерий с использованием транспозонного и химического мутагенеза

Глава 4.

Глава 5.

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

МУТАНТОВ С ИЗМЕНЕННОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ К АНТИБИОТИКАМ

Перекрестная резистентность к антибиотикам штаммов

В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia

Влияние на уровень антибиотикорезистентности штаммов 61 буркхольдерий верапамила - блокатора мембранных каналов Продукция внеклеточных ферментов штаммами Burkholde- 66 ria spp. с измененной чувствительностью к антибиотикам Анализ экспрессии мембранных белков мутантов

В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia

Вирулентность резистентных штаммов патогенных бурк- 74 хольдерий

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ

ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТОВ B.PSEUDOMALLEI, В. MALLEI И В. CEPACIA

Анализ генетической гетерогенности популяций исходных и полирезистентных штаммов Burkholderia spp. с использованием метода RAPD

Аллельный полиморфизм генов мажорного порина орсР1/отр39 у штаммов буркхольдерий с различной чувствительностью к антибиотикам

Комплементация последовательности орсР1/отр39 у мутан- 93 тов В. cepacia при трансформационной передаче

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фенотипическая и генотипическая характеристика мутантов патогенных видов рода Burkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам"

Патогенные буркхольдерии - представители довольно многочисленного рода Burkholderia, способные вызывать инфекционные заболевания у человека, животных и растений.

Известными патогенными видами буркхольдерий являются возбудители мелиоидоза {Burkholderia pseudomallei) и сапа {Burkholderia mallei), особо опасных, тяжело протекающих инфекций (Беляков с соавт., 1990; Puthu-cheary, Vadivelu, 2002).

Несмотря на высокую степень генетического родства и сложившееся на основании данных молекулярно-генетического исследования представление о В. pseudomallei и В. mallei, как клонах одного вида (Ramisse et al, 2003; Godoy et al, 2003), эти микроорганизмы отличаются по целому ряду биологических свойств и остаются самостоятельными возбудителями двух отдельных инфекций с различной географией распространения в мире, эпидемиологией и, в конечном итоге, имеющих различное медицинское значение. Настоящую роль В. pseudomallei и В. mallei в инфекционной заболеваемости человека и некоторых животных рассматривают, главным образом, в связи с существованием эндемичных районов, появлением завозных случаев инфекций, а также потенциальной опасностью преднамеренного использования этих микроорганизмов в качестве агентов биотерроризма (Strauss et al., 1969; Currie, 1996; Inglis etal., 2000; Dance, 2000; Inglis et al, 2006).

В последнее время отмечено повышение интереса к другим микроорганизмам, филогенетически родственным В. pseudomallei и В. mallei, имеющим медицинское значение. Burkholderia cepacia - типовой вид рода, сво-бодноживущий сапрофит, известен как оппортунистический патоген, вызывающий нозокомиальные инфекции и тяжелые патологические процессы в легких у больных с иммунодефицитными состояниями (муковисцидозом, грануломатозом). Нередко у таких больных, инфицированных В. cepacia, возникает так называемый cepacia-синдром, который характеризуется нек-ротизирующей пневмонией с лихорадкой, бактериемией и быстро приводит к летальному исходу (Govan, Deretic, 1996; Holmes et al., 1998; Mahenthiralingam et al., 2000; Plesa et al., 2004).

Как возбудители мелиоидоза и сапа, так и В. cepacia, с некоторыми отличиями, характеризуются высокой природной резистентностью к ингибиторам, в том числе к антибактериальным препаратам, используемым для лечения вызываемых ими инфекций. Особенности организации геномов всех трех видов обеспечивают патогенным Burkholderia spp. значительные возможности для адаптации в различных неблагоприятных условиях, в том числе в процессе лечения, позволяя с достаточной легкостью повышать резистентность и формировать штаммы с множественной лекарственной устойчивостью. Последнее делает проблематичной, а зачастую безуспешной терапию вызываемых ими инфекций и обусловливает их неблагоприятный прогноз (Батманов, 1994; Dance et al, 1989; Ciss et al, 1998; Kenny et al, 1999; Bonacorsi et al., 1999; Heine et al., 2001).

Показано, что множественная лекарственная резистентность бактерий определяется функционированием различных молекулярных механизмов, таких как модификация мишеней, снижение общей проницаемости клеточной оболочки за счет изменения экспрессии поровых белков наружной мембраны, активный транспорт из клетки антимикробных соединений (Страчун-ский, Козлов, 2002).

Изучение резистентности является важным направлением в исследовании биологии представителей рода Burkholderia. Оно перспективно для решения целого ряда научно-практических задач, касающихся оценки значения измененной чувствительности штаммов в развитии инфекционного процесса, установление связи резистентности с вирулентными и персистентными свойствами микроорганизма, поиск оптимальных путей преодоления устойчивости к антибактериальным средствам, разработку новых способов лечения и профилактики инфекционных заболеваний. Одновременно определение молекулярных маркеров, ассоциированных с теми или иными типами резистентности, может занять важное место в эпидемиологическом мониторинге этих патогенов.

Необходимой моделью для изучения особенностей природной резистентности микроорганизмов и молекулярно-генетических механизмов, лежащих в ее основе, являются экспериментально полученные штаммы, отличающиеся устойчивостью к антибиотикам различных групп. Селекция мутантов с измененным фенотипом резистентности и их последующая характеристика составляли основу настоящей работы.

Цель работы заключалась в изучении основных закономерностей формирования резистентности множественного типа у В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Дать сравнительную характеристику природной чувствительности к антибактериальным препаратам патогенных буркхольдерий и исследовать особенности формирования у них антибиотикорезистентности; получить коллекцию мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia с маркерами резистентности/чувствительности к антибиотикам групп фторхинолонов и цефалоспоринов.

2. Оценить участие в формировании резистентности механизмов, связанных с проницаемостью наружных мембран (изменение уровня анти-биотикоустойчивости в присутствии блокатора мембранных каналов и продукции некоторых внеклеточных ферментов).

3. Провести сравнительный анализ продукции компонентов системы мембранного транспорта у мутантов буркхольдерий с различными фенотипами резистентности к антибиотикам.

4. Определить вирулентность мутантов с измененной чувствительностью к антибиотикам для экспериментальных животных и разработать метод ее оценки на модели простейших.

5. Охарактеризовать генетический полиморфизм резистентных мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia с использованием метода RAPD, анализа фрагментов ДНК, гомологичных генам интеграз и изучить изменчивость пориновых генов с помощью ПЦР.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые проведено сравнительное исследование особенностей формирования резистентности к антибиотикам классов фторхинолонов и цефалос-поринов у патогенных филогенетически родственных видов Burkholderia (В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia). Установлено, что направленно селекционированные мутанты (SMR) этих микроорганизмов с маркерами резистентности к пефлоксацину, офлоксацину и цефтазидиму, приобретают фенотип множественной устойчивости к препаратам других классов высокого уровня.

Приоритетность исследований по получению и изучению резистентных штаммов буркхольдерий данного типа подтверждена патентом на изобретение «Инсерционный мутант Burkholderia pseudomallei КМЗ1 - модельный штамм для молекулярно-генетического анализа механизмов формирования множественной антибиотикорезистентности у патогенных буркхольдерий» (заявка №2009141036 от 5 ноября 2009 г., положительное решение о выдаче патента от 13 октября 2010 г.).

На основании изучения устойчивости к антибиотикам в присутствии блокатора мембранных каналов - верапамила и секреции внеклеточных ферментов дана предварительная оценка возможных механизмов формирования множественной резистентности, связанных с процессами проницаемости клеточных мембран.

У мутантов всех трех видов Burkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам проведен сравнительный анализ продукции компонентов системы мембранного транспорта и секреции и обнаружены различия в профилях белков наружных мембран, варьирующие при изменении резистентности к ингибиторам.

Для определения вирулентности мутантных штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia в качестве альтернативной модели впервые предложен вид простейших Paramecium caudatum и осуществлено моделирование локального инфекционного процесса (феномен Штрауса), вызываемого В. cepacia, на золотистых хомячках. Установлено, что развитие исследуемых типов резистентности или повышенной чувствительности приводит к снижению вирулентности мутантов для данных моделей.

Впервые изучен генетический полиморфизм мутантов патогенных видов Burkholderia с измененной чувствительностью к антибиотикам с использованием метода RAPD и проведен анализ изменчивости пориновых генов методом ПЦР. Показано, что штаммы В. pseudomallei, резистентные к пеф-локсацину, офлоксацину, цефтазидиму (SMR), образовывали две группы сходства, отдельные от групп, объединяющих транспозонные мутанты (ТТМ) этого вида, чувствительные к антибиотикам.

На основании результатов анализа аллельного полиморфизма пориновых генов орсР1/отр39, показавшего модификацию их структуры у SMR-штаммов В. mallei и В. cepacia, высказано предположение о возможной роли полифункциональных поринов ОрсР1/Ошр39 в формировании у патогенных буркхольдерий множественной резистентности. Роль порина OpcPl В. cepacia в развитии резистентности подтверждена комплементацией дефекта по продукции белка при трансформации по признаку устойчивости с выявлением специфического ПЦР-продукта, соответствующего последовательности орсР1/отр39 генов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

Получена коллекция мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia, включающая штаммы как с фенотипом множественной резистентности, так и штаммы с множественной чувствительностью к антибиотикам, предназначенных для изучения молекулярно-генетических механизмов резистентности и вирулентности буркхольдерий. Мутанты В. cepacia 25416 SMR2 (CfzRPfxR) и В. cepacia 25416 NSP депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий Российского НИПЧИ «Микроб», ГКПБ с присвоенными номерами В. cepacia КМ 197 и В. cepacia КМ 196 соответственно.

Модель простейших (P. caudatum), предложенная для ускоренного определения вирулентности, и мутантные штаммы используются в работе профильных лабораторий ВолгоградНИПЧИ при изучении вирулентности и способности к персистированию патогенных буркхольдерий.

Материалы диссертационной работы вошли в раздел методических указаний МУК 4.2.2495-09 «Определение чувствительности возбудителей опасных бактериальных инфекций (чума, сибирская язва, холера, туляремия, бруцеллез, сап, мелиоидоз) к антибактериальным препаратам», утвержденных Главным санитарным врачом РФ Г.Г. Онищенко 1 апреля 2009 г. (с введением в действие 1 июня 2009 г.).

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Полученные методом направленной селекции мутантные SMR-штаммы В. psendomallei, В. mallei, В. cepacia, резистентные к фторхинолонам (пефлоксацину, офлоксацину) и цефалоспоринам (цефтазидиму), характеризуются стабильным наследованием приобретенных признаков с развитием перекрестной устойчивости к антибиотикам других классов.

2. Мутанты патогенных буркхольдерий с множественной устойчивостью к антибиотикам отличаются измененной проницаемостью клеточных мембран, что фенотипически проявляется в снижении продукции внеклеточных ферментов и изменении резистентности к антибактериальным препаратам при воздействии на клетки верапамила, блокирующего мембранные каналы.

3. У резистентных мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia наблюдается варьирование состава мажорных протеинов наружных мембран с возрастанием экспрессии ряда белков, при этом у мутантов В. cepacia с повышенной чувствительностью происходит снижение продукции протеинов (Мг 21, 27, 71, 110 kDa) и отсутствие экспрессии порина Мг 36 kDa (OpcPl).

4. Развитие у буркхольдерий измененной чувствительности к антибиотикам, приводит к снижению вирулентности мутантных штаммов для лабораторных животных (белых мышей, золотистых хомячков) и простейших вида P. caudatum.

5. В развитии резистентности множественного типа у патогенных буркхольдерий принимает участие порин наружной мембраны ОрсР1/Отр39, что подтверждается наличием модификаций в структуре по-риновых генов орсРИотр39 резистентных штаммов. При трансформации мутантов В. cepacia с повышенной чувствительностью к антибиотикам, дефектных по гену opcPl, наблюдается компенсация признака сниженной резистентности, восстановление геномной последовательности, соответствующей орсР1/отр39 и продукция белка Мг 36 kDa.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Диссертация выполнена на основе 3 плановых государственных НИР.

Основные материалы диссертации были представлены на VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006); VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); V Международном конгрессе по мелиоидозу (Thailand, 2007); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии с инфекционными болезнями на территории государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2008); а также на ежегодных итоговых научных конференциях ВолгоградНИПЧИ (2002-2009).

По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, из них 2 - в рецензируемых периодических изданиях, рекомендованных ВАК для защиты докторских и кандидатских диссертаций, 1 — в зарубежной печати.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация изложена на 127 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, иллюстрированных 14 таблицами и 33 рисунками, заключения, выводов и библиографического указателя, включающего 232 литературных источника (38 отечественных и 194 иностранных авторов).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Молчанова, Елена Владимировна

109 ВЫВОДЫ:

1. Получена коллекция мутантных штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia с измененной чувствительностью к антибиотикам, состоящая из SMR-мутантов с селектированными признаками устойчивости к пефлокса-цину, офлоксацину, цефтазидиму и штаммов чувствительных к антибиотикам этих классов. Штаммы В. cepacia 25416 SMR2 (CfzRPfxR) и В. cepacia 25416 NSP с множественной чувствительностью к антибиотикам депонированы в ГКПБ с присвоенными номерами КМ 197 и КМ 196 соответственно.

2. Установлено, что у всех трех видов буркхольдерий резистентность SMR-типа носит множественный характер, формируется с участием процессов снижения проницаемости клеточных мембран и сопровождается варьированием белковых профилей. Резистентные SMR-мутанты отличаются, главным образом, повышением экспрессии мажорных протеинов с Мг 27, 39, 71, 110 kDa, тогда как штаммы В. cepacia NSP-типа с множественной чувствительностью имеют сниженную продукцию этих белков и отсутствие экспрессии порина ОрсР 1.

3. Показано, что развитие у В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia измененной чувствительности к антибиотикам приводит к снижению вирулентности мутантных штаммов для лабораторных животных. Данные по предварительной оценке вирулентности, полученные с использованием альтернативной модели простейших (P. caudatum), коррелируют с показателями вирулентности резистентных штаммов В. pseudomallei для белых мышей и В. mallei для золотистых хомячков.

4. Установлено, что для RAPD-профилей и фингерпринтов фрагментов ДНК, содержащих интегразу патогенных видов Burkholderia, характерна межвидовая вариабельность, тогда как у производных отдельного вида RAPD-профили более консервативны. При этом резистентные SMR-мутанты В. pseudomallei и чувствительные транспозонные мутанты оказались распределенными в обособленные друг от друга группы сходства, что свидетельствует об однотипном характере перестроек их геномов, связанных с формированием соответствующих фенотипов.

5. В формировании множественной резистентности буркхольдерий показано участие порина ОрсР1/Ошр39. Чувствительные мутанты NSP-типа В. cepacia, утратившие белок OpcPl, были дефектны по кодирующей последовательности этого порина. При трансформации чувствительных мутантов по признаку резистентности гомологичной ДНК и гетерологичной последовательностью отрЗЯ В. pseudomallei наблюдали восстановление фенотипа резистентности, продукции белка OpcPl и выявляли детерминирующую его геномную последовательность.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значительный рост резистентности микроорганизмов к антибактериальным препаратам, наблюдающийся в настоящее время, является естественным биологическим ответом на широкое и, зачастую, неоправданное использование антибиотиков, селективное давление которых способствует отбору, выживанию и размножению резистентных штаммов. Инфекции, вызываемые устойчивыми штаммами, отличаются длительным течением, повышением частоты госпитализации и увеличением продолжительности пребывания больного в стационаре, а также ухудшением прогноза лечения. При этом возникновение резистентности к одному препарату на фоне терапии обусловливает повышение устойчивости микроорганизмов как к антибиотикам этого, так и других классов.

Основные пути преодоления резистентности заключаются в применении антибактериальных препаратов, обладающих активностью в отношении высокорезистентных штаммов, раскрытии молекулярных механизмов приобретения устойчивости и создании в соответствии с ними новых средств химиотерапии, способных предотвращать или ингибировать процесс ее формирования (Фещенко, Дзюблик, 2002).

Биология патогенных буркхольдерий {В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia) и роль их в развитии инфекционной заболеваемости у человека и животных в последние годы являются предметом интенсивного исследования. Показано, что эти виды микроорганизмов изначально обладают высокой природной резистентностью и при лечении вызываемых ими инфекций, часто возникает проблема выбора антибиотика в связи с приобретением устойчивости к антибактериальным препаратам множественного типа в процессе самой терапии (Батманов, 1994; Dance et al., 1989; Ciss et al, 1998; Kenny et al, 1999; Bonacorsi et al., 1999; Heine et al., 2001).

Для изучения общих закономерностей и различий в формировании резистентности и устанавлении ее молекулярно-генетических механизмов обычно используют штаммы с измененной чувствительностью к антибиотикам, несущие ряд отличительных фенотипических признаков.

С этой целью в настоящей работе была создана коллекция, полученных методом направленной селекции, мутантных штаммов буркхольдерий филогенетически родственных видов SMR-типа, которая включала мутанты В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia, резистентные к пефлоксацину и цефта-зидиму, а также штаммы В. cepacia, устойчивые к канамицину и хлорамфе-николу. Мутантные штаммы отличались последовательностью селектированных маркеров, способом получения и уровнем приобретенной резистентности и показывали ее повышение в несколько раз в сравнении с исходными культурами дикого типа.

Помимо устойчивых мутантов, мы получили с помощью транспозон-ного или химического мутагенеза штаммы, утратившие исходную резистентность к одному или к ряду антибиотиков. В частности, был селекционирован штамм В. pseudomallei 57576 SMRT21, обладающий чувствительностью к цефтазидиму, и мутанты В. cepacia 25416/8235 NSP/NSK, характеризующиеся чувствительностью множественного типа.

Определение перекрестной резистентности у SMR-мутантов, устойчивых к пефлоксацину, офлоксацину и цефтазидиму, показало, что она сформировалась к препаратам различных классов, что характеризовало ее как множественную.

В зависимости от последовательности маркеров наблюдалось некоторое варьирование характера перекрестной устойчивости. Так, мутантные штаммы всех трех видов буркхольдерий SMR1 с фенотипом Pfi^Czf*1 чаще приобретали дополнительную резистентность к хлорамфениколу и ампициллину, SMR2 с фенотипом Czi^Pfx11 - к ампициллину и стрептомицину. I I

Было установлено также, что штаммы В. cepacia, отобранные на хло-рамфениколе, характеризовались устойчивостью не только к этому препарату, но и к пефлоксацину. Фенотип резистентности к цефтазидиму, напротив, выявлялся у штаммов с маркером KanR. Можно предположить, что существует тенденция взаимосвязи развития указанных типов перекрестной устойчивости друг от друга в направлении: Chi - Pfx и Kan - Cfz, когда повышение резистентности к одному препарату ведет к возрастанию МПК другого. Подобная тенденция в развитии устойчивости множественного типа у В. cepacia была описана в работах Rajyaguru, Muszynski (Rajyaguru, Muszyns-ki, 1997).

Эти результаты подтверждаются данными литературы, относительно случаев терапии тетрациклинами или хлорамфениколом, когда у микроорганизмов формируется устойчивость как к данным антибиотикам, так и к ß-лактамам и хинолонам; и, наоборот, когда резистентность бактерий к хино-лонам и их фторированным производным довольно часто сопровождается перекрестной устойчивостью к терациклинам и хлорамфениколу (Страчун-ский, Козлов, 2002; Aoyama et al., 1988).

Множественная резистентность в некоторых случаях может утрачиваться, что мы наблюдали при получении мутанта В. cepacia 25416 SMR112*, в процессе смены пефлоксацина как агента селекции на цефтази-дим.

Одновременно нужно отметить, что для штаммов В. cepacia с маркерами ChlR или KanR общий уровень перекрестной устойчивости был ниже, чем у мутантов, устойчивых к пефлоксацину или цефтазидиму. В свою очередь, среди последних, штаммы, полученные на средах с постепенно возрастающими концентрациями антибиотиков отличались также более низким общим уровнем множественной резистентности по сравнению со штаммами, выделенными другим способом.

Известно, что антибиотикоустойчивость множественного типа чаще всего формируется с участием одновременно нескольких механизмов в различных комбинациях. Так, в последние годы появилось много данных о широком распространении среди различных бактерий резистентности к хино-лонам, связанной с механизмами активного выведения их из микробной клетки и модификацией мишеней (Ма et al, 1994; Poole, 1994; Li et al., 1995). У P. aeruginosa, Acinetobacter baumannii, Helicobacter pylori отмечено снижение проницаемости наружной мембраны бактериальной клетки за счет утраты или снижения количества пориновых белков, которое встречается в комплексе с продукцией р-лактамаз расширенного спектра и дефектами в экспрессии отдельных пенициллин-связывающих протеинов (Rodriguez-Tebar et al, 1982; Fernandez-Cuenca et al, 2003; Kwon et al, 2003).

Для предварительной оценки возможных механизмов, посредством которых формируется устойчивость у Burkholderia spp., мы использовали один из известных приемов преодоления множественной резистентности, обусловленной multidrug efflux pumps, который заключается в блокировании мембранных каналов как опухолевых клеток, так и клеток бактерий, в частности В. pseudomallei (Ford, Hait, 1990; Robert, 1997; Moore, Woods, 1998; Arora, Shukla, 2003).

В наших исследованиях для блокирования мембранных каналов был использован верапамил, с помощью которого выявлялось изменение динамики чувствительности к антибиотикам у мутантов В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia в зависимости от селектированных фенотипов.

Прежде всего, было установлено, что верапамил практически не изменял уровень резистентности к гентамицину и хлорамфениколу дикого штамма В. cepacia АТСС 25416. В отличие от этого, у диких штаммов В. pseudomallei 56770 и В. mallei Ц-5 в присутствии блокатора наблюдалось отчетливое снижение устойчивости, проявляющееся в уменьшении числа жизнеспособных клеток на 20 - 40%.

Полирезистентные мутанты показали различное отношение к блокирующему действию верапамила. Так, на среде с верапамилом штаммы В. cepacia и В. pseudomallei, устойчивые к пефлоксацину и цефтазидиму, снижали резистентность к гентамицину и хлорамфениколу, тогда как штаммы устойчивые к цефтазидиму и пефлоксацину отчетливо повышали ее.

Таким образом, установленные различия находятся у обоих видов буркхольдерий в связи с последовательностью селектированных маркеров: если первым был маркер устойчивости к пефлоксацину, а вторым к цефтазидиму, то в присутствии верапамила резистентность культур увеличивалась, если же первым являлся маркер цефтазидимрезистентности, а вторым пеф-локсацинустойчивости, то такие мутанты демонстрировали снижение выживаемости.

Резистентные SMR мутанты В. mallei Ц-5, как и чувствительные В. cepacia 25416 NSP/NSK, показали лишь снижение резистентности в присутствии верапамила независимо от приобретенного фенотипа.

Поскольку формирование антибиотикорезистентности связано с комплексным изменением процессов клеточного транспорта и характера секреции, то у мутантных штаммов буркхольдерий можно было ожидать изменения в продукции некоторых внеклеточных ферментов. Определение протео-литической, липазной и лецитиназной активностей установило, что резистентные мутанты В. pseudomallei и В. cepacia отличались от штаммов дикого типа. В наибольшей степени у них отмечалось варьирование продукции экзопротеаз. При этом штаммы В. cepacia 25416 NSP с фенотипом множественной чувствительности к ряду антибиотиков показали отсутствие всех трех исследованных типов ферментативной активности. Полученные результаты мы интерпретировали как наличие модификации у мутантов как в проницаемости, так и в мембранном транспорте по сравнению с исходными культурами, что, в свою очередь, позволило предположить изменение экспрессии белков наружных мембран.

Участие поринов и белков с транспортной функцией в развитии резистентности к антибиотикам было показано рядом исследователей (Nikaido, 1989; Godfrey et al, 1991; Paulsen et al, 1996; Mine et al, 1999; Moore et al, 1999; Yorachit et al, 2000; Pages et al, 2005).

Проведенное нами сравнение профилей белков наружных мембран полирезистентных штаммов всех трех видов (В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia) выявило определенные различия в их экспрессии. Так, мутанты В. pseudomallei и В. mallei SMR-типа характеризовались в основном повышенной продукцией мажорных белков наружной и цитоплазматической мембран с Мг 27, 39, 71, 110 kDa.

Что касается В. cepacia, то спектр белков наружной мембраны мутантов, резистентных к канамицину и хлорамфениколу, в наименьшей степени отличался от такового дикого штамма. Более значительное снижение экспрессии отдельных мембранных белков (Мг 21, 27, 36 kDa) у штаммов В. cepacia 25416 SMR2 (CfzRPfxR), В. cepacia 25416 SMR3 (CfzR) или наоборот, повышение экспрессии целого ряда отдельных мембранных протеинов (Мг 21, 36, 71, 150, 200 kDa) у мутантных штаммов В. cepacia SMR111-116 (PfxR - PfxRCfzR) можно расценивать как преобладание различных механизмов формирования устойчивости: снижения проницаемости клеточной оболочки или экспрессии multi-drug efflux pumps. У чувствительных мутантов выявлялись дефекты в продукции отдельных мажорных белков с Мг 27 и 71 kDa у В. pseudomallei и Мг 36 kDa у В. cepacia.

В связи с формированием антибиотикорезистентности штаммы В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia изменяли, наряду с указанными признаками, также вирулентность, результаты оценки которой показали, в основном, снижение ее уровня. Однако высокоустойчивые мутанты В. mallei и В. pseudomallei со сниженной вирулентностью остаются опасными, так как обладают способностью к длительному внутриклеточному выживанию на фоне антибиотикотерапии и персистенции на протяжении многих лет, что при снижении иммунитета приводят к развитию острой формы инфекции. Что касается микроорганизмов комплекса В. cepacia, то, по мнению некоторых специалистов, существует потенциальная возможность усиления их па-тогенности за счет генов, воспринятых от других видов, в том числе от возбудителя мелиоидоза (Шагинян, Чернуха, 2003).

Острую форму инфекции, вызываемую В. cepacia, моделировали, используя иммунодепрессанты, что вызывало гибель белых мышей, в среднем, в течение 3 — 5 суток при инокуляции культур диких штаммов, тогда как животные, зараженные культурами резистентных мутантов, оставались живыми в срок наблюдения 21 день.

Феномен Штрауса у золотистых хомячков наглядно демонстрировал хроническую форму инфекции, вызываемую В. cepacia. При этом клинические изоляты показывали более высокий уровень вирулентности в сравнении с ризосферными штаммами.

В настоящее время для определения патогенности многих микроорга-измов, в том числе В. pseudomallei, Р. aeruginosa, В. cepacia, все более широко используются альтернативные модели — различные виды насекомых, растений, простейших. Среди направлений исследований - изучение факторов патогенности этих микроорганизмов, разработка метода определения анти-биотикочувствительности максимально приближенного к условиям in vivo (Inglis, 2000; Bernier, 2003; Inglis, 2004). Эти методы обладают высокой чувствительностью, экспрессностью, надежностью, универсальностью и малой себестоимостью. Они просты в проведении, поддаются инструментализации и автоматизации, а их результаты легко интерпретируемы. Несомненно, что данные модели не могут служить полноценной заменой млекопитающим лабораторным животным, но являются адекватными системами изучения отдельных механизмов патогенеза и скрининга культур.

Для оценки патогенности полученных мутантных штаммов мы исполь1 зовали в качестве альтернативной модели Р. caudatum - инфузориютуфельку. Одновременно с результатами, полученными на других моделях, она показала, что приобретение резистентности (или чувствительности) ведет к снижению вирулентных свойств. При этом, показатели вирулентности штаммов имели прямую корреляцию с таковыми, полученными на моделях золотистых хомячков и белых мышей. Следует также отметить, что с помощью лабораторных животных нам не удалось выявить штаммовые различия в уровне вирулентности резистентных культур В. cepacia, тогда как модель простейших это четко демонстрировала. Интересен и тот факт, что мутант В. cepacia 25416 SMR112*, полученный отбором в процессе смены селективного фактора (пефлоксацина на цефтазидим) характеризовался более высоким уровнем вирулентности для парамеций, по сравнению с исходным штаммом В. cepacia 25416 SMR111*, устойчивым к пефлоксацину.

Генетическую гетерогенность штаммов буркхольдерий с различными фенотипами устойчивости к антибиотикам для предварительной оценки общности или различия механизмов реализации того или иного спектра резистентности исследовали с использованием методов типирования, основанных на амплификации полиморфных и специфических последовательностей хромосомной ДНК буркхольдерий (RAPD), а также анализа конформацион-ного полиморфизма денатурированных одноцепочечных участков амплико-нов последовательности поринового гена орсР1/отр39 (SSCP).

Сравнение RAPD-профилей штаммов В. pseudomallei, резистентных к фторхинолонам и цефтазидиму и транспозонных ТТМ-мутантов В. pseudomallei со сниженной устойчивостью к этим антибиотикам обнаружило распределение их в обособленные друг от друга группы сходства. В целом же развитие данных селектированных фенотипов патогенных видов буркхольдерий по-видимому сопровождалось сходными геномными перестройками у мутантов внутри каждой из групп. Последнее подтверждалось и при исследовании фингерпринтов фрагментов ДНК, содержащих последовательности интеграз, показавшем фактическую идентичность этих профилей у двух из трех изученных SMR-штаммов В. pseudomallei.

Довольно четкое возрастание экспрессии мажорного порина наружных мембран Мг 39 kDa (Omp39) у полирезистентных мутантов В. pseudomallei и его аналога Мг 36 kDa (OpcPl) у полирезистентных штаммов В. cepacia, а также наличие дефекта, как в его экспрессии, так и в детерминирующей его геномной последовательности у чувствительных мутантов В. cepacia, позволили предположить возможную роль данного белка как компонента транспортной системы в формировании устойчивости к рассматриваемым группам антимикробных соединений.

Предварительный анализ аллельного полиморфизма гена мажорного порина орсР1/отр39 установил модификацию его структуры в штаммах В. cepacia и В. mallei с повышенной устойчивостью.

Трансформация мутантов В. cepacia 25416 NSP/NSK, чувствительных к антибиотикам, как гомологичной ДНК, так и гетерологичной последовательностью гена отр39 В. pseudomallei комплементировала признак сниженной резистентности к антибиотикам. При этом у трансформантов выявлялась исследуемая геномная последовательность орсР1/отр39 и восстанавливалась продукция белка-порина OpcPl.

Таким образом, отличительные черты полирезистентных мутантов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia, выявленные при изучении их фенотипов и генотипов, позволили установить основные закономерности и оценить некоторые принципиально возможные механизмы, посредством которых формировалась устойчивость. Представленные данные могут найти развитие в дальнейших исследованиях молекулярно-генетических основ резистентности у этих видов микроорганизмов, а также оказаться полезными в разработке перспективных средств лечения инфекций, вызываемых патогенными бурк-хольдериями.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Молчанова, Елена Владимировна, Волгоград

1. Агеева Н.П., Меринова JI.K. Влияние условий скрещивания на эффективность передачи плазмиды RP4 у Pseudomonas mallei II Микробиол. журн. 1987. - № 5. - С.З - 6.

2. Антонов Ю. В., Поповцева JI. Д., Ярулин Р. Г., Илюхин В. И. Проблемы резистентности возбудителя мелиоидоза к антибиотикам // Антибиотики и химиотерапия. 1991.-№ 10. - С.26 - 28.

3. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях // Ленинград: Гос. изд-во мед.лит. 1962. - 181 с.

4. Батманов В.П., Илюхин В.И., Антонов Ю.В! Лабораторный контроль эффективности химиотерапии при мелиоидозе // Антибиотики и химиотерапия. -1995.-№40.-С. 41-45.

5. Батманов В.П. Чувствительность Pseudomonas mallei к тетрациклинам и их эффективность в экспериментальном сапе // Антибиотики и химиотерапия. -1994.-№39.-С. 33-37.

6. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы // М. Медицина. - 1990. - 224с.

7. Викторов Д.В. Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов: Автореф. дис.докт. биол. наук. Волгоград. - 2009. - 54 с.

8. Викторов Д.В., Пивень H.H. Активный мембранный транспорт и множественная антибиотикорезистентность бактерий // Мол. генет. микробиол. вирусол. 2001. - № 3. - С. 3 - 8.

9. Ю.Вязьмина Т.Н., Тихонов Н.Г., Алексеев В.В., Попов С.Ф., Курилов В.Я. Патогенез, патологическая анатомия и патологическая морфология сапа // Сап / Под редакцией Н.Г. Тихонова. Волгоград. - 1995. - С. 50 - 70.

10. Ильина Т.С. Структурная организация и механизмы перемещения генных кассет, кодирующих резистентность к антибиотикам и факторы вирулентности бактерий // Мол. генет. микробиол. вирусол. 2001. -№ 1. - С. 3 - 12.

11. И.Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гинцбург A.JI. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития // Генетика. 2004. - № 11.-С. 1-12.

12. Котык А., Яначек К. Мембранный транспорт. М. - Мир. - 1980. - 330 с.

13. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева В.И. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий // М. — 1998. 256с.

14. Малеев В.В., Иванов A.C., Страчунский Л.С. Резистентность шигелл и современные возможности антибактериальной терапии шигеллезов // Клин. Микробиол. Антимикроб. Химиотер. 2005. - Том 7. - № 4. - С. 350 - 353.

15. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир. - 1984. - 479 с.

16. Маркова Ю.А., Романенко A.C., Шафикова Т.Н. Механизмы полигостально-сти бактерий // Ж. Стресс-физиологии и биохимии. 2007. - Том 3. - № 2. -С. 15-23.

17. Меринова Л. К., Тимофеева Е. В., Сеимова И. К. Инсерционные мутации в геноме Pseudomonas pseudomallei, индуцированные транспозонами ТпЮ, Тп9, Тп5 // Мол. генет. микробиол. вирусол. 1997. - № 1. - С. 14 - 17.

18. Меринова Л.К., Пивень H.H., Замараев B.C. с соавт. Получение маркированных штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа // Особо опасн. инфекц. за-бол.: диагн., профил. и биол. свойства возбудителей. Волгоград. - 1990. -Вып. 4.-С. 57-62.

19. Меринова O.A. Характеристика белков наружной мембраны Burkholderia pseudomallei: Автореф. дис.канд. мед.наук. Волгоград. — 2003. - 23 с.

20. Методические рекомендации по применению методов биотестирования для оценки качества воды в системах хозяйственно-питьевого водоснабжения. MP №ЦОС ПВ Р 005-95 // Москва. 1995. - 21 с.

21. Нозокомиальная пневмония у взрослых. Российские национальные рекомендации // Москва. 2009. - 90 с.

22. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания МУК 4.2.1890 04 // М. - 2004. - 90 с.

23. Пивень Н. Н., Смирнова В. И., Викторов Д. В., Фарбер С. М., Ярулин Р. Г. Иммуногенность и гетерогенность поверхностного антигена 8 возбудителя мелиоидоза // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1996. - С. 75 -78.

24. Пивень Н. Н., Тихонов Н. Г., Викторов Д. В., Плеханова Н. Г., Попов С. Ф. Факторы вирулентности Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei // Проблемы ООИ. 1999. -№ 79. - С. 180 - 183.

25. Попов С. Ф., Курилов В. Я., Мельников Б. И. Особенности паразитирования возбудителей мелиоидоза в клетках хозяина // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1991. - С. 12 - 14.

26. Попов С. Ф., Тихонов Н. Г., Пивень Н. Н., Викторов Д. В., Авророва И. В. Иммунобиологические свойства капсульного вещества Burkholderiapseudomallei. // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 2000. - С. 60 -64.

27. Пушкарева В.И., Величко В.В., Каминская А.А. Burkholderia cepacia в разных экологических условиях: численность и изменчивость бактериальной популяции // Журн. микробиол. 2005. - № 3. - С. 39. - 44.

28. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas II Отв. ред. Айзенман Б.Е.; АНУССР, ин-т микробиологии и вирусологии им.Д.К. Заболотного. — Киев. — Наук, думка. 1990. - 264 с.

29. Страчунский JI.C., Козлов С.Н. Современная антимикробная химиотерапия. Руководство для врачей. М.: Боргес. 2002. - 436 с.

30. Фещенко Ю.И., Дзюблик А .Я. Антибиотикорезистентность основных возбудителей инфекций нижних дыхательных путей и возможности левофлокса-цина в ее преодолении // Украинский химиотерапевтический журнал Киев. -№1 (13).-2002.-С. 3-10.

31. Чернуха М.Ю. Реализация патогенности бактерий Burkholderia cepacia при разных формах инфекции: Дис.док. биол. наук. Москва. - 2008. - 232с.

32. Зб.Чернуха М.Ю., Шагинян И.А., Романова Ю.М. и др. Роль регуляторной системы "quorum sensing" в симбиотическом взаимодействии бактерий Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa при смешанной инфекции // Журн. микробиол. 2006. - № 4. - С. 32-37.

33. Шагинян И.А., Данилина Г.А., Чернуха М.Ю. и др. Формирование биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса Burkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик // Журн. микробиол. 2007. - № 1. - С. 3 - 9.

34. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. Бактерии комплекса Burkholderia cepacia: особенности диагностики, организации генома и метаболизма // Мол. генет. микробиол. вирусол. — 2003. № 2. - С. 7 - 11.

35. Allardet-Servent, A., S. Michaux-Charachon, E. Jumas-Bilak, L. Karayan, and M. Ramuz, Presence of one linear and one circular chromosome in the Agrobacterium tumefaciens C58 genome // J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 7869 - 7874.

36. Andersen C. Channel-tunnels: outer membrane components of type I secretion systems and multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria // Rev. Physiol. Bi-ochem. Pharmacol. 2003. - Vol. 147. - P. 122 - 165.

37. Arora A., Shukla Y. Modulation of vinca-alkaloid induced P-glycoprotein expression by indole-3 carbinol // Cancer Lett. 2003. - Vol. 189(2). - P. 167. - 173.

38. Audia, J. P., and J. W. Foster. Acid shock accumulation of sigma S in Salmonella enterica involves increased translation, not regulated degradation // J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2003. - Vol. 5. - P. 17 - 28.

39. Audia, J. P., C. C. Webb, and J. W. Foster. Breaking through the acid barrier: an orchestrated response to proton stress by enteric bacteria // Int. J. Med. Microbiol. -2001.-Vol. 291.-P. 97- 106.

40. Bassam B. J., Caetano-Annoles G., Gresshoff P. M. Fast and sensitive silver staining of DNA in Polyacrylamide gels // Anal. Biochem. 1991. -Vol.196. - P. 80 -83.

41. Bateman, A., E. Birney, L. Cerruti, R. Durbin, L. Etwiller et al. The pfam protein families database // Nucleic Acids Res. 2002. - Vol. 30. - P. 276 - 280.

42. Bennett P. M. Integrons and gene cassettes: a genetic construction kit for bacteria // J. Antimicrob. Chemother. 1999. - Vol. 43. - P. 1 - 4.

43. Bergey's manual of determinative bacteriology. Baltimore, 1974. - 8 th ed.

44. Bernier S.P., Silo-Suh L., Woods D.E. Comparative analysis of plant and animal models for characterization of Burkholderia cepacia virulence // Infect. Immun. — 2003. Vol. 71. - P. 5306 - 5313.

45. Bohn C., Bouloc P. The Escherichia coli cmlA gene encodes the multidrug efflux pump Cmr/MdfA and is responsible for isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside exclusion and spectinomycin sensitivity // J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180. - P. 6072-6075.

46. Bredford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dyelinding U // J. Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248 - 254.

47. Burtnick M. N., Woods D. E. Isolation of polymyxin B-susceptible mutants of Burkholderia pseudomallei and molecular characterization of genetic loci involved in polymyxin B resistence // Antimicrob. Agents Chemother. 1999. -Vol. 43.-P. 2648-2666.

48. Byrne, A. M., and T. G. Lessie, Characteristics of IS401, a new member of the IS3 family implicated in plasmid rearrangements in Pseudomonas cepacia II Plasmid. -1994.-Vol. 31.-P. 138-147.

49. Chambon L. Isolement du bacilli de whitmore a partir du milieu exterieur // Ann Pasteur. Paris. - 1955. - Vol. 89. - P. 229 - 235.

50. Chan, Y. Y., and K. L. Chua. The Burkholderia pseudomallei BpeAB-OprB efflux pump: expression and impact on quorum sensing and virulence. // J. Bacteriol. — 2005. Vol. 187. - P. 4707 - 4719.

51. Chan, Y. Y., T. M. Tan, Y. M. Ong, and K. L. Chua. BpeAB-OprB, a multidrug efflux pump in Burkholderia pseudomallei 11 Antimicrob. Agents Chemother. -2004. Vol. 48. - P. 1128 - 1135.

52. Chaowagul, W. Recent advances in the treatment of severe melioidosis // Acta Trop. 2000. - Vol. 74. - P. 133 - 137.

53. Chauhan, A., S. K. Samanta, and R. K. Jain. Degradation of 4-nitrocatechol by Burkholderia cepacia: a plasmid-encoded novel pathway 11 J. Appl. Microbiol. -2000. Vol. 88. - P. 764 - 772.

54. Cheng, H. P., and T. G. Lessie. Multiple replicons constituting the genome of Pseudomonas cepacia 17616 // J. Bacteriol. 1994. - Vol. 176. - P. 4034 - 4042.

55. Cheung, T. K., P. L. Ho, P. C. Woo, K. Y. Yuen, and P. Y. Chau. Cloning and expression of class A beta-lactamase gene blaA (BPS) in Burkholderia pseudomallei II Antimicrob. Agents Chemother. 2002. - Vol. 46. - P. 1132 - 1135.

56. Ciss M.F., Dian Y.D. Sow A.I. et al Burkholderia cepacia isolation and characterization from hospital infections // Dakar Med. 1998. - Vol. 43. №2. - P. 144 -146.

57. Coenye, T., L. Liu, P. Vandamme, and J. J. LiPuma. Identification of Pandoraea species by 16S ribosomal DNA-based PCR assays // J. Clin. Microbiol. 2001. -Vol. 39.-P. 4452-4455.

58. Coenye, T., P. Vandamme, J. R. Govan, and J. J. LiPuma. Taxonomy and identification of the Burkholderia cepacia complex // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39.-P. 3427-3436.

59. Conway B.A., Venu V., Speert D.P. Biofilm formation and acyl homoserine lactone production in the Burkholderia cepacia complex // J. Bacteriol. 2002. -Vol. 184.-P. 5678-5685.

60. Cox, A. D., C. J. Taylor, A. J. Anderson, M. B. Perry, and S. G. Wilkinson. Structures of the two polymers present in the lipopolysaccharide of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia serogroup 04 // Eur. J. Biochem. — 1995. Vol. 231. - P. 784-789.

61. Currie B. J., Fisher D. A., Howard D. M., Burrow J. N., Selvanayagam S., Snelling P. L., Anstey N. M., Mayo M. J. The epidemiology of melioidosis in Australia and Papua New Guinea // Acta Tropica. 2000. - Vol. 74. - P. 121 - 127.

62. Currie B. Melioidosis and the monsoon in tropical Australia // Commun. Dis. Intell. Australia. - 1996. - Vol. 20. - P. 63 - 69.

63. Dance D., Wuthiekanun V., Chaowagul W. et al. The antimicrobial susceptibility of Pseudomonas pseudomallei. Emergence of resistance in vitro and during treatment // J. Antimicrob.Chemoth. 1989. - Vol. 24. - P. 295 - 309.

64. Dance D. A. B. Melioidosis as an emerging global problem // Acta Tropica. -2000.-Vol. 74.-P. 115-119.

65. Deshazer, D., P. J. Brett, and D. E. Woods. The type II O-antigenic polysaccharide moiety of Burkholderia pseudomallei lipopolysaccharide is required for serum resistance and virulence // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 30. - P. 1081 - 1100.

66. DeShazer, D., P. J. Brett, M. N. Burtnick, and D. E. Woods. Molecular characterization of genetic loci required for secretion of exoproducts in Burkholderia pseudomallei II J. Bacteriol. 1999. - Vol. 181. - P. 4661 - 4664.

67. Dharakul T, Songsivilai S. Recent developments in the laboratory diagnosis of melioidosis // J. Infect. Dis. Antimicrob. Agents. 1996. - Vol. 13. - P. 77 - 80.

68. Florian M.E. Wagenlehner, Kurt G. Naber. Treatment of bacterial urinary tract infections: presence and future // Europian Urology. 2006. - Vol. 49. - P. 235 -244.

69. Ford J.M., Hait W.N. Pharmacology of drugs that alter multidrug resistance in cancer // Pharmacol. Rev. 1990. - Vol. 42. - P. 155 - 199.

70. Garrity G. M., J. A. Bell, and T. G. Lilburn. Taxonomic outline of the procaryotes. Bergey's manual of systematic bacteriology // Second Edition. Release 5.0. -Springer-Verlag. - New York. - 2004.

71. Gaubier, P., D. Vega, and R. Cooke. Nucleotide sequence of a 2 kb plasmid from Pseudomonas cepacia implicated in the degradation of phenylcarbamate herbicides // DNA Seq. 1992. - Vol. 2. - P. 269 - 271.

72. Gibson R.L., Burns J.L., Ramsey B.W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis // Am. J. Resp. Crit. Care Med. 2003. - Vol. 168. -P. 918 -951.

73. Gilardi G.L. Pseudomonas species in clinical microbiology // J. Med. 1976. -Vol. 43.-P. 710-715.

74. Gilligan, P. H. Pseudomonas and Burkholderia, in manual of clinical microbiology, edited by P.R.Murray, E.J.Baron, M.A.Pfaller, F.C.Tenover, and R.H.Yolken II American Society for Microbiology. Washington. - DC. - 1995. - P. 509 - 519.

75. Godfrey A. J., Wong S., Dance D. A., Chaowagul W., Brayn L. E. P. pseudomallei resistance to beta-lactam antibiotics due to alterations in the chromosomally encoded beta-lactamase 11 Antimicrob. Agents Chemother. 1991. - Vol. 35. - P. 1635- 1640.

76. Gotoh N., Nagino K., Wada K., et al. Burkholderia cepacia porin is an oligomer composed of two components proteins // Microbiology. 1994. - Vol. 140. - P. 3285-3291.

77. Govan J.R.W., Deretic V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia II Microbiol. Rev. — 1996. — Vol. 60.-P. 539-574.

78. Gunn, J. S., and S. I. Miller. PhoP-PhoQ activates transcription of pmrAB, encoding a two-component regulatory system involved in Salmonella typhimurium antimicrobial peptide resistance // J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 6857 -6864.

79. Gunn, J. S., K. B. Lim, J. Krueger, K. Kim, L. Guo et al. PmrA-PmrB-regulated genes necessary for 4-aminoarabinose lipid A modification and polymyxin resistance // Mol. Microbiol. 1998. - Vol. 27. - P. 1171 - 1182.

80. Haak, B., S. Fetzner, and F. Lingens. Cloning, nucleotide sequence, and expression of the plasmid-encoded genes for the two-component 2-halobenzoate 1,2-dioxygenase from Pseudomonas cepacia 2CBS // J. Bacteriol. — 1995. — Vol. 177. -P. 667-675.

81. Haase, A., J. Janzen, S. Barrett, and B. Currie. Toxin production by Burkholderia pseudomallei strains and correlation with severity of melioidosis // J. Med. Microbiol. 1997. - Vol. 46. - P. 557 - 563.

82. Haase A., Melder A., Smith-Vaughan H., Kemp D., Currie B. RAPD analysis of isolates of Burkholderia pseudomallei from patients with recurrent melioidosis // Epidemiol. Infect. 1995. - Vol.115. - P. 115 - 121.

83. Haase A., Smith-Vaughan H., Melder A. Subdivision of Burkholderia pseudomallei ribotypes into multiple types by random amplified polymorphic DNA analysis provides new insights into epidemiology // J. Clin. Microbiol. 1995. -Vol.33.-P. 1687-1690.

84. Hancock R., Nikaido H. Outer membranes of gram-negative bacteria. Isolation from Pseudomonas aeruginosa PAOl and use in reconstitution and definition of the permeability barrier// J. Bacteriol. 1978. - Vol. 136. - P. 381 -390.

85. Haussler, S., M. Rohde, N. N. von, M. Nimtz, and I. Steinmetz. Structural and functional cellular changes induced by Burkholderia pseudomallei rhamnolipid I I Infect.Immun. 2003. - Vol. 71. - P. 2970 - 2975.

86. Heine H.S., England M.J., Waag D.M. et al. In vitro antibiotic susceptibilities of Burkholderia mallei (causetive agent of glanders) determined by broth microdilution and E-test II Antimicrob. Agents and Chemoth. 2001. - Vol. 45. - P. 2119 -2121.

87. Herasimenka G., Cescutti P., Sampaio N. Macromolecular properties of cepacian in water and in dimethylsulfonide // Carbohydr. Res. 2007. - № 10. - P. 570 -575.

88. Holmes A., Govan J., Goldstein R. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomo-nas) cepacia: a threat to human health? // J. Infect. Dis. 1998. - Vol. 4, N 2. - P. 221 -227.

89. Hu F.P., Young L.M. Biocidal activity in plant pathogenic Acidovorax, Burkholderia, Herbaspirillum, Ralstonia and Xanthomonas spp. II J. Appl. Microbiol. -1996. Vol. 84. - P. 263-271.

90. Hubner, A., Hendrickson, W. A fusion promoter created by a new insertion sequence, IS 1490, activates transcription of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid cata-bolic genes in Burkholderia cepacia AC 1100 // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. -P. 2717-2723.

91. Hueck, K. J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - Vol. 62. - P. 379 - 433.

92. Jones, A. L., T. J. Beveridge, and D. E. Woods. Intracellular survival of Burkhol-deriapseudomallei II Infect. Immun. 1996. - Vol. 64. - P. 782 - 790.

93. Jumas-Bilak, E., S. Michaux-Charachon, G. Borg, M. Ramuz, and A. Allardet-Servent. Unconventional genomic organization in the alpha subgroup of the Pro-teobacteria II J. Bacteriol. 1998. - Vol. 180. - P. 2749 - 2755.

94. Keig P.M., Ingham E., Vandamme P., Kerr K.G. Differential invasion of respiratory epithelial cells by members of the Burkholderia cepacia complex // J. Clin. Microbiol. Infect. 2002. - Vol. 8. - P. 47 - 49.

95. Keith, K. E., P. C. Oyston, B. Crossett, N. F. Fairweather, R. W. Titball et al. Functional characterization of OXA-57, a class D beta-lactamase from Burkholderia pseudomallei II Antimicrob. Agents Chemother. 2005. - Vol. 49. - P. 1639 -1641.

96. Kenny D.J., Russel P., Rogers D. et al. In vitro susceptibilities of Burkholderia mallei in comparision to those of other pathogenic Burkholderia spp. 11 Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - V.43. - P. 2773 - 2775.

97. Kwon, D. H., M. P. Dore, J.J. Kim, M. Kato, M.Lee et al. High-level beta-lactam resistance associated with acquired multidrug resistance in Helicobacter pylori II Antimicrob. Agents Chemother. 2003. -V.47.-P. 2169-2178.

98. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680 - 685.

99. Langley, R., D. T. Kenna, P. Vandamme, R. Ure, and J. R. Govan. Lysogeny and bacteriophage host range within the Burkholderia cepacia complex // J. Med. Microbiol. 2003. - Vol. 52. - P. 483 - 490.

100. Lennon, E., and B. T. DeCicco. Plasmids of Pseudomonas cepacia strains of diverse origins // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - Vol. 57. - P. 2345 - 2350.

101. Lessie, T. G., W. Hendrickson, B. D. Manning, and R. Devereux. Genomic complexity and plasticity of Burkholderia cepacia II FEMS Microbiol. Lett. 1996. -Vol. 144.-P. 117-128.

102. Lew A. E., Desmarchelier P. M. Molecular typing of Pseudomonas pseudomallei'. restriction fragment length polymorphisms of rRNA genes // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol.31. - P. 533 - 539.

103. Lewis K. Multidrug resistance pumps in bacteria: variations on a theme // Trends Biochem. Sci. 1994.-Vol. 19.-P. 119-123.

104. Li L, Lu Z, Han O. Epidemiology of melioidosis in China // Chinese J. Epidemiol. 1994. - Vol. 15. - P. 292 - 295.

105. Li X. Z., Nikaido H., Poole K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic eff in Pseudomonas aeruginosa II Antimicrob. Agents Chemother. 1995. - Vol.39. -P. 1948-1953.

106. Liang SL, Liang H. Pulmonary melioidosis. Report of 4 cases and literature reviewed // Chinese J. Tuberculosis Respir. Dis. 1994. - Vol. 17. - P. 168 - 170.

107. Liu, L., Spilker, T., Coenye, T., LiPuma, J. J. Identification by subtractive hybridisation of a novel insertion element specific for two widespread Burkholderia cepacia genomovar III strains // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 2471 -2476.

108. Ma D., Cook D. N., Hearst J. E. et al. Efflux pumps and drug resistance in gramnegative bacteria // Trends Microbiol. 1994. - Vol 2. - P. 489 - 493.

109. Mack K., Titball R.W. The detection of insertion sequences within the human pathogen Burkholderia pseudomallei which have been identified previously in Burkholderia cepacia IIFMS Microbiol. Let. 1998. - Vol. 162. - P. 69 - 74.

110. Marger M. D., Saier M. H. A major superfamily of transmembrane facilitators that catalyse uniport, simport and antiport // Trends Biochem. Sci. 1993. - Vol. 18. — P. 13-20.

111. Martin D.W., Mohr C.D. Invasion and intracellular survival of Burkholderia cepacia I I Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - P. 24 - 29.

112. Masoud, H., M. Ho, T. Schollaardt, and M. B. Perry. Characterization of the capsular polysaccharide of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei 304b // J. Bacteriol. 1997. - Vol. 179. - P. 5663 - 5669.

113. Messi, P., E. Guerrieri, and M. Bondi. Antibiotic resistance and antibacterial activity in heterotrophic bacteria of mineral water origin // Sci.Total Environ. -2005. Vol. 346.-P. 213-219.

114. Michaux, S., J. Paillisson, M.-J. Carles-Nurit, G. Bourg, A. Allardet-Servent et al. Presence of two independent chromosome in the Brucella melitensis 16M genome II J. Bacteriol. 1993. - Vol. 175. - P. 701 - 705.

115. Miche, L., Faure, D., Blot, M., Cabanne-Giuli, E., Balandreau, J. Detection and activity of insertion sequences in environmental strains of Burkholderia II Environ Microbiol. 2001. - Vol. 3. - P. 766 - 773.

116. Mine T., Morita Y., Kataoka A. Expression in Escherichia coli of a new multidrug efflux pump, MexXY, from Pseudomonas aeruginosa II Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - P. 415 - 417.

117. Mitchell B. A., Brown M. H., Skurray R. A. QacA multidrug efflux pump from Staphylococcus aureus: comparative analysis of resistance to diamidines, biguani-dines, and guanylhydrazones // Antimicrob. Agents Chemother. 1998. - Vol. 42. -P. 475-477.

118. Moore A., DeShazer D., Reckseidler S., Weissman A., Woods D. E. Efflux-mediated aminoglycoside and macrolide resistance in Bnrkholderia pseudomallei H Antimicrob. Agents Chemother. 1999. - Vol. 43. - P. 465 - 470.

119. Moore R. A. and Woods D. E. Effect of verapamil on aminoglycoside MICs in Bnrkholderia pseudomallei // International Congress on Melioidosis. Bangkok. -Thailand. - 1998.

120. Moore, R. A., S. Reckseidler-Zenteno, H. Kim, W. Nierman, Y. Yu et al. Contribution of gene loss to the pathogenic evolution of Bnrkholderia pseudomallei and Bnrkholderia mallei II Infect.Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 4172 - 4187.

121. Nierman, W. C., D. DeShazer, H. S. Kim, H. Tettelin, K. E. Nelson et al. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome II Proc Natl Acad Sci U S A. -2004.-Vol. 101.-P. 14246-14251.

122. Nikaido H. Minireview. Outer membrane barrier as a mechanism of antimicrobial resistance // Department of molecular and cell biology. University of California. -Berkeley. - 1989. - P. 1912 - 1919.

123. Nikaido H. Multidrug efflux pumps of gram-negative bacteria II J. Bacteriol.1996. Vol. 178. - P. 5853 - 5859.

124. Nikaido H. Prevention of drug access to bacterial targets: permeability barriers and active efflux // Science. 1994. - Vol. 264. - P. 382 - 388.

125. Nimtz, M., V. Wray, T. Domke, B. Brenneke, S. Haussler et al. Structure of an acidic exopolysaccharide of Burkholderia pseudomallei // Eur. J. Biochem.1997. Vol. 250. - P. 608 - 616.

126. Niumsup, P., and V. Wuthiekanun. Cloning of the class D beta-lactamase gene from Burkholderia pseudomallei and studies on its expression in ceftazidime-susceptible and resistant strains // J. Antimicrob. Chemother. - 2002. - Vol. 50. P. 445-455.

127. Oh, J. M., E. Kang, K. R. Min, C. K. Kim, Y. C. Kim et al. Structure of catechol 2,3-dioxygenase gene encoded in TOM plasmid of Pseudomonas cepacia G4 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - Vol. 234. - P. 578 - 581.

128. Pages J.M., Masi M., Barbe J. Inhibitors of efflus pumps in gram-negative bacteria II Trends Mol. Med. 2005. - Vol 11. - P. 3 82 - 3 89.

129. Paulsen I. T., Littlejohn T. G., Redstroem P. et al. The 3'- conserved segment of integrons contains a gene associated with multidrug resistance to antiseptics and disinfectants // Antimicrob. Agents Chemother. 1993. - Vol. 37. - P. 761 - 768.

130. Paulsen I. T., Skurray R. A., Tam R. et al. The SMR family: a novel family of multidrug efflux proteins involved with the efflux of lipophilic drugs // Mol. Microbiol. 1996. - Vol. 19.-P. 1167- 1175.

131. Petrucca A., Cipriani P., Sessa R. et al. Burkholderia cenocepacia vaginal infection in patient with smoldering myeloma and chronic hepatitis C // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol. 10. - P. 1957 - 1959.

132. Pilatz, S., K. Breitbach, N. Hein, B. Fehlhaber, J. Schulze et al. Identification of Burkholderia pseudomallei genes required for the intracellular life cycle and in vivo virulence // Infect.Immun. 2006. - Vol. 74. - P. 3576 - 3586.

133. Pons R, Advier M. Melioidosis in Cochin China // J. Hyg. 1927. - Vol. 26. - P. 28-30.

134. Poole K. Bacterial multidrug resistance emphasis on efflux mechanisms and Pseudomonas aeruginosa 11 J. Antimicrob. Chemother. - 1994. - Vol. 34. - P. 453 -456.

135. Prakash, D., A. Chauhan, and R. K. Jain. Plasmid-encoded degradation of p-nitrophenol by Pseudomonas cepacia II Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. -Vol. 224.-P. 375-381.

136. Preston P.J., Lightfoot N., Clarke P. A retrospective serological survey of royal marines previously exposed to Pseudomonas pseudomallei in Southeast Asia // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 1976. - Vol. 70. - P. 335 - 337.

137. Puthucheary SD, Vadivelu J. Human melioidosis // Singapore University Press.2002. 95p.

138. Rainbow, L., C. A. Hart, and C. Winstanley. Distribution of type III secretion gene clusters in Burkholderia pseudomallei, B. thailandensis and B. mallei // J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51. - P. 374 - 384.

139. Rajyaguru, J. M., and M. J. Muszynski. Sensitization of Burkholderia cepacia to antibiotics by cationic drugs // J. Antimicrob. Chemother. 1998. - V. 41. - P. 277-280.

140. Robert J. Multidrug resistance reversal agents // Drug Future. 1997. - Vol. 22. -P. 149-158.

141. Rodley, P. D., U. Romling, and B. Tummler. A physical genome map of the Burkholderia cepacia type strain // Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 17. - P. 57 -67.

142. Rodriguez-Tebar A., F. Rojo, D.Damaso, and D. Vazquez. Carbenicillin resistance of Pseudomonas aeruginosa II Antimicrob. Agents Chemother. — 1982. — Vol. 22.-P. 255-261.

143. Russel P., Eley S.M., Ellis J. et al. Comparison of efficacy of ciprofloxacin and doxycycline against experimental melioidosis and glanders // J. Antimicrob. Chemother. 2000. - V. 45. - P. 813 - 818.

144. Saier M. H. Computer-aided analysis of transport protein sequences: gleaning evidence concerning function, structure, biogenesis and evolution // Microbiol. Rev. 1994. - Vol. 58. - P. 71 - 93.

145. Saiman L., Siegel J. Infection control in cystic fibrosis // J. Clin. Microbiol. Rev. -2004. Vol. 17. -P. 57 - 71.

146. Sajjan U., Wu Y., Kent G., Forstner J. Preferential adherence of cablepiliated Burkholderia cepacia to respiratory epithelia of CF knockout mice and human cystic fibrosis lung explants // J. Med. Microbiol 2000. - Vol. 49. - P. 875 -885.

147. Sermswan R. W., Wongratanacheewin S., Tattawasart U., Wongwajana S. Construction of a specific DNA probe for diagnosis of melioidosis and use as an epidemiological marker of Pseudomonas pseudomallei 11 Mol. Cell. Probes 1994. -Vol.8.-P. 1-9.

148. Shaw D., Poxton I.R., Govan J.R.W. Biological activity of Burkholderia cepacia lipopolysaccharide // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1995. - Vol. 11. - P. 99 -106.

149. Shields, M. S., M. J. Reagin, R. R. Gerger, R. Campbell, and C. Somerville. TOM, a new aromatic degradative plasmid from Burkholderia (Pseudomonas) cepacia G4 // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - Vol. 61. - P. 1352 - 1356.

150. Siriteptawee J., Prinz H., Samosornsuk W. et al. Functional reconstitution, gene isolation and topology modeling of porins from Burkholderia pseudomallei and B. thailandensis II J. Biochem. 2003. - V. 377 - P. 479 - 587.

151. Sivalingam S.P., Sim S.H., Aw L.T., et al. Antibiotic susceptibility of fifty clinical isolates of Burkholderia pseudomallei from Singapore // J. Antimicrob. Chemother. 2006. - V. 55.-P. 1029-1031.

152. Sneath P. H., Sokal R. R. Numerical taxonomy: principles and practice of numerical classification. Freeman: San Francisco, 1973 — 324 p.

153. Sobral, B. W. S., R. J. Honeycutt, A. G. Atherly, and M. McClelland. Electropho-retic separation of the three Rhizobium melilotti replicons // J. Bacteriol. 1991. — Vol. 173.-P. 5173-5180.

154. Sofia H. J., Burland V., Daniels D. L. et al. Analysis of Escherichia coli genome. V. DNA sequence of the region from 76.0 to 81.5 minutes // Nucl. Acids Res. -1994.-Vol. 22.-P. 2576-2586.

155. Songsivilai, S., and T. Dharakul. Multiple replicons constitute the 6.5-megabase genome of Burkholderia pseudomallei 11 Acta Trop. — 2000. Vol. 74. - P. 169 -179.

156. Stevens, M. P., and E. E. Galyov. Exploitation of host cells by Burkholderia pseudomallei 11 Int. J. Med. Microbiol. 2004. - Vol. 293. - P. 549 - 555.

157. Stevens, M. P., J. M. Stevens, R. L. Jeng, L. A. Taylor, M. W. Wood et al. Identification of a bacterial factor required for actin-based motility of Burkholderia pseudomallei II Mol. Microbiol. 2005. - Vol. 56. - P. 40 - 53.

158. Stevens, M. P., M. W. Wood, L. A. Taylor, P. Monaghan, P. Hawes et al. An Inv/Mxi-Spa-like type III protein secretion system in Burkholderia pseudomallei modulates intracellular behaviour of the pathogen // Mol. Microbiol. 2002. -Vol. 46.-P. 649-659.

159. Stokes H. W., Hall R. M. A novel family of potentially mobile DNA elements encodig site-specific gene-integration functions: integrons // Mol. Microbiol. -1989.-Vol.3.-P. 1669- 1683.

160. Strauss J.M., Groves M.G., Mariappan M., Ellison D.W. Melioidosis in Malaysia: II Distribution of Pseudomonas pseudomallei in soil and surface water // Am J. Trop. Med. Hyg. 1969. - Vol. 18. - P. 698 - 702.

161. Summer, E. J., C. F. Gonzalez, T. Carlisle, L. M. Mebane, A. M. Cass et al. Burkholderia cenocepacia phage BcepMu and a family of Mu-like phages encoding potential pathogenesis factors // J. Mol. Biol. 2004. - Vol. 340. - P. 49 - 65.

162. Thibault F.M., Hernandez E., Vidal D.R., Girardet M., Cavallo J.D. Antibiotic susceptibility of 65 isolates of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei to 35 antimicrobial agents // J. Antimicrob.Chemoth. 2004. - Vol. 54.1. P.l 134 1138.

163. Trakulsomboon S., Dance D. A., Smith M. D., White N. J., Pitt T. L. Ribotype differences between clinical and environmental isolates of Burkholderia pseudomallei II J. Med. Microbiol. 1997. - Vol.46. - P. 565 - 570.

164. Vadivelu J, Puthucheary SD, Gendeh GS, Parasakthi N. Serodiagnosis of melioidosis in Malaysia // Singapore Med. J. 1995. - Vol. 36. - P. 299 - 302.

165. Vandamme, P., B. Holmes, T. Coenye, J. Goris, E. Mahenthiralingam et al. Burkholderia cenocepacia sp. nov.- a new twist to an old story // Res. Microbiol. — 2003.-Vol. 154.-P. 91-96.

166. Vandamme, P., E. Mahenthiralingam, B. Holmes, T. Coenye, B. Hoste et al. Identification and population structure of Burkholderia stabilis sp. nov. (formerly Burkholderia cepacia genomovar IV) // J. Clin. Microbiol. — 2000. Vol. 38. - P. 1042- 1047.

167. Vandamme, P., J. Goris, W. M. Chen, P. De Vos, and A. Willems. Burkholderia tuberum sp. nov. and Burkholderia phymatum sp. nov., nodulate the roots of tropical legumes // Syst. Appl. Microbiol. 2002. - Vol. 25. - P. 507 - 512.

168. Vandamme, P., M. Pott, M. Gillis, P. De Vos, K. Kersters et al. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Rev. 1996. -Vol. 60.-407-438.

169. Vermis, K., T. Coenye, J. J. LiPuma, E. Mahenthiralingam, H. J. Nelis et al. Proposal to accommodate Burkholderia cepacia genomovar VI as Burkholderia dolosa sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2004. - Vol. 54. - 689 - 691.

170. Vivian, A., J. Murillo, and R. W. Jackson. The roles of plasmids in phytopatho-genic bacteria: mobile arsenals? // Microbiology. 2001. - Vol. 147. - 763 - 780.

171. Vorachit M., Chongtrakool P., Arkomsean S., Boonsong S. Antimicrobial resistance in Burkholderia pseudomallei II Acta Tropica. 2000. - Vol. 74. - P. 139 - 144.

172. Wang G., Xiao M., Geng X. et al. Horizontal transfer of genetic determinants of phenol between bacteria living in plant and its rhizosphere // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. - Vol. 77. - P. 733 - 739.

173. White, N. J. Melioidosis//Lancet.-2003.-Vol. 361.-P. 1715-1722.

174. Wigley P., Burton N.E. Genotypic and phenotypic relationships in Burkholderia cepacia isolated from cystic fibrosis patients and the environment // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol.86. - P.460 - 468.

175. Winstanley, C., and C. A. Hart. Presence of type III secretion genes in Burkholderia pseudomallei correlates with Ara (-) phenotypes // J. Clin. Microbiol. -2000. Vol. 38. - P. 883 - 885.

176. Winstanley, C., B. A. Hales, and C. A. Hart. Evidence for the presence in Burkholderia pseudomallei of a type III secretion system-associated gene cluster // J. Med. Microbiol. 1999. - Vol. 48. - P. 649 - 656.

177. Wood, M. S., A. Byrne, and T. G. Lessie. IS406 and IS407, two gene-activating insertion sequences for Pseudomonas cepacia It Gene. 1991. - Vol . 105. - P. 101-105.

178. Woods, D. E., A. L. Jones, and P. J. Hill. Interaction of insulin with Pseudomonas pseudomallei II Infect. Immun. 1993. - Vol. 61. - P. 4045 - 4050.

179. Xia, X. S., S. Aathithan, K. Oswiecimska, A. R. Smith, and I. J. Bruce. A novel plasmid pIJBl possessing a putative 2,4-dichlorophenoxyacetate degradative transposon Tn5530 in Burkholderia cepacia strain 2a // Plasmid. 1998. - Vol. 39.-P. 154- 159.

180. Yamagishi, Y., J. Fujita, K. Takigawa, H. Miyawaki, Y. Yamaji. Epidemiological study on nosocomial infection of Pseudomonas cepacia by plasmid analyses // Kansenshogaku Zasshi. 1993. - Vol. 67. - P. 1160 - 1166.

181. Yang S, Tong S, Lu Z. Geographical distribution of Pseudomonas pseudomallei in China // Southeast Asian J. Trop. Med. Publ. Hlth. 1995. - Vol. 26. - P. 636 -638.

182. Yang, S. Melioidosis research in China II Acta Trop. 2000. - Vol. 77. - P. 157 -165.

183. You, I. S., and D. Ghosal. Genetic and molecular analysis of a regulatory region of the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetate catabolic plasmid pJP4 // Mol. Microbiol. 1995. - Vol .16. - P.321 - 331.

184. Zughaier S.M., Ryley H.C., Jackson S.K. A melanin pigment purified from an epidemic strain of Burkholderia cepacia attenuates monocytes respiratory burst activity by scavenging superoxide anion // Infect. Immunol. 1999. - Vol. 67. - P. 908-913.