Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Биологические свойства и принцины идентификации культур группы Burkholderia cepacia

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства и принцины идентификации культур группы Burkholderia cepacia"

На правах рукописи

ЛОБОЙКО Алексей Давидович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА II ПРИНЦИПЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ КУЛЬТУР ГРУППЫ BURKHOLDERIA CEPACIA

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

□03453211

Волгоград - 2008

003453211

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении здравоохранения Волгоградском 1 иуч!ю-исследовакльском противочумном институте Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научный руководитель:

засл. деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор В.И. Илюхин

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор О.Г. Крамарь

кандидат медицинских наук, Е.В. Резников

Ведущая организация: ГОУ ВГ10 «Саратовский государственный медицинский университет»

Защита диссертации состоится « 9 »2008 года в часов на засед:шии диссертационного совета Д 20008.06 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» (400131, г.Волгоград, пл. Павших борцов, д. 1).

Автореферат разослан « 2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор социологических наук доцент

М.Д. Ковалева

Общая характеристика, актуальность проблемы

В род Burkholderia в настоящее время входят более 30 видов грамотрицательных глюкозу неферментируюгцих бактерий, подавляющее большинство которых являются свободноживущими почвенными и водными микроорганизмами. Для медицинской практики имеет значение идентификация и биологические свойства 3-х видов буркхольдерий: В. mallei и В. pseudomallei, являющихся возбудителями особо опасных инфекций (сапа и мелиоидоза), а также В. cepacia, способной в определенных условиях вызывать оппортунистические и нозокомиальные инфекции у больных с иммунодефицитным состоянием (Беляков, 1990).

В. cepacia является убиквитарным микроорганизмом, обладающим уникальным набором приспособительных механизмов, позволяющих ему создавать экологические ниши как во внешней среде, так и в симбиотических состояниях с растениями и животными (Беляков, 1990; Vandamme, 2001; Segonds, Chabanon, 2001; Colwell et al., 1995). Учитывая способность утилизировать широкий набор простых и сложных химических соединений, в том числе и токсических, В. cepacia используется для биоремидиации почвы (Holmes et al., 1998). Однако при этом приходится считаться с тем, что В. cepacia способна вызывать патологические изменения у растений, животных и человека (Rahme et al., 2000; Speert et al., 2002).

B. cepacia является одним из этиологических агентов нозокомиальных инфекций в палатах интенсивной терапии у больных с иммунодефицитным состоянием. Причем течение инфекций, вызванных этой буркхольдерией имеет более неблагоприятный прогноз, чем в случае P. aeruginosa, S. aureus, Enterococcus, Aspergillus (Jones, et al., 2001; Gibson, etal., 2003). Наиболее остро стоит проблема инфекции В. cepacia для больных муковисцидозом, у которых возможно возникновение се/;ас;а-синдрома, характеризующегося

формированием некротической пневмонии и септицемией с неблагоприятным прогнозом (Шагинян, Чернуха, 2003; Hendry et al, 2000; Speert et al., 2002).

Цель рабогы заключалась в изучении культуральных, биохимических, патогенных свойств коллекции культур В. cepacia для установления набора тестов, имеющих принципиальное значение для разработки схемы идентификации и внутривидового тигшрования штаммов В. cepacia.

Задачи исследования:

1. Выявить фенотипические признаки, имеющие принципиальное значение для установления видовой принадлежности культур В. cepacia.

2. Отобрать тесты, необходимые для внутривидового типирования (эпидемиологических маркеров) штаммов В. cepacia.

3. Оценить диапазон чувствительности культур В. cepacia к антибактериальным препаратам с целью разработки терапевтических рекомендаций и создания селективных сред.

4. Разработать практическую схему лабораторной идентификации и дифференциации культур В. cepacia.

Научная новизна:

В результате исследования набора штаммов В. cepacia и филогенетически близких буркхольдерий отобраны основные фенотипические дифференциальные признаки и разработан алгоритм идентификации культур вида В. cepacia.

Показана перспективность использования иммунологических реакций (РДЦ, МФА), особенно на этапе предварительной идентификации.

Изучен спектр чувствительности штаммов В. cepacia к современным химиотерапевтическим препаратам, и даны рекомендации по их использованию в диагностических и лечебно-профилактических целях.

Выявлены фено- и генотипические признаки внутривидовой дифференциации штаммов В. cepacia как факторов эпидемиологического анализа. Приоритетность исследований подтверждается двумя патентами на изобретение, оформленными по материалам диссертационной работы.

Практическая значимость:

Разработана схема идентификации В. cepacia, позволяющая определять вид, геномовары и биовары в условиях клинической бактериологической лаборатории.

На основании изучения спектра чувствительности культур В. cepacia к антибактериальным препаратам, предложен набор антибиотиков, пригодных для химиотерапии и разработки селективных сред.

Материалы диссертационной работы использованы при подготовке «Методических рекомендаций по приготовлению и использованию питательной среды для дифференциальной диагностики патогенных и близкородственных буркхольдерий», утвержденных директором Волгоградского НИПЧИ В.В.Алексеевым 12.12.07 г.

Документация на оформление двух патентов зарегистрирована в Государственном реестре изобретений Российской Федерации: «Селективная среда для выделения возбудителя сапа», № 2007126294 от 12 июля 2007 г и «Штамм бактерий Burkholderia cepacia КМ 203-авирулентный продуцент бактериофага, лизирующего культуры возбудителя сапа», №2007126293 от 12 июля 2007 г. Штамм В. cepacia КМ 203 - авирулентный продуцент сапного бактериофага депонирован в государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» 27.12.06 г.

Положения, выносимые на защиту

1. Отобранные на основе изучения фенотипических свойств культур В. cepacia стабильные и вариабельные признаки позволили создать практическую схему идентификации с определением вида и биоваров штаммов В. cepacia.

2. Иммунологические методы диагностики (РДЦ и МФА) позволяют исключать или отрицать принадлежность культур к виду В. cepacia на стадии предварительной идентификации.

3. Изучение антибиотикочувствительности культур В. cepacia позволяет выявить препараты, рекомендуемые для лечения инфекций (карбапенемы, хинолоны, тетрациклины), а также применяемые при создании селективных сред (полимиксин В, гентамицин, ванкомицин).

4. Идентификация культур вида В. cepacia с помощью автоматических тест-систем (API 20 NE или NEFERM-test) позволяет с высокой степенью достоверности (>90%) установить видовую принадлежность исследуемых культур, однако с целью исключения гипердиагностики за счет филогенетически близких видов буркхольдерий, требует постановки дополнительных лабораторных тестов.

5. Принцип полифазной таксономии требует для окончательной идентификации штаммов В. cepacia комбинированного исследования культур с применением методов генотипического, фенотипического, серологического исследования, позволяющих в конечном итоге установить принадлежность культур не только к виду, но и к определенному био- или геномовару), что имеет важное значение для эпидемиологического анализа инфекций В. cepacia.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь,2007), на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007) а также на научных межлабораторных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в 2007,2008 гг.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, включая 2 патента.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 123 листах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 194 источника, в том числе 47 отечественных и 147 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 8 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

В работе использовали 25 культур В. cepacia, собранных в коллекции Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Большая часть штаммов получена из научных учреждений России, Украины, Франции путем личной переписки, поэтому штаммы не всегда имеют полную характеристику не только фенотипических свойств, но и сведений о месте, времени выделения и способах идентификации. Штамм В. cepacia 1934 -атипичный, дефектный по LDC и протеазе. Штамм В. cepacia 25416 является референтным не только для вида, но и для всего рода Burkholderia, был выделен в 1950 г W.Burkholder из лука.

В сравнительных опытах по изучению селективности сред и ряда биологических свойств использовались 50 штаммов 18 гетерологичных видов, наиболее часто встречающихся в лабораторной медицинской практике. Из числа близкородственных буркхольдерий опыты ставили с В. pseudomallei 107 и VP А (авирулентные штаммы); В. thailartdensis 264, 251, 295.

Для выращивания и поддержания культур В. cepacia использовали набор сред, широко применяемых при работе с буркхольдериями и псевдомонадам и — триптиказо-соевый агар (бульон), мясо-пептонный агар (бульон). При оценке

питательных потребностей (ауксограммы) отдельных штаммов использовали минимальную среду G.Gilardi.

Для выделения В. cepacia из внешней среды и клинического материала использовались селективные среды: среда Мак-Конки с добавлением 600000 ЕД/л полимиксина В и 10 мг/л гентамицина и BCSA с добавлением полимиксина В 600000 ЕД/л, гентамицина 10 мг/л, ванкомицина 10мг/л.

В исследованиях использовали температуру выращивания 37°С, кроме реакций, методика постановки которых требует иную величину температуры. Учет результатов осуществляли через 24 ч.

Все биохимические реакции проводились по общепринятым методикам (Илюхин с соавт., 1998; Сенина, 2004; Gilardi, 1976; Palleroni, 1984;).

При постановке пробы на луке наносили кашпо культуры 107 -108 м.к. на интактные изолированные чешуйки лука или же на срез луковицы. Учет результатов проводили через 24 - 48 ч по методике, описанной Wigley Р. и Burton N.E. (1999).

Для выявления продукции цепациацинов использовали 3 метода: двуслойный, штриховой и метод выращивания штаммов продуцентов в бульоне.

При изучении фагопродукции спектр литической активности фагов буркхольдерий выявляли на индикаторном газоне тест-штамма при посеве методом агаровых слоев по Грациа.

Иммунологические диагностические исследования проведены по стандартным методам, адаптированным к условиям работы с патогенными буркхольдериями (Илюхин с соавт., 1998).

Активность антибактериальных препаратов определяли двумя способами: методом кратных разведений в жидкой питательной среде и методом диффузии в агар (метод дисков).

При идентификации штаммов буркхольдерий по системе NEFERMtest 24 исследование проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору.

Идентификацию бактерий, относящихся к ГНФ типу, проводили с помощью системы API 20 NE. Принцип оценки этим методом заключается в определении кода по 21 качественному признаку, последние сгруппированы в 7 групп.

Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 25 мкл в микроцентрифужных пробирках (500 мкл). Реакционная смесь содержала: ДНК, специфические олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буфер и фермент Taq-полимерэзу. На поверхность смеси наслаивали 30 мкл минерального масла. В качестве отрицательного контроля в пробирку вместо образца вносили такой же объем дистиллированной воды. Амплификацию ДНК проводили на программируемом термоциклере 'Терцик" (НПФ "ДНК-технология", Москва) с использованием "горячего старта".

Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом гель-электрофореза в 1,5 % агарозном геле согласно рекомендациям, изложенным в руководстве Т.Маниатиса с соавт. (1984).

При изучении вирулентности различных по источнику выделения штаммов В. cepacia использовали два вида лабораторных животных - белых мышей и золотистых хомячков. Заражение проводили как интактных животных, так и предварительно обработанных иммунодепрессантами (гидрокортизон, актиномицин Д, четыреххлористый углерод и ацетат свинца), которые существенно повышают чувствительность животных к ряду инфекций. Дозы и время введения иммунодепрессантов - гидрокортизон 5 мг за 3 ч до заражения; ацетат свинца 5 мг одновременно; четыреххлористый углерод 0,2 мл за 48 ч; актиномицин Д - 25 мкг одновременно; все препараты вводили подкожно в область бедра.

Результаты исследований и их обсуждение

Культуры В. cepacia отличаются неприхотливостью роста и успешно культивируются на большинстве широко используемых в лабораторной практике питательных сред. На плотных средах культуры В. cepacia через 24 ч культивирования при 37°С формируют гладкие полупрозрачные колонии, которые через 48 ч достигают размеров 2 - 3 мм светло-коричневого или бежевого цвета. В бульоне через сутки отмечается помутнение культур, на поверхности — тонкая пленка, через 48 ч - на поверхности плотная кремового цвета пленка, бульон мутный, отмечается придонный рыхлый осадок.

При окрашивании по Граму видны розовые, палочковидные бактерии. По размерам и цвету, бактерии В. cepacia не имеют отличий от других видов грамотрицательных бактерий (псевдомонады, эшерихии и т.п.).

Наряду с морфологическими признаками колоний и клеток В. cepacia, биохимическая активность культур, выявляемых в специальных тестах, является основой разработанных в настоящее время диагностических схем и ключей идентификации бактерий, включая и ввд В. cepacia. На основе полученных нами данных и анализа литературных данных, составлена сводная таблица фенотипических свойств буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике. Обращают на себя внимание как обязательные положительные тесты для установления видовой принадлежности культур к виду В. cepacia оксидазная реакция и окисление, но не ферментация глюкозы, а также: наличие лизиндекарбоксилазы и бета-галактозидазы. При этом отрицательными должны быть тесты на аргининдигидролазу, окисление рамнозы и способность образовывать газообразные продукты в тесте на денитрификацию (табл. 1),

Таблица 1. Дифференциальные фенотипические признаки В. cepacia

Тесты В. cepacia В. pseudomallei В. thailandensis B. mallei

Окисление: глюкозы + + + +

фруктозы + + + +

ксилозы + -f + -

лактозы + + + +

мальтозы + + + +

сахарозы + + + -

рамнозы - + + -

Аргининдигидролаза - + + +

Лизиндекарбоксилаза + - - -

Орнитиндекарбоксилаза +/- - - -

ОКРв + - - -

Желатиназа +/- + + +

Денитрификация - + + +

ДНК-аза - - - -

Гидролиз эскулина +/- +/- +/- -

Число жгутиков >1 >1 >1 0

Рост при 4° С - - - -

Рост при 42" С +/- + + -

Полимиксин R R R R

Гентамицин R R R S

Рост при 2,5% ^таС1 +/- - - -

Ассимиляция Ь-арабинозы + - + -

Наличие пигмента +/- - - -

Г+Ц моль% 67 69 68 69

Я-колонии на агаре - -f/- - -

Вирулентность для з/х - + - +

Ауксотрофность - - - -

Примечания: + и - обозначают наличие или отсутствие признака у >90% штаммов данного вида; +/- - замедленная реакция; Я - резистентность; в - чувствительность к антибиотикам

При проведении серологических исследований в диагностических иммунологических реакциях считается вполне пригодной реакция преципитации в геле по Оухтерлони, где в качестве антигена используется густа;! взвесь (> 5x109 м.к./мл) живой культуры испытуемого штамма. В наших опьггах мы использовали для РДД преципитирующую сыворотку, полученную к ацетонвысушенным клеткам референтного штамма В. cepacia 25416. Титр сыворотки к гомологичной культуре в качестве антигена составлял 1:32. При постановке РДД со всеми штаммами В. cepacia и гетерологичными видами буркхольдерий установлено формирование многочисленных полос преципитатов с типичными культурами В. cepacia и формирование 1 или 2 минорных линий с близкородственными видами буркхольдерий. С гетерологичными видами других родов, особенно с культурами микрофлоры из внешней среды (почва, водоемы) формирование преципитатов в РДЦ с сывороткой В. cepacia не отмечалось.

При проведении оценки возможности использования МФА для диагностики В. cepacia, на основе преципитирующей гипериммунной кроличьей сыворотки были получены иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие к антигенам В. cepacia. Для идентификации микроорганизмов использовали мазки-препараты изучаемых культур в концентрации 5x108 м.к./мл по ОСО мутности. Было показано, что МФА позволяет идентифицировать все типичные штаммы В. cepacia при полном отсутствии ложно позитивных случаев идентификации близкородственных буркхольдерий и гетерологичных видов микроорганизмов. Отрицательные результаты в МФА получены с 7 музейными штаммами В.cepacia, которые по фенотипическим признакам не соответствовали критериям соответствия виду В. cepacia.

Определение чувствительности штаммов В. cepacia к антибиотикам и сульфаниламидным препаратам имеет значение, как для назначения адекватной терапии, так и в диагностических целях. Известно, что для буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике, характерна высокая природная

Таблица 2. Чувствительность штаммов В. cepacia к химиотерапевтическим препаратам в методе серийных разведений

Антибактериальные МПК50 S-R интервал Показатели

Препараты Чувствительности

Амоксиклав 64 6-24 R

Ванкомицин >128 >128 R

Гентамицин 64 4-16 R

Доксициклин 16 4-6 R(I)

Имипенем 8 4-16 I

Канамицин 16 8-16 R(I)

Ко-тримаксазол 4 40-80 S

Ломефлоксацин 2 2-8 I(S)

Меропенем 4 4-16 I(S)

Офлоксацин 2 2-8 I(S)

Пиперациллин 8 16-64 s

Полимиксин В >128 >128 R

Рифампицин 8 4-16 I

Спарфлоксацин 2 1-2 R(I)

Сульфаметоксазол 32 100-350 S

Хлорамфеникол 16 8 — 32. I

Цефепим 8 8-32. I(S)

Цефтазидим 2 8-32 s

Цефтриаксон 4 8-64 s

Ципрофлоксацин 1 1-4 I(S)

Примечания: цифровой материал выражен в мкг/мл; МПК50 - медиана 25 показателей; Б - Я интервал определен по МУК 4.2.1890-04; Я, Б, I - резистентный, чувствительный, промежуточный тип устойчивости, соответственно

устойчивость к пенициллинам, полимиксинам и аминогликозидам. Препараты этих типов антибиотиков включаются в селективные и транспортные среды для выделения буркхольдерий из клинического материала и внешней среды.

При оценке чувствительности штаммов В. cepacia имеющиеся в нашем распоряжении штаммы в большинстве своем резистентны или имеют умеренную чувствительность к препаратам, рекомендуемым при лечении заболеваний, вызываемых буркхольдериями и псевдомонадами (табл. 2).

При выделении бактериоцинов двуслойным методом в перекрестном изучении бактериоцинопродукции всех имеющихся у нас штаммов В. cepacia было установлено, что самый чувствительный штамм В. cepacia 3181. Он чувствителен ко многим штаммам-продуцентам бактериоцинов. Самые активные штаммы-продуценты В. cepacia 8237 и 8238. В. cepacia 1934 не является ни штаммом-продуцентом бактериоцинов, ни чувствительным штаммом. Есть штаммы, чувствительные только к одному, двум штаммам-продуцентам (25416, 8235, 8236, 3189,323,423, 506, 122,610, 620).

При изучении фагопродукции методом Грациа, было выявлено, что 6 штаммов В. cepacia (323, 370, 423, 8237, 8238, 8240) продуцируют литические фаги. Наиболее активной по литическому спектру была фагопродукция у штаыма В. cepacia 8238, выявить универсальный индикаторный штамм среди имеющихся культур В. cepacia не удалось.

При изучении вирулентности различных по источнику выделения штаммов В. cepacia на двух видах лабораторных животных - белых мышах и золотистых хомячках показано, что на модели нормальных и иммунодепрессивных животных можно выявлять уровень вирулентности штаммов В.cepacia только при введении максимальных доз уровня 109 м.к.

При постановке пробы на луке из 11 штаммов В. cepacia изменения в луковичной пластине были у 8 штаммов. Мацерации не было у В. cepacia 1934, 8239 и 8240. Наличие мацерации проверялось надавливанием пинцета на луковичную чешуйку. При положительной реакции, особенно выраженной у

штамма В. cepacia 25416, по ходу мацерации отмечалась коричневая пигментация зоны поражения. Е. coli К-12 служила отрицательным контролем.

Основным требованием при разработке схем и ключей при идентификации бактерий является отбор простых и воспроизводимых тестов, которые при своей постановке с .культурами данного вида проявляют в >90 % случаев положительный или отрицательный результат. Дополнительными тестами при первичной идентификации культур В. cepacia могут служить иммунологические реакции при наличии вндоспецифической сыворотки (РДД, МФА), а также постановка теста на антибиотикочувствительность с полимиксином В и аминоглшсозидами (гентамицин), к которым В. cepacia как и другие буркхольдерии в отличие от псевдомонад является резистентной.

При идентификации буркхольдерий по системе Nefermtest 24 было исследовано 28 штаммов. Учет проводился по цветным реакциям, характер которых определен стандартами в соответствии с рисунками, прилагаемыми фирмой к набору тест-системы. Полученные нами данные показывают, что в данной тест-системе вариабельные результаты на тестах, которые при стандартных исследованиях были стабильными. Особенно принципиальными были расхождения в оценке декарбоксилаз и денитрификации. Причем % таких ошибок достаточно высок, а вероятность точности диагностики даже для референтных штаммов, в свою очередь, низкая. Также идентификацию бактерий проводили с помощью системы API 20 NE. Принцип оценки этим методом заключается в определении кода по 21 качественному признаку, последние сгруппированы в 7 групп. Учитывая, что В.cepacia обладает широким спектром ассимилируемых субстратов, а в этой системе идентификации, начиная с 3-й триады, оценивается спектр усвоения различных карбогидратов, становится понятным, что для В. cepacia идентификационный код характерен в своей заключительной части формулы высокими цифровыми показателями типа ХХ77777. Из 15 исследованных штаммов В. cepacia - 12 с вероятностью от 95,2% до 99,9% по определителю относятся к виду В. cepacia, три штамма (320, 5809 и 5812) не являются представителями этого вида. Все

они исключались из вида В. cepacia как при постановке тестов в соответствии с идентификационным ключом, так и при иммунологических исследованиях.

<<3олотым» стандартом в окончательной идентификации культур В. cepacia являются только генотипические методы: ДНК-зонды и ПЦР-диагностика. Получение видо- и геномоспецифических праймеров, как и постановка экспериментов с ПЦР, проведены на базе лаборатории молекулярной биологии совместно с к.м.н., доцентом В.А.Антоновым.

Исследованные 28 штаммов, фенотипически признанные раньше, как культуры В. cepacia или В. gladioli, в ПЦР-тестах с видовыми праймерами четко разграничились на 2 группы, соответствующие результатам, ранее полученными в опытах с МФА. 18 штаммов В. cepacia соответствовали, как по фенотипическим, так и по генотипическим свойствам виду В. cepacia (табл. 3).

Показано, что использование стандартных микробиологических фенотипических методов не позволяет идентифицировать более 10% культур В. cepacia, как в сторону гипердиагностики, так и гиподиагностики. Более того, разработанные современные генотипические методы также не обеспечивают 100% гарантию видовой и внутривидовой таксономической дифференциации штаммов В. cepacia.

Единственно достоверным методом идентификации вида В. cepacia в настоящее время является полифазная таксономия, предусматривающая комплексное исследование изучаемых культур (Vandamme, 2001; Hendry et al, 2000). На основании проведенных исследований с использованием фенотипических, иммунологических и генетических методов нами разработана схема идентификации буркхольдерий (рисунок). Окончательный комплексный уровень идентификации предусматривает как генотипические исследования, так и изучение фенотипических биохимических свойств, белковый профиль клеточных структур, состав жирных кислот. Все это, в конечном счете, позволяет не только исключить гипердиагностику за счет близкородственных В. cepacia-like видов, но и разграничить культуры В. cepacia на геномовары, что важно .для оценки эпидемиологической значимости отдельных штаммов.

Таблица 3. ПЦР-диагностика штаммов В. cepacia

Штаммы ПЦР идентификация Вид по фенотипу МФА С Ig В. cepacia

Вид Геномовар

1. В. cepacia 25416 + I В. cepacia +

2. В. cepaciaЗШ + I В. cepacia +

3. В. cepacia 3189 + I В. cepacia +

4. В. cepacia 122 + I В. cepacia +

5. В. cepacia 610 + I В. cepacia +

6. В. cepacia 611 + I В. cepacia +

7. В. cepacia 620 + I В. cepacia +

8. В. cepacia 621 + I В. cepacia +

9. В. cepacia 1934 + II В. cepacia +

10. В cepacia 8236 + III В. cepacia +

11. В. cepacia 8237 + III В. cepacia +

12. A cepacia 8238 + III В. cepacia +

13. В. cepacia 8240 + III В. cepacia +

14. В. cepacia 506 + III В. cepacia +

15. В. cepacia 323 + III В. cepacia +

16. В. cepacia 423 + III В. cepacia +

17. В. cepacia 370 + III В. cepacia +

18. В cepacia 8235 + IV В. cepacia +

19 В. cepacia 8239 - - не определен -

20. В. серас/л 320 - - не определен -

21. В. cepacia 5809 - - P. aeruginosa -

22. В. cepacia 5810 - - P. putida -

23. В. cepacia 5811 - - P. aeruginosa -

24. В. cepacia 5812 - - P. aeruginosa -

25. В. cepacia 5813 - - P. putida -

26. В. gladioli 1298 - - P. putida -

27. В. gladioli 8494 - - В. cepacia -

28. В. gladioli Ш5 - - S. maltophilia -

МФА

Исследуемый материал (бактериология)

пцр

РДД

Бактериоскопия Грам (-) палочки

Селективная среда

МПГА

(ТС ГА)

Биопроба Золотистые хомячки Белые мыши

РДД ПЦР

МПГА РДД

ТС ГА ПЦР

Определение устойчивости к антибиотикам: попимиксин, гентамицин

■о/ф глюкозы

■оксидаза

■подвижность

•агд-дигидролаза

Чув-декарбоксилаза

•гидролиз желатина

■СЖРС

■рост при 42° С •ассимиляция на МСЖ Ьарабинозы и р-аланина

Рисунок. Схема этапов идентификации буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике

В наших условиях, как впрочем, и в других научно-исследовательских учреждениях полифазность исследований обеспечивается сочетанием генотипических и фенотипических методов. В зависимости от дели исследований и условий идентификации алгоритм первых этапов может существенно отличаться. При нацеленном поиске изучаемая культура, уже на первом этапе выросшая на селективной среде или присланная для окончательной идентификации, может исследоваться как в ПЦР, так и в МФА, методами, не требующими в принципе наличия «чистой» культуры.

ВЫВОДЫ

1. Изучены фенотипические свойства 25 музейных штаммов В. cepacia, установлен набор стабильных и вариабельных признаков для данного вида микроорганизма; на основании стабильных признаков разработана схема для практической, ориентировочной идентификации культур В. cepacia

2. Определены уровни чувствительности штаммоз В. cepacia к 18 химиотерапевтическим препаратам, показана перспективность использования для лечения карбапенемов, хиноленов и ко-тримаксазола. Для разработки селективных сред можно использовать сочетание полимиксинаВ, гентамицина и ванкомицина, к которым все культуры В. cepacia высоко резистентны

3. Патогенность культур В. cepacia на лабораторных животных не коррелирует с фитопатогенностью; при оценке вирулентности штаммов В. cepacia, выделенных из внешней среды и клинического материала, чувствительность животных к инфекции повышается при введении иммуноблокаторов — актиномицинаД или чегыреххлористого углерода

4. Иммунологические методы (РДД, МФА) показали перспективность их использования на этапах предварительной оценки, при этом показано, что в РДД происходит гипердиагностика за счет наличия у

близкородственных буркхольдерий общих антигенов, а МФА высокоспецифичен, нами не отмечены случаи гипер- или гиподиагностики

5. Использование для постановки ПЦР праймеров на основе ДНК гесА гена В. cepacia позволили определять как видовую принадлежность исследуемых культур, так и их инфравидовую характеристику -геномовар

6. Изучена возможность штаммов В. cepacia к фаго- и бактериоцинопродукции, имеющаяся коллекция штаммов разграничена на группы по их способности быть продуцентами или индикаторами, тем самым являясь механизмом типирования культур этого вида

7. Учитывая принципы полифазной таксономии, нам удалось выявить набор биохимических, иммунологических и генетических методов, который обеспечил разработку схемы идентификации культур B.cepacia с установлением не только видовой принадлежности, но и определение геномо- и биоваров исследуемых штаммов

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Андропова Н.В., Лобойко А.Д. Физико-химические факторы, влияющие на результаты оценки чувствительности буркхольдерий к антибиотикам. «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России». Мат. научно-практ. конф. Ставрополь. - 2007. - С. 21 - 22.

2. Калинкина Е.В......Лобойко А.Д. Применение модели простейших для

определения вирулентности штаммов патогенных Burkholderia с множественной резистентностью к антибиотикам. «Международные медико-санит. правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекц. болезнями в государствах-участн. СНГ». Мат. VIII Межг. научно-практ. конф. госуд.-участн. СНГ. - Саратов. - 2007. — С. 212 - 214.

3. Лобойко А.Д. Чувствительность патогенных видов буркхольдерий к антибактериальным препаратам. «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ». Мат. VIII Межгос. научно-практ. конф. государств-участн. СНГ. - Саратов. - 2007. - С. 239 - 240.

4. Сенина Т.В., Лобойко А.Д. Методы выявления и определения специфичности бактериоцинов буркхольдерий. «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ». Маг. VIII Межгос. научно-практич. конф. государств-участн. СНГ. - Саратов. -2007.-С. 287-288.

5. Антонов В.А., Илюхин В.И., Сенина Т.В., Лобойко А.Д. и др. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia. Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунол. - 2008. -№ 4 - С. 78- 82.

6. Решение о выдаче патента на изобретение Сеимова И.К., Илюхин В.И., Меринова Л.К., Сенина Т.В., Лобойко А.Д. и др. «Штамм бактерий Burkholderia cepacia KM 203 - авирулентный продуцент бактериофага, лизирующего культуры возбудителя сапа», №2007126293 от 12 мая 2008г.

7. Заявка на изобретение Жога Л.К., Илюхин В.И., Сенина Т.В., Андропова Н.В., Лобойко А.Д. «Селективная среда для выделения возбудителя сапа», № 2007126294 от 12 июля 2007 г.

8. Сенина Т.В., Лобойко А.Д., Калинкина Е.В. Алгоритм идентификации Burkholderia cepacia. Вестн. Рос. Военно-мед. академ-2008. - С. 201 -202.

9. Сенина Т.В., Лобойко А.Д. Принципы и схема идентификации

буркхольдерий, имеющих значение для медицинской практики.

«Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы

с инфекционными болезнями на территории государств-участников СНГ»

Мат. IX Межгос. научно-практич. конференции государств-участников

СНГ. - Волгоград. - 2008. - С. 276 -277.

Подписано в печать 1.11 08 Усл. печ л 1 Тираж 100 Заказ 500 Издательство - полиграфический комплекс ВГСХЛ «Нива» 400002, Волгоград, Университетский пр-т, 26

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Лобойко, Алексей Давидович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Экологические особенности и медицинское значение

В. cepacia

1.2. Основные фенотипические свойства и принципы идентификации В.cepacia

1.3. Таксономия и внутривидовое типирование бактерий группы В. cepacia.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы

2.2. Питательные и селективные среды

2.3. Морфологические методы

2.4. Биохимические диагностические реакции

2.5. Методы выявления продукции цепациацинов и фагов и определения чувствительности к ним штаммов бурк- 44 хольдерий

2.6. Иммунологические реакции

2.7. Определение чувствительности к антибактериальным средствам

2.8. Постановка реакций в автоматических системах идентификации

2.9. Генетические методы диагностики

2.10. Статистическая обработка результатов

Глава 3. ФЕНОТИПИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА В. CEPACIA

3.1. Изучение характера роста культур В. cepacia на различных средах

3.2. Особенности морфологии клеток

3.3. Биохимические свойства

3.4. Иммунологические реакции в идентификации культур

В. cepacia

3.5. Чувствительность штаммов В. cepacia к антибактериальным препаратам

3.6. Определение активности и специфичности продукции цепациацинов и фагов

3.7. Вирулентность В. cepacia в опытах in vivo и in vitro

Глава 4. ПОСТАНОВКА ТЕСТОВ ДЛЯ ПРЕДВАРИТЕЛЬНОЙ

ОРИЕНТИРОВОЧНОЙ) ИДЕНТИФИКАЦИИ В. CEPACIA

4.1. Отбор диагностических признаков для первичной идентификации штаммов В. cepacia

4.2. Оценка профилей в автоматических идентификационных системах

Глава 5. АЛГОРИТМ ОКОНЧАТЕЛЬНОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ В. CEPACIA

5.1. Генотипирование культур В. cepacia

5.2. Принципы полифазной таксономии и алгоритм иденти -фикации В. cepacia

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические свойства и принцины идентификации культур группы Burkholderia cepacia"

В род Burkholderia в настоящее время входят более 30 видов грамотрицательных глюкозу неферментирующих бактерий, подавляющее большинство которых являются свободноживущими почвенными и водными микроорганизмами. Для медицинской практики имеют значение идентификация и биологические свойства 3-х видов буркхольдерий: В. mallei и В. pseudomallei, являющихся возбудителями особо опасных инфекций (сапа и мелиоидоза), а также В. cepacia, способной в определенных условиях вызывать оппортунистические и нозокомиальные инфекции у больных с иммунодефицитным состоянием [4].

В. cepacia является убиквитарным микроорганизмом, обладающим уникальным набором приспособительных механизмов, позволяющих ему занимать экологические ниши, как во внешней среде, так и в симбиотических состояниях с растениями и животными [4, 73, 168,176]. Учитывая способность утилизировать широкий набор простых и сложных химических соединений, в том числе и токсических, В. cepacia используется для биоремидиации почвы [106]. Однако при этом приходится считаться с тем, что В. cepacia способна вызывать патологические изменения у растений, животных и человека [160, 168, 171].

Наиболее остро стоит проблема инфекции В. cepacia для больных муковисцидозом, у которых возможно возникновение cepacia-синдрома, характеризующегося формированием некротической пневмонии и септицемии с неблагоприятным прогнозом [46, 101, 171]. Проблемы лечения больных с В. серас/а-инфекциями усложняются высокой устойчивостью этого микроорганизма к большинству современных антибиотиков, причем в ходе лечения возможно появление полирезистентных клонов, поэтому цикл химиотерапии этих пациентов длительный и базируется на комплексном сочетании антибиотиков с разным механизмом действия [75, 86].

Диагностика инфекций, вызванных В. cepacia, в настоящее время весьма несовершенна, идентификация культур и их внутривидовая дифференциация, как средство эпидемиологического анализа, требует высокого уровня подготовки специалистов и наличия специальных средств генетической диагностики. Это возможно обеспечить только в специализированных центрах, в обычных клинических лабораториях выделение и идентификация культур В. cepacia происходит довольно редко, чаще всего подобные культуры идентифицируются как «необычные» псевдомонады или глюкозу неферментирующий вид бактерий [4]. В лабораториях, располагающих полуавтоматическими системами идентификации типа API, Nefermtest, Vitek, культуры В. cepacia идентифицируются чаще, однако этим методом они не дифференцируются на геномовары (виды группы В. cepacia) и не позволяют отличить от В. cepacia ряд близкородственных видов буркхольдерий.

Особенно опасны случаи неточности определения вида на уровне идентификации филогенетически близких возбудителей особо опасных инфекций В. mallei и В. pseudomallei как В. cepacia, что приводит к нарушениям режима работы и внутрилабораторным инфекциям [166].

Цель работы: изучение культуральных, биохимических, патогенных свойств коллекции культур В. cepacia для установления набора тестов, имеющих принципиальное значение для разработки схемы идентификации и внутривидового типирования штаммов В. cepacia.

Задачи исследования:

1. Выявить фенотипические признаки, имеющие принципиальное значение для установления видовой принадлежности культур В. cepacia.

2. Отобрать тесты, необходимые для внутривидового типирования (эпидемиологические маркеры) штаммов В. cepacia.

3. Оценить диапазон чувствительности культур В. cepacia к антибактериальным препаратам с целью разработки терапевтических рекомендаций и создания селективных сред.

4. Разработать практическую схему лабораторной идентификации и дифференциации культур В. cepacia.

Научная новизна.

В результате исследования набора штаммов В. cepacia и филогенетически близких буркхольдерий отобраны основные фенотипиче-ские дифференциальные признаки и разработан алгоритм идентификации культур вида В. cepacia.

Показана перспективность использования иммунологических реакций (РДД, МФА), особенно на этапе предварительной идентификации.

Изучен спектр чувствительности штаммов В. cepacia к современным химиотерапевтическим препаратам, и даны рекомендации по их использованию в диагностических и лечебно-профилактических целях.

Выявлены фено- и генотипические признаки внутривидовой дифференциации штаммов В. cepacia как факторов эпидемиологического анализа. Приоритетность исследований подтверждается двумя патентами на изобретение, оформленными по материалам диссертационной работы.

Теоретическая и практическая значимость. Проведенные исследования по идентификации буркхольдерий показали необходимость комплексных исследований с применением морфологических, биохимических, иммунологических,и генетических методик, т. е. представлены доказательства необходимости использования принципов полифазной таксономии для идентификации и типирования бактерий рода Burkholderia.

Разработана схема идентификации В. cepacia, позволяющая определять вид, геномовары и биовары в условиях клинической бактериологической лаборатории. В лекционно-практический курс отдела подготовки специалистов по особо опасным инфекциям введен раздел принципов полифазной таксономии буркхольдерий, позволяющий на современном уровне устанавливать как видовую принадлежность, так и проводить инфравидовое разграничение исследуемых культур буркхольдерий.

На основании изучения спектра чувствительности культур В. cepacia к антибактериальным препаратам, предложен набор антибиотиков, пригодных для химиотерапии и разработки селективных сред.

Материалы диссертационной работы использованы при подготовке «Методических рекомендаций по приготовлению и использованию питательной среды для дифференциальной диагностики патогенных и близкородственных буркхольдерий», утвержденных директором Волгоградского НИПЧИ В.В.Алексеевым 12.12.07 г.

Штамм В. cepacia КМ 203 - авирулентный продуцент сапного бактериофага депонирован в государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» 27.12.2006 г. Получен патент на изобретение №2339690 от 27.11. 2008 г «Штамм бактерий Burkhoideria cepacia -авирулентный продуцент бактериофага, лизирующего культуры сапа». Получено решение о выдаче патента на изобретение от 05.05.2009 г «Питательная среда для выделения возбудителя сапа», заявка № 2007126294, дата подачи заявки 10.07.2007 г.

Положения, выносимые на защиту:

1) отобранные на основе изучения фенотипических свойств культур В. cepacia стабильные и вариабельные признаки позволили создать практическую схему идентификации с определением вида и биоваров штаммов В. cepacia;

2) иммунологические методы диагностики (РДД и МФА) позволяют исключать или отрицать принадлежность культур к виду В. cepacia на стадии предварительной идентификации;

3) изучение антибиотикочувствительности культур В. cepacia позволяет выявить препараты, рекомендуемые для лечения инфекций (карбапенемы, хинолоны, тетрациклины), а также применяемые при создании селективных сред (полимиксин В, гентамицин, ванкомицин).

4) идентификация культур вида В. cepacia с помощью автоматических тест-систем (API 20 NE или NEFERM-test) позволяет с высокой степенью достоверности (>90 %) установить видовую принадлежность исследуемых культур, однако с целью исключения гипердиагностики за счет филогенетически близких видов буркхольдерий, требует постановки дополнительных лабораторных тестов;

5) принцип полифазной таксономии требует для окончательной идентификации штаммов В. cepacia комбинированного исследования культур с применением методов генотипического, фенотипического, серологического исследования, позволяющих в конечном итоге установить принадлежность культур не только к виду, но и к определенному био- или геномовару), что имеет важное значение для эпидемиологического анализа инфекций В. cepacia.

Апробация работы.

Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007), на VIII Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007), а также на научных межлабораторных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в 2007, 2008 гг.

Публикации результатов исследований.

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе одна издана в периодическом издании из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получен один патент на изобретение.

Структура и объем работы.

Диссертация изложена на 125 листах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы, включающего 194 источника, в том числе 47 отечественных и 147 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 8 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Лобойко, Алексей Давидович

выводы

1. На основании исследования фенотипических свойств 25 музейных штаммов В. cepacia, установлен набор стабильных и вариабельных признаков для данного вида микроорганизма; на основании стабильных признаков разработана схема для практической, ориентировочной идентификации культур В. cepacia.

2. Определены уровни чувствительности штаммов В. cepacia к 18 химиотерапевтическим препаратам, показана перспективность использования для лечения карбапенемов, хинолонов и ко-тримаксазола. Для разработки селективных сред можно использовать сочетание полимиксинаВ, гентамицина и ванкомицина, к которым все культуры В. cepacia высоко резистентны.

3. Патогенность культур В. cepacia на лабораторных животных не коррелирует - с фитопатогенностью; • при оценке вирулентности штаммов В. cepacia, выделенных из внешней среды и клинического материала, чувствительность животных к инфекции повышается при введении иммуноблокаторов - актиномицина Д или четырех-хлористого углерода.

4. Иммунологические методы (РДД, МФА) показали перспективность их использования на этапах предварительной оценки, при этом показано, что в РДД происходит гипердиагностика за счет наличия у близкородственных буркхольдерий общих антигенов, а МФА-высокоспецифичен, нами не отменены случаи гипер- или ги-подиагностики.

5. Использование для постановки ПЦР праймеров на основе ДНК гесА гена В. cepacia позволили определять как видовую принадлежность исследуемых культур, так и их инфравидовую характеристику - геномовар. 1 '

6. Установлена способность штаммов В. cepacia к фаго- и бакте-риоцинопродукции, имеющаяся коллекция штаммов разграничена на группы по их способности быть продуцентами или индикаторами, тем самым являясь механизмом типирования культур этого вида. 7. Учитывая принципы полифазной таксономии, нам удалось выявить набор биохимических, иммунологических и генетических методов, который обеспечил разработку схемы идентификации культур В.cepacia с установлением не только видовой принадлежности, но и определение геномо- и биоваров исследуемых штаммов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для идентификации культур, подозрительных на принадлежность к патогенным видам Burkholderia необходимо наряду с обязательными биохимическими тестами (декарбоксилазы, |3-галактоза, окисление Сахаров и оценка способности усваивать пентозы) проводить иммунологические исследования !(РДД, МФА).

2. При эпидемиологическом анализе нозокомиальных вспышек инфекции В.cepacia в качестве эпидемиологического маркирования нужно применять метод ПЦР для разграничения культур на геномовары.

3. В программу курсов отдела подготовки специалистов по особо опасным инфекциям рекомендуем ввести лекционно-практический раздел по принципам полифазной таксономии буркхольдерий, позволяющий на современном уровне устанавливать как видовую принадлежность, так и проводить инфравидовое разграничение исследуемых культур буркхольдерий.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Лобойко, Алексей Давидович, Ставрополь

1. Авроров, В.П. К вопросу об инактивации чумного мышиного токсина печенью и лейкоцитами белых крыс / В.П. Авроров, В.И. Илюхин // Бюлл. эксперим. биол. мед. 1970. - № 9. - С. 27 - 28.

2. Антонов, Ю.В. Чувствительность псевдомонад к современным антибактериальным препаратам / Ю.В. Антонов, В.И. Илюхин, Л.Д. По-повцева//Антибиотики и химиотерапия. -1991. № 1. - С. 14-16.

3. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев М.: Медгиз. - 1962. -180с.

4. Беляков, В.Д. Псевдомонады и псевдомонозы / В.Д. Беляков, Л.А. Ряпис, В.И. Илюхин М.: Медицина. -1990. -224 с.

5. Блинкова, Л.П. Бактериоцины: критерии, классификация, свойства, методы выявления / Л.П. Блинкова // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол:- —2003, № 3. - С. 109 - 113. ■

6. Блохина, И.Н. Систематика бактерий (с основами геносистематики) / И.Н. Блохина, Г.Ф. Леванова, А.С. Антонов Нижний Новгород, 1992. -170 с.

7. Будченко, А.А. Сравнительный анализ электрофореграмм суммарных клеточных белков патогенных буркхольдерий / А.А. Будченко, В.И. Илюхин, Д.В. Викторов // Мол. генет. микробиол. вирусол. -2005. № 2. - С. 24 - 28.

8. Додатко, Т.А., Бактериоцинотипирование штаммов Pseudomonas cepacia, выделенных от-больных и ризосферы растений / Т.А. Додатко, Е.А. Киприанова, В.В. Смирнов II Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1989. - № 1. - С. 21 - 26.

9. Додатко, Т.А. Биологическая активность и физико-химические свойства нового бактериоцина из штамма Pseudomonas cepacia 5779 / Т.А. Додатко, Е.А. Киприанова, В.В. Смирнов // Микробиол. журн.1989.-№ 4.-С. 68-74.

10. Ильина, Т.С. Биопленки как способ существования бактерий в окружающей среде и организме хозяина: феномен, генетический контроль и системы регуляции их развития / Т.С. Ильина, Ю.М. Романова,

11. A.Л. Гинцбург II Генетика. 2004. - № 11. - С. 1 - 12.

12. Илюхин, В.И. Псевдомонадные инфекции в патологии человека /

13. B.И. Илюхин //Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1985. - № 2.-С. 110-114.

14. Илюхин, В.И. Влияние актиномицинаД на чувствительность белых мышей к чумной интоксикации и инфекции / В.И. Илюхин, Н.П. Нико-лаенко, В.П. Авроров // Пробл. особо опасн. инфекций Саратов. -1972. -Вып.2.-С.124 -127.

15. Илюхин, В.И. Burkholderia thailandensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция / В.И. Илюхин, Т.В. Сени-на, Н.Г. Плеханова // Мол. генет. микробиол. вирусол. 2002. - № 1.1. C. 7-11.

16. Исхакова, Х.И Неферментирующие грамотрицательные бактерии и дифференциация их от Pseudornonas aeruginosa /Х.И. Исхакова, Л.Г. Баженов, Н.Г. Шабанова //Журн. гигиены эпидемиол. микробиол и иммунол.-1982.-Т. 26. С. 403-413.

17. Капранов,-НИ:' Антибиотикотерапия'муковисцидоза у детей / Н.И. Капранов, Л.А. Шабалова, Н.Ю. Каширская // Антибиот. химиотер. -2001. №2. - С. 26-32.

18. Капранов, Н.И. Муковисцидоз. Достижения и проблемы на современном этапе / Н.И. Капранов, Н.Ю. Каширская, Н.В. Петрова // Мед. генетика. 2004. - № 9. - С. 398 - 412.

19. Лабораторная-диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза (методические рекомендации). 1.10.94. / Утверждено Г.Г.Онищенко / -Волгоград, 1994. -62 с.

20. Литвин, В.Ю. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий / В.Ю. Литвин, А.Л. Гинцбург, В.И. Пушкарева М., 1998. - 256 с.

21. Медников, Б.М. Молекулярные-основы концепции биологического вида / Б.М. Медников // Рос. хим. журн. -1995. Т. 39, № 2. - С. 30 -38.

22. Мерков, A.M. Санитарная статистика / A.M. Мерков, Л.Е. Поляков. -Л., 1974.- — 384- с.» -.• '

23. Методы общей бактериологии / под ред. Ф. Герхарда. М. - 1983. -Т. 1.-536 с.

24. Опасные инфекционные заболевания / под ред. В.В. Алексеева. -Волгоград, 2006. 368 с.

25. Определитель грамотрицательных потенциально патогенных бактерий возбудителей внутрибольничных инфекций. Методические рекомендации. - М, 1986. - 36 с.

26. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. Методические указания МУК 4.2.1890 04. - М., 2004. - 90 с.

27. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. М.: Мир, 1997. - 2 т.

28. Патент 2144079 РФ. Штамм бактерий Pseudomonas cepacia ВДК ВКПМ В-7559-деструкгор фенола и формальдегида / И. И. Денисов, Н.Г. Тихонов, В.И. Илюхин. № 98110597/13; заявл. 4.06.98; опубл. 10.01.2000, Бюл. № 1.-4 с.

29. Пивень, Н.Н. Антигенный анализ возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности: дис.докт.мед. наук: 03.00.07 / Н.Н. Пивень Волгоград, 1997. - 296 с.t

30. Пивень, Н.Н. Перспективы исследования общих, перекрестнореа-гирующих и видовых антигенов у некоторых видов бактерий рода Pseudomonas /Н.Н. Пивень // Микробиол. журн.,1987. № 3. - С. 6 -10.

31. По'повцева, Л.Д.* Поиск оптимальной схемы идентификации возбудителя мелиоидоза: дис.канд. мед. наук: 03.00.07 / Л.Д. Поповцева -Волгоград, 1985. 115 с.

32. Пушкарева, В.И. Burkholderia cepacia в разных экологических условиях: численность и изменчивость бактериальной популяции / В.И. Пушкарева, В.В. Величко, А.А. Каминская // Журн. микробиол. эпиде-миол. иммунобиол. 2005. - № 3. - С. 39. - 44.

33. Рубан, Е.Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas / Е.Л. Рубан М.,1986. - 200 с.

34. Ряпис/ Л.А* Лабораторная диагностика Клинически значимых видов псевдомонад / Л.А. Ряпис, В.И. Илюхин, Е.И. Вострова // Лаб. дело. -1988.-№12.-С. 66-71.

35. Сенина, Т.В. Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике: дис.канд. биол. наук: 03.00.07 / Т.В. Сенина. Волгоград, 2004. -124с.

36. Смирнов, В.В. Pseudomonas / В.В. Смирнов, Е.А. Киприанова. -Киев: Наукова думка, 1990. 264 с.

37. Специфическая" индикация патогенных биологических агентов / под ред. Г.Г.Онищенко. М, 2006. - 288 с.

38. Студеникин, М.Я. Актуальные проблемы муковисцидоза / М.Я.

39. Студеникин, В. Чупиг М, 1977. - 196 с.

40. Тарасов, В.Н. Автоматизация диагностики бактериальных и вирусных инфекций / Итоги науки и техники, серия «Микробиология» // В.Н. Тарасов. М. - 1987. - Т. 18. - 244 с.

41. Ткаченко, Г.А. Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции / Г.А. Ткаченко, В.А. Антонов, B.C. Замараев // Мол. генет. 2003, - № 3. - С. 18 - 22.

42. Чернуха, М.Ю. Исследование вирулентных свойств госпитальных штаммов бактерий комплекса Burkholderia cepacia, выделенных в стационарах города Москвы / М.Ю. Чернуха, Г.В. Алексеева, И.А. Шаги-нян //Журн. микробиол. 2005. - № 6. - С. 46-51.

43. Чернуха, М.Ю. Изучение молекулярно-генетических механизмов патогенности бактерий родов Pseudomonas и Burkholderia / М.Ю. Чернуха, В.П. Ковтун, Т.Н. Николаева, И.А. Шагинян // Клин. лаб. диагн. -2001.-№11.-С. 40-41.

44. Шагинян, И.А. Бактерии комплекса Burkholderia cepacia: особенности диагностики, организации генома и метаболизма / И.А. Шагинян, М.Ю. Чернуха // Мол. генет. 2003. - № 2. - С. 3 - 10.

45. Шендеров, Б.А. Простые схемы идентификации неферментирую-щих грамотрицательных бактерий / Б.А. Шендеров, Г.П. Серкова // Вопросы биохимии и физиологии микроорганизмов. Саратов. - 1980. -вып. 8. - С. 60-71.

46. Aaron, S.D. Multiple combination bactericidal antibiotic testing for patients with cystic fibrosis infected by Burkholderia cepacia / S.D. Aaron, W. Ferris, D.A. Henry et al. //Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2000. - Vol.161. -P. 1206-1212.

47. Abe, K. Outbreak of Burkholderia cepacia bloodstream infection at an outpatient hematology and oncology practice / K. Abe, M.T. D'Angelo, R. Sunenshine // Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 2007. - Vol. 11. - P. 1311 -1313.

48. Agodi, A. Burkholderia cepacia complex infection in Italian patients with cystic fibrosis: prevalence, epidemiology and genomovar status / A. Agodi, E. Mahenthiralingam, M. Barchitta // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. -P. 2891 -2896.

49. API 20 NE. Analytical profile index/Bio Merieux S.A., 6 edition, 1997. -254 p.

50. Ashdown,4 L:R: An improved screening-technique for isolation of Pseu-domonas pseudomallei from clinical specimens / L.R. Ashdown // Pathology. -1979. Vol. 11, N2.-P. 293-297.

51. Aygencel, G. Burkholderia cepacia as a cause of ecthyma gangreno-sum-like lesion / G. Aygencel, M. Dizbay, G. iSahin // Infection. 2007. -oct 25. - P. 124-128.

52. Baldwin, A. Multilocus sequence typing scheme that provides both species and strain differentiation for the Burkholderia cepacia complex / A. Baldwin, E. Mahenthiralingam, K. Thickett et al. // J. Clin. Microbiol. 2005.-Vol. 43.-P. 4665-4673.

53. Baldwin, A. Elucidating the global epidemiology of Burkholderia multi-vorans in cystic fibrosis by multilocus sequence typing / A. Baldwin, E. Ma-henthiralingam, P. Drevinek // J. Clin. Microbiol. 2007. - Vol. 45. - P. 3645 - 3649.

54. Ballard, R.W. Taxonomy of aerobic pseudomonads: Pseudomonas cepacia, P.marginata, P.alliicola and P.caryophilli / R.W. Ballard, N.J. Palle-roni, M. Doudoroff//J. Gen. Microbiol. 1970.-Vol. 60. - P. 199-214.

55. Bauernfield, A. Discrimination of Burkholderia gladioli from other Burkholderia species detectable in cystic fibrosis patients by PCR / A. Bauernfield, I. • Schneider,-R. Jungwirth, C. Roller//!J. Clin. Microbiol. 1998. -Vol. 36.-P. 2748-2751.

56. Baxter, I.A. Isolation from clinical sources of Burkholderia cepacia possessing characteristics of Burkholderia gladioli/ I.A. Baxter, P.A. Lambert, I.N. Simpson // J. Antimicrob. Chemother. 1997. - Vol. 39. - P. 169 -175.

57. Beckman, W. Response of Pseudomonas cepacia to £ lactam antibiotic: utilization of penicillin G as carbon source / W. Beckman, T.G. Lessie^ //J. Bacteriol. - 1979. - Vol. 140. - P.'1126 - 1128.

58. Bergan*T. Human and animal pathogenic member of the genus pseudomonas/Т. Bergan // In: Procariotes. Berlin, 1981. - Vol. 1. - P. 666 -700.

59. Bernier, S.P. Comparative analysis of plant and animal models for characterization of-Burkholderia cepacia virulence / S.P. Bernier, L. Silo-Suh, D.E.Woods//Infect. Immun. -2003.-Vol. 71.-P. 5306-5313.

60. Berriatua, E. Outbreak of subclinical mastitis in a flock of diary sheepassociated with Burkholderia cepacia complex infection / E. Berriatua, J.

61. Ziluaga, C. Miguel-Virto // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 990 -994 - т.,-.-.

62. Bremmelgaard, A. Differentiation between Pseudomonas cepacia and Pseudomonas pseudomallei in clinical bacteriology / A. Bremmelgaard // Acta Pathol. Microbiol. Scand. 1975. - Vol. - 83. - P. 65 - 70.

63. Burkholder, W.H. Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs / W.H. Burk-holder //-Phytopathology. 1950. - Vol. 64. - P. 468 - 475.

64. Brisse, S. Comparative evaluation of the BD Phoenix and Vitek 2 automated instruments for identification of isolates of the Burkholderia cepacia complex / S. Brisse, S. Stefani, J. Verhoef et al. // J. Clin. Microbiol. -2002. Vol. 40. - P. 1743 - 1748.

65. Burns; ii:'Burkholderia cepacia infection in cystic fibrosis / J. Burns, L. Saimon//Pediatr. Infect. Dis. 1999.-Vol. 15.-P. 155-156.

66. Chiu, C.H. Adherence of Burkholderia cepacia to respiratory tract epithelial cells and inhibition with dextrans / C.H. Chiu, S. Wong, R.E. Hancock, D.P. Speert// Microbiol. -2001. Vol. 147. - P. 2551 -2558.

67. Coenye, T. Taxonomy and identification of the Burkholderia cepacia complex / T. Coenye, P. Vandamme, J.R.W. Govan, J.J. Li Puma//J. Clin. Microbiol.-2001.-Vol.39, N10.-P. 3427-3436.

68. Coenye, T. Updated version of the Burkholderia cepacia complex expe-rimentarstrain;pan§l7T."Coenye,"P. Vandamme, J.J. Li Puma//J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 2797 - 2798.

69. Colwell, R.R. Polyphasic taxonomy of the genus vibrio: numerical taxonomy of vibrio cholerae, vibrio parahaemolyticus and related vibrio species/R.R. Colwell // J. Bacteriol. 1970. - Vol. 104. - P. 410-433.

70. Colwell, R.R. The microbial species concept and biodiversity / R.R. Colwell, R.A. Clayton, B.A. Ortiz-Conde // In: "Microbial diversity and ecosystem function", ed. By D.Colwell, DJ. Hawsworth // Oxon. 1995. - P. 3 -15.

71. Conway, B.A. Biofilm formation and acyl homoserine lactone production in the Burkholderia cepacia complex / B.A. Conway, V. Venu, D.P. Speert // J. Bacteriol. 2002. - Vol. 184. - P. 5678 - 5685.

72. Conway, S.P. Antibiotic treatment of multidrug-resistant organisms in cystic fibrosis / S.P. Conway, R.G. Brownlee, M. Denton, D.G. Peckham // Am. J. Respir. Med. 2003. - Vol. 2. - P. 321 - 332.

73. Corey, M. Determinants of mortality from cystic fibrosis in Canada, 1970 1989. I M. Corey, V. Farewell II Am. J. Epidemiol. - 1996. - Vol. 143.-P. 1007-1017.

74. Di Cello, F. Biodiversity of a Burkholderia cepacia popylation isolated from the maize rhizosphere at different plant growth stades / F.A. Di Cello, A. Bevivino, L. Chiarini // Appl. Envir. Microbiol. 1997. - Vol. 63. - P. 4485-4493.

75. Difco manual // Detroit, 9-th ed, 1985. 1155 p.

76. Dijkshoorn, L. Strain, clone, and species: comments on three basic concepts of bacteriology / L. Dijkshoorn, B.M. Ursing, J.B. Ursing //J. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 49. - P. 397 - 401.

77. Drevinek/P. Genomovar distribution of the Burkholderia cepacia complex differs significantly between Czech and Slovak patients with cystic fibrosis / P. Drevinek, O. Cinek, J. Melter // J. Med. Microbiol-2003. Vol. 52. - P. 603 - 604.

78. Esanu, J.G. Zur Taxonomic und Nomenclatur von Pseudomonas cepacia /J.G. Esanu, R.H.W. Schubert//Zentr. Bakteriol. Parasit. Infect. Hyg. -1973. Vol. 224. - P. 478 - 483.

79. Estivariz, C.F. An outbreak of Burkholderia cepacia associated withcontamination of albuterol and nasal spray / C.F. Estivariz, L.I. Bhatti, R. Pati//Chest. 2006. - Vol. 130.-P. 1293-1296.

80. Faure, R. En route to a carbohydrate based vaccine against Burkholderia cepacia / R. Faure, T.C. Shiao, D. Lagnoux // Org. Biomol. Chem. -2007.-Vol. 16.-P. 2704-2708.

81. Fiore, A. Burkholderia cepacia complex: distribution of genomovars among isolates from the maize rhizosphere in Italy / A. Fiore, S. Laevens, A. Bevevino // Environ. Microbiol. 2001. - Vol. 3. - P. 137 - 143.

82. Garrity, G.M. Taxonomic outline of the prokaryotes. Bergeys manyal of systematic bacteriology / G.M. Garrity, K.L. Johnson, J. Bell, D.B. Searles // New York, Springer-Verlag. 2002. - 2-nd ed. - P. 58 - 60.

83. Gibson, R.L. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis / R.L. Gibson, J.L. Burns, B.W. Ramsey // Am. J. Resp. Crit. Care Med. -2003. Vol. 168. - P. 918 - 951.

84. Gilardi, G.L. Characterization of Pseudomonas species / G.L. Gilardi II Appl. Microbiol. 1971. - Vol. 21. - P. 414-419.

85. Gilardi, G.\E: Pseudomonas species in clinical microbiology / G.L. Gilardi // Mount Sinai. J. Med. 1976. - Vol. 43. - P. 710 - 726.

86. Gilardi, G.L. Identification of Pseudomonas and related bacteria / G.L. Gilardi // In: Glucose nonfermenting Gramnegative bacteria in clinical microbiology ed. by G.Gilardi. 1978. - P. 16— 44.

87. Gonzales,'C^F.' Bacteriocin, plasmid and1 pectolytic diversity in Pseudomonas cepacia of clinical and plant origin / C.F. Gonzales, A.K. Vidover //J. Gen. Microbiol. 1979. - Vol. 110. - P. 161 - 170.

88. Govan, J.R.W. Burkholderia cepacia friend and foe / J.R.W. Govan, J. Balendreau, P.- Vandamme // ASM News. - 2000. - Vol. 66. - P. 124

89. Govan, J.R.W. Evidence for transmission of Pseudomonas cepacia by social contact in cystic fibrosis / J.R.W. Govan, P.H. Brown, J. Maddison // Lancet. 1993. - Vol. 342. - P. 15 - 19.

90. Govan, J.R.W. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia /J.R.W. Govan, V. Deretic // Microbiol. Rev. 1996. - Vol. 60. - P. 539 - 574.

91. Govan, J.R.W. Typing of Pseudomonas cepacia by bacteriocin susceptibility and production / J.R.W. Govan, G. Harris // J. Clin. Microbiol. -1985. Vol. 22, N 4. - P. 490 - 494.

92. Govan, J.R.W. Burkholderia cepacia: medical, taxonomic and ecological issues / J.R.W. Govan, J.E. Hughes, P. Vandamme //J. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 45. - P. 395 - 407.

93. Hadrys, H'/Applications of random amplified polymorphic DNA (RAPD) in molecular ecology / H. Hadrys, M. Balick, B. Schrierwater // Mol Ecol. -1992.-Vol. 1.-P. 55-63.

94. Hamil, R. An ontbreak of Burkholderia cepacia respiratory tract colonization and infection associated with nebulized, albuterol therapy / R. Hamil, E. Houston, P. Georghion et al. // Ann: Intern. Med. 1995. - Vol. 15 - P. 762 - 766.

95. Heidt, А. О and H serotyping of Pseudomonas cepacia /А. Heidt, H. Monteil, C. Richard // J. Clin. Microbiol. 1983. - Vol. 18. - P. 738 - 740.

96. Hendry, J. Antibody response to Burkholderia cepacia in patients with cystic fibrosis colonized with Burkholderia cepacia and Pseudomonas aeruginosa / J. Hendry, S. Butler, J.S. Elborn // J. Infect. 2000. - Vol. 40. -P. 164-170.

97. Henry, D.A. Identification of Burkholderia cepacia isolates from patients with cystic fibrosis and use of a simple new selective medium / D.A. Henry, M.E. Campbell, J.J. Li Puma //J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, N3.-P. 614-619.

98. Henry, D. Comparison of isolation media for recovery of Burkholderia cepacia complex from respiratory secretions of patients with cystic fibrosis / D. Henry, M. Campbell, C. McGimpsey // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N4.-P. 1004-1007.

99. Henry, D.A. Phenotipic methods for determining genomovar status of the Burkholderia cepacia complex / D.A. Henry, E. Manenthiralingam, P. Vandamme//J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N 3. - P. 1073- 1078.

100. Herasimenka, G. Macromolecular properties of cepacian in water and in dimethylsulfonide / G. Herasimenka, P. Cescutti, N. Sampaio // Carbo-hydr. Res. 2007. - N 10. - P. 570 - 575.

101. Holmes, A. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia: a threat to human health? / A. Holmes, J.R.W. Govan, R. Goldstein // Emerg. Infect. Dis. 1998. - Vol. 4, N 2. - P. 221 - 227.

102. Holmes, A. An epidemic of Burkholderia cepacia transmitted between patients with and without cystic fibrosis / A. Holmes, R. Nolan, R. Taylor // J. Infect. Dis. 1999. - Vol. 179.-P. 1197- 1205.

103. Homma, I. Production of antibiotic of Pseudomonas cepacia as an agent for biological control of soil borne pathogens /1. Homma, Z. Sato, F. Hioyama // Soil Biol. Biochem. 1989. -Vol. 21. - P. 723 - 728.

104. Hu, F.P. Biocidal activity in plant pathogenic Acidovorax, Burkholderia, Herbaspirillum, Ralstonia and Xanthomonas spp. / F.P. Hu, L.M. Young // J. Appl. Microbiol. 1996. - Vol. 84. - P. 263-271.

105. Hutchison, M.L. Burkholderia cepacia produces a hemolysin that is capable of inducing apoptosis and degranulation of mammalian phagocytes / M.L. Hutchison, I.R. Poxton, J.R.W. Govan // Infect. Immun.1998. Vol. 66. - P. 2033 - 2039. .

106. Isles, A. Pseudomonas cepacia infection in cystic fibrosis: an emerging problem / A. Isles, M. Maclusky, M. Corey // J. Pediatr. 1984. - Vol. 104.-P. 206-210.

107. Janda, J.M. Bacterial identification for publication: When is enough enough? / J.M. Janda, S.L. Abbot И J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol. 40, N6.-P. 1887-1891.

108. Jones, A.M. Burkholderia cepacia: current clinical issues, environmental controversies and ethical dilemms / A.M. Jones, M.E. Dodd, A.K. Webb //Eur. Respir. J. 2001.-Vol. 17.-P. 295-301.

109. Jhons, P.A. Characterization of pseudomonas species for identification in the clinical laboratory / P.A. Jhons, R.G. Tisher // Amer. J. Med. Technol. 1973. - Vol. 39. - P. 495 - 500.

110. Keig, P.M. Differential invasion of respiratory epithelial cells by members of the Burkholderia cepacia complex / P.M. Keig, E. Ingham, P. Vandamme, K.G. Kerr // J. Clin. Microbiol. Infect. 2002. - Vol. 8. - P. 47 -49.

111. Keith, K.E Burkholderia cenocepacia С 5424 produces a pigment with antioxidant properties using a homogentisate / K.E. Keith, L. Killip, P. He // J. Bacteriol. 2007. - N. 10-P. 565-571.

112. Kenna, D.T. Lack of correlation between O-serotype, bacteriophage susceptibility and genomovar status in the Burkholderia cepacia / D.T. Kenna, V.A. Barcus, R.L. Langley // Immunol. Med. Microbiol. 2003. -Vol.35. - N 2. - P. 87 - 92.

113. Kenny, D.L. In vitro susceptibilities of Burkholderia mallei in comparison to those of other patogenic Burkholderia spp / D.L. Kenny, P. Russell, D. Rogers //Antimicr. Agents and Chemotherapy. 1999. - Vol. 43, N 11. -P. 2773 - 2775.

114. Kilian, K., Novel therapeutic possibilities in cystic fibrosis / K. Kilian, B.M. Kisiel // Pol. Merkur. Lekarski. 2006. - Vol. 119. - P. 586 - 590.

115. King, A. The identification of pseudomonads and related bacteria in a clinical laboratory I A. King, I. Phillips // J. Med. Microbiol. 1978. - Vol. 11, N 2. - P.165 - 176.

116. King, E. Population density of the biocontrol agent Burkholderia cepacia AMMDR 1 on four pea cultivars / E. King, J. Parke // Soil Biol. Biochem. 1996. - Vol. 28. - P. 306 - 312.

117. Kiratisin, P. Accuracy of commercial systems for identification of Burkholderia pseudomallei versus Burkholderia cepacia / P. Kiratisin, P. Santa-nirand, S. Kaewdaeng // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2007. - Vol.59. -P.277 — 281.

118. Koh, Т.Н.- Automated identification systems and Burkholderia pseudomallei /Т.Н. Koh, Ng L.S.Y., J.L.F. Ho et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. -Vol. 41.-P. 1809.

119. Krueger, T.S. In vitro susceptibility of Stenothrofomonas maltophilia to various antimicrobial combination / T.S. Krueger, E.A. Clark, D.B. Nix // Diagn: Microbiol. Infect. Dis. 2001. - Vol. 41.! - P. 71 -78.

120. Kutty, P.K. Multi-state outbreak of Burkholderia cenocepacia colonization and infection associated with the use of intrinsically contaminated alcohol-free mouthwash / P.K. Kutty, B. Moody, G. Smartt // Chest. 2007. -Vol. 132.-P. 754-761.

121. Langleey/"R. Lysogeny and bacteriophage host range within the Burkholderia cepacia complex / R. Langleey, D.T. Kenna, P. Vandamme // J.

122. Med. Microbiol: 2003. - Vol. 52. - P. 483 - 490.

123. Lee, C.H. Cepacidine A, a novel antifungal antibiotic produced by Pseudomonas cepacia / C.H. Lee,; S. Kim, B. Hyun // J. Antibiotics. -1994. Vol. 47. - P. 1402 - 1405.

124. Lennon, E.PIasmids of Pseudomonas cepacia of diverse origins / E. Lennon, B.T. De Cicco // Appl. Envir. Microbiol. 1991. - Vol. 57. - P. 2345 - 2350.

125. Lessie, T.G. Genomic complexity and plasticity of Burkholderia cepacia /Т.G. Lessie, W. Hendrickson, B.D. Manning, R. Deveruex // FEMS Microbiol. Let. 1996! - Vol. 144. - P. 117 - 128.

126. Li, X. Antifungal activity of a novel compound from Burkholderia cepacia against plant pathogenic fungi / X. Li, C.S. Quan, S.D. Fan // Lett. Appl. Microbiol. 2007. - Vol. 5. - P. 508 - 514.

127. Liou, T.G: Lung transplantation and survival in children with cystic fibrosis / T.G. Liou, F.R. Adler, D.R. Cox, B.C. Cahill // N. Engl. J. Med. -2007. Vol. 21. - P. 2143 - 2152.

128. LiPuma, J.J. Person-to-person transmission of Pseudomonas cepacia between patients with cystic fibrosis / J.J. LiPuma, S.E. Dasen, D.W. Niel-son // Lancet. 1990. - Vol. 336. - P. 1094 - 1096.

129. LiPuma, J.J. Commercial use of Burkholderia cepacia / J.J. LiPuma J.J., E. Mahenthiralingam // Emerg. Infect. Dis. 1999. - Vol. 5, N 2. - P. 305 - 306.

130. LiPuma;?J.J.-Isolation of soil-borne genomovar III Burkholderia cepacia and lytic phages with interspecies host range / J.J. LiPuma, E. Mahenthiralingam, G.L. Mark, C.F. Gonzales // Pediatr. Pulmonol. 2000. - Vol. 20. - P. 288 - 289.

131. Liu, P.V= Analytical serology of pseudomonadaceae / P.V. Liu II Analytical serology of microorganisms. Interscience Publishers, ed. J. Kwa-pinski. 1969. - Vol. 2. - P. 1 - 44.

132. Lu, D. Burkholderia cepacia bacteria: a retrospective analysis of 70118w . J -I.-.: - .-i, , '„' .' - < i-i i .-*episodes / D. Lu, S. Chang, I. Chen // J. Formos. Med. Assoc. 1997. -Vol. 96. - P. 972 - 978.

133. Mack, K. The detection of insertion sequences within the human pathogen Burkholderia pseudomallei which have been identified previously in Burkholderia cepacia / K. Mack, R.W. Titball // FMS Microbiol. Let. 1998. -Vol. 162.-P. 69-74.

134. Mariappan V. Identification of common immunodominant secretory antigens between Burkholderia cepacia and Burkholderia pseudomallei / V. Mariappan, K.M. Vellosamy, J. Suppiah // The 5-th world melioidosis congress, Khon Kaen, Thailand, 2007. P. 153.

135. Martin, D.W. Invasion and intracellular survival of Burkholderia cepacia /D.W. Martin, C.D. Mohr// Infect.' Immun.- 2000. Vol. 68. - P. 24-29.

136. Molin, G. Numerical taxonomy of psychrotrophic Pseudomonas / G. Molin, A. Ternstrom // J. Gen Microbiol. 1982. - Vol. 128. - P. 1249 -1264.

137. Monteil, H. Pseudomonas cepacia: intered epidemiologique de la de-terminantion des serogroups О des souches hospitalieres / H. Monteil, C. Richard, A. Heidt//Med. Mai. Infect. 1981.-Vol. 11. - P. 544-547.

138. Nzula, S. Sensitivity of the Burkholderia cepacia complex and Pseudomonas aeruginosa to transducing bacteriophages / S. Nzula, P. Van-damme, J.R.W. Govan // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 26.-P. 307-312.

139. Nzula, S. Influence of taxonomic status on the vitro antimicrobial susceptibility Burkholderia cepacia complex / S. Nzula, P. Vandamme, J.R.W. Govan // J. Antimicrob. Chemother. 2002. - Vol. 50 - P. 265 - 269.

140. OToole.-G. Biofilm- formation as microbial development / G. OToole, H.B. Kaplan, R. Kolter // Ann. Rev. Microbiol. 2000. - Vol. 54. - P. 49 -79.

141. Otterbein, C.K. Development and characterization of a murine monoclonal antibody reactive with a 64 kDa somatic antigen of Burkholderia cepacia /С.К. Otterbein, W.D. Splettstoesser// Hibridoma. 1998. - Vol. 17, N2.-P. 143-150.

142. Palleroni, N.J. Family of Pseudomonadaceae / N.J. Palleroni // Ber-geys manual of systematic bacteriology. Baltimore, 1984. - Vol. 1. - P. 141 -199.^ . 1 r. . ,, .

143. Palleroni, N.J. Pseudomonas cepacia sp. nov., nom. rev. / N.J. Palleroni, B. Holmes //Int. J. Syst. Bacteriol. 1981. - Vol. 31. - P. 479-481.

144. Parke, G.L. Diversity of the Burkholderia cepacia complex and implications for risk assessment of biological control strains / G.L. Parke, D. Gu-rian-Sherman // Ann. Rev. Phytopathol. 2001. - Vol. 39. - P. 225 - 258.

145. Payne, G.W. Development of a rec A Gene-based identification approach for the entire Burkholderia genus / G.W. Payne, P. Vandamme, S.H. Morgan //Appl. Envir. Microbiol. 2005.-Vol.71. - P.3917 - 3927.

146. Pegues, D.A. Acquisition of Pseudomonas cepacia at summer camps for patients with cystic fibrosis / D.A. Pegues, L.A. Carson, O.C. Tablaer //

147. J. Pediatr. 1994. - Vol. 124. - P. 694 - 702.

148. Petrucca, A. Burkholderia cenocepacia vaginal infection in patient with smoldering myeloma and chronic hepatitis С / A. Petrucca, P. Cipriani, R. Sessa // Emerg. Infect. Dis. 2004. - Vol. 10. - P. 1957 - 1959.

149. Pickett, M. Q. Characterization of saccharolytic nonfermentive bacteria associated withman / M.Q. Pickett, M.M. Pedersen // Can. J. Microbiol. -1970.-Vol. 16.-P. 401 -409.

150. Pitt, T.L. Bacteriocin typing /T.L. Pitt, M.A. Gaston // Methods Molecular Biol. 1995. - Vol. 46. - P. 5 - 14.

151. Rabkin, C.S. Pseudomonas cepacia typin systems: collaborative study to assess their potential in epidemiologic investigations / C.S. Rabkin, W.R. Garvis, R.L. Anderson // Rev. Infect. Dis. 1989. - Vol. 11. - P. 600 - 607.

152. Rahme, L.G. Plants and animal share functionaly common bacterial virulence factors / L.G.^Rahme, F.M. Ausubel, H. Cao // Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. - Vol. 97. - P. 8815 - 8821.

153. Rosenfeld, M. Early pulmonary infection, inflammation and clinical outcomes in infant with cystic fibrosis / M. Rosenfeld, R.L. Gibson, S. Mc Namara // Pediatr. Pulmonol. 2001. - Vol. 32. - P. 356 - 366.

154. Rosenstein, B.J. Cystic fibrosis foundation consensus panel: the diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement / B.J. Rosenstein, G.R. Cutting//J. Pediatr.-1998.-Vol. 132.-P. 589-595.

155. Rossello Mora, R. The species concept for prokaryotes / R. Rossello - Mora,"R. Amann'// FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 25. - P. 39 - 67.

156. Saiman, L. Infection control in cystic fibrosis / Saiman L., Siegel J.// J. Clin. Microbiol. Rev. 2004. - Vol. 17.-P. 57-71.

157. Sajjan, U. Preferential adherence of cablepiliated Burkholderia cepacia to respiratory epithelia of CF knockout mice and human cystic fibrosis lung explants / U. Sajjan, Y. Wu, G. Kent, J. Forstner// J. Med. Microbiol-2000. Vol. 49. - P. 875 - 885.

158. Schlech, W.F. Laboratory-acquired infection with Pseudomonaspseudomallei (melioidosis) /W.F. Schlech, J.B. Turchik, R.E. Westlake// N. Engl. J. Med. 1981. - Vol.305. - P.1133- 1135.

159. Schwab, U. Patterns of epithelial cell invasion by different species of the Burkholderia cepacia complex in we 11-differentiated human airway epi-thelia / U. Schwab, M. Leigh, C. Ribero // Infect. Immunol. 2002. - Vol. 70.-P. 4547-4555.

160. Segonds, C. Burkholderia cepacia: les dangers d un microorganism phytopathogene pour les patients atteints de mucoviscidose / C. Segonds, G. Chabanon // Ann. Biol. Clin. 2001. - Vol. 59. - P.259 - 269.

161. Shaw, D. Biological activity of Burkholderia cepacia lipopolysaccharide / D. Shaw, I.R. Poxton, J.R.W. Govan // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -1995.-Vol: 11.-P. 99-106.

162. Shelly, D.B. Utility of commercial systems for identification of Burkholderia cepacia complex from cystic fibrosis sputum culture / D.B. Shelly, T. Spilker, E.J. Gracely // J. Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 3112 -3115.

163. Speert, D.P. Epidemiology of Burkholderia cepacia complex in patients with cystic fibrosis, Canada / D.P. Speert, D. Henry, P. Vandamme // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8. - P. 181 - 187.

164. Summer, E.J. Burkholderia cenocepacia phage BcepMu and a family of Mu-like phages encoding potential pathogenesis factors / E.J. Summer, C.F. Gonzalez, T. Carlisle // J. Mol. Biol. 2004. - Vol. 340 - P. 49 - 65.

165. Suppiah, G. Development of polymerase chain reaction assay to detect Burkholderia genus and to differentiate the species in clinical specimens / G. Suppiah, P.G. Bagali, G. Vadivelu // the 5-Th world melioidosis congress, Khon Kaen. 2007. - P.245.

166. Thomassen, M.J. Pseudomonasf,cepacia colonization among patients in cystic fibrosis: a new opportunist /.M.J. Thomassen, C.A. Demko, J.D. Klinger, R.C. Stern // Am. Rev. Respir. Dis. 1985. - Vol. 131. - P. 791 -796.

167. Ursing, J.В. Taxonomic note: a pragmatic approach to the nomenclature of phenotypically similar genomic groups / J.B. Ursing, R.A. Rossello-Mora, E. Garcia-Valdes, J. Lalucat // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. - Vol. 45. - P. 604.

168. Vandamme, P. Polyphasic taxonomy in practice: the Burkholderia cepacia challenge / P. Vandamme // Newsletter. 2001. - Vol. 34. - P. 17 -24.

169. Vandamme, P. Burkholderia cenocepacia sp. nov. A new twist to an old story / P. Vandamme, B. Holmes, T. Coenye // Res. Microbiol. -2003. -Vol.154.-P. 91 -96.

170. Vandamme, P. Occurrence of multiple genomovars of Burkholderia cepacia in cystic fibrosis patients and proposal of Burkholderia multivorans sp. nov. / P. Vandamme, B. Holmes, M. Vancanneyt // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - Vol. 47. - P. 1188 - 1200.

171. Vandamme, P. Polyphasic taxonomy,- a consensus approach to bacterial systematics / P. Vandamme, B. Pot, M. Gillis // Microbiol. Rev-1996.-Vol.60.-P. 407 438.

172. Van Pelt, C. Identification of Burkholderia spp. in the clinical microbiology laboratory: comparison of conventional and molecular methods / C. Van Pelt,*C:Mr Verduin,- W.H.F. Goessens //rj. Clin. Microbiol. 1999. -Vol. 37, N7.-P. 2158-2164.

173. Vermis, K. Proposal to accommodate Burkholderia cepacia genomo-var VI as Burkholderia dolosa sp. nov. / K. Vermis, T. Coenye, J.J. LiPuma // Int. J. Evol. Microbiol. -2004. Vol. 54. - P.-689 -691.

174. Vermis, K. Evalution of species-specific rec A-based PCR tests forgenomovar level identification within the Burkholderia cepacia complex / K. Vermis, Т. Coenye, E. Mahenthiralingam // J. Med. Microbiol. 2002. -Vol. 51. -P. 937-940.

175. Vinion-Dubiel, A.D. Correlation of wbil genotype, serotype, and isolated source within species of the Burkholderia cepacia complex / A.D. Vinion-Dubiel, T. Spilker, C.R. Dean // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42. -P. 4121 -4126.

176. Wang, G. Horizontal transfer of genetic determinants of phenol between bacteria living in plant and its rhizosphere / G. Wang, M. Xiao, X. Geng // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. - Vol. 77. - P. 733 - 739.

177. Welsh, J. Fingerprinting genoms using PCR with arbitrary primers / J. Welsh, M. McClelland // Nucleic Acids Res. 1990. - Vol. 18. - P. 7213 -7218.

178. Werneburg, B. New serotypes of Pseudomonas cepacia / B. Werne-burg, H. Monteil//Res. Microbiol. 1989. - Vol. 140. - P. 17-20.

179. Whitby, P.W. Species-specific PCR as a tool for the identification of Burkholderia gladioli /P.W. Whitby, L.C. Pope, K.B. Carter // J. Clin. Microbiol. 2000. -Vol. 38. - P. 282 - 285.

180. Wigley, P. Genotipic and phenotypic relationships in Burkholderia cepacia isolated from cystic fibrosis patients and the environment / P. Wigley, N.E. Burton I I J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 86. - P. 460 - 468.

181. Wigley, P. Multiple chromosomes in Burkholderia cepacia and B. gladioli and their distribution in clinical and environment strains of B. cepacia / P. Wigley, N.E. Burton II J. Appl. Microbiol. 2000. - Vol. 88. - P. 914 -918.

182. Wilcox, W.R. A review of numerical methods in bacterial identification / W.R. Wilcox, S.P. Lapage, B. Holmes // Antonie Leeuwenhoek. 1980. -Vol. 46. - P. 233-299.

183. Zanetti, F. Recovery of Burkholderia pseudomallei and B. cepacia from drinking water / F. Zanetti, G. De Luca, S. Stampi // Int. J. Food Microbiol. 2000. - Vol. 59 - P. 67 - 72