Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике

Сенина, Татьяна Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике"

На правах рукописи ТОЛ«/—

СЕНИНА Татьяна Васильевна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ДИАГНОСТИКА БУРКХОЛЬДЕРИЙ, ИМЕЮЩИХ ЗНАЧЕНИЕ В МЕДИЦИНСКОЙ ПРАКТИКЕ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Волгоград - 2004

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор ИлюхинВ.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Попов Ю. А

доктор медицинских наук, профессор Швиденко И.Г.

Ведущая организация: Государственный научный центр

прикладной микробиологии (п. Оболенск).

Защита диссертации состоится GotiKdf/кя- 2004 года в "jQ *часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» Минздрава России (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб».

Автореферат разослан 41» Ciétye^L g.2004 года.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор биологических наук Слудский А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время борьба с инфекциями во всем мире приобретает особый характер, так как расширение международных контактов создает большие возможности для распространения из эндемичных природных очагов даже редко обнаруживаемых патогенных видов микроорганизмов, в том числе возбудителей сапа и мелиоидоза, относящихся к роду Burkholderia (В.И.Илюхин, 1985,1999; Yang S, 2000; Leelarasamee A, 2004).

Патогенные буркхольдерии (возбудители сапа и мелиоидоза), вызывают тяжелые инфекционные заболевания человека и многих видов животных и относятся к потенциальным агентам биотерроризма, как возбудители особо опасных инфекций. Плановых лабораторных исследований, направленных на выявление данных возбудителей в нашей стране практически не проводится. Диагностические препараты (как иммунологические, так и генетические) имеются на разных фазах разработок только в специализированных научно-исследовательских учреждениях и фактически не доступны для практических медицинских и ветеринарных лабораторий, в которых автоматические системы идентификации из-за своей дороговизны также отсутствуют. Учитывая высокую патогенность данных микроорганизмов для человека и многих видов животных, многообразие клинических форм заболеваний, отсутствие средств

специфической профилактики и недостаточную эффективность химиотерапии, очевидна актуальность разработки и совершенствования схем идентификации возбудителей мелиоидоза и сапа - Burkholderiapseudomallei и B.mallei.

Представленные в диссертации материалы получены в ходе выполнения в ВолгНИПЧИ плановой государственной тематики по лабораторной диагностике и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза, в частности тем № 2-027 - 98 и №084 - 3 - 01.

Цель работы - изучение культуральных, биохимических и патогенных свойств культур B.pseudomallei, B.mallei, B.cepacia и B.thailandensis для выявления набора тестов имеющих значение в разработке дифференциальных схем идентификации.

Задачи исследования

1. Оценить значимость различных идентификационных тестов, применяемых при дифференциальной диагностике буркхольдерий.

2. Изучить вирулентность штаммов буркхольдерий, филогенетически расположенных в системе сапрофит {B.cepacia, B.thailandensis), незавершенный паразит {B.pseudomallei), паразит {B.mallei).

3. Сопоставить резистентность буркхольдерий к антибактериальным препаратам, красителям и детергентам.

4. Изучить различия по отдельным углеводородам, используемым различными видами буркхольдерий в качестве источника углерода и энергии.

5. Разработать схемы идентификации буркхольдерий, имеющих медицинское значение^а различных таксономических уровнях (род, вид, биовар).

Научная новизна

Охарактеризованы гено — и фенотипические свойства буркхольдерий, необходимые для разработки диагностических и профилактических средств, а

также для расшифровки механизмов реализации патогенности возбудителей сапа и мелиоидоза

Впервые в основу разработки схемы идентификации патогенных буркхольдерий заложены принципы полифазной. таксономии, предусматривающие сочетанное применение генетических, биохимических, иммунологических методик при окончательном определении таксономической позиции изучаемого штамма.

Выявлены наборы основных дифференциальных тестов фенотипических свойств буркхольдерий, позволившие составить диагностические ключи для определения рода, вида и биоваров идентифицируемых культур возбудителей сапа мелиоидоза и близкородственных им буркхольдерий.

Впервые в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза для учебных целей (курсы бактериологов, учения по индикации возбудителей ООИ) вместо убитых клеток В.р8еМота11е1 предложена живая культура гетерологичного непатогенного вида B.thailandensis, имеющего высокую степень идентичности биохимических культуральных и антигенных свойств с возбудителем мелиоидоза.

Практическая значимость

Определены наборы идентификационных признаков различных видов буркхольдерий, позволяющие создать практические схемы их дифференциальной диагностики, пригодные для микробиологических лабораторий.

Написаны "Методические рекомендации по постановке диагностических тестов, необходимых для внутривидовой дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза (индивидуальная карта штамма)", утвержденные директором института д.м.н. Алексеевым В.В. 25. 06. 2003 г, протокол № 6.

Материалы настоящего исследования использованы при написании глав "Практического пособия для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму", утвержденного Руководителем Департамента Госсанэпиднадзора РФ С.И.Ивановым 06.11.03.

Штамм Burkholderia thailandensis B-9 депонирован в Саратовском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», как. B.thailandensis KM 161 с формулировкой: перспективный в качестве учебного штамма-имитатора возбудителя мелиоидоза. Документация на оформление патента на этот штамм отправлена в Российское агентство по патентам «и товарным знакам. «Штамм бактерий Burkholderia thailandensis KM - 161 авирулентный имитатор возбудителя мелиоидоза»: заявка № 2004112706 от 26.04.04.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Предложенная схема идентификации буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике, позволяет на основе известных лабораторных тестов определить принадлежность культур к видам, входящим в группы pseudomallei и cepacia.

2. Степень идентичности' B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis в биохимических, иммунологических и генетических диагностических тестах позволяет считать их биоварами одного вида, целесообразность сохранения их видового статуса в медицинской микробиологии определяется практическими (эпидемиологическими) задачами.

3. Идентификацию буркхольдерий с помощью автоматических тест- систем и упрощенных диагностических ключей на заключительном этапе необходимо дополнять набором специфических для каждого вида тестов, включающих определение вирулентности, антибиотикограмму, постановку

иммунологических и генотипических тестов, чтобы соответствовать основным положениям полифазной таксономии.

4. Принадлежность к особо опасным видам (B. mallei и B.pseudomallei), предопределяет целесообразность на ранних этапах проведение ускоренных идентификационных иммунологических и генетических методик (РА, МФА, ПЦР) с последующим подтверждением диагноза стандартными бактериологическими методами.

5. Штаммы B.thailandensis по своим биохимическим и антигенным свойствам, учитывая их непатогенность, могут быть рекомендованы как имитаторы возбудителя мелиоидоза при проведении учений и занятий по диагностике и индикации ООИ.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на научных институтских конференциях ВолгНИПЧИ в 2001 и 2002 гг., а также представлены на 4-ой интернациональной конференции по "Emerging zoonoses" (Ames, Iowa, USA, September 18-21,2003).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, двух глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 188 источников, в том числе 66 отечественных и 122 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 10 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы

В опытах исследованы следующие культуры буркхольдерий: 61 штамм B.pseudomallei, выделенных в различных географических регионах (Юго Восточной и Передней Азии, Западной Африке, Северной Австралии), 16 штаммов - B.mallei европейского и азиатского происхождения, 10 штаммов -B.cepacia, 5 штаммов B.thailandensis, 1 штамм - Pseudomonas aeruginosa 4000,1 штамм - Escherichia coli K-12, 1 штамм - Yersinia pestis EV, 1 штамм -Stenotrophomonas maltophilia 4131, все из коллекции ВолгНИПЧИ.

Культуры буркхольдерий и других гетерологичных видов выращивали на стандартных средах - Nutrient agar (МПА) и Tryptic soy agar (TCA) ("Difco" USA) с добавлением 4% глицерина.

Оценку спектра усвоения различных органических соединений в качестве источника углерода и энергии проводили на минимальной среде Gilardi.

При определении активности антибактериальных препаратов методом кратных разведений в жидкой питательной среде использовали бульон Antibiotic medium 3 ("Difco", USA), а для сульфаниламидов - Mueller Hinton broth ("Difco", USA).

При определении активности антибактериальных препаратов методом дисков использовали агар Antibiotic medium 2 ("Difco", USA).

В работе использовались селективные среды:

для выделения B.pseudomallei (LAshdown, 1979) - TCA ("Difco" USA) с добавлением 5 мг/л кристалл виолетта 50 мг/л нейтрального красного, 4 мг/л гентамицина;

для выделения B.cepacia (Henry D., Campbell M., McGimpsey С et al. 1999) BCSM - TCA (DifcoUSA) с добавлением 600000 ЕД/л полимиксина, 10 мг/л гентамицина 2,5 мг/л ванкомицина

для выделения B.mallei (Жога Л.К., Илюхин В.И., Самыгин В.М. 1995): ТСА ("Difco"USA) с добавлением 10 мг/л ампициллина, 2,5 мг/л полимиксина, 2,5 мг/л генциана фиолетового-

В исследованиях использовали температуру выращивания ЪТС, кроме реакций, методика постановки которых требует иную величину температуры. Учет результатов осуществляли через 24 ч, для возбудителя сапа через 48 ч.

Все биохимические реакции проводились по общепринятым методикам (Gilardi.G.L., 1976; PaUeroni,N.L., 1984; Илюхин'В.И. с соавт., 1998) При постановке пробы на луке наносили каплю культуры 107 - 108 м.к. на интактные изолированные чешуйки лука или же на срез луковицы. Учет результатов проводился по методике, описанной Wigley P. и Burton N.E. (1999).

Иммунологические диагностические исследования проведены по стандартным методам, адаптированным к условиям работы с патогенными буркхольдериями (Храпова Н.П. с соавт., 1995).

Активность антибактериальных препаратов определяли двумя способами — методом кратных разведений. в жидкой питательной среде и методом диффузии в агар (метод дисков).

Антибактериальную активность препаратов, не относящихся к химиотерапевтическим средствам (красители, спирты, детергенты и т.п.), оценивали только первым методом (кратных разведений).

Инфицирование и иммунизация животных. Бактериальную суспензию суточной культуры исследуемых штаммов вводили в объеме 0,5 мл 0,85% NaCl подкожно в паховую зону бедра. Вирулентность культур изучали на золотистых хомячках и морских свинках. LD50 рассчитывали по Керберу. Заражающую дозу вводили через 28 дней после иммунизации. Доза заражения 200 LD50 культуры вирулентного штамма B.pseudomallei 100. Результаты опыта оценивали через 60 дней. с учетом, данных аутопсии выживших лабораторных, животных. Оценка достоверности различий выживаемости

между иммунизированными и контрольными группами животных проведена по методу Фишера

При идентификации штаммов буркхольдерий по системе Nefermtest 24 исследование проводили согласно инструкции, прилагаемой к набору.

Для трансформации использовали хлороформные лизаты клеток штаммов' B.pseudomallei С 141, B.mallei- Ц 4,. а также лизаты всех- пяти- штаммов B.thailandensis и B. cepacia 25416. В качестве реципиента был взят ауксотрофный мутант B.pseudomallei С 141 pur 90 his 107. Трансформацию проводили на плотной минимальной среде с гистидином. В качестве донора использовали испытуемые штаммы. Для постановки теста к 5 мл суточной бульонной культуры изучаемого штамма добавляли 1,5 мл хлороформа, хорошо перемешивали до образования молочной взвеси, оставляли при37°С 2часа, а затем на сутки оставляли при 4°С. Через сутки 0,1 мл лизата из верхней части содержимого пробирки смешивали с 0,1 мл взвеси суточной агаровой культуры реципиента в 0,85% NaCl, содержащей 1 млрд. м.к.мл и высевали на минимальную среду. В качестве контроля на ту же среду высевали отдельно лизат и взвесь реципиента. Учет результатов проводили через 48 - 72 ч. Появление колоний прототрофов на опытной чашке при отсутствии их в контроле, свидетельствует о хромосомной трансформации.

Полимеразную цепную реакцию проводили в объеме 25 мкл в микроцентрифужных' пробирках (500' мкл). Реакционная смесь содержала: ДНК, специфические олигонуклеотидные прямые и обратные праймеры для идентификации B.pseudomallei и B.mallei, дезоксирибонуклеозидтрифосфаты, буфер и фермент Taq-полимеразу. Амплификацию ДНК проводили на программируемом термоциклере "Терцик" (НПФ "ДНК-технология", Москва) с использованием "горячего старта".

Анализ продуктов ПЦР осуществляли методом гель-электрофореза в 1,5 % агарозном геле согласно рекомендациям, изложенным в руководстве Т.Маниатиса с соавт. (1984).

Результаты исследований и их обсуждение

При росте на среде Ashdown мелиоидозные колонии приобретают темно-красный цвет за счет сорбции из среды нейтрального красного, вокруг колоний наблюдается просветление среды.

У B.thailandensis в отличие от B.pseudomallei нет морфологической диссоциации,.а на селективной среде интенсивность сорбции нейтрального красного существенно слабее.

Все штаммы буркхольдерий были изучены в бактериологических тестах используемых в дифференциальных схемах- и автоматических системах для идентификации глюкозу неферментирующих грамотрицательных бактерий. Приведены результаты основных тестов, изученных нами на наборе штаммов буркхольдерий, имеющихся в нашем распоряжении в таблице 1.

При постановке пробы на луке из 10 штаммов B.cepacia изменения в луковичной пластине были у 7 штаммов. При положительной реакции, особенно выраженной- у штамма B.cepacia -25416, по ходу мацерации отмечалась коричневая пигментация зоны поражения. Слабо выраженная реакция была у штаммов 3181,3189, 8235.

При проведении серологических исследований в диагностических иммунологических реакциях (РА, РДД, МФА) с использованием сывороток как к B.pseudomallei, так и к B.thailandensis выявлен высокий уровень родства антигенных структур этих микроорганизмов. Все культуры B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis агглютинировались мелиоидозной сывороткой в диагностических титрах (1:200), из 10 штаммов B.cepacia только культура 8235 в РА имела титр 1:40, остальные давали отрицательный результат. Серологические методы в идентификации буркхольдерий имеют безусловное значение в общем комплексе дифференциальных признаков. К сожалению, в РФ не выпускаются стандартные (производственные) видоспецифические сыворотки ни для одного вида буркхольдерий.

Таблица 1. Дифференциальные признаки буркхольдерий

Тесты pseudomallei thailandensis mallei cepacia

Окисление: глюкозы + + + +

фруктозы + + + +

ксилозы + + + +

лактозы + + + +

мальтозы + + + +

Аргининдигидролаза + + + -

Л изиндекарбоксилаза - - - +

Орнитиндекарбоксилаза - - - +/-

ОМРй - - - +

Желатиназа + + + +/-

Денитрификация + + + -

ДНКаза - - - -

Гидролиз эскулина +/- +/- - -

Число жгутиков >1 >1 - >1

Рост при 42°С + + - +/-

Полимиксин R R R R

Гентамицин R R S R

Рост при 2,5% №С1 - - - +

Ассимиляция Ь-арабинозы - + - +

Наличие пигмента - - - +/-

И-колонии на агаре + - - -

Вирулентность для з/х + - + -

Ауксотрофность - - - -

Примечание: (+) и (-) обозначают наличие или отсутствие признака у 90% и более штаммов данного вида R - устойчивость; S - чувствительность к антибиотикам

Высокая степень родства изученных буркхольдерий подчеркивается наличием множественных общих линий в РДД, проявляющихся при использовании сывороток, полученных к ультразвуковым лизатам ацетоновых клеток как B.pseudomallei так и B. cepacia. С одной стороны это свидетельствует о высокой степени родства видов семейства Buraceae являющихся в отличие от псевдомонад монофилетической таксономической

группой, с другой стороны это предопределяет сложности разработки видоспецифических диагностикумов. Особенно это проявляется внутри групп близкородственных видов.

При использовании в опытах мелиоидозных диагностических флуоресцентных иммуноглобулинов, все исследумые штаммы B.pseudomallei и B.mallei выявлялись в МФА при использовании препарата в рабочих титрах (1:256), штаммы B.thailandensis выявлялись только при использовании иммуноглобулинов в разведении в 3-4 раза меньшем (1:32 - 1:64), штаммы гетерологичных культур, в том числе и B.cepacia, этим препаратом не выявлялись.

В случае использования МФА для выявления культур B.cepacia видно, что уровень свечения различных штаммов в непрямом методе варьирует в широком диапазоне. Причем, если принять за рабочий титр разведение 1:800, то выпадают 2 штамма B.cepacia> а титр сыворотки, дающий положительную реакцию с гетерологичными культурами, отличается всего на 1-2 разведения. Более ценные диагностические результаты получаются в прямом методе, в котором отчетливо отсекаются гетерологичные виды.

При сопоставлении резистентности буркхольдерий к красителям, детергентам и антисептикам, применяемым в микробиологии, обращает на себя внимание, что в большинстве случаев наименьший уровень МПК среди буркхольдерий отмечается для культур B.mallei, а наивысший - для B.cepacia.

Вирулентность культур B.mallei, B.pseudomallei и B.cepacia проверяли на золотистых хомячках и морских свинках. Животные погибали только в случае их заражения возбудителями сапа и мелиоидоза, LD50 штаммов этих микроорганизмов для золотистых хомячков составила 101 - 102м.к. LD50 штаммов B.pseudomallei для морских свинок широко варьировала в пределах от 102 до 105 м.к. Штаммы B.mallei для морских свинок оказались маловирулентными, за исключением B.mallei Ц-4, у которого LD50 воспроизводимо повторялась в пределах 106 м.к., у остальных сапных культур

LD50 была в пределах 108 м.к., причем у животных формировались затяжные формы заболевания. B.cepacia оказалась непатогенной для золотистых хомячков и морских свинок

Вирулентность культур B.thailandensis проверяли на двух видах животных: золотистых хомячках и морских свинках. LD50 для золотистых хомячков составила в среднем 106м.к. Гибель морских свинок при введении 108 м.к. не отмечалась.

При идентификации буркхольдерий по системе Nefermtest 24 было исследовано 28 штаммов. Учет проводился по цветным реакциям, характер которых определен стандартами в соответствии с рисунками, прилагаемыми фирмой к набору те,ст-системы.

При идентификации буркхольдерий по этой системе была установлена принадлежность B.pseudomallei Vang к виду B.cepacia, что в принципе подтверждается и другими нашими исследованиями (vir LDCADH, ONPG, ara*). К тому же он давал отрицательную реакцию в ПЦР с мелиоидозными праймерами, а в РДД формировал многочисленные идентичные преципитаты с референтным штаммом B.cepacia. Также была установлена принадлежность B.mallei Олоф и B.mallei Конный к вилам Alcaligenes и Oligella uretralis. Правомерность включения этих культур в коллекцию вида B.mallei ставилась под сомнение в нашей лаборатории и ранее. При постановке всех тестов, включенных в схему идентификации буркхольдерий, видна отчетливая очевидность несоответствия по видовым признакам. Оба штамма отличались от типичных культур B.mallei по росту на селективных средах (резистентность не только к гентамицину, но и к рифампицину, тетрациклину, сульфаниламидам), антигенному набору (отрицательные результаты в РДД, РА с мелиоидозной сывороткой), вирулентности для золотистых хомячков (ЛД50 >109 м.к.).

Однако в данной тест-системе получены вариабельные результаты на тестах, которые при стандартных исследованиях были стабильными. Особенно принципиальными были расхождения в оценке декарбоксилаз и денитрифика-

ции. В итоге отмечено, что штаммы, видовая принадлежность которых обычными лабораторными методами, включая пробы на животных, не вызывает сомнений, по этой системе может правильно не дифференцироваться, причем % ошибок достаточно высок, а вероятность точности диагностики даже для референтных штаммов, в свою очередь, низкая.

При проведении генетической трансформации реципиент B.pseudomallei С 141 риг 90 his 107 трансформировался по хромосомному маркеру ДНК гомологичного вида, а также B.mallei и B.thailandensis, но не B.cepacia. Донорская активность B.thailandensis не имела существенных штаммовых различий и по частоте приближалась к трансформирующей способности B.mallei (табл. 2).

Таблица 2. Показатели трансформирующей активности различных видов буркхольдерий

Реципиент Штаммы доноры Частота образования Pur* трансформантов

B.pseudomallei С141 pur 90 his 107 B.pseudomallei С141 >1,0x10"*

B.mallei Ц 4 3,0x 10°

B.thailandensis 251 0,8x10"1

B.thailandensis 264 0,9x10°

B.thailandensis 265 0,8x10"5

B.thailandensis 295 1,0х105

B.thailandensis 299 1,х10°

B.cepacia 25416 0

Примечание: частота реверсий по маркеру Риг+ < 1,0x108

При постановке ПЦР для идентификации буркхольдерий, с помощью сконструированной амплификационной тест-системы детектировались все штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза, хранящиеся в коллекционном центре ВолгНИПЧИ, за исключением B.pseudomallei Vang, B.mallei Олоф и B.mallei Конный.

С ДНК гетерологичных микроорганизмов, в том числе с БЛНаНапёепзю и В серас амплификатов ожидаемых размеров в ПЦР не было выявлено (рис 1).

12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Рис. 1. Электрофореграмма результатов ПЦР с праймерами b23s7-b23a8 при исследовании различных гетерологичных микроорганизмов

1 - В pseudomallei С 141

2 - B.thailandensis 264

3 - B.pseudomallei 100 -

4 - B.pseudomallei 56812

5 - ß pseudomallei Vang

6 - В pseudomallei 57576

7 -B.mallei Z-12 '

8 - В pseudomallei 107

9 -B.cepacia 25416

10- P.aeruginosa 4000

11-Ecoli HB101

12- B.mallei Конный

13- B.mallei Олоф

14- Положительный контроль - ДНК B.mallei 10230

15- Отрицательный контроль - НгО

16- B.cepacia 8236

Идентификация буркхольдерий в клинической практике в зависимости от условий выделения культуры бывает в двух вариантах - ускоренная (индикация), в случае подозрения на заболевание сапом или мелиоидозом и стандартная, предусмотренная различными инструкциями и рекомендациями по выделению и идентификации грамотрицательных,. не ферментирующих глюкозу, оксидазоположительных бактерий.

В первом варианте культура или материал, подозрительный на зараженность B.mallei илиB.pseudomallei,, исследуются иммунологическими методами и в ПЦР. В этом случае ответ выдается уже в первые часы после получения материала, однако чувствительность и специфичность этих методов даже в руках опытных специалистов колеблется от 60 до 95%. Основная опасность, понятно; кроется в случае гиподиагностики.

При отсутствии эпидемиологической настороженности выделение культур буркхольдерий происходит в ходе выполнения обычных стандартных исследований по известным схемам или с применением наборов для систем типа API.

Все культуры буркхольдерий характеризуются рядом общих-свойств, позволяющих их объединить в один род. Этими облигатными признаками являются помимо общих свойств, для так называемой группы глюкозу не ферментирующих бактерий, еще несколько объединяющих характеристик (прототрофность, устойчивость к полимиксину отсутствие ДНК-азы. и диффундирующих в среду пигментов).

Дальнейшая идентификация выделенной культуры, обладающая выше перечисленными родовыми свойствами, требует постановки дополнительных тестов, позволяющих с определенной вероятностью отнести ее к отдельному' виду буркхольдерий. Решающими тестами в дифференциации буркхольдерий группы pseudomallei от cepacia являются проверка декарбоксилазной активности с аргинином и лизином и тест на Р - галактозидазу (табл. 3).

Таблица 3. Дифференциальные (видовые) признаки буркхольдерий

' Тест серааа рзешЬтаИе! \hailandensis таИег

ОЫРв + - - -

Аргининдигидролаза > - + + +

Лизиндекарбоксилаза - + - - -

Рост при 42°С ± + + -

Усвоение Ъ — арабинозы + - +

Чувствительность к гентамицну - - - +

Примечание:. (+) или(-)— наличие или. отсутствие признака у 90%. штаммов данного вида, (±) - тест вариабельный

Дифференциация видов внутри группы р$еыиота1Ш базируется как на основе фенотипических свойств- (усвоение Ь-арабинозы, подвижность, чувствительность к аминогликозидам, рост при 42°С), так и на базе ПЦР с применением праймеров, позволяющих дифференцировать все 3 вида группы р$еииота11е1. При окончательном оформлении документации на выделенные штаммы патогенных буркхольдерий обязательным элементом является проверка вирулентности штаммов для золотистых хомячков и морских свинок.

Ряд тестов,- стандартно используемых- в бактериологических исследованиях, проявляется при исследовании буркхольдерий в качестве вариабельных, учитывая, что эта изменчивость сохраняется'при пассировании культур на животных и питательных средах есть основание считать эти признаки диагностическими при разграничении культур на биовары (эпидемиологические маркеры)

Суммируя все проведенные исследования, можно представить себе ход. последовательной дифференциации культур буркхольдерий по этапам, представленным на предлагаемой нами схеме, которые включают в себя все диагностически значимые культурально морфологические, биохимические, иммунологические и генетические методы (рис.2).

Рисунок 2. Схема лабораторной диагностики буркхольдерий

Это обеспечивает основной на сегодняшний день принцип полифазности дифференциальной диагностики бурхольдерий. Предлагаемая схема позволяет давать, как предварительный ответ за счет постановки в течение нескольких часов иммунологических реакций и ПЦР, так и окончательный - через 2-7 сут, когда будут поставлены с выделенной «чистой» культурой основные тесты, значимые для определения родовой и видовой принадлежности изучаемых штаммов, включая вариабельные индивидуальные характеристики каждой культуры.

ВЫВОДЫ

1. На основании изучения основных фенотипических свойств, рекомендуемых при идентификации не ферментирующих глюкозу грамотрицательных бактерий, выявлен набор стабильных и вариабельных диагностических признаков для каждого вида буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике.

2. Определен уровень резистентности буркхольдерий к антибактериальным средствам, показано принципиальное значение показателя чувствительности к полимиксину и гентамицину, что может быть, использовано и для разработки селективных сред и как самостоятельный показатель при дифференциации изучаемых культур, подозрительных на принадлежность к роду Burkholdena.

3. Изучение свойств селективных сред для буркхольдерий (среда Эшдауна и БС8М) показало их высокую степень избирательности и чувствительности, обусловленную не только активностью селективных факторов, но и характером морфологии колоний и сорбцией красителей из сред.

4. Отобран комплекс биохимических, иммунологических и генетических методов, обеспечивающий на основе принципа полифазной таксономии установление вида идентифицируемых культур буркхольдерий.

5. Выявлен набор диагностических тестов, обеспечивших создание ключей для установления рода вида и биовара идентифицируемых штаммов патогенных буркхольдерий.

7. Штаммы B.thailandensis, учитывая их авирулентность при высокой степени сходства биохимических и антигенных свойств с B.pseudomallei, могут быть использованы в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учений, по идентификации возбудителей особо опасных инфекций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Будченко А.А., Илюхин В.И., Антонов В.А., Сеимова И.К., Трушкина М.Н., Меринова Л.К., Замараев B.C., Сенина Т.В. Изучение стабильности признаков, используемых для внутривидового типирования патогенных буркхольдерий // Природно-очаговые особо опасные инфекции на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика. - Сб.науч.тр.-Астрахань, 2001. - С.276 - 278.

2. Dyukhin V.I., Senina T.V., Plekhanova N.G., Antonov V.A., Merinova L.K., Tkatchenko G.A., Zamaraeva S.V., Alekseeva V.V. Biological properties and differentation of pathogenic species of genus burkholderia // Natural infectious diseases. Abstracts of scientific conference. - Ulaanbaatar, 6 december 2001. -P.33 - 35.

3. Илюхин В.И., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г., Антонов В.А., Меринова Л.К., Сеимова И.К. Burkholderia thailandensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция // Мол. генет., микробиол. и вирусол. - 2002. - N 1. - С. 7 -11.

4. Сенина Т.В. Факторы резистентно патогенных буркхольдерий, обеспечивающие их экологическую нишу в условиях естественного обитания // Поволжский экологический вестник. - Волгоград. - 2002. -С.245-247.

5. Ilyukhin V.I., Alekseev V.V., Batmanov V.P., Perepelitsyna S.V., Senina T.V., Kislichkin N.N. Some aspects of treatment and prophylaxis of experimental airborne melioidosis // 4th International conference on emerging zoonoses. -Ames, Iowa. - 2003. - C. 70.

6. Илюхин В.И., Плеханова Н.Г., Сенина Т.В., Становая О.В.", Кисличкин Н.Н. Экспериментальное обоснование возможности применения туляремийной живой вакцины для повышения резистентности к гетерологичным инфекционным заболеваниям- // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 2004.- №2. - С.38 - 42.

7. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму / Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Жилина Н.Я., Субботин В.Г., Алексеев В.В. Сенина Т.В. и др. - Волгоград - 2004. - 126с.

Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхолдерий, имеющих значение в медицинской практике.

Формат 60x84 '/16 Бумага офсетная №1-65 гр. Печать офсетная. Гарнитура Тайме Тираж 100 экз. Заказ № 1625

Отпечатано ООО «Бланк». Лиц. № 3550 г. Волгоград, ул. Скосырева, 2а

#15 566

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сенина, Татьяна Васильевна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Инфекции, вызываемые буркхольдериями.

1.2. Принципы идентификации буркхольдерий.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Штаммы микроорганизмов, используемые в работе.

2.2. Питательные среды и условия культивирования.

2.3. Постановка биохимических реакций.

2.4. Постановка серологических реакций.

2.5. Определение чувствительности штаммов к антибактериальным препаратам, детергентам и красителям.

2.6. Определение вирулентности и иммуногенности буркхольдерий для лабораторных животных.

2.7. Идентификация штаммов буркхольдерий по системе

Nefermtest 24.

2.8. Генетическоя трансформация у буркхольдрий.

2.9. Постановка ПЦР.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Сравнительное изучение роста буркхольдерий на питательных и селективных средах.

3.2. Биохимические тесты.

3.3.Серологические исследования.

3.4. Резистентность буркхольдерий к антибактериальным препаратам и разного рода ингибиторам.

3.5. Вирулентность и иммуногенность буркхольдерий для лабораторных животных.

3.6. Идентификация штаммов буркхольдерий по системе

Nefermtest 24.

3.7. Трансформация хромосомной ДНК у различных видов буркхольдерий.

3.8. ПЦР в идентификации буркхольдерий.

3.9. Принципы и схема идентификации буркхольдерий, наиболее значимых в медицинской практике.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике"

Санитарная охрана границ территории Российской Федерации от заноса инфекционных заболеваний является одной из задач органов здравоохранения. Внедрение рациональных форм санитарно-эпидемиологического обслуживания населения с целью предупреждения возникновения тяжелых инфекционных заболеваний на территории нашего государства имеет важное значение для решения социальных и экономических проблем.

В настоящее время борьба с инфекциями во всем мире приобретает особый характер, так как расширение международных контактов создает большие возможности для распространения из эндемичных природных очагов редко обнаруживаемых патогенных видов микроорганизмов, в том числе возбудителей сапа и мелиоидоза, относящихся к роду Burkholderia [21, 38, 86, 107, 136, 140].

Большинство бактерий рода Burkholderia относятся к сапрофитам, для медицинской практики определенное значение имеют четыре вида -Burkholderia mallei, B.pseudomallei, B.cepacia, B.thailandensis. Два из них являются патогенными и их обычно выделяют в самостоятельную группу. Это В.mallei и B.pseudomallei — возбудители сапа и мелиоидоза, опасных инфекционных заболеваний, эндемичные очаги которых имеются на сопредельных с Российской Федерацией территориях (Монголия, Иран, Китай, Турция) [121, 144]. Оба вида обладают выраженными патогенными свойствами для человека и животных. Хотя мелиоидоз является инфекционным заболеванием, эндемичным для стран Юго-Восточной Азии, в последнее время значительно возрос интерес к диагностике и лечению данного заболевания в ряде стран Европы и Америки, так как экологические особенности его возбудителя позволяют создавать относительно стойкие вторичные очаги инфекции при попадании возбудителя в другие климатические условия [100, 101, 108]. Кроме того, заболевание у людей нередко протекает в тяжелой форме и трудно поддается лечению. По данным Susaengrat [170] только в госпитале Хан-Кен-Сити (Таиланд) за 3,5 года находилось на лечении 220 больных с диагнозом мелиоидоз. При этом у 127 человек заболевание протекало с явлениями септицемии. А летальность в этой группе больных составила 90%, несмотря на проводимое лечение современными антибиотиками.

В.cepacia и B.thailandensis — бактерии, генетически и иммунологически близкие к возбудителю сапа и мелиоидоза, но при этом не патогенные для человека и животных. В.cepacia может вызывать оппортунистические заболевания у больных с иммунодефицитными состояниями. Особенно опасна при му-ковисцидозе. Всех их объединяет высокая резистентность к антибактериальным препаратам, в том числе и к антибиотикам. Эта природная устойчивость обеспечивает им выживаемость во внешней среде и создает сложности при лечении заболеваний. По фенотипическим признакам штаммы этих видов относительно однородны.

Наличие в природе бактерий, генетически и иммунологически близких к возбудителям сапа и мелиоидоза, но при этом не патогенных для человека и животных, является давно установленным фактом. Однако, лишь в последнее десятилетие, благодаря повысившемуся интересу к проблеме заболеваемости мелиоидозом в мире, выделение и изучение биохимических характеристик буркхольдерий распространилось на огромное количество культур, выделенных с помощью селективных сред из объектов внешней среды эндемичных территорий. В ходе этих исследований особое внимание уделено B.pseudomallei-like штаммам, основное различие которых с возбудителем мелиоидоза состояло в авирулентности для лабораторных животных и более высокой биохимической активности по отношению к моносахаридам из группы пентоз. Основные диагностические признаки у этих культур и у вирулентных типичных штаммов B.pseudomallei были идентичны. Brett с соавторами в 1998г выделил эти микроорганизмы в самостоятельный вид рода Burkholderia - B.thailandensis [87]. В настоящее время этот термин стал общепризнанным.

Цель работы - изучение культуральных, биохимических и патогенных свойств культур В.pseudomallei, B.mallei, B.cepacia и B.thailandensis для выявления набора тестов, имеющих значение в разработке дифференциальных схем идентификации.

Задачи исследования

2. Изучить вирулентность штаммов буркхольдерий, филогенетически расположенных в системе — сапрофит {В.cepacia, B.thailandensis), незавершенный паразит {B.pseudomallei), паразит {В.mallei).

3. Сопоставить резистентность буркхольдерий к антибактериальным препаратам, красителям и детергентам.

5. Разработать схемы идентификации буркхольдерий, имеющих медицинское значени^на различных таксономических уровнях (род, вид, биовар).

Научная новизна

Охарактеризованы гено - и фенотипические свойства буркхольдерий, необходимые для разработки диагностических и профилактических средств, а также для расшифровки механизмов реализации патогенности возбудителей сапа и мелиоидоза.

Впервые в основу разработки схемы идентификации патогенных буркхольдерий заложены принципы полифазной таксономии, предусматривающие сочетанное применение генетических, биохимических, иммунологических методик при окончательном определении таксономической позиции изучаемого штамма.

Выявлены наборы основных дифференциальных тестов фенотипических свойств буркхольдерий, позволившие составить диагностические ключи для определения рода, вида и биоваров идентифицируемых культур возбудителей сапа, мелиоидоза и близкородственных им буркхольдерий.

Впервые в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза для учебных целей (курсы бактериологов, учения по индикации возбудителей ООИ) вместо убитых клеток B.pseudomallei предложена живая культура гетерологичного непатогенного вида B.thailandensis, имеющего высокую степень идентичности биохимических, культуральных и антигенных свойств с возбудителем мелиоидоза.

Практическая значимость

Штамм Burkholderia thailandensis В-9 депонирован в Саратовском научно-исследовательском противочумном институте «Микроб» в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», как В .thailandensis КМ 161 с формулировкой: перспективный в качестве учебного штамма-имитатора возбудителя мелиоидоза. Документация на оформление патента на этот штамм отправлена в Российское агентство по патентам и товарным знакам. Заявка № 2004112706 от 26.04.04.

Положения, выносимые на защиту

2. Степень идентичности В.pseudomallei, B.mallei и В.thailandensis в биохимических, иммунологических и генетических диагностических тестах позволяет считать их биоварами одного вида, целесообразность сохранения их видового статуса в медицинской микробиологии определяется практическими (эпидемиологическими) задачами.

4. Принадлежность к особо опасным видам {В.mallei и B.pseudomallei), предопределяет целесообразность на ранних этапах проведение ускоренных идентификационных иммунологических и генетических методик (РА, МФА, ПЦР) с последующим подтверждением диагноза стандартными бактериологическими методами.

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 124 листах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 188 источников, в том числе 66 отечественных и 122 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 10 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Сенина, Татьяна Васильевна

ВЫВОДЫ

2. Определен уровень резистентности буркхольдерий к антибактериальным средствам, показано принципиальное значение показателя чувствительности к полимиксину и гентамицину, что может быть использовано и для разработки селективных сред и как самостоятельный показатель при дифференциации изучаемых культур, подозрительных на принадлежность к роду Burkholderia.

3. Изучение свойств селективных сред для буркхольдерий (среда Эшдауна и BCSM) показало их высокую степень избирательности и чувствительности, обусловленную не только активностью селективных факторов, но и характером морфологии колоний и сорбцией красителей из сред.

5. Выявлен набор диагностических тестов, обеспечивших создание ключей для установления рода, вида и биовара идентифицируемых штаммов патогенных буркхольдерий.

6. Комплексное изучение различными методами набора штаммов B.mallei, B.pseudomallei и B.thailandensis дает основание предположить, что степень их родства позволяет объединить их в одну таксономическую суправидовую единицу - группу pseudomallei, а разделение на виды по единичным диагностическим признакам имеет не столько таксономическую ценность, сколько эпидемиологическую. 7. Штаммы B.thailandensis, учитывая их авирулентность при высокой степени - сходства биохимических и антигенных свойств с B.pseudomallei, могут быть использованы в качестве имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учений по идентификации возбудителей особо опасных инфекций.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Широкое внедрение в практику таксономии прокариотов генетических методов привело к концу 20-го века к радикальному пересмотру классификации и идентификации бактерий. Господствовавшая с 50-х годов нумерическая таксономия, основанная на компьютерном анализе морфологических и биохимических характеристик штаммов микроорганизмов, уступила в 90-х годах место филогенетической классификации, основанной на анализе нуклеотидных последовательностей 16S рРНК [8, 106, 126, 158].

Первоначально молекулярная таксономия основывалась на данных G+C (моль%) в ДНК, затем был введен метод ДНК - ДНК гибридизации, наконец, в 80-х годах методики секвенирования субъединиц 16S рРНК и компьютерной обработки данных превратили этот метод фактически в основной для определения родовой принадлежности изучаемого микроорганизма [126, 132]. Для видовой характеристики на следующем этапе дополнительно используют оценку степени гомологии ДНК в сравнении с референтным штаммом [126, 142, 155, 182].

Несомненным достоинством перечисленных генетических методов, применяемых в таксономии и идентификации, является сопоставимость и воспроизводимость результатов, полученных в различных лабораториях, более того, в последние годы развернуты исследования по секвенированию полного генома бактериальных и вирусных патогенов, включая B.pseudomallei и В.cepacia [127, 177, 179]. При этом предполагается использование этих данных для создания сравнительных компьютерных алгоритмов, в перспективе могущих быть средством экспресс-анализа агентов биотерроризма [165].

Однако создание классификации на основе генетических методов с определением вида по данным секвенирования 16S рРНК субъединиц практически не учитывает функциональные проявления изучаемого объекта. За последние годы произошло резкое увеличение количества видов, базирующихся на основании характеристики всего лишь 1-2 штаммов [126]. Кроме того, внесено было много сумятицы в кругах специалистов-практиков в понимание базовых прин-| ципов определения вида. Например, попытка представить на основе геномного сходства возбудитель чумы как биовар псевдотуберкулезной бактерии - было предложено обозначение как Yersinia pseudotuberculosis subsp. pestis, вызвало очевидное недовольство, как в среде эпидемиологов, так и бактериологов [15, 80].

Столь же важна интерпретация генетических исследований и для таксономии возбудителей сапа и мелиоидоза. Так уже в первой основополагающей наименование рода Burkholderia статье EYabuuchi et al [184], при обосновании выделения 7 видов псевдомонад в самостоятельный род Burkholderia, подчер-I кивается, что при ДНК-ДНК гибридизации и секвенировании 16S рРНК различия между B.mallei и B.pseudomallei не выявляются. Если ранее на основе сопоставления фенотипа возбудитель сапа предлагали считать биоваром B.pseudomallei [21, 156], то на основании мультилокусного сиквенс-типирования [112] вообще пришли к выводу, что B.mallei является лишь клоном B.pseudomallei и не может иметь статус самостоятельного вида. Понятно, что подобное утверждение не может быть приемлемым с позиций эпидемиологии и экологии, к тому же фенотип этих возбудителей, имеет четкие дифференциальные тесты (подвижность, устойчивость к температуре и антибиотикам). | Смена таксономической основы в классификации бактерий существенно отразилась и на B.cepacia. Если к 70-м годам в один вид были объединены сходные по фенотипическим свойствам P.cepacia, P.multivorans и P.kingii выделяемые ранее в отдельные виды по экологической нише обитания [111, 151]. В 90-е годы по данным методик молекулярного исследования нуклеиновых кислот штаммы B.cepacia были разделены на 9 геномоваров, 6 из которых приобрели собственные видовые обозначения, тем не менее, в таксономических исследованиях объединенные в суправидовой таксон B.cepacia complex [113, 118, 152,173].

В практических лабораториях, даже хорошо оснащенных современной техникой, в настоящее время выделение и идентификация B.cepacia имеет труднопреодолимые проблемы - фактически нет общепризнанного "золотого стандарта" [152]. Генетические методы (ПЦР, РАПД, ДНК-ДНК гибридизация и др.) довольно трудоемки и пока неприменимы для практических целей, к тому | же имеются проблемы с определением специфичности отдельных геномоваров,

I н например I, III, IV и VII - геномовары не различаются при анализе 16S рРНК в РФЛП [118], а в системе API 20 NE B.cepacia, B.siabilis и B.fungorum не различаются по своему нумерическому профилю. В конечном счете, на сегодняшний день для проведения относительно достоверной идентификации представителей группы B.cepacia рекомендуется поэтапно делать посев на селективную среду, идентификацию в системе типа APL20NE и для окончательного подтверждения вида (геномовара) проводить ПЦР с последующим анализом рибо-сомальных фрагментов в РФЛП [152]. I Сложности идентификации B.cepacia с использованием автоматических систем связаны, как с недостоверностью отличий с рядом гетерологичных видов (S.maltophilia, B.gladioli, Ralstonia spp.), так и с отсутствием в ряде случаев достоверных критериев различий, между вновь обозначенными видами В. cepacia complex, что вполне объяснимо, учитывая, что системы API ведут свою историю с 1975 г и с тех пор добавляется только список кодов идентифицируемых видов, стремительно увеличивающийся с каждым годом [126, 158, 174].

Распространенные в западных странах системы API в практике работы i баклабораторий РФ не имеют реального внедрения прежде всего в силу дороговизны, кроме того, в случае работы с ООИ, к которым относятся возбудители сапа и мелиоидоза, эти системы весьма опасны с позиций соблюдения режима работы (очень трудно исключить контаминацию поверхности пластин, особенно при снятии предохранительной пленки).

Принципиальным является также тот момент, что и при наличии этих систем для окончательной идентификации культур, подозрительных на патогенные буркхольдерии, требуется постановка дополнительных тестов. Поэтому в лабораторной диагностике буркхольдерий по-прежнему используются идентификационные ключи [53, 66, 70, 131], которые составлены из стандартных тестов, характеризующих видовые особенности по альтернативным признакам. Особенно для дихотомических ключей имеют значение признаки, присущие или отсутствующие у подавляющего большинства, данного вида. Собственно из таких признаков и состоит принцип первичного группирования исследуемых культур буркхольдерий, которые относятся к глюкозу неферментирующим, ок-сидазоположительным, грамотрицательным бактериям. При дальнейшей дифференциации этих культур принципиальное значение имеет изучение пигмен-тообразования (исключение флуоресцирующих псевдомонад), рост на минимальной среде (прототрофность), наличие декарбоксилаз, рост при 4°С и при 42°С, устойчивость к 2,5% NaCl и полимиксину, определение галактозидазы. Культуры, идентифицированные по ключевым видовым признакам, в дальнейшем в случае принадлежности их к группе pseudomallei необходимо исследовать на патогенность для биопробных животных (лучшей моделью является золотистый хомячок).

Серологические методы в идентификации буркхольдерий имеют безусловное значение в общем комплексе дифференциальных признаков. К сожалению, в РФ не выпускаются стандартные (производственные) видоспецифиче-ские сыворотки ни для одного вида буркхольдерий. В свое время мелиоидозные сыворотки для реакции агглютинации выпускали фирмы "Difco" и "Institut Pasteur Production". Эти препараты с успехом использовались при исследовании культур, выделяемых в эндемичных по заболеванию регионах из материала от больных или из селективных сред при обследовании проб внешней среды.

В условиях специализированных лабораторий для постановки диагностических иммунологических реакций используют собственные антисыворотки, полученные к антигенным комплексам референтных штаммов. По понятным причинам подобные сыворотки содержат комплекс иммуноглобулинов, как ви-доспецифических, так и минорных, перекрестнореагирующих. Поэтому при учете реакции преципитации по характеру общих линий с референтной культурой можно давать лишь ориентировочную оценку степени родства изучаемого штамма, так как могут выявляться так называемые общие антигены, в виде единичных, минорных преципитатов [14, 47]. Учитывая, что результаты в РДД и РА имеют в общей схеме идентификации характер дополнительных тестов, интерпретация результатов в этих реакциях происходит только по характеру общих преципитатов с референтным штаммом и общая оценка может носить только предварительный характер. При этом отрицательный результат имеет больший диагностический вес, а положительный указывает на необходимость дополнительных исследований.

Учитывая исследования P.Liu [141], дополнительная постановка РДД с гретыми культурами (О - антигеном) может повысить диагностическую ценность реакции, так как по его данным видоспецифическими АГ являются в основном термолабильные экстраклеточные биополимеры. И по суммарному анализу РДД с живой культурой и кипячеными клетками можно сделать более точную оценку спектра общих антигенных структур сопоставляемых штаммов. В ходе комплексного исследования по идентификации буркхольдерий серологические реакции, хотя имеют ориентировочный характер, но по-прежнему незаменимы, учитывая их простоту постановки и объективность учета.

В ходе проведения наших опытов при постановке и отборе дифференциальных тестов одновременно решались задачи выявления штаммов буркхольдерий, видовая принадлежность которых по отдельным признакам вызывала сомнения. Попадание таких штаммов объясняется принципом комплектования набора буркхольдерий из различных научных ветеринарных и медицинских учреждений, а также по запросам из личных коллекций авторов по их публикациям. Наибольшие сомнения вызывали штаммы B.mallei Конный и Олоф (авирулентные для золотистых хомячков и не агглютинирующиеся мелиоидозной сывороткой), B.pseudomallei 107 и 122 (Vang) не вирулентные для золотистых хомячков. Наконец, весь набор штаммов B.cepacia, хотя и был комплектован по запросам в известные научные учреждения (институт Пастера, Париж; институт микробиологии АН Украины, Ростовский ПЧИ), но не был тщательно проанализирован по максимально полному набору дифференциальных тестов, штаммы в основном были охарактеризованы только по тестам, используемым для идентификации B.mallei и B.pseudomallei, так как по характеру тематики нашего института использовались в исследованиях в качестве гетерологичного близкородственного вида.

При постановке всех тестов, включенных в схему идентификации буркхольдерий, видна отчетливая очевидность несоответствия по видовым признакам штаммов Конный и Олоф. Оба штамма отличались от типичных культур B.mallei по росту на селективных средах (резистентность не только к гентами-цину, но и к рифампицину, тетрациклину, сульфаниламидам), антигенному набору (отрицательные результаты в РДД, РА с мелиоидозной сывороткой), вирулентности для золотистых хомячков (ЛД50 >109м.к.), а по результатам тестов в системе Nefermtest 24, культуры в соответствии с полученным кодом 1440500 вообще относятся к роду Alcaligenes или Comamonas.

Следует отметить, что дифференциация культур B.mallei не представляет больших затруднений, если имеется необходимость точного установления видовой принадлежности у культур, идентифицируемым по эпидемиологическим показаниям или выделенным в автоматических системах с кодом, предполагающим некоторую вероятность принадлежности к виду B.mallei. Основными доказательствами в этих случаях служат положительные реакции с сыворотками B.pseudomallei, высокая вирулентность для золотистых хомячков при отсутствии подвижности и роста при 42°С, а также чувствительности к гентамицину.

Вообще идентификация B.mallei, при отсутствии эпидемической настороженности, при случайном выделении в общих лабораториях работающих с автоматическими системами, весьма затруднена, особенно, вследствие слабой биохимической активности культур и противоречивой интерпретации ряда диагностических тестов (замедленная оксидазная реакция, а также проблемы при учете кислотообразования из Сахаров, оценка декарбоксилазной активности и гидролиз ряда субстратов). При постановке реакций с набором тест-систем учет производится через 24 - 48 ч а температура выращивания в ряде случаев 32°С, поэтому возможны ошибки как гипердиагностики (Acinetobacter spp.), так и неправильного диагностирования штаммов B.mallei. Особенно опасны последствия в последнем варианте, так при заболевании сапом, описанном A.Szinivasan ! et al. [168], первично этиологическим агентом в автоматической системе был установлен P.fluorescens или P.putida, что привело к явным проблемам, как при лечении, так и проведению эпидемиологического анализа. Известны также многочисленные случаи и гипердиагностики [153,160].

Более отработаны и изучены принципы идентификации B.pseudomallei. При идентификации культур от больных с подозрением на мелиоидоз, а также при скрининге в объектах внешней среды, первичный этап состоит из посева на селективные среды, отбор подозрительных колоний с помощью РА и только затем более тщательный анализ культур по изучению фенотипических свойств и ! антибиотикограммы [99, 134]. Автоматические системы дают весьма достоверные результаты идентификации. Если использование системы API 20Е приводит к ряду ошибок и требует постановки дополнительных тестов [72, 171], то более адаптированная к неферментирующим микроорганизмам система API 20NE приводит к более достоверным результатам, фактически 3 профиля (1156577, 115656 и 1556577), одновременно рассматриваемые, как биовары по утилизации цитрата и гидролизу эскулина [122]. В используемой нами системе Nefermtest 24 наиболее типичными для B.pseudomallei были коды 1410677, 1610677,1411677,1611677. 1 . Все имеющиеся у нас штаммы B.thailandensis по своим фенотипическим, антигенным свойствам практически не имели отличий от типичных штаммов

B.pseudomallei. Они хорошо росли на среде Ashdown, несколько отличаясь морфологией колоний - равномерно окрашенные, бледно-розовые S-колонии, имели сходную антибиотикограмму. Принципиальные отличия заключались в ! слабой вирулентности штаммов и способности ассимилировать L-арабинозу на минеральной среде. Подробный анализ фенотипических свойств и антигенного родства в РА, РДД, МФА позволил нам предложить один из штаммов нашей коллекции B.thailandensis в качестве учебного штамма - имитатора возбудителя мелиоидоза при проведении учебных занятий на курсах и учениях по индикации агентов биологического оружия. В настоящий момент он депонирован в Российском НИПЧИ "Микроб" как Burkholderia thailandensis KM - 161.

Идентификация бактерий комплекса cepacia всегда представляла немалые трудности, вследствие вариабельности признаков, что с одной стороны объяс-! нялось его высокой способностью к адаптации и устойчивости во внешней среде, а с другой стороны в последнее десятилетие исследователи выявили генетическую гетерогенность популяции штаммов, включенных в вид B.cepacia. С помощью ДНК-ДНК гибридизации было показано, что по степени близости связывания молекул ДНК (> 70%), штаммы B.cepacia следует разграничить на 9 геномоваров, большая часть из которых идентифицирована по биологическим свойствам, что позволило придать геномоварам видовое обозначение [65, 94, 118, 145]. При этом четких критериев идентификации и дифференциации видов cepacia complex не разработано. Так, при анализе генетически подтвержденных ! штаммов B.cepacia автоматическими системами, точность идентификации соответствует от 50 до 96% (наиболее высокий % совпадения с системами API 20NE), при постановке ПЦР также имеются неточности, как при разграничении геномоваров, так и в трудностях дифференциации с некоторыми видами родов Pandoreae и Ralstonia. Поэтому наиболее адекватно считается на сегодня использование полифазного таксономического принципа, сочетающего генотипи-ческие и фенотипические методы дифференциации [65, 94, 118, 74].

Что касается двух атипичных штаммов, В.pseudomallei 107 (PI 54) и 122 (Vang), хорошо растущих на селективной среде Ashdown, но не вирулентных для золотистых хомячков (ЛД5о> Ю9), то подробное изучение их с помощью ключевых дифференциальных тестов в сочетании с постановкой иммунологических реакций и ПЦР показало, что штамм 122 не может быть идентифицирован, как культура вида В.pseudomallei (vir", LDC ADH", ONPG ara +), к тому же он давал отрицательную реакцию в ПЦР с мелиоидозными праймерами, а в РДД формировал многочисленные идентичные преципитаты с референтным штаммом B.cepacia. Все это позволяет исключить этот штамм из коллекции культур В.pseudomallei и отнести его в вид группы B.cepacia. Напротив, авиру-лентный штамм 107 обладал всеми типичными признаками В.pseudomallei (LDC", ADH*", ONPG", ara"), идентифицировался в ПЦР и серологических реакциях как В.pseudomallei. На этом основании культуру В.pseudomallei 107 следует считать, как единственный в своем роде в нашей стране авирулентный про-тотрофный штамм, заслуживающий пристального изучения в исследованиях факторов патогенности этого вида микроорганизмов.

Таким образом, проведенные нами исследования диагностических методов и средств на наборе культур буркхольдерий, имеющих медицинское значение, в сочетании с анализом литературных источников по проблеме идентификации буркхольдерий, позволили разработать набор диагностических ключей и схем для последовательной дифференциации патогенных буркхольдерий с установлением их видовой принадлежности, а в ряде случаев и с выявлением ин-фравидовых биоваров. Подобные схемы рекомендованы к включению в руководства по бактериологической диагностике и идентификации бактерий, вызывающих опасные инфекционные заболевания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сенина, Татьяна Васильевна, Волгоград

1. А.С. 712999 СССР. Штамм Pseudomonas pseudomallei VPA для получения диагностической мелиоидозной агглютинирующей сыворотки / Ряпис Л.А., Илюхин В.И., Сычева Н.М. Заявлено 25.07.78; Опубл. 05.10.79.

2. Адимов Л.Б., Ширяев Д.Т. Мелиоидоз // Диагн. особо опасн. и малоизвестных инф. Ростов- н/Д., 1970. - С. 225 - 235.

3. Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В. и др. Использование ПЦР для идентификации Burkholderia mallei II Мол. генет., микробиол. и виру-сол. 2004. - № 1. - С. 12 - 17.

4. Антонов Ю.В., Илюхин В.И., Поповцева Л.Д. и др. Чувствительность псевдомонад к современным антибактериальным препаратам // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - Т.36, № 1. - С. 14-16.

5. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. // Статистические методы в микробиологических исследованиях. М.: Медгиз. - 1962. - С. 85 - 93.

6. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03 Утверждено Г.Г. Онищенко. 2003. - 77с.

7. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. -М.: Медицина, 1990. 224с.

8. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., Антонов А.С. Систематика бактерий (с основами геносистематики). Нижний Новгород, 1992. - 171с.

9. Будченко А.А. Сравнительный электрофоретический анализ белков патогенных псевдомонад: Автореф. дис.канд. биол. наук. Саратов, 1995. -24с.

10. Велянов Д. Физиологични и метаболитни проблемы на вирулентността при някои септицемийни възбудители //Acta microbiol. virol. et immunol. -1975.-Vol. l.-P. 29-39.

11. Внутривидовое типирование штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза; Отчет о НИР (заключит) / Волгогр. н.-и. противочум. ин-т; Руководитель Илюхин В .И. Волгоград, 2000, - Г.Р. 01.9.80. 001814.-61 с.

12. Воробьёв А.А. Оценка вероятности использования биоагентов в качестве биологического оружия // Эпидемиол. и инфекц. бол. — 2001. № 6. - С. 54-56.

13. Вышелесский С.Н. Случай хронического сапа у человека // Вестн. общ. ветеринарии. 1909. - №5. - С. 217 - 226.

14. Гонтарь И.П., Фарбер С. М., Ефременко В.И. и др. К природе антигенов Pseudomonas pseudomallei, общих для некоторых видов микроорганизмов // Микробиол., эпидемиол., иммунол. 1984. - № 3. - С. 55 - 57.

15. Доморадский И.В. Чума // М.: Медицина. 1998. - 176с.

16. Жирно-кислотные профили бактерий, патогенных для человека и животных. Васкоренко З.П., Фролов А.Ф., Смирнов В.В., Рубин Н.М. Киев.: Наукова думка, 1992. - 264с.

17. Жога JI.K., Илюхин В.И., Самыгин В.М. Транспортная среда для патогенных псевдомонад // Клин. лаб. диагн. М.: Медицина. - 1995. - С. 38 - 40.

18. Изучение диапазона стабильности основных диагностических признаков B.mallei и B.pseudomallei: Отчет о НИР (заключит.) / Волгогр. н.-и. противочум. ин-т; Руководитель Илюхин В.И. — Волгоград, 2003. — ГР.01.9.80. 001814.-52 с.

19. Илюхин В.И. Антигенная структура и серология псевдомонад // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1986. - № 5. - С. 88 - 93.

20. Илюхин В.И. Мелиоидоз // Эпидемиол. и инфекц. болезни. 1999. - № 4. -С. 49-51.

21. Илюхин В.И. Псевдомонадные инфекции в патологии человека // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1985 - № 2. - С. 110 - 114.

22. Илюхин В.И., Замараев B.C. Каплиев В.И. Микробиология, таксономия и бактериологическая диагностика Pseudomonas pseudomallei II Мелиоидоз / Под ред. Н.Г.Тихонова Волгоград, 1995. С. 8 - 26.

23. Илюхин В.И., Замараев B.C., Батманов В.П. и др. Мелиоидоз // Диагн. возб. опасн. инфекц. болезней. Саратов, 1998. - Т. 2. - С. 115 - 143.

24. Илюхин В.И., Некляев Н.Ф. Мелиоидоз. Библиографический указатель отечественной и зарубежной литературы. Волгоград, 1985. - 166с.

25. Илюхин В.И., Поповцева Л.Д., Пивень Н.Н. Идентификация Pseudomonas pseudomallei II Лаб. дело. 1983. - № 7. - С. 61 - 62.

26. Илюхин В.И., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г. и др. Burkholderia thailandensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 2002. - № 1. - С. 7 - 11.

27. Иммунолюминесценция в медицине / Под ред. Е.Н. Левиной. М.: Медицина, 1977.-240с.

28. Исхакова Х.И., Баженов Л.Г., Шабанова Н.Г. Неферментирующие гра-мотрицательные бактерии и дифференциация их от Pseudomonas aeruginosa II Журн. гигиены, эпидемиол., микробиол. и иммунол. 1982. - № 4. - С.403 - 413.

29. Калина Г.П. Род Pseudomonas: новые аспекты старой проблемы // Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1985. - № 5. - С. 91 - 98.

30. Ковалев Г.К. О лекарственной чувствительности Pseudomonas pseudomallei II Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983. - № 6.-С.10-16.

31. Ковалев Г.К.,Гнетнев A.M. О действии некоторых химиопрепаратов на возбудителей сапа и мелиоидоза. // Журн. микробиол., эпидемиол. и им-мунобиол. 1975. - № 12. - С. 85 - 89.

32. Кравченко А.Т. Сап // Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней / Под ред. К.И. Матвеева. Москва, 1973. - С. 537-542.

33. Краткий определитель бактерий Берги. М.: Медицина. — 1980. - 495с.

34. Куличенко А.Н. Детекция возбудителей инфекционных болезней в биологическом материале и объектах внешней среды с помощью полимераз-ной цепной реакции // Лаб. диагн. возб. опасн. инфекц. болезней. — Саратов, 1998.-С. 162-169.

35. Лабораторная диагностика, лечение и профилактика мелиоидоза: Метод, рекомендации / Онищенко Г.Г./ Госсанэпиднадзор РФ, 1994. - 62с.

36. Ларионов Г.М. Заносы мелиоидоза и эпидемиологический надзор за его распространением // Микробиол. журн. 1987. - № 3. - С. 93 - 97.

37. Ларионов Г.М. Патогенность и паразитизм возбудителей сапронозов // Генет. и биохимия возбудит особо опасн. инф. Матер, российской научн. конф., Волгоград. 1992. - С. 106.

38. Ларионов Г.М., Гавенский С.Д., Погасий Н.И. и др. Эпидемиология и профилактика мелиоидоза // Мелиоидоз / Под ред. Тихонова Н.Г. Волгоград, 1995.-С.161-195.

39. Мелиоидоз / Под ред. Ширяева Д.Т. М.: Медицина. - 1976. - 111с.

40. Методические указания по применению унифицированных микробиологических (бактериологических) методов исследования в клинико-диагностических лабораториях. Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР № 535 от 22. 04. 1985. 126с.

41. Навашин С.М., Фомина И.П. Справочник по антибиотикам. М.: Медицина, 1974. - 416с.

42. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР // Методические указания МУ 3.5.5.1034 01.

43. Огарков В.И., Гапочко К.Г. Аэрогенная инфекция. М.: Медицина, 1975. -232с.

44. Пат. 2070924 РФ Транспортная среда для патогенных псевдомонад / Жога Л.К., Илюхин В.И., Самыгин В.М. и др. № 92002224; Заявлено 26.10.92.; Опубл. 27.12. 96.

45. Пивень Н.Н. Антигенная структура возбудителя мелиоидоза // Мелиоидоз / Под редакцией Н.Г. Тихонова. Волгоград. - 1995. - С. 47 - 57.

46. Пивень Н.Н. Перспективы исследований общих, перекрестнореагирую-щих и видовых антигенов у некоторых видов бактерий рода Pseudomonas // Микробиол. журн. Киев. - 1987. - Т. 49, № 3. - С. 6 - 10.

47. Поповцева Л.Д. Поиск оптимальной схемы идентификации возбудителя мелиоидоза: Дис. канд. мед. наук. Волгоград, 1985. - 115с.

48. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму / Онищенко Г.Г., Федоров Ю.М., Жилина Н.Я. и др. Волгоград, 2004. - 233с.

49. Руднев Г.П. Мелиоидоз // Руководство по инфекционным болезням М.: Медицина, 1967. - С. 462 - 466.

50. Руководство по индикации. / Под ред. Р.Б. Гольдина. М.:Военное издательство, 1989. — 235с.

51. Ряпис Л.А., Гольдберг A.M. Чувствительность возбудителей сапа и мелиоидоза к некоторым антибиотикам // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1971.-№ 1. - С. 168 - 169.

52. Ряпис Л.А., Илюхин В.И., Вострова Е.И., Джузенов А.А. Лабораторная диагностика клинически значимых видов псевдомонад. // Лаб. дело. -1988.-№ 12. С. 66-71.

53. Санитарные правила: 1.2. Эпидемиология. СП 1.2. 001 94. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности // Госсанэпиднадзор России. - М., 1994. - 152 с.

54. Смайберт Р., Криг Н. Общая характеристика // Методы общей бактериологии: Пер. с англ. / Под ред. Ф. Герхарда. М.: Мир, 1984 - Т. 3. - С. 12.

55. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas.- Киев: Нау-кова думка, 1990. 262с.

56. Сэнфорд Д., Гилберт Д., Гербердинг Д., Сэнде М. Антимикробная терапия. М.: Практика, 1996. - С.84 - 86.

57. Тарасова Т.Д., Ряпис JI.A. Трансформация бактерий на плотной среде // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1983. - № 7. - С. 8 - 13.

58. Тихонов Н.Г., Липницкий А.В. Биологический терроризм (проблемы противодействия) // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье. Сб. науч. тр. / Под ред. Н.Г.Тихонова. Волгоград, 2000. - С. 265 - 271.

59. Ткаченко Г.А. Конструирование амплификационной тест-системы для выявления патогенных буркхольдерий: Дис.канд. мед. наук. — Волгоград, 2003.- 108с.

60. Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Замараев B.C., Илюхин В.И. Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза с помощью полимеразной цепной реакции // Мол. ген. микробиол. и вирусол. 2003. - № 3. - С. 18 - 22.

61. Храпова Н.П., Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C. и др. Иммунологическая диагностика мелиоидоза // Мелиоидоз / Под ред. Н.Г.Тихонова. Волгоград, 1995.-С. 57-68.

62. Храпова Н.П., Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C. и др. Иммунологическая диагностика сапа // Сап / Под ред. Н.Г. Тихонова. Волгоград, 1995. - С. 37 -44.

63. Цветков Н.Е., Черняк В.З. Сап М: Сельхозиздат, 1947. - 257с.

64. Шагинян И.А., Чернуха М.Ю. Бактерии комплекса Burkholderia cepacia: особенности диагностики, организации генома и метаболизма // Молек. генетика, микробиол., вирусол. 2002. - № 2. - С. 7 - 11.

65. Шендеров Б.А., Серкова Г.П. Простые схемы идентификации нефермен-тирующих грамотрицательных бактерий // Вопр. биохим. и физиол. мик-роорг. Саратов, 1980. - № 8. - С. 60 - 81.

66. Abbink F.C., Orendi J.M., de Beaufort A.J. Mother-to-child transmission of Burkholderia pseudomallei II New Enal J. Med. 2001. - Vol. 344, N 15. -P.1171 -1172.

67. Agodi A., Mahenthiralingam E., Barchitta M. et al. Burkholderia cepacia complex infection in Italian patients with cystic fibrosis: prevalence, epidemiology, and genomovar status //J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39. - P. 2891 -2896.

68. Anuntagool A, Intachote P., Naigowit P. et al. Rapid antigen detection assay for identification of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei infection // J.Clin. Microbiol. 1996. - Vol. 34. - P. 975 - 976.

69. Appejraum P.C. Four metods for identification of gram-negative nonferment-ing rods: organisms more commonly encountered in clinical specimens // J. Clin. Microbiol. 1980. - P. 271-278.

70. Ashdown L.R. An improved screening technique for isolation of Pseudomonas pseudomallei from clinical specimens // Pathology. 1979. - Vol. 11, N 2. - P. 293 - 297.

71. Ashdown L.R. Identification of Pseudomonas pseudomallei in clinical laboratory // J. Clin. Pathol. 1979. - Vol. 32, N 5. - P. 500 - 504.

72. Ashdown L.R. Nosocomial infection due to Pseudomonas pseudomallei: two cases and an epidemiologic stydy // Rev. Infect. Dis. 1979. - Vol. 1. - P. 891 -894.

73. Ashdown L.R., Johnson R.W., Kochler G.M.Enzyme linked immunosorbent assay for the diagnosis of clinical and subclinical melioidosis // J. Infect. Dis. -1989.-Vol. 160.-P. 253-360.

74. Balandreau J., Viallard V., Cournoyer B. et al. Burkholderia cepacia genomo-var III is a common plant-associated bacterium // Appl. Environ. Microbiol. -2001. Vol. 67. - P. 982 - 985.

75. Bassett, D.C.J., Stokes K.J., Thomas W. Wound infection with Pseudomonas multivorans. A.water-borne contaminant of disinfectant solutions // Lancet. -1970. Vol.1. - P.l 188-1191.

76. Bauernfeind A., Beer J.H., Friedl A. et al. A case of prostatitis caused by Burkholderia pseudomallei II International congress on melioidosis Bangkok, Thailand.-1998.-P. 85.

77. Bauernfeind A., Roller C., Meyer D. et al. Molecular procedure for rapid detection of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei II J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 36, N 9. - P. 2737 - 2741.

78. Becker K.H. Untersuchungen zur abgrenzung von pseudomallei gegen andere mesophile pseudomonaden mit neuzeitlichen diagnostischen methoden. Inaugural-Dissertation. - Giessen, 1981. - 189p.

79. Bercovier H., Mollaret H., Alonso J. M. et al. Intra and interspecies related-ness of Yersinia pestis by DNA hybridization and its relationship to Yersinia pseudotuberculosis II Curr. Microbiol. - 1980. - Vol. 4 - P. 225 - 229.

80. Bergan T. Human and animal pathogenic member of the genus pseudomonas II In Procariots. Berlin, 1981. - Vol. 1. - P. 666 - 700.

81. Bergey's manual of determinative bacteriology. Baltimore, 1974. - 8 th ed.

82. Bettinger G.E. Evalution of the Mini-Тек, Api-20 E, enterotube and oxi/ferm bacterial identification system with industrial isolates // Dev. Indust. Microbiol. -1979.-20.

83. Bremmelgaard A. Differentiation between Pseudomonas cepacia and Pseudomonas pseudomallei in clinical bacteriology //Acta Pathol. Microbiol. Scand. -1975.-Vol. 83.-P.65-70.

84. Bremmelgaard A., Bygbjerg I., Hoiby N. Microbiological and immunological studies in a case of human melioidosis diagnosed in Denmark // Scand. J. Dis. -1982.-Vol. 14, N4.-P. 271 -275.

85. Brett P.F., Dezhazer D., Woods D.E. Burkholderia thailandensis sp. nov. a Burkholderia pseudomallei like species // Intern. Bacteriol. - 1998. - Vol. 48.-P. 317-320.

86. Brett P.J., Woods D.E. Pathogenesis of and immunity to melioidosis // Acta Trop. 2000. - Vol. 74. - P. 201-210.

87. Brown N.F., Beacham I.R. Cloning and analysis of genomic differences unique to Burkholderia pseudomallei by comparison with B.thailandensis II J. Med. Microbiol. 2000. - Vol. 49, N 11. - P. 993 - 1001.

88. Burkholder W.H. Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs // Phytopathology. -1950.-Vol. 40-P. 115-117.

89. Chambon L., Lajudie P., Fournier J. Etude de la sensibilite du bacilli de Whit-more aux antibiotigues in vitro et chez les maladies atteints de melioidose // Bull. Soc. Pathol. Exot.-1954.-Vol. 47, N l.-P. 139- 153.

90. Coenye Т., LiPuma J.J. Henry D. et al. Burkholderia cepacia genomovar VI, a new member of the Burkholderia cepacia complex isolated from cystic fibrosis patients // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. -2001. Vol.51. - P. 271 - 279.

91. Соепуе Т., Vandamme P., Govan J.R.W., LiPuma J.J. Taxonomy and identification of the Burkholderia cepacia complex // J. Clin. Microbiol. 2001. -Vol.39, N10. - P. 3427 - 3436.

92. Danse DA, Wuthiekanum V, Naigowit P, White NJ. Identification of Pseudo-monas pseudomallei in clinical practice: use of simple screening tests and API 20NE // J.Clin. Pathol. 1989. - Vol. 42. - P. 645 - 648.

93. Dharakul Т., Songsivilai S. Recent developments in the laboratory diagnosis of melioidosis // J. Infect. Dis. Antimicrob. Agents. 1996. - Vol. 13. - P. 77 -80.

94. Dharakul Т., Tassaneetrithep В., Trakulsomboon S. et al. Phylogenetic analysis of ara+ and ara- Burkholderia pseudomalleii isolates and develoopment of a multiplex PCR procedure for rapid discrimination between the two biotypes //

95. J. Clin Microbiol. 1999. - Vol. 37, N 6. - P. 1906 - 1912.

96. Dodin A. Actualite de la melioidose // Rec. Med. Vet. 1976. - Vol. 152, N 5. -P. 285-288.

97. Dodin A., Galimand M. Naissance vie et recul d' une maladie infectionse la melioidose en pays tempere // Arch. Inst. Pasteur Tunis. 1986. - Vol. 63, N 1.-P. 69-73.

98. Dodin A., Galimand M., Chove M. et al. Le bacilli de Whitmore. Germe d' actualite // Med. et malad. infec. 1976. -Vol. 6. - P. 395 - 398.

99. Evans D.H. Colonial variation in Actinobacillus mallei // Canad. J. Microbiol.1.1966. - Vol. 12. - P. 609 - 616.i

100. Fournier J. Les antigens thermostables de Pseudomonas pseudomallei et de Malleomyces mallei et leurs communantes I I Ann. Inst. Pasteu. 1967. - Vol. 112.-P. 93 - 104.

101. Fournier J., Dodin A. Les communants antigeniques du bacille de Whitmore et du bacilli de la morve. Essai d' analyse par immunofluorescence // Bull. Soc. Pathol. Exot. 1971. - Vol. 64, N 4. - P. 832 - 836.

102. Fournier J., Chambon L. La melioidose, maladied, d' actualite et le bacille de Whitmore (Malleomyces pseudomallei) II Paris: Ed. Med. Flammarion, 1958. -P. 47 90.

103. Fraser C., Eisen J., Fleischmann R. et al. Comparative genomics and understanding of microbial biology // Emerg. Infect. Dis. 2000. - Vol. 6, N 5. - P. 505-512.

104. Galimand M., Dodin A. Diagnostic du bacilli de Whitmore an laboratorie // Bull.Soc. Patol. Exot. 1983. - Vol. 76, N 5. - P. 652 - 656.

105. Galimand M., Dodin A. Le point sur la melioidose dans le monde // Bull. Soc. Path. Exot. -1982. P. 375 - 383.

106. Garrity G.M., Johnson K.L., Bell G., Searles D.B. Taxonomic outline of the prokaryotes Bergey* s manual of systematic bacteriology // 2002, 2-nd ed., P. 58-60.

107. Gee J. E., Sacchi C.T., Glass M.B. et al. Use of 16S rRNA Gene Sequencing for Rapid Identification and Differentiation of Burkholderia pseudomallei and B.mallei II J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41, N 10. - P. 4647 - 4654.

108. Gilardi G.L. Pseudomonas species in clinical microbiology // J. Med. 1976. -Vol. 43.-P. 710-715.

109. Govan J.R.W., Hughes J.E., and Vandamme. Burkholderia cepacia: medical, taxonomic and ecological issues // J. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 45. - P. 395-497.

110. Graevenitz A. Clinical role of infrequently encountered nonfermenters // In: glucose nonfermenting gram negative bacteria in clinical microbiology, ed by G. Gilardi. - 1978. -P.l 19 - 154.

111. Heine S., England J., Waag M et al. In vitro antibiotic susceptibilities of Burkholderia mallei (causative agent of glanders) determined by broth Mi-crodilution and E Test // Antimicrobial Agent and Chemotherapy. - 2001. -Vol. 45, N 7. - P. 293 - 297.

112. Henry D., Campbell M., McGimpsey C. et al. Comparison of isolation media for recovery of Burkholderia cepacia complex from respiratory secretions of Patients with Cystic Fibrosis // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N 4. - P. 1004-1007.

113. Henry D.A., Campbell M.E., Li Puma J.J. et al. Identification of Burkholderia cepacia isolates from patients with cystic fibrosis and use of a simple new Selective Medium // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol. 35, N 3. - P. 614 - 619.

114. Henry D.A., Manenthiralingam E., Vandamme P. et al. Phenotipic methods for determining genomovar status of the Burkholderia cepacia complex // J. Clin. Microbiol. 2001/ - Vol. 39, N 3. - P. 1073 - 1078.

115. Holloway В., Krishnapillai V., Stanisich V. Pseudomonas genetics // Ann. Rev. Genet. 1971. - Vol. 5. - P. 425 - 426.

116. Holmes A., Govan J., Goldstein R. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia: A threat to human health? // Emerg. Infect. Dis. 1998. -Vol. 4, N2.-P. 221 -227.

117. Howe C., Sampath A., Spotnitz M. The pseudomallei group: a review // J. Infect. Dis. 1971.-Vol. 124, N6.-P. 598-606.

118. Hsueh P-R, Teng L-J, Lee L-N et al. Melioidosis: an emerging infection in Taiwan? // Emerg. Infect. Dis. 2001. -Vol. 7, N 3. - P. 428 - 433.

119. Inglis TJ, Chiang D, Lee GS et al. Potential misidentification of Burkholderia pseudomallei by API 20NE // Patology. 1998. - Vol.30. - P. 62 - 64.

120. International congress on melioidosis Bangkok, Thailand november 22-25, 1998

121. Isles A., Maclusky M., Corey M. et al. Pseudomonas cepacia infection in cystic fibrosis: an emerging problem // J. Pediatr. 1984. - Vol. 104. - P. 206 -210.

122. Kanai K., Dejsirilert S. Pseudomonas pseudomallei and melioidosis, with special reference to the status in Thailand // Japan. J.med. Sci. Biol. 1988. — Vol. 41.-P. 123- 157.

123. King A., Phillips I. The identification of pseudomonads and related bacteria in a clinical laboratory // J.Med. Microbiol. 1978. - Vol. 11, N 2. - P. 165 -176.

124. Kolbert C., Persing D.H. Ribosomal DNA sequencing as a tool for identification of bacterial patogens // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - Vol. 2. - P. 299305.i

125. Kunakorn M., Markham R.B. Clinically practical seminested PCR for Burkholderia pseudomallei quantitated by enzyme immunoassay with andwithout solution hybridization // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol. 33. - P. 2131-2135.

126. Laboratory procedures for the diagnosis of melioidosis // Depart. Vet. Microbiol. Walter Reed Army Inst, of Res. Washington. 1968.

127. Le van Phung. Chan Doan visinh vat benh nhiem khuan Whitmore // Hanoi. -1982.-20P.

128. Leelarasamee A. Recent development in melioidosis // Curr. Opin. Infect. Dis. 2004. - Vol. 17, N2. - P. 131 - 136.

129. Lehavi O, Aizenstien O, Katz LN et al. Glanders a potential disease for biological warfare in humans and animals // Hare Juan. - 2002. - Vol. 141, N 88 -91.-P. 119.

130. Levine H.B., Maurer R.L. Immunization with an induced avirulent auxotrophic mutant of Ps. pseudomallei // J. Immunol. 1958. - Vol. 81. - P. 433 - 438.

131. Lew A.E., Desmarchelier P.M. Detection of Pseudomonas pseudomallei by PCR and hybridization // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 1326-1332.

132. Li Li, He Jou. Pseudomonas pseudomallei and melioidosis in China // Chin Med. J. 1992. - Vol. 105, N 7. - P. 775 - 779.

133. Liu P.V. Analytical serology of pseudomonadaceae II Analitical serology of microorganisms. Interscience Publishers ed J. Kwapinski. 1969. - Vol. 2. - P. 1-44.

134. Ludwig W. and Schleifer K. Bacterial phylogeny based on 16S and 23S rRNA sequence analysis // FEMS Microbiol. Rev. 1994. - Vol. 15. - P.155 - 173.

135. Mackowiak P.A., Smith J.W. Septicemic melioidosis: occurrence following acute influenza a six years after exposure in Vietnam // Amer. Med. Assoc. -1978. Vol. 240, N 8. - P. 764 - 766.

136. Magge H.R., Mitehell R.M., Fitzwaler J.J. et al. Melioidosis // Med. J. Aust. -1967.- Vol. 1,N22.-P. 1180-1183.

137. Mandel M. Deoxyribonucleic acid base composition in the genus Pseudomonas II J. Gen. Microbiol. 1966. - Vol. 43, N 2. - P. 273 - 275.

138. Miller W.R., Pannell L., Gravitz L. et al. Studies on certain biological characteristics of Malleomyces mallei and Malleomyces pseudomallei II. Virulence and infectivity for animals // J.Bacteriol. 1948. - Vol. 55, N1. - P. 127 - 135.

139. Nigg C., Ruch J., Scott E., Noble R. Enhancement of virulence of Malleomyces pseudomallei // J. Bacterid. 1956. - Vol. 71, N 5. - P. 530 - 541.

140. Palleroni N., Doudoroff M. Some properties and taxonomic subdivisions of the genus Pseudomonas II Ann. Rev. Phytopatol. 1972. - Vol. 10. - P. 73 - 100.

141. Palleroni N., Doudoroff M., Stanier R. et al Taxonomy of the aerobic pseudomonas: The properties of the Pseudomonas stutzeri group // J. Gen. Microbiol. 1979. - Vol. 60. - P. 215 - 231.

142. Palleroni N.L. Family of Pseudomonadaceae II Bergey s manual of systematic bacteriology. Baltimore, 1984. - Vol. 1. - P. 141 -199.

143. Pelt C, Verduin С M, Goessens W. H. F. et al. Identification of Burkholderia spp. In the clinical microbiology laboratory: Comparison of conventional and molecular methods // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N 7. - P. 2158 -2164.

144. Rattanathongkom A., Sermswan R.W., Wongratanacheewin S. Detection of Burkholderia pseudomallei in blood samples using polymerase chain reaction // Mol. Cell. Probes. 1997. - Vol. 11, N 1. - P. 25 - 31.

145. Redfearn M.S., Palleroni N., Stanier R.J. A comparative study of Pseudomonas pseudomallei and Bacillus mallei // J. Gen. Microbiol. -1966. Vol. 43. - P. 293-313.

146. Richard C. Techniques de recherche d, enzymes utiles au diagnostic de bacter-ies a gram negative // Ann. Biol. Clin. 1978. - Vol. 36, N 5 - P. 407.

147. Rossello Mora R, Amann R. The species concept for prokaryotes // FEMS Microbiol. Rev. - 2001. - Vol. 25. - P. 39 - 67.

148. Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al. Public health assessment of potential biological terrorism agents // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8, N 2. - P. 225 - 230.

149. Russo G., Toscano M.A., Gismondo M.R. et al. Incidenza di bacilli gram-negativi non fermentanti in ospiti compromessi // J. Bacteriol. Virol. Immunol. -1981.-Vol. 74.-P. 61-66.

150. Samosornsuk N., Lulitanond A., Saenla N. et al. Evaluation of monoclonal antibody-based latex agglutination test for rapid diagnosis of septicemic melioidosis // Am, J. Trop. Med. Hyg. 1999. - Vol. 61. - P. 735 - 737.

151. Sanford J.P. Melioidosis and glanders // Harrison's Principles of Internal Medicine / Ed. Wintrole W.M., Thorn G., Adams R.D. New York, Mc Graw - Hill Book Co, 1974. - P. 827 -831.

152. Sermswan R.W., Wongratanacheewin S., Anuntagool N. et al. Comparison of the polymerase chain reaction and serologic tests for diagnosis of septicemic melioidosis // Am. J.Trop.Med. Hyg. 2000. - Vol. 63, N3 - 4. - P. 146 - 149.

153. Sirisinha S., Anuntagool N., Intachote P. et al. Antigenic differences between clinical and environmental isolates of Burkholderia pseudomallei // Microbiol. Immunol. 1998. - Vol. 42. - P.731 - 737.

154. Slezak Т., Kuczmazski Т., Ott L. et al. Comparative genomics tools applied to boiterrorism defence II Brief Bioinform. 2003. -Vol. 2, N 4. - P. 133 - 149.

155. Smith D.L., Gumery L.B., Smith E.G. et al. Epidemic of Pseudomonas cepacia in an adult cystic fibrosis unit: evidence of person-to-person transmission I I J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31. - P. 3017 - 3022.

156. Smith M.D, Angus B.J, Wuthiekanun V, White N.J. Arabinose assimilation defines a nonvirulent biotype of Burkholderia pseudomallei II Infect, and Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 4319 - 4321.

157. Srinivasan A, Kraus C.N. Deshazer D. et al. Glanders in a military research microbiologist // The New Engl. J. Med. 2001. - Vol. 345, N 4. - P. 256 -258.

158. Stanier R., Palleroni N., Doudorff M. The aerobic pseudomonas'. a taxonomic study // J. Gen. Microbiol. 1966. - Vol. 43. - P. 159 - 271.

159. Susaengrat W., Dhiensiri Т., Sinavatana P. et al. Renal failure in melioidosis // Nephron. 1987. - Vol. 76, N 2. - P. 167 - 169.

160. Thomas A.D. Evalution of the API 20E and microbact 24E systems for the identification of Pseudomonas pseudomallei II Vet. Microbiol. 1983. - Vol. 8,N6.-P. 611-615.

161. Thomas A.D. Prevalence of melioidosis in animals in northern Queensland // Aaustr. Vet. J. 1981. - Vol. 57. - P. 146 - 148.

162. Vandamme P., Holmes В., Vancanneyt M. et al. Occurrence of multiple geno-movars of Burkholderia cepacia in cystic fibrosis patients and proposal of Burkholderia multivorans sp. nov. Int. // J.Syst. Bacterid. 1997. - Vol. 47. -P. 1188- 1200.

163. Vandamme P., Pot В., Gillis P. et al. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics //Microbiol. Rev.-1996. Vol.60. - P. 407 -438.

164. Vidal D.R., Thibault F., Ferroni A. et al. Melioidosis in France: A review of cases // International congress on melioidosis. Bangkok, Thailand. 1998. - P. 89.

165. Wanvarie S. Melioidosis: certain interesting presentations and treatment // Trop. Georgr. Med. 1984. - Vol. 36. - P. 165 - 168.

166. Weinstock G. Genomics and bacterial patogenesis // Emerg. Infect. Dis. -2000. Vol. 6, N 5. - P. 496 - 505.

167. Welch D.F., Muszynski M.J., Pai C.H. et al. Selective and differential medium for recovery of Pseudomonas cepacia from the respiratory tracts of patients with cystic fibrosis // J. Clin. Microbiol. 1987. - Vol. 25. - P. 1730 - 1734.

168. Wellcome Trust Sanger Institute (www. Sanger. Ac. Uk.) Burkholderia pseudomallei.

169. Whitmore A., Krishnaswami C.S. An account of the discovery of the hitherto undescribed infective disease occurring among the population of Rangoon // Indian Med. Gazette. 1912. - Vol. 47. - P. 262 - 267.

170. Wigley P., Burton N.E. Genotipic and phenotypic relationships in Burkholderia cepacia isolated from cystic fibrosis patients and the environment //J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 86. - P. 460 - 468.

171. Wilson K.H. Molecular biology as a tool for taxonomy // Clin. Infect. Dis. -1995.-Vol. 20.-P. 117-121.

172. World Melioidosis Congress 26th 29th September, 2001. - Western Australia.

173. Yamamoto Т., Naigowit P., Dejsirilert S. In vitro susceptibilities of Pseudomonas pseudomallei to 27 antimicrobial agents // Antimicrob. Agents Chemoter. 1990. - Vol. 34. - P. 2027 - 2029.

174. Yang S. Melioidosis research in China // Acta Tropica. 2000. - Vol. 77. - P. 157-165.

175. Yap E.H., Chan Y.C., Joh K.T. et al. Sudden unexplained death syndrome a new manifestation in melioidosis // Epidemiol, and Infec. - 1991. - Vol. 107. -P. 577-584.

176. Yee K.C., Lee M., Chua C.T. et al. Melioidosis the great mimicker: a report of 10 cases from Malaysia // J. Trop. Med. Hyg. 1988. - Vol. 91. - P. 249 -254.

Информация о работе

Сенина, Татьяна Васильевна
кандидата биологических наук
Волгоград, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы