Электрофоретический анализ и иммуноблоттинг в идентификации и внутривидовой дифференциации буркхольдерий

Мазурова, Ирина Юрьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Электрофоретический анализ и иммуноблоттинг в идентификации и внутривидовой дифференциации буркхольдерий
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Электрофоретический анализ и иммуноблоттинг в идентификации и внутривидовой дифференциации буркхольдерий"

На правах рукописи

МАЗУРОВА Ирина Юрьевна

Электрофоретический анализ н пммуноблоттинг в идентификации и внутривидовой дифференциации буркхольдерий

03.02.03 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

3 1 (.¡АР 2011

Волгоград - 2011 Л/С^

4841722

Работа выполнена в ФГУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Илюхин Владимир Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Яковлев Анатолии Трофимович

доктор медицинских наук, профессор Шуб Геннадий Маркович

Ведущая организация: ФГУЗ «Ставропольский научно-

исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора

Защита состоится « 9Ч> /Х-^с^Хс¿¿Л- 2011 г. в /г часов на заседании диссертационного совета Д 208.008.06 при ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. I).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава» (400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, д. I).

Автореферат разослан « 05"» 201

1 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор социологических наук, доцент ' М.Д. Ковалева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Среди представителей рода Burkholderia, насчитывающего более 30 видов микроорганизмов, большинство являются сапрофитами или фитопатогенами (Т. Соепуе, 2003). Для медицинской практики особое значение имеет идентификация 2-х видов буркхольдерий: В. mallei и В. pseudomallei, являющихся возбудителями особо опасных инфекций (сапа и мелиоидоза), которые относятся ко II группе патогенности и считаются потенциальными агентами биотерроризма (И.В. Абаев, 2003; Г.Г. Онищенко, 2004; Y. Pagnarith, 2010). Для России сап и мелиоидоз не являются эндемичными заболеваниями и относятся к числу «экзотических инфекций». Расширение транспортных связей со странами, в которых регистрируются случаи сапа и мелиоидоза (Монголия, Вьетнам, Турция, Ирак, Китай, Индия) не исключают заноса данных инфекций на территорию России.

Сап - одно из тяжелых антропозоонозных инфекционных заболеваний, поражающий в естественных условиях преимущественно однокопытных, кошачьих, а также верблюдов. Среди людей заболевание носит отчетливый профессиональный характер (болеют конюхи, ветеринары, работники бактериологических лабораторий). В настоящее время на территории России сап официально не регистрируется, однако, вероятность заноса этой инфекции не может быть полностью исключена ввиду того, что возбудитель постоянно циркулирует в ряде пограничных стран: Монголия, Турция, Иран, Ирак, Китай, поражая людей, домашних и диких животных (N. Anuntagool, 2006; S.P. Harvey, 2005). В отличие от сапа, мелиоидоз - инфекционное заболевание, распространенное в регионах с влажным субтропическим климатом. Учитывая высокую вероятность возможности заноса и формирования эндемичных очагов сапа и мелиоидоза на территории нашей страны, представляются актуальными исследования по разработке современных средств диагностики и методов внутривидовой дифференциации как средств эпидемиологического анализа вспышек этих заболеваний.

Близость В. mallei и В. pseudomallei по геному, фенотипическим признакам, в том числе и по антигенному составу, вносит трудности в дифференциацию этих микроорганизмов. Наличие близкородственного к возбудителю мелиоидоза непатогенного вида В. thailandensis, обладающего близкими биохимическими свойствами, антигенным составом, добавляет сложности в дифференциацию В. mallei и В. pseudomallei (В.И. Илюхин, 2002; D.E. Woods, 2002). При этом факторы патогенности этих микроорганизмов до сих пор находятся в стадии активного изучения. Все вышеперечисленное определяет необходимость дальнейшего поиска различий в гено- и фенотипе этих микроорганизмов в целях совершенствования средств их дифференциации и типирования. В полной мере это относится и к средствам серологической диагностики, сравнительному электрофоретическому анализу, которые являются составной частью полифазной таксономии - современной системе идентификации и дифференциации микроорганизмов, основанной на комплексном применении бактериологических, биохшмических,

серологических, молекулярно-биологитеских, генетических методов исследования (Д.А. Чухланцев, 2008; С.С. Но, 2010; P. Vandamme, 2002; D.E. Woods, 2002).

В схеме лабораторной диагностики патогенных буркхольдерий серологические методы по праву занимают позиции достоверных и информативных способов обнаружения специфических антигенов и антител к ним (K.Hodgson, 2009). При этом, для получения диагностических препаратов применялись антигены клеточных стенок и жгутиков, отдельные антигены из состава внутриклеточных (200 KDa, 800 KDa) (B.B. Алексеев, 2003; H.H. Пивень, 2006; P.L. Felgnera, 2009), внеклеточные антигены отдельных штаммов В. pseudomallei (D.P. AuCoin, 2010). Перспективными для совершенствования серологических средств выявления и идентификации буркхольдерий являются: разработка новых серологических тестов, доработка применительно к изучаемым возбудителям имеющихся тестов, использование при получении диагностических препаратов иммунных сывороток к отдельным антигенам различных систем клетки (H.H. Пивень, 2007). Применение в качестве иммуногенных антигенов внеклеточных белков открывает перспективу получения иммунных сывороток для межвидовой дифференциации буркхольдерий (P.J. Brett, 2010).

Цель работы: изучение возможностей дифференциации патогенных буркхольдерий с помощью сравнительного анализа состава клеточных и внеклеточных антигенов, выявляемых иммунологическими методами, в том числе электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия и иммуноблоттингом. Задачи исследования:

1. Унифицировать методы получения антигенных комплексов буркхольдерий и иммунных сывороток к ним.

2. Провести сравнительный анализ составов клеточных и внеклеточных антигенов, выявленных иммунодиффузионными методами, в целях дифференциации патогенных буркхольдерий.

3. Оценить возможность дифференциации буркхольдерий методом иммунофлуоресцентного анализа.

4. Сравнить дифференцирующую способность ТИФМ иммунными сыворотками к клеточным и внеклеточным антигенам в отношении патогенных буркхольдерий.

5. Провести сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков патогенных буркхольдерий для их идентификации и типирования.

6. Изучить возможность использования различий в спектрах перекрестных клеточных и внеклеточных антигенов, полученных методом иммуноблоттинга, для межвидовой и внутривидовой дифференциации буркхольдерий.

Научная новизна. В представленной работе впервые проведено комплексное исследование вариабельности антигенного спектра патогенных буркхольдерий.

Разработаны унифицированные условия получения клеточных и внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий и этапов сравнительного анализа в электрофорезе в ПААГ с ДСН и иммуноблоттинге.

Впервые проведен сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных и внеклеточных белков типичных штаммов В. mallei, В. pseudomallei, В. thailandensis, В. cepacia.

Использование иммунной сыворотки к внеклеточным белкам штамма В. thailandensis 264 впервые позволило дифференцировать патогенные виды буркхольдерий (В. mallei, В .pseudomallei) в реакции иммунодиффузии в геле с живыми культурами.

Впервые оптимизирован алгоритм типирования В. mallei и В. pseudomallei на основе различий в их антигенном спектре. Сравнительный анализ электрофореграмм внеклеточных антигенов, полученных методом иммуноэлектрофореза, позволил выявить различия в составе антигенов буркхольдерий и провести дифференциацию возбудителей сапа и мелиоидоза.

Практическая ценность. На основании изучения чувствительности и специфичности кроличьих иммунных сывороток к антигенам авирулентных штаммов В. thailandensis установлена возможность замены используемых раннее при конструировании мелиоидозных и сапных диагностикумов иммунных сывороток к вирулентным штаммам В. pseudomallei на иммунные сыворотки к антигенам непатогенного вида В. thailandensis, что повышает безопасность и облегчает производство диагностических препаратов.

Материалы настоящего исследования использованы при написании глав «Сап» и «Мелиоидоз» в руководстве «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (Москва «Медицина» «Шико» 2009 г.).

На основании сравнительного электрофоретического анализа суммарных клеточных белков проведено группирование имеющихся в коллекции ВолгоградНИПЧИ штаммов В. pseudomallei, обеспечившее наиболее высокий уровень маркирования этих штаммов.

Документация на оформление двух патентов зарегистрирована в Государственном реестре изобретений Российской Федерации: «Способ дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза преципитирующей антисывороткой» № 2305557 от 10.09.2007 г. и «Способ дифференциации возбудителей мелиоидоза и сапа методом иммуноэлектрофореза» № 2366715 от 10.09.2009 г.

Материалы диссертационной работы используются отделом подготовки специалистов по особо опасным инфекциям ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ в рамках учебных программ. Кроме того, материалы настоящей работы используются при чтении лекций и проведении практических занятий для студентов медико-биологического факультета Волгоградского государственного медицинского университета.

Положения, выносимые на защиту:

1. Набор клеточных и внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий, полученный в унифицированных условиях в разных сериях, идентичен по своему составу.

2. Сравнительный анализ состава клеточных и внеклеточных антигенов В. thailandensis и В. pseudomallei, полученного иммунодиффузионными методами, показывает на близкое родство этих микроорганизмов и доказывает возможность применения в качестве тест-сывороток для антигенного анализа В. pseudomallei иммунных сывороток к клеточным антигенам В. thailandensis.

3. Анализ антигенного состава патогенных буркхольдерий, полученного в реакции иммунной диффузии с живыми культурами и с иммунной сывороткой к внеклеточным антигенам В. thailandensis 264, позволяет дифференцировать штаммы В. pseudomallei и В. mallei.

4. Выявленные с помощью иммуноэлектрофореза различия в составе внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий позволяют провести видовую дифференциацию возбудителей сапа и мелиоидоза.

5. Сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков позволяет дифференцировать штаммы буркхольдерий на инфравидовом уровне, что дает возможность использования этого метода в эпидемиологическом анализе.

6. Использование метода иммуноблоттинга с целью обнаружения антигенных фракций иммунными кроличьими сыворотками к внеклеточным антигенам буркхольдерий позволяет типировать штаммы В. pseudomallei.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006); XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоградский медицинский университет (Волгоград, 2006); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007); Всероссийской научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Волгоград, 2008); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Мин. Обороны России» (Киров, 2008); международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в

противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологической защиты войск и населения. Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология. Микробиология. Биотехнология. Экология» (Екатеринбург, 2009); X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Ставрополь, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 2 опубликованы в периодическом издании из перечня ведущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образования и науки России и рекомендованных для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получено 2 патента на изобретение.

Структура н объем диссертации. Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 разделов обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 168 источников, в том числе 62 отечественных и 106 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 34 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Материалы и методы.

В ходе опытов были использованы следующие культуры буркхольдерий: 60 штаммов В. pseiidomallei, 14 штаммов В. mallei, 10 штаммов В. cepacia, 5 штаммов В. thailandensis, а так же в качестве гетерологичных родов: Pseudomonas alcaligenes ВКМВ 4138, P. testosteroni 11996, P. marginata 1298, P. allicola 8496, P. myxogenes 878, P. taetrolens ВКМВ 904, P. fragi 4002, по 2 штамма P. mendocina (972, 25411), P. stutzeri (903, 17588), 3 штамма Р. pulida (1608, 973, 1301), 4 штамма P. fluorescens (А-4125, ВКМВ 984, 12633, В-1602), 6 штаммов P. aeruginosa (249, BP - 5812, Н - 1, Н - 6, 4000 (АТСС 10145), 13525), Escherihia coli К12; Staphylococcus aureus spp.; Stenotrophomonas maltophilia 4131.

Работа проводилась в соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности).

Для культивирования буркхольдерий и псездомонад использовали твердые и жидкие питательные среды «Difco» (США): Tryptic Soy Agar (ТСА), Pseudomonas Agar F (F-arap), Nutrient Agar с добавлением глицерина (4 %). Микроорганизмы инкубировали в термостатах при 37°С. Время роста определялось целью опыта. В работе использовали химические реактивы повышенной очистки фирм «Serva» и «Sigma» (Германия), «Amersham» (США).

Бакмассу выращивали на матрацах при 37°С. После 18 ч роста (логарифмическая фаза), смывали 0,15 М NaCl, pH 7,2 и стерилизовали охлажденным до -40°С ацетоном в соотношении по объему 1:3. Проверка на стерильность вирулентных штаммов включала посев на жидкие и плотные питательные среды и заражение золотистых хомячков (0,5 мл 5х103 м.к.).

Бакмассу отделяли от ацетона центрифугированием (15 мин, 15000 g) и сушили в вытяжном шкафу.

Для получения клеточных антигенов бакмассу суспендировали в 0,15 М NaCl, pH 7,2 в соотношении: 20 мг сухих м.к. бакмассы к 1 мл буфера (PJ.H. Jackman, 1987). Ультразвуковую дезинтеграцию суспензии проводили на приборе Labsonic 1510 «Braun» (США) (мощность -100 Вт, частота - 20 кГц) пятикратно циклами: 1 мин - обработка, 5 мин - охлаждение. Затем суспензию центрифугировали (15000g, 20 мин), супернатант отбирали и использовали в работе.

Суммарные клеточные белки получали из сухой бакмассы и из живых клеток, обрабатывая их детергентом додецилсульфатом натрия (ДСН) по методу U.K. Laemmli (1970). При работе с живыми культурами две полные стандартные бактериологические петли сырой бакмассы суспендировали в 1 мл лизирующего буфера с ДСН, тщательно размешивали и кипятили 5 мин. Суспензию центрифугировали (8000 g, 20 мин), супернатант использовали в работе (P.J.H. Jackman. 1987).

Для получения экстрацеллюляриых антигенов (ЭЦА) исследуемые культуры выращивали на F-arape, покрытом целлофаном, при 37°С в течение 18 ч. Выросшую бактериальную массу смывали 32 мл 0,15 М раствора NaCl pH 7,2, центрифугировали 25 мин при 8000g. Супернатант фильтровали через фильтры с размером пор 0,45 мкм и стерилизовали внесением охлажденного ацетона до конечной концентрации растворителя 75 %. Выпавшие в

осадок ЭЦА освобождали от ацетона центрифугированием в течение 25 мин при 8000g и высушивали под тягой. Количество белка в экстрактах определяли методом М.М. Bradford (1976).

Для получения иммунных сывороток кроликов иммунизировали антигенами с неполным адьювантом Фрейнда. Одно введение состояло из паравертебральных внутрикожных инъекций 0,2 мл приготовленной смеси антигена и адьюванта в 10 точек. Интервалы между введениями составляли 7 сут, между циклами - 30 сут. Иммунизирующую смесь готовили в объеме 2,0 мл, смешивая 1 мл антигена в 0,15 М NaCl pH 7,2 (1 мг/мл) и 1 мл неполного адьюванта Фрейнда. Животных обескровливали при титре сыворотки в реакции иммунодиффузии в геле (РИД) не менее 1:32 (H.H. Пивень, 1997).

Спектр клеточных и внеклеточных антигенов, специфичность сывороток определяли в РИД в 1,2 % агарозе и РИД с живыми культурами (Г. Фримель, 1987).

Иммуноэлектрофорез проводили в 1 % агарозе, приготовленной на трис-барбиталовом буфере pH 8,6 по общепринятой методике (Г.Фримель, 1987). В качестве свидетеля брали альбумин, окрашенный бромфеноловым синим. После инкубации с иммунной сывороткой в течение 24 - 72 ч, гели отмывали в фосфатном буфере pH 7,2 с 0,02 % азидом натрия, высушивали и окрашивали (H.H. Пивень, 2005).

Твердофазный иммуноферментный анализ проводили по общепринятой методике, используя стандартные 96-луночные планшеты Dynatech (Flow

Laboratories, США) (Д. Кэти, Ч. Райкундалина, 1991). Лунки сенсибилизировали клеточными антигенами и вносили в них анализируемые сыворотки, инкубировали. Затем в лунки вносили антиглобулиновый конъюгат, меченный пероксидазой хрена, используя субстрат (тетраметилбензидин) выявляли антигены. Учет реакции проводили на приборе «Stat Fax 2100 Awareness Technology».

Иммунофлуоресцентный анализ для идентификации буркхольдерий проводили по стандартной методике (Дж. Джонсон, 1991). Использовали конъюгат флуоресцирующих антител против иммуноглобулинов кролика (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

Суммарные клеточные белки фракционировали электрофорезом в ПААГ с ДСН по U.K. Laemmli (1970). Гели окрашивали Куммаси R-250, серебром. Используя современные компьютерные программы (RELP scan, Treecon for WINDOWS), проводили коррекцию денситограмм, выявление пиков, их подсчет, вычисление мер близости денситограмм и группирование исследуемых штаммов на основе критерия средней связи и парногруппового метода с построением дендрограмм сходства. В качестве эталонов молекулярной массы использовали наборы белков фирм «BDH» (Англия), «Hybond - С Amersham» (США), «Serva» (Германия).

Иммуноблоттинг антигенов проводили по H.Towbin (1979). Мембраны инкубировали с антикроличьими пероксидазными конъюгатами («Медгамал», Россия), антигенные фракции выявляли О-диаминобензидином («Serva»). Электрофореграммы и иммуноблотты сканировали или фотографировали цифровой камерой «Dimage 323 Konica».

Статистическую обработку результатов проводили по Ф.М. Меркову (1974).

Результаты исследований.

Достоверность сравнительного антигенного анализа состава клеток различных микроорганизмов в целях дифференциации обеспечивается воспроизводимостью полученных результатов. Для этого использовали унифицированные условия культивирования микроорганизмов, стандартные питательные среды, особо чистые химические реактивы, унифицированные методики выделения антигенов и иммунных сывороток.

В работе унификация методов выполнена с учетом результатов, ранее проведенных в нашей лаборатории исследований по сравнительной оценке полученных различными методами антигенов и сывороток (А.А. Будченко, 1995; Н.Н. Пивень, 2000). Дополнительно, для оценки степени вариабельности состава клеточных антигенов от влияния унифицированных условий выделения антигенных комплексов были получены 3 серии клеточных антигенов штамма В. thailandensis 264. Анализ состава антигенных комплексов полученных серий проводили с помощью РИД с иммунной сывороткой к клеточным антигенам В. thailandensis 264. Выявлено практически полное совпадение линий преципитатов между лунками с сывороткой и лунками с антигенами.

Был проведен сравнительный анализ РИД состава клеточных антигенов иммунными сыворотками, при получении которых в качестве иммунизирующих суспензий использовали антигены штамма (В. thailandensis 264) или смесь антигенов 5 штаммов В. thailandensis (264, 251, 265, 295, 299). Сравнили количество линий преципитатов между лунками с полученными сыворотками и лунками с антигенами, анализируемых штаммов буркхольдерий и P. aeruginosa. Было установлено, сыворотка к смеси антигенов штаммов В. thailandensis не выявила преимуществ в антигенном анализе РИД при сравнении с сывороткой к антигену В. thailandensis 264.

Сравнительный анализ состава клеточных и внеклеточных антигенов, который широко и успешно применяется при идентификации и дифференциации патогенных буркхольдерий, ранее был основан на применении в качестве тест-сывороток иммунных сывороток к антигенам В. pseiidomallei (H.H. Пивень. 1981). Однако, включение непатогенного вида В. thailandensis, близкородственного В. pseiidomallei, в род буркхольдерий открыло перспективу использования в качестве тест-сывороток сыворотки к антигенам этого вида. Эта замена значительно обезопасила бы процесс получения антигенов и иммунных сывороток (В.И. Илюхин, 2002). Выяснение возможности такой замены потребовало изучения перекрестных антигенов штаммов этого вида и штаммов микроорганизмов группы «.pseiidomallei», а t также штаммов типового вида рода Burkholderia - В. cepacia.

При анализе использовали РИД с полученными иммунными сыворотками к клеточным антигенам В. thailandensis 264, В. pseiidomallei С-141, В. mallei 10230, В. cepacia 25416. РИД с иммунной сывороткой к клеточным антигенам В. thailandensis 264 и клеточными антигенами этого штамма и антигенами В. pseudomallei С-141 выявило одинаковое количество преципитатов (рис. 1), Аналогичный результат был получен при использовании иммунной сыворотки к антигенам В. pseudomallei С-141. Эти результаты выявили тождественность составов клеточных антигенов В. pseudomallei и В. thailandensis. Была установлена возможность использования иммунной сыворотки к В. thailandensis 264 в качестве тест-сыворотки при антигенном анализе патогенных буркхольдерий.

Сравнительный анализ перекрестных внеклеточных антигенов патогенных буркхорльдерий с применением иммунных сывороток к внеклеточным (экстрацеллюлярным) антигенам (ЭЦА) иммунодиффузионными методами, в том числе РИД, до настоящего времени не проводился, в отличие от антигенного анализа клеточных антигенов, который довольно полно изучен (H.H. Пивень, 2000).

Для постановки РИД использовали полученные нами иммунные кроличьи сыворотки к ЭЦА В. thailandensis 264, В. pseudomallei С-141, В. mallei 10230, В. cepacia 25416 (рис. 2). При оценке перекрестно-реагирующих ЭЦА с помощью РИД установлено, что максимальное количество линий преципитатов (3) обнаруживается между лунками с иммунными кроличьими сыворотками к

ЭЦА В. pseudomallei С-141 и В. thailandensis 264 и лунками с ЭЦА В. thailandensis 264 и В. pseudomallei С-141.

Рис. 1 - Реакция двойной иммунодиффузии в геле клеточных антигенов Обозначения лунок с антигенами штаммов: 1 - В. thailandensis 264; 2 -В. pseudomallei С-141; 3 - В. pseudomallei 57576; 4 - В. mallei 10230; 5 - В. mallei Ц-5; 6 - В. cepacia 25416. 7 - лунка с иммунной сывороткой к клеточным антигенам В. thailandensis 264.

То есть, и в этом варианте РИД наблюдается очень высокая близость этих микроорганизмов (рис. 2 а, б). Между лункой с сывороткой к ЭЦА В. mallei 10230 и лунками с ЭЦА В. pseudomallei С-141 и В. thailandensis обнаружено по 2 линии преципитатов (рис. 2 а, б), а между лункой с сывороткой к В. mallei 10230 и лункой с ЭЦА В. cepacia 25416 линий преципитатов не обнаружено.

Рис. 2 - Реакция иммунодиффузии в геле ЭЦА и иммунных сывороток к ЭЦА буркхольдерий

Обозначение лунок с ЭЦА штаммов: 5 - В. pseudomallei С-141; 6 -В. thailandensis 264; 7 - В. mallei 10230; 8 - В. cepacia 25416 Обозначения лунок с сыворотками к ЭЦА штаммов: 1 - В. pseudomallei С-141; 2 - В. thailandensis 264; 3 - В. cepacia 25416; 4 - В. mallei 10230.

Таким образом, проведенный анализ составов ЭЦА патогенных буркхольдерий показал, что использование иммунной сыворотки к ЭЦА В. mallei 10230 выявляет различия в составе перекрестных антигенов «группы pseudomallei» и В. cepacia, которые позволяют дифференцировать штаммы этих видов (рис. 2 в, г).

Одним из методов прямого изучения состава внеклеточных антигенов является РИД с живыми культурами. При постановке этой реакции бактерии высеваются бляшками на питательный агар. По мере роста клетки выделяют в окружающую среду ферменты, белки и другие антигены, которые диффундируют в агар. В пробитые около бляшек лунки вносятся иммунные сыворотки, антитела которых также диффундируют в агар. Для изучения состава ЭЦА патогенных буркхольдерий нами была использована РИД с живыми культурами.

ф' щ

- т (

■Ф щ

щ ]; 1

fA ' ш ■ ' W:

11 12

13 1 4 1

■у

Щ с

t к ■

)

' У;).-'-

f V -

10 11

••:. •■ < Р -

v ■

г , 'Iе,

к '

' ■ ' ■ ■■ -

чЧ-vc

10 11

Рис. 3 - Реакция иммунодиффузии в геле с живыми культурами буркхольдерий и сывороткой к ЭЦА В. thailandensis 264 на разных средах

Обозначения бляшек штаммов: 1 - В. pseudomallei 98; 2 - В. pseudomallei 100; 3 - В. pseudomallei 107; 4 - В. pseudomallei 108: 5-5. pseudomallei 139; 6 -В. pseudomallei С-141; 7 - В. cepacia 25416; 8-5. thailandensis 264; 9 - В. mallei 10230; 10 - В. mallei В-120; 11- В. mallei Ц-5; 12 - В. mallei 8; 13 - В. mallei Muksuwar; 14 - В. mallei Будапешт; 15 - В. mallei Иванович; 16 - В. thailandensis 299

Обозначения сред: А - F-arap; Б - L-arap; В - ТСА.

Предварительно было изучено влияние используемой питательной среды на состав ЭЦА. В опыты были взяты питательные среды: Р-агар, Ь-агар, ТСА, в качестве тест-сыворотки - сыворотка к ЭЦА В. thailandensis 264, 7 штаммов

В. mallei, 6 штаммов В. pseudomallei, 2 штамма В. thailandensis, 1 штамм В. cepacia (рис. 3).

В результате линии преципитатов образовывались на F-агаре, ТСА, L-агаре между лунками с сывороткой и бляшками культур всех выросших штаммов В. pseudomallei, В. thailandensis, В. cepacia. В то же время, между лунками с сывороткой и бляшками культур В. mallei линии преципитатов образовывались у нескольких штаммов на ТСА, L-arape и не образовывались на F-arape. Таким образом, состав среды влиял на экстракцию антигенов только штаммов В. mallei. Затем в качестве тест-сывороток были использованы полученные иммунные сыворотки к ЭЦА В. pseudomallei С-141, В. mallei 10230, В. cepacia 25416. Линии преципитатов образовывались между лунками с сыворотками и бляшками большинства анализируемых штаммов. Была поставлена РИД с сывороткой к ЭЦА В. thailandensis 264 и бляшками 60 штаммов В. pseudomallei, 14 штаммов В. mallei, 5 штаммов В. thailandensis, 2 штаммов В. cepacia, 1 штаммом Staphylococcus aureus spp. Установлено, что линии преципитатов образовывались между лунками с сывороткой и всеми бляшками культур штаммов В. pseudomallei, но не образовывались с бляшками культур штаммов В. mallei (рис. 4). Изолят Staphylococcus aureus spp. был использован в качестве отрицательного контроля.

0+<

S W 1! * О ;ц

Ш<> 13

П ш

Рис. 4 - Реакция иммунодиффузии в геле с живыми культурами В. mallei и иммунной сывороткой к ЭЦА В. thailandensis 264

Обозначения бляшек штаммов: с 1 по 14 - штаммы В. mallei; 15 -В. thailandensis 251; 16-5. thailandensis 299.

Выявленные различия в образовании линий преципитатов штаммами В. pseudomallei и В. mallei, полученных в РИД с живыми культурами, использованы нами в предложенном способе дифференциации штаммов этих

видов. На этот способ дифференциации патогенных буркхольдерий получен патент на изобретение № 2305557.

Иммуноэлектрофорез - один из широко распространенных методов аналитического исследования антигенной структуры сложных многокомпонентных систем (Р. Grabar, С.А. Williams, 1955). В данной работе этот метод был использован для сравнительного анализа состава клеточных и внеклеточных антигенов изучаемых микроорганизмов и оценки возможности применения выявленных различий для их дифференциации. Для анализа были взяты типичные штаммы В. pseudomallei С-141, В. thailandensis 264, В. mallei 10230, В. cepacia 25416. Используя иммунные сыворотки к клеточным антигенам анализируемых штаммов, проводили анализ состава клеточных антигенов. Изучая иммуноэлектрофореграммы клеточных антигенов В. pseudomallei С-141, В. thailandensis 264 удалось выявить очень высокое сходство составов преципитатов клеточных антигенов с гомологичными сыворотками и преципитатов перекрестных антигенов этих штаммов (рис. 5). Данные позволили сделать окончательный вывод о возможности применения в качестве тест-сывороток для антигенного анализа В. pseudomallei иммунных сывороток к клеточным антигенам В. thailandensis. Анализ состава ЭЦА изучаемых штаммов в ИЭФ с иммунными сыворотками к ЭЦА этих штаммов выявил наибольшее количество преципитатов при использовании гомологичных сывороток (рис. 5). Так, на иммуноэлектрофореграммах ЭЦА В. pseudomallei С-141 и В. thailandensis 264 с иммунными сыворотками к ЭЦА этих же штаммов выявлено по 8 линий преципитатов. Схожие результаты были получены при ИЭФ ЭЦА штаммов В. pseudomallei 56770, 57576, 100 с этими же сыворотками. Иммуноэлектрофореграммы ЭЦА штаммов В. mallei с гомологичными сыворотками выявили в нейтральных зонах со сдвигом в катодные области по одной мажорной линии преципитата, что указывает на более «бедный» состав внеклеточных антигенов, секретируемых штаммами возбудителя сапа в питательную среду, чем состав секретируемых антигенов штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis (рис. 5). На основе выявленных методом ИЭФ различий в составе перекрестных ЭЦА патогенных видов В. pseudomallei и В. mallei был разработан способ дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза, на который получен патент «Способ дифференциации возбудителей мелиоидоза и сапа методом иммуноэлектрофореза» № 2366715 от 10.09.2009 г.

Проведен анализ возможности дифференциации патогенных видов от видов В. thailandensis, В. cepacia с помощью непрямого метода флуоресцирующих антител (НМФА) с иммунными сыворотками к ЭЦА буркхольдерий.

Рис. 5 - Иммуноэлектрофореграмма ЭЦА патогенных буркхольдерий с иммунными сыворотками к ЭЦА.

В работе использовали иммунные кроличьи сыворотки к внеклеточным антигенам В. thailandensis 264, В. pseudomallei С-141, В. mallei 10230, В. cepacia 25416. Было определено, что сыворотки видов группы <<pseudomallei» с интенсивностью свечения (+ + +) выявляли клетки трех видов буркхольдерий (табл. 1). При этом с помощью этих сывороток клетки В. cepacia не определялись. Используя сыворотку к ЭЦА В. cepacia 25416, мы смогли идентифицировать большинство имеющихся у нас штаммов В. cepacia, однако наблюдалось окрашивание как клеток некоторых штаммов псевдомонад, так и клеток патогенных буркхольдерий. Таким образом, наличие перекрестных антигенов у исследуемых буркхольдерий, не дает возможности использовать сыворотку к ЭЦД В. cepacia 25416 для дифференциации видов В. cepacia от видов группы «pseudomallei». В то же время, используя иммунные сыворотки к ЭЦА штаммов группы «pseudomallei» возможна дифференциация штаммов этих видов от штаммов В. cepacia и псевдомонад. Для окончательного вывода о возможности применения метода НМФА с иммунными сыворотками для такой дифференциации необходимо проверить большее количество патогенных для человека видов микроорганизмов.

Сравнительный анализ специфической активности анализируемых иммунных сывороток относительно суммарных антигенов, изолированных из буркхольдерий и ряда псевдомонад, был проведен непрямым вариантом ТИФМ. Были исследованы сыворотки к клеточным антигенам В. pseudomallei С-141, В. cepacia 25416, В. thailandensis 264, а также к ЭЦА штаммов В. pseudomallei С-141, В. mallei 10230, В. cepacia 25416, В. thailandensis 264. Использовали клеточные антигены: 10 штаммов В. pseudomallei, 4 штаммов В. mallei, 2 штаммов В. thailandensis, 14 штаммов В. cepacia и 11 штаммов псевдомонад. Анализ активности иммунных кроличьих сывороток к клеточным антигенам В. pseudomallei С-141, В. thailandensis 264 в отношении клеточных

антигенов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis 264 показал отсутствие различий в чувствительности.

Таблица 1 Результаты НМФА буркхольдерий и псевдомонад с сыворотками к ЭЦА буркхольдерий___

№ п./п. Название штамма Уровень специфического свечения клеток:

Иммунные сыворотки к ЭЦА

B.pseudomallei С-141 В. mallei 10230 B.thailandensis 264 В. cepacia 25416

1 . B.pseudomalleiC-l4\ +++ +++ +++ +++

2 В. pseudomallei 100 +++ +++ +++ +++

3 В. pseudomallei 97 1 i II +++ +++

4 В. pseudomallei 108 +++ +++ +++ -

5 В. pseudomallei 110 +++ - +++ -

6 В. mallei 10230 +++ -н+ 4-Н- +++■

7 В. mallei В-120 +++ +Н- +++ +++

8 В. mallei Z-X2 +++ +++ +++ +++

9 В. mallei Ц-5 +++ +++ +++ +++

10 В. mallei - Muksuwar - +++ - -

11 В. cepacia 25416 - - - +++

12 В. cepacia 8235 - - - +++

13 В. thailandensis 264 +++ +++ +++

14 В. thailandensis 251 +++ +++ +++ ++

15 P. stutzeri 271 - - -

16 P. fluorescens В - - - +++

17 P. putida 901 - - - +++

18 S. maltophilia 4131 - - - -

19 P. alcaligenes 4138 - - - -

Примечание: «-» - отрицательный результат реакции

Иммунные сыворотки вступали в специфическую реакцию в разведении 10° -10"6. Эти же сыворотки реагировали с клеточными антигенами штаммов В. cepacia в разведении 10"2 -10"3 , что оказалось на 3 порядка меньше, чем при взаимодействии с клеточными антигенами штаммов группы «pseudomallei». Чувствительность иммунной сыворотки к клеточным антигенам В. cepacia 25416 в отношении клеточных антигенов штаммов видов группы «pseudomallei» (10"'-10'3) была ниже относительно клеточных антигенов гомологичного вида, которая составляла 10"4. При использовании в опыте сывороток к ЭЦА штаммов В. pseudomallei С-141, В. mallei 10230, В. thailandensis 264 с клеточными антигенами этих же штаммов обнаружен положительный результат ТИФМ в разведениях 1x10'4 до 1x10"5. В наибольших разведениях сыворотки вступали в реакцию с клеточными антигенами гомологичных видов. Сыворотка к ЭЦА В. pseudomallei С-141 не взаимодействовала с эпитопами клеточных антигенов штаммов В. cepacia. Активность изучаемых сывороток буркхольдерий к клеточным антигенам при взаимодействии в ТИФМ с клеточными антигенами псевдомонад оказалась более низкой и составляла 1х10''-10"3. То есть, использование в ТИФМ этих

сывороток позволяет дифференцировать микроорганизмы рода буркхольдерий от псевдомонад.

Сравнительный анализ электрофореграмм суммарных клеточных белков, полученных методом электрофореза в ПААГ с ДСН, успешно применялся при дифференциации многих близкородственных микроорганизмов (D.T. Holland, 1998; С. Franzen, 1999; В. Lanoot, 2002). В данной работе была изучена возможность использования этого метода для инфравидовой и внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий, а также для дифференциации их от непатогенных близкородственных видов В. cepacia, В. thailandemis и псевдомонад. Для достижения поставленной цели были взяты по .5 штаммов каждого вида: В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia и В. thailandensis (рис. 6). У патогенных видов отбирали штаммы, изолированные в разных эндемичных районах. Протеинограммы, полученные на разных гелях, корректировали по маркерным белкам с помощью компьютерных программ.

Рис. 6 - Электрофореграммы суммарных клеточных белков 4 видов буркхольдерий

Обозначения: 1 - стандартные белки («Pharmacia» Швеция); 2 - В. pseudomallei 133; 3 - В. pseudomallei 108; 4 - В. pseudomallei 107; 5 - В. pseudomallei 57576; 6 - В. pseudomallei 100; 7 ■• В. mallei 10230; 8 - В. mallei Ц-4; 9 - В. mallei Ц-5; 10 -В. mallei 5584; 11-5. mallei 8; 12 - В. thailandensis 299; 13 - В. thailandensis 295; 14 - В. thailandensis 251; 15 - В. thailandensis 265; 16-5. thailandensis 264; 17 -В. cepacia 3181; 18-5. cepacia 25416; 19-5. cepacia 8235; 20 -В. cepacia 8236; 21-5. cepacia 8237.

Был проведен сравнительный анализ протеинограмм, который заключался в визуальном просмотре полученных протеинограмм, в подсчете фракций, определении их молекулярных масс, оценке сходства спектров методами числовой таксономии. На электрофореграммах было выявлено 30-35 фракций с молекулярной массой в диапазоне от 19 до 125 кВа.

Анализ вычисленных коэффициентов корреляции (Ккор) для денситограмм 5 штаммов каждого из 4 видов буркхольдерий позволил подтвердить ранее сделанные выводы о различиях в степени сходства штаммов

этих видов. Кластерный анализ матриц сходства, составленных из Ккор, позволил распределить штаммы на группы и построить дендрограммы сходства. Анализ полученных дендрограмм позволил выяснить, что штаммы видов В. pseudomallei и В. cepacia имели Ккор в диапазоне (71 - 94 %) и дифференциация их была достоверной. Ккор протеинограмм штаммов В. mallei имели значения в диапазоне 90 - 96 %, что подтвердило ранее известную генетическую близость штаммов микроорганизмов этого вида. Ккор электрофореграмм белков штаммов В. thailandensis имел значения в диапазоне 92 - 99 %. Кластерный анализ полученных матриц сходства выявил достоверную возможность дифференциации взятых для анализа штаммов В. pseudomallei и В. cepacia. С меньшим уровнем дифференциации на основе этого метода распределились на группы штаммы В. mallei. Имеющиеся в нашем распоряжении штаммы В. thailandensis практически этим методом не дифференцировались.

Нумерический анализ электрофореграмм 59 штаммов В. pseudomallei позволил разделить сравниваемые штаммы на уровне 89 % сходства на 4 группы, состоящие из 6 и более штаммов. В первую группу вошли 24 штамма, во вторую 13 штаммов, в третью 10 штаммов и четвертую 6 штаммов. Шесть штаммов на этом уровне сходства не дифференцировались (табл. 2).

Таким образом, сравнительный анализ суммарных клеточных белков выявил высокую однородность изучаемых штаммов В. pseudomallei, которая подтверждается отсутствием стабильных лабораторных методов внутривидового группирования штаммов и высоким уровнем (до 100 %) идентификации штаммов мелиоидоза с помощью автоматических систем тестирования (L.R. Ashdown, 1981).

Таблица 2 Группирование штаммов В. р5е^ота1Ш на основе сравнительного анализа электрофореграмм суммарных клеточных белков

№ группы штаммов Количество штаммов в группе Названия штаммов

1 24 1; 114: 102; 112; 109; 128:99; 113; 117;116; 132; 136; 137; 138; 2; 130; 131; 129; 125; 60939; 60806; 61503; 60913;139

2 13 97; 135; 111; 110; 134; С-141; 140; ВКМ-900; VPA; 98; 101; 133; 108

3 10 56738; 56812; 56830; 57582; 51274; 57562; 59426; 59214; 56738; 59361

4 6 100; 107; 115; 56770; ССЕВ-860; 118

5 6 103; 60631; 60263; 57576; 119; 127

Изучены ЭЦА анализируемых видов с помощью сравнительного электрофоретического анализа. На электрофореграммах после окраски Кумасси R-250 выявлено 7-9 фракций, после окраски гелей серебром - 9 - 11 фракций (рис. 7). Увеличение количества фракций на гелях при окраске серебром в сравнении с окраской Кумасси R-250 связано с тем, что серебром окрашиваются протеины, углеводные антигены (B.R. Oakley, 1980).

Сопоставление электрофореграмм внеклеточных белков выявило высокое сходство электрофореграмм В. thailandensis 264, В. pseudomallei С-141. Электрофореграмма В. mallei 10230 в большей степени отличалась от электрофореграмм штаммов 2 других видов группы <<pseudomallei»: В. thailandensis 264, В. pseudomallei С-141. Различия наблюдались в диапазоне молекулярных масс от 23 до 45 KDa. Электрофореграмма штамма В. cepacia 25416 отличалась от электрофореграмм всех трех видов группы «pseudomallei», в составе которой обнаружены фракции 19 и 26 кОа, отсутствующие в составе остальных сравниваемых электрофореграмм.

MW (kDa)

■*- 94 <«—67

♦—43 ♦—30

♦—20 ♦—14

1 2 3 4 5

Рис. 7 - Электрофореграмма ЭЦА буркхольдерий (окраска серебром) Обозначения: 1 - В. thailandensis 264; 2 - В. pseudomallei С-141; 3 - В. mallei 10230; 4 - В. cepacia 25416; 5 - стандартные белки («Pharmacia» Швеция).

Расчет коэффициентов корреляции денситограмм, снятых с электрофореграмм анализируемых штаммов, позволил выявить следующие результаты: наибольший Ккор выявлен между В. thailandensis 264, В. pseudomallei С-141 - 94 %. Меньшее сходство выявлено между этими штаммами и В. mallei 10230 - 88 %. Ккор между группой «pseudomallei» и В. cepacia 25416 составил 80 %. То есть, вычисленные коэффициенты сходства подтвердили фенотипические различия штаммов этих видов.

Была изучена возможность типирования возбудителя мелиоидоза методом ИБ клеточных антигенов с иммунными сыворотками к ЭЦА. Анализируя полученные иммуноэлектрофореграммы, фракции которых выявлены иммунной сывороткой к ЭЦА В. pseudomallei С-141, обнаружили высокий уровень сходства иммуноэлектрофореграмм по наличию крупных фракций. Имеющиеся различия наблюдались в зоне молекулярных масс 45 - 66

кВа. Используя схемы иммуноэлектрофореграмм, вычислили коэффициенты сходства Дайса, составили матрицу сходства, кластерный анализ которой позволил построить дендрограмму (рис. 8).

1 2 3 4 5 Рис. 8 - Иммуноэлектрофореграмма иммуноблоттинга клеточных антигенов штаммов В. pseudomallei с иммунной сывороткой к ЭЦА В. psendomallei С-141 Обозначения: I- В. pseudomallei С-141; 2 - В. pseudomallei 57576; 3 -В. pseudomallei 133; 4 - В. pseudomallei 107; 5 - В. pseudomallei 115.

Анализ дендрограммы выявил высокое сходство двух пар штаммов: В. pseudomallei С-141 (трек №1) и В. pseudomallei 57576 (трек 2) (коэффициент Дайса 92 %), образующие 1 группу, и В. pseudomallei 107 (трек 4) и В. pseudomallei 115 (трек 5) (коэффициент Дайса 96 %), образующие со штаммом В. pseudomallei 133, вторую группу. Окончательно, коэффициент Дайса между парой штаммов (трек 1 и 2) и группой из трех штаммов составил 81 % (рис. 9). Таким образом, на основе полученных методом иммуноблоттинга иммуноэлектрофореграмм клеточных антигенов с сывороткой к ЭЦА В. pseudomallei С-141, возможно типирование штаммов В. pseudomallei.

Проведен анализ возможности тигшрования штаммов В. mallei на основе сравнения иммуноэлектрофореграмм, полученных методом иммуноблоттинга клеточных антигенов с иммунными сыворотками к ЭЦА. Кластерный анализ матриц сходства, составленных из коэффициентов Дайса иммуноэлектрофореграмм антигенов штаммов В. mallei, показал, что достоверная дифференциация этим методом штаммов возбудителя сапа невозможна.

100 90 80 70 %

2 3

5 —1

Рис. 9 - Деидрограмма кластерного анализа матрицы сходства, составленной из коэффициентов Дайса иммуноэлектрофореграмм клеточных антигенов штаммов B.pseudomallei.

Обозначения: 1- В. pseudomallei С-141; 2-Я pseudomallei 57576; 3 -В. pseudmallei 133; Л- В. pseudomallei 107; 5 - В. pseudomallei 115.

Были проанализированы иммуноэлектрофореграммы, полученные в иммуноблоттинге ЭЦА с иммунными сыворотками к клеточным и внеклеточным антигенам. Выявлены различия в составах антигенов, которые возможно использовать для дифференциации штаммов изучаемых 4 видов буркхольдерий.

ВЫВОДЫ:

1. Унификация условий при выделении клеточных и внеклеточных антигенов буркхольдерий, а также иммунных сывороток, обеспечивает идентичность исследуемого материала в разных сериях, тем самым повышая ценность исследований в сравнительном аспекте в целях разработки методов иммунологической идентификации патогенных буркхольдерий.

2. Сравнительный анализ клеточных и внеклеточных антигенов В. thailandensis и В. pseudomallei, полученных иммунодиффузионными методами, указывает на близкое родство этих микроорганизмов и доказывает возможность применения в качестве тест-сывороток для антигенного анализа патогенных буркхольдерий иммунных сывороток к клеточным антигенам В. thailandensis.

3. Применение для антигенного анализа патогенных буркхольдерий в реакции иммуннодиффузии с живыми культурами и иммунной сывороткой к внеклеточным антигенам В. thailandensis 264 позволил дифференцировать культуры В. pseudomallei от В. mallei.

4. Сравнительный анализ состава клеточных и внеклеточных антигенов, выявленного иммуноэлектрофорезом, обнаружил значительные различия в составе внеклеточных антигенов В. pseudomallei, В. thailandensis и В. mallei, которые позволили дифференцировать виды В. pseudomallei и В. mallei.

5. Изучение возможности применения полученных сывороток к внеклеточным антигенам в диагностике буркхольдерий в сравнении с сыворотками к клеточным антигенам методами ТИФМ и МФА выявило высокую специфичность иммунных сывороток к внеклеточным антигенам.

6. На основании сопоставления спектров суммарных клеточных белков, полученных методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия, проведена внутривидовая дифференциация штаммов возбудителя мелиоидоза имеющихся в коллекционном центре ВолгоградНИПЧИ (4 группы на уровне сходства 89 %).

7. Сравнение электрофореграмм суммарных клеточных белков штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis, В. cepacia и набора гетерологичных видов бактерий, позволило четко выделить штаммы буркхольдерий в отдельную группу, относящуюся к одному роду.

8. Использование иммуноэлектрофореграмм клеточных антигенов, полученных методом иммуноблоттинга с иммунными сыворотками к внеклеточным антигенам буркхольдерий дало возможность типировать изучаемые штаммы В. pseudomallei.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Мазурова, И.Ю. Изучение клеточных и внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий методом твердофазного иммуноферментного анализа /' Будченко A.A., Мазурова И.Ю. // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - № 2 (22). - Приложение (ч. I). - С. 199 - 200.

2. Мазурова, И.Ю. Фенотипическая и генотипическая идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia / Антонов В.А., Илюхин В.И., Сенина Т.В., Лобойко А.Д., Ткаченко Г.А., Зинченко О.В., Мазурова И.Ю. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии - 2008. - № 4 - С. 78 - 82.

3. Мазурова, И.Ю. Лабороторная диагностика инфекционных болезней / Алексеев, В.В., Илюхин В.И., Замараев B.C., Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В., Сенина Т.В., Мазурова И.Ю., Викторов Д.В., Зинченко О.В., Липницкий A.B., Лесовой B.C., Гришина М.А., Савченко С.С. // Практическое рук. под ред. акад. РАМН, проф. Г.Г. Онищенко - Москва. - 2009. - 472 с.

4. Мазурова, И.Ю. Сравнительный анализ электрофореграмм суммарных клеточных белков в идентификации и типировании патогенных буркхолдерий. Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму / Будченко A.A., Илюхин В.И., Викторов Д.В., Мазурова И.Ю. // под ред. Онищенко Г.Г., Кутырева В.В., Алексеева В.В. - Волгоград. - 2005. - С. 121 -122.

5. Мазурова, И.Ю. Анализ клеточных и экстрацеллюлярных антигенов буркхольдерий в твердофазном иммуноферментном методе / Будченко A.A., Мазурова И.Ю. // Актуальные проблемы эксперементальной и клинической медицины: XI Региональная конференция молодых исследователей Волгоградской области. - Волгоград. - 2006. - С. 14 - 15.

6. Мазурова, И.Ю. Анализ состава суммарных клеточных белков и явления фагопродукции Burkholderia thailandensis / Будченко A.A., Сеимова И.К., Мазурова И.Ю. // Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий госуд.-участн. СНГ». -Оболенск. - 2006. - С. 90 - 91.

7. Мазурова, И.Ю. Способ экспресс-обнаружения Burkholderia cepacia и дифференциации его от возбудителей сапа и мелиоидоза / Будченко A.A., Храпова Н.П., Илюхин В.И., Сенина Т.В., Мазурова И.Ю. // Матерериалы VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий госуд.-участн. СНГ"». - Оболенск. - 2006. - С. 91 - 92.

8. Мазурова, И.Ю. Изучение возможности использования иммунных сывороток к экстрацеллюлярным антигенам буркхольдерий для дифференциации штаммов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei / Будченко A.A., Мазурова И.Ю. // Материалы X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России». -Ставрополь. - 2007. - С. 52 - 54.

9. Мазурова, И.Ю. Изучение специфической активности кроличьих сывороток против клеточных и экстрацеллюлярных антигенов Burkholderia в твердофазном иммуноферментном методе / Будченко A.A., Илюхин В.И., Мазурова И.Ю. // Материалы X Межгосударственной научно-практической конференции госуд.-участн. СНГ «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России». -Ставрополь. - 2007. - С. 123 - 124.

10. Мазурова, И.Ю. Использование анализа иммуноэлектрофореграмм клеточных и внеклеточных антигенов при дифференцифции буркхольдерий / Будченко A.A., Мазурова И.Ю., Кулаков М.Я. // Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории госуд.-участн. СНГ». -Волгоград. - 2008. - С. 38 - 40.

11. Мазурова, И.Ю. Изучение антигенных комплексов Burkholderia в реакции иммунодиффузии и иммуноэлектрофорезе с различными сыворотками / Корсакова И.И., Напалкова Г.М., Храпова Н.П., Ломова Л.В., Мазурова И.Ю. // Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории госуд.-участн. СНГ». - Волгоград. - 2008. - С. 97 - 98.

12. Мазурова, И.Ю. Применение иммуноблоттиш'а клеточных белков для типирования возбудителя мелиоидоза / Будченко A.A., Мазурова И.Ю. //

Материалы IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории госуд.-учасгн. СНГ». - Волгоград. - 2008. - С. 111 - 112.

13. Мазурова, И.Ю. Возможность использования гликопротеиновых антигенов для диагностики и иммунопрофилактики сапа и мелиоидоза / Корсакова И.И., Напалкова Г.М., Авророва И.В., Пивень Н.И., Храпова Н.П., Ломова Л.В., Сидорук В.А., Будченко A.A., Мазурова И.Ю., Кулаков М.Я. // Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - Киров. - 2008. - С. 83 - 86.

14. Мазурова, И.Ю. Изучение клеточных и внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий методом твердофазного иммуноферментного анализа / Будченко A.A., Мазурова И.Ю. // Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - Киров. - 2008. - С. 188 - 190.

15. Мазурова, И.Ю. Применение иммуноблоттинга клеточных белков для типирования возбудителя мелиоидоза / Мазурова И.Ю., Будченко A.A. // Актуальные проблемы биологической защиты войск и населения. Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология. Микробиология. Биотехнология. Экология. - Екатеринбург. -2009.-С. 174- 175.

16. Мазурова, И.Ю. Анализ антигенного состава буркхольдерий в реакциях преципитации с антисыворотками против Burkholderia thailandensis / Мазурова И.Ю., Будченко A.A. // Международная научно-практическая конференция «Перспективы сотрудничества госуд.-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней». - Новосибирск. - 2009. - С. 137 - 139.

17. Мазурова, И.Ю. Антигенные комплексы патогенных буркхольдерий, обладающие функциональной и диагностической значимостью / Илюхин В.И., Храпова Н.П., Корсакова И.И., Напалкова Г.М., Ломова Л.В., Голосеев Ю.А., Дрефс Н.М., Чупрына Н.А, Будченко A.A., Мазурова И.Ю., Жукова С.И., Авророва И.В., Прошина О.Б., Кулаков М.Я., Пушкарь В.Г., Ротов К.А., Снатенков Е.А. // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране РФ (реферативный сборник) Саратов. - 2009. - С. 50-51.

18. Мазурова, И.Ю. Дискриминирующая способность иммунных кроличьих сывороток против внеклеточных антигенов буркхольдерий / Будченко A.A., Мазурова И.Ю. // Материалы научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней». - Иркутск. - 2009. Том 16, № 3. - С. 77 -78.

19. Мазурова, И.Ю. Сравнительный анализ перекрестных внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий в иммуноблоттинге / Будченко A.A., Мазурова И.Ю. // Материалы X Межгосударственной научно-практической конференции госуд. - участн. СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и

ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения госуд.-участи. СНГ». -Ставрополь. - 2010. - С. 166 - 167.

20. Мазурова, И.Ю. Сравнительное изучение патогенных и непатогенных буркхольдерий / Корсакова И.И., Храпова Н.П., Илюхин В.И., Будченко A.A., Напалкова Г.М., Ломова Л.В., Мазурова И.Ю. // Материалы X Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Актуальные проблемы предупреждения и ликвидации последствий чрезвычайных ситуаций в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения госуд.-участн. СНГ». Ставрополь. - 2010. - С. 195 -196.

Патенты па изобретения:

1. Патент № 2305557 РФ Способ дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза преципитирующей антисывороткой / A.A. Будченко, И.Ю. Мазурова, В.И. Илюхин. - № 2006100651/13; заявл. 10.01.2006; опубл. 10.09.2007, Бюл. № 25.

2. Патент № 2366715 РФ Способ дифференциации возбудителей мелиоидоза и сапа методом иммуноэлектрофореза / A.A. Будченко, И.Ю. Мазурова, В.И. Илюхин. - № 2008111417/17; заявл. 24. 03. 2008; опубл. 10.09.2009, Бюл. № 25.

Мазурова Ирина Юрьевна «ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ II ИММУНОБЛОТТИНГ В ИДЕНТИФИКАЦИИ И ВНУТРИВИДОВОЙ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БУРКХОЛЬДЕРИЙ»

03.02.03 - Микробиология

Волгоград, 2011

Формат 60x90 1/16. Печать трафаретная. Бумага офсетная № 65. Гарнитура «Тайме». Тираж 100 экз. Заказ № 2524. Отпечатано в ООО «Бланк». Лиц. №3550. 400131, г. Волгоград, ул. Скосырева, 2а.

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Мазурова, Ирина Юрьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Принципы идентификации и типирования патогенных буркхольде- 13 рий сравнительным электрофоретическим анализом белков и серологическими методами

1.2 Современное состояние использования серологических и иммуно- 16 химических методов в дифференциации патогенных буркхольдерий

1.3 Использование иммуноблоттинга в дифференциации патогенных 21 буркхольдерий

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Штаммы микроорганизмов

2.2 Питательные среды, условия культивирования

2.3 Методы выделения и очистки антигенных комплексов

2.4 Компьютерная и статистическая обработка полученных результатов

ГлаваЗ ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ ИМ

МУНОДИФФУЗИОННЫМИ МЕТОДАМИ

3.1 Унификация методик выделения антигенов

3.2 Изучение возможности применения преципитирующих антигенов 44 для дифференциации патогенных буркхольдерий

3.3 Изучение возможности дифференциации буркхольдерий в реакции 50 иммунодиффузии с живыми культурами

3.4 Использование антигенного состава буркхольдерий для дифферен- 55 циации с помощью иммуноэлектрофореза

Глава 4 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НЕПРЯМОГО МЕТОДА ФЛУОРЕСЦИРУЮ- 61 ЩИХ АНТИТЕЛ С ИММУННЫМИ СЫВОРОТКАМИ К ВНЕКЛЕТОЧНЫМ АНТИГЕНАМ ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ БУРКХОЛЬ-ДЕРИЙ

Глава 5 ИЗУЧЕНИЕ ДИФФЕРЕНЦИРУЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ ИМ- 63 МУННЫХ СЫВОРОТОК К КЛЕТОЧНЫМ И ВНЕКЛЕТОЧНЫМ АНТИГЕНАМ БУРКХОЛЬДЕРИЙ В ТВЕРДОФАЗНОМ ИММУ-НОФЕРМЕНТНОМ МЕТОДЕ

Глава 6 ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СУММАРНЫХ КЛЕТОЧ- 68 НЫХ БЕЖОВ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ

6.1 Изучение возможности дифференциации буркхольдерий методом 69 сравнительного анализа спектров суммарных клеточных белков

6.2 Межвидовая дифференциация буркхольдерий и псевдомонад

6.3 Типирование буркхольдерий методом сравнительного электрофоре- 76 тического анализа

Глава 7 ИЗУЧЕНИЕ АНТИГЕННОГО СОСТАВА ПАТОГЕННЫХ БУРК- 83 ХОЛЬДЕРИЙ В ИММУНОБЛОТТИНГЕ

7.1 Характеристика антигенов буркхольдерий

7.2 Различия в составе клеточных антигенов, выявленные в иммуноб- 86 лоттинге с иммунными кроличьими сыворотками к внеклеточным антигенам буркхольдерий В. pseudomallei, В. mallei

7.3 Инфравидовая дифференциация буркхольдерий по составу внекле- 95 точных антигенов

Введение Диссертация по биологии, на тему "Электрофоретический анализ и иммуноблоттинг в идентификации и внутривидовой дифференциации буркхольдерий"

Среди представителей рода Burkholderia, насчитывающего более 30 видов микроорганизмов, большинство являются сапрофитами или фитопатогенами [91, 92]. Для медицинской практики имеет значение идентификация 2-х видов буркхольдерий: В. mallei и В. pseudomallei, являющихся возбудителями особо опасных инфекций (сапа и мелиоидоза), которые относятся ко II группе пато-генности и считаются потенциальными агентам биотерроризма [1, 11, 14, 36, 56, 129, 131, 138, 145]. Для России сап и мелиоидоз не являются эндемичными заболеваниями и относятся к числу «экзотических инфекций». Расширение транспортных связей со странами, в которых регистрируются случаи сапа и мелиоидоза (Монголия, Вьетнам, Турция, Ирак, Китай, Индия) не исключают заноса данных инфекций на территорию России. В национальных системах классификации особо опасных бактериальных патогенов Великобритании, США и Канады возбудители сапа и мелиоидоза также входят в ведущие группы по степени опасности для человека [145].

Сап — одно из тяжелых антропозоонозных инфекционных заболеваний, поражающий в естественных условиях преимущественно однокопытных, кошачьих, а также верблюдов. Среди людей заболевание носит отчетливый профессиональный характер (болеют, как правило, конюхи, ветеринары, кавалеристы, работники бактериологических лабораторий и т.п.). Сап на территории России в настоящее время официально не регистрируется, однако, вероятность заноса этой инфекции не может быть полностью исключена ввиду того, что возбудитель ее постоянно циркулирует в ряде пограничных стран (Монголия, Турция, Иран, Ирак, Китай), поражая людей, домашних и диких животных [59, 64, 109].

В отличие от сапа, мелиоидоз - инфекционное заболевание, распространенное в регионах с влажным субтропическим климатом. Существует классификация регионов, где встречается мелиоидоз [34, 120]. В первую группу входят страны Юго-Восточной Азии (Таиланд, Малайзия, Сингапур, Южный Вьетнам), имеющие эндемоэнзоотические очаги естественного происхождения и постоянно высокий уровень заболеваемости среди людей и животных [36, 37, 89, 94, 95, 131, 133]. Вторую группу составляют страны (Австралия, Иран, Турция, отдельные регионы Китая, Африки и Южной Америки), где имеются собственные природные очаги, возникшие позднее в результате заноса возбудителя [67, 95, 115]. В третью группу входят страны, в которых распространение возбудителя явилось следствием завоза животных, почвы и воды из эндемичных регионов. В четвертую группу входят практически все страны Западной Европы, в которых мелиоидоз выявляется среди лиц, побывавших в эндемичных зонах [120]. Публикации последних лет свидетельствуют о том, что нозоа-реал мелиоидоза неуклонно расширяется, охватывая все новые территории. Только за последнее десятилетие мелиоидоз зарегистрирован в Индии, Бразилии, странах Карибского бассейна, на островах Тихого океана [144, 158, 165]. Таким образом, есть все основания считать, что мелиоидоз из региональной проблемы отдельных стран приобрел глобальный характер, что вызывает серьезную озабоченность мировой медицинской общественности.

Учитывая высокую вероятность возможности заноса и формирования эндемичных очагов сапа и мелиоидоза на территории нашей страны, представляются актуальными исследования по разработке современных средств диагностики и методов внутривидовой дифференциации как средств эпидемиологического анализа вспышек этих заболеваний.

В настоящее время бактериологическая схема идентификации буркхоль-дерий, имеющих медицинское значение, разработана и эффективно используется [6, 14]. Однако, близость В. mallei и В. pseudomallei по геному, фенотипиче-ским признакам, в том числе и по антигенному составу, вносит трудности в дифференциацию этих микроорганизмов. Добавляет сложности в дифференциацию В. mallei и В. pseudomallei наличие близкородственного к возбудителю мелиоидоза непатогенного вида В. thailandensis, обладающего близкими биохимическими свойствами, антигенным составом [29, 166]. При этом факторы патогенности этих микроорганизмов до сих пор находятся в стадии активного изучения. Все вышеперечисленное определяет необходимость дальнейшего поиска различий в гено- и фенотипе этих микроорганизмов в целях совершенствования средств их дифференциации и типирования. Это же в полной мере относится и к средствам серологической диагностики, сравнительному электро-форетическому анализу, которые являются составной частью полифазной таксономии - современной системе идентификации и дифференциации микроорганизмов, основанной на комплексном применении бактериологических, биохимических, серологических, молекулярно-биологических, генетических методов исследования [6, 58, 110, 163, 166].

Из тестов, позволяющих дифференцировать микроорганизмы на уровне штаммов, успешно в таксономических целях при группировании бактерий использовался сравнительный электрофоретический анализ белков [24, 121]. Ранее применялся электрофоретический анализ для группирования ограниченного количества штаммов В. pseudomallei [20]. Поэтому актуальным явилось изучение электрофореграмм суммарных клеточных белков всех имеющихся в коллекционном центре ВолгоградНИПЧИ штаммов буркхольдерий, в целях межвидового и внутривидового группирования.

В схеме лабораторной диагностики патогенных буркхольдерий серологические методы по праву занимают позиции достоверных и информативных способов обнаружения специфических антигенов и антител к ним [111]. При этом, для получения диагностических препаратов применялись внутриклеточные, жгутиковые антигены, отдельные антигены из состава внутриклеточных (200 KDa, 800 кБа) [3, 4, 44, 45, 99], внеклеточные антигены отдельных штаммов В. pseudomallei [71, 81]. Перспективными для совершенствования серологических средств выявления и идентификации буркхольдерий являются: разработка новых серологических тестов, доработка применительно к изучаемым возбудителям имеющихся тестов, использование при получении антигенных препаратов иммунных сывороток к отдельным антигенам различных систем клетки [47]. Применение в качестве иммуногенных антигенов внеклеточных белков открывает перспективу получения иммунных сывороток для межвидовой дифференциации буркхольдерий [79].

Актуальность представленных в диссертации материалов подчеркивается их выполнением в рамках плановой государственной тематики ФГУЗ Волго-градНИПЧИ по лабораторной диагностике и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза, а именно тем 052-2-10 «Идентификация и типирование возбудителей сапа и мелиоидоза на основе принципов полифазной таксономии», 043-306 «Антигенные комплексы патогенных буркхольдерий, обладающие функциональной и диагностической значимостью».

Задачи исследования:

1. Унифицировать методы получения антигенных комплексов буркхольдерий и иммунных сывороток к ним.

3. Оценить возможность дифференциации буркхольдерий методом имму-нофлуоресцентного анализа.

5. Провести сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков патогенных буркхольдерий для их идентификации и типирова-ния.

В представленной работе впервые проведено комплексное исследование вариабельности антигенного спектра патогенных буркхольдерий.

Использование иммунной сыворотки к внеклеточным белкам штамма В. thailandensis 264 впервые позволило дифференцировать патогенные виды буркхольдерий (В. mallei, В .pseudomallei) в реакции иммунодиф фузии в геле с живыми культурами.

Впервые оптимизирован алгоритм типирования В. mallei и В. pseudomallei на основе различий в их антигенном спектре. Сравнительный анализ электро-фореграмм внеклеточных антигенов, полученных методом иммуноэлектрофо-реза, позволил выявить различия в составе антигенов буркхольдерий и провести дифференциацию возбудителей сапа и мелиоидоза.

Практическая ценность: На основании изучения чувствительности и специфичности кроличьих иммунных сывороток к антигенам авирулентных штаммов В. thailandensis установлена возможность замены используемых раннее при конструировании ме-лиоидозных и сапных диагностикумов иммунных сывороток к вирулентным штаммам В. pseudomallei на иммунные сыворотки к антигенам непатогенного вида В. thailandensis, что повышает безопасность и облегчает производство диагностических препаратов.

На основании сравнительного электрофоретического анализа суммарных клеточных белков проведено группирование имеющихся в коллекции Волго-градНИПЧИ штаммов В. р8еис1ота1Ш, обеспечившее наиболее высокий уровень маркирования этих штаммов.

Документация на оформление двух патентов зарегистрирована в Государственном реестре изобретений Российской Федерации: «Способ дифференциации возбудителей сапа и мелиоидоза преципитирующей антисывороткой» 2305557 от 10.09.2007 г. и «Способ дифференциации возбудителей мелиои доза и сапа методом иммуноэлектрофореза» № 2366715 от 10.09.2009 г.

Положения, выносимые на защиту:

1. набор клеточных и внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий, полученный в унифицированных условиях в разных сериях, идентичен по своему составу;

2. сравнительный анализ состава клеточных и внеклеточных антигенов В. ЖаНапЛепьчя и В. рзеийотсйЫ, полученного иммунодйффузионными методами, показывает на близкое родство этих микроорганизмов и доказывает возможность применения в качестве тест-сывороток для антигенного анализа В. рзеи-с1ота1Ш иммунных сывороток к клеточным антигенам В. 1каИап(1еп$1з\

3. анализ антигенного состава патогенных буркхольдерий, полученного в реакции иммунной диффузии с живыми культурами и с иммунной сывороткой к внеклеточным антигенам В. thailandensis 264, позволяет дифференцировать штаммы В. pseudomallei и В. mallei\

4. выявленные с помощью иммуноэлектрофореза различия в составе внеклеточных антигенов патогенных буркхольдерий позволяют провести видовую дифференциацию возбудителей сапа и мелиоидоза;

5. сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков позволяет дифференцировать штаммы буркхольдерий на инфравидовом уровне, что дает возможность использования этого метода в эпидемиологическом анализе;

6. использование метода иммуноблоттинга с целью обнаружения антигенных фракций иммунными кроличьими сыворотками к внеклеточным антигенам буркхольдерий позволяет типировать штаммы В. pseudomallei.

Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); VII межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств» (Обо-ленск, 2006); XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоградский медицинский университет (Волгоград, 2006); научно-практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического надзора за особо опасными инфекционными заболеваниями на юге России» (Ставрополь, 2007); Всероссийской научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); IX Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Волгоград, 2008); Всероссийской научнопрактической конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Мин. Обороны России» (Киров, 2008); международной научно-практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 2009); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологической защиты войск и населения. Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Эпидемиология и эпизоотология. Микробиология. Биотехнология. Экология» (Екатеринбург, 2009); X межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (Ставрополь, 2010).

По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 2 - в периодических изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание искомой ученой степени, получено 2 патента на изобретение.

Структура и объем диссертации Диссертация изложена на 129 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 разделов обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 168 источников, в том числе 62 отечественных и 106 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 34 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Мазурова, Ирина Юрьевна

Выводы:

7. Сравнение электрофореграмм суммарных клеточных белков штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. thailandensis, В. cepacia и набора гетерологичных видов бактерий позволило четко выделить штаммы буркхольдерий в отдельную группу, относящуюся к одному роду.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полифазная таксономия, предусматривающая сочетанное применение генетических, биохимических, иммунологических методик нашла в настоящее время широкое применение для окончательного определения таксономической позиции изучаемых близкородственных микроорганизмов [6, 163]. Типирова-ние — группирование штаммов внутри одного видаявляется одной из основных областей применения полифазной таксономии [15, 50]. Так как, изучаемые патогенные буркхольдерии и В. thailandensis обладают очень сходными феноти-пическими и генетическими свойствами, то применение для их дифференциации принципов и методов полифазной таксономии закономерно [29, 78, 85].

Сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков и иммуноблоттинг успешно применялся и применяется в настоящее время для дифференциации многих микроорганизмов [16, 25, 84, 127], в том числе и возбудителей особо опасных инфекций [10, 82]. Угрозы возникновения вспышек опасных инфекционных заболеваний и акты биотерроризма, вызванные патогенными микроорганизмами, предопределили актуальность исследований, направленных на совершенствование иммунодиагностических средств обнаружения возбудителей этих инфекций, которые наряду с высокой чувствительностью и специфичностью, характеризуются простотой постановки реакций [3]. Выше изложенное, в полной мере относится к В. mallei и В. pseudomallei, возбудителям сапа и мелиоидоза, опасных заболеваний человека и животных [136, 148]. Серологические методы (гемагглютинация, РИД, ИЭФ, ТИФМ, ИФА) по прежнему используются для идентификации этих микроорганизмов и диагностики вызываемых ими инфекций в эндемичных регионах [100, 102].

В настоящее время в качестве Аг для получения иммунных сывороток используются клеточные Аг, отдельные выделенные и в различной степени очищенные антигенные комплексы, внеклеточные антигены, Аг различных систем клетки [22, 79, 102, 157]. Ранее отмечалось о перспективе использования ЭЦА для межвидовой дифференциации микроорганизмов [132]. Анализ опубликованных литературных источников показал недостаточное изучение внеклеточных Аг патогенных буркхольдерий, возможностей их использования в серологической дифференциации В. mallei и В. pseudomallei.

Исходя из этих данных следует считать перспективным дальнейшее изучение возможностей дифференциации патогенных буркхольдерий с помощью сравнительного анализа состава клеточных и внеклеточных антигенов, выявляемых иммунологическими методами, в том числе электрофорезом в полиак-риламидном геле с додецилсульфатом натрия и иммуноблоттингом.

При этом необходимо решать следующие задачи: унифицировать методы получения антигенных комплексов буркхольдерий и иммунных сывороток к ним, провести сравнительный анализ составов клеточных и внеклеточных антигенов, выявленных иммунодиффузионными методами, в целях дифференциации патогенных буркхольдерий, оценить возможность дифференциации буркхольдерий методом иммунофлуоресцентного анализа, сравнить дифференцирующую способность ТИФМ иммунными сыворотками к клеточным и внеклеточным антигенам в отношении патогенных буркхольдерий, провести сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков патогенных буркхольдерий для их идентификации и типирования, изучить возможность использования различий в спектрах перекрестных клеточных и внеклеточных антигенов, полученных методом иммуноблоттинга, для межвидовой и внутривидовой дифференциации буркхольдерий.

Безусловно, важнейшим условием достоверности сравнительного анализа составов антигенных комплексов микроорганизмов является воспроизводимость их препаративного выделения, которая достигается при унификации условий выделения, применение особо чистых химических реактивов, стандартных сред [16] .В наших исследованиях на примере выделения различных серий клеточных Аг из штаммов буркхольдерий с использованием стандартных сред фирмы «Difco» и унификации этапов исследований с применением особо чистых реактивов фирм «Sigma», «Amersham», показана стабильность и воспроизводимость выделенных клеточных Аг.

С помощью электрофореза в ПААГ с ДСН измерили мол. м. клеточных и внеклеточных Аг. Используя РИД, РИД с живыми культурами, ИЭФ, ТИФМ, ИФА, ИБ выявили различия в составе изучаемых Аг, оценили возможность использования этих различий при дифференциации В. pseudomallei и В. mallei.

Выделенные клеточные и внеклеточные Аг были охарактеризованы количественно. Так, концентрация клеточных Аг в суспензии, полученной после обработки 1 мл смеси (100 мг сырой бактериальной массы в 1 мл) составила после центрифугирования 12-18 мг/мл. Концентрация ЭЦА составляла 1,2-2 мг/мл. Спектр белковых фракций клеточных Аг после электрофореза в ПААГ с ДСН состоял из 34 - 47 фракций мол. м. которых составляла 10 - 120 кЕ>а, окрашенных Кумасси R-250. Спектр ЭЦА, полученный в электрофорезе в ПААГ с ДСН, после окраски гелей серебром, составлял 12-14 фракций, с диапазоном мол. м. 14 - 120 KDa. Значения полученных количественных характеристик белков и фракций соответствуют опубликованным данным по другим микроорганизмам [93, 107]. Клеточные Аг получены из ацетонвысушенных и живых клеток. Внеклеточные Аг получали после смыва культур, выращенных на твердой питательной среде, покрытой целлофаном [47].

Иммунодиффузионные методы широко использовались и используются для характеристики и сравнения Аг различных систем клетки. Достоинство этих методов состоит в том, что они позволяют выявлять нативные Аг, не выделяя их из суспензии [31]. РИД с использованием иммунных сывороток позволяет проводить полуколичественный анализ содержания Аг в исследуемых системах. В настоящее время РИД чаще используется для предварительной оценки состава Аг, титров Ат и специфичности получаемых кроличьих иммунных сывороток [63]. В нашей работе был проведен в РИД сравнительный анализ состава гомологичных и перекрестных клеточных Аг патогенных бурк-хольдерий, В. thailandensis и В. cepacia. Было установлено, что у штаммов

В. thailandensis 264 и В. pseudomallei С-141 количество Аг одинаковое - 3 шт., ас В. mallei 10230 - 2 шт. и с В. cepacia 25416 — 1 шт. То есть, количество перекрестных Аг убывает по мере уменьшения филогенетической близости анализируемых видов. Постановка РИД с иммунной сывороткой к клеточным Аг В. pseudomallei С-141 и клеточными Аг тех же штаммов выявило такое же количество преципитатов, что и при использовании в РИД сыворотки к В. thailandensis. Этим была установлена возможность использования иммунной сыворотки к В. thailandensis 264 в качестве тест-сыворотки при антигенном анализе В. pseudomallei. Таким образом, показано, что для получения требуемой тест-сыворотки возможно внести прогрессивные изменения, а именно, для выделения Аг необходимых для иммунизации животных, можно использовать вместо штаммов В. pseudomallei, являющегося микроорганизмом 2 группы па-тогенности, штаммы В. thailandensis, относящиеся к 4 группе патогенности [12].

С помощью РИД проведен сравнительный анализ перекрестных внеклеточных Аг патогенных буркхольдерий с применением иммунных сывороток к ЭЦА. Установлено, что максимальное количество линий преципитатов (3) обнаруживается между лунками с иммунными кроличьими сыворотками к ЭЦА В. pseudomallei С-141 и В. thailandensis 264 и лунками с ЭЦА В. thailandensis 264 и В. pseudomallei С-141. То есть, показана высокая близость этих микроорганизмов. При использовании в РИД сыворотки к ЭЦА В. mallei 10230 между лункой с сывороткой и лунками с ЭЦА В. pseudomallei С-141 и В. thailandensis 264 выявлено по 2 преципитата. Не выявлено линий преципитатов между лункой с сывороткой к В. mallei 10230 и лункой с ЭЦА В. cepacia 25416. Таким образом, использование иммунных сывороток к ЭЦА позволяет выявлять такие различия в составе перекрестных Аг, которые можно применить для дифференциации штаммов группы «pseudomallei» и штаммов В. cepacia.

В РИД с живыми культурами было изучено влияние состава питательной среды на секрецию буркхольдериями антигенов во внешнюю среду. Для этого были использованы питательные среды «Difco»: F-агар, L-arap, ТС А, в качестве тест-сыворотки, применена сыворотка к ЭЦА В. thailandensis 264. В опытах брали 7 штаммов В. mallei, 6 штаммов В. pseudomallei, 2 штамма В. thailandensis, 1 штамм В. cepacia. Установлено, что в РИД с живыми культурами на чашках с питательными средами F-arap и ТСА перекрестные Аг образовывались между сывороткой и культурами всех штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis, но отсутствовали между лунками с сывороткой и бляшками культур штаммов В. mallei. На чашке с L-агаром линии преципитатов образовались между лунками с иммунной сывороткой и бляшками культур всех штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis, и 2 штаммами В. mallei (Иванович и Muk-suwar). Проверка 60 штаммов В. pseudomallei, 14 штаммов В. mallei, 12 штаммов В. cepacia, 5 штаммов В. thailandensis, 16 штаммов псевдомонад на F-arape показала, что перекрестные Аг отсутствовали между культурами штаммов В. mallei и лунками с сывороткой к ЭЦА В. thailandensis 264. Выявленные данные использовали для разработки практического способа дифференциации В. pseudomallei и В. mallei, на который получен патент. В то же время, при использовании этой сыворотки и сывороток к ЭЦА других буркхольдерий в РИД с живыми культурами, перекрестные Аг были выявлены у большинства штаммов В. pseudomallei, В. thailandensis, В. cepacia. Наши данные согласуются с опубликованными ранее данными по срокам секреции внеклеточных белков штаммамов В. mallei [2].

ИЭФ из всех иммунодиффузионных методов, обладает наибольшей разрешающей способностью при анализе антигенного состава микроорганизмов и позволяет идентифицировать по электрофоретической подвижности отдельные Аг [30]. Проведенный анализ электрофореграмм клеточных Аг, полученных нами при помощи ИЭФ с иммунными кроличьими сыворотками к ЭЦА патогенных буркхольдерий и В. thailandensis показал, что наборы Аг В. pseudomallei и В. thailandensis, очень близки по количественному составу и электрофоретической подвижности [46]. Применение ИЭФ и сывороток к ним для сравнительного анализа спектра ЭЦА фильтратов буркхольдерий, выявило стойкие различия в наборах линий преципитаций, представленных на электрофоре-граммах. Наибольшее количество линий преципитатов выявляется при анализе гомологичных Аг В. pseudomallei и В. thailandensis и сывороток к ним. При использовании этих же сывороток для выявления перекрестных Аг на электрофо-реграммах ЭЦА В. mallei, было отмечено значительно меньшее количество Аг, по сравнению с набором Аг штаммов В. pseudomallei и В. thailandensis. Так, практически отсутствовали перекрестные Аг штаммов В. mallei в анодной и катодной областях. В нейтральной зоне на электрофореграммах штаммов В. mallei присутствовала одна линия преципитатов. Учет выявленных устойчивых различий картин с линиями преципитаций ЭЦА на электрофореграммах В. pseudomallei, В. thailandensis, В. mallei полученных методом иммуноэлектро-фореза, позволили дифференцировать близкородствейные микроорганизмы В. pseudomallei и В. mallei. На основе разработанных данных получен патент «Способ дифференциации возбудителей мелиоидоза и сапа методом иммуно-электрофореза» № 2366715 от 10.09.2009 г [41].

МФА основан на использовании свойства специфичности иммунологической реакции и чувствительности флуоресцентной микроскопии. В отличие от иммунодиффузионных методов, МФА позволяет выявлять поверхностные Аг. Выявление гомологичных Аг специфическими Ат для данного микроорганизма, позволяет идентифицировать и сам микроорганизм. Также, МФА обладает быстротой и высокой чувствительностью, эти обстоятельства обеспечили методу широкое применение для индикации возбудителей многих инфекций, в том числе особо опасных. Проведенное нами сравнительное изучение сывороток к клеточным и внеклеточным Аг буркхольдерий в МФА показало, что иммунные кроличьи сыворотки к ЭЦА патогенных буркхольдерий и В. thailandensis выявляли клетки изучаемых штаммов В. pseudomallei, В. mallei и В. thailandensis со специфическим свечением на 3 (+++) и не выявляли клетки В. cepacia. Этот уровень специфичности метода позволил дифференцировать штаммы группы «pseudomallei» от штаммов В. cepacia.

ТИФМ, основанный на использовании ферментного маркера, фиксированного на Ат или Аг, присутствие которого позволяет зафиксировать реакцию «антиген-антитело», часто применяется для индикации возбудителей и ускоренной диагностики инфекционных болезней [61]. В работе были протестированы иммунные сыворотки к клеточным и внеклеточным Аг буркхольдерий методом ТИФМ на чувствительность и специфичность относительно Аг штаммов В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia, В. thailandensis. Было показано, что использование поливалентных иммунных сывороток к внеклеточным Аг обеспечивает более высокую специфичность, но меньшую чувствительность при обнаружении Аг изучаемых штаммов, в отличие от использования сывороток к клеточным Аг.

Сравнительный электрофоретический анализ суммарных клеточных белков нашел широкое применение при таксономической дифференциации многих микроорганизмов. Успешно его применяли при группировании близкородственных микроорганизмов, дифференциация которых биохимическими, бактериологическими методами затруднена [161, 163]. Использовали электрофоретический анализ и при изучении патогенных буркхольдерий [19, 65, 101]. Основным условием объективного сравнения электрофореграмм является получение их в унифицированных условиях при использовании стандартных химических реактивов [116]. В своих исследованиях мы опирались на ранее полученные данные по выявлению влияния на воспроизводимость электрофореграмм состава питательной среды для выращивания бактерий, способов обработки проб [18]. Использование унифицированных условий получения суммарных клеточных белков, параметров электрофоретического разделения позволило получить воспроизводимые с высоким разрешением электрофореграммы, которые подверглись нумерическому анализу с целью проведения межвидовой и внутривидовой дифференциации буркхольдерий. Для выяснения возможности межвидового распределения на группы были взяты референтные штаммы изучаемых буркхольдерий В. pseudomallei С-141, В. mallei 10230, В. thailandensis 264, В. cepacia 25416 и 5 штаммов бактерий рода Pseudomonas. На основании результатов нумерического анализа штаммы были достоверно распределены на две группы: в первую вошли буркхольдерии, во вторую - остальные виды. Таким образом, метод электрофоретического анализа может быть эффективно применен для межродовой дифференциации.

На основании нумерического анализа электрофореграмм было проведено внутривидовое группирование 59 штаммов В. pseudomallei и 14 штаммов В. mallei, имеющихся в Коллекционном центре ВолгоградНИПЧИ. Штаммы возбудителя мелиоидоза на уровне коэффициента корреляции 89 % были распределены на 4 фенона. В первый фенон вошли 24 штамма, во второй - 13 штаммов, в третий — 10 штаммов, в четвертый - 6 штаммов. На этом уровне сходства 6 штаммов не вошли ни в одну из перечисленных групп, которые объединили в пятую группу.

Штаммы возбудителя сапа, обладающие высоким сходством фенотипов, на основе электрофоретического анализа были распределены на уровне сходства 89 % только на 2 группы (9 и 2 штамма в группе), не вошли в группы 2 штамма, коэффициент корреляции которых со штаммами 1 и 2 группы был ниже 89 %. Учитывая вышеизложенное, можно сделать вывод о том, что метод сравнительного электрофоретического анализа, обладающий высокой разрешающей способностью, позволяет проводить межвидовую дифференциацию и типирование патогенных буркхольдерий.

Метод ИБ с иммунными сыворотками в настоящее время применяется как для идентификации отдельных Аг, выделенных из клеток, так и для фракционирования смесий Аг. Последующий сравнительный анализ полученных иммуноэлектрофореграмм позволяет дифференцировать изучаемые микроорганизмы. Иммуноблоттинг применялся для дифференциации многих микроорганизмов, в том числе и возбудителей особо опасных инфекций. Так, с помощью

ИБ были дифференцированы бруцеллы, изолированные, в разных районах Сибири [32].

В работе изучена возможность дифференциации буркхольдерий на основе кластерного анализа иммуноэлектрофореграмм, фракции которых выявлены иммунными сыворотками. Для вычисления коэффициентов сходства применяли современные компьютерные программы. Избирательность иммуноблоттинга в сравнении с электрофорезом повышается за счет вовлечения в анализ как индивидуальных, так и перекрестных Аг изучаемых штаммов, выявленных иммунными сыворотками к клеточным и внеклеточным Аг буркхольдерий. Проведенные нами исследования показали, что применение для выявления Аг сывороток к внеклеточным Аг, делает возможным типирование штаммов В. pseu-domallei. Наибольшей дискриминирующей способностью обладали иммунные сыворотки против клеточных антигенов В. cepacia 25416, выявите меньшее количество перекрестных Аг в сравнении с сыворотками к В. pseudomallei и В. mallei. Как известно, штаммы В. mallei отличаются высоким сходством по фенотипическим признакам, что значительно затрудняет их типирование. Метод ИБ с сыворотками к внеклеточным Аг буркхольдерий также не позволил осуществить их дифференциацию.

Таким образом, проведенные исследования состава клеточных и внеклеточных Аг с применением иммунных кроличьих сывороток к этим Аг с использованием различных серологических методов не только позволили предложить в ряд новых способов дифференциации изучаемых патогенных буркхольдерий, но и изучить специфичность и чувствительность методов в зависимости от применяемых сывороток, проанализировать состав гомологичных и перекрестных Аг, а также показать перспективы дальнейших исследований в данной области.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Мазурова, Ирина Юрьевна, Волгоград

1. Агеева, Н.П. Фенотипическая характеристика мутантов Burkholderia mallei, дефектных по синтезу внеклеточных протеолитических ферментов / Н.П. Агеева, Л.К. Меринова, Д.В. Викторов // Вестник ВОЛГМУ. Волгоград, 2005.-№2.-С. 11-15.

2. Алексеев, В.В. Аэрогенные инфекции в аспекте проблемы биотерроризма / В.В. Алексеев, Н.Г. Тихонов, A.B. Липницкий // Проблемы особо опасных инфекций. Саратов, 2003. - Вып. 85. - С. 20 - 27.

3. Антитела / под ред. Д. Кэтти. М. - 1991. - Т. 2. - 382 с.

4. Антонов, В.А. Идентификация и внутривидовое типирование сапа и ме-лиоидоза: дис.докт. мед. наук: 03.00.07 / В.А. Антонов Волгоград, 2008. -297 с.

5. Антонов, В.А. Использование мультилокусного сиквенс-типирования (MLST) и амплификации с произвольными праймерами (RAPD) для дифференциации штаммов возбудителя сапа / В.А. Антонов, В.В. Алтухова,

6. B.C. Замараев // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2007. - № 3. — С. 3 — 9.

7. Антонов, В.А. Молекулярно-биологические подходы к диагностике и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза / В.А. Антонов, В.И. Илюхин // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2005. - № 2.1. C. 3-8.

8. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, A.A. Воробьев // Л.: Медицина, 1962. — 180 с.

9. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности). Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03. Утверждено Г.Г. Онищенко. — 2003. 77с.

10. Безопасность работы с микроорганизмами III IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2322-08. Утверждено Г.Г. Онищенко. - 2009. - 77с.

11. Бейли, Н. Математика в биологии и медицине / Н. Бейли // М.: «Мир», 1970.-328 с.

12. Беляков, В.Д. Псевдомонады и псевдомонозы / В.Д. Беляков, Л.А. Ряпис, В .И. Илюхин М.: Медицина, - 1990. - 224 с.

13. Беляков, В.Д. Типирование возбудителей инфекционных болезней на современном этапе / В.Д. Беляков, Л.А. Ряпис, Г.Д. Каминский // Журн. мик-робиол. эпидемиол. иммунол. 1990. - С. 98 - 103.

14. Блохина, И.Н. Систематика бактерий (с основами геносистематики) / И.Н. Блохина, Г.Ф. Леванова, A.C. Антонов Нижний Новгород, 1992. - 172 с.

15. Будченко, A.A. Сравнительный анализ электрофореграмм суммарных клеточных белков патогенных буркхольдерий / A.A. Будченко, В.И. Илюхин, Д.В. Викторов // Мол. генет. микробиол. и вирусол. — 2005. № 2. - С. 24 -28.

16. Будченко, A.A. Сравнительный электрофоретический анализ белков патогенных псевдомонад: дис.канд. биол. наук: 03.00.07 / A.A. Будченко — Волгоград, 1995. — 138 с.

17. Вееке, Б. Руководство по количественному иммуноэлектрофорезу / Б. Вее-ке // М.: «Мир», 1977. 216 с.

18. Викторов, Д.В. Молекулярные механизмы формирования множественной лекарственной резистентности у Burkholderia pseudomallei и близкородственных видов микроорганизмов: дис.докт. биол. наук: 03.00.07, 03.00.15 / Д.В. Викторов. Волгоград, 2008. — 265 с.

19. Гонтарь, И.П. К природе антигенов Pseudomonas pseudomallei общих для некоторых видов микроорганизмов / И.П. Гонтарь, С.М. Фарбер, В.И. Еф-ременко // Журн. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. — 1984. № 3 — С. 55 -57.

20. Дегтева, Г.К. Сопоставление белковых спектров стафилококков с помощью некоторых математических приемов / Г.К. Дегтева, И. Н. Блохина // Стафилококковые инфекции. Ленинград, 1972. — Т. 1. — С. 28.

21. Зайцев, A.A. Электрофоретический анализ водорастворимых белков из типичных и некоторых атипичных чумных и псевдотуберкулезных штаммов / A.A. Зайцев, Ю.А. Филимонова // НИПЧИ. Ставрополь, 1993. -19 с.-Деп. в ВИНИТИ 15.12.93, № 3063.

22. Зыкин, Л.Ф. Актуальные вопросы иммунодиагностики особо опасных инфекций / Л.Ф. Зыкин // Ставрополь. 1986. - ч. 1. - С. 118 - 121.

23. Илюхин, В.И. Антигенная структура и серология псевдомонад // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1986. -№ 5. — С. 88-93.

24. Илюхин, В.И. Мелиоидоз / В.И. Илюхин, B.C. Замараев, В.П. Батманов // Диагн. возб. опасн. инфекц. болезней. — Саратов, 1998. Т.2. - С. 115 - 143.

25. Илюхин, В. И. Burkholderia thailandensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция / В.И. Илюхин, Т.В. Сенина, Н.Г. Плеханова // Мол. генет. микробиол. вирусол. 2002. -№ 1.-С. 7 - 11.

26. Иммунологические методы / под ред. Г. Фримеля. М. - 1987. - 472 с.

27. Иммунохимический анализ / под ред. Л.А. Зильбера. — М. — 1968. — 300 с.

28. Кулаков, Ю.К. Использование молекулярно-биологических методов идентификации бруцелл в сравнительном анализе штаммов, выделенных от больных собак / Ю.К. Кулаков, М.М. Желудков, Т.А. Толмачева // Мол. генет. микробиол. и вирусол. 2003. - №1. - С. 6 - 14.

29. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней / Практ. ру-ков. / под ред. Г.Г. Онищенко, В.В. Кутырева. — М.: «Медицина», «Шико», 2009. -472 с.

30. Мелиоидоз // под ред. Н.Г. Тихонова. Волгоград. 1995. - 220 с.

31. Мерков, A.M. Санитарная статистика / A.M. Мерков, Л.Е. Поляков // Л.: Медицина, 1974. 184 с.

32. Онищенко, Г.Г. Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов по вопросам противодействия биотерроризму / Г.Г. Онищенко, Ю.М. Федоров, Н.Я. Жилина Волгоград, 2004. - 233 с.

33. Опасные инфекционные заболевания: учебное пособие (I и II части) / под ред. В.В. Алексеева. Волгоград: НП «Здоровье и экология». - 2006.- 368 с.

34. Определитель бактерий Берджи: в 2 т. М.: Мир, 1997. - 2 т.

35. Остерман, Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Элек трофорез и ультрацентрифугирование / Л.А. Остерман — М.: Наука, 1981.286 с.

36. Патент 2305557 РФ. Способ дифференциации возбудителей сапа и мелио-идоза преципитируюгцей антисывороткой / A.A. Будченко (РФ), И.Ю. Мазурова, В .И. Илюхин. № 2006100651/13; заявл. 10.01.2006; опубл. 10.09.2007. Бюл. № 25. 3 с.

37. Патент 2366715 РФ. Способ дифференциации возбудителей мелиоидоза и сапа методом иммуноэлектрофореза / A.A. Будченко (РФ), И.Ю. Мазурова, В.И. Илюхин. № 2008111417/17; заявл. 24. 03. 2008; опубл. 10.09.2009, Бюл. №25.-3 с.

38. Пивень, H.H. Патогенность Burkholderia pseudomallei как функция внеклеточных и поверхностных антигенов / H.H. Пивень, В.И. Илюхин // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - № 6. - С. 94 - 99.

39. Пивень, H.H. Антигенный анализ возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности: Автореф. дис. . докт. мед. наук: 03.00.07 / H.H. Пивень. Волгоград, 1997. - 41 с.

40. Пивень, H.H. Иммуногенность поверхностных и капсульных антигенов Burkholderia'mallei / H.H. Пивень, И.В. Авророва, С.И. Жукова // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол.- 2007.- № 1.- С. 47 52.

41. Пивень, H.H. Иммуногенность и гетерогенность поверхностного антигена 8 Burkholderia pseudomallei / H.H. Пивень, В.И. Смирнова, Д.В. Викторов // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1996. - № 4. - С.75 - 78.

42. Пивень, H.H. Перекрестно-реагирующие антигены патогенных буркхоль-дерий и некоторых опасных возбудителей инфекционных болезней / H.H. Пивень, В.И. Илюхин, В.Б. Тимошин // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2005. - № 2. - С. 14-19.

43. Пивень, H.H. Преципитиногены возбудителя мелиоидоза и перспективы создания на их основе диагностических препаратов: дис.канд. мед. наук: 03.00.07 / H.H. Пивень. Волгоград, 1981. - 150 с.

44. Рыбкин, B.C. Метод иммуноферментного анализа в практике эпизоотоло-гического обследования природного очага чумы / B.C. Рыбкин, И.И. Чер-ченко, Л.Ф. Зыкин // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. — 1986. -№ 5.-С. 107- 108.

45. Ряпис, Л.А. Молекулярная эпидемиология инфекционных болезней / Л.А. Ряпис, Н.Н Филатов, Н.Я. Салова // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2003.-№ 5. - С. 49 - 53.

46. Санитарные правила: 1.2. Эпидемиология. СП 1.2. 001 94. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности // Госсанэпиднадзор России.-М., 1994.- 152 с.

47. Сап / под ред. Н.Г. Тихонова. Волгоград. - 1995. - 128 с.

48. Сенина, Т.В. Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике: автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.07 / Т.В. Сенина. Волгоград, 2004. - 22 с.

49. Справочник по лабораторным методам исследования / под ред. Л.Д. Даниловой // СПб: Питер. 2003. - 736 с.

50. Стародуб, Н.Ф. В биохимических исследованиях белковый иммуноблотт и иммунодотт / Н.Ф Стародуб, В.П. Артюх, В.И. Назаренко // Укр. биохим. журн. 1987. - Т. 59. - № 3. - С. 108 - 120.

51. Тихонов, Н.Г. Биологический терроризм (проблемы противодействия) / Н.Г. Тихонов, A.B. Липницкий // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье, сб. науч. тр. / под ред. Н.Г.Тихонова. — Волгоград, 2000. С. 265 -271.

52. Храпова, Н.П. Иммунологическая диагностика мелиоидоза / Н.П. Храпова, Н.Г. Тихонов, B.C. Рыбкин // Мелиоидоз: сб. науч. тр. Волгоград, - 1995.-С. 57 - 68.

53. Чухланцев, Д.А. Использование ПНР для идентификации и межвидового дифференцирования возбудителей сапа и мелиоидоза / Д.А. Чухланцев, И.В. Маракулин, И.В. Дармов // Проблемы ООИ 2008. - вып. 97. - С. 63 -66.

54. Ширяев, Д.Т. Методы обнаружения возбудителя мелиоидоза в объектах внешней среды и другом материале / Д.Т. Ширяев, Л.А. Ряпис, Л.П. Кочет-кова // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1976. - № 4. — С. 91 -95.

55. Яковлев, А.Т. Идентификация возбудителей чумы, сапа и мелиоидоза им-муноферментным методом / А.Т Яковлев, Л.Ф. Зыкин, В.Н. Метлин // Диагностика и профилактика чумы, холеры, сапа и мелиоидоза. Волгоград, 1983.-С. 86-87.

56. Яковлев, А.Т. Иммуноферментный анализ в микробиологии / А.Т. Яковлев, Л.Ф. Зыкин, B.C. Рыбкин // Изд-во Саратовского университета. 1990. - 112 с.

57. Ameri, М. Comparison of two commercial radial immunodiffusion assays for detection of bovine immunoglobulin G in newborn calves / M. Ameri, M.J. Wil-kerson // J. Vet. Diagn Invest 2008. - Vol. 20. - P. 333 - 336.

58. Anuntagool, N. Antigenic relatedness between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei I N. Anuntagool, S. Sirisinha // J. Microbiol. Immunol. -2002.-Vol. 46.-P. 143 150.

59. Anuntagool, N. Identification of specific antigens of Pseudomonas pseudomallei and evaluation of their efficacies for diagnosis of melioidosis / N. Anuntagool, P. Rugdech, S. Sirisinha // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31. - P. 1232 -1236.

60. Anuntagool, N. Lipopolysaccharide heterogeneity among Burkholderia pseudomallei from different geographic and clinical origins / N. Anuntagool, V. Wuthiekanun, N.J. White // J. Trop Med Hyg. 2006. - Vol. 74 (3) - P. 348 -352.

61. Arakava, V. Chronic melioidosis. A report of the first case in Japan / V. Ara-kava, T. Mitsui, R. Miki // J. Jap. Asoc. Infec. Diseases. 1993. - Vol. 67. - № 2.-P. 154- 162.

62. Ashdown, L.R. Relationship and significance of specific immunoglobulin M antibody response in clinical and subclinial melioidosis / L.R. Ashdown // J. Clin. Microbiol. 1981. - Vol. 14. - P. 361 - 364.

63. Atkins, T. Characterisation of an acapsular mutant of Burkholderia pseudomallei identified by signature tagged mutagenesis / T. Atkins, R. Prior, K. Mack//J. Med. Microbiol. 2002. - Vol. 51.-P. 539-553.

64. AuCoin, D. P. Identification of Burkholderia cepacia complex bacteria with a lipopolysaccharide-specific monoclonal antibody / D. P. AuCoin, R. B. Crumpl, P. Thorkildson // Med. Microbiol. 2010. - Vol. 59. - P. 41 - 47.

65. Baert, B. Multiple phenotypic alterations caused by a c-type cytochrome maturation ccmC gene mutation in Pseudomonas aeruginosa / B. Baert, C. Baysse, S. Matthijs//Microbiol.-2008.-Vol. 154.-P. 127- 138.

66. Biesiegel, U. Protein blotting / U. Biesiegel // Electrophoresis. 1986. Vol. 7, № l.-P.l - 18.

67. Boiron, P. Use of partially purified 54-kilodalton antigen for diagnosis of nocardiosis by Western blot (immunoblot) assay / P. Boiron, F. Piovost // J.Clin. Microbiol. 1990. - Vol. 28. - № 2. - P. 328 - 331.

68. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the guantitation of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72. - P. 248 - 254.

69. Brett, P.J. Characterization of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia pseudomallei-like strains / P.J. Brett, D. DeShazer, D.E. Woods // Epidemiol. Infect. 1997. - Vol. 118. - P. 137 - 148.

70. Brett, P.J. Burkholderia thailandensis sp. nov., a Burkholderia pseudomallei-like species / P.J. Brett, D. De Shazer, D.E. Woods // Intern. J. Syst. Bacteriol. -1998.-Vol. 48. P.317 - 320.

71. Brett, P.J. Heiss Burkholderia thailandensis oacA Mutants Facilitate the Expression of Burkholderia mallei-like O-Polysaccharides / P.J. Brett, M. N. Burtnick, C. Heiss // J. Infect. Immunol. 2010. - Vol. 10. - P. 1023 - 1033.

72. Brett, P.J. Isolation and characterization of Pseudomonas pseudomallei flagellin proteins / P.J. Brett, D.C. Mah, D. E. Woods // Infect. Immunology. 1994. Vol. 62.-P. 1914-1919.

73. Brett, P.J. Pathogenesis and immunity to melioidosis / P.J. Brett, D.E. Woods // Acta Tropica. 2000. - Vol. 74. - P. 201 - 210.

74. Broms, J.E. Helix Essential for a Type VI Secretion-Like System of Francisella tularensis / J.E. Broms, M. Lavander, A. Sjostedt // American Society for Microbiol. 2009. - Vol. 191, №. 8. - P. 2431-2446.

75. Burnie, J. Immunoblot analysis: a new method for fingerprinting hospital pathogens / J. Burnie, R.C. Matthews // J. Immunol. Methods. 1987. - Vol. 100, №1.2.-P. 41 -46.

76. Bvkova, S.A. Clusterization of halophilic and halotolerant eubacteria using whole-cell protein electrophoresis data / S.A. Bvkova, I.S. Zviagintseva, D.S. Akhiynin // Microbiol. 2000. - Vol. 69, № 5. - P. 649 - 703.

77. Chandler, J. R. Mutational Analysis of Burkholderia thailandensis Quorum Sensing and Self-Aggregation / J. R. Chandler, B. A. Duerkop, A. Hinz // J. of Bacteriol. 2009. - Vol. 191, №. 19. - P. 5901 - 5909.

78. Chantratita, N. Accuracy of enzyme-linked immunosorbent assay using crude and purified antigens for serodiagnosis of melioidosis / N. Chantratita, V. Wu-thiekanun, A. Thanwisai // Clin. Vaccine Immunol. 2007. - V. 14, № 1. - P. 110-113.

79. Cheng, A. C. Positive serologic test results for Burkholderia pseudomallei in asymptomatic persons / A. C. Cheng, B. J. Currie, S. Peacock // Am. J. Trop. Med. Hyg.-2009.-Vol. 80.-P. 1065-1071.

80. Cheng, A. C. Humoral and cellular immune responses in adult geese induced by an inactivated vaccine against new type gosling viral enteritis virus / A. C. Cheng, S. Chen, M.S. Wang // J. Trop. Med. Hyg. 2010. - Vol. 89. - P. 2410 -2418.

81. Choy, J. Animal melioidosis in Australia / J. Choy, M. Mayo, B. Currie // International congress on melioidosis. Bangkok, Thailand, - 1988. - P. 34 - 37.

82. Cipriano, R.C. Detection of vibrio anguillarum antigen by the dot blot assay / R.C. Cipriano, J.B. Pyle, C.E. Starliper // J.Wild Dis. 1985. - Vol. 21, № 3. - P. 211-218.

83. Coenye, T. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches / T. Coenye, P. Vandamme // Environ. Microbiol. -2003.-Vol. 5. -P. 719-729.

84. Coenye, T. Taxonomy and identification of the Burkholderia cepacia complex / T. Coenye, P. Vandamme, R. W Govan // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, № 10.-P. 3427-3436.

85. Costas, M. Numerical analisis of electrophoretic protein patterns of methycillin-resistant strains of Staphylococcus aureus / M. Costas, M. Cookson, B.D. Cook-son // J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol. 27, № 1. - P. 65-85.

86. Dance, D. Melioidosis as an emerging global problem / D. Dance // International congress on melioidosis // Bangkok, Thailand, — 1988. — P. 29 32.

87. Dance, D. The global epidemiology of melioidosis an update / D. Dance // Wold melioidosis congress. - Perth, W. Australia, - 2001. - P. 14- 17.

88. Davies, R.L. Comparison of methods for the analysis of outer membrane antigens of Neisseria meningitides by western blotting / K.L. Davies, R.A. Wall, S.P. Borriello // J. Immunol. Methods. 1990. - Vol. 134. - № 2. - P. 215 - 226.

89. Franzen, C. Molecular technigues for detection, species differentiation, and phy-logenetic analysis of microsporida // J. Clin. Microbiol. 1999. Vol. 12. - P. 243 -285.

90. Felgnera, P.L. A Burkholderia pseudomallei protein microarray reveals sérodiagnostic and cross-reactive antigens / P.L. Felgnera, M. A. Kayalab, A. Vigila // J. Clin. Microbiol. 2009. - Vol. 28. - P. 1073 - 1075.

91. Fomiatti, K.R. Use of the biological system for the identification of Burkholderia pseudomallei and their differentiation from other species of Burkholderia / K.R. Fomiatti, S. Benedict // Acta tropica. 2001. - № 11. - P. 46 - 49.

92. Geurtsen, J. Identification of active-site histidine and serine residues / J.Geurtsen, L. Steeghs, J. Hove // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 8248 -8259.

93. Gilmore, G. Use of antigens derived from B. pseudomallei, B. thailandensis, and B. cepacia in the indirect hemagglutination assay for melioidosis I G. Gilmore,

94. J. Barnes, N. Ketheesan // Clin. Vaccin. Immunol. 2007. - Vol. 14. - P. 1529 -1531.

95. Goodyear, A. Protection from pneumonic infection with Burkholderia species by inhalational immunotherapy / A. Goodyear, L. Kellihan, H. Bielefeldt-Ohmann // Infect. Immunol. 2009. - Vol. 77, №. 4. - P. 1579 - 1588.

96. Gotoh, N. Isolation and characterization of the outer-membrane proteins of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei / N. Gotoh, N.J. White, W. Chao-wagul / Microbiol. 1994. - Vol. 140. - P. 797 - 805.

97. Hagebock, J.M. Serological responses to the mallein test for glanders in solipeds / J.M. Hagebock, L.K. Schlater, W.M. Freriehs // J. Vet. Diagn. Invest. 1993.-Vol. 5, №9.-P. 97-99.

98. Hardy, L.N. Comparison of extracellular protein profiles of seven serotypes of mutans tsreptococci under controlled conditions / L.N. Hardy, Knox, K.W., Brown, R.A. // J. General Microbiol. 1986. - Vol. 132. - P. 1389 - 1400.

99. Harris, P. N. A. Clinical features that affect indirect-hemagglutination-assay responses to Burkholderia pseudomallei / P. N. A. Harris, N. Ketheesan, L. Owens // Clin. Vacc. Immunol. 2009. - Vol. 16, № 6. - P. 924 - 930.

100. Harvey, S.P. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates / S.P. Harvey, J.M. Minter // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005. - Vol. 44, №1. - P. 91 - 97.

101. Hodgson, K. Comparison of routine bench and molecular diagnostic methods in identification of B. pseudomallei / K. Hodgson, C. Engler, B. Govan // J. Clin.

102. Microbiol. 2009. - Vol. 47. - № 5. - P. 1578 - 1580.

103. Hoefer scientific instruments. 1988 - 1989. - P. 132 - 133.

104. Holland, D.T. Differentiation and Characterization of Enteroviruses by Computer-Assisted Viral Protein Fingerprinting / D.T. Holland, J. Senne, C.R. Peter // J. Clin. Microbiol. 1998. Vol. 36, № 6. - P. 1588-1594.

105. Inglis, T.A Comparison of rapid, automated ribotyping of Burkholderia pseu-domallei wich DNA macrorestriction analysis / T. A. Inglis, A. Clair, L. O'Reilly // Acta tropica. 2001. - № 11. - P. 47 - 50.

106. Inglis, J. J. The american society of tropical medicine and hygiene melioidosis risk in a tropical industrial environment / J. J. Inglis, A. Levy, A.J. Merritt // Am. J. Trop. Med. Hyg. 2009. - Vol. 80 (1). - P. 78 - 84.

107. Jackman, P.J.H. Microbiol systematic s based on electrophoretic whole — cell protein patterns / P.J.H. Jackman // Methods in microbiology. 1987. — Vol. 19. -P. 1911 - 1915.

108. Keasey, S. L. Extensive Antibody Cross-reactivity among Infectious Gramnegative bacteria revealed by proteome microarray analysis / S. L. Keasey, K.E. Schmid, M. S. Lee // J. Molec. Cell. Proteomics. 2009. - Vol. 8. - P. 924 - 935.

109. Keluangkhot, V. Melioidosis / V. Keluangkhot, R. Pethouvanh, M. Strobel // Med. Mai. Infect. 2005. - Vol. 35, № 10. - P. 469 - 475.

110. Kersters, K. Identification and of bacteria by protein electrophoresis / K. Ker-sters, B. Rot, M. Vancanneyt // Program and Abstr. FEMS Meet. Granada.1993.-P. 29-30.

111. Koonpaew, S. Genome fingerprinting by pulsed-field gel electrophoresis of isolates of Burkholderia pseudomallei from patients with melioidosis in Thailand / S. Koonpaew, M.N. Ubol, S. Sirisinha // Acta Trop. 2000. - Vol. 74. - P.187 -191.

112. Kotani, H. Identification and isolation of mycoplasmas by immunobinding / H. Kotani, H. Huang, M. Carrity // J. Med. Sci. 1987. - Vol. 23, №. 6. - P. 752 -758.

113. Kunakorn, M. Gold blot for detection of immunoglobulin M (IgM)- and IgG-specific antibodies for rapid serodiagnosis of melioidosis / M. Kunakorn, B. Petchclai, K. Khupulsup // J. Clin. Microbiol. 1991. - Vol. 29 - P. 2065 - ■ 2067.

114. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227, № 15. - P. 680-685.

115. Lee, W. Fingerprinting Candida albicans / W. Lee, J. Burnie, K. Matthews // J. Immunol. Methods. 1986. - Vol. 93, № 2. - P. 177 -182.

116. Levine, H.B. Immunization with an induced avirulent auxotrophic mutant of Ps. pseudomallei / H.B. Levine, R.L. Maurer // J. Immunol. 1958. - Vol. 81. - P. 433 -438.

117. Lim, K.P. Expression and purification of a recombinant scFv towards the exotoxin of the pathogen Burkholderia pseudomallei / K.P. Lim, H. Li, S. Nathan // J. Microbiol. 2004. - Vol. 42 (2) - P. 126 - 132.

118. Limmathurotsakul, D. Increasing incidence of human melioidosis in northeast Thailand / D. Limmathurotsakul, S. Wongratanacheewin, N.Teerawattanasook // J. Trop. Med. Hyg. 2010. - Vol. 82.-P. 1113-1117.

119. Liu, P. Identification of pathogenic Pseudomonas by extracellular antigens / P. Liu// J. Bacteriol. 1961. - Vol. 7, № 81. - P. 28 - 35.

120. Mayo, M. An outbreak of melioidosis linked to an unchlorinated water supply / M. Mayo, N. Anstey, P. Donohoe // Wold Melioidosis Congress. Perth, W. Australia, -2 001. -P.36 - 38/

121. Naas, T. Genetic structures at the origin of acquisition of the p-Lactamase blaKPC gene / T. Naas, G. Cuzon, M. V. Villegas // Antimicrob. Agents Chemother. - 2008. - Vol. 52. - P. 1257 - 1263.

122. Naureen, A. / Comparative evalution of Rose Bengal plate agglutination test, mallein test, and some conventional serological test for diagnosis of eguine glanders // A Naureen, M. Sagib, G.Muhammad // J. Vet. Diagn. Invest. 2007. -Vol. 19.-P. 362-367.

123. Novem, V. Structural and biological diversity of lipopolysaccharides from Burkholderia pseudomallei and Burkholderia thailandensis / V. Novem, G. Shui, D. Wang // Clin, and Vaccine Immunol. 2009. - Vol. 16, No. 10. - P. 1420 - 1428.

124. Oakley, B.R. A simplified ultrasensitive silver stain for detecting proteins in po-lyacrylamide gels / B.R. Oakley, D.R. Kirsch, N.R. Morris // Anal. Biochem. -1980.-Vol. 105.-P. 361 -363.

125. Pagnarith, Y. Emergence of Pediatric Melioidosis in Siem Reap, Cambodia / Y. Pagnarith, V. Kumar, J. Thaipadungpanit // J. Trop. Med. Hyg. 2010. - Vol. 82. - P. 1106-1112.

126. Pilatz, S. Identification of Burkholderia pseudomallei genes required for the intracellular life cycle and in vivo virulence / S. Pilatz, K. Breitbbach, N. Hein // Infection and Immunit. 2006. - P. 3576 - 3586.

127. Pongsunk, S. Rapid identification of Burkholderia pseudomallei in blood cultures by a monoclonal antibody assay / S. Pongsunk, N. Thirawattanasuk, N. Pi-yasangthong // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37, N 11. - P. 3662 - 3667.

128. Reckseidler-Zenteno, S. L. Characterization of the type III capsular polysaccharide produced by Burkholderia pseudomallei / S. L. Reckseidler-Zenteno, D.-F. Viteri, R. Moore // J. Med. Microbiol. 2010. - Vol. 59. - P. 1403 - 1414.

129. Rolim, D. B. Environmental Isolates of Burkholderia pseudomallei in Ceara State, Northeastern Brazil / D.B. Rolim, M. F. G. Rocha, R. S. N. Brilhante // American Society Microbiol. 2009. - Vol. 75, №. 4. - P. 1215 - 1218.

130. Rotz, L.D. Public health assessment of potential biological terrorism agents / L.D. Rotz, A.S. Khan, S.R. Lillibridge // Emerg. Infect. Dis. 2002. - Vol. 8, № 2. - P. 225 - 230.

131. Sarasombath, S. Characterization of monoclonal antibodies to protein antigen of Salmonella typhi / S. Sarasombath, S. Lertmemongkolchai, N. Banchuin // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26. - P. 508 - 512.

132. Sermswan, R.W. Comparison of the polymerase chain reaction and serologic tests for diagnosis of septicemic melioidosis / R.W. Sermswan, S. Won-gratanacheewin, N. Anuntagool // J. Trop Med Hyg 2000. - Vol. 63. - P. 146

133. Shanks, J. Burkholderia mallei tssM encondes a putative deubiguitinase that is secreted / J. Shanks, M.N. Burtnick, P.J. Brett // Infect. Immunol. 2009. - Vol. 77, №. 4.-P. 1636- 1648.

134. Srisurat, N. Bacterial loads and antibody responses in BALB/c mice infected with low and high doses of B. pseudomallei / N. Srisurat, R.W. Sermswan, U. Tatawasart // J. Trop. Med. 2010. - Vol. 82. - P. 1102 - 1105.

135. Steinmetz, I. Purification and characterization of an exopolysaccharide of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei / I. Steinmetz, M. Rohde, B. Brenneke // Infect. Immunol. 1995 - Vol. 63. - P. 3959 - 3965.

136. Stott, D.I. Immunoblotting and dot blotting / D.I. Stott // J. Immunol. Methods. 1989.-Vol. 119, №. 2.-P. 153 - 179.

137. Taketa, K. A tetrazolium method for staining peroxidase labels in blotting assays / K. Taketa, E. Ichickana, H. Taga // J. Immunol. Metods. 1986.-Vol. 95. -№ 1.-P.-71 -73.

138. Tan, K. S. Lim suppression of host innate immune response by Burkholderiapseudomallei through the virulence factor TssM / K. S. Tan, Y. Chen, Y.-C. Lim //J. Immunol. 2010. Vol. 184. - P. 5160 - 5170.

139. Tay, S. T. Sequence polymorphism and PCR-restriction fragment length polymorphism analysis of the flagellin gene of Burkholderia pseudomallei / S. T. Tay, P. C. Cheah, S. D. Puthucheary // J. Clin. Microbiol. 2010. - Vol. 48, №. 4.-P. 1465 - 1467.

140. Towbin, H. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets. Procedure and some applications / H. Towbin, J. Staehelin, J. Gordon // Proc .Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76. - P.4350 - 4354.

141. Vandamme, P. Differentiation of Campylobacters and Campylobacter — like organisms by numerical analis one-dimensional electrophoretic protein patterns / P. Vandamme, B. Rot, K. Kersters // Syst. and Appl. Microbiol. 1991. - Vol. 14, № 1. - P. 57-66.

142. Vandamme, P. Identification and population structure of Burkholderia stabilis sp. nov. (formerly Burkholderia cepacia genomovar IV) / P. Vandamme, E. Mahenthiralingam, B. Holmes // J. Clin. Microbiol. 2000.- Vol.38. - P. 10421047.

143. Vandamme, P. Polyphasic taxonomy in practice: the Burkholderia cepacia challenge / P.Vandamme, // WFCC Newsletter. 2002. - Vol. 34. - P. 17 - 24.

144. Whitlock, G. C. Burkholderia mallei cellular interactions in a respiratory cell model / G. C. Whitlock, A. Gustavo, L. Vsevolod // J. Med. Microbiol. 2009. -Vol. 58.-P. 554-562.

145. Woods, D.E. Burkholderia thailandensis El25 harbors f temperae bacteriophage specific for Burkholderia mallei / D.E. Woods, J.A. Jeddelok // J. Bacteriol. 2002. Vol. 184, № 14. - P.4003 - 4017.

146. Wuthiekanun, V. Rapid immunofluorescence microscopy for diagnosis of melioidosis / V. Wuthiekanun, V. Desakorn, G. Wongsuvan // Clinical and Diagnostic Laboratory immunology. 2005. - Vol. 8. - P. 555 - 556.

147. СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И МЕЛИОИДОЗА ПРЕЦИПИТИРУЮЩЕЙ АНТИСЫВОРОТКОЙ

148. Патснтообладатель(ли): ФГУЗ Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Ки)1. Автор(ы): см. на обороте1. Заявка №2006100651

149. Приоритет изобретения 10 января 2006 г. За^гистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 сентября 2007 г.

150. Срок действия патен та истекает 10 января 2026 г.

151. СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА И САПА МЕТОДОМ ИММУНОЭЛЕКТРОФОРЕЗА

152. Патентообладатель(ли): Федеральное государственное учреждение здравоохранения Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (К11)1. Автор(ы): см, на обороте1. Заявка № 2008111417

153. Приоритет изобретения 24 марта 2008 г. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 сентября 2009 2.

154. Срок действия патента истекает 24 марта 2028 г.

155. Руководитель Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам1. Б.П. Симонов1. Ж Ж Жж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж ж жж ж ж ж ж ж ж ж ж ж жжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжжж

Информация о работе

Мазурова, Ирина Юрьевна
кандидата медицинских наук
Волгоград, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Электрофоретический анализ и иммуноблоттинг в идентификации и внутривидовой дифференциации буркхольдерий - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы