Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Анализ белкового и антигенного состава штаммов PSEUDOMONAS PSEUDOMALLEI различной вирулентности

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Анализ белкового и антигенного состава штаммов PSEUDOMONAS PSEUDOMALLEI различной вирулентности"

На правах рукописи

ШТАММОВ PSEUDOMONAS PSEUDpMALLEI РАЗЛИЧНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ. 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 1997

Работа выполнена в Волгоградском научно-исследовательском проти

вочумном институте.

Научный руководитель: кадидат медицинских наук, старший

научный сотрудник H.H. Пивень

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, академик АЕН,

профессор Г.М. Шуб доктор биологических наук, старший научный сотрудник A.A. Щербаков

Ведущая организация: Ростовский противочумный

научно-исследовательский институт

Защита состоится "/У " ¿иу/ч^ 1997 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410071 г.Саратов, Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб".

Автореферат разослан "Ж." «¿/¿-¿¿ь/у/ 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Корнеев Г.А.

3J3-e о

/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Аэробные бактерии рода Pseudomonas в оследнее время стали предметом пристального и систематического зучения, поскольку широко распространены в природе, являются ажиым звеном в трофических цепях биоценозов и играют значи-ельную роль в инфекционной патологии человека (Ширяев Д.Т., 1976; Совалев Г.К., 1979; Илюхин В.И., 1985; Беляков В.Д. и др., 1990).

Из имеющих клиническое значение псевдомонад к патогенным от-осят Pseudomonas pseudomallei и Pseudomonas mallei, таксономнчески лизкородственные виды, вызывающие опасные заболевания человека : широкого круга животных - мелиоидоз и сап. Проблема мелиоидоза, о оценкам специалистов, сейчас значима не только для традиционно ндемичных регионов, но и для ряда областей, где заболевание ранее е регистрировалось (Dodin A., Ferry D., 1975; Dodin А., 1976; Paredes Avila R., 1976; Galimand M., Dodin A., 1982; Ashdown L., Kochler J., 990).

Биомолекулярные основы вирулентности Pseudomonas pseudo-lallei - одно из наименее освещенных направлений в изучении данного [икроорганизма. К настоящему времени имеются сведения о патогене-ической роли отдельных клеточных и экстрацеллюлярных биополи-геров возбудителя мелиоидоза (Hiídebrand G. et al., 1963; Илюхин !.И., 1985; Ashdown L., Kochler J., 1990; Пивень H.H., 1995; Плеханова 1.Г., 1995; Тихонов Н.Г. li др., 1995). Однако, данных их детального нализа современными методами электрофоретических и нммунохи-шческих исследований в доступной литературе нами обнаружено не ыло.

Цель работы: Выявление и характеристика биополимеров Pseudo-lonas pseudomallei, связанных с вирулентностью данного микроорга-изма.

Задачи исследования:

1. Провести электрофоретический и иммунохимический анализ бис полимеров штаммов возбудителя мелиоидоза различной вирулент ностн.

2. Выявить биополимеры, продукция которых коррелирует с уровне; вирулентности штаммов Р.рзешЗотаПеь изучить их физико-хими ческие и иммунохимические свойства.

3. Изучить протективные свойства отдельных биополимеров и оценит перспективу их использования в качестве компонентов химическо; вакцины.

Научная новизна.

Впервые с помощью электрофоретического и иммунохимическоп анализа выявлены биополимеры, уровень продукции которых корре лирует с уровнем вирулентности возбудителя мелиоидоза.

Установлено, что клетки вирулентных штаммов возбудителя ме лиоидоза продуцируют высокомолекулярные гликопротеииы, входя щие в состав поверхностного антигенного комплекса.

В составе клеточных оболочек вирулентных штаммов возбудится: мелиоидоза определены пять мажорных белков, два из которых жеста связаны с пептндогликаном.

Показаны протективные свойства высокомолекулярных глико протеинов и пептидоглгасан-связанных белков клеточной оболочю при иммунизации животных и последующей экспериментальной ме лиоидозной и сапной инфекции.

Практическая ценность. Материалы диссертации использовань при составлении следующих инструктивно-методических документов: 1. Методические рекомендации "Анализ электрофореграмм об щеклеточных белков патогенньк псевдомонад с применением компью терных программ" (Утверждены директором ВолгНИПЧИ 14.06.94г.).

2. Методические рекомендации "Получение и использование ла-тексных иммуноглобулинозых диагностикумов для идентификации некоторых патогенных псевдомонад" (Утверждены директором Волг НИПЧИ 12.12.95г.).

Апробация работы. Материалы диссертации были обсуждены на Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций (Волгоград, 1992), институтских и межлабораторных конференциях ВолгНИПЧИ (1991-1994), а также на юбилейной конференции ВолгНИПЧИ (Волгоград, 1995).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, отражающих основное ее содержание.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Результаты сравнительного электрофоретическогб и иммунохими-ческого анализа белков Pseudomonas pseudomallei различной вирулентности.

2. Сведения о составе, физико-химических и иммунохимических свойствах поверхностных биополимеров возбудителя мепиоидоза.

5. Новые данные о протехтивном эффекте некоторых белков клеточной оболочки Pseudomonas pseudomallei при экспериментальном мелио-идозе и сапе.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 108 листах машинописного текста и со-ггоит из введения, обзора литературы, трех глав собственных иссле-деваний, иллюстрированных 3 таблицами и 23 рисунками, заключения, 1ыводов и библиографического указателя по 199 литературным гсточникам.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В работе были использованы 17 штаммов Pseudomonas pseudo-mallei дикого типа различного географического происхождения, 6 му тантных низковирулентных штаммов, полученных в ВолгНИПЧИ, г также коллекционные штаммы следующих видов: - Pseudomonas mallei P. cepacia, P. aeruginosa, P. fluorescens, P. maltofilia, P. putida, P. stutzeri Escherichia coli. Культуры возбудителя меяноидоза и других мгосроор-ганизмов выращивали на питательном агаре ("Pifco", США) или в питательном бульоне ("Difco"), с добавлением глицерина до 4%.

Для получения препаратов общеклеточных белков клетки лизи-ровали в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) по Laemmli U.K. (1979). При использовании высушенной ацетоном бакмассы применяли предварительную ультразвуковую дезинтеграцию. Поверхностные биополимеры P. pseudomallei получали по методике, рекомендованноГ Н.Н.Пивнем (1995). Клеточные оболочки P.pseudomallei выделяли пс модифицированным нами методам Hancock R.E.W., Nikaido Н. (1978) Frazier C.R., Royt P.W. (1986). Концентрацшо белка определяли стандартными методами Lowry О. et al. (1951) и Bradford М.М. (1976).

Были использованы следующие варианты электрофореза белков а) в полиакриламидком геле с ДСН (ПААГ-ДСН) по Laemmli U.K (1979); б) диск-электрофорез по Davis B.J. (1959); в) изоэлектрическос фокусирование (ИЭФ) по Ригегпг (1986). Электрофоретический перенос биополимеров из ПААГ на нитроцеллюлозные (НЦ) мембрань: проводили методами Towbin Н. et al. (1979), TsangV. et al. (1983).

Гипериммунные козлиные и кроличьи сыворотки получали ¿¡pi иммунизации животных антигенами P.pseudomallei двумя циклами с интервалом 24 сут. Протектквные свойства биополимеров P. pseudo-mallei при экспериментальном мелиоидозе и сапе изучали на белы* мышах, белых крысах и золотистых хомячках. Контрольные и опытные группы состояли из 10 животных.

Иммуносорбцию сывороток проводили на иммобилизованных в ПЛАГ клетках низковирулентных мутантных штаммов P.pseudomallei. Выделение иммуноглобулинов (Иг) и приготовление иммунофермент-ных конъюгатов осуществляли согласно рекомендациям Кэтти Д. (1991). Включение |151 в Иг проводили ло JI. А. Остерману (1983). Ди-агностикум латексный иммуноглобулиновый получали по методике С.К. Александер к др. (1990).

При постановке реакции нммунодиффузнн в геле (РИД) и нмму-но~>лектрофореза (ИФ) использовали методы, описанные X. Фримелем (1979).

Дот-ИФА и иммуноблоттинг на НЦ- мембранах проводили но методам, рекомендованным Финдлей Д. (1990), Towbin Н. et al. (1979), TsangV. etal. (1983).

Денситометрию электрофореграмм осуществляли при помощи сканирующей системы GS300/360 ("HSI", США). Статистический анализ денситограмм проводили методами, описанными Socal R., Sneath Р. (1963), Бейли Н. (1970), Богословским Н. и др. (1982).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

До настоящего времени детального глектрофоретического и им-мунохимического сравнительного анализа биополимеров Pseudomonas pseudomallei с различной вирулентностью не проводилось. Одним из направлений нашей работы являлась стандартизация условий и приемов сопоставления белковых электрофореграмм и иммуноэлектрофо-реграмм различных штаммов возбудителя мелиоидоза. При сопоставлении электрофоретнческих треков в ДСН - ПААГ нами применялась процедура выравнивания соответствующих денситограмм по идентичным пикам локального участка с пересчетом значений Rf всех точек участка, реализованная в виде программного модуля. Обработка оцифрованных денситограмм при помощи алгоритма фильтра сколь-

зящего среднего (Фрейзер П., 1990) позволяла выявлять и идентифицировать фракции на электрофореграммах с высоким уровнем фонового окрашивания, а также разграничивать фракции с близкими значениями Rr. Точное определение молекулярных масс белков проводилось по рассчитанным функциям зависимости Rr и Мг на различных участках денситограмм. Вычисление мер близости денситограмм с учетом Rr и площадей пиков и дальнейший кластерный анализ матрицы коэффициентов корреляции позволял разделять исследуемый набор белковых спектров на компактные ограниченные группы по критерию максимального сходства. С применением вышеописанных приемов компьютерной обработки денситограмм, было оценено влияния плотности геля, времени и параметров электрофореза на воспроизводимость эксперимента. На примере ДСН-ПААГ электрофореза клеточных белков P.pseudomallei 111 в гелях постоянной, линейной и экспоненциальной концентраций ПААГ выявлены оптимальные для сравнительного анализа и расчета Мг участки электрофореграмм. Наиболее оптимальным для серийных сопоставлении протеннограмм P. pseudomallei являлось применение 10-11 % ДСН-ПААГ. Электрофорез в гелях линейных и экспоненциального градиентов концентраций ПААГ позволял с высокой точностью идентифицировать и анализировать биополимеры P.pseudomallei близких значений Rr , однако степень воспроизводимости результатов оказалась ниже, чем при использовании гелей постоянной концентрации.

Для изучения антигенных спектров штаммов P.pseudomallei с различной вирулентностью были получены несколько тест-систем на основе Иг козлиных сывороток к P.pseudomallei 100 и 111, Иг сывороток, адсорбированных ¡слетками низковирулентных штаммов (P.pseudomallei 100-16-1, 111-6-1), Иг кроличьей сыворотки к поверхностному полисахарвдно-белковому антигенному комплексу P.pseudomallei 111, а также МКА к Аг8 (В.В. Свиридов, Н.П. Храпова, 1987). В качестве

метки применялась щелочная фосфатаза. Иммуноферментные тест-системы на основе Иг общих и адсорбированных сывороток к клеткам P.pseudomallei, по данным дот-ИФА, оказались наиболее приемлемы для изучения особенностей общего антигенного спектра и отдельных антигенных комплексов штаммов возбудителя мелиоидоза различной вирулентности. Данные тест-снстемы показали наибольшую специфичность при детекции типичных патогенных псевдомонад. Взаимодействия с клетками гетерологнчных видов практически не наблюдалось. Результаты оценкн чувствительности и специфичности различных Иг з дот-ИФА были использованы при разработке латекных иммуноглобулиновых диагносгикумов для экспресс-детекции патогенных псевдомонад.

Был проведено сопоставление спектров общеклеточных белков 17 штаммов P.pseudomallei дикого типа с различным уровнем вирулентности для лабораторных животных, б низковирулентных мутантов, а также 5 высоковирулентных пассированных на животных культур возбудителя мелиоидоза. Полученные ДСН-ПААГ электрофореграммы содержали от 45 до 50 индивидуальных фракций с молекулярной массой в интервале 12 - 200 kD. По данным кластерного анализа (взвешенный парно-групповой метод, WPGMA), штаммы P.pseudomallei формировали группу по степени сходства протеинограмм на уровне 90 %, с тремя подгруппами на уровне 95 % сходства, объединяющими, как правило, штаммы единого географического происхождения (рис. I). Полученные данные согласовались с ранее опубликованными результатами использования белковых электрофореграмм при таксономической дифференциации различных видов Pseudomonas (Kersters К.., 1980; Jackman Р., 1985; Волчкевич Ж.А., 1990; Будченко A.A., 1995).

Были определены две области протеинограмм P.pseudomallei с

1 I 1 i L В;

7 * » Ч U 1Г и 15 14 J 7 )• 1» I* И | - ■П ■ j

М JJ 17 II 90 -i- 85 °/о

Рис. 1 Дендрограммы сходства протеинограмм штаммов P.pseudo-mallei различной вирулентности и гетерологичных видов. А - белки Мг 12 - 200 kD; Б - белки Мг 70 - 200 kD. Цифрами обозначены штаммы: 1 - P.pseudomallei 59361; 2 - 56830; 3 - 56830*; 4 - 56770; 5 - 56770*; 6 -С-141; 7 -С-141*; 8 -60631;9 - 60631*; I0-BKM900; 11 -ССЕВ860; 12-57576; 13- 100; 14- 100-6-1; 15- 100-16-1; 16-139; 17-98; 18-97; 19- 111; 20- 111-6-1; 21 - 111-7-1; 22 - 114; 23 - 114-7-1; 24 - 114-15-1; 25 - 128; 26 - 129; 27 - 130; 28 - 130*; 29 - P.mallei 10230; 30 - Ц-5; 31 -P.cepacia 25416; 32 - P.aeruginosa РАО-1; 33 - E.coli С-600; * - пассированный на животных.

наибольшим уровнем вариабельности по числу и концентрациям белков - участок диапазона Мг от 18 до 45 кЭ и высокомолекулярная область от 70 до 200 кЭ. Анализ степени сходства высокомолекулярной зоны протеинограмм показал максимальные значения мер близости для низковирулентных мутантов и отличный от проведенного на осно-

вс общего набора белков характер группирования изучаемых штаммов в целом (рис. 1). Низковирулентные мутанты возбудителя мелиоидоза характеризовались уменьшением числа и концентраций высокомолекулярных белков (Мг 100-200 кБ), а также снижением концентраций отдельных белков в областях Мг 59 - 95 кО и 20 - 45 к!) (рис. 2). У пас-

кгэ

4170 - 95

Чм %*м ¥Ш> %о» «А ъ*» «Я* «Х-

*#««•» Аф «Ь» ^

и '

«и* «ь- г у ^ -

#» V. 1ч. .

Й Т*! Й Й ** Й Й 1:1 ^ **

Г*

Г" **

ТТ »3 !

Я* ^ Т5 -

Ш е» щ «

■ «й» ¿'Л *«» .

■59

-34 -25

*<*•,

12 3 4 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14 15 1« 17 13 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28

Рис. 2 Электрофореграммы общеклеточных белков штаммов Р.рзеи-

с5ота11е1 различной вирулентности в 10 % ДСН-ПААГ. - . Цифрами обозначены штаммы: 1 - Р.рвеиаотаИа 59361; 2- 56830; 3 - 56830*; 4 - 56770*; 5 - 56770; 6 -С-141; 7 - С-141*; 8 - 60631*; 9 - 60631; 10 - ВКМ900; И - ССЕВ860; 12 - 57576; 13 - 100; 14 - 100-6-1; 15 -100-16-1; 16 - 139; 17 - 98; 18 - 97; 19- 111; 20- 111-6-1; -111-7-1; 22-114; 23- 114-7-1; 24- 114-15-1; 25 - 128; 26 - 129; 27 - 130; 28 - 130*; * - пассированный на животных.

сированных на животных штаммов наблюдалась выраженная гиперпродукция биополимеров Мг 170, 59, 52 кБ (рис. 2). количественная оценка изменения уровня экспрессии отдельных биополимеров у

штаммов с различной вирулентностью проводилась путем рассчета и сопоставления площадей соответствующих пиков денситограмм. По нашим данным, у низковирулентных мутантов P.pseudomaliei наблюдалось снижение продукции биополимеров Мг 170, 120, 95, 83, 79, 73, 59, 52, 34 kD в 15 - 100 раз, по сравнению с исходными штаммами. При возрастании вирулентности в результате пассажа культуры на экспериментальных животных наблюдалось 5 - 50 кратное возрастание концентрации фракций электрофореграмм с Мг 120 - 170 kD и 59, 52, 34 kD.

Изучение антигенного состава штаммов возбудителя мелиоидоза методом иммуноблоггинга показало, что все вирулентные штаммы P.pseudomaliei продуцируют антигены Мг 120 - 170 kD (рис. 3). Данный набор высокомолекулярных антигенов был отмечен также у вирулентных штаммов возбудителя сапа, за исключением биополимера 170 kD. У низковирулентных мутантов обоих видов уровень экспрессии этих антигенов, а также антигенов Мг 30 - 35 kD был значительно снижен (рис. 3). Число и количественная выраженность антигенов Мг 120 - .170 и 30 - 35 kD оказались значимыми признаками, по данным статистического анализа, при дифференциации штаммов P.pseudomaliei различной вирулентности (рлс. 4).

Полученные данные, по нашему мнению, позволяют говорить о связи вирулентных свойств P.pseudomaliei и продукции белков вышеназванных Мг с антигенными свойствами в клетках возбудителя.

Мечение ннтастных клеток 1251, последующий электрофорез клеточных лизатов в ДСН-ПААГ и радиавтография гелей позволили установить, что отличия спектров поверхностных белков у штаммов различной вирулентности имели тот же характер, что и при сопоставлении общеклеточных белков (рис. 5). Данный факт свидетельствовал о

\kD V170

M20

■ 59

L.J

■ 3-4 "22

12 34 56789 Ю11

Рис. 3 Иммуноблоттинг общеклеточных белков различных видов Pseudomonas с PIr, очищенными иммуносорбцией на м.к. P.pseudomallei 111-6-1. Цифрами обозначены штаммы: P.pseudomallei: 1 - 100; 2 - 100-16-1; 3 - 111; 4-111-6-1; 5 - С-141; 6 - С-141*; P.rnallei: 7 -10230; S - 10230-163; 9 - Ц-5; P.ceoacia: 10 - 25416; P.aeruginosa: 11 - РАО-!. * - пассирозанный на животных.

ю ах

Им

—1-

>ис. 4 Дендрограмма мер сходства антигенных спехтроа различных видов Pseudcraonas при использовании адсорбированных Иг к P.pseudomallci 111. Цифрами обозначены штаммы: • P.pseudomallsi: 1 -100; 2 - 100-16-1; 3 -111; 4 -111-6-1; 5 - С-141; 6 -С-141"; P.mallri: 7 -10230; 8 -10230-163; 9 - Ц-5; P.cepacia: 10 -25416; P.aerugmosa: 11 - РАО-1; * - пассированный на животных.

локализации биополимеров, связанных с вирулентностью, в поверхностных структурах клетки P.pseudomallei.

ИФ очищенных ГХ водно-солевых экстрактов вирулентного P.pseudomallei 111 и авирулентного мутанта 111-6-1 с использованием иммунной сыворотки к вирулентному штамму показал, что общими были катодподвижные антигены, тогда как дуга преципитата в электронейтральной зоне иммунофореграммы отмечена только у P.pseudomallei 111. Данный биополимер имел, по данным ГХ, молекулярную массу 750 - 800 kD и характеризовался весовым соотношением углевода к белку 8:1. Неденатурирующий диск-электрофорез высокомолекулярного антигена в 7% ПААГ показал в его составе фракцию с Мг порядка 400 kD преимущественно углеводной природа. Иг сыворотки к P.pseudomallei 111 в иммуноблоттинге взаимодействовали с данной фракцией, а также с более высокомолекулярным комплексом, не мигрирующим в разделяющем геле. ИЭФ в 1,5 % агарозном геле в интервале рН 3 - 10 показало, что изоэлектрическая точка выявленного биополимера находилась в области 7,0-7,2. Структурные составляющие высокомолекулярного биополимера более детально были охарактеризованы при предварительном мечении препарата дансилхлоридом и последующем ДСН-ПААГ электрофорезе, а также при дифференциальном окрашивании гелей серебром. Установлено, что под воздействием ДСН происходит диссоциация высокомолекулярного комплекса на ряд гликопротеинов Мг 120 - 200 kD и белки Мг 20 - 60 kD, в более низкой по сравнению с гликопротеинами концентрации (рис. 6).

При сопоставлении ДСН-ПААГ электрофореграмм препаратов клеточных оболочек были определены 5 мажорных белков Мг 22, 30, 34, 52, 59 kD, характерных для всех вирулентных штаммов P.pseudomallei. Полученные нами результаты в определенной мере согласуются с данными о белковом составе клеточной оболочки щтам-, мов P.pseudomallei, выделенных в различных географических регионах

ЕЗ pw» — г»«* —• - в*« . kD

. «ЧР~ . tf. 170

» ■

fc. к f I г

г CTJ- Т? ?Sr сг- ----59

• h* ■ b" !-<■:

(ц» Cs» о е» r.f-- е» w'l

» • ^ ff е-» fr» ^ РП fr*

5 ■ QSDQDOeQu-"

П»-ч «*«• *•«• сч ---22

t,'.| ..... .....

----. ;_____1

,02i. ••i.i ^а» ¿ЯЭ» _

1 2 3 4 5 6 7

8

9 10 II

Рис. 5 Электрофореграммы поверхностных белков P.pseudomallei,меченных 1251, в 10 % ДСН-ПААГ. Цифрами обозначены штаммы: 1- 100; 2- 100-16-1; 3- 111; 4 - И1-6-1; 5 - С-141; б - С-141*; 7 -56830; 8 - 56830'"; 9 - 130; 10 - 130*; 11 -139*; ** - пассированный на животных.

J-

О

О ->

fi.Isl

«а» » •

с м

'.'i'i^j'i .Hi

___i9

*S 34

В

Рис. 6 Изучение биополимерного состава высокомолекулярного поверхностного антигена P.pseudomallei Ills ДСН-ПААГ электрофорезе при мечении ДНХ (А) и окрашивании серебром (В). Обозначения: - белки; - гликопротеины; - полисахариды.

(Калачев И. и др., 1993; СрК>Ь N. е( а!., 1994). Пассированный высоковирулентный вариант штамма С-141 характеризовался наибольшей концентрацией указанных белков. В составе клеточных оболочек низковирулентных Р.рБсиёотаПе! 100-16-1 и 111-6-1 белок 30 кО отсутствовал, а белки 22 и 34 кБ отмечены в более низкой концентрации по сравнению с вирулентными штаммами (рис. 7). Из выявленных структурных белков клеточной оболочки, два (Мг 30 и 34 кО) оказались связанными прочной ковалентной связью с пептидогликаном. Разрыв данной связи был возможен только при температурах от 80° до 100°С в присутствие 2-меркаптоэтанола и ДСН.

к о

«ок»

«ЙЕ5» 22

Рис. 7 Белковый состав клеточных оболочек Р.р5еиёоша11е1 различной вирулентности в 10 % ДСН-ПААГ. Цифрами обозначены штаммы: 1 -100; 2 -100-16-1; 3 -111;4-111-6-1; 5 - С-141; 6 - С-141*; * - пассированный на животных.

Сравнительная оценка протективного эффекта выявленных поверхностных биополимеров была проведена на модели экспериментальной мелиоидозной и сапной инфекции белых мышей, золотистых хомячков и белых крыс. Были использованы высокомолекулярные гликопротеины, очищенные ГХ и ИОХ, а также электрофорети чески очищенные белки клеточной оболочки Мг 30 и 34 kD P.pseudomallei III. Иммунизация животных очищенным ГХ материалом клеточной оболочки, содержащим два мажорных белка Мг 30 и 34 kD и их высокомолекулярный комплекс с пептидогликаном, обеспечивали частичную защиту (на уровне 30%) при 100% гибели контрольной группы животных. Сходные результаты удалось получить при использовании в иммунизации белка Мг 34 kD. В этом случае наблюдалась 30% и 40% выживаемость животных, зараженных P.pseudomallei 100 и P.mallei Ц5 соответсзенно. Препарат, полученный ИОХ и содержащий в качестве основных компонентов гликопротеин 120 kD и белки 30 и 34 kD, показал наиболее выраженный протективный эффект - 40% и 66,7% выживания иммунизированных групп белых мышей и белых крыс при заражении P.pseudomallei 100.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что изменение вирулентности Pseudomonas pseudomallei сопровождается прямо зависимым изменением уровня продукции поверхностных антигенов гликопротеиновон и белковой природы в клетках возбудителя. Полученные данные существенно дополняют представления о бномолекулярных основах вирулентности P.pseudomallei и могут послужить основой для дальнейшего изучения структурных особенностей и поиска генетических детерминант отдельных факторов патоген-ности возбудителя мелиоидоза.

ВЫВОДЫ.

1. Разработка и применение методов компьютерной информационной обработки денеитограмм, вычисления их мер сходства, расчета элек-трофоретической подвижности и молекулярных масс позволили стандартизовать систему сравнительного анализа электрофореграмм биополимеров различных штаммов P.pseudomallei.

2. Электрофоретический и иммунохимический анализ общеклеточных белков штаммов P.pseudomallei различной вирулентности выявил существенные межштаммовые отличия по числу и концентрациям биополимеров с молекулярными массами 100 - 200 kD и 20 - 45 kD. Продукция антигенов i 20 - 170 и .30 - 35 kD в клетках возбудителя мелиоидоза коррелирует с уровнем вирулентности штаммов, снижаясь у низковирулентных и увеличиваясь у высоковирулентных, в том числе у пассированных на животных культур.

3. Антигены 120 - 170 kD, характерные для вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза, по своей химической природе являются глико-протеинами и входят в состав поверхностного высокомолекулярного гетерополимерного комплекса с массой 800 kD.

4. В состав клеточных оболочек вирулентных штаммов возбудителя мелиоидоза входят 5 мажорных белков с молекулярными массами 22, 30, 34, 52, 59 kD. Белки 30 и 34 kD образуют мультимернын комплекс с пептидогликаном оболочки, диссоциирующий при температуре свыше 80°С в присутствие додецилсульфата натрия и меркапто-этанола. Низковирулентные штаммы Р. pseudomallei отличаются сниженной продукцией белков оболочки 30 и 34 kD.

5. Гликопротеин 120 kD и белки клеточной оболочки 30 и 34 kD обладают заметным протективным эффектом, проявляющемся в выживании 30 % - 60 % иммунизированных животных при экспериментальном мелиоидозе и сапе.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ. .

1. Будченко A.A., Викторов Д.В. Белковый спектр патогенных псевдомонад, выращенных на различных питательных средах. //Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. - Материалы Российской конференции. - Волгоград, 1992. - С.74.

2. Будченко A.A., Викторов Д.В. Компьютерный анализ изоэлектро-фореграмм клеточных белков (антигенов) микроорганизмов рода Pseudomonas. //Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. - Материалы Российской конференции. - Волгоград, 1992. -

. С.75.

3. Будченко A.A., Викторов Д.В. Система анализа белковых спектров псевдомонад. //Информ. бюлл. Проблемной комиссии по эпидемиологии и микробиологии ООИ. - Саратов, 1993. - С.24-25.

4. Будченко A.A., Викторов Д.В. Влияние состава лизирующего раствора на электрофоретическое разделение общеклеточных белков псевдомонад. //Материалы межгосударственной научно-практической конференции. - Ставрополь, 1994.-С. 167.

5. Викторов, A.A. Будченко. Сравнительное изучение протешюграмм патогенных псевдомонад с использованием компьютерного анализа. //Генетика'и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. - Материалы Российской конференции. - Волгоград, 1992. - С.31.

6. Виктороз, A.A. Будченко. Анализ электрофореграмм ■ общеклеточных белков патогенных псездомонад с применением компьютерных программ. //Информ. бюлл. Проблемной комиссии по эпидемиологии и микробиологии ООИ. - Саратов, 1995. - С. 23.

7. Виктороз Д.В., Пивень H.H., Смирнова В.И. Анализ состава термостабильного антигена 8 Pseudomonas pseudomallei методом имму-ноблоттинга. //Генетика и биохимия вирулентности возбудителей ООИ. - Материалы Российской конференции, - Волгоград, 1992. - С. 82.

8. Гетерогенность структуры антигена 8 возбудителя мелиоидоза. /В.И. Смирнова, Д.В. Викторов, H.H. Пивень и др. //Материалы Российской научной конференции. - Саратов, 1993. - С. 122.

9. Сравнительное изучение белковых спектров возбудителен мелиоидоза и сапа с использованием компьютерного анализа. /Д.В. Викторов, A.A. Будченко, H.H. Пивень н др. //Информ. бюлл. Проблемной ко-

миссии по эпидемиологии и микробиологии ООИ. - Саратов, 1995. -С. 66-67.

Ю.Электрофоретический анализ экстрацеллюлярных антигенов патогенных псевдомонад. /А.А. Будченко, А.Е. Замарин, Д.В. Викторов и др. //Материалы Российской научной конференции. - Саратов, 1993. -С.269.