Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка и изучение рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Разработка и изучение рекомбинантных антител против вируса клещевого энцефалита"

9 15-2/166

На правах рукописи

БАЙКОВ ИВАН КОНСТАНТИНОВИЧ

РАЗРАБОТКА И ИЗУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ ПРОТИВ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Новосибирск - 2015

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Научный руководитель:

д.б.н., доцент Тикунова Нина Викторовна

Официальные оппоненты:

Габибов Александр Габибович, д.х.н., профессор, член-корр. РАН Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, зам. директора по научной работе

Локтев Валерий Борисович, д.б.н., профессор Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», заведующий отделом молекулярной вирусологии флавивирусов и вирусных гепатитов

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Лимнологический институт СО РАН

Защита состоится «23» октября 2015 года в 10:00 часов

на заседании диссертационного совета Д 003.045.01 на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН по адресу 630090, г. Новосибирск, пр. Ак. Лаврентьева, 8

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и на сайте www.niboch.nsc.ru

Автореферат разослан « » Р$ 2015 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н., доцент

Коваль В. В.

РОСаЛ. .

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОЩй СУД АРСТ8 ЕННАГ Актуальность темы. Антитела (иммуноглобулины) БУ* Сйййбьийй&цы сыворотки крови, которые образуются клетками иммунной системы в ходе иммунного ответа на чужеродные для организма соединения, называемые антигенами, и необходимы для их нейтрализации и деградации. В настоящее время антитела и их производные широко используются в медицине для лечения, предотвращения и диагностики различных заболеваний и нарушений. Использование сывороточных антител человека и моноклональных антител животных в терапии ограничено, что связано либо с их поликлональным характером, либо с чужеродностью таких антител для человека. Широкое развитие получили различные варианты рекомбинантных (искусственных) антител, таких как химерные, гуманизированные и полноразмерные человеческие антитела. Такие антитела конструируют генно-инженерными методами и получают биотехнологически в культурах клеток, контролируя их свойства и обеспечивая однородность от партии к партии. Благодаря возможности изменять и добавлять функциональные участки в молекуле антитела, технология создания рекомбинантных антител позволяет получать биомолекулы, специализированные для решения конкретной задачи. В результате, рекомбинантные антитела являются активным компонентом многих современных противораковых и противовирусных препаратов, а также препаратов для лечения аутоиммунных заболеваний (Nelson A. L. et al., 2010).

Одной из проблем здравоохранения Российской Федерации, ряда европейских стран, а также северного Казахстана, Монголии и Китая является клещевой энцефалит, вызываемый вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ) (Suss J., 2010). Ежегодно в мире клещевым энцефалитом заболевают по разным оценкам от 6 до 12 тысяч человек, при этом более половины случаев приходится на территорию Российской Федерации (Lindquist L. et al., 2008). В России и Казахстане для профилактики и этиотропной терапии клещевого энцефалита применяют «Иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита» (ФГУП «НПО «Микроген», Россия), получаемый из плазмы крови доноров, проживающих в природных очагах заболевания (Пеньевская Н. А. и др., 2010) Дефицит и высокая стоимость данного препарата, а также возможный биологический риск при его применении приводят к необходимости поиска альтернативных терапевтических средств. В качестве альтернативы могут быть использованы рекомбинантные полноразмерные антитела, такие как химерные или гуманизированные варианты мышиных антител против вируса клещевого энцефалита.

Цель данной работы - создание протективного химерного антитела против гликопротеина Е вируса клещевого энцефалита и изучение его иммунохимических и противовирусных свойств.

В соответствии с поставленной целью было необходимо решить следующие задачи:

1) клонировать гены гибридомной линии клеток, кодирующие вариабельные домены протективного моноклонального антитела против вируса клещевого энцефалита;

2) сконструировать кассетные векторные плазмиды для экспрессии генов, кодирующих полноразмерные антитела с константными доменами иммуноглобулинов человека, в эукариотических клетках и получить на их основе плазмиды с генами лёгкой и тяжёлой цепей химерного антитела против ВКЭ;

3) провести очистку химерного антитела, наработанного путём транзиентной экспрессии в эукариотических клетках, и исследовать его структурные характеристики: молекулярную массу, число лёгких и тяжёлых цепей, степень и тип гликозилирования;

4) определить сродство химерного антитела к белку Е вируса клещевого энцефалита и исследовать противовирусные свойства этого антитела по отношению к вирусу клещевого энцефалита.

Научная новизна работы. В настоящей работе впервые было сконструировано химерное антитело, способное защищать мышей от введения сотен летальных доз ВКЭ. Определены нуклеотидные последовательности участков, кодирующих вариабельные домены ряда перспективных мышиных моноклональных антител (МКА) против ВКЭ. Полученные последовательности депонированы в базу данных ОепВапк. Показано, что введение химерного антитела сЫ4Б5а в субнейтрализующей дозировке не вызывает антителозависимого усиления инфекции на мышиной модели клещевого энцефалита.

Основные научные положения, выносимые на защиту.

1. Впервые сконструировано химерное антитело, способное защищать мышей от введения сотен летальных доз ВКЭ.

2. Структурная организация сконструированного химерного антитела, включая тип гликозилирования, соответствует характеристикам рекомбинантных антител, получаемых в клетках СНО и применяемых в терапии.

3. Гибридомная линия клеток 14Э5 продуцирует протективные антитела против ВКЭ с двумя типами вариабельных доменов лёгкой цепи, отличающимися по последовательности а.к.о. и относящимися к разным семействам УЬ-генов мыши.

4. Сконструированные плазмиды рСН2 и рСЬ2 позволяют ускорить процесс получения новых полноразмерных антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в эукариотических клетках по сравнению с предыдущими плазмидами рСН и рСЬ.

Практическая и теоретическая значимость работы.

Получено химерное антитело сЬ14Б5а против ВКЭ, которое обладает терапевтическим потенциалом и может быть использовано для создания новых эффективных средств профилактики и лечения клещевого энцефалита, отвечающих современным стандартам.

Сконструированы плазмидные шатгл-векторы рСН2 и рСЬ2, предназначенные для экспрессии в эукариотических клетках генов тяжёлых и легких цепей полноразмерных рекомбинантных антител, содержащих константные домены иммуноглобулинов /каппа человека. Эти плазмиды могут быть использованы для получения различных полноразмерных антител, в частности с их помощью были получены полноразмерные человеческие антитела против ортопоксвирусов (КЬ^еуюЬ У. А. й а1., 2014; Байков И. К. и др., 2013), ДНК-гидролизующие полноразмерные антитела (Могогоуа V. V. е1 а1., 2013), а также антитела против интерлейкина-18 (данные не опубликованы).

Сконструированы плазмиды рСН2-1405 и рСЬ2-1405а, кодирующие цепи химерного антитела против ВКЭ. С помощью этих плазмид возможно получение вариантов антитела сЫ405а в экспрессионных системах, отличных от клеток СНО, например, для получения различных гликоформ этого антитела.

Полученные в данной работе нуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельные домены некоторых наиболее перспективных МКА против ВКЭ, могут быть использованы для анализа и сравнения с последовательностями других антител.

Для антитела chl4D5a определены иммунохимические и противовирусные свойства, такие как сродство к белку Е ВКЭ, индекс нейтрализации (1С50) и протективная активность на мышиной модели ВКЭ. Эти данные могут быть использованы для анализа и сопоставления со свойствами других антител против ВКЭ.

Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, из них 2 статьи в журналах из списка ВАК и 2 в рецензируемых зарубежных журналах. Кроме этого получен патент РФ. Материалы диссертации были также представлены на различных Российских и зарубежных конференциях: XLVI и XLIX Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, Россия, 2008 и 2011); МЭСК-2008 - XIII Международная экологическая студенческая конференция «Экология России и сопредельных территорий. Экологический катализ» (Новосибирск, Россия, 2008); IV и V Российские симпозиумы «Белки и пептиды» (Казань, Россия, 2009 и Петрозаводск, Россия, 2011); Научная конференция «Медицинская геномика и протеомика» (Новосибирск, Россия, 2009); XXII зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». (Москва, Россия, 2010); Международные научные конференции «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами» (Иркутск, 2012) и «Фундаментальные науки - медицине» (Новосибирск, 2012); 38th FEBS Congress (Санкт-Петербург, 2013); Научно-практическая конференция «Диагностика и профилактика инфекционных болезней» (Новосибирск, 2013); "17th Annual Meeting of the European Society for Clinical Virology" (Прага, Чехия, 2014); "3rd Antivirais Congress" (Амстердам, Нидерланды, 2014).

Вклад автора. Большинство экспериментов и анализ полученных данных сделаны лично автором. Автор благодарен коллегам, которые помогли выполнить некоторые эксперименты, без которых работа была бы неполной. В частности, протективная активность антител была исследована в НПО «Микроген», г. Томск. Изучение вируснейтрализующей активности in vitro выполняли совместно с к. б. н. А. Б. Рыжиковым, ФБУН ГНЦ ВБ "Вектор". Некоторые стадии при создании генетических конструкций, кодирующих химерное антитело, выполнены при содействии И.Н. Бабкиной. Трансфекцию и культивирование эукариотических клеток для наработки химерных антител осуществлял А. Л. Матвеев. При секвенировании ДНК капиллярный электрофорез подготовленных проб выполняли сотрудники Центра коллективного пользования "Геномика" СО РАН. В масс-спектрометрических исследованиях определение масс-спектров подготовленных образцов выполнено сотрудниками Центра масс-спектрометрического анализа ИХБФМ СО РАН либо сотрудником Лимнологического института СО РАН И. Г. Кондратовым.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов работы, их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 157 страницах, содержит 43 рисунка, 6 таблиц и 7 приложений. Список литературы состоит из 305 источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Оценка протективной активности мышиных моноклональных антител против ВКЭ in vivo с целью выбора прототипного антитела

При создании химерного антитела против ВКЭ необходимо выбрать в качестве источника вариабельных доменов антитело, обладающее наибольшей противовирусной активностью. Ранее в ИХБФМ СО РАН (НИБХ СО АН) была получена панель мышиных МКА, специфичных к поверхностному гликопротеину Е ВКЭ (Матвеев Л. Э. и др., 1989), и было показано, что некоторые из этих антител способны ингибировать инфекционность ВКЭ in vitro (Tsekhanovskaya N. A. et al., 1993). В настоящей работе протективную активность трёх высокоаффинных вируснейтрализующих антител 14D5, 13D6 и 1В1 исследовали на периферической мышиной модели ВКЭ (Тимофеев А. В. и др., 2001). Животных инфицировали приблизительно 500 ЛД50 вируса, препараты антител в дозировке 150 мкг/мышь вводили внутривенно через 24 ч после инфицирования. В результате эксперимента было установлено, что выживаемость мышей в случае введения антитела 14D5 выше по сравнению с антителами 1В1 и 13D6 (Рисунок 1). На основании этого МКА 14D5 было выбрано в качестве прототипа для создания химерного антитела против ВКЭ.

Рисунок 1. Протективная активность МКА против ВКЭ in vivo. Мышам вводили по 150 мкг указанных МКА внутривенно через 24 ч после инфицирования 500 ЛД50 ВКЭ. * р<0,05; **р<0,005 (логранговый критерий).

2. Получение ДНК-фрагментов, кодирующих вариабельные домены МКА 14D5,1В1 и 13D6, и определение нуклеотидных последовательностей этих

фрагментов

Из гибридомных клеток линии 14D5, продуцирующих МКА 14D5, была выделена РНК, которую использовали для синтеза фрагментов кДНК, кодирующих вариабельные домены антитела. Для синтеза ПЦР-фрагментов, кодирующих VH- и

Уь-домены, использовали праймеры, соответствующие началу каркасных областей V-генов, и праймеры, комплементарные началу генов, кодирующих константные домены ^01/карра-антител мыши. В результате ПЦР для тяжёлой цепи синтезировался один ДНК-фрагмент Ун1405, а для лёгкой цепи образовалось три фрагмента Уь1405а, УЬ1405Ь и Уь1405с с различной электрофоретической подвижностью (Рисунок 2).

!326Ьр

587 Ьр 434 Ьр 307 Ьр

. УЫ405_с

^УЫ405_Ь УН1405-УЫ405_а

мр#

-1326 Ьр _

Рисунок 2.

Электрофореграмма в

— 587 Ьр 6% ПААГ ПЦР-

фрагментов,

полученных с кДНК 'Ь4 Ьр гибридомных клеток линии 1405. М -

- 307 Ьр пдазмидная ДНК рС>рЕ,

гидролизованная эндонуклеазой Нае III.

Каждый из полученных ПЦР-фрагментов встроили в плазмиду риС19 по сайтам эндонуклеаз рестрикции £соЫ и Нтд,III; плазмиды обозначили риС19-УН-1405, риС19-УЬ-1405а, р1_ГС19-УЬ-1405Ь и риС19-УЬ-1405с. После этого были определены нуклеотидные последовательности встроенных участков для нескольких клонов каждой из полученных плазмид. Анализ последовательностей с помощью базы данных 1МСТ/У-С>иЕ8Т (http://www.imgt.org) выявил, что последовательность фрагмента УН14Б5 относится к семейству ЮНУ1 антител мыши, Уь1405а - к семейству ЮКУ10, а УЬ1405Ь - к семейству ЮКУ6, согласно классификации 1МСТ. Последовательность фрагмента У[,1405с содержит У-участок (нуклеотиды 1 - 296), идентичный зародышевому гену ЮКУЗ-5, однако вместо 1-сегмента присутствует вставка участка генома (нуклеотиды 297 - 360), которая приводит к сдвигу рамки трансляции, что препятствует образованию легких цепей с константным доменом.

Аналогичным образом были определены нуклеотидные последовательности фрагментов, кодирующих антитела ТВ 1 и 1306. Как и в случае гибридомы 1405, для тяжёлых цепей антител 1В1 и 1306 было получено по одному ДНК-фрагменту, тогда как для лёгких цепей в результате ПЦР образовалось несколько фрагментов с различной электрофоретической подвижностью. В результате секвенирования было установлено, что последовательности фрагментов УН1В1 и Ун1306 относятся к семейству ЮНУ1 антител мыши, 1В1 а и У[1306а - к семейству ЮКУЮ. Нуклеотидные последовательности ДНК-фрагментов У[.1В1Ь и УЬ1306Ь оказались идентичны нуклеотидной последовательности фрагмента УЬ1405Ь.

Сравнение последовательностей а.к.о. вариабельных доменов мышиных антител 14Б5, 1В1 и 1306, а также некоторых других антител против ВКЭ (Байков И. К. и др., 2012) показало, что Ун-последовательности антител 14Э5, 1В1 и 1306 выделяются в одну группу, а Ун-последовательности антител 10С2 и 1402 образуют другую группу. Это хорошо согласуется с данными эпитопного картирования, проведённого для этих антител, а также с их противовирусными свойствами (ТБекЬапоузкауа N. А. е1 а1., 1993). Уь-последовательности Уь1405а, УЬ1В1, Уь1306а

и Vl14D2 образуют одну группу, Уь-последовательности VL14D5b и VL13D6 образуют другую группу. Отдельно от них отстоит последовательность VL10C2. Сравнение с последовательностями антител Е6В и 4.2 (Jiang W. et al., 1994; Тикунова HB и др., 1999) не выявило значительной гомологии.

3. Электрофоретический и масс-спектрометрический анализ образца МКА

14D5

Чтобы определить, какие именно лёгкие цепи содержатся в молекулах антитела, секретируемого гибридомой 14D5, провели электрофоретическое разделение образца МКА 14D5 с последующим масс-спектрометрическим анализом легких и тяжёлых цепей отдельно. В результате этого было установлено, что препарат МКА 14D5 содержит молекулы IgG с лёгкими цепями двух типов: light_14D5a и light_14D5b, соответствующими последовательностям VL14D5a и VL14D5b (Рисунок 3). Пиков, соответствующих неполной лёгкой цепи light_14D5c, не было обнаружено в спектре. Исходя из соотношения высот пиков, соответствующих пептиду LLIYYTSR ([М+Н+]=1028,6) цепи light_14D5a и пептиду LLIYSASYR ([М+Н*]= 1085,6) цепи light_14D5b, можно предположить, что соотношение лёгких цепей light_14D5a и light_14D5b в препарате МКА 14D5 составляет приблизительно 1:3.

Для мышиных гибридомных линий клеток описаны случаи секреции двух различных лёгких цепей одновременно (Köhler G. et al., 1976; Zack D. J. et al., 1995). На основании результатов сравнения полученных последовательностей VL14D5a и VL14D5b с известными последовательностями мышиных антител и антител, секретируемых миеломами, не удалось однозначно определить, какая из цепей light_14D5a или light_14D5b вносит больший вклад в сродство МКА 14D5 к гликопротеину Е ВКЭ. Поэтому было решено получить два химерных антитела chl4D5a и chl4D5b с одинаковыми тяжелыми и разными лёгкими цепями.

70 60

04

.150

ся

5 40 с

£ 30

1 20 10

о

Рисунок 3. МА1Л1-ТОР масс-спектр триптических фрагментов лёгких цепей антитела 1405, снятый в рефлективном положительном режиме с использованием матрицы БИВ. Пики, отмеченные Ж, соответствуют цепи ^Ы_1405а, тогда как пики, отмеченные ■, соответствуют цепи ^1т1_14В5Ь. Пики, отмеченные □ соответствуют константному домену каппа-цепей мышиных антител.

4. Конструирование кассетных плазмидных ДНК для экспрессии полноразмерных рекомбинантных антител с константной частью иммуноглобулинов человека IgGl/каппа

Для транзиентной экспрессии полноразмерных антител в клетках млекопитающих ранее использовали плазмиды рСН и pCL, содержащие гены тяжёлой цепи с константной частью IgGl человека и лёгкой цепи с константной частью каппа-цепей антител человека, соответственно (патент РФ № 2285043). Эти плазмиды сконструированы на основе коммерческого вектора pcDNA3.1(+) (Invitrogen), гены тяжёлой и лёгкой цепей находятся в них под контролем цитомегаловирусного промотора и содержат последовательность сигнала полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Обе плазмиды содержат в качестве селективного маркера ген аминогликозид З'-фосфотрансферазы, обеспечивающий устойчивость к генетицину.

В данной работе на основе плазмид рСН1 и pCLl были получены кассетные плазмидные ДНК рСН2 и pCL2, в которых можно заменять V-гены, получая при этом новые антитела с различной специфичностью. Кроме того в плазмиде, кодирующей лёгкую цепь, был заменён ген устойчивости к антибиотику. Это позволяет осуществлять независимый селективный отбор клонов по каждой из плазмид, что необходимо при получении клеточного клона, стабильно секретирующего антитело.

На первой стадии в плазмиде pCLl ген Neo, обеспечивающий устойчивость к генетицину, заменили на ген hygroB, кодирующий гигромицин Б-киназу и обеспечивающий устойчивость к гигромицину Б. Для этого плазмиду pCLl гидролизовали эндонуклеазами рестрикции Nhe I и A pal, после чего фрагмент light IN А, содержащий ген лёгкой цепи, встроили в гидролизованную теми же эндонуклеазами рестрикции плазмиду pcDNA3.1/Hygro(+) (Invitrogen), содержащую ген устойчивости к гигромицину Б. В результате была получена плазмида pCLl/hygro, несущая ген устойчивости к гигромицину Б.

Далее в плазмиды рСН1 и pCLl/hygro сайт-направленным мутагенезом были введены дополнительные уникальные сайты гидролиза эндонуклеазами рестрикции в 5'- и З'-концевые области VH- и VL-участков. Сайты были подобраны таким образом, чтобы они редко встречались в VH- и Уь-последовательностях антител человека и мыши, а также чтобы их введение минимально изменяло консервативную аминокислотную последовательность N- и С-концов вариабельных доменов антител. В результате анализа последовательностей вариабельных доменов мышиных и человеческих антител с помощью базы данных Abysis (www.bioinf.org.uk/abysis/) были выбраны сайты эндонуклеаз Xhol и Acc65l (Крп\) для плазмиды рСН1 и сайты эндонуклеаз EeoRV и ШпдШ для плазмиды pCLl/hygro.

Для конструирования кассетного вектора pCL2 на основе плазмиды pCLl/hygro из этой плазмиды предварительно удалили некодирукяций участок полилинкера с 1640 п.н. по 1681 п.н., содержащий сайт HindiII, с образованием промежуточной плазмиды pCLml. Затем удалили участок с 1301 п.н. по 1312 п.н. длиной 12 п.н., кодирующий неестественную для иммуноглобулинов вставку Ala-Leu-Gly-Arg между VL- и Сь-доменами, с образованием ДНК-фрагмента light_delta. Далее методом мегапраймера (Giebel L. В. et al„ 1990; Ке S. Н. et al., 1997) последовательно вводили сайты эндонуклеаз рестрикции £coRV и Я/ndIII, в результате чего получили плазмиду pCLm2, содержащую сайты ЕсоЮ/ и Hindill в положениях 977 п.н. и 1283 п.н. Полученную плазмиду pCLm2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции EcoKV и Я/'ndIII и объединяли в реакции лигирования с двуцепочечным олигонуклеотидным

коннектором, образованном олигонуклеотидами Ьсопп сПг и Ьсопп геу. В результате получили плазмиду рСЬ2 (Рисунок 4), обеспечивающую удобное клонирование генов, кодирующих Уь-домены различных антител.

Для конструирования кассетного вектора рСН2 на основе плазмиды рСН1 из этой плазмиды предварительно удалили некодирующий участок с 2346 п.н. по 2497 п.н., содержащий сайт ХИЛ, с образованием промежуточной плазмиды рСНш1. Затем методом мегапраймера последовательно вводили сайты эндонуклеаз рестрикции ХЪо\ и сс651, в результате чего получили промежуточную плазмиду рСНш2, содержащую сайты ХИо\ и Асс651 в положениях 999 п.н. и 1311 п.н., соответственно. Плазмиду рСНт2 обрабатывали эндонуклеазами рестрикции Хко\ и Лсс65\ и объединяли в реакции лигирования с двуцепочечным олигонуклеотидным коннектором Нсопп, образованном олигонуклеотидами Нсопп сИг и Нсопп геу. В результате получили плазмиду рСН2 (Рисунок 4), обеспечивающую удобное клонирование генов, кодирующих Ун-домены различных антител.

Кассетные векторные плазмиды рСН2 и рСЬ2 удобны для клонирования последовательностей вариабельных доменов с целью получения полноразмерных рекомбинантных антител. Кроме данной работы эти плазмиды также использовали для получения полноразмерных человеческих антител против ортопоксвирусов (Байков И. К. и др., 2013; КЫизеуюЬ У. А. Й а1., 2014), ДНК-гидролизующих полноразмерных антител (Могогоуа V. V. е1 а1., 2013), а также антител против интерлейкина-18.

Рисунок 4. Схема кассетных векторных плазмид рСН2 и рС.Т.2.

5. Конструирование плазмидных ДНК для экспрессии химерных антител на основе МКА 1405

Кассетные векторные плазмиды рСН2 и рСЬ2 были использованы при конструировании плазмид для экспрессии химерных антител против ВКЭ на основе фрагментов ДНК Ун1405, Уь14Э5а и V,, 14Э5Ь.ДНК-фрагмент Ун1405, кодирующий Ун-домен мышиного МКА 1405, был получен в результате ПЦР с плазмиды риС 19-УН-1405 с использованием праймеров УИ сИг ХЬо! и УН_геу_Асс651 и встроен в плазмиду рСН2 по сайтам эндонуклеаз Хко\ и Асс651. ДНК-фрагменты У[. 1405а и УГ1405Ь, кодирующие Уь-домены мышиного МКА 1405, были получены в результате ПЦР с плазмид риС19-УЬ-1405а и рЦС19-УЬ-1405Ь с использованием праймеров УЬсНгЕсоБО/ и УЪгеуНтёШ и встроены в плазмиду рСЬ2 по сайтам эндонуклеаз ЕсоКV и НтйIII. В результате были получены плазмидные ДНК рСН2-1405, рСЬ2- 1405а и рСЬ2-1405Ь (Рисунок 5).

sequence

human lgG1

constant

pCMV

signa sequence

^N^EcoRV

VL14D5a • HindUl

„human kappa constant

HygroB'

Рисунок 5. Схема плазмид pCH2-14D5 и pCL2-14D5a. Схема плазмиды pCL2-14D5b аналогична схеме плазмиды pCL2-14D5a.

6. Наработка и очистка химерных антител chl4D5a и chl4D5b

Антитела chl4D5a и chl4D5b получали в результате транзиентной экспрессии генов лёгкой и тяжёлой цепей антитела в линии эукариотических клеток СНО-К1. Клетки ко-трансфицировапи соответственно плазмидами pCH2-14D5 + pCL2-14D5a, а также pCH2-14D5 + pCL2-14D5b с использованием реагента "Lipofectamine 2000" (Life Technologies) согласно методике, рекомендованной производителем. Культуральную жидкость заменяли каждые сутки свежей средой DMEM F12 advanced (Gibco) с 2% фетальной сывороткой быка с пониженным содержанием иммуноглобулинов (Life technologies) в течение 7 дней. Собранную культуральную жидкость объемом 600 мл осветляли центрифугированием и фильтрацией, после чего выделяли антитело хроматографией на белок А-сефарозе (Рисунок 6).

С S

2,0

1,0

0,0

pH 5,0 pH 3,0 4 4

; Элюция Элюция

; антител быка 1 химерного

; антитела

J V

Рисунок 6.

Очистка антитела

chl4D5a аффинной хроматографией на белок А-сефарозе

10

25

30

35

40

15 20 Время, мин

Поскольку кроме целевого химерного антитела культуральная жидкость также содержала иммуноглобулины из фетальной сыворотки быка, стандартная методика (Antibody purification handbook, 2001) была модифицирована. При отработке методики хроматографического выделения было установлено, что иммуноглобулины быка полностью элюируются 0,1М цитратным буфером с pH 5,0, а целевое антитело смывается аналогичным буфером с pH 3,0. Поэтому к стандартной методике была добавлена стадия элюции иммуноглобулинов быка 0,1М цитратным буфером с pH 5,0. После аффинной хроматографии раствор химерного антитела нейтрализовали и осуществляли дополнительную очистку от клеточных белков и ДНК анионообменной

хроматографией в проточном режиме. Химерное антитело сЫ405Ь было очищено аналогично. Выход обоих антител составил 0,4 - 0,6 мг с литра полученной культуральной жидкости.

Электрофорезом в невосстанавливающих условиях было показано, что исследованные образцы антител сЬ1405а и сИ1405Ь содержат белки с высокой молекулярной массой и не содержат отдельно лёгких или тяжёлых цепей либо их фрагментов (Рисунок 7). В восстанавливающих условиях антитела разделяются на лёгкие и тяжёлые цепи с молекулярной массой 25 кДа и 50 кДа, соответственно (Рисунок 7).

250 кДа-> 150 кДа—*■

50 кДа—►

25 кДа—►

— нативные химерные антитела

— тяжелые цепи антител

4— легкие цепи антител

М 1 2 3 4

Рисунок 7. Электрофореграмма очищенного антитела chl4D5a в 12% ДСН-ПААГ в восстанавливающих (дорожка 1) и невосстанавливающих (дорожка 3) условиях, и очищенного антитела chl4D5b в восстанавливающих (дорожка 2) и невосстанавливающих (дорожка 4) условиях. М - белковый маркер молекулярных масс.

Поскольку моноклональные антитела склонны к агрегации (Яештек Я. Ь. е1 а1., 2006; Беретка О. е1 а!., 2013), высокоэффективной гель-фильтрацией было проверено наличие ди- и олигомеров в образцах антител (Рисунок 8). Было установлено, что время выхода основного пика антител согласно калибровочной хроматограмме соответствует молекулярной массе около 100 кДа и хорошо согласуется с опубликованными хроматографическими профилями препаратов моноклональных антител, содержащих преимущественно мономерную форму (Яетшек II. Ь. е! а1., 2006; Оерегака в. е1 а1., 2013). Примесь димерной и тримерной форм (пики с объёмом элюции Уе = 5,2 и 6,1 мл) составила менее процента.

Для подтверждения того, что полученные химерные антитела содержат константные части иммуноглобулинов человека класса 1§С1, был проведён вестерн-блот анализ образцов антител сЫ405а и сЫ405Ь с использованием моноклонапьного иммуноконъюгата против Бс-фрагмента антител 1£С1 человека и поликлонального иммуноконъюгата против антител человека. В качестве отрицательного контроля использовали мышиное МКА 1405. Анализ подтвердил принадлежность константных участков химерных антител к человеческим иммуноглобулинам (Рисунок 9).

85 75 65 55 45 35 25 15 5 -5

Конапьбумин, 75кДа Альдолаза, 158 кДа ^ Ов^льбумин, 44кДа

Ферритин, 440 кДа Тиреоглобулин, 669 кД;

сЫ405а

6 8 10 12 Объем элюата, мл

Рисунок 8. Хроматографический анализ образца антитела сЬ1405а высокоэффективной гель-фильтрацией. Хроматограмма антитела сЫ405а вместе с хроматограммой калибровочных белков.

тяжелые цепи антител

легкие цепи антител

Рисунок 9. Вестерн-блот анализ антител сЫ405а и сЫ405Ь, разделённых электрофорезом в восстанавливающих условиях. Химерные антитела сИ 1405а (дорожка 1) и сИ1405Ь (дорожка 3), проявленные иммуноконъюгатом моноклонального антитела мыши против Рс-фрагмента антител 1§01 человека; химерные антитела с111405а (дорожка 2) и сЫ405Ь (дорожка 4), проявленные иммуноконъюгатом поликлональных антител козы против антител человека.

7. Масс-спектрометрический анализ химерных антител сЬ 1405а и с!114Г)5Ь. Анализ типа гликозилирования у полученных антител.

Структуру антител сЫ405а и сЫ405Ь дополнительно подтверждали масс-спектрометрическим анализом продуктов гидролиза антител трипсином (Рисунок 10). Спектр лёгкой цепи антитела сЫ405а содержит пик 1028,6, соответствующий пептиду ШУУТБЯ, а спектр лёгкой цепи антитела сЬ1405Ь содержит пик 1085,6, соответствующий пептиду ЬЫУЗАЗУЯ. Покрытие составило около 80% для антитела сЫ405а и около 60% для антитела сЬ1405Ь.

Кроме того было показано, что Ы-концы тяжёлых и легких цепей антител сЫ405а и сЬ1405Ь не содержат лидерных пептидов, что подтверждается наличием в спектрах пиков 1926,05, 1863,91 и 1058,53 (Рисунок 11). Отсутствие лидерных пептидов на 1Ч-концах цепей свидетельствует о правильном процессинге полученных антител.

Рисунок 10. МА1ЛЭ1-ТОР масс-спектр триптических гидролизатов тяжёлой цепи антитела сЫ405а (А) и лёгких цепей антител сЫ405а (Б) и сЫ405Ь (В) в положительном режиме с использованием ЭНВ-матрицы. Пики, отмеченные А, соответствуют вариабельному домену УЫ405а, пики, отмеченные ■, соответствуют вариабельному домену УЫ405Ь. Пики, отмеченные □, соответствуют константному домену легких цепей каппа-типа антител человека. Отмеченные • пики соответствуют вариабельному домену УН 1405, отмеченные О пики соответствуют константному домену антител человека.

А) MAW VWTLLFLMAAAQSAQAEVQLLESGAELAKPGASVK...

|_1926,05_|

_4016,10_|

Б) МК8дГОУ1'У1'ЫЛХУ8САПОВ1УМТд8Р85Ь8А8ЬСБЯ...

|_1863,91_|

_3750.88_I

В) мк8дтдуттлл,су80лн001умтд8нк...

I 1058,53 |

_2945.50_|

Рисунок 11. Пептиды, которые должны образоваться при полном гидролизе трипсином Ы-концевого участка А) тяжёлой цепи антител сИ1405а и сЫ4П5Ь; Б) лёгкой цепи антитела сЬ 1405а; В) лёгкой цепи антитела сЫ405Ь. Серым цветом обозначен соответствующий лидерный пептид. Приведены моноизотопные массы.

Поскольку терапевтические свойства антител существенно зависят от типа и степени гликозилирования (.[ейепв Я. е1: а1., 2009; АЬёв Я. е1: а1., 2010), для антител сЫ405а и сИ 1405Ь был изучен профиль гликозилирования. Для этого антитела дегликозилировали М-гликозидазой Е, после чего электрофоретически разделяли на тяжёлые и легкие цепи (Рисунок 12).

тяжелые цепи антитела ->

К-гликозидаза Р легкие цепи антитела-»-

- 45 кДа -35 кДа

- 25 кДа

-18 кДа -14 кДа

Рисунок 12.

ПбкДа 12% полиакриламидный 66 кДа гель-электрофорез в

восстанавливающих условиях

дегликозилированного антитела сЬ 1405а (дорожка

2), антитела с(11405а, выдержанного в реакционном буфере, но без добавления фермента (дорожка 1) и интактного антитела сЬ 1405а (дорожка

3). М - белковый маркер молекулярных масс.

Увеличение подвижности тяжёлых цепей дегликозилированного антитела по сравнению с контролем свидетельствует о том, что обе тяжёлых цепи антитела 14-гликозилированы.

Легкие и тяжёлые цепи дегликозилированного антитела гидролизовали по-отдельности трипсином с последующим масс-спектрометрическим анализом, полученные спектры сравнили со спектрами лёгкой и тяжёлой цепей интактного антитела сЫ405а (Рисунок 13). В спектрах лёгких цепей не было выявлено существенных отличий, поэтому можно считать, что Ы-гликозилирование лёгких цепей отсутствует, что нормально для подавляющего большинства антител.

В спектрах тяжёлых цепей было обнаружено несколько пиков, для которых отношение массы к заряду m/z изменилось при дегликозилировании (Таблица 1). Значения сдвигов в спектрах составили (2405,93 - 1189,51) = 1216,42; (2634,07 -1189,51) = 1444,56; (2796,15 - 1189,51) = 1606,64 и (2958,23 - 1189,51) = 1768,72. Эти данные не несут полной информации о структуре гликозидных остатков, однако полностью согласуются с установленными ранее значениями для антител, секретируемых клетками СНО (Routier F. H., 1997; van Berkel P. H. et al., 2009), и позволяют предположить, что полученные химерные антитела находятся в гликоформах G0F, GIF, G2F и, возможно, MAN5.

60- ft

-30-60- г 1190.52 Г

1170

1200

1230

1260

1290

m/z

е I

С= 1

- о

- -1 -2 -3

1, 2405.93 L.......... ib.

2340

2370

2400

2430 m/z

- 40

- 20

: 0 -20 -40

, Г07 ,|Ц. ....... 2796.15

2640

2670

2700

2730

2760

2790

2820 m/z

? 2.0 Г 10 f 0.0 -1.0 -2.0

2958.23 . ,

2940 2945

2950

2955

2960 2965 2970 2975 2980

2985

2990 m/z

Рисунок 13. Сравнение масс-спектров триптических фрагментов тяжёлой цепи антитела сЫ405а до и после дегликозилирования. Верхние половины каждого фрагмента содержат спектры, соответствующие интактному антителу (оранжевый) и антителу, инкубированному в буфере без добавления 1Ч-гликозидазы (синий). Нижние половины - дегликозилированному антителу (зелёный). Спектры получены в положительном линейном режиме.

Таблица 1.

Экспериментально установленные значения m/z в спектрах триптических фрагментов тяжёлых цепей, полученных из интактного антитела chl4D5a, а также инкубированных в реакционном буфере с добавлением N-гликозидазы F и без неё.

Пептид

Моноизотопная масса [М+Н]+ (m/z при z=l)

chl4D5a интактный

chl4D5a инкубирован в буфере

chl4D5a обработан N-гликозидазой F

EEQYNSTYR EEQYDSTYR

1189.51

1190.52

EEQYN(G0F)STYR 2634,07 +

EEQYN(G1F)STYR 2796,15 +

EEQYN(G2F)STYR 2958,23 +

EEQYN(MAN5)STYR 2405,93 +

Аппарат N-гликозилирования клеток человека и хомячка содержит некоторые различия, что может вызывать вопросы о применимости антител, полученных в клетках СНО, для лечения людей. Однако различия эти незначительны и в целом профиль гликозилирования антител, полученных в клетках СНО, очень близок профилю гликозилирования человеческих антител (Routier F. H. et al., 1997; Raju T. S., 2003; Jefferis R., 2005), что позволяет их успешно использовать в терапии.

Полученные результаты подтверждают, что антитела chl4D5a и chl4D5b полностью гликозилированы по обеим тяжёлым цепям, при этом гликозилированный аминокислотный остаток расположен в пептиде EEQYNSTYR и с высокой долей вероятности соответствует остатку Asn297, который консервативно гликозилирован в иммуноглобулинах IgGl человека (Raju T. S., 2003; Shade К. С. et al., 2013). Установлено, что образцы антител содержат несколько гликоформ, которые соответствуют гликоформам антител, секретируемых клетками СНО и используемыми в терапии (Routier F. H., 1997; Raju T. S., 2003; Jefferis R., 2009).

8. Определение иммунохимических свойств антител chl4D5a и chl4D5b

Сродство антител chl4D5a и chl4D5b к белку Е ВКЭ оценили методом твёрдофазного ИФА. Комплексы антител с белком Е выявляли иммуноконъюгатом моноклонального антитела мыши против Fc-фрагмента антител IgGl человека (Sigma). Анализ связывания антител chl4D5a и chl4D5b с белком Е ВКЭ показал, что сродство антитела chl4D5a к белку Е ВКЭ (около 10"'° М) значительно выше, чем сродство антитела chl4D5b к этому же белку (около 10"7 М). Кроме того, сродство антитела chl4D5a к белку Е ВКЭ оказалось выше, чем сродство исходного МКА 14D5 (около 10"9М).

Константы аффинности химерных антител chl4D5a и chl4D5b, а также МКА 14D5 по отношению к белку Е ВКЭ были определены на оптическом биосенсоре ProteOn XPR 36 (Bio-Rad) (Рисунок 14). Для химерных антител chl4D5a и chl4D5b значения констант скорости ассоциации и диссоциации, а также равновесной константы аффинности были вычислены с использованием модели односайтового связывания (Таблица 2).

Рисунок 14. Связывание антител chl4D5a (А) и МКА 14D5 (Б) в концентрациях 3,12, 6,25, 12,5, 25 и 50 нМ с рекомбинантным белком Е, иммобилизованным на поверхность чипа GLC (Bio-Rad). Пунктиром показаны результаты общего кинетического анализа данных с использованием модели односайтового связывания (А) и модели односайтового связывания с гетерогенным аналитом (Б).

Интересно отметить, что в случае антител chl4D5a и chl4D5b вклад легкой цепи в их аффинность оказался существенным, поскольку сродство антитела chl4D5a к белку Е ВКЭ (2,6 х 1010 М"') оказалось на три порядка выше по сравнению со сродством антитела chl4D5b к тому же белку (1,0 х 107 М"1).

С помощью простой модели односайтового связывания не удалось аппроксимировать данные связывания МКА 14D5, содержащего различные лёгкие цепи, с белком Е. Однако использование модели гетерогенного аналита позволило определить параметры взаимодействия (Таблица 2). МКА 14D5 показало промежуточную аффинность, что может объясняться присутствием в образце высокосредне- и низкоаффинных молекул антитела, имеющих соответственно две цепи light_14D5a либо по одной цепи light_14D5a и light_14D5b либо две цепи light_14D5b.

Поскольку антитело chl4D5a проявило значительно большее сродство к рекомбинантному белку Е по сравнению с антителом chl4D5b, дальнейшие эксперименты по изучению противовирусных свойств проводили только с антителом chl4D5a.

Таблица 2.

Кинетические параметры и константы аффинности для взаимодействия антител с рекомбинантным белком Е ВКЭ.

Константа скорости Равновесная

Константа скорости , „i _ „ „„

Антитело , , -к ассоциации ka, (М s константа ассоциации

диссоциации kj, (s ) к Кд ^j-k

chl4D5a 4,99±0,55* х КГ6 1,30±0,01 х Ю5 2,6±0,6 х 1010

chl4D5b 2,11 ±0,03 х Ю-3 2,10±0,01 х Ю4 1,0±0,1 х Ю7

МКА 1,24±0,05 х 10^ 1,05±0,01 х 104 8,5±0,1 х Ю7

14D5** 3,21±0,06 х Ю"3 1,57±0,01 х Ю4 4,9±0,1 х Ю6

* Среднее ± стандартная ошибка среднего; ** Представлены данные для высоко- и

низкоаффинных антигенсвязывающих сайтов МКА 1405.

9. Нейтрализация инфекционности ВКЭ антителом chl4D5a и МКА 14D5 in vitro

Вируснейтрализующая активность последовательных разведений антитела chl4D5a и МКА 14D5 по отношению к ВКЭ, штамм 205, была определена в реакции ингибирования фокусообразования на культуре клеток Vero Е6. Оба антитела оказались способны нейтрализовать инфекционность ВКЭ, при этом индекс нейтрализации 1С50 при 50% ингибировании инфекционности вируса для антитела chl4D5a и МКА 14D5 составил 0,043±0,028 мкг/мл и 0,50±0,14 мкг/мл соответственно.

Вероятно, более высокая вируснейтрализующая активность антитела chl4D5a по сравнению с МКА 14D5 объясняется тем, что гибридомная линия клеток 14D5 синтезирует два вида лёгких цепей - light_14D5a и light_14D5b (La и Lb) с приблизительным соотношением 1:3. Предполагая, что характер объединения лёгких цепей с тяжелыми является случайным, можно ожидать наличие иммуноглобулиновых молекул вида LaHHLa (высокоаффинное антитело, содержание около 6%), LaHHLb (промежуточная аффинность, содержание около 38%) и LbHHLb (низкоаффинное антитело, содержание около 56%) в препарате МКА 14D5, в то время как препарат ch 14D5a содержит только высокоаффинное антитело.

10. Протективная активность антитела chl4D5a против ВКЭ in vivo

Для определения протективных свойств химерного антитела chl4D5 были использованы мыши линии BALB/c массой 10 грамм. Животным парентерально вводили 240 ЛД50 вируса клещевого энцефалита штамм «Абсетгаров», а препараты антител вводили внутривенно через 24 ч после заражения. Параллельно с антителом chl4D5a были протестированы МКА 14D5 и иммуноглобулин человека против клещевого энцефалита с титром 1:160 (НПО «Микроген»). Согласно результатам эксперимента (Рисунок 15), химерное антитело chl4D5 продемонстрировало более высокую протективную активность по сравнению с другими препаратами антител. Оно обеспечило 100% уровень протекции в дозировках 80 мкг/мышь и 10 мкг/мышь, в то время как МКА 14D5 обеспечило 70% уровень протекции лишь в дозировке 80 мкг/мышь и не обеспечило защиту мышей будучи использованным в дозировке 10 мкг/мышь. Кроме того, протективная активность антитела chl4D5a оказалась выше по сравнению с активностью иммуноглобулина человека против клещевого энцефалита, который используется для профилактики и лечения ВКЭ.

Существуют опасения, что введение терапевтических антител, обеспечивающее пассивную иммунизацию, способно вызвать антителозависимое усиление инфекции (antibody-dependent enhancement, ADE) (Aebi С. et al., 1994; Kluger G. et al., 1995). Полагают, что ADE связан с суб-нейтрализующей концентрацией протективных либо наличием непротективных антител в препарате (Broker М. et al., 2008; Huisman W. et al., 2009). Чтобы оценить, способно ли антитело chl4D5a вызывать антителозависимое усиление инфекции, была исследована субнейтрализующая дозировка 0,5 мкг/мышь. Введение мышам антитела chl4D5a в этой дозировке не защищало животных от летальных доз ВКЭ, но и не уменьшало среднюю продолжительность жизни мышей, которая составила 8,3±1,0 дней по сравнению с 7,7±0,7 дней для нелеченых животных. Согласно логранговому критерию, достоверного различия не обнаружено (р = 0,095) (Рисунок 15). Поэтому в данном случае антителозависимое усиление инфекции при введении субнейтрализующей дозы антитела chl4D5a отсутствовало.

Рисунок 15. Протективная активность антитела chl4D5a и МКА 14D5, а также сывороточного иммуноглобулина человека против ВКЭ in vivo. Мышам вводили указанные количества антител внутривенно через 24 ч после инфицирования 240 ДД50 ВКЭ. * /»=0,067 (логранговый критерий).

11. Оценка степени гуманизации химерного антитела chl4D5a

При разработке рекомбинантных терапевтических средств важна степень гуманизации белковых молекул. Для антитела chl4D5a степень гуманизации оценивали по частоте встречаемости данного а.к.о. в данной позиции с помощью базы данных Abysis (http://www.bioinf.org.uk/abysis/). Антитело chl4D5a состоит из 1320 а. к. о., из них 24 нехарактерны для позиций, в которых они находятся. Оцененная таким образом степень гуманизации антитела составляет (1320 - 24) / 1320 = 0,982 или 98,2 %.

Таким образом, созданное и исследованное в данной работе антитело chl4D5a является перспективным кандидатом для создания профилактических и терапевтических препаратов против ВКЭ: оно обладает высоким сродством к антигену, а также высокой противовирусной активностью в экспериментах in vitro и in vivo. В настоящее время идут доклинические испытания антитела chl4D5a, в ходе которых предполагается выяснить эффективность антитела при профилактической и терапевтической схемах введения, фармакокинетические и фармакодинамические параметры, а также выявить наличие либо отсутствие острой и хронической токсичности. Если эти характеристики будут соответствовать требованиям для лекарственных средств, то можно ожидать появления новых препаратов против ВКЭ на основе антитела chl4D5a и его производных.

выводы

1. Установлено, что гибридома 14D5 продуцирует антитела против ВКЭ с VH-доменами, принадлежащими к семейству ЮНУ1 антител мыши, и с двумя типами VL-доменов, принадлежащих к семействам IGKV10 и IGKV6.

2. Сконструированы кассетные векторные плазмиды рСН2 и pCL2, позволяющие осуществлять экспрессию генов полноразмерных антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в эукариотических клетках; на основе этих плазмид сконструированы плазмиды pCH2-14D5, pCL2-14D5a и pCL2-14D5b, которые несут гены, кодирующие тяжёлую и лёгкую цепи химерных антител chl4D5a и chl4D5b.

3. Получены образцы очищенных химерных антител chl4D5a и chl4D5b, и показано, что их молекулярная масса, число лёгких и тяжёлых цепей, а также степень и тип гликозилирования соответствуют характеристикам рекомбинантных антител, получаемых в клетках СНО.

4. Определены значения констант аффинности химерных антител chl4D5a и chl4D5b к белку Е ВКЭ, которые составили 2,6-Ю10 М~' и 1,0*107 М"1, соответственно, и показано, что химерное антитело chl4D5a в дозировке 1 мг/кг веса мыши обеспечило 100% защиту мышей, предварительно инфицированных 240 ЛД50 ВКЭ.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

1. Baykov I. К., Matveev A. L., Stronin О. V., Ryzhikov А. В., Matveev L. Е., Kasakin М. F., Richter V. A., Tikunova N. V. A protective chimeric antibody to tick-bome encephalitis virus // Vaccine. - 2014. - V. 32. - Issue 29. - P. 3589-3594. doi: 10.1016/j.vaccine.2014.05.0I2.

2. Байков И. К., Хлусевич Я. А., Матвеев А. Д., Бабкина И. Н., Тикунова Н. В. Конструирование кассетных векторных плазмид для получения полноразмерных рекомбинантных антител // Вестник НГУ. Серия: Биология, клиническая медицина. -2013. - Т. 11. -№ 3. - С. 56-64.

3. Байков И. К., Матвеев JI. Э., Матвеев А. Л., Тикунова Н. В. Сравнительный анализ вариабельных доменов моноклональных антител против вируса клещевого энцефалита // Сибирский медицинский журнал. - 2012. - Т. 111.-№4.-С. 30-33.

4. Levanov L. N., Matveev L. Е., Goncharova Е. P., Lebedev L. R., Ryzhikov А. В., Yun Т. E., Batanova T. A., Shvalov A. N., Baykov I. K., Shingarova L. N., Kirpichnikov M. P., Tikunova N. V. Chimeric antibodies against tick-borne encephalitis virus // Vaccine. - 2010. - V. 28. - Issue 32. - P. 5265-5271.

5. Патент РФ № 2550252 CI от 15.11.2013. Рекомбинантная плазмидная ДНК pCLm4/hygro-14D5, кодирующая полипептид со свойствами легкой цепи химерного антитела против вируса клещевого энцефалита, и рекомбинантная плазмидная ДНК pCHm2-14D5, кодирующая полипептид со свойствами тяжелой цепи химерного антитела против вируса клещевого энцефалита, химерное антитело, обеспечивающее экстренную профилактику клещевого энцефалита у мышей. Тикунова Н. В., Байков И. К., Матвеев Л. Э., Бабкина И. Н., Матвеев Л. Э., Рихтер В. А.

Подписано в печать 18.08.2015 г. Формат 60x84/16 Усл. п. л. 1,16 Тираж 100 экз. Заказ № 0818

Отпечатано в типографии ООО «Параллель» 630090, г. Новосибирск, ул. Институтская, 4/1 Тел. 8 (383) 330-26-98

15-1 О 5 6 Т

2015672888

2015672888