Ультраструктурно-функциональный анализ патогенных буркхольдерий и особенности их взаимодействия с макроорганизмом при развитии инфекционного процесса

Попов, Сергей Федорович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Ультраструктурно-функциональный анализ патогенных буркхольдерий и особенности их взаимодействия с макроорганизмом при развитии инфекционного процесса
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Ультраструктурно-функциональный анализ патогенных буркхольдерий и особенности их взаимодействия с макроорганизмом при развитии инфекционного процесса"

На правах рукописи

ПОПОВ Сергей Фёдорович

УЛЬТРАСТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ И ОСОБЕННОСТИ ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С МАКРООРГАНИЗМОМ ПРИ РАЗВИТИИ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА

03.00.07 - микробиология

автореферат

диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Волгоград- 2004

Работа выполнена в Волгоградском научно - исследовательском противочумном институте Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный консультант:

доктор медицинских наук, старший научный сотрудник Алексеев Владимир Валерьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Девдариани Зураб Леванович доктор медицинских наук, профессор Зыкин Леонид Фёдорович доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

Ведущая организация:

Ростовский - на - Дону научно - исследовательский противочумный институт

Защита состоится «6» октября 2004 г. в 1300 часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по присуждению учёной степени доктора (кандидата) наук при Российском научно - исследовательском противочумном институте «Микроб» (410005 г. Саратов, Университетская,46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке РосНИПЧИ «Микроб»

Автореферат разослан «31» августа 2004 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Слудский А А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Из известных в настоящее время представителей рода Burkholderia возбудители мелиоидоза - Burkholderia pseudomallei и сапа -Burkholderia mallei занимают особое место в клинической микробиологии. Это связано с их высокой патогенностью для человека и животных (; Илюхин, 1985; Калина, 1985; Беляков с соавт., 1990Bergan, 1981; Brett and Woods, 2000).

Способность вызывать у людей и животных тяжёлые заболевания, характеризующиеся септицемией с множественными некротическими поражениями внутренних органов, трудно поддающиеся антибактериальной терапии (Руднев, 1967; Ширяева, 1976; Беляков с соавт., 1990; Тихонов с савт., 1995; Chaowagul et all., Kanai, 1994), предопределили, " в соответствии с санитарно-эпидемиологическими критериями, принятыми в России, включение В. pseudomallei и В. mallei во вторую группу патогенных для человека микроорганизмов.

Эндемичный район для мелиоидоза находится между 20° с. ш. и 20° ю. ш. Заболевание встречается в тропических и субтропических зонах Юго-Восточной Азии, Западной и Центральной Африки, а также в Северо-Восточной Австралии. В других частях света мелиоидоз менее известен медицинским работникам, что, с одной стороны, объясняется относительно малым количеством публикуемой литературы по этому вопросу, а с другой - неоправданной недооценкой значимости данной инфекции.

В последние годы интерес к мелиоидозу возрос вследствие увеличения заболеваемости во многих государствах, расположенных вне «классических» эндемичных Канада,

Франция, Япония, Китай; Турция, куда инфекция была завезена больными людьми или инфицированными животными (Ларионов, 1995; Brett and Woods, 2000).

Сап раньше был широко распространён на земном шаре и приносил большие экономические потери. В России в 1906 -1910 годах ежегодно погибали от него около 17500 лошадей, а заболеваемость людей составляла 150-200 случаев в год. В последующем, в результате комплексных противоэпизоотических мероприятий, сап на территории бывшего Советского Союза был полностью ликвидирован (Беляков с соавт., 1990). Вместе с тем данная болезнь среди животных регистрируется в Турции, Иране, Афганистане, Китае, Монголии (Ларионов, 1995). Опасность заноса сапа из-за рубежа, особенно из стран, непосредственно граничащих с Россией, сохраняется, об этом свидетельствуют исследования, проведённые специалистами Волгоградского НИПЧИ на Улан - Удэнском мясокомбинате в 1984-1985 годах. При анализе материала от двухсот лошадей, импортированных из Монголии, в трёх случаях удалось обнаружить специфические сапные антигены и антитела, а в одном случае выделить типичный вирулентный штамм B.mallei (Мельников, 1987). Всё это определяет необходимость постоянного внимания к этой инфекции.

Отдельно следует отметить, что В. pseudomallei и В. mallei рассматриваются как потенциальные агенты при проведении биотеррористических актов (Воробьёв, 2001; Rotz et all., 2002).

Интерес для клинической микробиологии имеет так же В. cepacia, впервые выделенная и охарактеризованная в 1949 г. немецким бактериологом W. Burkholder, как фитопатогенный микроорганизм. В госпитальных условиях В. cepacia вызывает ряд патологий, среди которых особенно часто встречаются инфекции мочевого тракта (Калина, 1985). 'Отмечено, что этот микроорганизм обусловливает

развитие некротизирующих пневмоний, абсцессов легких, послеоперационных раневых инфекций и септицемии (Von Graevenitz, 1985; Gregory and. Me Nabb, 1986; Chelich, 1989). Наблюдается увеличение частоты выделения B. cepacia от больных кистозным фиброзом (Bernhardt et al.,2003). Это дало основание отнести данный микроб к группе «оппортунистических» микроорганизмов (Смирнов и Киприянова, 1990):

Несмотря на некоторые успехи в изучении биологии возбудителей мелиоидоза и сапа, а так же В. cepacia, многие стороны патогенеза заболеваний, вызванных этими бактериями, остаются раскрытыми поверхностно (Беляков с соавт., 1990; Тихонов с савт., 1995). Последнее, очевидно, связано с отдельными недостатками в исследовании факторов патогенности у буркхольдерий, которые определены довольно схематично (Денисов, 1985; Плеханова, 1995; Пивень с соавт., 1999; Sexton et al., 2000; Atcins et al., 2002).

Следует отметить, что в освещении патогенеза заболеваний важное место занимают знания об особенностях строения возбудителя и механизмах его взаимодействия с макроорганизмом (Ариэль, 1981; Прозоровский с соавт., 1991). Вместе с тем, количество публикаций, посвященных ультраструктурной организации возбудителей мелиоидоза, сапа и В. cepacia и возможной связи выявленных у них структур с патогенностью, весьма ограничено, а изложенные в них данные носят отрывочный характер и касаются, в основном, описания патогенов вне связи с организмом-хозяина (Велянов, 1982; Ряпис с соавт., 1986; Замараев с соавт., 1987; Каплиев с соавт., 1990; Puthucheary at al., 1996; Reckseidler et al., 2001).

Приведённые выше факты требуют глубокого изучения биологии патогенных буркхольдерий и, в частности, вопросов, связанных с

адаптационными механизмами этих микробов в процессе их взаимодействия с макроорганизмом при развитии инфекции.

Для понимания этих процессов целесообразно привлечение новых методических подходов. Перспективным здесь являются морфофизиологические исследования с применением ряда электронно-микроскопических методик, которые позволяют получить новые данные о субклеточном строении как возбудителя, так и клеток макроорганизма, а также изучить их состояние в процессе становления и развития системы «паразит - хозяин».

Цель работы: изучить особенности ультраструктуры патогенных буркхольдерий при взаимодействии с макроорганизмом и выявить функциональную направленность структурных образований! у этих микроорганизмов, определяющих развитие инфекционного процесса.

Задачи исследования:

1. Исследовать в сравнительном аспекте ультраструктурно

' функциональную организацию В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia. Определить функциональную значимость поверхностных образований у этих возбудителей, в частности, структур, связанных с адгезивными и антифагоцитарными свойствами.

2. Разработать технологию получения, и выделения комплексов биополимеров капсульного вещества возбудителей мелиоидоза и сапа.

3. Изучить физико-химические, иммунохимические, иммунотропные и иммуногенные свойства полученных биополимеров капсульной субстанции В. pseudomallei и В: mallei.

4. Исследовать особенности воздействия В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia на кислородзависимую и кислороднезависимую биоцидные системы фагоцитов, а также изучить динамику изменений биохимической активности некоторых ферментов макрофагов (5-нуклеотидаза, лизосомальные ферменты) при инфекциях, вызываемых возбудителями мелиоидоза, сапа и В. cepacia.

5. Изучить на субмикроскопическом уровне особенности взаимодействия возбудителей мелиоидоза и сапа с гуморальными и клеточными факторами иммунитета макроорганизма и определить механизмы преодоления иммунобиологических барьеров организма в ходе развития инфекционного процесса.

Научная новизна и теоретическая значимость

Впервые в рамках одной работы представлены результаты комплексного сравнительного исследования по ультраструктурному анализу патогенных буркхольдерий (В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia) при росте на питательных средах и в процессе их взаимодействия с макроорганизмом, с выявлением структурных образований, определяющих патогенность у данных микроорганизмов.

капсульных фракций: СК-1, СК-2 возбудителя сапа, а также способ получения белка наружной мембраны В. pseudomallei, подтверждённый патентом на изобретение № 2208445 «Способ выделения белка 39 кДа наружной мембраны возбудителя мелиоидоза» от 20 июля 2003 г. Определены физикохимические параметры выделенных фракций капсульного вещества В. pseudomallei и В. mallei.

Впервые изучены иммунотропные и иммуногенные свойства полученных фракций капсульной субстанции возбудителей мелиоидоза и сапа. Установлено, что фракции МК-4 и СК-1 капсульного вещества В. pseudomallei и В. mallei обладают иммунодепрессирующими свойствами, которые способствуют персистенции данных бактерий в организме хозяина, тогда как фракции МК-1, МК-2, МК-3 и СК-2 обладают иммуномодулирующим действием.

На субмикроскопическом уровне с использованием моноклональных антител показано, что оболочечный гликопротеин м.м. 200 kD является антигеном, составляющим основу капсульной субстанции В. pseudomallei, В. mallei, и относится к факторам патогенности этих микроорганизмов.

На ультраструктурном уровне изучен механизм инвазии возбудителей мелиоидоза и сапа в клетки макроорганизма. Выявлено участие пилей В. pseudomallei в проявлении адгезивных свойств по отношению к клеткам организма хозяина.

Показана антифагоцитарная функция капсул у возбудителей мелиоидоза и сапа в условиях макроорганизма, что позволяет говорить о феномене капсулообразования у данных бактерий как о факторе патогенности.

Впервые, в сравнительном аспекте, исследована функциональная активность фагоцитов при инфекциях, вызванных В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia. Показано, что при остром экспериментальном

мелиоидозе и сапе кислородзависимая цитоцидная активность фагоцитирующих клеток имеет фазный характер изменений с максимальным увеличением к 6 часам. Одновременное снижение показателей антимикробного потенциала фагоцитов (тест восстановления НСТ, содержание БКБ, активность кислой фосфатазы и катепсина Д) является прогностически неблагоприятным признаком течения инфекции.

Впервые на ультраструктурном уровне, при моделировании лёгочного мелиоидоза (новизна этих исследований подтверждена патентом на изобретение № 2157538 от 10 октября 2000г. «Способ моделирования лёгочного-мелиоидоза»), проведён анализ механизмов, направленных на выживание В. pseudomallei внутри клеток макроорганизма. Выявлено защитное свойство капсулы у данного возбудителя от деструктивных факторов клеток организма.

Установлено, что возбудители мелиоидоза и сапа способны паразитировать внутри соматических клеток, проявляя тропность к клеткам системы мононуклеарных фагоцитов, а также к ряду клеток, относящихся к «непрофессиональным» фагоцитам: эндотелиальные клетки капилляров, альвеолярные клетки, ретикулярные клетки селезёнки и лимфатических узлов.

Практическая ценность

Полученные при выполнении работы данные вошли в состав двух коллективных монографий, представленных в рубрике «Публикации», а также были использованы при написании инструктивно-методических документов:

1. «Методические рекомендации по стерилизующему режиму фиксации клеток макроорганизма, зараженных возбудителями мелиоидоза и

сапа, для электронной цитохимии и иммуноцитохимии», утверждены директором ВолгНИПЧИ 09.07.90 г.

2. «Методические рекомендации по экспериментальному моделированию легочных форм сапа и мелиоидоза», утверждены директором ВолгНИПЧИ 10.02.93 г.

3. Методические рекомендации «Оценка антимикробного потенциала фагоцитов при экспериментальном мелиоидозе и сапе», утверждены директором ВолгНИПЧИ 23.03.94 г.

4. «Методические рекомендации по выявлению и изучению экзоцеллюлярных комплексов патогенных псевдомонад», утверждены директором ВолгНИПЧИ 07.04.97 г.

5. «Методические рекомендации по экспериментальному моделированию легочного мелиоидоза, вызванного атипичным штаммом Pseudomonas pseudomallei», утверждены директором ВолгНИПЧИ 06.04.99 г.

6. «Методические рекомендации по выделению функционально значимых компонентов капсульного вещества возбудителей сапа и мелиоидоза», утверждены директором ВолгНИПЧИ 14.03.01 г.

7. «Программа курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму», утверждена первым заместителем Министра здравоохранения РФ Г. Г. Онищенко 01.02.01г.

8. «Методические рекомендации по моделированию на морских свинках легочного мелиоидоза, вызванного штаммом Burkholderia pseudomallei 100-16-1 (Аг8-)», утверждены директором ВолгНИПЧИ 28.06.02 г.

9. «Практическое пособие для подготовки врачей, бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму», утверждено Руководителем Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России С.И. Ивановым 6.11.03г.

Материалы диссертационной работы используются при проведении занятий в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте на курсах первичной специализации врачей, биологов по диагностики особо опасных инфекций, специфической индикации возбудителей. ООИ, санитарной. охране территории* и противоэпидемической защите населения.

Положения выносимые на защиту

1. В.'pseudomallei, В. mallei и В. cepacia имеют структурированную капсулу, которая является фактором патогенности данных микроорганизмов. Возбудитель мелиоидоза, в отличие от возбудителя сапа, формирует фимбриальные образования, которые обусловливают у В. pseudomallei гидрофобные и адгезивные свойства.

2. Биополимерные комплексы фракций МК-4 и СК-1 капсульного вещества возбудителей мелиоидоза и сапа индуцируют в макроорганизме иммуносупрессию, а биополимеры капсульных фракций МК-1, МК-2, МК-3 и СК-2 - иммуномодуляцию.

3. Поверхностный гликопротеин м.м. 200 Ш является одним из основных структурных компонентов капсульной субстанции. В. pseudomallei, В. mallei и обладает антигенными и антифагоцитарными -свойствами.

4. Вирулентность инкапсулированных форм В. pseudomallei и В. mallei обеспечивается устойчивостью к фагоцитозу и паразитированием.

как в фаголизосомах, так и свободно в цитоплазме клеток макроорганизма.

5. Одновременное снижение показателей антимикробного потенциала фагоцитов (тест восстановления НСТ, содержание бактерицидных катионных белков, активность кислой фосфатазы и катепсина Д) является прогностически неблагоприятным признаком течения острой мелиоидозной и сапной инфекции.

6. Особенности патогенеза мелиоидоза и сапа обусловлены тропизмом В. pseudomallei и В. mallei к клеткам мононуклеарных фагоцитов, эндотелиальным клеткам капилляров, альвеолоцитам; ретикулярным клеткам селезёнки и лимфатических узлов.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на научных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в 1992-2000 гг.; Российской научной конференции «Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций» (Волгоград, 1992); Российской научной конференции «Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций» (Саратов, 1992); юбилейной конференции, посвященной 25-летию Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (Волгоград, 1995); Международной научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова «Идей И.И.Мечникова и развитие современного естествознания» (Харьков, 1995); VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации аллергологов и клинических иммунологов: «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммуноморфологии» (Москва, 1997); юбилейной научной конференции,

посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Киров, 1998); юбилейной конференции, посвященной 30-летию Волгоградского: научно-исследовательского противочумного института (Волгоград, 2000); юбилейной конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции: «Природно-очаговые особо опасные инфекции на юге. России, их профилактика и лабораторная диагностика (Астрахань, 2001)..

Публикации. По теме диссертации опубликовано 56 работ, получено два патента на изобретения и одно положительное решение о выдаче патента на изобретение. Материалы диссертации вошли в две коллективные монографии: «Сап» (1995) и «Мелиоидоз» (1995) под редакцией Заслуженного деятеля науки РФ, д.м.н., профессора Н.Г. Тихонова.

Объём и структура работы

Работа изложена на 229 страницах машинописи, иллюстрирована 88 рисунками, 12 таблицами. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов. Список используемой литературы включает 124 работы отечественных и 280 работ иностранных авторов.

Собственные исследования Материалы и методы исследования

В работе использовали. 13 штаммов В. pseudomallei, 12 штаммов B.mallei, 5 штаммов В. cepacia из коллекционного центра Волгоградского научно - исследовательского противочумного института, а так же штамм

В. pseiidomallei 100-16-1, дефектный по Аг8, селекционированный в Волгоградском НИПЧИ Пивнем Н.Н., 1997.

В качестве питательных сред применяли мясопептонный агар и бульон рН 6,8, в которые для стимулирования капсулообразования добавляли 4% глицерина и 1,5% нормальной сыворотки морской свинки и белой крысы.

В работе были использованы мыши линии BALB/c, золотистые хомячки, морские свинки, белые беспородные мыши и крысы.

Капсулу у патогенных буркхольдерий при световой микроскопии выявляли методом негативного окрашивания мазков по Бурри. Исследования целых бактериальных клеток в электронном микроскопе проводили с помощью негативного контрастирования растворами солей урана, молибдена, фосфорновольфрамовой кислоты (ФВК) или напыления платины.

При подготовке материала к изучению в ультратонких срезах применялись общепринятые методики фиксации, обезвоживания, заключения в эпоксидные смолы и контрастирования (Venable Y.H., Coggeschall R., Л 965). Препараты просматривали и фотографировали с помощью электронного микроскопа JEM - 100SX (JEOL, Япония).

Электронно-цитохимическое исследование экстрацеллюлярных кислых полисахаридов у мелиоидозных микробов проводили после обработки препаратов рутениевым красным по методу Cagle,1972.

Локализацию поверхностных антигенов возбудителей мелиоидоза и сапа определяли с помощью электронно- иммуноцитохимического метода (Полак и Ван Норден, 1987).

Для выявления, на субмикроскопическом, уровне в структуре капсулы у возбудителей мелиоидоза и сапа гликопротеина м.м.. 200 kD,

использовался непрямой иммунопероксидазный метод с моноклональными антителами: Gil (IgM) и 1G2 (IgG), полученными сотрудниками Волгоградского НИПЧИ и Центрального НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова (Свиридов и др., 1987).

С целью выяснения способности у возбудителей мелиоидоза и сапа к опсонизации in vivo, бактериальные клетки, полученные из перитонеального экссудата от зараженных внутрибрюшинно морских свинок, обрабатывали, конъюгированными с ферритином антивидовыми иммуноглобулинами класса G в разведении 1:20 (производство НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи).

Гемагглютинирующую активность мелиоидозных бактерий определяли в тесте агглютинации- с формалинизированными эритроцитами белых беспородных крыс в пластиковых титровальных планшетах.

Гидрофобные свойства возбудителя мелиоидоза, исследовали в тесте агглютинации латекса на стекле по методике Lachica et al. (1984) и в тесте адгезии к гексадекану по методу Rosenberg (1984).

Исследование начальных этапов взаимодействия, В. pseudomallei, В. mallei, и В. cepacia с клетками макроорганизма in vivo проводили на модели внутрибрюшинного и интраназального заражения белых крыс, морских свинок, золотистых хомячков.

Для идентификации слияния лизосом с фагосомами, содержащими бактерии, применялось маркирование лизосом ферритином (Silva et al, 1987), а также электронно - цитохимическая реакция на кислую фосфатазу (Гомори, 1956).

При изучении взаимодействия В. pseudomallei, В. mallei с тканями и клеточными элементами в инфицированных органах, у экспериментальных животных (морские свинки, белые крысы, золотистые хомячки) воспроизводились острая и подострая формы

болезни. Препараты лёгких, печени селезёнки и лимфатических узлов исследовали как в электронном, так и в световом микроскопах на 3,7,20, 28 и 35 день болезни;

Для уточнения" роли в патогенезе мелиоидоза капсульного гликопротеина м.м.. 200 kD (фрагмент антигена 8) в экспериментах при аэрогенном заражении белых мышей использовался типичный вирулентный штамм В. pseudomallei 100 и селекционированный из него авирулентный штамм В. pseudomallei 100-16-1, не синтезирующий этот антиген, а так же препарат антигена 8.

Капсульное вещество В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia выделяли при помощи центрифугирования нативных бактериальных клеток в буферной системе, состоящей из 0,75М сахарозы; 0,05М Трис-НС1 рН 8.0; 0,0015М этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и 0,01% Тритон Х-100.

Определение молекулярных масс (м.м.) и фракционирование общего капсульного вещества возбудителей мелиоидоза и сапа осуществляли с помощью гель - хроматографии (ГХ) на поливиниловой матрице TSK HW 60F («Toyopearl», Япония). Исследования проводили по методикам Детермана (1970).

Препараты капсульного вещества В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia анализировали в системе вертикального электрофореза по Laemmli (1970). Окраску проводили кумасси G - 250; «Stain all» («Serva», Германия) (Остерман, 1981), а также щелочным - раствором нитрата серебра (Sammons, 1981).

Для исследования иммунобиологических свойств капсульного вещества в работе использовали капсульные фракции (антигены) возбудителя мелиоидоза (МК— 1, МК - 2, МК - 3, МК - 4) и сапа (СК - 1 и СК - 2). Антигены вводили белым мышам в дозе 20 мкг. Гуморальный иммунитет оценивали по числу антителообразующих клеток (АОК) к

эритроцитам барана (ЭБ) методом локального гемолиза (Yerne; Nordin, 1963). Воздействие препаратов на клеточное звено иммунного ответа изучали по уровню гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в тесте отёка лапок, (Попова, 1980). Фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов определяли хемилюминесцентным методом (Любимов с соавт., 1992). Протективные свойства капсульного вещества возбудителя мелиоидоза исследовали в тесте активной защиты на беспородных белых мышах по показателям летальности: вычисляли процент погибших животных и среднюю продолжительность жизни.

Функциональное состояние макрофагов оценивали по активности одного из ферментов цитоплазматичсской мембраны клеток - 5' -нуклеотидазы (Туманян и др., 1984), а также лизосомальных ферментов - кислой фосфатазы и катепсина Д (Учитель с соавт., 1978). Атимикробный потенциал фагоцитирующих клеток изучали в реакции восстановления нитросинего тетразолия (НСТ - тест) (Park et al., 1968); по активности миелопероксидазы (Шафран с соавт., 1979); содержанию бактерицидных катионных белков (БКБ) в полиморфноядерных лейкоцитах (ПМЯЛ) (Цигаревский, Мазинг, 1981).

С целью выяснения влияния плазмид у возбудителя мелиоидоза на процесс капсулообразования, исследуемые штаммы В. pseudomallei, были подвергнуты скринингу и препаративному выделению плазмидной ДНК методом щелочной экстракции (Casse et al., 1979).

Полученные экспериментальные данные обрабатывали статистически: LD50 вычисляли по методу Кербера, результаты по фагоцитарной активности, количеству антителообразующих клеток и летальности-животных оценивали по критерию Стьюдента (Ашмарин, Воробьёв, 1962). Статистическую обработку данных реакции ГЗТ, а также показателей функционального состояния фагоцитов осуществляли с помощью непараметрического метода Вилкоксона - Манна - Уитни

(Гублер, Генкин, 1973). Результаты считали достоверными, если вероятность ошибки не превышала 0,05 (Р<0,05).

Ультраструктурно - функциональная организация возбудителей мелиоидоза, сапа и В. cepacia

На ультратонких срезах неповрежденные мелиоидозные бактерии как высоковирулентных, так и низковирулентных штаммов, имели ультраструктуру, в целом типичную для грамотрицательных микроорганизмов.

К поверхностным структурам у возбудителя мелиоидоза относятся фимбрии. Данные образования представляли собой перитрихиально расположенные нити, которые по морфологии и локализации соответствуют фимбриям I типа по классификации Brinton (1965). Толщина фимбрий составляла 7 нм, длина - до 2 мкм. Количество их было 100 и более на клетку. Число особей, обладающих способностью к преобразованию, у разных штаммов не превышало 2-3%.

Из локомоторных образований у В. pseudomallei следует отметить жгутики, которые выявляются на одном из полюсов в количестве от 1 до 6 на клетку.

При окраске мазков культур В, pseudomallei по методу Бурри удалось выявить капсулу толщиной до 0,5 мкм с четкой наружной границей. Электронно-микроскопическое исследование- целых клеток мелиоидоза методом негативного контрастирования показало наличие у части особей на поверхности клеточной стенки капсулы толщиной до 0,5 мкм, представленной зернистым материалом.

При постановке электронно-цитохимической реакции со специфическим маркером кислых полисахаридов рутениевым красным; удалось стабилизировать морфологическую структуру капсулы у возбудителя мелиоидоза.

Для доказательства бактериальной природы капсулы у В. pseudomallei проводили обработку инкапсулированных бактерий мелиоидоза меченными пероксидазой иммуноглобулинами кролика, полученными против целых клеток В. pseudomallei и В. mallei. Было установлено, что в обоих случаях метка рыхло откладывалась на поверхности возбудителя мелиоидоза, усиливая контрастность его капсулы. Эти данные свидетельствуют о том, что общие поверхностные антигены у мелиоидозных и сапных микробов входят в состав капсулы В. pseudomallei.

Изучение культур В. cepacia в ультратонких срезах показало, что данные бактерии имеют субмикроскопическое строение, подобное возбудителю мелиоидоза. Применение электронно-цитохимической реакции с рутениевым красным позволило нам обнаружить на поверхности наружной мембраны клеточной стенки отложение рутений -позитивного материала в виде капсулы толщиной до 200 нм.

Наряду с капсулой у В. cepacia, нами обнаружен локомоторный аппарат, представленный полярно расположенными жгутиками, а также перитрихиально расположенные фимбрии толщиной 7 нм и длинной до 3 мкм в количестве около ста на одну особь, которые по морфологии и локализации соответствуют фимбриям I типа по классификации Brinton (1965).

Поскольку адгезивные свойства микроорганизмов во многом определяют начальные этапы взаимодействия с клетками макроорганизма, была сделана попытка установить зависимость между способностью В. pseudomallei адгезироваться к некоторым органическим субстратам и наличием у бактерий определенных поверхностных образований.

Показано, что возбудитель мелиоидоза обладает низкими гидрофобными свойствами, что обусловило слабую адгезию его по

отношению к гексадекану и в тесте латекс - агглютинации. Так как гидрофобные свойства бактериальных клеток, по данным ряда авторов (Duguid et al., Pearce, Buchanan, 1980; Rosenberg et al., 1982), обусловлены фимбриями, мы попытались обогатить; популяцию мелиоидозных бактерий особями с повышенной гидрофобностью путем адгезии на гексадекане с последующим подращиванием адсорбированных клеток. Электронно-микроскопическое исследование полученной субкультуры выявило повышение числа клеток, обладающих фимбриями, до 10%. Одновременно происходило и увеличение числа клеток, имеющих жгутики, поэтому дифференцировка свойстВ. обусловленных каждой из этих структур, была затруднена. Вместе с тем было установлено, что в образцах с отрицательной реакцией агглютинации латекса фимбрии у В. psendomallei встречались лишь эпизодически, тогда как капсула более часто.

Гемагглютинирующую активность- с эритроцитами морских свинок и белых крыс в незначительной степени и непостоянно проявляли только некоторые штаммы В. pseudomallei 111 и. 114.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о слабой гидрофобности поверхности В. pseudomallei, которая обусловлена фимбриями и жгутиками. А фактором, определяющим гидрофильные свойства возбудителя мелиоидоза, является капсула.

Касаясь современных представлений о морфологии возбудителя сапа, следует отметить, что этот облигатный паразит из рода Burkholderia, в целом, имеет ультраструктурную организацию, аналогичную В. pseudomallei и В. cepacia.

Однако, в отличие от В. pseudomallei и В. cepacia, у возбудителя сапа не удалось обнаружить фимбрий, а также жгутикового аппарата.

При изучении в электронном микроскопе методом негативного контрастирования целых клеток В. mallei у 5-10% особей на поверхности

клеточной стенки была обнаружена капсула толщиной до 300 нм. Использование рутениевого красного позволило выявить усиление контрастности капсулы у возбудителя сапа.

В подтверждение бактериального происхождения капсульного вещества инкапсулированные бактерии сапа обрабатывали меченными пероксидазой иммуноглобулинами кролика, полученными против целых клеток В. mallei. В результате иммуноцитохимической реакции наблюдалось резкое повышение контрастности капсулы.

Описанные особенности ультраструктурной организации возбудителей мелиоидоза, сапа и В. cepacia очевидно связаны с адаптацией к среде обитания этих микроорганизмов. Так, отсутствие аппарата подвижности и неспособность к пилеобразованию у В. mallei обусловлено- его облигатным. паразитизмом. Единственным поверхностным образованием, позволяющим возбудителю сапа успешно переживать в организме хозяина, является капсула. В отличие от В. mallei возбудитель мелиоидоза и В. cepacia обитают преимущественно во «внешней» среде, где наличие жгутикового аппарата и фимбрий обеспечивает данным микроорганизмам способность лучше приспосабливаться к таким условиям существования. Наряду с этим В. psendomallei является факультативным паразитом, способным вызывать тяжелые заболевания у человека и животных. При этом образуемая у него капсула, наряду с другими- факторами, позволяет, в случае попадания бактерий в макроорганизм, противостоять факторам защиты хозяина.

Структурно - функциональная характеристика капсульного вещества возбудителей мелиоидоза и сапа

Использование непрямого иммунопероксидазного метода для электронной иммуноцитохимии с моноклональными антителами G11 и

1G2, направленными против эпитопов гликопротеина м.м. 200 kD, возбудителей мелиоидоза и сапа, показало, что пероксидазная метка обильно фиксировалась на поверхности клеточной стенки В. pseudomallei и A. mallei, образуя выраженный капсульный покров.

Следовательно, гликопротеин м.м. 200 kD является одним, из структурообразующих биополимеров капсульной субстанции В. pseudomallei и В. mallei, представляя собой общий капсульный антиген возбудителей мелиоидоза и сапа, подчеркивая тем самым высокое родство данных микроорганизмов.

Гель-хроматография капсульного вещества В. pseudomallei позволила получить 4 фракции (МК-1, МК-2, МК-3 и МК-4), а у В. mallei - 2 фракции (СК-1 и СК-2). По данным реакции двойной иммунодиффузии, антиген 8 присутствовал, в основном, в первых фракциях капсульного вещества возбудителей мелиоидоза и сапа.

Характеристика капсульных фракций В. pseudomallei, по данным ДСН-ПААГ электрофореза, показала, что фракция МК-1 имела наиболее комплексный биополимерный состаВ. представленный гликопротеинами (200, 150-90, 75 kD), белковыми компонентами (39, 25, 20, 18 kD), а также фрагментами ЛПС (120-80 и 70-50 kD). Фракция МК-2, имея в целом сходный биополимерный состав с МК-1, отличалась от последней присутствием мажорного низкомолекулярного белка 15 kD. Фракция МК-3 содержала наибольшее количество белкоВ. особенно протеинов 4530 kD. Препарат МК-4 содержал белки 48, 45 и 20 kD. Хроматографические фракции СК-1 и СК-2 капсульного вещества возбудителя сапа имели сходный биополимерный состав с пиками МК-1 и МК-2 В. pseudomallei.

Изучение иммунобиологических свойств капсульной субстанции возбудителя мелиоидоза показало, что подавляющее большинство фракций (МК-1, МК-2, МК-3) стимулировали гуморальный иммунитет и

фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей. Вместе с тем, данные антигены снижали уровень формирования ГЗТ, причем введение препарата МК-1 приводило к существенному снижению индекса реакции ГЗТ. Мелиоидозный капсульный антиген МК-4 интенсивно угнетал фагоцитарную активность перитонеальных макрофагоВ. не оказывая при этом заметного влияния на гуморальный иммунитет (табл.1). Как показали опыты, ни одна из фракций капсулы не обладала существенными протективными свойствами (табл.2).

Исследование иммунотропных свойств капсульного вещества возбудителя сапа (табл.3) выявило, что фракция СК-1 угнетала клеточный и гуморальный иммунитет у белых мышей. Препарат СК-2 В. mallei оказывал стимулирующее влияние на уровень антителообразующих клеток в селезенке. Данный антиген способствовал усилению фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов белых мышей.

Необходимо отметить, что выявленная способность первых-фракций капсульного вещества В. pseudomallei и В. mallei к угнетению реакции ГЗТ, на наш взгляд, является одним из ключевых моментов в понимании патогенеза мелиоидоза и сапа, поскольку для эффективного

Таблица 1. Иммунотропная активность капсульных фракций возбудителя

мелиоидоза

Фрак ции Число АОК на селезенку (М ± т) Р ГЗТ (ИР. 94) Р ФА (КС) . Р

МК1 74085 ±5684 <0,05 25,5 = 0,05 1,7±0,7 >0,05

МК2 43218 ±7716 <0,05 33,8 >0,05 1,0*0,4 >0,05

МКЗ 57410 ±1621 <0,05 27,0 >0,05 1,5 ±0,6 >0,05

МК4 21004 ±3081 >0,05 39,7 >0,05 0,1 ±0,7 >0,05

Контроль 13035±1752 40,3 0,3 ±0,7

Таблица 2. Протективная активность капсульных фракций возбудителя мелиоидоза

Летальность при заражении В pseudomallei С-141

5 LDso 50 LD50

Препарат Кол-во животных Из них пало Кол-во животных Из них пало Р

СПЖ СПЖ

абс. % павших абс % павших

МК-1 7 б 86,0 14,0±1,9 6 б 100 1б,5±3,4 >0,05

МК-2 б 6 100 16,5±4Д 5 5 100 5,4±1,5 >0,05

МК-3 8 7 87,5 14,3±2,5 7 7 100 15,0±1,9 >0,05

МК-4 9 8 88,9 11,8±2,1 9 9 100 12,9±1,9 >0,05

Контроль 6 6 100 17,б±2,5 б 6 100 10,7±0,9

Таблица 3. Иммунотропная активность капсульных фракций возбудителя сапа

Фракции Число АОК на селезенку (М ± ш) Р ГЗТ (Ш. Р ФА ГКО Р

СК1 16483 ±500,5 >0,05 11,9 = 0,05 0,01 ±0,005 <0,05

СК2 271690 ±9863,5 <0,05 12,2 =0,05 2,9 ± 1,1 >0,05

Контроль 34948 ±1983,6 19,4 1.4 ±0,7

уничтожения факультативных внутриклеточных паразитоВ. к которым относятся возбудители мелиоидоза и сапа, требуется развитие именно иммунологической реакции ГЗТ.

Таким образом, подтверждается функциональная значимость капсулы у В. psendomallei и В. mallei как фактора патогенности. Фракция МК-4 капсульного вещества возбудителя мелиоидоза и фракция СК-1 возбудителя сапа обладают иммунодепрессирующими свойствами, что обеспечивает защиту инкапсулированных микробных клеток при инвазии макроорганизма. В то же время биополимеры, составляющие

фракции МК-2, МК-3 и. СК-2, проявляют иммуномодулирующие свойства.

При изучении признака капсулообразования как in vitro, так и in vivo были исследованы как плазмидсодержащие штаммы В. pseudomallei 777(рСМ2); 56812 (рРМ1); ПО (рСМ4), так и бесплазмидные штаммы: С-141, 108, 97 возбудителя мелиоидоза. С помогщью электронно-микроскопического исследования было выявлено образование капсулы у всех вышеназванных штаммов возбудителя мелиоидоза вне зависимости от наличия или отсутствия у них плазмидной ДНК. Эти факты позволили нам прийти к заключению, что феномен капсулообразования у В. pseudomallei не связан с плазмидной детерминацией.

Взаимодействие патогенных буркхольдерий с макроорганизмом на начальных этапах развития инфекционного процесса

Было проведено электронно-микроскопическое исследование препаратов (перитонеальный и бронхолегочный экссудаты), полученных от экспериментальных животных в первые часы после внутрибрюшинного и интраназального заражения изучаемыми штаммами В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia. Установлено, что интактные микробы, расположенные вне клеток макроорганизма, наряду со схожими чертами строения с агаровой культурой, имели ряд отличий, которые, прежде всего, касались поверхностных структур возбудителя. Среди них можно было выделить два морфологических варианта. На ультратонких срезах бактерии первого (бескапсульного) морфологического варианта имели типичное для грамотрицательных микробов строение. Клетки второго (капсульного) морфологического варианта В. mallei, а также В. cepacia, отличались от предшсствующего наличием капсулы, которая имела слоистое строение: первый узкий

слой, прилегающий непосредственно к наружной мембране клеточной стенки, был электронно-прозрачным, второй - электронно-плотным в виде бахромки шириной до 150 нм. Второй морфологический вариант B.pseudomallei, в отличие от второго варианта В. mallei и В. cepacia, имел трехслойное строение поверхностного образования общей толщиной до 0,3 мкм. Первые два слоя у возбудителя мелиоидоза были подобны таковым у возбудителей сапа и В. cepacia, а третий - наружный, наиболее массивный слой, состоял из радиально отходящих переплетающихся фибрилл и зернистого, умеренно электронно-плотного материала с разрежением к периферии.

Следует отметить, что деструктивные формы бактерий у данных микроорганизмов наиболее часто встречались у клеток первого (бескапсульного) морфологического варианта.

При световой микроскопии, с окраской по методу Бурри, предварительно отмытых центрифугированием препаратоВ. полученных от животных, у В. pseudomallei, B. mallei и В. cepacia также была обнаружена капсула в виде светлого ореола размером от 0,2 до 0,5 мкм. Использование рутениевого красного выявило усиление слоистости в строении капсулы данных бактерий.

Обработка бактерий мелиоидоза и сапа, имеющих капсулу, меченными ферритином или пероксидазой хрена иммуноглобулинами кролика, полученными как против целых бактериальных клеток, так и против экзополисахарида слизи возбудителя мелиоидоза, показала, что метка усиливала контрастность их капсул. Эти данные доказывают истинно бактериальную природу капсульного вещества у мелиоидозных и сапных микробов.

уже к 3 часу взаимодействия вне соматических клеток преобладал капсульный вариант.

Изучение материала, полученного в первые минуты и часы после введения исследуемых возбудителей в брюшную полость морских свинок, показало, что меченные ферритином антивидовые иммуноглобулины, полученные против нормальной сыворотки морской свинки, т.е. хозяина, выявлялись на поверхности бескапсульных бактерий мелиоидоза и сапа, располагаясь тонким слоем по всей поверхности микробной клетки. В зоне взаимодействия бескапсульных бактерий с цитоплазматической мембраной фагоцита также определялась ферритиновая метка. У возбудителей мелиоидоза и сапа, обладающих капсулой, ферритиновая метка откладывалась рыхло только на поверхностных слоях капсулы. При этом наблюдался неустойчивый контакт капсульных форм бактерий с плазмолеммой фагоцита. В данном случае ферритиновая метка, соответствующая опсонинам, отрывалась с поверхностными фрагментами капсульного вещества В. pseudomallei и В. mallei, оставаясь на поверхности фагоцита, не приводя к устойчивой фиксации и захвату возбудителей.

Эти результаты свидетельствуют о том, что капсула препятствует эффективной опсонизации мелиоидозных и сапных бактерий. Микробы, лишенные капсулы, подвергаются воздействию неспецифических факторов гуморального иммунитета, что приводит к устойчивой фиксации их на поверхности фагоцита с последующим поглощением.

Вскрытые механизмы роли капсульного вещества В. pseudomallei и В. mallei в преодолении первых двух стадий фагоцитарного процесса -стадии узнавания и стадии поглощения согласуются с тем, что при электронно-микроскопическом исследовании перитонеального и бронхоальвеолярного экссудатов фагоцитозу подвергались преимущественно бескапсульные формы этих возбудителей.

После проникновения возбудителей мелиоидоза и сапа в клетку хозяина и формирования вокруг них пищеварительной вакуоли стратегия возбудителей, направленная на выживание в макрофагах и ПМЯЛ перитонеального экссудата, шла в нескольких направлениях.

Динамика наблюдения за взаимодействием.В. pseudomallei и В. mallei с макроорганизмом. показала, что к концу первых суток в перитонеальном и бронхоальвеолярном экссудатах преобладали интактные инкапсулированные бактерии, обнаруживаемые, в основном, в фагоцитах. Микробы, у которых капсула отсутствовала или имела минимальные размеры находились, как правило, на различных стадиях деградации. Это говорит о том, что к процессе, внутриклеточного паразитирования происходит отбор капсульных форм бактерий; которые оказываются более жизнеспособными, чем бескапсульные особи.

Размножение мелиоидозных микробов в фагоцитирующих клетках перитонеального и, бронхоальвеолярного экссудатов в ряде случаев приводит к их гибели, то есть фагоцитирующая клетка in vivo в определенных условиях представляет В. pseudomallei и В. mallei возможность для их беспрепятственного размножения. Эти данные позволяют предположить, что возбудители мелиоидоза и сапа являются факультативными внутриклеточными паразитами и на ранней стадии заболевания, в период, предшествующий значительному антителообразованию, фагоциты, по-видимому, представляют собой клетки-мишени, которые и участвуют в диссеминации возбудителей в организме.

Для понимания становления и развития системы «паразит-хозяин» -необходимо оценивать и ответную реакцию макроорганизма на внедрение инфекционного агента. Так показано, что имеются различия в функционировании ферментных систем фагоцитов при инфекциях, вызываемых патогенными буркхольдериями: В. pseudomallei, В. mallei, В. серасга. Установлено, что кислородзависимая цитоцидная активность фагоцитирующих клеток при остром экспериментальном мелиоидозе и сапе имеет фазный характер изменений с максимальным увеличением (респираторный «взрыв») к 6 ч. Одновременное снижение показателей

антимикробного потенциала фагоцитов (тест восстановления НСТ, содержание бактерицидных катионных белкоВ. активность лизосомальных ферментов) свидетельствует о неблагоприятном течении данных инфекций. Анализ биоцидной активности фагоцитов при инфекции у мышей, вызванной В cepacia, свидетельствовал об угнетении таковой. Характерно, что максимальный подъем кислородзависимой цитоцидной активности при инфекции, вызванной В. cepacia, наступал в более поздние сроки в сравнении с мелиоидозной и сапной инфекциями (на 1-2 сутки после заражения). Снижение содержания бактерицидных катионных белков было более выражено при остром мелиоидозе (в 7-10 раз ниже, чем в контроле), а при заражении мышей В. cepacia показатели не отличались от контрольных.

Выявленные различия в бактерицидной активности фагоцитов у мышей при острых инфекциях, вызванных В. pseudomallei, В. mallei и В. серасia, по-видимому, непосредственно связаны с вирулентностью данных микроорганизмов.

Механизмы персистенции возбудителей мелиоидоза и сапа в макроорганизме

С целью уточнения роли в патогенезе мелиоидоза высокомолекулярного гликопротеинового антигена 8 (первой фракции капсульного вещества Вpseudomallei), было проведено патоморфологическое и электронно - микроскопическое исследования внутренних органов экспериментальных животных (белые крысы), которых заражали аэрогенно вирулентным штаммом В. pseudomallei 100 и штаммом В pseudomallei 100-16-1 (не синтезирующий Аг 8 и авирулентный для белых крыс при подкожном заражении), а также при введении им аэрогенно препарата Аг 8 мелиоидозного микроба.

Изучение патоморфогенеза мелиоидоза, вызванного полноценным и дефектным по Аг 8 штаммами, показало значительное отличие в морфологических проявлениях инфекции. При аэрогенном заражении белых крыс В. pseudomallei 100 генерализация инфекции с образованием множественных специфических гранулём в лёгких, печени, селезёнке и гибель всех животных наступала на 5-7 день болезни. По данным электронно-микроскопического исследования поражённых участков лёгких возбудитель, мелиоидоза паразитировал преимущественно в фагоцитах, альвеол оцитах и эндотелиоцитах капилляроВ. формируя при этом капсулу.

Особенности морфологических проявлений при эрогенном заражении белых крыс В. pseudomallei 100-16-1, прежде всего, выражались в отсутствии специфических гранулем в печени и селезенке. Воспалительные явления в легких характеризовались преобладанием продуктивных процессов над деструктивными и были направлены на отграничение и рассасывание очагов. Электронно-микроскопическое исследование пораженных участков легких показало, что основная масса В. pseudomallei 100-16-1 находилась в альвеолярных макрофагах, преимущественно в фаголизосомах, и имела признаки различных стадий деградации. Для таких бактерий было характерно отсутствие процесса капсулообразования.

Изучение влияния очищенного высокомолекулярного капсульного антигена 8 на ткани и клетки макроорганизма при аэрогенном его введении установило отсутствие во внутренних органах экспериментальных животных специфических гранулем, характерных для мелиоидоза.

Эти данные свидетельствуют об определенной патогенетической роли исследуемого антигена 8 и подчеркивают его значимость как

одного из основных структурных компонентов капсульного вещества возбудителя мелиоидоза.

В результате электронно - микроскопического исследования ультратонких срезов поврежденных участков легких, печени, селезенки и лимфатических узлоВ. полученных от экспериментальных животных с острой и подострой формами как мелиоидозной, так и сапной инфекций, мы не обнаружили «прямого» поражения микробами паренхиматозных клеток, за исключением альвеолоцитов. Другой особенностью мелиоидозной и сапной инфекций было то, что возбудитель обнаруживался в клетках макроорганизма, способных к фагоцитозу. Бактерии проявляли тропность и успешно паразитировали как в «профессиональных» фагоцитах (мононуклеарные фагоциты, полиморфнонуклеарные лейкоциты), так. и в ряде клеток, которые относятся к группе «непрофессиональных» фагоцитоВ. в таких как эндотелиальные клетки капилляроВ. ретикулярные клетки селезенки и лимфатических узлоВ. а также в альвеолоцитах. Указанные клетки, очевидно, являются клетками - «мишенями» при мелиоидозе и сапе, в которых и персистируют В. pseudomallei и В mallei.

Поскольку вышеназванными клетками наиболее богаты легкие, печень, селезенка и лимфатические узлы, то становится понятным преимущественное поражение при мелиоидозе и сапе именно этих органоВ. объясняя схожесть патоморфологической картины и патогенеза данных инфекций, что нашло отражение в старом названии мелиоидоза -ложный сап.

Исследование в электронном микроскопе ультратонких срезоВ. поврежденных специфическим процессом участков легких, печени, селезенки и лимфатических узлов, полученных от морских свинок с подострым течением мелиоидоза и сапа, позволило выявить некоторые особенности персистенции штаммов В. pseudomallei и В. mallei с

различной вирулентностью как вне, так и внутри клеток макроорганизма. Так, на 22-28 сут. после заражения расположенные внеклеточное неповрежденные мелиоидозные и сапные микробы определялись лишь там, где происходил распад клетки-хозяина на фоне выраженной внутриклеточной пролиферации возбудителя, что чаще наблюдалось в случае заражения животных более вирулентными штаммами В. pseudomallei и В. mallei. Данные бактерии имели типичную структуру. На поверхности клеточной стенки у некоторых особей можно было видеть остатки капсульного вещества. При обнаружении на срезе клетки макроорганизма единичных интактных паразитов, находящихся как в фагосомах, так и свободно в цитоплазме, мы не видели какой-либо значительной патологии со стороны ультрастуктур клетки хозяина. В таких случаях, очевидно, наступало своеобразное- биологическое равновесие во взаимоотношении в системе «паразит - хозяин», позволяющее патогену длительно персистировать в клетке макроорганизма.

Во всех случаях внутриклеточного паразитирования вокруг каждой- интактной бактериальной клетки выявлялась четкая зона, хорошо проницаемая для электроноВ. шириной от 120 до 300 нм, соответствующая капсуле возбудителей мелиоидоза и сапа.

Особенностью паразитирования В. pseudomallei и В. mallei в «профессиональных» фагоцитах было то, что часть интактных бактерий находилась в фагосомах, которые в ряде случаев сливались с лизосомами, при этом капсула возбудителя препятствовала прохождению лизосомальных гидролитических ферментов к клеточной стенке возбудителя. Такая картина чаще наблюдалась в случае заражения животных менее вирулентными штаммами В. pseudomallei и В. mallei. Другая часть неповрежденных инкапсулированных бактерий

как возбудителя мелиоидоза, так

располагалась

БИБЛИОТЕКА СПетербУРг ОЭ 300 акт

свободно в цитозоле фагоцитоВ. что было характернее для более вирулентных штаммов В. pseudomallei и В. mallei.

В случае поражения возбудителями мелиоидоза. и сапа «непрофессиональных» фагоцитоВ. на электронограммах можно было видеть, что неповрежденные бактерии имели капсулу и располагались, как правило, свободно в цитоплазме клетки-хозяина.

Способность В. pseudomalleiи В. mallei паразитировать в «непрофессиональных» фагоцитах, наряду с капсулообразованием, на наш взгляд, можно рассматривать в качестве одного из .факторов способствующих их персистенции in vivo, поскольку эти клетки не обладают столь мощной бактерицидной системой, как «профессиональные» фагоциты.

В случае паразитирования в «профессиональных» фагоцитах лизис фагосомальной мембраны и выход бактерий в цитоплазму происходил, до слияния с лизосомами. Это позволяло В. pseudomallei и В. mallei. избегать киллерного воздействия клетки-хозяина.

Необходимо сказать, что, в целом, установленные механизмы персистенции и характер взаимоотношения возбудителей мелиоидоза и сапа с клетками макроорганизма были одинаковы. Вместе с тем, при заражении животных более вирулентными штаммами В. pseudomallei и В. mallei инфекционный- процесс протекал острее и исход взаимодействия «клетка-клетка» решался чаще в пользу микроорганизма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведённые исследования позволили решить ряд вопросоВ. касающихся современного представления об ультраструктурно -функциональной организации патогенных буркхольдерий: В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia, а также особенностей их

взаимодействия с макроорганизмом при развитии инфекционного процесса. Определено значение поверхностных структурных образований у возбудителей мелиоидоза и сапа в реализации патогенных свойств этих бактерий. Выделены, охарактеризованы и изучены иммунобиологические свойства капсульного вещества данных микроорганизмов. Исследована фукционалъная активность фагоцитов при инфекциях, вызванных B.pseudomallei, В. mallei и В. cepacia. Установлены механизмы внутриклеточной персистенции возбудителей мелиоидоза и сапа. Всё это даёт возможность наметить ближайшие перспективы по совершенствованию средств диагностики, лечения и разработке мер профилактики, изучаемых инфекций.

ВЫВОДЫ,

1. Ультраструктурно - функциональное изучение патогенных буркхольдерий: В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia выявило наличие на поверхности этих микроорганизмов при росте in vitro и in vivo, капсулы гранулярно-фибриллярной структуры, прочно и равномерно связанной с клеточной стенкой. В: pseudomallei и В. cepacia, в отличие от В. mallei, формируют жгутиковый аппарат и фимбриальные образования, которые, наряду с капсулой, обусловливают у возбудителя мелиоидоза гидрофобные, адгезивные и антифагоцитарные свойства.

иммуносупрессивным действием, что способствует их персистенции в макроорганизме, тогда как фракции МК-1, МК-2, МК-3 и СК-2 обладают иммуномодулирующими свойствами.

3. Показано, что капсула возбудителей мелиоидоза и сапа в условиях макроорганизма препятствует фагоцитозу и внутриклеточному перевариванию микробных клеток, что позволяет рассматривать феномен капсулообразования как один из факторов патогенности этих возбудителей.

4. Установлено, что гликопротеин м.м. 200 kD, возбудителей мелиоидоза и сапа, является одним из основных структурообразующих биополимеров капсул с выраженной антифагоцитарной активностью и представляет собой капсульный антиген, общий для В. pseudomallei и В. mallei.

5. Показано что кислородзависимая цитоцидная активность фагоцитирующих клеток при острой форме мелиоидоза и сапа имеет фазный характер изменений с максимальным увеличением к 6 ч. Одновременное снижение показателей антимикробного потенциала фагоцитов (тест восстановления НСТ, содержание БКБ, активность кислой фосфатазы и катепсина Д) является прогностически неблагоприятным признаком течения инфекций.

6. Установлено, что В pseudomallei и В. mallei обладают высокими инвазивными свойствами, которые напрямую зависят от их вирулентности и проявляются в способности успешно преодолевать мембранные структуры клеток макроорганизма. Показана способность возбудителей мелиоидоза и сапа элиминироваться из

фагосом до слияния их с лизосомами и паразитировать в цитоплазме эукариотической клетки, уклоняясь от воздействия лизосомальных. факторов.

7. Выявлено, что возбудители мелиоидоза и сапа не блокируют процесс слияния фагосом, содержащих эти микроорганизмы, с лизосомами фагоцитов макроорганизма. Вместе с тем, В. pseudomallei и В. mallei вследствие синтеза защитной капсулы, проявляют высокую устойчивость к литическому действию лизосомальных ферментов за счет недоступности их к клеточной стенке бактерий.

8. Показано, что В. pseudomallei и В. mallei являются факультативными внутриклеточными паразитами. Эти возбудители проявляют направленную тропность, успешно паразитируя как в «профессиональных» фагоцитах — мононуклеарных фагоцитах, полиморфноядерных лейкоцитах, так и в клетках из группы «непрофессиональных» фагоцитов - эндотелиальных клетках капилляроВ. ретикулярных клетках селезенки и лимфатических узлоВ. а также в альвеолоцитах. Эти «клетки - мишени» при мелиоидозе и сапе выступают в роли своеобразной экологической микрониши паразитов.

СПИСОК

работ, опубликованных по теме диссертации

1. Бакулина Н.Г., Мельников Б.И., Божко В.Г., Попов С.Ф., Авророва И.В., Жаркова В.А., Рыбкин B.C. Изучение функциональной, активности фагоцитов при острой мелиоидозной инфекции у мышей // Тез. докл. Первого Всесоюзного иммунологического съезда. (Сочи, 15-17 ноября, 1989 г.) - М.,1989. - T.I. - С. 197.

2. Мельников Б.И., Попов С.Ф., Яковлев А.Т., Денисов И.И., Божко В.Г., Курилов ВЛ. Капсулообразование у возбудителя мелиоидоза в организме //Журн.микробиол., эпидсмиол. и иммунобиол. -1990.-№9.-С. 6-10.

3. Попов С.Ф., Мельников Б.И., Курилов В.Я., Божко В.Г. Особенности ультраструктуры возбудителя мелиоидоза и его взаимодействия с фагоцитами in vivo // Микробиол. журн. - 1990. -T.52.№2.-C. 18-22.

4. Попов С.Ф., Мельников Б.И., Лагутин М.П., Курилов ВЛ. Изучение капсулообразования у возбудителя сапа // Микробиол. журн. -1991:-Т.53^.-С.90-92.

5. Попов С.Ф., Курилов В. Л., Мельников Б.И. Особенности паразитирования возбудителя мелиоидоза в клетках хозяина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1991. - N 10. - С. 12 - 14.

6. Попов С.Ф., Мельников Б.И., Курилов ВЛ. Ультраструктурная характеристика возбудителя сапа, и его взаимодействие с фагоцитами в макроорганизме // Тез. докл. VI Всероссийского съезда микробиологоВ. Эпидемиологов и паразитологов (г. Нижний Новгород, 1991г.). -М., 1991. - Т.Н. - С. 267 - 268.

7. Мельников Б.И., Попов С.Ф., Лагутин М.П., Курилов ВЛ. Взаимодействие возбудителя мелиоидоза с фагоцитирующими клетками // Акт. пробл. и задачи биох., диаг. и имм. - профилактики особо опасных инфекций. - СаратоВ. 1991. - С. 132 - 135.

8. Попов С.Ф., Курилов В. Л., Мешкова Л.Ю. Ультраструктурный аспект паразитирования возбудителя сапа в клетках хозяина // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции -Волгоград, 1992.-С. 121.

9. Попов С.Ф., Курилов ВЛ., Яковлев А.Т. Изучение локализации общих поверхностных антигенов у возбудителей сапа и мелиоидоза // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей опасных инфекций. Материалы Российской научной конференции -Волгоград, 1992.-С. 122.

10. Фарбер СМ., Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C., Жукова СИ., Ломова Л.В., Попов С.Ф. Изменение структуры возбудителей сапа и

мелиоидоза под влиянием гуморальных факторов // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций; Материалы Российской научной конференции - Волгоград, 1992. - С. 139.

11. Попов С.Ф., Курилов В.Я., Лагутин МЛ. Взаимодействие возбудителя мелиоидоза с альвеолярными макрофагами хозяина // Микробиол. журн. -1992. - Т.54; N 4. - С. 3 - 7.

12. Божко В.Г., Денисов И.И., Рыбкин B.C., Попов* С.Ф., Васильев В.П. Изучение влияния кислого экзополисахарида возбудителя мелиоидоза на функциональную активность макрофагов// Микробиол. журн. -1992. - Т.54, № 6 - С. 54 - 58.

13. Божко В.Г., Вязьмина Т.Н., Рыбкин B.C., Попов С.Ф. Динамика изменений лейкоцитарной формулы и цитоцидной активности полиморфноядерных лейкоцитов на начальных этапах острой мелиоидозной инфекции // Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций: Матер. Российской науч. конф. (21 - 23 сентября 1993, Саратов). - СаратоВ.1993. - С. 111.

14. Алексеев В.В., Курилов В.Я., Вязьмина Т.Н., Савченко СТ., Яковлев А.Т., Федосов СМ., Попов С.Ф. Патогенез сапа у белых мышей линии ВАЛВ/с при аэрогенном методе заражения // Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезненей: - Ставрополь, 1993. - С 321 - 322.

15. Вязьмина Т.Н., Попов С.Ф., Алексеев В.В., Курилов ВЛ., Савченко СТ. Патоморфология подострого мелиоидоза у белых крыс при аэрогенном заражении // Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезненей. — Ставрополь, 1993. - С. 329 - 330.

16. Попов-С.Ф., Вязьмина Т.Н., Курилов В.Я., Божко В.Г. Особенности паразитирования возбудителей сапа и мелиоидоза в организме хозяина на начальных этапах инфекции // Современные аспекты природной очаговости, эпидемиологии и профилактики особо опасных инфекционных болезненей. - Ставрополь, 1993. - С 345 - 346.

17. Popov SJF., Tikhonov N.G., Kurilov V.Y. Influence of capsule formation in Pseudomonas pseudomallei and Pseudomonas mallei on their relations with host cells // Immunology and Infections Diseases. - 1994. - V4, №3.-P. 142-145.

18. Alekseev V.V., Tikhonov N G, Savchenko S.T., Kurilov V.Y., Vjaszmina T.N., Yakovlev A.T., Denisov 11. and Popov S.F. Experimental bacterial aerosols: some physical and Biological (Pathogenic) properties // J. Aerosol Sci. - 1994. - V25, N 8. - P. 1413 - 1423.

19. Денисов И.И., Илюхин В. И, Попов С.Ф. Культурально -морфологические особенности мономорфоваров возбудителя мелиоидоза // «Актуальные вопросы профилактики чумы и других инфекционных заболеваний». Материалы межгосударственной научно -практической конференции, посвященной 100 - летаю открытия возбудителя чумы. - Ставрополь, 1994. - С. 177 - 178.

20. Алексеев В.В., Тихонов Н.Г., Вязьмина Т.Н., Попов С.Ф., Курилов В.Я., Пивень Н.Н., Савченко СТ., Денисов И.И. Патогенез, патологическая морфология мелиоидоза // Мелиоидоз / Под ред. Н.Г. Тихонова - Волгоград: Нижне - Волжское кн. изд - во, 1995. -,С .91 -119.

21. Вязьмина Т.Н., Тихонов Н.Г., Алексеев -В.В., Попов С.Ф., Курилов В.Я. Патогенез, патологическая анатомия и патологическая морфология сапа // Сап / Под ред Н.Г. Тихонова - Волгоград: Нижне -Волжское кн. изд - во, 1995. - С. 50 - 72.

22. Денисов И.И., Илюхин В.И., Попов С.Ф. Культурально -морфологические особенности ализогенных вариантов возбудителя мелиоидоза // Идеи И.И. Мечникова и развития современного естествознания: Тез. докл. Международной, научной конференции, посвященной 150 - летаю со дня рождения И.И. Мечникова. -ХарькоВ.1995.-С. 99.

23. Вязьмина Т.Н., Алексеев В.В., Савченко СТ., Курилов В.Я., Попов С.Ф. Патогенез острого лёгочного мелиоидоза у золотистых хомячков при аэрогенном методе заражения // Идеи И. И, Мечникова и развитие современного естествознания: Тез. докл. Международной) научной конференции, посвященной 150 - летаю со дня рождения И.И. Мечникова. - Харьков, 1995. - С. 65 - 66.

24. Попов С.Ф., Курилов В.Я., Яковлев А.Т. Pseudomonas pseudomallei и Pseudomonas mallei - капсулообразующие бактерии // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 1995. — № 5. - С. 32 - 36.

25. Попов С.Ф., Вязьмина Т.Н., Курилов В.Я., Бакулина Н.Г., Божко В.Г. Сравнительный анализ особенностей взаимодействия

возбудителей мелиоидоза и сапа с клетками хозяина // Эколого -эпидемиологический надзор за природно - очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии: Сб. науч. трудов. - Астрахань, 1996. - С. 106 - 107.

26. Вязьмина Т.Н., Попов С.Ф., Курилов BJL, Алексеев В.В., Савченко С.Т. Патоморфология экспериментального мелиоидоза в зависимости от вирулентности возбудителя // Эколого - эпидемический надзор за природно - очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии: Сб.-науч. трудов. -Астрахань, 1996. - С. 140-141.

27. Попов. С.Ф., Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Курилов В.Я., Использования сывороточной среды для стимуляции капсулопродукции у возбудителя мелиоидоза // Эколого - эпидемический надзор за природно - очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии: Сб. науч. трудов. - Астрахань, 1996.—С. 151.

28. Божко В.Г., Рыбкин B.C., Бакулина Н.Г., Попов С.Ф. Сравнительная оценка антимикробного потенциала фагоцитов мышей при экспериментальных инфекциях, вызванных некоторыми видами псевдомонад // Эколого - эпидемический надзор за природно -очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии: Сб. науч. трудов. -Астрахань,1996.-С. 191-192.

29. Попов С.Ф., Курилов В.Я. Капсулообразование у Pseudomonas cepacia in vivo // Матер. VII съезда Всероссийского общества эпидемиологоВ. микробиологов и паразитологов. -Москва, 1997.-Т.1.-С.231.

30. Божко В.Г., Попов С.Ф., Вязьмина Т.Н., Бакулина Н.Г., Рыбкин B.C., Курилов В.Я. Исследование функциональной активности фагоцитов при экспериментальном мелиоидозе // Современные проблемы аллергологии клинической иммунологии и иммуноморфологии: Сб. трудов. - Москва, 1997. - С. 238.

31. Бакулина Н.Г., Тихонов Н.Г., Попов С.Ф., Божко В.Г., Вязьмина Т.Н. Изучение особенностей фагоцитарной реакции макроорганизма на начальных этапах инфекционного процесса, вызванного некоторыми видами патогенных псевдомонад // Матер. научно - практической конференции, посвященной 10 0 - летаю образования противочумной службы России. — СаратоВ. 1997. - Т.1. - С. 181-182.

32. Алексеев В.В., Тихонов Н.Г., Вязьмина Т.Н., Савченко СТ., Курилов В.Я, Попов С.Ф. Некоторые особенности патогенеза экспериментального лёгочного мелиоидоза // Матер. научно-практической конференции, посвященной 100 - летию образования противочумной службы России. - СаратоВ. 1997. - Т.2. - С. 3.

33. Вязьмина Т.Н., Бакулина Н.Г., Попов С.Ф., Курилов. В.Я. Патоморфологические аспекты мелиоидозной инфекции, вызванной типичными и атипичными штаммами возбудителя // Матер., научно -практической конференции, посвященной 100 - летию образования противочумной службы России. - СаратоВ. 1997. - Т.2. - С. 23- 24:

34. Каплиев В.И., Пивень Н.Н., Замараев B.C., Попов С.Ф. Исследование фактороВ. обусловливающих адгезивные свойства Pseudomonas pseudomallei // Матер. научно - практической конференции, посвященной 100 - летию образования противочумной службы России. -СаратоВ. 1997. - Т.2. - С. 58 - 59.

35. ПопоВ.С.Ф., Викторов. Д.В., Пивень Н.Н., Вязьмина Т.Н., Бакулина Н.Г., Курилов ВЛ. Изучение состава капсульного вещества у возбудителей сапа и мелиоидоза // Матер. научно - практической конференции, посвященной 100 - летию образования противочумной службы России. - СаратоВ.1997. - Т.2. - С. 104 - 105.

36. Попов С.Ф., Пивень Н.Н., Викторов Д.В., Курилов В Л. Капсулообразование у патогенных бактерий рода Burkholderia // Матер. научно - практической конференции, посвященной 100 - летию образования противочумной службы России. - СаратоВ.1997. - Т.2. - С. 105-106.

37. Попов С.Ф., Пивень Н.Н., Вязьмина Т.Н., Курилов ВЛ., Викторов Д.В. Макрофаги как клетки - мишени при мелиоидозе // Матер. юбилейной научной конференции, посвященной 70 - летию НИИ микробиологии МО РФ. - КироВ. 1998. - С. 196.

38. Пивень Н.Н., Тихонов Н.Г., Викторов Д.В., Плеханова Н.Г., Попов С.Ф. Внеклеточные и поверхностные антигены Pseudomonas {Burkholderia)pseudomallei как потенциальные факторы вирулентности // Матер. юбилейной научной конференции, посвященной 70 - летию НИИ микробиологии МО РФ. - КироВ.1998. - С. 191.

39. Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Плеханова Н.Г., Меринова О.А., Попов С.Ф. Физико - химические и иммунобиологические

свойства белков наружной мембраны Burhholderiapseudomallei И Матер. юбилейной научной конференции, посвященной 70 - летию НИИ микробиологии МО РФ. - КироВ. 1998. - С. 67 - 68.

40. Захарова И.Б., Замараев B.C., Викторов Д.В., Попов С.Ф. Анализ продуктов экспрессии фрагментов плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза, клонированных в Е. coli II Матер. юбилейной научной конференции, посвященной 70 - летию НИИ микробиологии МО РФ.-КироВ.1998.- С. 100-101.

41. Пивень Н.Н., Тихонов Н.Г., Викторов Д.В., Плеханова Н.Г., Попов- С.Ф., Меринова О.А. Факторы вирулентности Pseudomonas (Burkholderia)pseudomallei и В. mallei II Scientific jornal. (Ulaanbaatar). -1999.-№ 7.-С. 184-188.

42. Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Плеханова Н.Г., Попов С.Ф., Меринова О.А. Идентификация и характеристика некоторых компонентов системы мембранного транспорта Burkholderia pseudomallei II Проблемы особо опасных инфекций: Сб. науч. трудов / Под ред. В.В. Кутырева. - Саратов: Изд - во «Слово», 1999. - Вып.79. - С. 144 -148.

43. Пивень Н.Н., Тихонов Н.Г., Викторов Д.В., Плеханова Н.Г., ПопоВ. С.Ф., Меринова О.А. Факторы вирулентности Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei//Проблемы особо опасных инфекций: Сб. науч. трудов / Под ред. В.В. Кутырева. - Саратов: Изд - во «Слово»,

1999.-Вып.79.-С. 175-181.

44. Попов С.Ф., Тихонов Н.Г., Пивень Н.Н., Курилов В.Я., Дементьев И.П. Роль капсулообразования у Burkholderia mallei для его персистенции in vivo // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -

2000.-№3-C.73-75.

45. Алексеев В.В., Тихонов Н.Г., Вязьмина Т.Н., Плеханова Н.Г., Демедюк Е.А., Пивень Н.Н., Попов С.Ф.1, Замараева СВ., Каплиев В.И., Пучков B.C., Викторов Д.В. Патогенетическое действие и механизмы адаптации антигенных вариантов Burkholderia pseudomallei при экспериментальном мелиоидозе // Природно - очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб. науч. трудов / Под ред. Н.Г. Тихонова. -Волгоград: Изд-во «Принт» ВолГУ.,2000. - С. 12- 29.

46. Антонов В.А., Замараев B.C., Захарова И.Б., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Попов С.Ф. Изучение плазмид патогенных буркхольдерий // Природно - очаговые инфекции в Нижнем Поволжье:

Сб. науч. трудов / Под ред. Н.Г. Тихонова, - Волгоград: Изд - во «Принт» ВолГУ.,2000. - С. 41 - 47.

47. Попов С.Ф., Тихонов Н.Г., Каплиев В.И., Пивень Н.Н., Викторов Д.В. Влияние экстрацеллюлярных образований Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei на взаимодействие с клетками макроорганизма // Природно - очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб. науч. трудов / Под ред. Н.Г. Тихонова. - Волгоград: Изд - во «Принт» ВолГУ.,2000. - С. 199 - 203.

48. Алексеев В.В., Вязьмина Т.Н., Плеханова Н.Г., Демедюк Е.А., Попов С.Ф., Каплиев В.И., Пивень Н.Н. Способ моделирования лёгочного мелиоидоза // Патент на изобретение №2157538, 10 октября 2000г.

49. Пивеиь Н.Н., Рыбкин B.C., Плеханова Н.Г., Жукова СИ., Викторов Д.В., Авророва И.В., Демедюк Е.А., Дрефс Н.М., Попов С.Ф. Иммунотропные и иммуногенные свойства поверхностных и мембранных антигенов Burkholderia pseudomallei II Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2001. - N 1. - С. 29 - 33.

50. Каплиев В.И., Замараев СВ., Алексеева В.В., Попов С.Ф. Электронно - микроскопическое исследование взаимодействия возбудителя мелиоидоза с клетками макроорганизма // Природно-очаговые особо опасные инфекции на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика: Сб. науч. тр. - Астрахань, 2001. - С. 224 -225.

51. Алексеев В.В., Вязьмина Т.Н., Плеханова Н.Г., Алексеева В.В., Замараева СВ., Попов С.Ф., Каплиев В.И. Особенности патогенеза экспериментального лёгочного мелиоидоза, вызванного штаммами Burkholderia pseudomallei с различным антигенным составом // Проблемы особо опасных инфекций: Сб. научн. тр. / Под ред. В. В. Кутырева. - СаратоВ. 2001. - Вып.2(82) - С 95 - 99.

52. Попов С.Ф., Алексеев В.В., Пивень Н.Н., Плеханова Н.Г., Алексеева В.В., Замараева СВ., Каплиев В.И. Электронно -микроскопическое изучение взаимодействия штаммов возбудителя, мелиоидоза с различной антигенной структурой и фагоцитирующих клеток лёгкого при аэрогенном заражении //Проблемы особо опасных инфекций: Сб. научн. тр. / Под ред. В. В. Кутырева. - СаратоВ.2001. - . Вып.2(82)-С 112-115.

53. Попов С.Ф., Тихонов Н.Г., Пивень Н.Н., Авророва И.В., Викторов Д.В., Курилов ВЛ. Иммунобиологические свойства капсульного вещества Burkholderiapseudomallei и Burkholderia mallei II Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2002. - № 6. - С. 60 - 64.

54. Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Захарова И.Б., Меринова О.А., Попов С.Ф. Способ выделения белка 39 кДа наружной мембраны возбудителя мелиоидоза // Патент на изобретение №2208445, 20 июля 2003г.

55. Попов С.Ф., Алексеев В.В., Пивень Н.Н, Курилов ВЛ., Елизаров В.В. Особенности персистенции возбудителей мелиоидоза и сапа в макроорганизме // Сб. научн. тр., посвященных 75-летию НИИ микробиологии МО РФ. - КироВ. 2003. - С. 107 - 109.

56. Пивень Н.Н., Попов С.Ф., Викторов Д.В., Тихонов Н.Г., Авророва И.В., Курилов ВЛ. Способ получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза // Решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2001129615/13(031548) от 9 января2004г.

Подписано в печать 27.08.2004 г. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз. Заказ 221.

Издательство Волгоградского государственного университета. 400062, Волгоград, ул. 2-я Продольная, 30.

- 1 564 9

Содержание диссертации, доктора медицинских наук, Попов, Сергей Федорович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурно- функциональная характеристика возбудителей ме-лиоидоза и сапа.

1.2. Факторы патогенности микроорганизмов и их роль во взаимодействии с макроорганизмом.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Используемые микроорганизмы, питательные среды, экспериментальные животные.

2.2. Электронно- микроскопические, цитохимические и иммуноци-тохимические методы исследования.

2.3. Изучение адгезивных и гидрофобных свойств микроорганизмов

2.4. Исследования взаимодействия микроорганизмов с клетками макроорганизма.

2.5. Физико- химические и биохимические методы исследования.

2.6. Иммунологические исследования.

2.7. Статистическая обработка результатов исследований.

Глава 3. УЛЬТРАСТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА, САПА И у5 В. cepacia.

3.1. Субмикроскопическое строение B.pseudomallei и В. cepacia.

3.2. Ультраструктурно-функциональное исследование поверхностных образований у возбудителя мелиоидоза.

3.3. Электронно-микроскопическое исследование структурной организации В. mallei.

Глава 4.СТРУКТУРНО - ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КАПСУЛЬНОГО ВЕЩЕСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ МЕЛИОИДОЗА И САПА.

4.1. Электронно-иммуноцитохимическое исследование капсулы B.pseudomallei и В. mallei.

4.2. Выделение и анализ состава капсульной субстанции возбудителей мелиоидоза, сапа и В. cepacia.

4.3. Изучение иммунотропных и иммуногенных свойств основных компонентов капсульного вещества В. pseudomallei и В. mallei. Ю

4.4. Аспекты генетической детерминации капсулообразования у возбудителей мелиоидоза и сапа.

Глава 5. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПАТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ С МАКРООРГАНИЗМОМ НА НАЧАЛЬНЫХ ЭТАПАХ РАЗВИТИЯ ИНФЕКЦИОННОГО ПРОЦЕССА.

5.1. Особенности ультраструктурной организации В. pseudomallei,

В. mallei и В. cepacia in vivo.

5.2. Взаимодействие возбудителей мелиоидоза и сапа с гуморальными и клеточными факторами иммунной системы макроорганизма.

5.3. Исследование функциональной активности фагоцитов при инфекциях, вызываемых В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia.

Глава 6. МЕХАНИЗМЫ ПЕРСИСТЕНЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ

МЕЛИОИДОЗА И САПА В МАКРООРГАНИЗМЕ.

6.1. Взаимоотношение В. Pseudomallei, В. mallei и В. cepacia с тканями и клеточными элементами в инфицированных органах макроорганизма.

6.2. Особенности внутриклеточной персистенции патогенных бурк-хольдерий.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ультраструктурно-функциональный анализ патогенных буркхольдерий и особенности их взаимодействия с макроорганизмом при развитии инфекционного процесса"

Из известных в настоящее время представителей рода Burkholderia возбудители мелиоидоза - Burkholderia pseudomallei и сапа — Burkholderia mallei занимают особое место в клинической микробиологии. Это связано с их высокой патогенностью для человека и животных, в отличие от большинства остальных видов рода Burkholderia, которые принадлежат к фитопатогенным бактериям и сапрофитам (11, 107, 176, 184, 210, 307, 394, 403).

Способность вызывать у людей и животных тяжёлые заболевания, характеризующиеся септицемией с множественными некротическими поражениями внутренних органов, трудно поддающиеся антибактериальной терапии (11, 67, 101, 129, 154, 205, 210, 230, 237, 249, 350, 362), а также резко повышать свою вирулентность при пассировании через организм животных (235, 398) предопределили, в соответствии с санитарно-эпидемиологическими критериями, принятыми в России, включение В. pseudomallei и В. mallei во вторую группу патогенных для человека микроорганизмов. Необходимо отметить, что по мнению ряда экспертов возбудители мелиоидоза и сапа являются вероятными агентами при проведении биотеррорестических актов (27, 270,337,386).

Эндемичный район для мелиоидоза находится между 20° с. ш. и 20° ю. ш. Заболевания встречаются в тропических и субтропических зонах Юго-Восточной Азии, Западной и Центральной Африки, а также в СевероВосточной Австралии. В других частях света мелиоидоз менее знаком медикам, что, с одной стороны, объясняется относительно малым количеством публикуемой литературы по этому вопросу, а с другой - неоправданной недооценкой значимости данной инфекции.

Случаи так называемого «Вьетнамского туберкулёза», то есть лёгочного мелиоидоза у американских солдат, участвовавших в военных действиях во Вьетнаме, вызвали всплеск интереса к этому заболеванию, особенно в Таиланде (200). По данным Kanai (248), в этой стране было сообщено о трёх случаях мелиоидоза в 1965 г. и о более 800 - в 1986 г. Французские и американские специалисты установили, что среди лиц, находившихся более месяца в эндемичных районах, до 9% являются потенциально больными мелиоидозом (140, 174, 180). В последние годы интерес к мелиоидозу возрос также и из-за увеличения заболеваемости во многих государствах, расположенных вне «классических» эндемичных географических регионов - США, Канада, Франция, Япония, Китай, Турция, куда инфекция была завезена больными людьми или инфицированными животными (182, 197, 272, 275, 322, 323).

На территории Российской Федерации мелиоидоз не регистрировался, однако, постоянно расширяющиеся торгово-экономические связи с эндемичными по данному заболеванию странами создают предпосылки для появления в нашей стране этой опасной инфекции.

Сап раньше был широко распространён на земном шаре и приносил большие экономические потери (331). В России в 1906 -1910 годах ежегодно погибали от него около 17500 лошадей, а заболеваемость людей составляла 150-200 случаев в год. В последующем, в результате комплексных противо-эпизоотических мероприятий, сап на территории бывшего Советского Союза был полностью ликвидирован (11). В настоящее время болезнь среди животных регистрируется в Турции, Иране, Афганистане, Китае, Монголии (11 ,101, 178). Заболевания среди людей встречаются редко. Вместе с тем, опасность заноса сапа из-за рубежа, особенно из стран, непосредственно граничащих с Россией, о которых говорилось выше, не может быть полностью исключена, о чём свидетельствуют исследования, проведённые специалистами Волгоградского НИПЧИ на Улан-Удэнском мясокомбинате в 1984-1985 годах. При анализе материала от двухсот лошадей, импортированных из Монголии, в трёх случаях удалось обнаружить специфические сапные антигены и антитела, а в одном случае выделить типичный вирулентный штамм

В.mallei (68). Всё это определяет необходимость постоянного внимания к этой инфекции.

Наряду с вышеназванными особо опасными В. pseudomallei и В. mallei, определенный интерес для клинической микробиологии имеет В. cepacia, впервые выделенная и охарактеризованная в 1949 г. немецким бактериологом W.Burkholder как фитопатогенный микроорганизм (159). В госпитальных условиях В. cepacia вызывает ряд патологий, среди которых особенно часто встречаются инфекции мочевого тракта (51, 271). Отмечено, что этот микроорганизм обусловливает развитие некротизирующих пневмоний, абсцессов легких, а также послеоперационных раневых инфекций и септицемий (145, 163, 359, 360). В последние годы наблюдается увеличение частоты выделения В. cepacia от больных кистозным фиброзом (149, 171, 212, 280, 296, 304, 351). Это дало основание отнести данный микроб к группе «оппортунистических» микроорганизмов (107, 173). Несмотря на это обстоятельство патогенные свойства В. cepacia изучены недостаточно. Показана способность штаммов В. cepacia выживать и размножаться в водных источниках, его устойчивость к дезинфектантам, антисептикам, антибиотикам, что создает условия для формирования внутрибольничных инфекций (11, 107, 175, 224, 256).

Имеющиеся работы, посвященные возбудителям мелиоидоза и сапа, дают определенное представление об основных биологических свойствах микроорганизмов, касающихся прежде всего продукции и структуры антигенов (67, 80, 100, 101, 132, 133, 160, 190, 311, 316, 326), наличии и функции ряда токсинов и ферментов (30, 67, 76, 101, 261, 367), составе и биохимической активности этих бактерий (19, 67, 94, 101, 257, 300, 307,366, 399). Исследованы устойчивость микробов к антибактериальным средствам (3, 9, 67, 101, 214, 314, 327, 339, 345, 402) и особенности клинического течения различных форм мелиоидоза и сапа (11, 67, 101, 168, 239, 255, 301, 346, 371, 374).

Однако, несмотря на некоторые успехи в изучении биологии возбудителей мелиоидоза и сапа, многие стороны патогенеза, вызванные этими инфекционными заболеванями, остаются поверхностно раскрытыми (67, 101, 154). Последнее, очевидно, связано с отдельными недостатками в исследовании у буркхольдерий факторов патогенности, которые определены довольно схематично (11, 370, 33, 83, 86, 172, 194, 300).

Следует отметить, что в освещении патогенеза заболеваний важное место занимают знания об особенностях строения возбудителя и механизмах его взаимодействия с макроорганизмом (4, 20, 37, 38, 96, 117, 147, 251). Вместе с тем, количество публикаций, посвященных ультраструктурной организации возбудителей мелиоидоза и сапа и возможной связи выявленных у них структур с патогенностью, весьма ограничено, а изложенные в них данные носят отрывочный характер и касаются в основном описания патогенов вне связи с организмом хозяина (11, 41, 55, 99, 246, 321).

Приведённые выше факты требуют глубокого изучения биологии патогенных буркхольдерий и, в частности, вопросов, связанных с адаптационными механизмами этих микробов в процессе их взаимодействия с макроорганизмом при развитии инфекции. Необходимо выявление и выяснение роли таких морфологических образований, как капсула, фимбрии, жгутики в осуществлении взаимодействия данных бактерий с клетками - мишенями организма хозяина.

В течении инфекционных процессов, вызываемых различными микробами, есть некоторые общие черты, но весьма важны те отличительные особенности, которые характерны для определённых возбудителей. Именно они обусловлены индивидуальными биологическими свойствами возбудителя и дают ключ для понимания конкретного заболевания. Следовательно, знания о структурно-функциональной организации возбудителя, его особенностях взаимодействия с организмом хозяина на различных стадиях инфекционного процесса будут иметь большое практическое значение при разработке концепции патогенеза, а также для лечения, диагностики и выработки мер профилактики, изучаемых заболеваний.

Для понимания этих процессов необходимо привлечение новых методических подходов. Перспективным являются морфофизиологические исследования с применением ряда электронно-микроскопических методик. Электронная микроскопия, электронная цито- и иммунохимия как методы структурного анализа, позволяют получить новые данные о субклеточном строении как возбудителя, так и клеток макроорганизма, а также изучить их состояние в процессе становления и развития системы «паразит-хозяин».

Данная работа предусматривает системное изучение морфологических структур В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia in vitro и in vivo в сравнительном аспекте, а также выяснение функционального назначения выявленных структур в процессе взаимодействия этих возбудителей с организмом хозяина. Выявление и исследование роли капсульных биополимеров возбудителей мелиоидоза и сапа в патогенезе данных заболеваний как факторов патогенно-сти. Раскрытие механизмов персистенции В.pseudomallei и В.mallei в макроорганизме.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - изучить особенности ультраструктуры патогенных буркхольдерий при взаимодействии с макроорганизмом и выявить функциональную направленность структурных образований у этих микроорганизмов, определяющих развитие инфекционного процесса.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Исследовать в сравнительном аспекте ультраструктурно - функциональную организацию В. pseudomallei, В. mallei, В. cepacia. Определить функциональную значимость поверхностных образований у этих возбудителей, в частности, структур, связанных с адгезивными и антифагоцитарными свойствами.

2. Разработать технологию получения и выделения комплексов биополимеров капсульного вещества возбудителей мелиоидоза и сапа.

3. Изучить физико-химические, иммунохимические, иммунотропные и им-муногенные свойства полученных биополимеров капсульной субстанции В. pseudomallei и В. mallei.

4. Исследовать особенности воздействия В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia на кислородзависимую и кислороднезависимую биоцидные системы фагоцитов, а также изучить динамику изменений биохимической активности некоторых ферментов макрофагов (5- нуклеотидаза, лизосо-мальные ферменты) при инфекциях, вызываемых возбудителями мелиоидоза, сапа и В. cepacia.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

Впервые показано, что В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia являются капсулообразующими бактериями. С помощью электронно-микроскопического, цитохимического и иммуноцитохимического методов исследована ультраструктура капсулы у этих микроорганизмов. Проведено выделение и изучение капсульного вещества В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia. Разработан метод получения капсульных фракций: МК-1, МК-2, МК-3, МК-4 возбудителя мелиоидоза (приоритетность подтверждена положительным решением о выдаче патента на изобретение по заявке №2001129615/13(031548) от 9 января 2004г. «Способ получения капсульного вещества возбудителя мелиоидоза») и капсульных фракций: СК-1, СК-2 возбудителя сапа, а также способ получения белка наружной мембраны В. pseudomallei, подтверждённый патентом на изобретение № 2208445 «Способ выделения белка 39 кДа наружной мембраны возбудителя мелиоидоза» от 20 июля 2003г. Определены фи-зикохимические параметры выделенных фракций капсульного вещества В. pseudomallei и В. mallei.

На ультраструктурном уровне изучен механизм инвазии возбудителей мелиоидоза и сапа в клетки макроорганизма. Выявлено участие пилей B.pseudomallei в проявлении адгезивных свойств по отношению к клеткам организма хозяина.

Показана антифагоцитарная функция капсул у возбудителей мелиоидо-за и сапа в условиях макроорганизма, что позволяет говорить о феномене капсулообразования у данных бактерий как о факторе патогенности.

Впервые в сравнительном аспекте исследована функциональная активность фагоцитов при инфекциях, вызванных В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia. Показано, что при остром экспериментальном мелиоидозе и сапе ки-слородзависимая цитоцидная активность фагоцитирующих клеток имеет фазный характер изменений с максимальным увеличением к 6 часам. Одновременное снижение показателей антимикробного потенциала фагоцитов (тест восстановления НСТ, содержание БКБ, активность кислой фосфатазы и катепсина Д) является прогностически неблагоприятным признаком течения инфекции.

Впервые на ультраструктурном уровне, при моделировании лёгочного мелиоидоза (новизна этих исследований подтверждена патентом на изобретение № 2157538 от 10 октября 2000г. «Способ моделирования лёгочного мелиоидоза»), проведён анализ механизмов, направленных на выживание В. pseudomallei внутри клеток макроорганизма. Выявлено защитное свойство капсулы у данного возбудителя от деструктивных факторов клеток организма.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ

1. «Методические рекомендации по стерилизующему режиму фиксации клеток макроорганизма, зараженных возбудителями мелиоидоза и сапа, для электронной цитохимии и иммуноцитохимии», утверждены директором ВолгНИПЧИ 09.07.90 г.

4. «Методические рекомендации по выявлению и изучению экзоцеллюляр-ных комплексов патогенных псевдомонад», утверждены директором ВолгНИПЧИ 07.04.97 г.

8. «Методические рекомендации по моделированию на морских свинках легочного мелиоидоза, вызванного штаммом Burkholderia pseudomallei 10016-1 (Аг8~)», утверждены директором ВолгНИПЧИ 28.06.02 г.

Материалы диссертационной работы используются при проведении занятий в Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте на курсах первичной специализации врачей, биологов по диагностики особо опасных инфекций, специфической индикации возбудителей ООИ, санитарной охране территории и противоэпидемической защите населения.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia имеют структурированную капсулу, которая является фактором патогенности данных микроорганизмов. Возбудитель мелиоидоза, в отличие от возбудителя сапа, формирует фим-бриальные образования, которые обусловливают у В. pseudomallei гидрофобные и адгезивные свойства.

2. Биополимерные комплексы фракций МК-4 и СК-1 капсульного вещества возбудителей мелиоидоза и сапа индуцируют в макроорганизме им-муносупрессию, а биополимеры капсульных фракций МК-1, МК-2, МК-3 и СК-2 - иммуномодуляцию.

3. Поверхностный гликопротеин м.м. 200 kD является одним из основных структурных компонентов капсульной субстанции В. pseudomallei, В. mallei и обладает антигенными и антифагоцитарными свойствами.

4. Вирулентность инкапсулированных форм В. pseudomallei и В. mallei обеспечивается устойчивостью к фагоцитозу и паразитированием как в фаго-лизосомах, так и свободно в цитоплазме клеток макроорганизма.

6. Особенности патогенеза мелиоидоза и сапа обусловлены тропизмом В.pseudomallei и В.mallei к клеткам мононуклеарных фагоцитов, эндотели-альным клеткам капилляров, альвеолоцитам, ретикулярным клеткам селезёнки и лимфатических узлов.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены на научных конференциях Волгоградского научно-исследовательского противочумного института в 19922000 гг.; Российской научной конференции «Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций» (Волгоград, 1992); Российской научной конференции «Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций» (Саратов, 1992); юбилейной конференции, посвященной 25-летию Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (Волгоград, 1995); Международной научной конференции, посвященной 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова «Идеи И.И.Мечникова и развитие современного естествознания» (Харьков, 1995); VII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997); 1-ой Национальной конференции Российской Ассоциации аллергологов и клинических иммунологов «Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммуноморфологии» (Москва, 1997); юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ «Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология. Ветеринария» (Киров, 1998); юбилейной конференции, посвященной 30-летию Волгоградского научно-исследовательского противочумного института (Волгоград, 2000); юбилейной конференции, посвященной 100-летию Астраханской противочумной станции «Природно-очаговые особо опасные инфекции на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика (Астрахань, 2001).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 56 работ, получено два патента на изобретения и одно положительное решение о выдаче патента на изобретение. Материалы диссертации вошли в две коллективные монографии: «Сап» (1995) и «Мелиоидоз» (1995) под редакцией Заслуженного деятеля науки РФ, д.м.н., профессора Н.Г.Тихонова.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Попов, Сергей Федорович

ВЫВОДЫ

1. Ультраструктурно-функциональное изучение патогенных буркхольдерий: В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia выявило наличие на поверхности этих микроорганизмов при росте in vitro и in vivo капсулы гранулярно-фибриллярной структуры, прочно и равномерно связанной с клеточной стенкой. В. pseudomallei и В. cepacia, в отличие от В. mallei, формируют жгутиковый аппарат и фимбриальные образования, которые, наряду с капсулой, обусловливают у возбудителя мелиоидоза гидрофобные, адгезивные и антифагоцитарные свойства.

2. Биополимерный состав хроматографических фракций МК-1, МК-2,МК-3 и МК-4 капсульного вещества В. pseudomallei и фракций СК-1 и СК-2 капсульного вещества В. mallei представлен, в основном, гликопротеиновыми структурами. Фракции МК-4 и СК-1 капсульного вещества возбудителей мелиоидоза и сапа обладают иммуносупрессивным действием; что способствует их персистенции в макроорганизме, тогда как фракции МК-1, МК-2,МК-3 и СК-2 обладают иммуномодулирующими свойствами.

6. Установлено, что В. pseudomallei и В. mallei обладают высокими инвазив-ными свойствами, которые напрямую зависят от их вирулентности и проявляются в способности успешно преодолевать мембранные структуры макроорганизма. Показана способность клеток возбудителей мелиоидоза и сапа элиминироваться из фагосом до слияния их с лизосомами и паразитировать в цитоплазме эукариотической клетки, уклоняясь от воздействия лизосомальных факторов.

7. Выявлено, что возбудители мелиоидоза и сапа не блокируют процесс слияния фагосом, содержащих эти микроорганизмы, с лизосомами фагоцитов макроорганизма. Вместе с тем, В. pseudomallei и В. mallei вследствие синтеза защитной капсулы, проявляют высокую устойчивость к лити-ческому действию лизосомальных ферментов за счет недоступности их к клеточной стенке бактерий.

8. Показано, что B.pseudomallei и В.mallei являются факультативными внутриклеточными паразитами. Эти возбудители проявляют направленную тропность, успешно паразитируя как в «профессиональных» фагоцитах -мононуклеарных фагоцитах, полиморфноядерных лейкоцитах, так и в клетках из группы «непрофессиональных» фагоцитов - эндотелиальных клетках капилляров, ретикулярных клетках селезенки и лимфатических узлов, а также в альвеолоцитах. Эти «клетки-мишени» при мелиоидозе и выступают в роли своеобразной экологической микрониши парази

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди представителей рода Burkholderia для современной инфектоло-гии особый интерес представляют возбудители мелиоидоза и сапа. Этот факт объясняется, с одной стороны, их высокой опасностью для человека и некоторых животных (11, 67, 101, 130, 170, 250, 347, 297, 398), а с другой - в силу недостаточного внимания со стороны медицинской общественности и их ма-лоизученностью.

На современном этапе география мелиоидоза вышла за традиционные рамки. Случаи этой особо опасной болезни зарегистрированы в Европе, Северной и Южной Америке, Китае (144, 181, 182, 231, 323).

Нозоареал сапа за прошедшие десятилетия значительно сузился, однако эта болезнь продолжает отмечаться в Иране, Монголии, Турции, Италии (11, 101, 189).

В связи с развитием процессов глобализации и всесторонней международной экономической интеграцией значительно возрастает возможность заноса мелиоидоза и сапа на территорию Российской Федерации. Существуют реальные условия для заболевания мелиоидозом и сапом граждан нашей страны, прибывших из эндемичных регионов, и формирования вторичных очагов этих инфекций.

Отдельно следует отметить, что В. pseudomallei и В. mallei рассматриваются в последнее время как потенциальные агенты при проведении биотеррористических актов (27,188, 270, 386).

Кроме В. pseudomallei и В. mallei для практической медицины представляет определенный интерес В. cepacia - микроорганизм, способный вызывать внутрибольничные инфекции, отличающийся устойчивостью к антибактериальным препаратам (11, 107, 234).

С учетом вышеизложенного возникает необходимость более глубокого изучения биологии возбудителей мелиоидоза, сапа, В.cepacia и, в частности, вопросов, связанных с особенностями поведения данных микробов в процессе их взаимодействия с макроорганизмом.

Основой любой инфекции является особая форма симбиоза микробов и клеток - мишеней макроорганизма, которая позволяет рассматривать взаимодействие макро- и микроорганизмов в инфекционном процессе как систему макроорганизм - микроб, интегрирующую все свойства этих двух начал (4, 113). Хотя в течении инфекционных процессов, вызываемых разными микробами, есть некоторые общие черты, весьма важны те отличительные особенности, которые характерны для определенных паразитов. Эти конкретные особенности, заданные индивидуальными биологическими свойствами микроорганизма, дают ключ для понимания патогенеза конкретного заболевания и являются отправной точкой при разработке подходов к профилактике и лечению. Исходя из этого, имеет большое практическое значение знание о строении возбудителя и особенностях его взаимодействия с макроорганизмом на различных стадиях инфекционного процесса.

Немногочисленные исследования, посвященные ультраструктуре и аспектам взаимодействия возбудителей мелиоидоза и сапа с клетками макроорганизма, носят отрывочный характер и проведены, как правило, in vitro. Настоящая работа была предпринята с целью выполнения системного изучения морфологических структур В. pseudomallei, В. mallei in vitro и in vivo в сравнительном аспекте, а также выяснения функционального назначения выявленных структур в процессе взаимодействия этих возбудителей с организмом хозяина при развитии инфекции.

Выполненные нами исследования показали, что на ультратонких срезах неповрежденные мелиоидозные бактерии как высоковирулентных штаммов, так и штаммов с низкой вирулентностью, выращенные при стандартных условиях in vitro, имели ультраструктуру, в целом типичную для грамотрица-тельных микроорганизмов. Клеточная стенка В. pseudomallei была представлена наружной трехслойной мембраной, толщиной 8 нм, имеющей умеренно извилистый профиль, и пептидогликановым слоем, шириной до 3,5 нм, за которым следовало периплазматическое пространство. Протопласт возбудителя, состоящий из цитоплазмы и центрально расположенной зоны нуклеоида, был заключен в цитоплазматическую мембрану. Размеры бактерий колебались в пределах - длина 2-5 мкм, толщина 0,3-0,7 мкм.

Необходимо отметить, что, несмотря на общестатистические параметры, о которых говорилось выше, для возбудителя мелиоидоза характерна гетерогенность популяции даже в пределах одного штамма. Данный факт говорит о высокой пластичности и адаптационных возможностях этого вида к условиям среды обитания.

К поверхностным структурам, принимающим участие в процессах адгезии, у возбудителя мелиоидоза относятся фимбрии. Данные образования представляли собой перитрихиально расположенные нити, которые по морфологии и локализации соответствуют фимбриям I типа по классификации Brinton (157). Толщина фимбрий этого типа 7 нм, длина - до 2 мкм. Количество таких фимбрий составляет 100 и более на клетку. Общее количество особей, обладающих способностью к пилеобразованию, колеблется у разных штаммов и не превышает 2-3%.

Из других выявленных поверхностных образований у В. pseudomallei следует отметить жгутики. Как правило, они выявляются на одном из полюсов, их количество составляет от 1 до 6 на клетку, в редких случаях больше. Иногда жгутики формируются на обоих полюсах клетки. В таких случаях размеры бактерий и образующаяся перетяжка в средней части дают основание считать, что формирование жгутиков предшествует делению клетки или происходит одновременно с ним.

При использовании окраски мазков культур В. pseudomallei по методу Бурри нам удалось выявить внеклеточное образование в виде светлого ореола толщиной до 0,5 мкм с четкой наружной границей. Электронно-микроскопическое исследование целых клеток мелиоидоза методом негативного контрастирования также показало наличие у части особей на поверхности клеточной стенки экстрацеллюлярной структуры в виде капсульного покрова толщиной до 0,5 мкм, представленной зернистым материалом. На ультратонких срезах у бактерий мелиоидоза на наружной мембране определялся слой капсульного вещества толщиной до 70 нм. Последний факт свидетельствует о том, что капсульное вещество у В. pseudomallei представлено оводненным материалом, который значительно уплотняется в процессе дегидратации препаратов при подготовке к электронной микроскопии.

В случае постановки электронно-цитохимической реакции со специфическим маркером кислых полисахаридов рутениевым красным (29), который позволяет успешно выявлять на ультратонких срезах полисахаридные капсулы у таких капсулообразующих бактерий, как Klebsiella pneumoniae и Diplococcus pneumoniae (361), нам удалось стабилизировать морфологическую структуру капсулы у возбудителя мелиоидоза. Так, в начале стационарной фазы роста капсула у бактерий обладала выраженными размерами (более 200 нм) и выглядела как электронно-плотная «бахрома», прилегающая непосредственно к наружной мембране клеточной стенки. При этом разрыхленные поверхностные слои капсульного вещества легко отрывались, заполняя межклеточное пространство. Описанный процесс, связанный с капсулопро-дукцией, очевидно, является объяснением известного феномена слизеобразо-вания у возбудителя мелиоидоза (67, 89).

Для доказательства бактериальной природы капсулы у В. pseudomallei мы проводили обработку инкапсулированных бактерий мелиоидоза меченными пероксидазой иммуноглобулинами кролика, полученными против целых клеток В. pseudomallei и В. mallei. Было установлено, что в обоих случаях метка рыхло откладывалась на поверхности возбудителя мелиоидоза, усиливая контрастность его капсулы. Эти данные также свидетельствуют о том, что общие поверхностные антигены у мелиоидозных и сапных микробов входят в состав капсулы В. pseudomallei.

Отмеченное усиление в несколько раз капсулопродукции у возбудителя мелиоидоза при росте на сывороточных средах является подтверждением значимости феномена капсулообразования как одного из факторов защиты микробной клетки от воздействия неблагоприятной среды обитания.

Таким образом, на основании вышеизложенных морфофункциональ-ных свойств (наличие определенной структуры, размеров, сопоставимых с диаметром бактериальной клетки, прочной связи с клеточной стенкой, усиления процесса капсулообразования при росте на сывороточных средах) выявленное in vitro структурное образование на поверхности клеточной стенки В. pseudomallei является капсулой. На основании электронно-цитохимического исследования основу капсульного вещества возбудителя мелиоидоза составляют полисахаридные биополимеры.

Также была исследована в сравнительном аспекте с В. pseudomallei ультраструктура В. cepacia, которая впервые была открыта в 1949 г. микробиологом Walter Burkholder как фитопатогенный паразит. В честь этого автора и получил современное название исследуемый нами род микроорганизмов (159).

Изучение культур В. cepacia в ультратонких срезах показало, что данные бактерии имеют субмикроскопическое строение, подобное возбудителю мелиоидоза. Применение электронно-цитохимической реакции с рутениевым красным позволило обнаружить на поверхности наружной мембраны клеточной стенки отложение рутений - позитивного материала в виде «бахромки» толщиной до 200 нм.

При культивировании В. cepacia на сывороточных средах отмечено увеличение инкапсулированных особей в несколько раз.

С учетом ряда вышеописанных признаков — морфологическая очерчен-ность, определенные размеры, прочная связь с клеточной стенкой - поверхностное образование у В. cepacia можно отнести к разряду капсул. По данным цитохимии, основу капсульного вещества у этого микроорганизма составляют полисахаридные биополимеры.

Наряду с капсулой из поверхностных образований у В. cepacia обнаружен локомоторный аппарат, представленный полярно расположенными жгутиками, а также перитрихиально расположенные фимбрии в количестве около ста на одну особь, которые по морфологии и локализации соответствуют фимбриям I типа по классификации Brinton (157).

На основании проведенного ультраструктурного анализа можно сказать, что В. pseudomallei и В. cepacia имеют сложную ультраструктурную организацию, в целом характерную для грамотрицательных бактерий. Названные микроорганизмы способны формировать ряд клеточных органелл - фимбрии, жгутики, а также капсулу. Выявленные поверхностные образования наряду с другими факторами, очевидно, позволяют этим микробам оптимально существовать как во внешней среде, так и в условиях макроорганизма.

Поскольку адгезивные свойства микроорганизмов во многом определяют начальные этапы взаимодействия с клетками макроорганизма и характеризуются, в частности, такими факторами, как лигандрецепторное связывание, различные силы притяжения и отталкивания: ван-дер-ваальсовы силы, силы электростатического взаимодействия, водородные связи и гидрофобные силы (37, 38, 202, 260, 304, 305), нами была сделана попытка установить зависимость между способностью В. pseudomallei адгезироваться к некоторым органическим субстратам и наличием у бактерий определенных поверхностных образований. В связи с этим у возбудителя мелиоидоза были исследованы гидрофобные свойства в тесте адгезии к гексадекану, в тесте агглютинации латекса, а также адгезивные свойства в реакции гемагглютинации.

Показано, что возбудитель мелиоидоза обладает низкими гидрофобными свойствами, что обусловило слабую адгезию его по отношению к гексадекану и в тесте латекс-агглютинации. Так как гидрофобные свойства бактермальных клеток, по данным ряда авторов (363, 397), обусловлены фим-бриями, мы попытались обогатить популяцию мелиоидозных бактерий особями с повышенной гидрофобностью путем адгезии на гексадекане с последующим подращиванием адсорбированных клеток. Электронно-микроскопическое исследование полученной субкультуры выявило повышение числа клеток, обладающих фимбриями, до 10%. Одновременно происходило и увеличение числа клеток, имеющих жгутики, поэтому дифференцировка свойств, обусловленных каждой из этих структур, затруднена. К тому же диссоциативные процессы быстро приводят селекционированную культуру в исходное состояние. Вместе с тем было установлено, что в образцах с отрицательной реакцией агглютинации латекса фимбрии у В. pseudomallei встречались лишь эпизодически, тогда как капсула более часто.

Гемагглютинирующую активность в незначительной степени и непостоянно проявляли только некоторые штаммы возбудителя мелиоидоза с эритроцитами морских свинок и белых крыс.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о слабой гидро-фобности поверхности В. pseudomallei, которая обусловлена фимбриями и жгутиками. А фактором, определяющим гидрофильные свойства возбудителя мелиоидоза, является капсула.

Касаясь современных представлений о морфологии возбудителя сапа, следует отметить, что этот облигатный паразит из рода Burkholderia в целом имеет ультраструктурную организацию, аналогичную В. pseudomallei и В. cepacia, о которой говорилось выше.

Однако, в отличие от В. pseudomallei и В. cepacia, у возбудителя сапа не удалось обнаружить фимбрий, а также жгутикового аппарата, ответственного за подвижность прокариотов.

При изучении в электронном микроскопе методом негативного контрастирования целых клеток В. mallei у 5-10% особей на поверхности клеточной стенки была обнаружена поверхностная структура в виде капсульного слоя толщиной до 300 нм, представленная зернистым материалом умеренной электронной плотности.

Использование рутениевого красного в качестве специфического маркера кислых полисахаридов (361) позволило стабилизировать морфологическую структуру капсулы у возбудителя сапа. Вне зависимости от вирулентности штаммов у 3-5% особей выявлялась капсула, представленная электронно-плотной «бахромой» толщиной до 250 нм.

Как показали исследования, в случае выращивания возбудителя сапа на сывороточных средах наблюдалась интенсификация капсулообразования, что подтверждает защитную роль капсулы у В. mallei от воздействия гуморальных факторов макроорганизма.

Для подтверждения бактериального происхождения капсульного вещества инкапсулированные бактерии сапа обрабатывали меченными пероксида-зой иммуноглобулинами кролика, полученными против целых клеток как В. mallei так и B.pseudomallei. В результате электронно-иммуноцитохимической реакции в обоих случаях наблюдалось резкое повышение контрастности капсулы возбудителя сапа. Это также указывает на наличие в капсуле В. mallei общих поверхностных антигенов возбудителей сапа и мелиоидоза.

Вышеназванные морфологические свойства (наличие определенной структуры и размеров, прочной связи с клеточной стенкой), а также данные иммуноцитохимической реакции подтверждают, что выявленное структурное образование на поверхности клеточной стенки В. mallei является истинной капсулой, а основу капсульного вещества, по данным электронной цитохимии, составляют полисахаридные биополимеры.

Описанные особенности ультраструктурной организации возбудителей мелиоидоза, сапа и В. cepacia связаны с адаптацией к среде обитания этих микроорганизмов. Так, отсутствие аппарата подвижности и неспособность к пилеобразованию у В. mallei обусловлено его облигатным паразитизмом. Единственным поверхностным образованием, позволяющим возбудителю сапа успешно переживать в организме хозяина, является капсула. В отличие от В. mallei возбудитель мелиоидоза и В. cepacia обитают преимущественно во «внешней» среде, где наличие жгутикового аппарата и фимбрий обеспечивает данным микроорганизмам способность лучше приспосабливаться к таким условиям существования. Наряду с этим В. pseudomallei является факультативным паразитом, способным вызывать тяжелые заболевания у человека и животных. При этом образуемая у него капсула позволяет, в случае попадания бактерий в макроорганизм, противостоять факторам защиты хозяина.

С целью уточнения природы полимеров (антигенов), входящих в состав капсульной субстанции возбудителей мелиоидоза и сапа, был использован электронно-иммуноцитохимический метод. При обработке бактерий мелиоидоза и сапа, культивируемых in vitro и полученных из перитонеального экссудата, меченными ферритином иммуноглобулинами кролика, полученными против кислого экзополисахарида установлено, что метка рыхло откладывалась на поверхности обоих прокариотов, усиливая контрастность их капсул. На бескапсульных особях данная метка не выявлялась. Эти данные свидетельствуют о присутствии в составе капсул В. pseudomallei и В. mallei общего поверхностного антигена полисахаридной природы. Использование непрямого иммунопероксидазного метода для электронной иммуноцитохи-мии с моноклональными антителами Gl 1 и 1G2, направленными против эпи-топов гликопротеина м.м. 200 kD возбудителей сапа и мелиоидоза, показало, что пероксидазная метка обильно фиксировалась на поверхности клеточной стенки обоих прокариотов, образуя выраженный капсульный покров. В отличие от В. pseudomallei и В. mallei использование указанных моноклональных антител для выявления поверхностных структур у В. cepacia дало отрицательный результат.

Следовательно гликопротеин м.м. 200 kD является одним из структурообразующих биополимеров капсульной субстанции В. pseudomallei и В. mallei, представляя собой общий капсульный антиген возбудителей мелиоидоза и сапа, подчеркивая тем самым высокое родство данных микроорганизмов.

Для изучения химической природы капсульного вещества В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia был предложен метод отмывания нативных, предварительно очищенных от слизи, бактериальных клеток в буферной системе с последующим исследованием капсульной субстанции в ДСН-ПААГ электрофорезе с дифференциальной окраской геля. Анализ показал, что кап-сульное вещество исследуемых буркхольдерий представляет собой гетеропо-лимерный комплекс, состоящий из протеинов (18-70 kD), гликопротеинов (90-200 kD) и липопротеинов (18-20 kD). Особенностью штаммов В.mallei, по сравнению с В. pseudomallei и В. cepacia, было снижение содержания поли-сахаридных и гликопротеиновых компонентов капсульной субстанции. В случае выращивания данных микроорганизмов на сывороточных средах отмечалась гиперпродукция полисахаридного и гликопротеинового комплексов капсульной субстанции и, в частности, гликопротеина м.м. 200 kD.

Гель-хроматография капсульного вещества В. pseudomallei позволила получить 4 фракции (МК-1, МК-2, МК-З и МК-4), а у В. mallei - 2 фракции (СК-1 и СК-2). По данным реакции двойной иммунодиффузии, антиген 8 присутствовал, в основном, в первых фракциях капсульного вещества возбудителей мелиоидоза и сапа.

Характеристика капсульных фракций В. pseudomallei, по данным ДСН-ПААГ электрофореза, показала, что фракция МК-1 имела наиболее комплексный биополимерный состав, представленный гликопротеинами (200, 150-90, 75 kD), белковыми компонентами (39, 25, 20, 18 kD), а также фрагментами ЛПС (120-80 и 70-50 kD). Фракция МК-2, имея в целом сходный биополимерный состав с МК-1, отличалась от последней присутствием мажорного низкомолекулярного белка 15 kD. Фракция МК-З содержала наибольшее количество белков, особенно протеинов 45-30 kD. Препарат МК-4 содержал белки 48, 45 и 20 kD. Хроматографические фракции СК-1 и СК-2 капсульного вещества возбудителя сапа имели сходный биополимерный состав с фракциями МК-1 и МК-2 В. pseudomallei, что в определенной мере говорит о высоком родстве этих микроорганизмов.

Изучение иммунобиологических свойств капсульной субстанции возбудителя мелиоидоза показало, что подавляющее большинство изученных фракций (МК-1, МК-2, МК-3) стимулировали гуморальный иммунитет и фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей. Вместе с тем, данные антигены снижали уровень формирования ГЗТ, причем введение препарата МК-1 приводило к существенному снижению индекса реакции ГЗТ. Мелиоидозный капсульный антиген МК-4 интенсивно угнетал фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов, не оказывая при этом заметного влияния на гуморальный иммунитет.

Исследование иммунотропных свойств капсульного вещества возбудителя сапа выявило, что фракция СК-1 угнетала клеточный и гуморальный иммунитет у белых мышей. Препарат СК-2 В. mallei оказывал стимулирующее влияние на уровень антителообразующих клеток в селезенке. Данный антиген способствовал усилению фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов белых мышей.

Необходимо отметить, что выявленная способность первых фракций капсульного вещества В. pseudomallei и В. mallei к угнетению реакции гиперчувствительности замедленного типа, на наш взгляд, является одним из ключевых моментов в понимании патогенеза мелиоидоза и сапа, поскольку для эффективного уничтожения факультативных внутриклеточных паразитов, к которым относятся возбудители мелиоидоза и сапа (67, 89, 101), требуется развитие именно иммунологической реакции гиперчувствительности замедленного типа (241).

Таким образом, подтверждается функциональная значимость капсулы у В. pseudomallei и В. mallei как фактора патогенности. Фракция МК-4 капсульного вещества возбудителя мелиоидоза и фракция СК-1 возбудителя сапа обладают иммуиодепрессирующими свойствами, что обеспечивает защиту инкапсулированных микробных клеток при инвазии макроорганизма. В тоже время биополимеры, составляющие фракции МК-2, МК-3 и СК-2 проявляют иммуномодулирующие свойства.

Поскольку у ряда патогенных микроорганизмов генетическая детерминация признака капсулообразования опосредована плазмидными репликона-ми (62, 78, 152, 221, 376), мы исследовали влияние плазмид на феномен капсулообразования у возбудителей мелиоидоза и сапа.

Проведенные исследования по плазмидному анализу изучаемых штаммов В. pseudomallei и В. mallei показали, что многие культуры возбудителя мелиоидоза, независимо от источника получения и срока хранения, содержали плазмидные репликоны с различной молекулярной массой, которые были обозначены: pPMl, рСМ2, рСМЗ и рСМ4, тогда как у возбудителя сапа, являющегося таксономически близкородственным микроорганизмом В. pseudomallei, плазмид обнаружить не удалось (67, 101).

При изучении признака капсулообразования как in vitro, так и in vivo были исследованы как плазмидсодержащие штаммы В. pseudomallei: 111(рСМ2); 56812 (pPMl); 110 (рСМ4), так и бесплазмидные штаммы: С-141, 108, 97 возбудителя мелиоидоза, а также типичные штаммы В. mallei: 10230, Ц-5, В-120. С помощью электронно-микроскопического исследования было выявлено образование капсулы у всех вышеназванных штаммов возбудителей мелиоидоза и сапа, вне зависимости от наличия или отсутствия у них плазмидной ДНК. Эти факты позволили придти к заключению, что феномен капсулообразования у В. pseudomallei не связан с плазмидной детерминацией.

Для понимания патогенеза любой инфекции весьма важно знать особенности строения возбудителя не только in vitro, но, что особенно важно, in vivo (20).

С этой целью было проведено электронно-микроскопическое исследование препаратов (перитонеальный и бронхолегочный экссудаты), полученных от экспериментальных животных в первые часы после внутрибрюшин-ного и интраназального заражения изучаемыми штаммами В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia. Установлено, что интактные микробы, расположенные вне клеток макроорганизма, наряду со схожими общими чертами строения с агаровой культурой имели ряд отличий, которые, прежде всего, касались поверхностных структур возбудителя. Среди них можно было выделить два морфологических варианта, различающихся по ультраструктурной организации. На ультратонких срезах бактерии первого (бескапсульного) морфологического варианта имели типичное для грамотрицательных микробов строение. Клетки второго (капсульного) морфологического варианта В. mallei, а также В. cepacia, отличались от предшествующего наличием поверхностного образования, равномерно окружающего бактериальную клетку. Данное образование было прочно связано с телом прокариота и имело слоистое строение: первый узкий слой, прилегающий непосредственно к наружной мембране клеточной стенки, был электронно-прозрачным, второй - электронно-плотным в виде бахромки шириной до 150 нм. Второй морфологический вариант В. pseudomallei, в отличие от второго варианта В. mallei и В. cepacia, имел трехслойное строение поверхностного образования общей толщиной до 0,3 мкм. Первые два слоя у возбудителя мелиоидоза были подобны таковым у возбудителей сапа и В.cepacia, а третий - наружный, наиболее массивный слой, состоял из радиально отходящих, переплетающихся фибрилл и зернистого, умеренно электронно-плотного материала с разрежением к периферии.

При световой микроскопии, с окраской по методу Бурри предварительно отмытых центрифугированием препаратов, полученных от животных, у В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia также было обнаружено внеклеточное образование в виде светлого ореола размером от 0,2 до 0,5 мкм с четкой наружной границей, равномерно окружающее тело микроба, окрашенного в темно-синий цвет.

Известно, что возбудители мелиоидоза и сапа при росте на питательных средах продуцируют слабосвязанную с клеточной стенкой слизь (11, 33, 154). В современной литературе вопрос разграничения между капсулами и слизистыми слоями, синтезируемыми микроорганизмами, освещается следующим образом. Если слизистый слой досаточно толст, прочен, имеет определенную форму и концентрируется вокруг бактериальной клетки, то его называют капсулой (73). Близкое по значению определение дает Кац (56): капсула - это самостоятельный полифункциональный органоид бактериальной клетки, образующийся лишь при определенных условиях культивирования, достаточно прочно связанный с клеточной стенкой и четко ограниченный с поверхности. Поскольку в нашем исследовании применялась двойная глютаральдегидноосмиевая фиксация с последующей традиционной обработкой материала для трансмиссионной электронной микроскопии, которая приводит к потере слизистых покровов бактериальными клетками, то выявленное у возбудителей мелиоидоза, сапа и В. cepacia поверхностное образование не является слизистым слоем. Следовательно, исходя из приведенных выше определений и полученных результатов, можно считать, что внеклеточное образование у В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia, сформированное в макроорганизме, является капсулой.

Поскольку капсулы у второго морфологического варианта возбудителей мелиоидоза, сапа и В. cepacia имеют определенную структуру, не разрушающуюся при жестких условиях подготовки материала к электронной микроскопии, а также значительные размеры (0,2-0,5 мкм), их скорее можно отнести к истинно бактериальным образованиям, нежели объяснить феноменом сорбции компонентов макроорганизма на поверхности клеточной стенки микробов. Капсулоподобиые покровы, сформированные за счет сорбирования компонентов макроорганизма, как правило, имеют аморфную структуру размером не более 50 нм и их образование не характерно для грамотрица-тельных бактерий (22, 23). Заключение о формировании капсулы у В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia подтверждается и тем, что при введении животным предварительно убитых глутаральдегидом бактерий на их поверхности откладывался аморфный зернистый слой толщиной до 5-40 нм, не имеющий определённой структуры образуемой живым возбудителем.

Применение электронно-цитохимического и электронно-иммуноцито-химического методов позволило получить дополнительные данные о строении и качественном составе капсулы возбудителя мелиоидоза, сапа и В. cepacia, образуемой в организме хозяина. Для решения этих вопросов нами была использована способность рутениевого красного избирательно контрастировать полисахаридсодержащие комплексы (29). Исследование ультратонких срезов инкапсулированных бактерий позволило выявить рутенийпо-зитивные биополимеры, которые формировали в составе капсулы слои, равномерно окружающие тело прокариота. Так, у возбудителя мелиоидоза внутренний слой, обращенный к клеточной стенке и отстающий от нее на 10 нм, выглядел как электронно-плотная «бахрома». Наружный, наиболее широкий до, 250 нм, слой был представлен зернами рутенийпозитивного материала, которые, сливаясь, образовывали «лучи», отходящие непосредственно от внутреннего слоя. Бактерии В. mallei и В. cepacia обладали, как правило, лишь одним внутренним слоем рутенийпозитивного материала.

Таким образом, использование рутениевого красного, являющегося специфическим маркером кислых полисахаридов, выявило усиление слоистости в строении капсулы и показало, что основу капсульного вещества возбудителей мелиоидоза, сапа и В. cepacia составляют полисахаридные биополимеры.

Если избирательное контрастирование слоев капсулы рутениевым красным указывает на их преимущественную полисахаридную природу, то контрастирование с помощью пероксидазо- и ферритинмеченных антител свидетельствует об антигенной специфичности выявляемых объектов. Так, обработка бактерий мелиоидоза и сапа, имеющих капсулу, меченными фер-ритином или пероксидазой хрена иммуноглобулинами кролика, полученными как против целых бактериальных клеток, так и против экзополисахарида слизи возбудителя мелиоидоза, показала, что метка обнаруживалась на поверхности обоих прокариотов, усиливая контрастность их капсул. Метка также выявлялась на поверхности клеточной стенки бескапсульных форм этих возбудителей. Полученные данные свидетельствуют о наличии однотипных антигенных детерминант, расположенных на поверхности, как клеточной стенки бактерий, так и капсулы возбудителей. Эти данные, с одной стороны, доказывают истинно бактериальную природу капсульного вещества, а с другой, говорят о том, что общие поверхностные антигены у мелиоидозных и сапных микробов входят, в основном, в состав капсульного вещества этих микроорганизмов.

Анализ соотношения бескапсульного и капсульного морфологических вариантов В. pseudomallei и В. mallei в перитонеальном экссудате морских свинок в динамике развития инфекции показал, что уже к 3 часу взаимодействия вне соматических клеток преобладал капсульный вариант, а к 6 часу встречались единичные, в основном капсульные особи этих микроорганизмов. Значительное уменьшение количества находящихся вне фагоцитов бактерий мелиоидоза и сапа к 6 часу, по-видимому, можно объяснить как фагоцитозом микробов, так и проникновением возбудителей из брюшной полости в кровеносное русло (28), а относительное увеличение в экссудате процента капсульных форм говорит об их устойчивости к фагоцитозу.

Поскольку одним из определяющих моментов при взаимодействии микроорганизма с клеткой макроорганизма является процесс опсонизации, который делает инородный объект легко узнаваемым для защитной клетки макроорганизма, было проведено исследование на наличие или отсутствие опсонинов на капсульных и бескапсульных вариантах В. pseudomallei и В. mallei in vivo. Изучение материала, полученного в первые минуты и часы после введения исследуемых возбудителей в брюшную полость морских свинок, показало, что меченные ферритином антивидовые иммуноглобулины, полученные против нормальной сыворотки морской свинки, т.е. хозяина, выявлялись на поверхности бескапсульных бактерий мелиоидоза и сапа, располагаясь тонким слоем по всей поверхности микробной клетки. В зоне устойчивого взаимодействия бескапсульных бактерий с цитоплазматической мембраной фагоцита также определялась ферритиновая метка. У возбудителей мелиоидоза и сапа, обладающих капсулой, ферритиновая метка откладывалась рыхло только на поверхностных слоях капсулы. При этом наблюдался неустойчивый контакт капсульных форм бактерий с плазмолеммой фагоцита. В данном случае ферритиновая метка, соответствующая опсонинам, отрывалась с поверхностными фрагментами капсульного вещества В. pseudomallei и В. mallei, оставаясь на поверхности фагоцита, не приводя к устойчивой фиксации и захвату возбудителей.

Участие капсулы В. pseudomallei и В. mallei в преодолении первых двух стадий фагоцитарного процесса - стадии узнавания и стадии поглощения согласуются с тем, что при электронно-микроскопическом исследовании перитонеального и бронхоальвеолярного экссудатов фагоцитозу подвергались преимущественно бескапсульные формы этих возбудителей, составляя к 0,51 ч после внутрибрюшинного или интраназального заражения более 80-90% от общего числа поглощенных макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами бактерий. Значительно реже наблюдался фагоцитоз второго (капсульного) морфологического варианта. Количество таких микробов в защитной клетке хозяина составляло менее 20%. При этом поглощение возбудителей осуществлялось при помощи активного захвата бактериальной клетки псевдоподиями фагоцита, в процессе которого не было отмечено тесного контакта между поверхностными структурами капсулы и цитоплазматиче-ской мембраной клетки-хозяина, что имело место при фагоцитозе бескапсул ьных вариантов.

Из приведенного материала становится очевидным, что капсула у В. pseudomallei и В. mallei, формируемая in vivo, позволяет патогенам избегать такого важного элемента защиты хозяина, как фагоцитоз. При этом фагоци-табельность паразитов находится в обратной зависимости от размеров капсулы.

Необходимо отметить, что вышеописанные начальные этапы взаимодействия В. pseudomallei и В. mallei с фагоцитирующими клетками макроорганизма (адгезия, поглощение) были однотипными.

Способы защиты от завершенного фагоцитоза при мелиоидозной и сапной инфекциях недостаточно изучены, хотя для многих возбудителей болезней, являющихся облигатными или факультативными внутриклеточными паразитами, эта стадия фагоцитоза имеет решающее значение (38, 96, 128, 146). Детерминанты патогенности, обеспечивающие микробам сапа и мелиоидоза внутриклеточное выживание, мало исследованы, а именно от них в определенной мере зависит судьба возбудителя в клетке макроорганизма.

В одних случаях уже через 0,5-1 час от начала взаимодействия возбудителя с фагоцитами на электронограммах обнаруживалась деструкция в мембране первичных фагосом, за которой следовал выход паразита в цито-золь клетки. Причем это происходило, как правило, до слияния парази-тофорных вакуолей с лизосомами. Такая картина наблюдалась чаще в случае заражения животных более вирулентными штаммами возбудителей мелиоидоза и сапа. Паразитируя в дальнейшем в цитоплазме фагоцитов, такие бактерии, как правило, имели нормальную ультраструктуру и формировали вокруг своего тела равномерную, четкую зону, хорошо проницаемую для электронов, толщиной до 200-300 нм. Описанный механизм, позволяющий В. pseudomallei и В. mallei избежать воздействия лизосомального содержимого является характерным для ряда внутриклеточных паразитов (204, 288, 348, 387, 392). Механизм разрушения мембран фагосом в этом случае точно не известен. Установлено, например, что R.prowazekii вызывает гемолиз после контакта риккетсии с эритроцитом (7). Возбудитель мелиоидоза также проявляет гемолитическую активность и вместе с возбудителем сапа способен к продукции ряда протеолитических ферментов (67, 101, 136, 154). Возможно, что подобный механизм, связанный с контактным цитолизом, обеспечивает В. pseudomallei и В. mallei лизис мембран фагоцита. Проникнув в цитоплазму клетки, мелиоидозные и сапные бактерии получают богатый источник субстратов для энергии и биосинтеза макромолекул и в то же время оказываются защищенными клеткой хозяина от бактерицидных механизмов макроорганизма.

В других случаях на электронограммах можно было видеть, что часть мелиоидозных и сапных микробов не покидала первичных фагосом. Это характернее было для возбудителя сапа, а также для менее вирулентных штаммов В. pseudomallei. В таких случаях уже на ранних сроках наблюдения - 0,51 час с помощью индикации лизосомального маркера - кислой фосфатазы, а также электронно-плотного трасера - ферритина выявлялся процесс слияния фагосом, содержащих как В. pseudomallei, так и В. mallei, с лизосомами. При этом интенсивность образования таких фаголизосом, как правило, не зависела от вирулентности возбудителя. В дальнейшем часть бактерий, преимущественно в случае заражения животных менее вирулентными штаммами, подвергалась деструкции в фаголизосомах, тогда как при использовании более вирулентных штаммов у бактерий чаще отмечалась способность к переживанию в них. В последнем случае между поверхностью клеточной стенки прокариота и содержимым фаголизосомы определялась четкая зона, хорошо проницаемая для электронов, толщиной до 250 нм, заполненная в ряде случаев мелкозернистым материалом. Подобные электронно-прозрачные зоны были обнаружены в случае внутриклеточного паразитирования у ряда капсуло-образующих патогенных бактерий. Так, Sibley et al. (354, 355), изучая особенности паразитирования в клетках хозяина патогенных штаммов микобак-терий, обнаружили вокруг микробов широкие, характерные зоны, хорошо проницаемые для электронов. С помощью разных способов фиксации, заливки и проведения иммуноцитохимического окрашивания они убедились в том, что электронно-прозрачные зоны не являются артефактом, а представляют собой защитную капсулу. Исходя из сказанного, а также учитывая описанную выше способность у В. pseudomallei и В. mallei формировать капсулу, мы пришли к заключению, что выявляемая вокруг паразитов при их развитии как свободно в цитоплазме, так и в фаголизосомах зона, хорошо проницаемая для электронов, соответствует капсуле. Отсутствие четкого контрастирования капсулы на ультратонких срезах говорит о её, как и у большинства грамотри-цательных бактерий, преимущественно полисахаридной природе. Это было подтверждено нами в случае обработки внеклеточно расположенных инкапсулированных бактерий рутениевым красным.

Другим способом противостояния бактерицидному действию содержимого лизосом, возможно, является нарушение функции лизосомальных гидролаз с помощью протеиназ, синтезируемых возбудителями мелиоидоза и сапа (67, 86, 101, 352). Очевидно, этот механизм защиты имеет большое значение на начальных этапах формирования патогеном капсулы, когда она имеет еще минимальные размеры.

Динамика наблюдения за взаимодействием В. pseudomallei и В. mallei с макроорганизмом показала, что к концу первых суток в перитонеальном и бронхоальвеолярном экссудатах преобладали интактные инкапсулированные бактерии, обнаруживаемые в основном в фагоцитах. Микробы, у которых капсула отсутствовала или имела минимальные размеры, находились, как правило, на различных стадиях деградации. Это говорит о том, что в процессе внутриклеточного паразитирования происходит отбор капсульных форм бактерий, которые оказываются более жизнеспособными, чем бескап-сульные особи. Более высокую устойчивость высоковирулентных бактерий мелиоидоза и сапа мы также связываем с цитопатическим действием продуктов жизнедеятельности этих микроорганизмов, и в частности, продукцией ими ряда ферментов агрессии (11, 35, 67, 81, 87, 101). Об этом свидетельствует наличие характерных для данного явления морфологических изменений цитоплазматических компонентов фагоцита, которые выражаются в снижении количества свободных рибосом, везикуляции цитоплазмы, просветлении матрикса, набухании и дезорганизации крист митохондрий (122). При этом выраженность цитопатического эффекта на клетку-хозяина находится в прямой зависимости от интенсивности пролиферации в ней возбудителей мелиоидоза и сапа. Следовательно, размножение мелиоидозных микробов в фагоцитирующих клетках перитонеального и бронхоальвеолярного экссудатов в ряде случаев приводит к их гибели, то есть фагоцитирующая клетка in vivo в определенных условиях представляет В. pseudomallei и В. mallei возможность для их беспрепятственного размножения. Эти данные позволяют предположить, что возбудители мелиоидоза и сапа являются факультативными внутриклеточными паразитами и на ранней стадии заболевания, в период, предшествующий значительному антителообразованию, фагоциты, повидимому, представляют собой клетки-мишени, которые и участвуют в дис-семинации возбудителей в организме.

Таким образом, удалось установить следующие механизмы, позволяющие В. pseudomallei и В. mallei успешно паразитировать в клетках хозяина: это, прежде всего, способность возбудителя покидать фагосому до слияния с лизосомами и пролиферировать свободно в цитоплазме, а также возможность при своем внутриклеточном развитии формировать капсулу, которая делает эти патогены защищенными от бактерицидных систем макроорганизма. Феномен капсулообразования у В. pseudomallei и В. mallei является, на наш взгляд, одним из факторов патогенности.

Для понимания становления и развития системы «паразит-хозяин» недостаточно знания одних лишь факторов патогенности микроорганизма, направленных на выживание возбудителя in vivo. Необходимо оценивать и ответную реакцию макроорганизма на внедрение инфекционного агента. Существование в организме хозяина факультативных внутриклеточных паразитов, к которым относятся возбудители мелиоидоза и сапа, во многом зависит от киллерной активности клеточного звена иммунитета макроорганизма, в частности, от ферментативной активности клеток системы мононуклеарных фагоцитов и полиморфноядерных лейкоцитов.

С учетом вышесказанного были изучены активность одного из ферментов пуринового метаболизма фагоцитов - 5-нуклеотидазы, а также лизосо-мальных ферментов - катепсина Д и кислой фосфатазы. Функциональное состояние ПМЯЛ оценивали по активности миелопероксидазы - одного из ферментов микробиоцидной системы клетки, функционирование кислород-зависимого метаболизма изучали с помощью НСТ-теста, а кислороднезави-симого - БКБ-теста.

В результате проведенных экспериментов показано, что имеются различия в функционировании ферментных систем фагоцитов при инфекциях, вызываемых патогенными буркхольдериями: В. pseudomallei, В. mallei, В. сеpacia. Так установлено, что кислородзависимая цитоцидная активность фагоцитирующих клеток при остром экспериментальном мелиоидозе и сапе имеет фазный характер изменений с максимальным увеличением (респираторный "взрыв") к 6 ч. Одновременное снижение показателей антимикробного потенциала фагоцитов (тест восстановления НСТ, содержание бактерицидных катионных белков, активность лизосомальных ферментов) свидетельствует о неблагоприятном течении данных инфекций. Анализ биоцидной активности фагоцитов (кислородзависимые и кислороднезависимые пути метаболизма) при инфекции у мышей, вызванной В. cepacia, свидетельствовал об угнетении таковой. Характерно, что максимальный подъем кислородзависи-мой цитоцидной активности (респираторный «взрыв») при инфекции, вызванной В. cepacia, наступал в более поздние сроки в сравнении с мелиои-дозной и сапной инфекциями (на 1-2 сутки после заражения). Снижение содержания бактерицидных катионных белков было более выражено при остром мелиоидозе (в 7-10 раз ниже, чем в контроле), а при заражении мышей В.cepacia показатели не отличались от контрольных.

Выявленные различия в бактерицидной активности фагоцитов у мышей при острых инфекциях, вызванных В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia, по-видимому, непосредственно связаны с вирулентностью данных микроорганизмов. Полученные результаты согласуются с группировкой этих возбудителей по их особенностям патогенного воздействия на организм человека (11).

Выполненные патоморфологические исследования внутренних органов восприимчивых экспериментальных животных, зараженных В. pseudomallei и В. mallei, показали, что основным специфическим морфологическим субстратом острого и подострого мелиоидозного и сапного инфекционных процессов является гранулема. В зависимости от течения инфекционного процесса гранулемы имели экссудативный характер - в случае острого течения или преимущественно продуктивный - при переходе болезни в подострое течение. Данный морфологический субстрат выявлялся, как правило, в легких, селезенке, печени и лимфатических узлах. Следует отметить, что при мелио-идозе патологические процессы развивались несколько быстрее, чем при сапе. Различия в динамике проявления морфологических изменений в тканях при мелиоидозе и сапе, на наш взгляд, связаны с более быстрой адаптацией возбудителя мелиоидоза в макроорганизме по сравнению с возбудителем сапа. В отличие от В. pseudomallei и В. mallei, заражение экспериментальных животных различными штаммами В. cepacia не приводило к развитию инфекционного процесса.

С целью уточнения роли в патогенезе мелиоидоза высокомолекулярного гликопротеинового антигена 8 (первой фракции капсульного вещества B.pseudomallei), было проведено патоморфологическое и электронно-микроскопическое исследования внутренних органов экспериментальных животных (белые крысы), которых заражали аэрогенно по запатентованному нами методу вирулентным штаммом B.pseudomallei 100 и штаммом В. pseudomallei 100-16-1 (не синтезирующий Аг 8 и авирулентный для белых крыс при подкожном заражении), а также при введении им аэрогенно препарата Аг 8 ме-лиоидозного микроба.

Изучение патоморфогенеза мелиоидоза, вызванного полноценным и дефектным по Аг 8 штаммами, показало значительное отличие в морфологи-гических проявлениях инфекции. При аэрогенном заражении белых крыс В. pseudomallei 100 генерализация инфекции с образованием множественных-специфических гранулём в лёгких, печени, селезёнке и гибель всех животных наступала на 5-7 день болезни. По данным электронно-микроскопического исследования поражённых участков лёгких возбудитель мелиоидоза паразитировал преимущественно в фагоцитах, альвеолоцитах и эндотелиоцитах капилляров, формируя при этом капсулу.

Особенности морфологических проявлений при аэрогенном заражении белых крыс В. pseudomallei 100-16-1 прежде всего выражались в отсутствии специфических гранулем в печени и селезенке. Воспалительные явления в легких характеризовались преобладанием продуктивных процессов над деструктивными и были направлены на отграничение и рассасывание очагов. Электронно-микроскопическое исследование пораженных участков легких показало, что основная масса В. pseudomallei 100-16-1 находилась в альвеолярных макрофагах, преимущественно в фаголизосомах, и имела признаки различных стадий деградации. Также для таких бактерий было характерно отсутствие процесса капсулообразования.

Изучение влияния очищенного высокомолекулярного капсульного антигена 8 на ткани и клетки макроорганизма при аэрогенном его введении установило отсутствие появления во внутренних органах экспериментальных животных специфических гранулем, характерных для мелиоидоза. Основная патология проявлялась в обратимых гемодинамических расстройствах и дистрофических процессах в паренхиматозных органах.

Эти данные свидетельствуют об определенной патогенетической роли исследуемого антигена 8 и подчеркивают его значимость как одного из основных структурных компонентов капсульного вещества возбудителя мелиоидоза.

Избирательное поселение в определенных органах и тканях является биологическим свойством многих микроорганизмов, обеспечивающим существование вида. В настоящее время принято говорить о тропизме патогенных микробов не только к отдельным органам и тканям, но также и к конкретным клеточным элементам организма (121).

Возбудители мелиоидоза и сапа, как известно, могут вызывать у людей и животных тяжелые заболевания, характеризующиеся септицемией с множественными некротическими поражениями преимущественно легких, печени, селезенки и лимфатических узлов, трудно поддающимися антибактериальной терапии (И, 67, 101, 346, 394). Однако вопросы о локализации этих патогенов и их взаимоотношения с клеточными элементами в инфицированных органах остаются на сегодняшний день малоизученными.

В результате электронно - микроскопического исследования ультратонких срезов поврежденных участков легких, печени, селезенки и лимфатических узлов, полученных от экспериментальных животных с острой и подо-строй формами как мелиоидозной, так и сапной инфекций, мы не обнаружили «прямого» поражения микробами паренхиматозных клеток, за исключением альвеолоцитов. Вместе с тем на фоне общей интоксикации в них развивались дистрофические изменения, которые в ряде случаев завершались некрозом. Другой особенностью мелиоидозной и сапной инфекций было то, что возбудитель обнаруживался в клетках макроорганизма, способных к фагоцитозу. Бактерии проявляли тропность и успешно паразитировали как в «профессиональных» фагоцитах (мононуклеарные фагоциты, полиморфнонукле-арные лейкоциты), так и в ряде клеток, которые относятся к группе «непрофессиональных» фагоцитов, в таких как эндотелиальные клетки капилляров, ретикулярные клетки селезенки и лимфатических узлов, а также в альвеоло-цитах. Указанные клетки, очевидно, являются клетками - «мишенями» при мелиоидозе и сапе, в которых и персистируют В. pseudomallei и В. mallei.

Поскольку вышеназванными клетками наиболее богаты легкие, печень, селезенка и лимфатические узлы, то становится понятным преимущественное поражение при мелиоидозе и сапе именно этих органов, объясняя схожесть патоморфологической картины и патогенеза данных инфекций, что нашло отражение в старом названии мелиоидоза - ложный сап.

Исследование в электронном микроскопе ультратонких срезов, поврежденных специфическим процессом участков легких, печени, селезенки и лимфатических узлов, полученных от морских свинок с подострым течением мелиоидоза и сапа, позволило выявить некоторые особенности персистенции штаммов В. pseudomallei и В. mallei с различной вирулентностью как вне, так и внутри клеток макроорганизма. Так, на 22-28 сут после заражения расположенные внеклеточно неповрежденные мелнондозные и сапные микробы определялись лишь там, где происходил распад клетки-хозяина на фоне выраженной внутриклеточной пролиферации возбудителя, что чаще наблюдалось в случае заражения животных более вирулентными штаммами В. pseudomallei и В. mallei. Данные бактерии имели типичную структуру. На поверхности клеточной стенки у некоторых особей можно было видеть остатки капсульного вещества. При обнаружении на срезе клетки макроорганизма единичных интактных паразитов, находящихся как в фагосомах, так и свободно в цитоплазме, мы не видели какой-либо значительной патологии со стороны ультрастуктур клетки хозяина. В таких случаях, очевидно, наступало своеобразное биологическое равновесие во взаимоотношении в системе паразит-хозяин, позволяющее патогену длительно персистировать в клетке макроорганизма.

Во всех случаях внутриклеточного паразитирования вокруг каждой ин-тактной бактериальной клетки выявлялась четкая зона, хорошо проницаемая для электронов, шириной от 120 до 300 нм, соответствующая капсуле возбудителей мелиоидоза и сапа.

В случае поражения возбудителями мелиоидоза и сапа «непрофессиональных» фагоцитов, к которым относятся эндотелиоциты капилляров изучаемых органов, ретикулоциты селезенки и лимфатических узлов, а также альвеолоциты, на электронограммах можно было видеть, что неповрежденные патогенные буркхольдерии имели капсулу и располагались, как правило, свободно в цитоплазме клетки-хозяина.

Способность В. pseudomallei и В. mallei паразитировать в «непрофессиональных» фагоцитах наряду с капсулообразованием, на наш взгляд, можно рассматривать в качестве одного из факторов способствующих их перси-стенции in vivo, поскольку эти клетки, не обладают столь мощной бактерицидной системой как «профессиональные» фагоциты.

Следует отметить, что В. pseudomallei и В. mallei, имеющие те или иные морфологические признаки деструкции, обнаруживались преимущественно в фаголизосомах «профессиональных» фагоцитов. Капсула у таких бактерий либо отсутствовала, либо была наименьших размеров. Чаще такая картина наблюдалась в случае заражения животных менее вирулентными штаммами возбудителей мелиоидоза и сапа.

При преобладании продуктивных процессов в мелиоидозных и сапных гранулемах иногда встречались макрофаги, в фагосомах которых наблюдалось образование сферопластоподобных форм В. pseudomallei и В. mallei, которые могут считаться начальными структурами процесса L-трансформации. Процесс L-трансформации является своеобразной формой защиты от неблагоприятного воздействия организма-хозяина, способствующей поддержанию инфекционного процесса, поскольку указанные формы способны реверсировать в обычные бактериальные клетки (96, 97).

Обнаружение возбудителей мелиоидоза и сапа, свободно лежащих в цитоплазме клетки-хозяина, очевидно, связано с их способностью разрушать фагосому, на что указывает наличие у В. pseudomallei и В.mallei ряда протео-литических ферментов (11, 67, 81, 86, 101). Об этом также свидетельствуют наши наблюдения о возможности лизиса ядерной мембраны и паразитирова-ния мелиоидозных и сапных бактерий в нуклеоплазме. Наряду с этим одним из способов проникновения изучаемых микроорганизмов в цитоплазму соматической клетки является собственно лизис плазматической мембраны клетки без индукции фагоцитоза.

В случае паразитирования в «профессиональных» фагоцитах лизис фа-госомальной мембраны и выход бактерий в цитоплазму происходил до слияния с лизосомами. Это позволяло В. pseudomallei и В, mallei избегать киллер-ного воздействия клетки-хозяина.

Необходимо сказать, что в целом установленные механизмы перси-стенции и характер взаимоотношения возбудителей мелиоидоза и сапа с клетками макроорганизма одинаков, что нашло отражение в наших подходах к формированию концепции патогенеза этих заболеваний (67, 101). Вместе с тем при заражении животных более вирулентными штаммами В. pseudomallei и В. mallei инфекционный процесс протекал острее и исход взаимодействия «клетка-клетка» решался чаще в пользу микроорганизма.

В заключение необходимо отметить, что проведенные исследования позволили решить ряд вопросов, касающихся современного представления об ультраструктурной организации патогенных буркхольдерий: В. pseudomallei, В. mallei и В. cepacia, а также особенностей их взаимодействия с макроорганизмом при развитии инфекционного процесса. Доказано наличие у этих микроорганизмов капсулы. В. pseudomallei, и В. cepacia, в отличие от В. mallei, имеют жгутики и фимбрии, которые наряду с капсулой, обуславливают у возбудителя мелиоидоза гидрофобные, адгезивные и антифагоцитарные свойства. Основу капсул, изученных патогенных буркхольдерий составляют гликопротеиновые биополимеры. Определены отдельные фракции капсульного вещества, обладающие как иммуносупрессивным, так и иммуно-модулирующим действием. Исследование функциональной активности фагоцитов при острой форме мелиоидоза и сапа выявило, что кислородзависи-мая цитоцидная активность фагоцитирующих клеток имеет фазный характер изменений с максимальным увеличением к 6 ч. Одновременное снижение показателей антимикробного потенциала фагоцитов (тест восстановления НСТ, содержание БКБ, активность кислой фосфатазы и катепсина Д) является прогностически неблагоприятным признаком течения инфекций. Установ-ленно, что капсула возбудителя мелиоидоза и сапа in vivo препятствует фагоцитозу и внутриклеточному перевариванию бактерий. В. pseudomallei и В. mallei являются факультативными внутриклеточными паразитами и проявляют тропность к фагоцитам макроорганизма, а так же к эндотелиальным клеткам капилляров, ретикулоцитам селезёнки и лимфатических узлов, аль-веолоцитам. Данные «клетки-мишени» при сапе и мелиоидозе выступают в роли своеобразной экологической микрониши паразитов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора медицинских наук, Попов, Сергей Федорович, Саратов

1. Антонов В.А., Замараев B.C., Захарова И.Б. и др. Изучение плазмид патогенных буркхольдерий // Природно очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб. науч. трудов. - Волгоград, 2000. - С.41 - 46.

2. Антонов Ю.В., Поповцева Л.Д., Ярулин Р.Г., Илюхин В.И. Проблемы резистентности возбудителя мелиоидоза к антибиотикам // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - N10. - С.26 - 28.

3. Ариэль Б.М. Системный анализ в патологии и возможности его использования при изучении морфогенеза инфекций // Арх. пат. -Т2. 1981. -С.3-13.

4. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Л., 1962. - 180с.

5. Балаева Н.М. Взаимодействие риккетсий с клетками-эукариотами // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1990. -N 2. - С.80-86.

6. Барштейн Ю.А., Ариэль Б.М. Эпидемиологический процесс как социально экологическая система. - М.: Медицина, 1986.-С.120-132.

7. Батманов В.П. Чувствительность Pseudomonas mallei к фтор-хинолонам и эффективность их при экспериментальном сапе // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - N9. - С.31 - 34.

8. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп опасности // Санитарные правила. СП 1.2.011 94. - 151с.

9. Беляков В.Д., Ряпис JI.A., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. М.: Медицина, 1990. - 224с.

10. Бирюзова В.И. Об ультраструктурной организации бактерий // Современная электронная микроскопия в исследовании вещества.- М.: Наука,1982. С.220 - 230.

11. Божко В.Г., Денисов И.И., Рыбкин B.C., Попов С.Ф., Васильев В.П. Изучение влияния кислого экзополисахарида возбудителя мелиоидоза на функциональную активность макрофагов // Микробиол. журн. 1992. - T54,N6. - С.54 - 58.

12. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса // Журн. микробиол. 1999. - N5. -С.34 - 39.

13. Бондаренко В.М., Петровская В.М., Потатуркина Нестерова Н.И. Проблема патогенности клебсиелл. -М.:Медицина, 1996.

14. Бондаренко В.М., Шахмарданов М.З. Современные представления о молекулярно биологических основах патогенеза шигеллёзов // Журн. Микробиология. - 1998. - N6. - С.88 - 92.

15. Борисова Е.В. Иммуносупресивные компоненты экстрацел-люлярного липополисахарида клинических штаммов Pseudomonas aeruginosa II Журн. Микробиология. 2000. - N6. - С.35 - 38.

16. Будченко А.А. Сравнительный электрофоретический анализ белков патогенных псевдомонад // Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов, 1995.-24с.

17. Бухарин О.В. Персистенция патогенных бактерий. Екатеринбург.: Уро РАН,1999.

18. Бухарин О.В., Курлаев П.П., Чернова O.JI., Матюшкина С.Б. Факторы персистенции стафилококков в прогнозировании течения гнойно — воспалительных заболеваний // Журн. Микробиология. — 1998. -N5.-C.27-30.

19. Быков А.С., Лазуренко И.О., Селезнев А.С. О роли иммуног-лобулинового покрова в процессе фагоцитоза микроорганизмов // Арх. пат.-1981.-Вып. 9.-С. 10-16.

20. Быков А.С., Пашков Е.П., Миронов А.Ю. Морфологическая характеристика бактерий, обработанных сывороткой крови и иммуноглобулином человека // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуно-биол. -1988. -N8. -С.3-7.

21. Васкоренко З.П., Фролов А.Ф., Смирнов В.В., Рубан Н.М. Жирно кислотные профили бактерий, патогенных для человека и животных. - Киев.: Наукова думка, 1992. - 264с.

22. Велянов Д., Харбов Д., Димова И. Пручване Върху R- и S-форм н Pseudomonas pseudomallei (морфология на колоните и вирулентност за бел мишки и морски свинчета) // Acta. Microbiol. Bulg. -1982. Nil. -P.l04 - 108.

23. Викторов Д.В. Анализ белкового и антигенного состава штаммов Pseudomonas pseudomallei различной вирулентности // Дис. канд. биол. наук. Саратов, 1997.

24. Воробьёв А.А. Оценка верятности использования биоагентов в качестве билогического оружия // Эпидемиология и инфекционные болезни N6. - 2001. - С54 - 56.

25. Втюрин Б.В., Скуба Н.Д., Панова Н.В., Бочкарёва И.П. Ультраструктурный анализ инвазии синегнойной палочки в кровеносные капилляры подкожной клетчатки // Арх. патологии. 1986. - T48,N8. -С.57-63.

26. Гайер Г. Электронная гистохимия: Пер. с нем. М.: Мир, 1974. -488с.

27. Гриценко В.А., Дерябин Д.Г., Брудастов Ю.А., Бухарин О.В. Механизмы уропатогенности бактерий // Журн. Микробиология. 1998. -N6.-C.93-98.

28. Гублер Е.В., Генкин А.А. Применение непараметрических критериев статистики в медико-биологических исследованиях. JL: Медицина, 1973. - 141с.

29. Денисов И.И. Полисахаридный компонент слизи Pseudomonas pseudomallei II Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуно биол. - 1985. -N11.-С. 23-26.

30. Денисов И.И. Структурно функциональные особенности патогенных псевдомонад и их роль в реализации вирулентных свойств и устойчивости к факторам внешней среды // Автореф. дис. докт. мед. наук. - Волгоград, 2000. - 31с.

31. Денисов И.И., Нарбутович Н.И., Илюхин В. И., Каплиев В.И. Термостабильный гемолизин Pseudomonas pseudomallei И Журн. микробиол. 1996.-Nl. - С.16 - 19.

32. Детерман Г. Гель хроматография. - М.: Мир, 1970. - 120с.

33. Езепчук Ю.В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий. М.: Медицина, 1997.

34. Езепчук Ю.В. Стратегия возбудителя в организме хозяина. -Ленинград, 1987. С.41- 47.

35. Ермолаева С.А., Тартаковский И.С. Регуляция экспрессии факторов вирулентности у Listeria monocytogenes II Журн. Микробиоло-гия.~2001. -N3. -С.103 110.

36. Зайцева Л.Г.,Дуплищева А.П., Мысякин Е.Б., Туманян М.А. Регуляция функции клеток мононуклеарной фагоцитирующей системы сальмозаном // Журн. микробиол. 1988. - N7. - С.63 - 68.

37. Замараев B.C., Илюхин В.И., Саямов С.Р., Ряпис Л.А. Л -трансформация возбудителей как один из путей реализации хронического носительства бактерий рода Pseudomonas II Микробиол. журн. — 1987. Т.49, N 3. - С.91-96.

38. Замараев B.C. Образование и персистенция морфологических вариантов возбудителя мелиоидоза в организме экспериментальных животных // Теоретич. И прикладн. инфекцион. иммунолог. Тез. докл. I Всесоюзн. конф. -М. 1982. - С. 89.

39. Замараев B.C., Антонов Ю.В., Илюхин В.И. Индукция морфологических вариантов возбудителя мелиоидоза в организме животных // Труды Волгоградского мед. ин та. - 1981. - Т.34, N4. - С.55 - 56.

40. Зенгбум П. Молекулярная и клеточная биология. Т2. М.: Мир, 1982.-438с.

41. Илюхин В.И. Антигенная структура и серология псевдомонад // Журн. микробиол. 1986. - N5. - С. 88 - 93.

42. Илюхин В.И., Лихолетов С.М., Мельников Б.И. Диффузионные камеры при работе с возбудителями особо опасных инфекций // Пробл. ООИ. Саратов, 1978. - N 4. - С.21 - 24.

43. Иммунологические методы исследований // Пер. с англ. Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1988. - 530с.

44. Исин Ж.М. Изменения активности кислородозависимосимого метаболизма полиморфноядерных лейкоцитов периферической крови и макрофагов перитонеального экссудата при экспериментальном заражении мышей возбудителем чумы // Журн. микробиол. 1985. - N10. -С.69.

45. Исин Ж.М., Тугамбаев Т.И. Структурно функциональные свойства и биологическая активность капсульного антигена, «мышиного» токсина и эндотоксина Yersinia pestis II Журн. микробиол. - 1987. -N4. - С.91 -98.

46. Калина Г.П. Род Pseudomonas: новые аспекты старой проблемы // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 1985. — N 5. — С.91-98.

47. Каплиев В.И., Батманов В.П. Изменение ультраструктуры клеток возбудителя мелиоидоза при воздействии антибиотиков in vitro // Эколого эпидемиол. надзор за природно-очаговыми инф. в Северном Прикаспии: Сб. науч. тр. - Астрахань, 1996. - С. 109 - 111.

48. Каплиев В.И., Денисов И.И., Курилов В.Я. Морфологическая характеристика слизистых вариантов Pseudomonas pseudomallei //Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1990. -N10. С.41- 45.

49. Каплиев В.И., Пивень Н.Н., Храпова Н.П. Определение локализации антигенов возбудителя мелиоидоза на ультраструктурном уровне с помощью моноклональных антител // Микробиол. журн. — 1992. -T54,N1. — С.85 89.

50. Кац JI.H. В кн.: Стафилококки и стафилококковые инфекции. Под ред. О.В.Барояна.- Саратов: изд-во Сарат.ун-та, 1980. 120с.

51. Киселев Ю.Л., Исин Ж.М., Тугамбаев Т.И., Дмитровский A.M. Зависимость индуцирующего действия антигенов Yersinia pestis на синтез и продукцию кахектина мононуклеарными фагоцитами мышей // Журн. микробиол. 1993. - N6. - С81 - 82.

52. Ковальчук В.К., Григорьев А.В., Сопиль А.С. Структурные особенности дистанционного взаимодействия шигелл и сальмонелл с энтероцитами экспериментальных животных // Журн. микробиол. -1985. N6. - С.68 - 72.

53. Константинова Н.А. Иммунные комплексы и повреждение тканей. М.: 1998. - 256с.

54. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. СПб.: «Специальная литература», 1998. -592с.

55. Кутырев В.В., Попов Ю.А., Проценко О.А. Плазмиды патогенности чумного микроба // Молекул, генетика, микробиология и вирусология. 1986. - N6. - С.З - 11.

56. Ломакин М.С. Иммунобиологический надзор. М.: Медицина, 1990.-256с.

57. Ляшенко В.А. Макрофаги в инфекционном процессе // Иммунология 1995. - N4. - С.48 - 52.

58. Маслов А.К., Дягина М.Н. Электронно микроскопическое исследование Mycobacterium Leprae, пассируемых на лабораторных животных // Журн. Микробиология. - 2001. -N5. - С.20 - 23.

59. Маянский А.Н., Пикуза О.И. Клинические аспекты фагоцитоза. -Казань, 1993.

60. Мелиоидоз. Сб. науч. тр. Под ред. Н. Г. Тихонова. — Волгоград: Ниж.-Волж. кн. изд-во, 1995. — 224с.

61. Мельников Б.И., Пивень Н.Н., Яковлев А.Т. и др. К вопросу о выделении возбудителя сапа от монгольской лошади на Улан Удэн-ском мясокомбинате // В сборн.: Вопросы противоэпидемической защиты. - НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. - 1987. - Вып. 33. - С.49 - 54.

62. Мельников Б.И., Попов С.Ф., Яковлев А.Т., Денисов И.И., Божко В.Г., Курилов В.Я. Капсулообразование у возбудителя мелиоидоза в организме // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1990. -N9.-C.6-10.

63. Меркулов Т.А. Курс патологогистологической техники. М.: Медицина, 1969.-406с.

64. Методические рекомендации по стерилизующему режиму фиксации клеток макроорганизма, зараженных возбудителями мелиоидоза и сапа, для электронной цитохимии и иммуноцитохимии // Попов С.Ф., Мельников Б.И., Лагутин М.П., Курилов В.Я. Волгоград, 1990. -5с.

65. Методы общей бактериологии: Пер. с анг. // Под ред. Ф.Герхардта и др. М.: Мир, 1983. - 536с.

66. Микробиология / Воробьёв А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова A.M. Учебник,2-е изд., переработанное и дополненное. - М.: Медицина, 1998. - 336с.

67. Мягкова М.А., Трубачёва Ж.Н., Панченко О.Н. Естественные антитела к физиологически активным соединениям // Иммунология. -2000. -N6. -С.6-10

68. Мясленко Р.П. Механизмы фагоцитарной реакции у животных // С.-Х. биол. 1986. -N 11.- С.97- 103.

69. Нарбутович Н.И., Голосеев Ю.А., Варыханова Т.Г. Изучение свойств внеклеточной щелочной фосфатазы возбудителя мелиоидоза // Журн. микробиол. 1991. - N8. - С.9 - 11.

70. Павлова И.П., Ленченко Е.М. Электронно микроскопическое исследование адгезивности бактерий // Журн. Микробиология. -2002. - N1. - С.З - 6

71. Пехов А.П. Плазмиды бактерий. М.: Медицина, 1986. -224с.

72. Пивень Н.Н. Антигенный анализ возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности // Автореф. дис. докт. мед. наук. Волгоград, 1997.

73. Пивень Н.Н., Илюхин В.И. Антигенная структура возбудителя мелиоидоза//Журн. микробиол. 1981.-N4.-С. 335 -339.

74. Пивень Н.Н., Подзолкова Г.Г., Закревский В.И. и др. Протеа-зы патогенных псевдомонад: выделение и очистка // В кн.: Тез. докл. VI Всероссийского съезда микробиол., эпидемиол. и паразитол. Н. Новгород. - 1991. - TII. - С. 122 - 123.

75. Пивень Н.Н., Смирнова В.И., Викторов Д.В., Коваленко А.А., Фарбер С.М., Ярулин Р.Г., Подзолкова Г.Г. Иммуногеность и гетерогенность поверхностного антигена 8 возбудителя мелиоидоза // Журн. микробиол. 1996. - N4. - С.75 - 78.

76. Пивень Н.Н., Смирнова В.И., Каплиев В.И. Роль поверхностных антигенов Pseudomonas pseudomallei в патогенезе мелиоидоза // Журн. микробиол. 1991. -N10. - С. 8 - 12.

77. Пигаревский В.Е. Мазин Ю.А. К методике применения лизо-сомально катионного теста в лабораторной диагностической практике // Лаб. дело. - 1984. - N10. - С.579 - 586.

78. Плеханова Н.Г. Экзопротеазы возбудителя мелиоидоза: выделение, очистка, физико химические и иммунобиологические свойства // Дис. канд. биол. наук. - Волгоград, 1995. - 123с.

79. Плеханова Н.Г., Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Нарбутович Н.И. Некоторые свойства экзопротеаз возбудителя мелиоидоза // Генет. и биохимия вирулентности возбудителей особо опасн. инф.: Матер. Росс. науч. конф. Волгоград. - 1992. - С. 117.

80. Полак Дж., Ван Норден С. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы.: Пер. с англ. М.: Мир, 1987. - 74с.

81. Попов С.Ф., Курилов В .Я., Яковлев А.Т. Pseudomonas pseudomallei и Pseudomonas mallei капсулообразующие бактерии // Журн. микробиол.- 1995. - N5. - С.32 - 36.

82. Попов С.Ф., Мельников Б.И., Курилов В.Я., Божко В.Г. Особенности ультраструктуры возбудителя мелиоидоза и его взаимодействия с фагоцитами in vivo // Микробиол. журн. 1990. - T.52,N2. - С. 18 -22.

83. Попов С.Ф., Мельников Б.И., Лагутин М.П., Курилов В .Я. Изучение капсулообразования у возбудителя сапа // Микробиол. журн. -1991. T.53,N1. - С.90 - 92.

84. Попова А.Е. Методические рекомендации по определению отёкогенного эффекта на белых мышах. Волгоград, 1980. - 18с.

85. Поповцева Л.Д. Поиск оптимальной схемы идентификации возбудителя мелиоидоза // Дис. канд. мед. наук. Волгоград. - 1985. -134с.

86. Поповцева Л.Д., Пивень Н.Н. Применение методов молекулярной биологии в таксономии патогенных псевдомонад // В кн.: Молек. биология, генетика и иммунол. возб. ООИ: Тез. докл. Всесоюзн. конф. -Ростов-на-Дону. 1984. - С.50 - 52.

87. Проблемы инфектологии / Под ред. С.В. Прозоровского. М.: Медицина, 1991.-400с.

88. Прозоровский С.В., Кац Л.Н., Каган Г.Я. L-формы бактерий механизм образования, структура, роль в патологии. М.: Медицина, 1981.-240с.

89. Рубан Е.А. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas М.: Наука, 1986. - 200с.

90. Ряпис Л.А., Фарбер С.М., Голубинский Е.П., Токарев С.А. Сравнительная характеристика ультраструктуры возбудителей сапа и мелиоидоза // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1975. -N5. -С.41-43.

91. Ряпис Л.А., Ширяев Д.Т., Гольдберг A.M., Акулова М.Ф. Сравнительное изучение антигенных свойств возбудителей сапа и мелиоидоза // Пробл. особо опасных инфекций. 1971. - Вып.1. - С.155 -157.

92. Сап. Сб . науч. тр. Под ред. Н. Г. Тихонова. Волгоград: Ниж,-Волж. кн. изд-во, 1995. — 128с.

93. Сафронов А.А., Желтова В.И. Персистенция бактерий. Куйбышев, 1990. -С.58 - 61.

94. Серов В.В. Иммунологические и иммунопатологические аспекты воспаления. М., 1995. - С.219 - 261.

95. Серов В.В. Общепатологические подходы познания болезни. Саратов,1992.

96. Синегнойная инфекция / А.Ф. Мороз, Н.Г. Анциферова, Н.В. Баскакова и др. Под ред. А.Ф. Мороз. М.: Медицина, 1988. -256с.

97. Смирнов В.В. Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas. -Киев.: Наукова думка, 1990. -262с.

98. Совершенствование методов диагностики псевдомонад и бацилл //Отчет по НИР (заключительный). Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт. Рук. Замараев B.C. Волгоград. - 1990. -ГР.0188.0-0060 85.- 46с.

99. Способ моделирования лёгочного мелиоидоза / Алексеев В.В., Вязмина Т.Н., Плеханова Н.Г. и др. // Пат. №21575538 на изобретение, 10 октября 2000г.

100. Тартаковский И.С., Ермолаева С.А., Малеев В.В. Факторы па-тогенности листерий и их роль в патогенезе и лабораторной диагностике листериоза // Журн. Микробиология. 2003. - N4. - С.31-36.

101. Терентьева Э.И. Цитохимия элементов кроветворения при лейкозе. М.: Медицина, 1968. - 52с.

102. Тотолян А.А., Фрейдлин И.С. Клетки иммунной системы. Till. СПб.: Наука, 1999. - 232с.

103. Туйгунов М.М., Габидуллин З.Г., Зурочка А.В., Бухарин О.В. Молекулярные механизмы взаимоотношений организма и патогенных энтеробактерий // Журн. Микробиология. 2003. - N4. - С.23-27.

104. Туманян М.А., Кирилличева Г.Б. Способ отбора иммуномо-дуляторов // Авторское свидетельство на изобретение №1210790,1986г.

105. Фрейдлин И.С. Иммунная система и её дефекты. СПб.: 1998. -110с.

106. Хаитов P.M., Алексеев Л.П. Генетика иммунного ответа // Иммунология. 1998.-N5.-C.il - 15.

107. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные представления о защите организма от инфекции // Иммунология. 2000. — N1. — С.61-64.

108. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса // Иммунология. 1995. - N4. -С.3-8.

109. Хаитов P.M., Сидорович И.Г., Игнатьева Г.А. Иммунология -М.: Медицина, 2000. 432с.

110. Хемилюминесценция перитонеальных макрофагов при действии макрофагактивирующего фактора / Любимов Г.Ю., Зенков Н.К., Вольский Н.Н., Козлов В.А. // Иммунология. 1992. -Nl. - С.40 - 43.

111. Цинзерлинг А.В. Современные инфекции. Патологическая анатомия и вопросы патогенеза. СПб., 1993.

112. Шахламов В.А. Прошлое, настоящее и будущее проблем патологии клетки // Арх. пат. 1998. - N5. - С.71-74.

113. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем.- М.: Мир, 1987.-567с.

114. Ярилин А.А. Межклеточная кооперация при иммунном ответе. Выбор клеткой формы ответа // Иммунология. 1999. - N1. - С.17 -24.

115. Agramonte-Hevia J., Gonzalez-Arenas A., Barrera D., JVeiasco -Velazquez M. Gram-negative bacteria and phagocytic cell interaction mediated by complement receptor 3 // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2002. -V34,N4. - P.255 - 266.

116. Alexander J., Satoskar A.R., Rusell D.G. Leishmania species: models of intracellular parasitism // J. Cell. Sci. 1999. - V12, Ptl8. -P.2993 - 3002.

117. Allen R.K. Melioidosis: a cause of pneumonia to suspect in travellers back from Oceania // Rev. Mai. Respir. 2002. - VI9,N6. - P.807 - 808.

118. An indigenous melioidosis: a case report / Chen Y., Peng C., Hwang K. et al. // Kaohsiung J. Med. Sci. 1999. - VI5. - P.292 - 296.

119. Anuntagool A., Intachote P., Naigowit P., Sirisinha S., Rapid antigen detection assay for identification of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei infection // J. Clin. Microbiol. 1996. - P.975 - 976.

120. Anuntagool N., Sirisinha S. Antigenic relatedness between Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei II Microbiol. Immunol. — 2002. V46, N3. - P. 143 - 150.

121. Anuntagool A., Panichakul Т., Aramsri P., Sirisinha S. Shedding of lipopolysaccharide and 200kDa surface antigen during the in vitrgrowth of virulent Ara' and avirulent Ara+ Burkholderia pseudomallei II Acta. Tropica. -V74.-2000.-P. 221-228.

122. Archidalci F.Se, Duong M.N. Superoxide dismutase and oxygen toxicity defenses in the genus Neisseria II Infect. Immun. 1986. - V51. -P.631-641.

123. Ashdown L.R., Koehler J.M. Production of hemolysin and other extracellular enzymes by clinical isolates of Pseudomonas pseudomallei II J. Clin. Microbiol. 1990. - V28, N10. - P.2331 - 2334.

124. Babior B.M. Phagocytes and oxidative stress // Am. J. Med. -2000.-V109, Nl.-P.33 -44.

125. Barrert B. Ebah I., Roberts I.S. Genomic structure of capsular determinants // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002. - V264, N1- P. 55 -137

126. Barrett-Connor E. Latent and chronic infection imported from Southeast Asia//J. Amer. Med. Assoc. 1978. -V239, N18. -P.l901-1906.

127. Bayer M.E. Areas of adhesion between wall and membrane of E. coli 11 J. Gen. Microbiol. 1968. - V53. - P. 395^04.

128. Beacham J. Periplasm enzymes in gramnegative bacteria // J.Biochem. 1976. - V10, N11. - P. 1437-1490.

129. Beamen B.L., Beamen L. Nocardia species: host-parasite relationships // Clin. Microbiol. Rev. 1994. - V7, N2. - P. 64 - 213.

130. Beeker A. Van de Stadt KD, Bakker K. Melioidosis // Neth. J. Med. 1999. - V54. - P.76 - 79.

131. Belchis D.A., Simpson E., Colby T. Histopathologic features of Burkholderia cepacia pneumonia in patien without cystic fibrosis // Mod. Pathol. 2000. - V13, N4. - P.369 - 372.

132. Belyi Y. Intracellular parasitism and molecular determinants of Legionella virulence // Int. Microbiol. 1999. - V2, N3. - P. 145-154.

133. Belyi Y.F. Intracellular parasitism of microorganism. Springer -Verlag GmbH&Co/kg. -1996.

134. Bergquist N.R., Schilling W.G. Preparation of antihuman immu-noglobalin for indirect fluorescent tracing of antibodies: standartization in immunofluorescence.-Oxford, 1970. P. 19—65.

135. Bernhardt S.A., Spilker Т., Coffey Т., LiPuma J.J. Burkholderia cepacia complex in cystic fibrosis: frequency of strain replacement during chronic infection // Clin. Infect. Dis. 2003. - V37, N6. - P.780 - 785.

136. Bona C., Bonilla F. Textbook of immunology. Amsterdam, 1996. -406p.

137. Bourgogne A, Drysdale M., Ilijseiibeck SG. Peterspn. S.N., Koehler T.M. Global effects of virulence gene regulators in a Bacillus an-thracis strain with both virulence plasmids // Infect. Immun. 2003. - V71, N5. - P.2736 - 2743.

138. Brennan P.J. Structure, function, and biogenesis of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis II Tuberculosis (Edinb). 2003. - V83, N1-3. -P.91- 97.

139. Brett P.J., Woods D.E. Pathogenesis of and immunity to melioidosis // Acta Trop. 2000. - V74. - P.201 - 210.

140. Brett P.J., Mah D.C., Woods D.E. Isolation and characterization of Pseudomonas pseudomallei flagellin proteins // Infect. Immun. 1994. -P.1914 - 1919.

141. Brindle G.S., Cowan S.T. Flagellation and taxonomy of Whit-more's bacillus //J. Pathol. Bacteriol. -1951. -V63, N4. P.571-575.

142. Brinton C.C.Jr. The structure, function, synthesis and genetic control of bacterial pill and a molecular model for DNA and RNA transport in gram negative bacteria // Trans. T.Y. Acad. Sci. -1965. -V27, N3. -P. 10031054.

143. Brown E.J. Phagocytosis // Bioessays. 1995. - V17, N2. - P.109 -117.

144. Burkholder W. Sour skin, a bacterial rot of onion bulbs // Phytopa-tology. 1950. - V40. - P. 115 - 118.

145. Burtnick M.N., Brett P.J., Woods D.E. Molecular and physical characterization of Burkholderia mallei 0 antigens // J. Bacteriol. 2002. -VI84, N3. -P.849 - 852.

146. Buttery J., Moxon E.R. Capsulate bacteria and the lung // Br. Med. Bull.- 2002. -P.63-80.

147. Cagle G.D., Pflister R.M., Vela G.R. Improved staining of extracellular polymer for electron microscopy: examination of Azotobacter, Zo-oglea, Leuconostoc and Bacillus // Applied. Microbiol. 1972. - V24, N3. -P. 477-487.

148. Cant A.J., Gordon S.B., Read R.C., Hart C.A., Winstanley C. Respiratory infections. //J. Med. Microbiol. -2002. -V51,N1. -P.903 -914.

149. Carpena X., Loprasert S., Mongkolsuk S., Switala J., Loewen P.C., Fital I. Catalase peroxidase KatG of Burkholderia pseudomallei at 1.7A resolution // J. Mol. Biol. - 2003. - V327, N2. - P.475 - 489.

150. Carrick L. Berk R.S. Membranous inclusions of P.aeruginosa II J. Bacteriol. -1971. VI06, N1. - P.250 - 256.

151. Casse F., Boucher C., Julliot J.S. Indentificftion and characterization of lage plasmids in hizobium meliloti using agarose electrophoresis // J. Gen. Microbiol. 1979. - VI13, Pt.2. - P.229 - 242.

152. Celli J., Finlav B.B. Bacterial avoidance of phagocytosis. // Trends. Microbiol. 2002. - V10, N5. - P.232-237.

153. Chadwick D.R., Ang В., Sitoh Y.Y., Lee C.C. Cerebral melioidosis in Singapore: a review of five cases // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. -2002. V96, N1 - 2. - P.72-76.

154. Chapman G., Hillier J. Electron microscopy of ultrathin sections of bacteria // J. Bacteriol. 1953. - V66. - P.362-373.

155. Cheng A.C., Hanna J.N., Norton R., Hills S.L., Davis J., Krause V.L., Dowse G., Inglis T.J., Currie B.J. Melioidosis in northern Australia, 2001-02. // Commun. Dis. Intell. 2003. - V27, N2. - P.272 - 277.

156. Chernish R.K., Aaron S.D. Approach to resistant gram-negative bacterial pulmonary infections in patients with cystic fibrosis // Curr. Opin. Pulm. Med. 2003. - V9, N6. - P.509 - 515.

157. Chua K.L., Chan Y.Y., Gan Y.H. Flagella are virulence determinants of Burkholderia pseudomallei II Infect. Immun. 2003. — V71, N4. -P. 1622- 1629.

158. Cieri M.V., Mayer-Hamblett N., Griffith A., Burns J.L. Correlation between an in vitro invasion assay and a murine model о Burkholderia cepacia lung infection // Infect. Immun. 2002. - V70, N3. - P. 1081-1086.

159. Clayton A.T., Lisella R.S., Martin D.G. Melioidosis: a serological survey in the military personnel // Milit. Med. 1973. - V138, N1. - P.24-25.

160. Coenye Т., LiPuma J.J. Molecular epidemiology of Burkholderia species // Front. Biosci. 2003. - V8, N1. - P.55-67.

161. Coenye Т., Vandamme P. Diversity and significance of Burkholderia species occupying diverse ecological niches // Environ. Microbiol. 2003. - V5, N9. - P.719 - 729.

162. Coenye Т., Vandamme P., Govan J.R., LiPuma J.J. Taxonomy and identification of the Burkholderia cepacia II J. Clin. Microbiol. 2001. -P.3427 - 3436.

163. Coenye Т., LiPuma J.J., Molecular epidemiology of Burkholderia species // Front. Biosci. 2003. - V8. - P.55-67.

164. Colston M.J. Mycobacterial infection from the cellular point of view//Acta CientVenez.-2001.-V52, Suppl 1.-P. 13- 15.

165. Currie B.J. Melioidosis: an important cause of pneumonia in residents of and travellers returned from endemic regions // Eur. Respir. J. -2003. V22, N3. - P.542 - 50.

166. Dance D.A. Ecology of Burkholderia pseudomallei and the interactions between environmental Burkholderia spp. and human-animal hosts // Acta Trop. 2000. - V74, N2 - 3. - P. 159 - 168.

167. Dance D.A. Melioidosis as an emerging global problem // Acta Trop. 2000. - V74, N2-3. - P.l 15 - 119.

168. Dance D.A.B. Melioidosis // Rev. Med. Microbiol. 1990. -P.143- 150.

169. Dance D.A. Melioidosis // Curr Opin Infect Dis. 2002. - V15, N2. -P.127-132.

170. Davies D.G., Parsek M.R., Pearson J.P., Iglewski B.H., Costerton J.W., Greenberg E.P. The involvement of cell-to-cell signals in the development of bacterial biofilm // Science. 1998. - P.295 - 298.

171. De Duve C., Pressman B.C., Gianetto R., Wattiaux R., Appelmans F. Tissue fractiomation studies // J. Biochem. 1955. - V60. - P.604-617.

172. De Smet M., Eggink G., Witholt B. Characterization of intracellular inclusion formed by Pseudomonas ollovorans during growth on octane // J. Bacterid. 1983. - V154, N 2. - P.870-878.

173. Deitchman S., Sokas J.R. Glanders in a military research microbiologist // N Engl J. Med. 2001. - V345, N22. - P. 1644.

174. Derbyshire J.B. The eradication of glanders in Canada // Can. Vet. J. 2002. - V43, N9. - P.722 - 726.

175. DeShazer D., Brett P., Woods D.E. The Type II O-antigen moiety of Burkholderia pseudomallei lipopolisaccaride is required for serum resistance and virulence // Mol. Microbiol. 1998. - P.1011 - 1081.

176. Dixon T.C., Fadl A.A., Koehler TM., Swanson J.A., Hanna PC. Early Bacillus anthracis-macrophage interactions: intracellular surviva survival and escape // Cell. Microbiol. 2000. - V2, N6. - P.453-463.

177. Djaldetti M., Salman H., Bergman M., Djaldetti R. Bessler H. Phagocytosis the mighty weapon of the silent warriors // Microsc. Res. Tech. - 2002. - V57, N6. - P.421 - 431.

178. Doid P., Todd Т., Sastry P.A., Lee K.K., Hodges R.S., Paranichych W., Yrvin R.T. Role of Pili in Adhesion of Pseudomonas aeruginosa to Human respiratory epithelial cells // Infect. Immun. 1988. -V56, N6. — P.1641—1646.

179. Du Y., Rosqvist R., Foreberg A Role of fraction 1 antigen of Yersinia pestis in inhibition of phagocytes // Infect. Immun. 2002. - V70, N3.-P.1453- 1460.

180. Duhon D., Cardelli J. The regulation of phagosome maturation in Dictyostelium // J. Muscle. Res. Cell. Motil. 2002. - V23, N7 - 8. - P.803 -808.

181. Faa A.G., Holt P.J. Melioidosis in the Torres Strait islands of far North Queensland // Commun. Dis. Intell. 2002. - V26, N2. - P.279 - 283.

182. Feger F., Varadaradjalou S., Gao Z., Abraham S.N., Arock M. The role of mast cells in host defense and their subversion by bacterial pathogens // Trends. Immunol. -2002. -V23, N3. P. 151 - 158.

183. Feldman M., Bryan R., Rajan S., Scheffler L., Brunnert S., Tang H., et al. Role of flagella in Patogenesis Pseudomonas aeruginosa pulmonary infection // Infect. Immun. 1998. - P.43 - 51.

184. Forsberg C.W., Rayman M.K., Costerton J.W., Mac Leod R.A. Isolation, characterization and ultrastrue tare of the peptydoglycan layer of marine pseudomanad // J. Bacteriol. 1972. - V109, N2. - P.895-905.

185. Fouet A., Mesnage S. Bacillus anthracis cell envelope components // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002. -P.87 - 113.

186. Fournier J., Chambon L. La melioidose inaladie d'actualize et le bacille de Whitmore (Malleomycespseudomallei) // Paris. 1958. - 106p.

187. Fratti R.A., Chua.J., Deretic Y. Cellubrevin alterations and Mycobacterium tuberculosis phagosome maturation arrest // J. Biol. Chem. 2002.- V277, N19. P. 17320 - 17326.

188. Fritz D.L., Vogel P., Brown D.R., Deshazer D., Waag D.M., Mouse model of sublethal and lethal intraperitoneal glanders (Burkholderia mallei) // Vet. Pathol. 2000. - V37, N6. - P.626- 636.

189. Frosch M., and A. Miiller. Phospholipid substitution of capsular poly-saccharide and mechanisms of capsule formation in Neisseria meningitidis II Mol. Microbiol. 1993. - P.483 - 493.

190. Fukushima J., Shimura Y., Inamoto T. Genus Pseudomonas (Pseudomonas aeruginosa) // Nippon. Rinsho. 2003. - V61, Suppl 3. -P.737-741.

191. Furth R. van. Production and migration of monocytes and kinetics of macrophages // Mononuclear. Phagocytes. Leiden, 1992. - P.3 - 12.

192. Ganz T. Oxygen-independent microbicidal mechanisms of phagocytes // Proc. Assoc. Am. Physicians. 1999. - Vlll, N5. - P.390 - 395.

193. Gauthier Y.P., Hagen R.M., Brochier G.S., Neubauer H., Splettstoes-ser W.D., Finke E.J., Vidal D.R. Study on the pathophysiology of experimental Burkholderia pseudomallei infection in mice // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2001. - V30. - P.53 - 63.

194. Gauthier Y.P., Tribault F.M. Paucod J.C., Vidal D.R. Protease production bu Burkholderia pseudomallei and virulence in mice // Acta. Trop. 2000. - V74, N2 - 3. - P.215 - 220.

195. Gibson R.L., Burns J.L., Ramsey B.W. Pathophysiology and management of pulmonary infections in cystic fibrosis // Am J. Respir. Crit Care Med. 2003. - V168, N8. -P.918 - 951.

196. Gilardi G.L. Characterization of Pseudomonas species isolated from clinical specimens // Appl. Microbiol. 1971. - V21. - P.414 - 419.

197. Godfrey A.J., Wong S., Dance D.A. Chaowagul W., Bryan L.E. Pseudomonas pseudomallei resistance to beta-lactam antibiotics due to alterations in the chromosomally encoded beta-lactamase // Antimicro. Agents Chemother. 1991. - P. 163 5 - 1640.

198. Goldman D., Klinger J. Pseudomonas cepacia: biology, mechanisms of virulence, epidemiology // J. Pediatr. -1986. V108. - P.806 - 812.

199. Gomori G. An improved histochemical technic for acid phosphatase. 1950. - V25. - P.81.

200. Goosney D.L., Gruenheid S., Finlay B.B. Gut feelings: enteropa-thogenic E. coli (EPEC) interactions with the host // Annu. Rev. Cell. Dev. Biol. 2000.-P.173- 189.

201. Gotoh N., White N., Chawagul W., Woods D. Isolation and characterization of the outer membrane proteins of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei H J. Microbiol. - 1994. - V140. - P.797 - 805.

202. Govan J., Deretic V. Microbiol pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia II Microbiological. Reviews. 1996. - V60. - P. 539 - 574.

203. Govan J., Hughes J., Vandamme P. Burkholderia cepacia: medical, taxonomic and ecological issues // J. Med. Microbiol. 1996. - V45. -P.395 -407.

204. Green B. D., Battisti L., Koehler T.R., Thorne C.B. Demonstration of a capsule plasmid in Bacillus anthracis II Infect. Immun. 1985. - V49. -P.291 -297.

205. Gruenheid S. Finlay B.B. Microbial pathogenesis and cytoskeletal function // Nature. 2003. - V422. - P.775 -781.

206. Haas A. Reprogramming the phagocytic pathway—intracellular pathogens and their vacuoles (review) // Mol. Membr. Biol. 1998. - VI5, N3. -P.103-121.

207. Haase A., Jansen J., Barrett S., Currie B. Toxin production by Burkholderia pseudomallei streins and correlation with severity of melioidosis // J. Med. Microbiol. 1997. - V46, N7. - P.557 - 563.

208. Harley V.S., Dance D.A., Tovey G., Mc Crossan M.V., Drasar B.S. An ultrastructural study of the phagocytosis of Burkholderia pseudomallei II Microbios. 1998. - V94. - P.35 - 45.

209. Hart P.D'A., Macrophage antimicrobial activity: evidence for participation by lysosomes in the killing of Saccharomyces cerevisiae by normal resident macrophages // Infect. Immun. 1981. -V31, N2. - P.828 - 830.

210. Hart P.DA., Armstrong J.A. Strain virulence and the lysosomal response in macrophages infected with Mycobacterium tuberculosis II Infect. Immun. 1974. - V10. - P.742-754.

211. Hassler D., Braun R., Schwarz T.F. Melioidosis: a disease that is advancing // Dtsch. Med. Wochenschr. 2003. - V128, N10. - 479p.

212. Haubler S., Nimtz M., Domke Т., Wray V., Steinmetz I. Purification and characterization of a citotoxic exolipid of Burkholderia pseudomallei II Infection and Immunity. 1998. - V66, N4. - P.l588 - 1593.

213. Haynes W.G., Burkholder H. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology // Eds. The Williams and Wilkins Co. Baltimore, London, -1957.-P. 100.

214. Holder J.A., Wheller R., Montie I.C. Flagellar preparations from Pseudomonas aeruginosa: animal protection studies // Infect. Immun. — 1982. V35. - P.276-280.

215. Holmes A., Govan J., Goldstein R. Agricultural use of Burkholderia (Pseudomonas) cepacia: a threat to Human Health // Emerg. Infect. Dis. 1998. - V4, N2. - P. 221 - 227.

216. Hoppe I., Brenneke В., Rohde M., Kreft A., Heaussler S., Regan-zerowski A., Steinmetz I. Characterization of a murine model of melioidosis comparison of different strains of mice // Infect. Immun. 1999. — V67. -P.289 - 900.

217. Home R. W. The applicatoion of negative microscopy // Labor. Invest. 1965. - V14, N6. - P.l054 - 1068.

218. Hsuch Po Ren, Teng Lee - Jene, Lee Li - Na, Yu Chong - Jen, Yang Pan - Chyr, Ho Shen - Wu, Zuh Kwen - Tay. Melioidosis: An Emerging infection in Taiwan // Emerg. Infect. Dis. - 2001. - V7. - P.428 - 433.

219. Inglis T.J., Robertson Т., Woods D.E., Dutton N., Chang B.J. Fla-gellum-mediated adhesion by Burkholderia pseudomallei precedes invasion of Acanthamoeba astronyxis // Infect. Immun. 2003. - V71, N4. - P.2280-2282.

220. Ip M., L.G. Osterberg, P.Y. Chau, and T.A. Raffln. Pulmonary melioidosis//Chest 1995.-P. 1420- 1424.

221. Ismail G., Razak K., Mohamed R., Embi K., Omar O. Resistance of Pseudomonas pseudomallei to normal Human serum bactericidal action // MicroMol. Iimnunol. 1988. - V32, N7. - P.645 - 652.

222. Ismail N., Olano J.P., Feng H.M., Walker P.H. Current status of immune mechanisms of killing of intracellular microorganisms // FEMS Microbiol. Lett. 2002. - V207, N2. - P.l 11 - 120.

223. Janeway Ch. A., Travers P. Immunology. London, 1994. - 560p.

224. Janeway Ch. A., Travers P., Hunt S., Walport M. Immunobiology. The Immune System in Health and Disease. - New York; London, 1997.

225. Jones H.C., Roth J.L., Sanders W.M. Electron microscopic study of a slime layer//J. Bacteriol.- 1969.-V99,N 1.-P.316-325.

226. Jones L.A., Beveridge T.J., Woods D.E. Intracellular survival of Burkholderia pseudomallei II Infect. Immun. 1996. - V64, N3. - P. 782 -790.

227. Josephson J. Melioidosis: an emerging tropical health problem // Environ Sci Technol. 2001. - V35, N21. - P.454A-457A.

228. Kanai К. Dejsirilest S. Pseudomonas pseudomallei and Melioidosis, with special reference to the status in Thailand // Japan. J. Med. Sci. Biol.- 1988. —V41. -P.125-157.

229. Kanai K., Kondo E. Recent advances in biomedical sciences of Burkholderia pseudomallei (basonym: Pseudomonas pseudomallei) // Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1994. - V47. -P.l -45.

230. Kaufmann, S. H. E. Immunity to intracellular bacteria // Annu. Rev. Immunol. 1993. - P. 129 - 163.

231. Kernacki K.A., Hobden J.A., Hazlett L.D., Fridman R, Berk R.S. In vivo bacterial protease production during Pseudomonas aeruginosa corneal infection // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 1995. -P.1371 - 1378.

232. Khrapova N.P., Tikhonov N.G., Prokhvatilova Y.U. Detection of glycoprotein of Burkholderia pseudomallei II Emerg. Infect. Dis. 1998. -V4, N2. - P.336 - 337.

233. Kiertiburanakul S., Sungkanuparph S., Kositchiwat S., Vorachit M. Burkholderia pseudomallei: abscess in an unusual site // J. Postgrad Med.- 2002. V48, N2. - P.124 - 126.

234. Kleinschmidt A.K. Monolayer techniques in electron microscopy // Methods. Enzymol. 1978. - VI2. - P.361 - 377.

235. Knirel, Y. A., Paramonov N. A., Shashkov A. S., Kochetkov N. K., Yarullin R. G., Farber S. M., and Efremenko V. I. Structure of the polysaccharide chains of Pseudomonas pseudomallei lipopolysaccharides // Carbo-hydr. Res. 1992. - P.l85 - 193.

236. Koehler I.M. Bacillus anthracis genetics and virulence gene regulation // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 2002. - P. 143 - 164.

237. Kohler H., Mc Coirnick B.A., Walker W.A. Bacterial enterocyte crosstalk: cellular mechanisms in health and diseas // J. Pediatr. Gastroenterol Nutr. - 2003. - V36, N2. - P.85 -175.

238. Kondo E., Kurata Т., Naigowit P., Kanai K. Evolution of cell-surface acid phosphatase of Burkholderia pseudomallei II Asian J. Trop. Med. Public. Health. 1996. - P. 592 - 599.

239. Krause K.H. Professional phagocytes: predators and prey of microorganisms // Schweiz. Med. Wochenschr. 2000. - V130, N4. - P.97 -100.

240. Lachica R.V., Zink D.L. Determination of plasmidassociated hud-rophobicity of Yersinia enterocolitica by a latex agqlutination test // J. Clin. Microbiol. 1984. - V19, N5. - P.660 - 663.

241. Langermans JA. Hazenbos WL. van Furth R. Antimicrobial functions of mononuclear phagocytes // J. Immunol. Methods. 1994. - VI4. -P.94- 185.

242. Langley R., Kenna D.T., Vandamme P., Ure R., Govan J.R. Ly-sogeny and bacteriophage host range within the Burkholderia cepacia complex // J. Med. Microbiol. 2003. - V52, Pt 6. - P.483 - 490.

243. Le Gac P., Gourmes E., Bres B. Mote preliminaire a I'etude des colonies muqueuses du bacille de Whitmore // Bull. Soc. Pathol, Exot. — 1954. V47, N1. -P.41-43.

244. Lee M., Lin Y. Sequencing and characterization of a novel serine metalloprotease from Burkholderia pseudomallei II FEMS Microbiol. Lett. -2000. V77, N2. - P. 157 - 165.

245. Leelarasamee A. Pseudomonas pseudomallei: the unbeatable foe // Southerns Asian J. Trop. Med. Public Health. 1998. - V29. - P. 2410 -2415.

246. Lehavi O., Aizenstein O., Katz L.H., Hourvitz A. Glanders a potential disease for biological warfare in humans and animals // Harefiiah. -2002. V141, SpecN:88-91. -119 p.

247. Li F.K., Chan K.W., Chan T.M., Lai K.N. Burkholderia urinary tract infection after renal transplantation // Transpl. Infect. Dis. 2003. -V5,N 1. — P.59-61.

248. Li L., He J. Pseudomonas pseudomallei and melioidosis in China // Clin. Med. J. 1992. - V105, N 5. - P. 775 - 779.

249. Li Puma J.J. Burkholderia cepacia epidemiology and pathogenesis: implications for infection control // Curr. Opin. Pulm. Med. 1998. - N6. - P.337 — 341.

250. Liautard J.P. Gross A. Dornand J. Kohler S. Interactions between professional phagocytes and Brucella spp. // Microbiologia. 1996. - VI2, N2. -P.197-206.

251. Lim W.K., Gurdeep G.S., Norain K. Melioidosis of the head and neck // Med. J. Malaysia. 2001. -V56, N4. - P.471 - 477.

252. Lorenz M.C., Fink G.R. Life and death in a macrophage: role of the glyoxylate cycle in virulent // Eukaryot. Cell. 2002. - VI, N5. - P.657-662.

253. Luft J.H. Rutenium red and violet. I. Chemistry, purification, methods and use of electron microscopy and mechanism of action // Anat. Res. 1971. - N2. - P.347 -368.

254. Mahenthiralingam E., Baldwin A., Vandamme P. Burkholderia cepacia complex infection in patients with cystic fibros // J. Med. Microbiol.- 2002. V51, N7. - P.533 - 538.

255. Makino S. Watarai M Cheun Ш, Shirahata T. Uchida I. Effect of the lower molecular capsule released from the cell surface of Bacillus an-thracis on the pathogenesis of anthrax // J. Infect .Dis. 2002. - VI86, N2. -P.227-233.

256. Malik Z.A., Denning G.M., Kusner D.I. Inhibition of Ca(2+) signaling by Mycobacterium tuberculosis is associated with reduced phagosome- lysosome fusion and increased survival within human macrophages // J. Exp. Med. 2000. - VI91, N2. - P.287 - 302.

257. Martin D.W., Mohr C.D. Invasion and intracellular survival of Burkholderia cepacia II Infect. Immunology. 2000. - V68, N1. - P.24 - 29.

258. Matsuura M., Kawahara K., Ezaki Т., Nakano M. Biological acti-vioes of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei И FEMS Microbiol. Lett.- 1996. — N3. -P.18.

259. Mecsas J., Strauss E.J. Molecular mechanisms of bacterial virulence: type III secretion and pathogenicity islands // Emerg. Infect. Dis. -1996. -N2. -P.271 -288.

260. Meier B. Superoxide generation of phagocytes and nonphagocytic cells // Protoplasma. 2001. - V217, N1-3. - P. 117-124.

261. Melo R.C., Machado C.R. Trypanosoma cruzi: peripheral blood monocytes and heart macrophage; the resistance to acute experimental infection in rats // Exp. Parasitol. 2001. - V97, N1. - P. 15-23.

262. Miller B.H., Shinnick T.M. Identification of two Mycobacterium tuberculosis H37Rv ORFs involve in resistance to killing by human macrophages // BMC Microbiol. 2001. - V1, N1. - P.26 -31.

263. Mitsuyama M. Problems in the host defense system against bacterial infection IID Nippon. Rinsho. 1994. - V52, N2. - P.309 - 314.

264. Mitsuyama M. Escape mechanism of intracellular parasitic bacteria and prospect of new approach to infection control // Nippon. Rinsho. -2001.-V59, N5. -P.1013 1021.

265. Mitsuyama M., Suzuki K. Mechanisms of pathogenicity and host defense in infections by intracellular parasitic microbes // Kekkaku. 2000. -V75, N9. - P.557 - 560.

266. Miyagi K. Saito A. Melioidosis // Nippon Rinsho. 2003. - V61, Suppl 2. — P.428 - 433.

267. Mock M., Fouet A. Anthrax // Annu. Rev. Microbiol. 2001. -P.647 - 671.

268. Moens S.M., Vanderleyden J., Functions of bacterial flagella // Crit. Rev. Microbiol. 1996. - P. 67-100.

269. Montie T.C., Craven E.G., Holder J.A. Flagellar preparations from Pseudomonas aeruginosa: isolation and characterization // Infect. Immun. -1982. V35, N2. - P.281 - 288.

270. Moore J.E., Xu J., Millar B.C., Courtney J., Elborn J.S. Development of a Gram-negative selective agar (GNSA) for the detection of Gram-negative microflora in sputa in patients with cystic fibrosis // J. Appl. Microbiol. 2003. - V95, N1. - P. 160-166.

271. Munckhof W.J. Mayo M.J, Scott I. Currie B.J. Fatal human melioidosis acquired in a subtropical Australian city // Am J. Trop. Med. Hyg. 2001. - V65, N4. - P.325 - 328.

272. Nagl M., Kacani L., Mullauer В., Lemberger E.M., Stoiber H., Sprinzl G.M., Schennach H., Dierich M.P., Phagocytosis and killing of bacteria by professional phagocytes and dendritic cells // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2002. - V9, N6. - P. 1165-1168.

273. Nauseef W.M. The NADPH-dependent oxidase of phagocytes // Proc. Assoc. Am. Physicians. 1999. - Vlll, N5. - P.373-382.

274. Nimtz M., Wray V., Domke Т., Brenneke В., Haussler S., Steinmetz I., Structure of an acidic exopolysaccharide of Burkholderia pseudomallei // Eur. J. Biochem. 1997. - P.608-616.

275. Northfield J., Whitty C.J., MacPhee I.A. Burkholderia pseudomallei infection, or melioidosis, and nephritic syndrome // Nephrol. Dial. Transplant. 2002. - V7, N1. - P.137 - 139.

276. O'Brien G.R., Krockenberger M.B., Martin P., Parkes H., Kidd M., Malik R. Disseminated melioidosis in two cats // J. Feline Med Surg. -2003.-V5, N2.-P. 83-89.

277. Ocak F., Gozalan A., Ozcelik U., Anadol D., Kiper N., Aktepe O.C., Gocmen A., Esen B. Isolation frequency of Burkholderia cepacia from cystic fibrosis patients // Mikrobiyol. Bui. 2002. - V36, N1. - P. 1 - 10.

278. Ofek I., Goldhar J., Keisari Y., Sharon N. Nonopsonic phagocytosis of microorganisms // Amu. Rev. Microbiol. 1995. - P.239 - 276.

279. Ofek I., Sharon N. Adhesins as lectins: specificity and role in infection // Curr. Top. Microbiology. Immunnol. 1990. - V151. - P.91 - 113.

280. Otto H., Takamiya H., Vogt A. A two stage method for crosslink-ing antibody globulin to ferritin by glutaraldehyde. Comparison between the one-stage and the two stage method // J. Immunol. Meth. - 1973. - V3. -P.137-142.

281. Palleroni N. Family of Pseudomonadaceae // Bergey's manual of systematic bacteriology / Ed. By Krieg N., Holt G.- Baltimore, 1984. VI.- P. 141-199.

282. Pate J.L., Ordal J.E. The fine structure of choudrococcus colum-naris. III. The surface layers of choudrococcus columnaris // J. Cell. Biol. -1967. V35, N1. - P.37 - 44.

283. Penn C.W., Luke C.J. Bacterial flagellar diversity and significance in pathogenesis // FEMS Microbiol. Lett. 1992. - P. 331 - 336.

284. Perret J.L., Vidal D., Thibault F. Pulmonary melioidosis // Rev. Pneumol. Clin. 1998. - P.6365 - 6372.

285. Perry M.B., Mac Lean L., Schollardt T. et al. Structural characterization of the lipopolysaccharide antigens of Burkholderia pseudomallei // Infect. Immun. 1995. - V63. - P.3348 - 3352.

286. Pieters J. Entry and survival of pathogenic mycobacteria in macrophages // Microbes Infect. 2001. - V3, N3. - P.249 - 255.

287. Pieters J., Gatfield J. Hijacking the host: survival of pathogenic mycobacteria inside macrophages // Microbiol. 2002. - VI0, N3. - P. 142146.

288. Piliouras P., Ulett G.C., Ashhurst Smith C. Hirst R.G., Norton R.E. A comparison of antibiotic susceptibility testing methods for cotrimoxa-zole with Burkholderia pseudomallei II Int. J. Antirnicrob. Agents. - 2002. -V19, N5. -P427 -429.

289. Pitt T.L., Aucken H., Dance D.A. Homogeneity of 7 V lipopoly-saccharide antigens in Pseudomonas pseudomallei II J. Infect. 1992. - P. 139-146.

290. Pollack M. In: Mandell G.L., Benett J.E., Dolin R. Principles and practice of infectious diseases Pseudomonas aeruginosa editors // New York: Churchill. Livingstone. 1995.-p. 1980-2003.

291. Popov S.F., Tikhonov N.G., Kyrilov V.Y. Influence of capsule formation in Pseudomonas pseudomallei and Pseudomonas mallei on their relations with host cells // Immunology and Infections Diseases. 1994. - N5. -P.142 - 145.

292. Prabhakaran K., Harris E.B., Randhawa B. Regulation by protein kinase of phagocytosis of Mycobacterium leprae macrophages // J. Med. Microbiol. 2000. - V49, N4. - P.339 - 342.

293. Propost A., Vigier M. Isolement au Tchad (Afrique centrale) de deux souches de Malleomyces pseudomallei //Ann. Inst. Pasteur. — I960. -V98, N3. -P.461 463.

294. Puthucheary S.D., Vadivelu S., Cecile C., Kum Thong W., Ismail G. Short report: Electron microscopic demonstration of extracellular structure Burkholderia pseudomallei II Am. J. Trop. Med. Hyg. 1996. - V54. - P.313 - 314.

295. Raja N.S. Localized melioidosis // J. Рак. Med. Assoc. ~ 2003. -V53, N8. P.373 - 374.

296. Rao P.S., Dhawan R., Shivananda P.G. Burkholderia pseudomallei infections // Trop. Doct. 2002. - V32, N3. - P.174 - 175.

297. Razar N., Ismail G. Interaction of Human polymorphnonuclear leukocytes with Pseudomonas pseudomallei II J. Gen. Appl. Microbiol.1982. V28. - P.509-518.

298. Redfearn M.S., Palleroni N. J., Stanier R.J. A comparative study of Pseudomonas pseudomallei and Bacillus mallei II J. Gen. Microbiol. -1966. V43, N2. - P.293 - 313.

299. Reechaipichitkul W., Tantiwong P. Clinical features of community-acquired pneumonia treated at Srinagarind Hospital, Khon Kaen, Thailand // Southeast Asian J. Trop. Med. Public. Health. 2002. - V33, N2. -P.355-361.

300. Reichert R.W., Das N.E., Zarn L.S. Adherence properties of Pseudomonas pili to epithelial cells of the human cornea // Current Eye Res.1983.-V2.-P.289-293.

301. Reiner N. Altered cell signaling and mononuclear phagocyte deactivation during intracellular infection // Immunol. Today. 1994. - VI5. -P.374 - 380.

302. Richard P., Le F.R., Chamoux C., Pannier M., Espaze E., Richet H. Pseudomallei aeruginosa outbreak in a burn unit: role of antimicrobials in the emergence of multiply resistant strains // J. Infect. Dis. 1994. - P.377-383.

303. Richet G. Rayer's studies on the contagion of glanders (18371843) // Hist. Sci. Med. 2002. - V36, N4. - P.389 - 408.

304. Rogers H., Tripp C., Vnanue E. Different stages in the natural and acquired resistance to an intracellular pathogen // The Immunologist. 1995. -V3.-P.152- 155.

305. Rogers H.J. Bacterial growth and the cell envelopes // Bacteriol. Rev. 1970. - V34. - P. 194 - 204.

306. Roitt I.M. Essential Immunology. Oxford, 1997.

307. Rosenberg M., Guthik D., Rosenberg E. Adherence of bacteria to hydrocarbous a simple method for measuring cell surface hydrophobicity // FEMS Microbiol. - 1980. - V9, N1. - P.29 - 33.

308. Rosenshine I., S. Ruschkowski and B.B. Finlay. Inhibitors of cy-toskeletal function and signal transduction to study bacterial invasion // Me-tods. Enzymol. 1996. - P. 467 - 476.

309. Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al. Public health assessment of potential terrorism agents. // Emerg. Infect. Dis. 2002. - V8, N2. -P.225-230.

310. Russell N.S. Mucoid Pseudomonas and the cystic fibrosis lung // Biochem. Soc. Trans. 1989. -VI7, N 3. -P. 469-471.

311. Russell P., Eley S.M., Ellis J., Green M., Bell D.L., Kenny D.J., Titball R.W. Comparison of efficacy of ciprofloxacin and doxycycline against experimental melioidosis and glanders // J. Antimicrob. Chemother. 2000. -V45,N6. -P.813 - 818.

312. Saika Т., Kobayashi I., Hasegawa M., Nishida M. Antimicrobial resistance and DNA-flngerprinting pattern of Burkholderia cepacia blood isolates // J. Infect. Chemother. 2002. - V8, N4. - P.341 - 344.

313. Sajjan U.S., Xie H., Lefebre M.D., Valvano M.A., Forstner J.F. Identification and molecular analysis of cable pilus biosynthesis genes Burkholderia cepacia II Microbiology. 2003. - V49, Pt4. - P.961 - 971.

314. Sajjan V., Liu L., Lu A., Spilker Т., Forsther J., Li Puma J.J. Lack of cable pili expression by cblA containing Burkholderia cepacia complex // Microbiology. - 2002. - V148, Pt 11. - P.3477 - 3484

315. Sammons D., Adams L., Nishizawa E. Ultrasensitive silver -based color staining of polypeptides in polyacrilamide gels // Electroforesis. -1981.-N2.-P.135- 141.

316. Samuel M., Ti T.Y., Interventions for treating melioidosis // Cochrane. Database. Syst. Rev. 2002. - V4. - P. 1258 - 1263.

317. Sanford, J. P. Pseudomonas species (including melioidosis and glanders), In G. L. Mandell, R. G. Douglas, Jr., and J. E. Bennett (ed.). Principles and practice of, infectious diseases // Churchill. Livingstone., New York, N.Y. 1995. - P.2003 - 2009.

318. Sangchan A., Mootsikapun P., Mairiang P. Splenic abscess: clinical features, microbiologic finding, treatment and outcome // J. Med. Assoc. Thai. 2003. - V86, N5. - P.436-441.

319. Sansonetti P. Phagocytosis of bacterial pathogens: implications in the host response // Semin. Immunol. 2001. - V13, N6. - P.381 - 390.

320. Schlesinger L.S. Role of mononuclear phagocytes in M. tuberculosis pathogenesis // J. Investig Med. 1996. - V44, N6. - P.312-323.

321. Schneller A., Colder W., Burchard G. Persistent pulmonary inflammation in a patient who spent time in Asi Melioidosis // Radiologe. -2003. V43, N3. - 247 - 249.

322. Segonds G., Bingen В., Couetdic G., et al. Genotypic Analysis of Burkholderia cepacia isolates from В French cystic fibrosis centers // J. Clin. Microbiol. 1997. - V35. - P. 2055 - 2060.

323. Sexton M.M., Jones A.L., Chaowaqul W., Woods D.E. Purification and characterization of a proteases from Pseudomonas pseudomallei II Can. J. Microbiol. 1994. - V40, N11.- P.903 - 910.

324. Shaginian I.A., Chernukha M.Iu. Bacteria of the Burkholderia cepacia complex: specific features of diagnostics, genome organization and metabolism // Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 2003. - P.3 - 10.

325. Sibley L.D., Franzblau S.G., Krahenbuhl J.L. Intracellular fate of Mycobacterium leprae in normal and activated mouse macrophages // Infect, and Imaun. 1987. - V55, N3. - P. 680-685.

326. Sibley L.D., Andrews N.W. Cell invasion by un-palatable parasites // Traffic. 2000 - VI, N2. - P. 100-106.

327. Silva M.T., Appelberg R., Nazare M., Macedo P. Mp. In vivo killing and degradation of Mycobacterium avium within mouse peritoneal macrophages // Infect. Immun. 1987. - V55, N9. - P. 2006-2016.

328. Smith M.D., Angus B.J., Withickanun V., White N.J. Arabinose assimilation defines a honvirulent biotipe of Burkholderia pseudomallei II Infection and Immunity. 1997. - V65. - P. 4319 - 4321.

329. Speert D.P. Case 1: assessment. Burkholderia cepacia II Paediatr. Respir. Rev. 2002. - V3, N3. - P.273 - 274.

330. Speert. D.P. Advances in Burkholderia cepacia complex I I Paediatr. Respir. Rev. 2002. - V3, N3. - P.230 - 235.

331. Spinger E.L., Roth I.L. The ultrastructucture of the capsules of Diplococcus pneumniae and Klebsiella pneumoniae stained with ruthenium red // J. Gen. Microbiol. 1973. - V74, N1. - P.21 - 31.

332. Srirompotong S., Reechaipichitkul W. Disseminated septicaemic melioidosis: an unusual presentation of masticator space infection // J. Laryn-gol. Otol. 2003. - VI17, N5. - P.417-418.

333. St Geme J.W. Bacterial adhesins: determinants of microbial colonization and pathogenicity // Adv. Pediatr. 1997. - N44. - P.43 - 72.

334. Stafford J.L., Neumann N.J, Belosevic M. Macrophage-mediated innate host defense against protozoan parasites // Crit. Rev. Microbiol. -2002. V28, N3. - P.l87 - 248.

335. Steinmetz I., Nimtz M., Wray V., Reganzerowski A., Brenneke B. Exopolysaccharides of Burkholderia pseudomallei II Acta. Tropica. 2000. -V74-P.211-214.

336. Steinmetz, I., Rohde, M., Brenneke, B. Purification and characterization of an exopolysaccharide of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei И Infect. Immun. 1995. - P.3959 - 3965.

337. Su Y.C., Lim K.P., Nathan S. Bacterial expression of the scFv fragment of a recombinant antibody specific for Burkholderia pseudomallei exotoxin // J. Biochem. Mol. Biol. 2003. - V36, N5. - P.493 - 498.

338. Tan J.K., Yip S.K., Png D.J., Moorthy P. Primary melioidotic prostatic abscess: presentation, diagnosis and management // ANZ J. Surg. -2002. V72, N6. - P.408 - 410.

339. Tito M.A., Miller J., Griffin K.F., Williamson E.D., Titball R.W., Robinson C.V. Macromolecular organization of the Yersinia pestis capsular F1 antigen insights from time-of-flight mass spectrometry // Protein Sci. -2001. V10, N11. - P.2408 - 2413.

340. Tomich M., Herfst C.A., Golden J.W., Mohr C.D. Role of flagella in host cell invasion by Burkholderia cepacia II Infect. Immun. — 2002. — V70, N4. P.l 799 - 1806.

341. Tran D., Tan H.H. Cutaneous melioidosis // Clin. Exp. Dermatol. 2002. - V27, N4. - P.280 - 282.

342. Underhill D.M., Ozinsky A. Phagocytosis of microbes: complexity in action II Annu Rev. Immimol. 2002. - V20. - P.825 - 852.

343. Ushida J., Sekzaki Т., Hashimoto K., Terrakado N. Associacion of the encapsulation of B. anthracis with a 60 megadalton plasmid // J. Gen. Microbiol. 1985. - V131.-P.363 - 367.

344. Vaca Pacheco Sergio, Cervantes-Vega Y.Carlos. Factores de viru-lencia de Pseudomonas aeruginosa I I Rev. Latino amer. microbiol. - 1988. - V30, N2. - P.87-90.

345. Van Creve J.R., Ottenhoff Т.Н., van der Meer J.W. Innate immunity to Mycobacterium tuberculosis II Clin. Microbiol. Rev. 2002. - VI5, N2. - P.294-309.

346. Van Delden C., Iglewski B.H. Cell to - Cell Signaling and Pseudomonas aeruginosa II Infections Emerging Diseases. - 1998. - V4, N4. -P.551 -560.

347. Velasco-Velazquez M.A., Barrera D., Gonzales-Arcnas A., Rosales C., Agramonte-Hevia J. Macrophage Mycobacterium tuberculosis interactions: role of complement receptor 3 I I Microb. Pathog. - 2003. - V35, N3 -P.125 -131.

348. Venable J.H., Coggeshall R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy // J. Cell. Bi-ol. 1965. - V25, N3. - P.407 - 408.

349. Verhoef J. The phagocytic process and the role of complement in host defense // J. Chemother. 1991. - V3, Suppl 1. - P.93 - 97.

350. Vieira M., Dutra J.M„ Carvalho T.M., Cunha-e-Silva N.L., Souto-Padron Т., Souza W. Cellular signaling during the macrophage invasion by Trypanosoma cruzi II Histochem. Cell. Biol. 2002. - VI18, N6. - P.491-500.

351. Vinion Dubiel A.D., Goldberg J.B. Lipopolysaccharide of Burkholderia cepacia complex // J. Endotoxin Res. - 2003. - V9, N4. -P.201-213.

352. Vorachit M., Lam K., Jayanetra P., Costerton J.W. Electron microscopy study of the mode of growth of Pseudomonas pseudomallei in vitro and in vivo // J. Trop. Med. Hyg. 1995. - V98, N6. - P. 379 - 391.

353. Voskuhl G.W., Cornea P., Bronze M.S., Greenfield R.A. Other bacterial diseases as a potential consequence of bioterrorism: Q fever, brucellosis, glanders, and melioidosis // J. Okla.'State. Med. Assoc. 2003. - V96, N5. -P.214 -217.

354. Wadsworth S.J., Goldfine H. Mobilization of protein kinase С in macrophages induced by Listeria monocytogenes affects its internalization and escape from the phagosome // Infect. Immun. 2002. - V70, N8. -P.4660 -4650.

355. Walther-Mauruschat A., Aragno M., Mayer F., Schegel H. Cell envelope, membrane and cytoplasmic inclusions // Arch. Microbiol. 1977. -VI14, N2. -P.101 - 110.

356. Warawa J., Woods D.E. Melioidosis vaccines // Expert. Rev. Vaccines. 2002. - VI, N4. - P.477 - 482.

357. Ward P.A. Phagocytes and the lung // Ann. N. Y. Acad. Sci. -1997.-V832.-P.304-310.

358. Watson D.C., Robbins J.B., Szu S.C. Protection of mice against Salmonella typhimurium with an O-specific polysaccharide-protein conjugate vaccine // Infect. Immun. 1992. - P.4679 - 4686.

359. Webster P. Early intracellular events during internalization of Lis-tena monocytogenes by 1774 cells // J. Histochem. Cytochem. 2002. - V50, N4.-P.503-518.

360. Weingart C.L., Hooke A.M. Regulation of expression of the nonhemolytic phospholipase С of Burkholderia cepacia И Curr. Microbiology. -1999. V39, N6. - P.336 - 341.

361. White N.J. Melioidosis // Lancet. 2003. - V361. - P.1715 -1722.

362. Whitmore A., Krishnaswami C.S. An account of the disco very of the hitherto undeseribed infective disease occurring among the population of Rangoon // Indian. Med. Gazette. - 1912. - N47. - P.262-267.

363. Williams P. Role of the cell envelope in bacterial adaptation to growth in vivo in infections // Biochemistry. 1988. - V70. - P.987 - 1011.

364. Wizemann T.M., Adamou J.E., Langerman S. Adhensins as Targets for Vaccine Development // Emerging Infectious Diseases. 1999. - V5, N3. -P.395 -403.

Информация о работе

Попов, Сергей Федорович
доктора медицинских наук
Саратов, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Ультраструктурно-функциональный анализ патогенных буркхольдерий и особенности их взаимодействия с макроорганизмом при развитии инфекционного процесса - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы