Экспресс-детекция и выявление генов факторов патогенности бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций

Орлова, Клавдия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экспресс-детекция и выявление генов факторов патогенности бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экспресс-детекция и выявление генов факторов патогенности бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций"

На правах рукописи

ОРЛОВА КЛАВДИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ЭКСПРЕСС-ДЕТЕКЦИЯ И ВЫЯВЛЕНИЕ ГЕНОВ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ

03.00.07-микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной Министерства Здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

В.Н. Мазепа

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Г.И. Григорьева кандидат медицинских наук Л.В. Пожалостина

Ведущее учреждение: Военно-медицинская академия, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится « 2004 г. в / /] часов

на заседании диссертационного совета Д 208.046.01 при Московском научно - исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского по адресу: 125212, г. Москва, ул. Адмирала Макарова, д. Ю.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Автореферат разослан «

/ » ¿¿Н1аА 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

С.Ю. Комбарова

гзггч <

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

В настоящее время острые кишечные инфекции продолжают оставаться серьезной проблемой для здравоохранения многих стран, в том числе и России. В последние годы из-за снижения уровня жизни и ухудшения экологической ситуации в нашей стране отмечается рост заболеваемости острыми кишечными инфекциями, в особенности шигел-лезом (Черкасов Б.Л., 1997; Сергевнин В.И.,1999).

Согласно официальным данным службы Госсанэпиднадзора, по России в 80% случаев кишечных заболеваний не выявляется этиологический агент. Несовершенство методической лабораторной базы ЛПУ приводит к тому, что диагностика ОКИ во многих случаях поздняя, а число диагностических ошибок достигает 12,2-14,7% и остается стабильным (Ющук Н.Д., 2000; Покровский В.И. и др. 2002). В связи с этим важной задачей является разработка новых ускоренных, прямых, высокочувствительных и специфичных методов диагностики, обеспечивающих раннее выявление возбудителя и изучение его биологических свойств.

Всем этим требованиям соответствуют диагностические системы, базирующиеся на ПЦР-технологии: продолжительность анализа 6-7 часов, чувствительность до 10-100 бактерий в образце, практически 100% специфичность, возможность анализировать 100-200 и более образцов в день.

Быстрое, своевременное определение возбудителя, источника инфекции, круга инфицированных лиц является важным условием оперативного контроля над эпидемиологической ситуацией, целенаправленного государственного санитарно-эпидемиологического надзора за сырьем и пищевыми продуктами, оценки эффективности комплекса противоэпидемических мероприятий и назначения адекватной этио-

тропной терапии. РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

ВИКЛЯОТЕКА С.Я Я0«РК

Цель работы: разработка тест-системы для выявления бактерий рода Shigella и энтероинвазивных E.coli, совершенствование диагностики острых кишечных инфекций применением ПЦР-детекции наиболее распространенных бактериальных возбудителей диарейных заболеваний.

Задачи исследования:

1. Разработать ПЦР тест-систему для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Е. coli, позволяющую выявлять инфекционные агенты в клиническом материале, продуктах питания, объектах внешней среды.

2. Оптимизировать отечественные экспериментальные ПЦР тест-системы, выявляющие бактерии рода Salmonella, для внедрения в практическую медицину.

3. Определить целесообразность комплексного ПЦР-исследования клинического материала на наличие распространенных бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций.

4. Изучить распространенность генов факторов патогенности в клинических изолятах шигелл, сальмонелл и эшерихий.

Научная новизна исследований

Подобраны оригинальные праймеры, позволяющие проводить эффективный высококачественный синтез фрагмента консервативного участка оперона инвазивности шигелл и энтероинвазивных эшерихий. На базе данных праймеров разработана отечественная тест-система для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Е. coli в клиническом материале, продуктах питания и объектах внешней среды.

Получены новые данные о распространенности генов факторов патогенности в клинических изолятах шигелл, сальмонелл, эшерихий, выделенных в Волго-Вятском регионе. Показано широкое распространение генетических детерминант инвазивности (33,0%), токсигенности (22,6%) и подвижности (11,4%) микроорганизмов. Выявлено наличие у некоторых штаммов энтеробактерий генов шигоподобного токсина 1 типа. У штаммов

E. coli 0127 выявлены генетические структуры, сходные с генами адгезии tcpA V. cholerae и V. eltor. Полученные результаты вносят вклад в систему фундаментальных исследований биологических свойств микроорганизмов.

Обосновано применение комплексного ПЦР-исследования клинического материала для выявления наиболее значимых бактериальных возбудителей диарейных заболеваний. Использование комплексного подхода при диагностике острых кишечных инфекций позволило увеличить выяв-ляемость этиологического фактора более чем в 2 раза, получить новую объективную информацию о циркуляции Campylobacter ssp. и Yersinia en-terocolitica в Волго-Вятском регионе.

Научно-практическая значимость Созданная в ходе настоящей работы ПЦР тест-система для детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий, а также апробированные и в ряде случаев оптимизированные экспериментальные тест-системы для выявления бактерий родов Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica показали высокую эффективность при проведении исследований клинического материала и в санитарно-эпидемиологической практике.

Показана целесообразность внедрения отечественных ПЦР тест-систем для детекции бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций разработки последних лет в лабораторную практику ЛПУ и центров ГСЭН. Исследованные ПЦР тест-системы имеют высокую степень стандартизации всех стадий ПЦР, просты и удобны в работе, дают стабильный и воспроизводимый результат, позволяют повысить качество лабораторной диагностики кишечных инфекций и санитарно-эпидемиологического надзора за диарейными заболеваниями.

Использование метода ПЦР для детекции бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций и изучения их патогенных свойств дает возможность получить новую научную информацию о циркуляции эпидемически значимых штаммов энтеробактерий в регионах.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанная ПЦР тест-система, основанная на оригинальных праймерах, специфичных к оперону инвазивности, позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью проводить выявление шигелл и эн-тероинвазивных эшерихий в клиническом материале от больных острыми кишечными инфекциями.

2. Применение ПЦР-детекции шигелл и сальмонелл позволяет более чем в 2 раза увеличить эффективность выявления указанных инфекционных агентов в клиническом материале и при проведении санитарно-эпидемиологических исследований.

3. Экспериментальные отечественные ПЦР тест-системы для изучения биологических свойств энтеробактерий позволяют получать новую, объективную информацию о распространенности генетических детерминант факторов патогенности в клинических изолятах Shigella, Salmonella, Е. coli.

4. Методически и экономически целесообразно комплексное ПЦР-ис-следование клинического материала на наличие бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica при проведении первичного обследования больных острыми кишечными инфекциями.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены на научно-практическом симпозиуме "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" (Москва, 2002), на научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Н. Новгород, 2003), на научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Ел-кина И.И. "Актуальные проблемы эпидемиологии инфекционных болезней" (Н.Новгород, 2003), на заседании Ученого совета и межлабораторного семинара Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н.Блохиной. По теме диссертации опубликовано 10 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 143 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 13 таблицами и 12 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов и их обсуждений, заключения, выводов, списка литературы, содержащего 192 источника, из них 114 иностранные.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Объектами исследований являлись 263 штамма энтеробактерий родов Shigella, Salmonella, Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter из коллекций ННИИЭМ и цеха бактериофагов НП «ИМБИО»; 368 штаммов энтеробактерий, выделенных от больных острыми кишечными инфекциями, 525 проб клинического материала (фекалии, ректальные пробы); 174 пробы продуктов питания и смывов с объектов внешней среды.

Выражаем глубокую благодарность Лобановой Г.И.,Волковой М.А., Картошкиной P.M., и Каташиной Г,М. - сотрудникам ДИБ №8 г. Н. Новгорода за предоставление клинического материала и свежевыделенных культур энтеробактерий.

Отдельные стадии метода полимеразной цепной реакции выполнялись сотрудниками лаборатории: к.б.н. Мазепой В.Н., к.б.н. Маховой М.А., к.б.н. Черневской О.М., к.м.н. Бруснигиной Н.Ф., н.с.Скобло Л.Е.

В работе были использованы молекулярно-биологические методы: по-лимеразная цепная реакция, анализ плазмидных профилей бактерий, компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей ДНК бактерий. Всего проведено 2472 ПЦР-исследования, 164 анализа плазмидного состава бактерий.

При создании тест-систем для выявления генов факторов патогенно-сти энтеробактерий проводили подбор и синтез праймеров на основе компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей ДНК генов с применением пакета программ «DNA-star».

Для оптимизации метода ПЦР к практическому применению был проведен сравнительный анализ различных способов пробоподготовки к проведению ПЦР: прогревание на кипящей водяной бане, ферментативный лизис с фенольно-хлороформной депротеинизацией, лизис нитрозогуани-динтиоцианатом с сорбцией ДНК на силикагеле.

Для характеристики патогенных свойств клинических изолятов энтеробактерий применяли лабораторные экспериментальные ПЦР тест-системы с праймерами к генам LT, ST, VT токсинов и оперона инвазивности шигелл и эшерихий, экспериментальную ПЦР тест-систему "E.coli tox (VT-1, VT-2, Н7)" производства ЦНИИЭ (Москва), а также экспериментальную ПЦР тест-систему производства НИИМ МО РФ (Киров) с праймерами к гену холерного энтеротоксина ctxA V. cholerae и к гену адгезии tcpA холерных вибрионов.

Выявление продуктов амплификации проводили методом электрофореза в 2% агарозном геле, электрофореграммы просматривали на трансиллюминаторе в ультрафиолетовом свете и фотографировали на фотопленку «Микрат 300». Впоследствии обработка изображения проводилась при помощи компьютерной программы «Биотест» фирмы "Keklab" (Москва).

Изучение плазмидного состава чистых культур энтеробактерий проводили методом вертикального электрофореза по Экхардту (Eckhardt Т., 1978) и "литиевым" методом (Леванова Г.Ф. и др., 1995).

Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью персонального компьютера с применением статистических функций программы Microsoft Excel (раздел описательная статистика). Определение значимости данных при сравнении двух альтернативных рас-

пределений проводили с использованием критерия хи-квадрат (Урбах В.Ю. Биометрические методы, Москва, "Наука", 1964, С. 237-239)

Результаты исследований и их обсуждение Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий

Для исследования чистых культур энтеробактерий из коллекций Нижегородского НИИЭМ и предприятия по производству бакпрепаратов "Имбио" нами были разработаны ПЦР тест-системы, выявляющие гены факторов патогенности энтеробактерий: LT, ST, VT1 токсинов и оперона инвазивности шигелл и эшерихий.

С применением программ «DNA-star» на базе НИИ биоорганической химии АН РСФСР им М.М. Шемякина (Москва) был проведен компьютерный анализ, подбор и синтез праймеров, специфичных к участкам ДНК генов факторов патогенности энтеробактерий.

Праймеры, специфичные к участку ДНК гена оперона инвазивности шигелл и энтероинвазивных эшерихий (inv):

SF-1 5' - GGAAGCTTAATACTCCTGAACGGCG - 3'

SF 2 5' - GGAAGCTTAGGTGTCGGCTTTTCTG - 3';

Реакционный буфер готовили по руководству Саики Р. с авторами "Анализ генома" (Москва, "Мир", 1990, с. 176-190). Для проведения ПЦР был использованы дНТФ производства фирмы "Sigma" (США) и фермент термостабильная Tag-полимераза, производства Вильнюсского НПО "Фермент".

Температура отжига праймеров рассчитывалась по формуле:

Тотж-= 2(А+Т) + 4(C+G) - 5

К началу нашей работы отечественных ПЦР тест-систем для детекции бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций в клиническом материале не существовало.

Все разработанные нами ПЦР тест-системы использовались для изучения биологических характеристик чистых культур энтеробактерий, при этом было выявлено, что практически все штаммы шигелл вне зависимости от вида и 3 штамма Е.соИ сероварианта 0124:К72 взаимодействовали с праймерами, специфичными к участку ДНК оперона инвазивности. Отрицательный результат был получен с некоторыми штаммами шигелл, у которых была выявлена элиминация крупных плазмид (140мД и 120 мД), содержащих по данным литературы оперон инвазивности (8азака\уа С. й а!., 1986; Романова Ю.М., 1997).

Программа амплификации фрагмента гена оперона инвазивности: 94°С-3 мин} 1; 94°С - 1 мин, 55°С - 1 мин, 71°С - 1 мин}35; 72°С - 5 мин} 1.

Амплификацию проводили в режиме матричного регулирования температуры на приборе "Ампли-250" фирмы "Биоком" (Москва). Размер синтезированного фрагмента ДНК - 760 п.н.

Экспериментальный вариант тест-системы был апробирован при расследовании случаев группой заболеваемости дизентерией в соматических стационарах г. Нижнего Новгорода. Результаты исследования, представленные в табл. 1 свидетельствовали о перспективности применения метода ПЦР в диагностике ОКИ.

Таблица 1

Результаты исследования клинического материала при расследовании вспышек ОКИ в соматических стационарах г. Н.Новгорода

Стационар Количество обследованных (абс.) Результат обследования

ПЦР (абс.) Бак. анализ (абс.)

Психиатрическая больница №1 40 7 -

Автозаводский дом ребенка 26 6 -

Всего 66 13 -

Для повышения чувствительности исследования мы дополнительно инкубировали пробы в селенитовом бульоне в течение 18 часов при 37°С, что существенно увеличивало продолжительность исследования.

Совершенствование тест-системы в дальнейшем проводилось совместно с лабораторией молекулярно-биологической диагностики ЦНИИЭ МЗ РФ.

Для увеличения чувствительности и специфичности мы апробировали принцип "буст"-ПЦР. В данном варианте используется две пары прайме-ров, но амплификация проходит в один этап в одной реакционной смеси.

Компьютерный подбор, дизайн и синтез праймеров выполнялся сотрудниками лаборатории молекулярной диагностики ЦНИИЭ, проверка специфичности праймеров на чистых культурах энтеробактерий, апробация тест-системы на клиническом материале проводилась нами на базе ННИЭМ им. акад. И.Н.Блохиной. По результатам совместной работы для тест-системы были отобраны следующие 2 пары праймеров:

внешние: БЫ 5' -ОСТАСТТСТТТСТОСАТСОТАТССТСАСС-З';

8Ь2 5' - СТААвС АТТСЮССС АСОСГССТГСТС-З'; внутренние: БЬЗ 5' - ССАСАТТТТСААСЗСТСОТТС-З';

8Ь4 5' - йОССААСААТТАТТТССГГС-З'.

При оценке оптимальности выделения и очистки ДНК из клинического материала ориентировались по эффективности синтеза фрагмента ДНК в ПЦР. Выбирались те варианты пробоподготовки, после которых на электрофореграмме продукта ПЦР регистрировалось большее количество специфического фрагмента при отсутствии продуктов неспецифического синтеза.

Метод кипячения на водяной бане был пригоден для работы только с чистыми культурами микроорганизмов. При использовании методов ферментативного лизиса и фенольно-хлороформной депротеинизации необходимо было проводить культивирование пробы в МПБ в течение 18 часов, чтобы получить достаточное количество ДНК для амплификации. Наибо-

лее оптимальным был метод неферментативного лизиса нитрозогуанидин-тиоцианатом с последующей сорбцией ДНК на силикагеле. Метод является стандартным применительно к любому биологическому субстрату и позволяет получать максимальное количество чистого препарата нуклеиновых кислот без стадии культивирования пробы. Для обработки проб использовали набор реактивов "ДНК-сорб Б" разработки ЦНИИЭ МЗ РФ (Москва).

В работе с новым вариантом тест-системы "Ampli-Inv" амплификация проводилась на модели термоциклера "Терцик МС2" фирмы «ДНК-технология» (г. Москва), который обеспечивает проведение ПЦР в условиях и матричного, и активного регулирования процесса амплификации.

Программа "буст"-ПЦР для синтеза фрагмента оперона инвазивности : 95°С - 3 мин.} 1; 95°С - 15 сек., 65°С - 15 сек., 72°С - 15 сек.} 10; 95°С -11 сек., 55°С - 11 сек., 72°С - 11 сек.} 30; 72°С - 1 мин.} 1.

Размер синтезированного фрагмента ДНК - 348 п.н.

Усовершенствованием приборной базы, использованием режима активного регулирования нам удалось сократить длительность отдельных стадий ПЦР до 10-15 сек и значительно уменьшить общую продолжительность процесса (до 1,5 часов), оптимизировать и упростить исследования, повысить их качество, что было продемонстрировано при лабораторно-экспериментальном изучении нового варианта ПЦР тест-системы.

Тест-система стабильно давала положительный результат при концентрации ДНК S. flexneri 2а 10"" г/мл. Аналитическая чувствительность тест-системы "Ampli-Inv" составила 500 кл/мл. По результатам исследования клинического материала чувствительность тест-системы составила 97,3 %, а специфичность - 95,4 %.

На разработанную ПЦР тест-систему "Ampli- Inv" подготовлена научно-техническая документация (ВФС, ЭПР, инструкция по применению). Документация прошла первый этап проверки в ГИСКе им. Л.А.Тарасевича (Москва).

Дополнительно специфичность тест-системы была исследована на коллекции чистых культур энтеробактерий: всех видов шигелл, различных серовариантов эшерихий, бактериях родов Salmonella, Klebsiella, Enterobacter и др. Все свежевыделенные штаммы бактерий рода Shigella и культуры Е. coli 0124:К72 дали положительный результат в ПЦР. Проведенные исследования подтвердили литературные данные, из которых известно, что бактерии данного сероварианта Е. coli имеют оперон инвазивности, идентичный шигеллезному (Покровский В.И., 1985). Штаммы энтеробактерий других родов давали отрицательный результат.

В ходе лабораторных испытаний тест-системы были проведены эксперименты, в которых амплификация осуществлялась только с пары "внутренних" праймеров. Такой "упрощенный" вариант ПЦР не отличался существенно по чувствительности и специфичности от исходного варианта, основанного на принципе "буст"-ПЦР, но оказался менее затратным и занимал меньше времени. В дальнейшем исследования проводили с использованием одной пары праймеров и программы амплификации в следующем режиме: 95°С - 5 мин. } 1; 95°С - 10 сек., 65°С - 10 сек., 72°С - 10 сек.} 42; 72°С - 1 мин. }1. Размер синтезируемого фрагмента ДНК оперона инвазивности шигелл и EIEC - 348 п.н.

Клинические испытания ПЦР тест-системы "AMpli-Inv" были проведены на базе нижегородской ДИБ №8. За период с 2001 по 2002 год было исследовано 165 образцов клинического материала (фекальные пробы) от больных с диагнозами: ОКИ, дизентерия, гастроэнтерит, энтерит, пищевая токсикоинфекция, ОРВИ.

Все пробы параллельно исследовали микробиологическим методом в бактериологической лаборатории ДИБ №8.

Эффективность выявления шигелл в клиническом материале методом ПЦР была выше более чем в раза (28,5%) по сравнению с микробиологическим методом (11%). Статистическая обработка показала достоверность полученных результатов.

При сравнении данных ПЦР и бактериологического анализа были выявлены 4 варианта результатов (рис.1).

116

ИПЦР+БАК+

■ ПЦР+БАК-

■ ПЦР-БАК+ □ ПЦР-БАК-

Рис. 1. Варианты результатов, полученных при параллельном исследовании клинического материала на наличие шигелл и EIEC методом ПЦР и бактериологическим методом (п=165)

Результаты исследования показали, что высокая чувствительность метода ПЦР позволяет выявлять низкие концентрации возбудителя, которые бактериологическим методом не выявляются. Кроме того, метод ПЦР выявляет микроорганизмы, находящиеся в некультивируемом состоянии, которое недавно было показано для грамотрицательных бактерий, в том числе и для шигелл (Романова Ю.М. и др., 1993; Гинцбург Л.А. и др., 1997, 1999; Домарадский И.В., 1997; Corwell P.R. et al., 1994). Такое состояние микроорганизмов характеризуется снижением метаболической активности в неблагоприятных условиях и неспособностью расти на питательных средах. При этом бактерии сохраняют свой нуклеотидный комплекс и жизнеспособность и при смене условий на благоприятные начинают активно размножаться.

Разработанная ПЦР тест-система выявляет не только бактерии рода Shigella, но и энтероинвазивные эшерихии, которые в бактериологической лаборатории ДИБ №8 не выявляют из-за отсутствия специфических антисывороток.

Как видно из таблицы 2, методом ПЦР шигеллы были выявлены только в клинических образцах, полученных от детей с диагнозом ОКИ и дизентерия. Полученные данные статистически достоверны.

Таблица 2

Выявление бактерий рода Shigella у больных с различными клиническими диагнозами

Диагноз Количество обследованных Выявлено шигелл

Методом ПЦР Бактериологическим методом

Абс.ч. % Абс.ч. %

ОКИ 49 30 61,2 8 16,3

Дизентерия 18 17 94,4 10 55,5

Гастроэнтерит 31 - - - -

Энтерит 22 - - — -

ОРВИ 18 - - - -

Пищевая токсико-инфекция 27 - - - -

Всего 165 47 28,5 18 11

В процессе исследовательской работы продолжалось совершенствование экспериментального варианта ПЦР тест-системы: с 2003 года тест-система комплектуется внутренним контрольным образцом (ВКО), который позволяет выявлять ложноотрицательные результаты при ингибировании ПЦР компонентами исследуемого образца и системой антиконтаминаци-онной защиты урацил - урауцилДНКгликозилаза для исключения ложно-положительных результатов.

Апробация и оптимизация к проведению практических исследований экспериментальных вариантов ПЦР тест-систем для детекции сальмонелл, кампилобактеров, йерсиний

Сальмонеллы занимают одно из ведущих мест в этиологии ОКИ и нередко бывают причиной вспышечных заболеваний желудочно-кишечного

тракта, поэтому экспресс-детекция сальмонелл в клиническом материале является актуальной проблемой.

Задачей нашего исследования являлась апробация на клиническом материале разработанных к настоящему времени двух экспериментальных отечественных ПЦР тест-систем для детекции бактерий рода Salmonella: ГУ МНИИЭМ им. H.A. Гамалеи РАМН (Москва) и ЦНИИЭ МЗ РФ (Москва).

Первая тест-система была разработана на основе праймеров к участку ДНК арабинозного оперона Ara С сальмонелл и позволяла амплифициро-вать фрагмент размером 500 п.н.

На первом этапе работы мы провели оценку специфичности тест-системы на коллекции чистых культур энтеробактерий. Все тестерные сероварианты сальмонелл дали положительный результат. Это свидетельствует о родовой специфичности данной тест-системы вопреки инструкции по применению, в которой указывалось о специфичности тест-системы только в отношении сероварианта Salmonella typhimurium.

Праймеры тест-системы не взаимодействовали ни с одним из микроорганизмов других родов энтеробактерий, включая антигенно близкие формы Citrobacter freundii 021,022,038; Е. coli Olli, 044, 077.

Аналитическая чувствительность на бактериях серовариантов S. typhimurium и S. enteritidis составила 1000 кл/мл.

Для проведения ПЦР разработчиками тест-системы была предложена сложная программа, состоящая из 5 отдельных блоков.Температура отжига праймеров на разных этапах амплификации составляла 60, 57, 55° С. На этапе проверки специфичности тест-системы нами были внесены изменения в программу, позволившие сократить время проведения ПЦР и улучшить качество результата: «горячий старт» сократили с 10 до 4 минут, процесс проводили при температуре отжига праймеров 57° С. Кроме этого, на 25% было уменьшено количество вносимых в реакционную смесь прай-

меров, что улучшило качество электрофореграммы. Проведенная модификация улучшила рабочие характеристики тест-системы.

Клинические испытания тест-системы осуществлялись при проведении плановых и экстренных мероприятий санитарно-эпидемиологического контроля над предприятиями промышленного птицеводства, общественного питания и торговли, и при расшифровке вспышек ОКИ. Микробиологические исследования на наличие сальмонелл проводили специалисты бактериологической лаборатории нижегородского центра ГСЭН. Всего было исследовано 78 проб. Результаты исследования свидетельствуют об эффективности выявления сальмонелл в смывах с объектов внешней среды и продуктах питания методом ПЦР более чем в 2 раза (табл.4). Следует отметить, что все пробы, давшие положительный результат при бактериологическом исследовании, оказались положительными и при ПЦР-детекции. Полученные результаты статистически достоверны.

Несмотря на очевидную эффективность данной тест-системы при проведении санитарно-эпидемиологических исследований, ряд недостатков не позволяет рекомендовать ее для практического применения. Для стабильной работы тест-системы необходим отбор пробы в накопительную среду и культивирование в течение 18 часов, что увеличивает продолжительность исследования. В процессе работы довольно часто наблюдался неспецифический синтез, затрудняющий интерпретацию результата. Компановка тест-системы каждым ингредиентом реакционной смеси по отдельности (6 пробирок) усложняет этап постановки ПЦР, увеличивает вероятность неспецифического синтеза.

Вторая тест-система для детекции бактерий рода Salmonella, апробированная нами - «Ампли- сенс - Salmonella species 250» (ЦНИИЭ МЗ РФ) - представляет собой комплект из двух пробирок с реакционными смесями. До начала амплификации смеси разделены восковой перегородкой, предотвращающей неспецифический синтез. Праймеры тест-системы по-

зволяют амплифицировать фрагмент гена белка фимбрий сальмонелл размером 225 п.о.

При первичном контроле система «Ампли-сенс - Salmonella species 250» показала такую же специфичность, как и тест-система разработки ГУ МНИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, а аналитическая чувствительность была выше в 2 раза и составила 500 кл/мл.

Применение на стадии подготовки проб сорбционной технологии, более удобное комплектование реактивов для ПЦР - всего 2 пробирки с компонентами, составляющими реакционную смесь, делает тест-систему разработки ЦНИИЭ МЗ РФ более технологичной и удобной в работе.

Практические испытания тест-системы проведены во время плановых и экстренных санитарно-эпидемиологических мероприятий. Микробиологический анализ проводили сотрудники областного и городского центров ГСЭН. Всего исследовали 96 проб. Проведенные исследования продемонстрировали более высокую эффективность ПЦР-детекции сальмонелл по сравнению с микробиологическим исследованием (табл. 4) и показали целесообразность использования метода ПЦР для первичной индикации сальмонелл в клиническом материале, продуктах питания и объектах внешней среды.

Таблица 3

Сравнительная характеристика отечественных экспериментальных ПЦР тест-систем для выявления сальмонелл

Тест- Продол-жи- Чувстви- Специ- Комплек- Культивиро-

система тельность тельность фичность тация вание пробы

Анализа (кл/мл)

1 26 час. 1000 95% Сложная Необходимо

2 6-8 час. 500 95% Удобная Не требуется

Примечание: 1 - ПЦР тест-система разработки ГУ МНИИЭМ РАМН им. Г.Ф. Гамалеи; 2 -ПЦР тест-система разработки ЦНИИЭ МЗ РФ.

Статистическая обработка полученных результатов показала, что вы-являемость сальмонелл методом ПЦР была почти в 2 раза достоверно выше по сравнению с бактериологическими исследованиями.

ПЦР тест-система «Ампли-сенс - Salmonella species 250» (ЦНИИЭ МЗ РФ) по многим рабочим характеристикам превосходит ПЦР тест-систему разработки ГУ МНИИЭМ им. H.A. Гамалеи РАМН (табл. 3) и является более технологичной и практичной для применения в лабораториях ЛПУ и центров ГСЭН.

Таблица 4

Результаты обследования на наличие бактерий рода Salmonella объектов пищевой промышленности и торговли г. Н. Новгорода с использованием отечественных экспериментальных ПЦР тест-систем

Используемая ПЦР тест-система для выявления бактерий рода Salmonella Исследовано смывов с объектов окружающей среды и продуктов питания (абс.) Выявлено сальмонелл

ПЦР-метод (абс.). Бактериоло-ги-ческий метод (абс.)

ПЦР тест-система разработки ГУ МНИИЭМ РАМН им. Г.Ф. Гамалеи 78 28 10

ПЦР тест-система разработки ЦНИИЭ МЗ РФ 96 29 19

Всего 174 57 29

Разработанные в 2003 году ЦНИИЭ МЗ РФ ПЦР тест-системы для детекции бактерий рода Campylobacter и Yersinia enterocolytica позволили нам изучить целесообразность комплексного ПЦР-исследования клинического материала на 4 наиболее распространенных бактериальных возбудителя ОКИ: шигеллы, сальмонеллы, кампилобактеры, йерсинии. Подобные исследования в РФ еще не проводились и представляют практический и научный интерес. Сальмонеллезы и шигеллезы занимают ведущее место в структуре ОКИ в РФ, а информация о кампилобактериозах и йерсиниозах

практически отсутствует в печати в связи с трудностями лабораторной диагностики этих кишечных инфекций (Черкасский Б.Л., 1997).

Все использованные в данной работе тест-системы являлись разработкой ЦНИИЭ МЗ РФ (Москва). Это позволило проводить исследования в стандартных условиях: использовать единый метод обработки проб, общую схему приготовления рабочей реакционной смеси, только две программы амплификации, что упростило проведение анализа и сократило продолжительность работ, снизило его себестоимость.

Всего проанализировано 153 клинических образца от детей в возрасте от 3 мес. до 14 лет с острыми кишечными заболеваниями спорадического характера. Микробиологический анализ проб от этих же больных проводили специалисты баклаборатории ДИБ №8 г. Нижнего Новгорода. Результаты исследования представлены в табл. 5.

Таблица 5

Результаты комплексного ПЦР-исследования клинического материала (п-153)

Микро-организмы Исследовано проб (абс.) Выявлено возбудителей ОКИ

ПЦР Бак. анализ

(абс.) % (абс.) %

Shigella 153 7 5,4 2 1,3

Salmonella 153 45 29,4 22 14,4

Campylobacter 153 3 2 - -

Yersinia 153 2 1,3 - -

Всего 153 57 37,3 24 15,7

Методом ПЦР этиологический фактор установлен в 37,3% случаев, при микробиологическом исследовании - в 15,7%, что свидетельствует о более высокой эффективности комплексной ПЦР-детекции бактериальных

возбудителей ОКИ. Полученные результаты являются статистически достоверными.

Следует подчеркнуть, что на всех этапах нашей работы была выявлена существенная разница в результатах детекции бактериальных возбудителей ОКИ методом ПЦР и бактериологическим методом. В большинстве случаев ПЦР была эффективнее бактериологического метода в 2 раза и более (табл. 6).

Таблица 6

Результаты исследования клинического материала на бактериальные возбудители ОКИ методом ПЦР и бактериологическим методом

(п=1018)

Микро-организмы Исследовано проб (абс.) Выявлено возбудителей ОКИ

ПЦР метод Баканализ

(абс.) % (абс.) %

Shigella 383 67 17,5 20 5,4

Salmonella 329 103 31,3 51 15,5

Campylobacter 153 3 1,9 Нет Нет

Yersinia 153 2 1,3 Нет нет

Всего 1018 175 17,2 71 7

Учитывая такие показатели как возможность стандартизации условий ПЦР-анализа при выявлении разных инфекционных агентов и высокую эффективность метода ПЦР мы считаем целесообразным проведение комплексного ПЦР-исследования при первичной детекции бактериальных возбудителей ОКИ.

Выявление факторов патогенности энтеробактерий с использованием отечественных экспериментальных ПЦР тест-систем Изучение распространенности генетических детерминант факторов патогенности энтеробактерий с использованием метода ПЦР - одно из пер-

спективных направлений современной микробиологии, имеющее как фундаментальное научное, так и практическое значение.

Факторы патогенности обусловливают эпидемическую значимость штаммов энтеробактерий и их способность инициировать инфекционный процесс в макроорганизме. Наличие у шигелл фактора инвазивности, а у эшерихий - адгезинов определяет патогенность штаммов. Если у бактерий дополнительно имеются гены токсинов, это значительно повышает их вирулентность, Такие штаммы вызывают особо тяжелые формы ОКИ (Рати-нерЮ.А.,1998; Шахмарданов М.З. 2000).

На первом этапе работы для изучения патогенных свойств энтеробактерий мы использовали лабораторные ПЦР тест-системы для выявления генов факторов патогенности энтеробактерий: ЬТ, вТ, УТ1 токсинов и оперона инвазивности шигелл и эшерихий. На базе НИИ биоорганической химии им М.М. Шемякина РАН (Москва) с применением программ «01ЧА-в1аг» мы провели компьютерный анализ, подбор и синтез праймеров, специфичных к консервативным участкам ДНК указанных генов. Комплектация тест-систем, расчет температуры отжига праймеров и подбор программы амплификации специфических фрагментов, проверку специфичности на чистых культурах энтеробактерий проводили аналогично тест-системе для выявления оперона инвазивности шигелл.

С применением экспериментальных ПЦР тест-систем был изучен 171 штамм (клинические изоляты энтеробактерий). В качестве контролей использовали штаммы из коллекций ННИИЭМ и отдела биологического контроля фирмы «Имбио». Наиболее распространенным в клинических изоля-тах энтеробактерий был фактор инвазивности (44,5%), в 8,2% штаммов выявлялся ген шигоподобного токсина 1, чаще он выявлялся у эшерихий (5,8%).

На втором этапе исследования мы изучали патогенные свойства клинических изолятов энтеробактерий с использованием 2-х отечественных экспериментальных ПЦР тест-систем: тест-системы для детекции виру-

лентных штаммов V. cholerae разработки НИИМ МО РФ (Киров) и тест-системы разработки ЦНИИЭ МЗ РФ (Москва) для идентификации Е. coli 0157:Н7. Первая тест-система позволяет выявлять ген холерного токсина (близкий аналог LT-токсина) и гены факторов адгезии V. cholerae и V. eltor.

По данным литературы между бактериями семейств Vibrionaceae и Enterobacteriaceae возможен обмен генетическим материалом, поэтому представляло интерес исследовать клинические изоляты энтеробактерий на наличие генов факторов патогенности холерного вибриона (Ильина Т.С., 2001; Haker J. et al., 1997). Было проверено 35 штаммов энтеропатогенных эшерихий разных серовариантов, 8 штаммов S.sonnei и 12 штаммов S.flexneri. В результате исследования токсигенные штаммы не были выявлены, с праймерами на ген адгезии взаимодействовали 3 штамма Е, coli серо варианта Ol27, при этом синтезировался один фрагмент ДНК размером около 300 п.о. Полученный результат свидетельствует о наличии у E.coli 0127 генетических структур сходных с геном адгезии холерного вибриона. Данный факт выявлен впервые.

Вторая ПЦР тест-система позволяла выявлять гены шигоподобных токсинов 1 и 2 (VT1, VT2) и белка жгутикового антигена Н7 Е. coli 0157:Н7. Клинические изоляты энтеробактерий были исследованы на наличие указанных генов и на ДНК оперона инвазивности шигелл и EIEC.

Полученные в ходе многолетних исследований результаты свидетельствуют о преимущественном распространении в клинических изолятах энтеробактерий генетических детерминант, ответственных за инвазивность (33,0%), токсигенность (22,6%) и подвижность (11,4%) микроорганизмов (табл.7).

По-видимому, эти гены шире распространены в популяциях энтеробактерий и стабильнее сохраняются при лабораторных манипуляциях с бактериями-хозяевами.

Таблица 7

Распространенность генов факторов патогенности в клинических изолятах энтеробактерий (п-368)

Микро-организмы Исследовано штаммов (абс.) Выявлены гены факторов патогенности (абс.)

VT 1 VT 2 LT ST ctxA tcpA Н7 Inv

Escherichia 140 22 - - - - 3 32 6

Shigella 163 61 - - - - - 8 116

Salmonella 65 не проводили не проводили 2

Всего Entero-bacteriaceae 368 83 - - - - 3 42 122

Из генетических детерминант токсигенности на двух этапах исследования выявлены только гены VT1 (22,6%). Причем на первом этапе исследования (1994-1996г.г.) выявлялось больше токсигенных E.coli. Однако в настоящее время ген VT1 чаще встречается в клинических изолятах S.flexneri 2а. Этот факт согласуется с литературными данными о том, что вид S.flexneri 2а, доминирующий сейчас в этиологической структуре возбудителей дизентерии в РФ, в ряде случаев вызывает глубокие поражения кишечника, и имеются случаи летальных исходов заболевания (Шахмарда-нов М.З., 2000; Ющук Н.Д. и др., 2002; Schuch R., 1997).

Проведенные исследования показали практически полное отсутствие у изученных изолятов сальмонелл генов факторов патогенности, характерных для эшерихий и шигелл. Исключение составили 2 штамма, у которых выявлены структуры, сходные с геном белка жгутикового антигена Н7.

Таким образом, несмотря на ряд несовершенств использованных тест-систем, получены оригинальные данные о распространении факторов патогенности в клинических изолятах Shigella, Salmonella, Е. coli, выделенных в Нижегородской области.

ВЫВОДЫ

1. Разработана ранее неизвестная отечественная ПЦР тест-система для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Е. coli, основанная на оригинальных праймерах к консервативному участку оперона инва-зивности.

2. Обнаружено, что эффективность выявления бактерий родов Shigella и Salmonella методом ПЦР при исследовании клинического материала, смывов с объектов внешней среды и продуктов питания в 2,5 раза выше, чем при микробиологичеком анализе.

3. Показана целесообразность комплексного ПЦР-исследования клинического материала на наличие бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolytica, позволяющего быстро и одновременно анализировать большое количество образцов, обнаруживать труднокультивируемые формы возбудителей, повысить эффективность выявления этиологического фактора острых кишечных инфекций более чем в 2 раза.

4. Выявлено присутствие генов инвазивности (33,0%) токсигенности (22,6%) и подвижности (11,4%) микроорганизмов в клинических изоля-тах энтеробактерий, выделенных в Волго-Вятском регионе. Токсиген-ные формы представлены штаммами E.coli и S.flexneri 2а, содержащими ген шигоподобного токсина 1. Выявлено наличие у E.coli 0127 генетических структур, сходных с геном адгезии холерного вибриона.

Список работ по теме диссертации

1. Блохина И.Н., Мазепа В.Н., Бруснигина Н.Ф., Орлова К.А., Макарова Т.Г., Векшина Н.В., Романова Т.В. Использование метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) для индикации бактерий рода Salmonella на объектах внешней среды // Сб. "Экология и здоровье". - Н.Новгород. - 1997. -С.21-22.

2. Мазепа В.Н., Бессараб Д.А., Уланова Т.И., Пузырев В.Ф., Барышева H.H., Орлова К.А. Разработка тест-систем (ДНК-зондов) для выявления факторов вирулентности энтеробактерий // Мол. генетика - 1994. - №4. -С.11-12.

3. Мазепа В.Н., Бруснигина Н.Ф., Черневская О.М., Орлова К.А., Быкова С.А., Черняева Г.А. Опыт использования ПЦР-диагностики в санитарно-эпидемиологической практике // Сб. "Экология и здоровье". -Н.Новгород. - 1998. - С.18.

4. Мазепа В.Н., Орлова К.А., Черневская О.М., Бруснигина Н.Ф., Скобло Л.Е. Создание мобильной ПЦР-лаборатории и апробация ее на базе ЦРБ г. Бора // В кн. Естественные факторы защиты в профилактике и лечении экологически обусловленных заболеваний - Н.Новгород. - 2000. -С.64-65.

5. Мазепа В.Н., Бруснигина Н.Ф., Черневская О.М., Орлова К.А., Скобло Л.Е., Махова М.А. Опыт работы центра индикации, идентификации и таксономии Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной // Сб. Фундаментальные и прикладные проблемы медицинской биотехнологии. - Москва, Н.Новгород. - 2000. - С.64.

6. Мазепа В.Н., Орлова К.А., Махова М.А., Царева A.C. Опыт применения ПЦР тест-системы для выявления Vibrio cholerae // Сб. Генодиагностика инфекционных заболеваний - Москва. - 2002. - С.282-283.

7. Мазепа В.Н., Орлова К.А., Черневская О.М., Махова М.А., Лобанова Г.И., Картошкина P.M. Выявление методом ПЦР бактерий рода Shigella в фекальных пробах от больных с острыми кишечными инфекциями //Сб. III международный медицинский форум "Человек и инфекция". - Н.Новгород. -2002.-С.71-72.

8. Мазепа В.Н., Черневская О.М., Шипулин Г.А., Бруснигина Н.Ф., Орлова К.А., Скобло Л.Е., Махова М.А., Кленина H.H. Принципы отбора, хранения и транспортировки биологических субстратов для проведения ПЦР-диагностики бактериальных и вирусных инфекций // Пособие для врачей. - Н.Новгород. - 2002. - 12 с.

9. Орлова К.А., Мазепа В.Н., Черневская О.М., Махова М.А., Лобанова Г.И.*, Картошкина P.M.* Выявление методом ПЦР бактерий рода Shigella в фекальных пробах от больных с острыми кишечными инфекциями // Сб. "Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии". - Москва. -2001.-С. 120-122.

10. Орлова К.А., Мазепа В.Н., Черневская О.М., Махова М.А., Лобанова Г.И., Картошкина P.M. Выявление методом ПЦР бактерий рода Shigella в фекальных пробах от больных с острыми кишечными инфекциями // Сб. "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении" - Москва. - 2002. - С.268-270.

Подписано в печать 15.06.2004. Формат 80x84 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Усл.печ.л. 1. Зак. 120.Тир.100.

Отпечатано на ризографе в НООО «Компьютерный экологический центр», Н.Новгород, ул.Минина, 3.

РНБ Русский фонд

2006-4 23524

2 3 ИЮ/^201

•о

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Орлова, Клавдия Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика бактерий - возбудителей острых кишечных инфекций.

1.2. Факторы патогенности бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций и их генетическая детерминация.

1.3. Молекулярно-биологические методы идентификации бактериальных возбудителей ОКИ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Методы взятия и транспортировки проб.

2.2. Методики выделения ДНК в процессе подготовки к проведению ПЦР.

2.3. Проведение ГШР-амплификации фрагментов генома энтеробактерий.

2.4. Регистрация результатов.

2.5. Учет результатов.

2.6. Анализ плазмидного состава энтеробактерий.

2.7. Статистическая обработка результатов.

ГЛАВА 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение.

3. 1. Разработка ПЦР тест-системы для экспресс-детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий.

3.2. Апробация и оптимизация к проведению практических исследований экспериментальных вариантов ПЦР тест-систем для детекции бактериальных возбудителей ОКИ: сальмонелл, кампилобактеров, йерсиний.

3.3. Изучение распространенности генов факторов патогенности бактериальных возбудителей ОКИ с использованием метода ПЦР.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экспресс-детекция и выявление генов факторов патогенности бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций"

Актуальность темы

В настоящее время острые кишечные инфекции продолжают оставаться серьезной проблемой для здравоохранения многих стран, в том числе и России. В последние годы из-за снижения уровня жизни и ухудшения экологической ситуации в нашей стране отмечается рост заболеваемости острыми кишечными инфекциями, в особенности шигеллезом (Черкасов Б.Л., 1997; Сергевнин В.И.,1999).

Всем этим требованиям соответствуют диагностические системы, базирующиеся на ПЦР-технологии: продолжительность анализа 6-7 часов, чувствительность до 10-100 бактерий в образце, при удачном подборе праймеров практически 100% специфичность, возможность анализировать до 100-200 и более образцов за день.

Цель работы:

Разработка ПЦР тест-системы для выявления бактерий рода Shigella и энтероинвазивных E.coli, совершенствование диагностики острых кишечных инфекций применением ПЦР-детекции наиболее распространенных бактериальных возбудителей диарейных инфекций.

Задачи исследования:

1. Разработать ПЦР тест-систему для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Е. coli в клиническом материале, продуктах питания, объектах внешней среды.

3. Оценить целесообразность комплексного ПЦР-исследования клинического материала на наличие распространенных бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций.

Научная новизна исследований

Подобраны оригинальные праймеры, позволяющие проводить эффективный высококачественный синтез консервативного участка оперона инвазивности шигелл и энтероинвазивных эшерихий. На базе данных праймеров разработана отечественная тест-система для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных Е. coli в клиническом материале, продуктах питания и объектах внешней среды.

Получены новые данные, характеризующие степень патогенности клинических изолятов шигелл, сальмонелл, эшерихий, выделенных в Волго-Вятском регионе. Показано широкое распространение генетических детерминант инвазивности (33,0%), токсигенности (22,6%) и подвижности

11,4%) микроорганизмов. Из генов токсигенности выявлен ген шигоподобного токсина 1. У штаммов Е. coli 0127 выявлены генетические структуры, сходные с генами адгезии tcpA V. cholerae и V. eltor. Основные положения, выносимые на защиту

1. ПЦР тест-система, разработанная на основе оригинальных праймеров, специфичных к оперону инвазивности, позволяет с высокой чувствительностью и специфичностью проводить выявление шигелл и энтероинвазивных эшерихий в клиническом материале от больных ОКИ.

2. Применение в клинических исследованиях и санитарно-эпидемиологических мероприятиях ПЦР-детекции шигелл и сальмонелл позволяет более чем в 2 раза увеличить эффективность выявления указанных инфекционных агентов.

3. Экспериментальные отечественные ПЦР тест-системы для изучения патогенных свойств энтеробактерий позволяют получать новую, объективную информацию о наличии генетических детерминант факторов патогенности в клинических изолятах Shigella, Salmonella, E.coli.

4. Комплексное ПЦР-исследование на наличие бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica на стадии первичного анализа клинического материала от больных ОКИ позволяет в увеличить выявление этиологического фактора и проследить циркуляцию труднокультивируемых возбудителей ОКИ.

Практическая значимость

Созданная в ходе настоящей работы ПЦР тест-система для детекции шигелл и энтероинвазивных эшерихий в 2,5 раза эффективнее выявляет инфекционный агент в клиническом материале по сравнению с бактериологическим методом, сокращает время проведения анализа до одного рабочего дня.

Апробированные и в ряде случаев оптимизированные экспериментальные тест-системы для выявления бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolitica позволяют увеличить выявляемость этиологического фактора ОКИ более чем в 2 раза. При проведении комплексного ПЦР-исследования клинического материала возбудитель ОКИ был выявлен методом ПЦР в 37% случаев, бактериологическим методом - в 16%.

Использование метода ПЦР для характеристики патогенных свойств клинических изолятов энтеробактерий позволило получить объективную научную информацию о циркуляции эпидемически значимых штаммов микроорганизмов в регионе. В 33% исследованных штаммов энтеробактерий выявлен оперон инвазивности, в 22,6% - ген шигоподобного токсина 1, и в 11,4% - ген белка фимбрий Н7, все культуры шигелл, выделенные от больных ОКИ, имеют оперон инвазивности. Выявление гена шиготоксина 1 в клинических изолятах S. flexneri 2а коррелирует с тяжелым проявлением заболевания.

Внедрение результатов работы

Подготовлена и прошла первый этап проверки в ГИСК им Л.А. Тарасевича документация (научно-производственный регламент, временная фармакопейная статья и инструкция по применению) на ПЦР тест-систему "Amply-Inv" для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных E.coli.

Подготовлено и опубликовано пособие для врачей «Принципы отбора, хранения и транспортировки биологических субстратов для проведения ПЦР-диагностики бактериальных и вирусных инфекций» (Н.Новгород, 2002).

Результаты, полученные при ПНР-исследовании клинического материала от больных ОКИ, проб продуктов питания, объектов внешней среды использовались лечебными учреждениями для подтверждения этиологии в диагностике ОКИ и проведения адекватной этиотропной терапии, а центрами ГСЭН - при проведении санитарно-эпидемиологических мероприятий, что подтверждено актами внедрения.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Н. Новгород 2002), на научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Елкина И.И. "Актуальные проблемы эпидемиологии инфекционных болезней" (Н.Новгород, 2003), на заседании Ученого совета и межлабораторного семинара Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. РАМН И.Н. Блохиной.

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Орлова, Клавдия Александровна

ВЫВОДЫ

3. Показана целесообразность комплексного ПЦР-исследования клинического материала на наличие бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolytica, позволяющего быстро и одновременно анализировать большое количество образцов, обнаруживать труднокультивируемые формы возбудителей, повысить образцов, обнаруживать труднокультивируемые формы возбудителей, повысить эффективнось выявления этиологического фактора ОКИ более чем в 2 раза.

4. Выявлено присутствие генов инвазивности (33%) токсигенности (22,6%) и подвижности (11,4%) микроорганизмов в клинических изолятах энтеробактерий, выделенных в Н. Новгороде и в Волго-Вятском регионе. Токсигенные формы представлены штаммами E.coli и S.flexneri 2а, содержащими ген шигоподобного токсина 1 (22,6%). Впервые выявлено наличие у E.coli 0127 генетических структур, сходных с геном адгезии холерного вибриона.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Несмотря на свою изученность, бактериальные возбудители острых кишечых инфекций остаются объектами внимания ученых и практиков во всем мире. Ежегодно в структуре кишечных заболеваний в Российской Федерации до 80% случаев не выявляется этиологический агент. Об актуальности усовершенствования диагностики ОКИ свидетельствуют многочисленные публикации в отечественной и западной литературе.

Современное состояние лабораторной диагностики ОКИ не отвечает требованиям практического здравоохранения. Актуальной задачей становится внедрение новых диагностических методов, которые позволят увеличить выявляемость возбудителя в более ранние сроки и с меньшими финансовыми затратами.

Молекулярно-биологические методы уже вышли на тот этап научно-практической разработки, когда их можно с уверенностью предложить для внедрения в клиническую и эпидемиологическую практику.

Особенно наглядным в этом отношении может быть пример метода ПЦР, который позволяет в короткое время с большой эффективностью выявлять самый широкий спектр возбудителей.

Целью нашей работы являлась разработка и адаптация к практическому применению ПЦР тест-систем для детекции бактериальных возбудителей ОКИ, выявление методом ПЦР генов факторов патогенности клинических изолятов энтеробактерий.

В ходе настоящей работы нами совместно с сотрудниками Центрального НИИ эпидемиологии МЗ РФ была разработана ПЦР тест-система для детекции бактерий рода Shigella и энтероинвазивных эшерихий, значительно превосходящая по рабочим характеристикам тест-системы первого поколения. Разработанная тест-система основана на оригинальных праймерах, специфичных к консервативному участку оперона инвазивности шигелл, который является родовым признаком этих энтеробактерий. В данную тест-систему входят стандартные комплекты реактивов для подготовки проб к ПЦР и для выявления продукта амплификации методом электрофореза в агарозном геле. Для стадии ПЦР предусмотрены два варианта ее проведения: «буст»-ПЦР и стандартная одностадийная ПЦР, комплект для ПЦР включает две реакционных смеси: «нижняя реакционная смесь» - раствор праймеров и дезоксинуклеотидтрифосфатов (для «буст»-ПЦР-2 пары праймеров; для стандартного варианта - 1 пара); «верхняя реакционная смесь», состоящая из компонентов ПЦР-буфера, термостабильной ДНК-полимеразы, глицерина, красителя-маркера для электрофореза. Нижняя реакционная смесь заранее вносится в микропробирки и запечатывается легкоплавким воском. При такой комплектации тест-системы для постановки ПЦР достаточно внести в пробирку верхнюю реакционную смесь, вазелиновое масло и исследуемую пробу. Разделение компонентов рабочей смеси предотвращает низкотемпературный неспецифический синтез на стадии подготовки к ПЦР. В тест-системе предусмотрено использование ВКО с целью отслеживания ингибирования ПЦР. Для уменьшения вероятности контаминации и получения ложно-положительных результатов применяется урацилгликозилазная обработка ампликонов. При исследовании клинического материала от больных ОКИ разработанная ПЦР тест-система показала высокую специфичность и чувствительность. Эффективность выявления шигелл и энтероинвазивных эшерихий методом ПЦР была выше по сравнению с микробиологическим методом более чем в 2 раза. На разработанную ПЦР тест-систему составлена научно-техническая документация, которая прошла первый этап проверки в ГИСКе им. Л.А.Тарасевича.

Не менее актуальной проблемой является совершенствование методической базы органов ГСЭН в процессе мониторинга за ОКИ, улучшение контроля за сырьем и продуктами питания, выявление источника инфекции и своевременное проведение санитарно-эпидемиологических мероприятий во время групповых вспышек заболеваемости ОКИ. Сальмонеллез занимает одно из ведущих мест в структуре заболеваний ОКИ и экспресс-детекция сальмонелл является не менее важной задачей. Использование метода ПЦР для решения проблем эпидемиологии не нашло пока практического применения в РФ, но экспериментальные ПЦР тест-системы для детекции сальмонелл прошли этап научной разработки. Поэтому вторая задача нашей работы носила методический характер и заключалась в апробации и адаптации к требованиям практической медицины двух отечественных экспериментальных тест-систем для детекции бактерий рода Salmonella.

В рамках решения этой задачи мы провели сравнительные испытания на клиническом материале экспериментальных ПЦР тест-систем для выявления сальмонелл разработки ГУ МНИИЭМ РАМН им. Г.Ф. Гамалеи (Москва) и ЦНИИЭ МЗ РФ (Москва).

ПЦР тест-система ГУ МНИИЭМ РАМН им. Г.Ф. Гамалеи относится к тест-системам первого поколения и отличается сложной комплектацией реактивов (6 пробирок), многоэтапной программой амплификации (5 этапов) и длительностью анализа (26 час.). Для получения интерпретируемого результата и повышения эффективности синтеза специфического фрагмента ДНК требуется культивирование пробы в накопительной среде, что существенно увеличивает продолжительность исследования. Тем не менее чувствительность этой тест-системы была достаточно высокой (1000 кл/мл), и эффективность выявления сальмонелл по сравнению с микробиологическим методом выше в 2 раза. На этапе проверки специфичности первой ПЦР тест-системы мы оптимизировали программу амплификации, что позволило сократить время проведения ПЦР и улучшить качество результата: «горячий старт» сократили с 10 до 4 минут, процесс проводили при температуре отжига праймеров 57° С. Кроме этого, на 25% уменьшили количество вносимых в реакционную смесь праймеров, что улучшило качество электрофореграммы.

В процессе работы мы провели сравнительные испытания различных способов подготовки клинического материала к проведению ПЦР: кипячение на водяной бане, ферментативный лизис с фенольно-хлороформной депротеинизацией и неферментативный лизис нитрозогуанидинтиоцианатом с последующей сорбцией ДНК на сорбенте. Последний из указанных методов был более технологичным, позволял существенно сократить стадию пробоподготовки, получить наиболее чистый препарат ДНК и не содержал токсичных веществ.

ПЦР тест-система «Ампли-сенс-Salmonella species 250» ЦНИИЭ МЗ РФ относится к тест-системам нового поколения. Достоинства этой тест-системы заключаются в стандартизации всех этапов ПЦР-анализа, что является существенным для применения в практических лабораториях. Удобная комплектация тест-системы (2 пробирки), простая программа амплификации фрагмента ДНК (3 этапа), универсальный набор для обработки проб и непродолжительность анализа (6-8 час) позволяли получать стабильный результат при исследовании смывов с объектов внешней среды и продуктов питания. Чувствительность данной тест-системы в 2 раза превышала чувствительность тест-системы первого поколения и составила 500 кл/мл, а эффективность выявления сальмонелл по сравнению с бактериологическим методом была достоверно выше более чем в 2 раза.

Проведенные исследования показали преимущества ПЦР тест-системы «Ампли-сенс-Salmonella species 250» по рабочим характеристикам по сравнению с тест-системой ГУ МНИИЭМ РАМН им. Г.Ф. Гамалеи. Простота, технологичность, и стабильность делает ПЦР тест-систему «Ампли-сенс-Salmonella species 250» доступной для ПЦР-лабораторий лечебных учреждений и центров ГСЭН.

Разработанные в 2003 г. ЦНИИЭ МЗ РФ ПЦР тест-системы для детекции кампилобактеров и йерсиний предоставили нам возможность решения задачи комплексного ПЦР-исследования клинического материала на наиболее значимые и распространенные бактериальные возбудители ОКИ. Внедрение комплексного ПЦР-иссследования в диагностике позволит увеличить выявляемость этиологического фактора ОКИ и усовершенствовать лабораторную диагностику диарейных заболеваний. Такой подход становится особенно актуальным при необходимости обследовать большое количество заболевших или контактных при групповых вспышках кишечных заболеваний.

ПЦР тест-системы для детекции бактерий родов Shigella, Salmonella, Campylobacter и Yersinia enterocolytica укомплектованы по одной схеме. Это позволило проводить исследования в стандартных условиях: использовать единый метод обработки проб, общую схему приготовления рабочей реакционной смеси, только две программы амплификации, что упростило проведение анализа и снизило его себестоимость, сократило продолжительность работ.

Полученные результаты исследования клинического материала свидетельствуют о более высокой эффективности комплексной ПЦР-детекции бактериальных возбудителей ОКИ по сравнению с микробиологическим методом. Методом ПЦР этиологический фактор установлен в 37% случаев, при микробиологическом исследовании - в 16%. Статистическая обработка показала, что выявляемость этиологического фактора ОКИ методом ПЦР достоверно выше более чем в 2 раза по сравнению с бактериологическим методом.

Использование разработанных в РФ и исследованных в нашей работе ПЦР тест-систем для детекции бактериальных возбудителей ОКИ увеличивает выявляемость инфекционного агента в 2,5 раза по сравнению с классическими методами, сокращает время исследования до 1 рабочего дня и позволяет анализировать одновременно большое количество образцов. И метод ПЦР, и разработанные тест-системы являются стандартными и могут применяться в любой клинической лаборатории, оборудованной соответствующей стандартной аппаратурой.

Внедрение метода ПЦР в практическую медицину позволит ускорить детекцию возбудителя ОКИ, особенно в первые дни заболевания, и увеличит вероятность выявления инфекционного агента при проведении санитарно-эпидемиологических мероприятий, при обследовании контактных лиц и бактерионосителей во время групповых вспышек ОКИ. В современных экономических условиях, когда микробиологические исследования, особенно на труднокультивируемые микроорганизмы, зачастую превышают стоимость ПЦР, целесообразным является комплексный ПЦР-анализ и при спорадических заболеваниях.

Внедрение ПЦР-исследования на кампилобактеры и йерсинии позволит практическому здравоохранению решить проблему с диагностикой диарейных заболеваний, вызываемых этими возбудителями и получить новые данные о циркуляции данных микроорганизмов. Нельзя не согласиться с мнением Б.Л. Черкасского, утверждающего, что низкая заболеваемость в РФ кампилобактериозом и йерсиниозом связана с недостаточной лабораторной диагностикой этих инфекций.

Поскольку изучение биологических характеристик патогенных микроорганизмов является фундаментальной задачей микробиологии и научной информации по этой проблеме недостаточно, мы провели ПЦР-исследование клинических изолятов энтеробактерий на наличие генов факторов патогенности с использованием отечественных ПЦР тест-систем.

Полученные в ходе многолетних исследований результаты свидетельствуют о распространенности в клинических изолятах энтеробактерий генов инвазивности (33%), токсигенности (22,6%) и подвижности (11,4%) микроорганизмов. Штаммы, имеющие ген шигоподобного токсина 1, выявлены в 22,6% изолятов энтеробактерий, при этом на первом этапе работы было выявлено больше токсигенных эшерихий (5,8%), а на последнем этапе ген VT1 чаще выявлялся у шигелл (16,5%).

Особо следует отметить выявление у штаммов E.coli 0127 генетических детерминант, имеющих гомологию с геном адгезии V.cholerae tcpA. Информации по данному факту нами не обнаружено.

Проведенные в нашей работе исследования патогенных свойств клинических штаммов эитеробактерий позволили получить ценную информацию о присутствии генов факторов патогенности в изученных изолятах и высветили ряд научных и практических проблем, связанных с изучением биологических свойств бактериальных возбудителей ОКИ.

Применение молекулярно-биологических методов, в том числе и метода ПЦР представляются нам перспективными в таких областях как:

1. в качестве оперативного скринингового теста для диагностики широко распространенных бактериальных возбудителей;

2. как основной прямой тест для выявления труднокультивируемых микроорганизмов;

3. как дополнительный тест к бактериологическому исследованию для характеристики патогенных свойств возбудителей.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Орлова, Клавдия Александровна, Москва

1. Аксенов М.Ю., Гинцбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода ПЦР // Мол. ген. микроб, и вирус. 1993. - №4. -С.3-8.

2. Безруков В.М., Шипулин Г.А., Федоров Н.А., Шобухова Т.С., Филимонова И.Н., Постникова Т.М., Блоха В.В., Эльберт Е.В. Полимеразная цепная реакция в диагностике бактериальных инфекций // Клин.лаб. диагностика 1996. - №1. - С.20-23.

3. Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами. Санитарные правила. М: Федеральный центр ГСЭН МЗ РФ.-1999.-107с.

4. Белохвостов А.С. Полимеразная цепная реакция и лигазные реакции, принципы, традиционные методики и нововведения // Мол. генетика. -1995.- №2.-С. 21-26.

5. Блохина И.Н., Бруснигина Н.Ф., Скобло Л.Е., Мазепа В.Н., Барышева Н.Н. Применение метода молекулярной гибридизации для изучения энтеротоксигенных свойств сальмонелл // Журн. микробиол. 1990. -№6-С.20-23.

6. Блохина И.Н., Леванова Г.Ф., Антонов А.С. Систематика бактерий (с основами геносистематики). Н.Новгород. 1992. - 170с.

7. Бондаренко В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса // Журн. микробиол. 1999. - №5. - С.34-39.

8. Бондаренко В.М., Шахмарданов М.З. Современнные представления о молекулярно-биологических основах патогенеза шигеллезов // Журн. микробиол. 1998. - №6. - С.88-92.

9. Боровой В.Н., Терехов В.И., Шпонько Ю.Б. Генодиагностика патогенных эшерихий в Краснодарском крае. // Сб. Генодиагностика инф. забол. Москва. 2002. - С.323-324.

10. Ю.Бухарин О.В. Биомедицинские аспекты персистенции бактерий // Журн. микробиол. 1994. - (Прил.) - С.4-12.

11. П.Бухарин О.В. Персистенция бактериальных патогенов как результат отношений в системе паразит-хозяин // Журн. микробиол. 1997. - №4. - С.3-9.

12. Бухарин О.В., Каган Ю.Д., Бурмистрова A.JI. Сальмонеллы и сальмонеллезы. Екатеринбург. 2000. - 163с.

13. Вертиев Ю.В. Бактериальные токсины: биологическая сущность и происхождение//Журн. микробиол. 1996.- №3.-С.43-46.

14. Воробьев А.А., Бондаренко В.М. Роль микробиологии в снижении инфекционной заболеваемости // Эпидем. и инфек. бол. 1997. - №4. -С.7-11.

15. Гинцбург А.Л., Зигангирова Н.А., Романова Ю.М. Современное состояние и перспективы молекулярно-генетических методов в решении задач медицинской микробиологии // Журн. микробиол. 1999. - №5. -С.22-26.

16. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. Некультивируемые формы бактерий и их роль в сохранении сапронозов во внешней среде // Журн. микробиол. -1997.- №3. С. 116-121.

17. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Алексеева Н.В., Ковалев Ю.Н., Аляпкина Ю.С., Чегаева Е.В. Мезанизм действия и природа факторов, индуцирующих образование некультивируемых форм Salmonella tiphymurium // Журн. микробиол. 1999. - №6. - С.3-8.

18. Гущин А.Е., Гладышев Е.В., Шипулин Г.А. Использование урацил-ДНК-гликозилазы (УДГ) для снижения риска контаминации продуктами ПЦР // Сб. "Генодиагностика инф. забол". Москва. 2002. - С. 404-408.

19. Домарадская Т.И., Езепчук Ю.В. Пептидные термостабильные токсины энтеробактерий (генетический контроль, структура, механизмы действия, тестирование) // Мол. генетика. 1993. - №1. - С.3-8.

20. Домарадская Т.И., Езепчук Ю.В., Мотин B.JL, Микулькис А.В., Коробко

21. B.Г. Определение термостабильного и термолабильного энтеротоксинов в штаммах Escherichia coli генетическими, биологическими и иммуносерологическими методами // Мол. генетика. 1992. - №9-10.1. C.11-13.

22. Домарадский И.В. Некоторые проблемы адаптации патогенных бактерий к окружающей среде // Журн. микробиол. 1997. - №4. -С.29-34.

23. Дубинина И.Г., Щербо С.Н., Макаров В.Б. Метод ПЦР в лабораторной практике // Клин. лаб. диагностика. 1997. - №7. - С.5-9.

24. Езепчук Ю.В. Патогенность как функция биомолекул. Москва. "Медицина". 1985. - 235с.24.3айнуллин Л.И., Ахмадеев P.M., Алимов A.M. Дифференциация штаммов сальмонелл методом RAPD ПЦР // Сб. «Генодиагностика инф. забол.". Москва. - 2002. - С. 337-338.

25. Ильина Т.С. Структурная организация и механизмы перемещений генных кассет, кодирующих резистентность к антибиотикам и факторы вирулентности бактерий // Мол. генетика. 2001. - №3. - С.3-12.

26. Куракин Е.С., Катков В.П. Плазмидный анализ штаммов Shigella flexneri, обусловивших вспышку в стационаре психоневрологического профиля // Журн. микробиол. 1996. - №6. - С.69-70.

27. Леванова Г.Ф., Парфенова О.В., Кашников С.Ю. Молекулярно-биологические способы идентификации и дифференциации бактерий // Методические рекомендации. Москва. 1995.

28. Ломовцев А.Э., Каминский Г.Д. Анализ клонального распределения штаммов Shigella flexneri, циркулирующих в Тульской области, на основе определения их плазмидного профиля // Журн. микробиол. -1996. №6. - С.67-69.

29. Мазепа В.Н., Бруснигина Н.Ф., Скобло Л.Е., Барышева Н.Н. Изучение распространения энтеротоксигенных энтеробактерий с помощью зондов разной степени очистки // В кн. "Регуляция биологических систем". Н. Новгород-1991.-С. 10-13.

30. Малов В.А. Клинико-патогенетическое значение интоксикации у больных острыми кишечными заболеваниями. Автореферат дис. д.м.н-Москва. 1992.

31. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. М., Мир 1984 - 479с.

32. Медицинская микробиология. Под ред. Покровский В.И., Поздеев O.K.// Москва. ГЭОТАР МЕДИЦИНА. - 1998.- 1200с.

33. Медицинские лабораторные технологии. Под ред. проф. А.И. Карпищенко // «Интермедика» Санкт-Петербург. - 1998. - 2т. - с. 680.

34. Методические указания МЗ СССР по микробиологической диагностике заболеваний, вызванных энтеробактериями // Москва. 1984.

35. Министерство здравоохранения СССР, приказ 22 апреля 1985г. №535 "Об унификации микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений".

36. Пак С.Г., Турьянов М.Х., Пальцев М.П. Сальмонеллез. М., Медицина. -1988.-304 с.

37. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Общие принципы генетического контроля патогенности бактерий // Журн. микробиол. 1994. - №3. -С.106-110.

38. Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Роль хромосомы и ее взаимодействие с внехромосомными детерминантами в процессе генетического контроля патогенности бактерий // Мол. генетика. 1994. - №5. - С.3-8.

39. Подколзин А.Т., Яцышина С.Б., Свистунова Т.С., и др. Изучение чувствительности и специфичности диагностических ПЦР тест-систем для выявления микроорганизмов рода Salmonella // Сб. "Генодиагностика инф. забол." Москва. 2002. - С.240-244.

40. Покровский В.В., Шипулин Г.А., Безруков В.М., и др. Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР. Москва. 1995. - 10 с.

41. Покровский В.И. Энтеробактерии. Москва. "Медицина". 1985. - 321с.

42. Покровский В.И., Малеев В.В. Актуальные проблемы инфекционной патологии//Эпид. и инфек. бол. 1999. - №2.- С. 17-20.

43. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Л. Актуальные направления совершенствования профилактики инфекционных болезней // Эпид. и инфек. бол. 2000. - №2 - С.4-8.

44. Покровский В.И., Онищенко Г.Г., Черкасский Б.Л. Инфекционные болезни в конце XX века и санитарно-эпидемиологическое благополучие в России в XXI веке // Журн. микробиол. 2002. - №3. -С. 16-23.

45. Покровский В.И., Черкасский Б.Л., Сальмонеллезы. Москва. АО "Медицинская газета". 1995. -С.286.

46. Попова Т.А., Сыпченко А.Я., Шишкина Л.И. Вспышка ОКИ, вызванных Е. coli 0157:Н7, в Тульской области // Эпид. и инфек. бол. 2000. - №3. -С. 19-21.

47. Ратинер Ю.А., Бондаренко В.М., Siitonen А. Энтерогеморрагические кишечные палочки и вызываемые ими заболевания // Журн. микробиол. 1998.-№5.-С.87-96.

48. Романова Ю.М. Плазмиды вирулентности бактерий рода Shigella // Мол. генетика. 1991. - №6 - С.3-9.

49. Романова Ю.М., Бошнаков Р.Х., Баскаков Т.В., Гинцбург А.Л. Механизмы активации патогенных бактерий в организме хозяина // Журн. микробиол. 2000. - №4. - С.7-11.

50. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Есть ли сходство в механизмах образования "некультивируемых форм" у грамотрицательных бактерий и спор у бацилл? // Мол. генетика. 1993. - №6. - С.34-37.

51. Романова Ю.М., Гинцбург А.Л. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий // Журн. микробиол. -1999.-№5.-С.22-29.

52. Рябченко Л.Е., Ряпис А.А. Рестрикционный анализ хромосомной ДНК штаммов S. enteritidis // Мол. генетика. 1993. - №6. - С.31-34.

53. Саики Р., ГиленстенУ., Эрлих Г. Полимеразная цепная реакция // Анализ генома. Методы. Под ред. Дейвиса К. М.: Мир. - 1990. -С. 176-190.

54. Сергевнин В.И. Методические подходы к расследованию вспышек ОКИ // Эпид. и инфек. бол. 1999. - №1. - С.27-28.

55. Сергевнин В.И. Этиологическая структура и экологическая классификация острых кишечных инфекций // Эпид. и инфек. бол. -1997.- №6 С.8-9.

56. Скобло Л.Е., Уланова Т.И., Мазепа В.Н., Бруснигина Н.Ф., Барышева Н.Н. Плазмиды бактерий семейства Enterobacteriaceae, несущие ген термолабильного энтеротоксина // В кн. "Биотехнология и генетика". -Н. Новгород. 1991. - С. 14-16.

57. Ставицкая Е.Л., Нарвская О.В., Мокроусов И.В., и др. Генотипирование S. flexneri 2а, выделенных от пациентов с острой дизентерией в Санкт-Петербурге // Журн. микробиол. 1998. - №3. - С.5-7.

58. Тимаков В.Д., Петровская В.Г., Бондаренко В.М. Биологические и генетические характеристики бактерий рода Shigella. Москва. 1980. -148с.

59. Чайка Н.А., Хазенсон Л.Б., Butzler J.M. и др. Кампилобактериоз. Москва. Медицина. 1988. - С.115-135.

60. Черкасский Б.Л. Современные особенности эпидемиологии кишечных инфекций в Российской Федерации // Эпид. и инфек. бол. 1997. - №5 -С.12-15.

61. Шагинян И.А. Геномный полиморфизм в решении фундаментальных и прикладных проблем микробиологии и эпидемиологии // Журн. микробиол. 1996. - №3. - С.21-24.

62. Шагинян И.А. Идентификация и типирование патогенных бактерий: современные подходы // Вест. РАМН. -2000. 1:22-8.

63. Шагинян И.А., Гинцбург A.JI. ПЦР-генетическое типирование патогенных микроорганизмов // Генетика. 1995. - Т.31. - №5. -С.600-609.

64. Шагинян И.А., Першина М.Ю. Генетические маркеры в эпидемиологии бактериальных инфекций // Журн. микробиол. 1997. - №4. - С.5-9.

65. Шагинян И.А., Романова Ю.М., Уткин В.В. и др. Изучение геномного полиморфизма штаммов Shigella flexneri, изолированных в разных географических регионах // Мол. генетика. 1993. - №1. - С.8-13.

66. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций // Лаб. диагностика. 2000. - Т.2. - №3. - С. 1-21.

67. Шахмарданов М.З. Инвазивные свойства возбудителя в патогенезе шигеллеза Флекснера 2а // Эпид. и инфек. бол. 2000. - №1. - С. 25-27.

68. Шмитт К.К., Мейсик К.С., О'Брайен А.Д. Бактериальные токсины: друзья или враги? // Клин, микробиол. и химиотер. 2000. - №2. - С.4-15.

69. Шувалова Е.И., Беляева Т.В., Осипова Г.И. Клинико-морфологические и иммунологические особенности дизентерии Флекснера // Эпид. и инфек. бол. №6 - 2002. - С. 18-23.

70. Ющук Н.Д., Бродов JI.E. Острые инфекционные диарейные болезни // Мед. газета 2000. - №31.

71. Ющук Н.Д., Розенблюм А.Ю., Пархоменко Ю.Г. и др. Клинико-морфологические особенности шигеллеза Флекснера у больных с отягощенным преморбидным фоном //Журн. микробиол. 2002. - №2. -С.26

72. Aabo S., Rasmussen O.F., Rossen L et al. Salmonella identification by the polymerase chain reaction // Molecular and Cellular probes. 1993. - Vol. 10.- №3 - P. 171-178.

73. A1-Hasani K., Adler В., Rajakumar K., Sakellaris H. Distribution and structural variation of the she pathogenicity island in enteric bacterial pathogens // Med. Microbiol. 2001. - Vol. 50. - №9. - P. 780-786.

74. Altwegg, Perschil I., Gruner E. Molecular biology detection and antibiotic sensitivities of Shigella spp. and enteroinvasive Escherichia coli (EIEC) in patients returning from the tropics // Schweiz Rundsch Med Prax. 1997. -Vol.86. - №9 - P. 348-351.

75. Bai S., Li X., Xia G. et al. Gena types of Shigella enterotoxins of S. flexneri 2a // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 2000. - Vol. 21. - №4. - P. 280-282.

76. Bando S.Y., do Valle G.R., Martinez M.B., Trabulsi L.R., Moreira-Filho C.A. Characterization of enteroinvasive Escherichia coli and Shigella strains by RAPD analysis // FEMS Microbiol Lett. 1998. - Vol. 165. -№1. - P. 159-165.

77. Barlow R.S., Hirst R.G., Norton R.E., Ashhurst-Smith C., Bettelheim K.A. A novel serotype of enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) as a major pathogen in an outbreak of infantile diarrhoea // J Med Microbiol. 1999.

78. Vol. 48.- №12.-P. 1123-1125.

79. Belanger S.D., Boissinot M., Menard C., Picard F.J., Bergeron M.G. Rapid detection of Shiga toxin-producing bacteria in feces by multiplex PCR with molecular beacons on the smart cycler // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol.40.- № 4. P. 1436-1440.

80. Beutin L., Strauch E., Fischer I. Isolation of Shigella sonnei lysogenic for a bacteriophage encoding gene for production of Shiga toxin // Lancet. 1999.- Vol.353. №9163.-P.1498.

81. Birnboim H.C., Doly J. // Nucleic. Acid. Res. 1979. - Vol. 7. - №6. -P.l 513-1523.

82. Boom R., Sol C., Salimans V. Rapid and simple method for purification of nucleic acid. // J. Clin. Microbiol. 1990 - Vol. 28. - №6. - P.495-503.

83. Carniel E., Guilvout I., Prentice M. Characterization of a large chromosomal " High Pathogenicity Island" in biotype IB Yersinia enterocolitica // J. Bact.- 1996.-Vol. 178.-P. 6743-6751.

84. Cheetham B.F., Katz M.E. A role for bacteriophages in the evolution and transfer of bacterial virulence determinants // Gene. 1995. - Vol. 165. -P.53-58.

85. Coimbra R.S., Grimont F., Grimont P.A. Identification of Shigella serotypes by restriction of amplified O-antigen gene cluster. // Res Microbiol. 1999. -Vol.150.-№8.- P. 543-553.

86. Coimbra R.S., Lenormand P., Grimont F., Bouvet P., Matsushita S., Grimont P.A. Molecular and phenotypic characterization of potentially new Shigella dysenteriae serotype.// J Clin Microbiol. 2001. - Vol.39. - № 2. - P. 618621.

87. David H. Pershing, Ed. PCR protocols for emerging infectious diseases // American society for microbiology. Washington, DC. 1996. - P.526.

88. Doran J.L., Collinson S.K., Burian J. et al. DNA-based diagnostic tests for Salmonella species targeting agfA, the structural gene for thin, aggregative fimbriae // J Clin Microbiol. 1993. - Vol. 31. - №9. - P. 2263-2273.

89. Donnenberg M.S., Welch R.A. Virulence determinants of uropathogenic Echerichia coli // Urinari Tract Infectious Molecular Pathogenesis and Clinical Management // Ed.H.Mobley, J. W. Warren. Washington. - P. 465496.

90. DuPont H.L., Enteropathogenic organisms: New etiological agents and concepts of disease // Med. Clin. North Am. 1997. - Vol. 62. - P. 945-949.

91. Eckhardt T. A rapid method for the identification of plasmid

92. Desoxiribonucleic acid in bacteria // Plasmid. J. 1978. - Vol. 21. - P. 584588.

93. Elliot S.J., Wainwright L.A., McDaniel Т.К. et.al. Structural analysis of locus enterocyte effacement genomic islands among enteropathogenic (EPEC) and enterohemorrhagic (ЕНЕС) E. coli // Mol. Microbiol. - 1998. -Vol. 28.-P. 1-4.

94. Elwell L.P., Shipley P.L. Plasmid-mediated factors associated with virulence of bacteria to animals // Annu. Rev. Microbiol. 1991. - Vol. 34. -P. 465-496.

95. Falkow S. The evolution of pathogenecity in Escherichia, Shigella, and Salmonella // Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology / (Ed.-in-chief) F.C. Neidhardt. Wachington. - 1999. - P. 27232729.

96. Finkelstein R.A., Ben Marchlewicz A., Donald R. et al. Isolation and characterization of a cholera related enterotoxin from Salmonella typhimurium // FEMS Microbiol. Lett. 1990. - Vol. 17. - P. 239-241.

97. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Holt P. et al. Vibrio cholerae hemaglutinin-lectin-pronase hydrolises fibronectin and ovomucin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 80. - P. 1092-1095.

98. Foultier В., Troisfontaines P., Muller S. et al. Characterization of the ysa pathogenicity locus in the chromosome of Yersinia enterocolitica and phylogeny analysis of type III secretion systems // Mol Cell Probes. 1994. -Vol.8.-№4.-P. 285-290.

99. Friedrich M.J., Kinsey N.E., Vila J., Kadner R.J. Nucleotide sequence of a 13,9 kb segment of the 90 kb virulence plasmid of Salmonella typhimurium: the presence of the fimbrial biosynthetic genes // Mol. Microbiol. 1993. - Vol. 8. - P. 543-558.

100. Fukushima M., Kakinuma K., Kawaguchi R. Phylogenetic analysis of Salmonella, Shigella, and Escherichia coli strains on the basis of the gyrB gene sequence // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol. 32. - P. 3072-3078.

101. Gascon J., Vargas M., Quinto L. et al. Enteroaggregative Escherichia coli strains as a cause of traveler's diarrhea: a case-control study // J. Infect. Dis. -1998.-Vol. 177.-№5.-P. 1409-1412.

102. Gates R. Infectious disease secrets. Philadelfia. Hanley & Belfus. 1998.- P. 96.

103. Grant M.A., Weagant S.D., Feng P. Glutamate decarboxylase genes as a prescreening marker for detection of pathogenic Escherichia coli groups // Appl Environ Microbiol. 2001. - Vol. 67. - №7. - P. 3110-3114.

104. Groisman E.A., Ochman H. Cognate gene clusters govern invasion of host epithelial cells by Salmonella typhimurium and Shigella flexneri // EMBO J.- 1993. Vol. 142. - P. 3779-3787.

105. Haker J., Blum Oehler G., Muhldorfer I., Tschape H. Pathogenecity Islands of virulent bacteria: structure, function and impact on microbial evolution // Mol. Microbiol. 1997. - Vol. 23. - P. 1089-1097.

106. Houng H.S., Venkatesan M.M. Genetic analysis of Shigella sonnei form I antigen: identification of a novel IS630 as an essential element for the form I antigen expression. // Microb Pathog. 1998. - Vol. 25. - №4. - P. 165-173.

107. Hsu S.C., Tsen H.Y. PCR primers designed from malic acid dehydrogenase gene and their use for detection of Escherichia coli in water and milk samples // Int. J. Food Microbiol. 2001. - Vol.64. - № 1-2. - P. 111.

108. Hulton C.S., Higgins C.F., Sharp P.M. ERIC sequences: a novel family of Repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhimurium and other enterobacteria //Mol. Microbiol. 1991. - Vol. 35. -P. 825-834.

109. Ina K., Kusugami K., Ohta M. Bacterial hemorrhagic enterocolitis // J. Gastroenterol. 2003. -Vol.38. - №2. - P. 111-120.

110. Islam M.S., Hossain M.S., Hasan M.K. et al. Detection of Shigellae from stools of dysentery patients by culture and polymerase chain reaction techniques // J. Diarrhoeal. Dis. Res. 1998. - Vol. 14. - №4. - P. 248-251.

111. Ito K., Watanabe H., Toyosato M., Kosaka Т., Mizuno K. Genetic analysis of Shigella pathogenesis and rapid detection method of Shigella virulencegene by the polymerase chain reaction // Nippon Rinsho. 1992. - Vol. 50. -P. 368-372.

112. Jackson M.P. Detection of Shiga toxin-producing Shigella dysenteriae type 1 and Escherichia coli by using polymerase chain reaction with incorporation of digoxigenin-ll-dUTP // J. Clin Microbiol. 1991. - Vol. 29.-№9.-P. 1910-1914.

113. James P. Nataro and James B. Kaper. Diarreagenic Echerichia coli. // Clin. Microbiol. Rev. 1998. -Vol. 11. - P. 142-201.

114. Kaplan B.S. Hemolytic uremic syndrome and thrombotic thrombocytopenic purpura//N.Y. 1992. - P. 54.

115. Kobayashi K., Seto K., Makino M. Detection of two Shiga-like toxins from Escherichia coli 0157:H7 isolates by the polymerase chain reaction method // Nippon Saikingaku Zasshi. 1990. - Vol. 45. - №3 - P. 649-652.

116. Kobayashi K. A simple and rapid confirmation method of the bacterial contamination using polymerase chain reaction // Kansenshogaku Zasshi. -1994. Vol. 68. - №4. - P. 495-499.

117. Kongmuang U., Luk J.M., Lindberg A.A. Comparison of three stool-processing methods for detection of Salmonella serogroups В, C2 and D by PCR. // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32. - P. 3072-3074.

118. Lampel K.A., Jagow J.A., Trucksess M., Hill W.E. Polymerase chain reaction for detection of invasive Shigella flexneri in food // Appl. Environ. Microbiol. 1990.-Vol. 56.-№6.-P. 1536-1540.

119. Lan R., Lumb В., Ryan D et al. Molecular evolution of large virulence plasmid in Shigella clones and enteroinvsive Escherichia coli. // Infect. Immun. 2001. - Vol. 65. - P. 2685-2692.

120. Lindqvist R. Detection of Shigella spp. in food with a nested PCRmethod-sensitivity and performance compared with a conventional culture method // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol. 86. - №6. - P. 971-978.

121. Liu P.Y., Lau Y.J., Hu B.S., et al. Analysis of clonal relationships among isolates of Shigella sonnei by different molecular typing methods // J Clin Microbiol. 1995. - Vol. 33. -№7. - P. 1779-1783.

122. Ludwig A., Tengel C., Bauer S. et al. SlyA, a regulatory protein from Salmonella typhimurium, induces a haemolytic and pore-forming protein in Escherichia coli // Mol. Gen. Genet. 1995. - Vol. 249. - №5. - P. 474486.

123. Luo W., Wang S., Peng X. Identification of shiga-toxin producing bacteria by a new immuno-capture toxin gene PCR // J. Clin. Microbiol. 1998. -Vol. 28.-P. 543-548.

124. Luscher D., Altwegg M. Detection of shigellae, enteroinvasive and enterotoxigenic Escherichia coli using the polymerase chain reaction (PCR) in patients returning from tropical countries // Mol. Cell. Probes. 1994. -Vol. 8. - №4. - P. 285-290.

125. Luscher D., Graf Settah S., Altwegg M. Bacterial pathogens in diarrhea: demonstration of verotoxin-producing Escherichia coli using the polymerase chain reaction // Schweiz. Med. Wochenschr. 1992. - Vol. 122. -№50.- P. 1911-1918.

126. Mainil J. Shiga/verocytotoxins and Shiga/verotoxigenic Escherichia coli in animals // Vet. Res. 1999. - Vol. 30. - №2-3. - P. 235-257.

127. Mariani-Kurkdjian P., Bingen E. Hemolytic-uremic syndrome after verotoxin-producing Escherichia coli infection // Presse Med. 1995. - Vol. 24.-№2.-P. 99-101.

128. Marquart M.E., Picking W.L., Picking W.D. Structural analysis of invasion plasmid antigen D (IpaD) from Shigella flexneri // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - Vol. 214. - №3. - P. 963-970.

129. Maurelli A.T., Blackmon В., Curtiss R. Loss of pigmentation in Shigella flexneri 2a is correlated with loss of virulence and virulence-associated plasmid // Infect Immun. 1994. - Vol. 43. - №1. - P. 397-401.

130. Mclver C.J., White P.A., Jones L.A. et al. Epidemic strains of Shigella sonnei biotype g carrying integrons // J Clin Microbiol. 2002. - Vol. 40. -№4.-P. 1538-1540.

131. McDaniel Т.К., Jarvis K.G., Donnenberg M.S., Kaper J.B. A genetic locus of enterocyte effacement concerved among diverse enterobacterial pathogens // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 95. -№5. - P.1664-1668.

132. Meng J., Zhao S., Doyle M.P., Mitchell S.E., Kresovich S. A multiplex PCR for identifying Shiga-like toxin-producing Escherichia coli 0157:H7// Lett. Appl. Microbiol. 1997. - Vol. 24. - №3. - P. 172-176.

133. Muller M., Kruse L., Tabrett A.M. et al. Detection of a single base exchange in PCR-amplified DNA fragments using agarose gel electrophoresis containing bisbensimide-PEG // Nucleic Acids Res. 1997. -Vol.25. - № 24. - P.5125-5126.

134. Nataro J.P., Seriwatana J., Fasano A. et al. Identification and cloning of a novel plasmid-encoded enterotoxin of enteroinvasive Escherichia coli and Shigella strains // Infect Immun. 1995. - Vol. 63. - №12. - P. 4721-4728.

135. Noriega F.R., Liao F.M., Formal S.B., Fasano A., Levine M.M. Prevalence of Shigella enterotoxin 1 among Shigella clinical isolates of diverse serotypes // J. Infect. Dis. 1995. - Vol. 172. - №5. - P. 1408-1410.

136. Olive D.M., P.Bean. Principes and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 1661-1669.

137. Oyofo B.A., Mohran Z.S., el-Etr S.H. et al. Detection of enterotoxigenic Escherichia coli, Shigella and Campylobacter spp. by multiplex PCR assay // J. Diarrhoeal. Dis. Res. 1996. - Vol. 14. - №3. - P. 207-210.

138. Parreira V.R., Gyles C.L. Shiga toxin genes in avian Escherichia coli \\ Mol. Microbiol. 1995. - Vol. 5. - P. 825-834.

139. Peng X., Luo W., Zhang J., Wang S., Lin S. Rapid detection of Shigella species in environmental sewage by an immunocapture PCR with universal primers // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - Vol. 68. - №5. - P. 25802583.

140. Petrovskaya V.G., Bondarenko V.M., Nastichkin J.A. A chromosome map of Shigella flexneri with the loci related to pathogenicity // Мол. генетика. -1994.-№1.-С. 3-10.

141. Pierard D., Stevens D., Moriau L., Lior H., Lauwers S. Isolation and identification virulence factors of verocytotoxin-producing Escherichia coli in human stool samples // Clin Microbiol Infect. 1997. - Vol. 3. - №5. - P. 531-540.

142. Pronk L.M., Sanderson K.E. Intervening sequences in rrl genes and fragmentation of 23 S rRNA in genera of the family Enterobacteriaceae // J. Bacterid.-2001.-Vol. 183.-№19.-P. 5782-5787.

143. Qadri F., Hossain S.A., Ciznar I. et al. Congo red binding and salt aggregation as indicators of virulence in Shigella species // J. Clin. Microbiol. 1988. - Vol. 26. - №7. - P. 1343-1348.

144. Read S.C., Clarke R.C., Martin A. et al. Polymerase chain reaction for detection of verocytotoxigenic Escherichia coli isolated from animal and food sources // Mol.Cell. Probes. 1992. - Vol. 6. - №2. - P. 153-161.

145. Rosqvist R., Hakansson S., Forsberg A., Wolf-Watz H. Functional conservation of the secretion and translocation machinery for virulence proteins of yersiniae, salmonellae and shigellae // EMBO J. 1995. - Vol. 14. -№17.-P. 4187-4195.

146. Sabat G., Rose P., Hickey W.J., Harkin J.M. Selective and sensitive method for PCR amplification of Escherichia coli 16S rRNA genes in soil. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66. - №2. - P. 844-849.

147. Sakai Т., Sasakawa C., Makino S., Kamata K., Yoshikawa M. Molecular cloning of a genetic determinant for Congo red binding ability which is essential for the virulence of Shigella flexneri // Infect. Immun. 1986. -Vol. 51.-№2.-P. 476-482.

148. Sasakawa C., Kamata K., Sakai T. et al. Virulence-associated genetic regions comprising 31 kilobases of the 230-kilobase plasmid in Shigella flexneri 2a // J. Bacterid. 1988. - Vol. 170. - №6. - P. 2480-2484.

149. Sasakawa C., Kamata K., Sakai T. et al. Molecular alteration of the 140-megadalton plasmid associated with loss of virulence and Congo red binding activity in Shigella flexneri // Infect. Immun. 1986. - Vol. 51. - №2. - P. 470-475.

150. Sasakawa C., Komatsu R., Tobe Т., et al. Eight genes in region 5 that from an operon are essential for invasion of Epithelial cells by Shigella flexneri 2a // J. Bacteriol. 1993. - Vol.175. - P. 2334-2346.

151. Schuch R., Maurelli A.T. Virulence plasmid instability in Shigella flexneri 2a is induced by virulence gene expression // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65.-№9.-P. 3686-3692.

152. Sethabutr O., Venkatesan M., Murphy G.S. et al. Detection of Shigellae and enteroinvasive Escherichia coli by amplification of the invasion plasmid antigen H DNA sequence in patients with dysentery // J. Infect. Dis. 1993. -Vol. 167.-№2.-P. 458-461.

153. Sethabutr O., Venkatesan M., Yam S. et al. Detection of PCR products of the ipaH gene from Shigella and enteroinvasive Escherichia coli by enzyme linked immunosorbent assay // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2000. - Vol. 37. -№1. - P. 11-16.

154. Sharma K., Rishi P., Grewal J.S., Ram S., Tiwari R.P. Correlation between Congo red binding and contact haemolysin production in Shigella species // Microbios. 2001. - Vol. 106. - №413. - P. 31-38.

155. Small P.L., Falkow S. Development of DNA probe for the virulence plasmid of Shigella ssp. and enteroinvasive Escherichia coli // Microbiol. -1986. American Society for Microbiology, Washington D.C. - P. 121-124.

156. Spierings G., Ockhuijsen C., Hofstra H., Tommassen J. Polymerase chain reaction for the specific detection of Escherichia coli/Shigella // Res. Microbiol. 1993. - Vol. 144. - №7. - P. 557-564.

157. Szakal D., Gado I., Pal T. A colony blot immunoassay to detect enteroinvasive Escherichia coli and Shigella in water samples // J. Appl.

158. Microbiol. 2001. - Vol. 90. - №2. - P. 229-236.

159. Theron J., Morar D., Du Preez M. et al. A sensitive seminested PCR method for the detection of Shigella in spiked environmental water samples // Water Res. 2001. - Vol. 35. - №4. - P. 869-874.

160. Unkmeir A., Schmidt H. Structural analysis of phage-borne stx genes and their flanking sequences in shiga toxin-producing Escherichia coli and Shigella dysenteriae type 1 strains // Infect. Immun. 2000. - Vol. 68. - №9. -P. 4856-4864.

161. Vantarakis A., Komninou G., Venieri D., Papapetropoulou M. Development of a multiplex PCR detection of Salmonella spp. and Shigella spp. in mussels // Lett. Appl. Microbiol. 2000. - Vol. 31. - №2. - P. 105109.

162. Vargas M., Gascon J., Jimenez De Anta M.T., Vila J. Prevalence of Shigella enterotoxins 1 and 2 among Shigella strains isolated from patients with traveler's diarrhea. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - №11. - P. 3608-3611.

163. Villalobo E., Torres A. PCR for detection of Shigella spp. in mayonnaise // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64. - №4. - P. 1242-1245.

164. Wang R.F., Cao W.W., Cerniglia C.E. A universal protocol for PCR detection of 13 species of foodborne pathogens in foods // Appl. Microbiol. -1997. Vol. 83. -№6. - P. 727-736.

165. Wang RF, Cao WW, Cerniglia CE. Phylogenetic analysis and identification of Shigella spp. by molecular probes // Mol Cell Probes. -1997. Vol. 11. - №6. - P. 427-432.

166. Watanabe H., Nakamura A., Timmis K.N. Structural analysis of the virulence plasmid of Shigella ssp. // Ibid. 1995. - Vol. 43. - P. 55.

167. Way J.S., Josephson K.L., Pillai S.D. et al. Specific detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol. 59. - №5. - P. 1473-1479.

168. Wawer C., Ruggeberg H., Meyer G., Muyzer G. A simple and rapid electrophoresis method to detect sequence variation in PCR-amplified DNA fragments // Nucleic Acids Res. 1995. - Vol. 23. - №11. - P.4928-4929.

169. Xu J., Cheng В., Wu Y. A new diarrhea pathogen: entero-SLTs-producing and invasive Escherichia coli was over-looked as normal flora E. coli // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. 1994. - Vol. 15. - №6 - P. 333-338.

170. Yavzori M., Cohen D., Wasserlauf R. et al. Identification of Shigella species in stool specimens by DNA amplification of different loci of the Shigella virulence plasmid // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1994. -Vol. 13. -№3 - P. 232-237.

171. Yavzori M., Uriel N., Porat N. et al. Development of molecular tests for rapid detection of enteropathogens // Harefuah. 2000. - Vol. 138. - №9. -P. 758-762, 805.

172. Ye L.Y, Lan F.H., Zhu Z.Y. et al. Detection of Shigella and enteroinvasive Escherichia coli using polymerase chain reaction // J. Diarrhoeal. Dis. Res. 1993. - Vol. 11. - №1. - P. 38-40.

173. Yokoigawa К., Hirasawa R., Ueno H. et al. Gene cloning and characterization of alanine racemases from Shigella dysenteriae, Shigella boydii, Shigella flexneri, and Shigella sonnei // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2001. - Vol. 288. - P. 676-684.

Информация о работе

Орлова, Клавдия Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2004
ВАК 03.00.07

Диссертация

Экспресс-детекция и выявление генов факторов патогенности бактериальных возбудителей острых кишечных инфекций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы