Формирование патогенного потенциала у аутоштаммов Escherichia coli в ассоциативном симбиозе толстой кишки у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта

Иванова, Елена Иннокентьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Формирование патогенного потенциала у аутоштаммов Escherichia coli в ассоциативном симбиозе толстой кишки у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Формирование патогенного потенциала у аутоштаммов Escherichia coli в ассоциативном симбиозе толстой кишки у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта"

¿¿6^/1

На правах рукописи

ИВАНОВА Елена Иннокентьевна

ФОРМИРОВАНИЕ ПАТОГЕННОГО ПОТЕНЦИАЛА У АУТОШТАММОВ ESCHERICHIA COLI В АССОЦИАТИВНОМ СИМБИОЗЕ ТОЛСТОЙ КИШКИ У ДЕТЕЙ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ НАРУШЕНИЯМИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНОГО ТРАКТА

03.02.03 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

005549358

Иркутск —2014

005549358

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Попкова София Марковна

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор

Долгих Владимир Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Маркова Юлия Александровна

(и.о. заведующей лабораторией фитоиммунологии Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН)

(доцент кафедры физико-химической биологии ФГБОУ ВПО «Иркутский государственный университет»)

Ведущая организация:

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Минздрава России

Защита диссертации состоится « ¿¿-¿£/¿»2- 2014 г. в /С часов на засе-

дании диссертационного совета ДМ 001.038.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН по адресу: 664003, г. Иркутск, ул. Тимирязева, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте www.nzmedek.ru ФГБУ «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» СО РАМН

кандидат биологических наук

Юринова Галина Валерьевна

Автореферат разослан « 16 » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук

Кулеш Дмитрий Владимирович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Международные исследования микробиома человека, позволили пролить свет на огромную роль микробиоты человека в сохранении физиологического здоровья и тесной взаимосвязи его дисбиотических состояний со множеством заболеваний макроорганизма (Arumugam М. et al., 2011; Qin J. et al., 2010). В микробиоме человека наиболее представительна микробиота желудочно-кишечного тракта, в структуре патологии которого значительное место в детском возрасте занимают функциональные нарушения (Хавкин А.И., 2001; Tyler A.D. et al., 2013). В нормальных физиологических условиях макроорганизм и его микробиота представляют собой сложный, многофункциональный, динамический, равноправный симбиоз (эубиоз) (Ефимов Б.А. и др., 2002; Войда Ю.В. и др., 2012). При превышении пороговой величины отрицательно воздействующих на организм экзогенных и эндогенных факторов микробиоценозы выходят из состояния равновесия, что проявляется не только микроэкологическими или иммунными нарушениями, но и огромным спектром заболеваний, сопряженных с нарушением микроэкологического гомеостаза (Abbasian F. et al., 2013). Иммунная система детей играет решающую роль в этих процессах как мощный защитный барьер и регулятор патологических состояний организма, а возрастная структура детей характеризуется некоторыми особенностями развития иммунитета. Для понимания функциональных возможностей иммунитета растущего организма важно знать физиологию его становления, которая определяется наличием пяти критических периодов развития (Стефани Д.В. и др., 1977; Хаитов P.M., 2001; Леванова JI.A. и др., 2003; Никулин Б.А., 2007; Щеплягина JI.A. и др., 2009). Немногочисленные исследования свидетельствуют о том, что для каждого периода развития иммунной системы детей характерен своеобразный состав микробиоты кишечника (Лева-нова Л.А. и др., 2003; Спирюкова У.А., 2010; Куандыкова А.К. и др., 2010). Поэтому вопросы профилактики дисбиотических расстройств вызывают возрастающий интерес, поскольку поддержание на физиологическом уровне нормальной микробиоты человека предупреждает как развитие дисбиозов, так и многих других заболеваний, развивающихся и углубляющихся на их фоне (Янковский Д.С. и др., 2010).

Любые нарушения приводят к доминированию в биотопе потенциально опасных микроорганизмов, усилению генетического обмена и формированию клонов, несущих геномные «острова» патогенности, а также множественную лекарственную устойчивость микроорганизмов (Янковский Д.С. и др., 2010).

Escherichia coli, являясь постоянным обитателем кишечника человека, выполняет ряд полезных для хозяина функций - синтезирует витамины и аминокислоты, поддерживает колонизационную резистентность кишечника, обеспечивает антигенную стимуляцию местного иммунитета (Тюрин Ю.А. и др., 2002). Между тем, при нарушениях микроэкологического характера E.coli способна резко наращивать не только свое количественное присутствие, но и проявлять патогенные свойства, что играет важную роль в патогенезе развития дисбиоза кишечника. Постоянный антигенный дрейф, наличие или приобретение различных факторов патогенности (токсины, гемолизины, некротизирующий и гемолитический факторы, сидерофоры) затрудняют проведение эффективной специфической профилактики эшерихиоза, что побуждает не только постоянно осуществлять мониторинг данной инфекции, но изучать и контролировать биологические свойства возбудителя, прежде всего, его антибиотикоре-зистентность и наличие различных маркеров патогенности (Мамбетова Э.Ф., 2007; Лайман Е.Ф. и др., 2012). Наличие подобных свойств повышает патогенный потенци-

ал микробов, придавая им высокую экологическую пластичность и способность активно участвовать в воспалительном процессе (Малов В.А. и др., 2005; Гриценко В .А. и др., 2000).

Особого внимания заслуживают кишечные (диарейные) заболевания, обусловленные штаммами E.coli, продуцирующими Shiga-подобный токсин. Вызываемые шигатоксигенным типом вспышки происходят все чаще, последняя из них (май-июнь 2011 г. в Германии) охватила свыше 4000 человек, у 25 % из которых диарея сопровождалась развитием гемолитико-уремического синдрома. Заболевание завершилось летальным исходом в 39 случаях (возбудитель серотип ОЮ4:Н4) (Кафтырева Л.А. и др., 2011; Brzuszkiewicz Е. et al., 2011; Corogeanu D. et al., 2012).

Цель работы. Изучить динамику формирования патогенного потенциала микроорганизмов-симбионтов кишечного микробиоценоза для оценки риска развития воспалительных процессов у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта.

Для реализации этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Дать микробиологическую характеристику кишечного биоценоза и изучить ассоциативные взаимоотношения симбионтов толстой кишки у детей разного возраста с ФНЖКТ.

2. Установить наличие и частоту встречаемости фрагментов генов «островов» патогенности у аутоштаммов Escherichia coli, выделенных при ФН ЖКТ у детей разных возрастных групп.

3. Определить характер взаимосвязи между наличием патогенного потенциала изученных культур индигенной Escherichia coli с сопутствующей кишечной микро-биотой.

Научная новизна работы

Впервые показано, что аутоштаммы E.coli с нормальной ферментативной активностью, выделенные от детей с ФН ЖКТ, несут фрагменты ДНК «островов» патогенности, гомологичные известным генам кластеров патогенности Escherichia coli и характерным для диареегенных штаммов (энтеропатогенных, энтерогемморагиче-ских E.coli).

Регистрация генетических детерминант патогенности в аутоштаммах индиген-ных эшерихий в сочетании с сопутствующей потенциально-патогенной микробиотой дают основание для дальнейшего изучения вопросов, связанных с внутривидовой пластичностью и эволюцией E.coli.

Практическая значимость работы обоснована научной новизной проведенных исследований.

Полученные в работе данные расширяют и углубляют представления о характере межмикробных взаимодействий, определяющих формирование и поддержание микросимбиоценозов кишечника, что позволит оптимизировать диагностику, профилактику и коррекцию патомикробиоценозов.

Использование метода ГТЦР для детекции факторов патогенности в аутоштаммах индигенной E.coli целесообразно для получения объективной информации о локальной циркуляции аутоштаммов E.coli с наличием детерминант патогенности.

Полученные новые данные используются в учебном процессе на кафедре эпидемиологии и микробиологии ГЪОУ ДПО ИГМАПО МЗ РФ, физико-химической биологии ФГБОУ ВПО ИГУ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Развитие микроэкологических нарушений в кишечном биотопе у детей с ФН ЖКТ характеризуется снижением доминирования и значимости индигенной сим-биотической биоты, что сопровождается нарушением контроля за составом условно-патогенных видов.

2. Штаммы Е.соН разных фенотипических групп (вариантов), выделенные от детей с ФН ЖКТ, являются резервуаром генетических детерминант факторов пато-генности, обеспечивающих главным образом колонизацию (закрепление) микроорганизмов и синтез шига-подобных токсинов.

3. Потенциал факторов патогенности в составе популяций Е.соН формируется у детей с ФН ЖКТ чаще при дисбиотических нарушениях, нежели при эубиозе.

Апробация диссертационных материалов проведена на разных уровнях. Фрагменты диссертации были представлены на 3-х м ежду 11 ар од н ых конференциях, на 9 форумах регионального и межрегионального значения. В их числе: Ежегодная научно-теоретическая конференция аспирантов и студентов Иркутского государственного университета (г. Иркутск, 2009); Научно-практическая конференция «Экспериментальные подходы в решении медико-биологических проблем» (г. Иркутск, 2011); II Межрегиональная научно-практическая конференция молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (г. Иркутск, 2011); IX Научно-практическая конференция молодых ученых, посвященная 35-летнему юбилею Научно-исследовательского института медицинских проблем Севера СО РАМН «Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири» (г. Красноярск, 2011); Межрегиональная научно-практическая конференция молодых ученых «Экологические и медицинские проблемы Сибири» (г. Ангарск, 2012); Научно-практическая конференция молодых ученых «Диагностика, профилактика и надзор за природно-очаговыми и другими инфекционными болезнями» (г. Иркутск, 2013); 80-ая Юбилейная Всероссийская Байкальская научно-практическая конференция молодых ученых и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицины» (г. Иркутск, 2013); Международная конференция «Молекулярная эпидемиология актуальных инфекций» (г. Санкт-Петербург, 2013); Юбилейная научно-практическая конференция с международным участием, посвященная 90-летию организации кафедры инфекционных болезней «Актуальные проблемы современной инфектологии» (г. Иркутск, 2013); Научно-практическая конференция педиатров «Актуальные проблемы детской инфектологии (г. Иркутск, 2013); III Межрегиональная научно-практическая конференция молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (г. Иркутск, 2013).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, в том числе 8 — в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. В работах вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

Объем н структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, глав собственных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 125 страницах машинописного текста, иллюстрирована 7 таблицами, 20 рисунками. Библиографический указатель включает 147 наименований отечественных и 77 зарубежных источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Объектами настоящего исследования являлись дети с ФН ЖКТ (абдоминальный синдром, расстройства дефекации, расстройства билиарного тракта, функциональные запоры, колики в течение не менее 12 недель за последние 12 месяцев) -225 человек (из них дети до года — 85 человек, дети после года — 140 человек). В процессе анализа полученного материала и в соответствии с решаемыми задачами обследованные дети были разделены по возрастным группам, сопоставимым с критическими периодами развития иммунной системы (Стефани Д.В. и др., 1996; Ле-ванова JI.A., 2003). 1 -я группа (п = 33) - дети от рождения до 1 месяца (I критический период), 2-я группа (п = 48) — от 3 до 6 месяцев (И критический период); 3-я группа (п = 52) - от 1 года до 2 лет (III критический период); 4-я группа (п = 64) — от 4 до 6 лет (IV критический период); 5-я группа (п = 19) - 12-15 лет (V критический период). В качестве контрольной группы была взята выборка здоровых детей (100 чел.) сопоставимого возраста. Факторами исключения из исследования были хронические заболевания, в том числе желудочно-кишечного тракта, прием антибактериальных и про-биотических препаратов за 3 месяца до обследования. Исследование одобрено комитетом по биомедицинской этике ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ» СО РАМН и выполнено с информированного согласия пациентов.

Материалом для исследований послужили 225 копрологических проб, отобранных у всех обследованных детей с ФН ЖКТ в период с 2011 по 2013 г., и 100 копрологических проб здоровых детей. Для исследования были выделены разные типы E.coli как от здоровых детей, так и с ФН ЖКТ: с нормальной ферментативной активностью (соответственно 20 и 202 аутоштаммов), со слабой ферментативной активностью (10 и 60 аутоштаммов) и с гемолитической активностью (24 аутоштамма — от детей с ФН ЖКТ). По культурально-ферментативным свойствам и антигенным характеристикам исследуемые штаммы E.coli являлись типичными представителями индигенной микробиоты рода Escherichia.

Бактериологическое исследование качественного и количественного состава содержимого кишечника проводили по методикам Р.В. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Виль-шанской в модификации Б.А. Ефимова, В.М. Коршунова и др. «Диагностика, профилактика и лечение дисбактериозов кишечника», 1991 г., 1997 г., Методическим рекомендациям — СПб, 2002 г., с использованием актуальных справочных материалов (Йоргенсен Дж.Х., 2006; Меньшиков В.В., 2009).

Экстракцию тотальной бактериальной ДНК из бактериальных суспензий исследуемых микроорганизмов осуществляли с помощью комплекта реагентов «ДНК-сорб-АМ» (Россия, ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Для ПЦР амплификации использовали стандартный набор «АмплиСенс-1» (пр-во ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), амплификатор «Mastercycler» (фирма «Eppendorf»). Подбор температуры отжига праймеров осуществляли экспериментальным путем, а также используя данные литературы (Schultsz С. et al., 1994; Gunzburg S.T. et al., 1995; Tornieporth N.G. et al., 1995; Schmidt H. et al., 1995; Blanco M. et al., 2003) и рекомендации НПФ «Литех». Для исследования одного образца использовали 15 мкл реакционной смеси: 5-х PCR-буфер - 3 мкл; MgS04 - 1,5 мкл; dNTP - 0,3 мкл; олигонуклеотидные праймеры — по 1 мкл; Tag-полимераза - 0,05 мкл; деионизированная вода - 7,2 мкл; 2 мкл тотальной ДНК исследуемого микроорганизма.

Бактерии тестировали методом ПЦР на наличие генов вирулентности. Использовали праймеры к ряду генов, обнаруженных в составе «островков» патогенности Е.соН: ген Ь/р- контролирующий способность к формированию связывания пилей, ген еае — синтез бактериального адгезина интимина, еЫА — токсинообразование, гены ¡1x1 и $1x2 - синтез шигаподобных токсинов 1 и 2 типа, ¡раН - способность к инвазии, Есо1и~Рь1[ фрагмент плазмиды рСУВ432 (рСУ0432) (табл. 1). Праймеры синтезированы в НПФ «Литех» (г. Москва).

Таблица 1

Праймеры, использованные в работе

Ген Олигонуклеотидные последовательности (5' - 3') Размер ампли-кона (П.Н) t° отжига ГО Источник

Ь/Р F AATGGTGCTTGCGCTTGCTGC 326 56 Gunzburg S.T. et al., 1995

R GCCGCTTTATCCAACCTGGTA

еае F GGAACGGCAGAGGTTAATCTGCAG 775 55 Blanco M. et al., 2003

R GGCGCTCATCATAGTCTTTC

stxl F CGCTGAATGTCATTCGCTCTGC 302 55 Blanco M. et al., 2003

R CGTGGTATAGCTACTGTCACC

stx2 F CTTCGGTATCCTATTCCCGG 516 55 Blanco M. et al., 2003

R CTGCTGTGACAGTGACAAAACGC

elíA F GGCGACAGATTATACCGTGC 696 43 Schultsz С. et al., 1994

R CCGAATTCTGTTATATATGTC

ipaH F GCTGGAAAAACTCAGTGCCT 426 56 Tomieporth N.G. et al.,1995

R CCAGTCCGTAAATTCATTCT

pCVD432 F CTGGCGAAAGACTGTATCAT 630 53 Schmidt H. et al., 1995

R CAATGTATAGAAATCCGCTGTT

Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в 1% агарозном геле, окрашенным бромистым этидием. В качестве буферной системы использовали трис-ацетатный буфер. Электрофорез проводили в режиме: 100 В, 50 мА, 40-50 мин. В качестве маркера использовали O'RangeRuler 100 bp DNA Ladder («Fermentas», Литва), в качестве отрицательного контроля использовали реакционную смесь, не содержащую ДНК. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете и документировали с помощью программы inVCR на трансиллюминаторе UVT 1 biokom.

Статистическая обработка данных произведена при помощи лицензионных прикладных программ «MS Excel for Windows» и «Statgrafics» с учетом конкретных целей решавшейся задачи. Вычислялись основные показатели параметрических методов вариационной статистики (средняя арифметическая, мода, медиана, дисперсия, критерий Стыодента-Фишера, достоверность полученных результатов), а также непараметрические критерии оценки достоверности (критерий Вилкоксона) при критическом значении уровня значимости р<0,05 (Мюллер П., 1982; Кулачёв А.П., 1999; Гайдышев И.В., 2001; ГОСТ Р ИСО 5725-2-2002; Савилов Е.Д. и др., 2011).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Микроэкологическая характеристика интестииального биоценоза детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта

Проведенные исследования показали, что практически у всех обследованных детей выявлялись отклонения в составе микроорганизмов кишечной микробиоты относительно общефизиологических нормативов (ОСТ, 2003).

Микробный пейзаж у детей с ФН ЖКТ демонстрировал снижение содержания облигатных анаэробных микроорганизмов (бифидобактерий у 55,6 %, лактобактерий у 1,3 % лиц) и аэробных - E.coli с нормальной ферментативной активностью (16,4 %) микроорганизмов, доминирующих в составе нормальной кишечной биоты, и повышение уровня факультативных и условно-патогенных, таких как Klebsiella spp. (у 37,3%), Enterobacter spp. (9,7%), Clostridium spp. (17,3%), Staphylococcus spp. (24,5%), Candida spp. (до 20,0%), E.coli с проявлением атипичных свойств (у 11,6%— 27,1 % обследованных). Процессы колонизации условно-патогенными бактериями происходят на фоне резкого угнетения нормальных симбионтов, обеспечивающих колонизационную резистентность. Что является логичным явлением, так как бифидофлора не только осуществляет поддержание микроэкологического гомеостаза за счет эволюционно сложившихся симбиотических взаимодействий с организмом хозяина, но и контролирует включение в микробиоценоз условно-патогенных бакте-рий-ассоциантов за счет препятствия их адгезии, антагонистического действия и подавления персистентных свойств аллохтонной микробиоты (табл. 2).

Таблица 2

Характеристика микробиоты толстой кишки у детей с ФН ЖКТ (п = 225)

Микроорганизмы Частота регистрации микроорганизмов и обнаружения различных дисбиотических состояний (М±т %)

Дети до года (п = 85) Дети старше года (п = 140)

E.coli со слабой ферментативной активностью 40±5,31 19,3±3,3*|

E.coli (гем+) 10,6±3,3 12,1±2,7

Enterococcus spp. 70,6±4,9 72,1 ±3,7

Clostridium spp. 22,4±4,5 14,3±2,9

Klebsiella spp. 57,6±5,3 25,0±3,6*1

Enterobacter spp. 10,6±3,3 9,3±2,4

Citrobacter spp. 3,5±1,9 5,0±1,8

Proteus spp. 2,4±1,6 1,4±0,9

Pseudomonas spp. 2,4±1,6 3,6±1,5

Staphylococcus spp. 49,4±5,4 8,6±2,3*|

Candida spp. 7,1±2,7 20,0±3,3*t

Характер изменении:

Дефицит бифидофлоры 60,0±5,3 52,9±4,2

Дефицит лактобацилл 1,2±1,1 1,4±0,9

Дефицит E.coli с нормальной ферментативной активностью 18,8±4,2 15,0±3,0

Примечание: — значение показателя статистически значимо ниже такового в сравниваемой группе (р < 0,05);

— значение показателя выше такового в сравниваемой группе (р < 0,05)

Однако обращает на себя внимание достоверно более высокая (р < 0,01) распространенность среди детей с ФН ЖКТ энтерококков (около 70 %) по сравнению со здоровыми (13,0 %) (табл. 2, 3). Это обстоятельство предполагает, что энтерококки в выборке детей с ФН ЖКТ приобрели статус доминирующего вида, тогда как у здоровых они регистрируются как факультативные обитатели кишечного биоценоза. Учитывая неоднозначную роль энтерококков в микроэкологии человека (обеспечение колонизационной резистентности слизистых в норме и, в то же время, усиление в последние десятилетия их роли в возникновении нозокомиальных инфекций), можно полагать, что увеличение частоты регистрации их у детей с ослабленной иммуноре-зистентностью свидетельствует о высоком риске появления штаммов с наличием ряда факторов патогенности, вызывающих инфекционные процессы (Габриелян И.Н. и др., 2007; Попкова С.М. и др., 2011).

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что у каждого второго ребенка с ФН регистрируется кишечный дисбактериоз первой-второй степени. Исследования характера и степени микробной колонизации кишечного биотопа, определяемой в копропробах, показали, что у детей с ФН ЖКТ первого года жизни «идеальный», т.е. физиологически нормальный, биоценоз кишечника встречается редко (1,2 %).

Таблица 3

Частота обнаружения и количество микроорганизмов в 1 г копроматериала

у здоровых детей

Наименование микроорганизма Частота обнаружения (коэффициент постоянства, с) (%) Популяционная плотность, M±m (lg КОЕ/г)

Анаэробные микроорганизмы

Бифидобактерии 100 8.2±0,1

Лактобактерии 100 6.2±0,1

Аэробные микроорганизмы

Эшерихии 100 6,2±0,3

Е.соИ со слабой ферментативной активностью 12,7±3,3 6,1 ±0,5

Энтерококк 13,0±3.3**| 4,1±0,2

Стафилококк 5.6±2.3 3,0±0,1

Примечание: — р < 0,01, сравнение с аналогичным показателем у детей с ФН (табл. 2)

С возрастом наблюдалась тенденция к снижению частоты выделения атипичных E.coli, а доля лиц с нормальным содержанием полноценной E.coli увеличивалась (табл. 2).

Результаты исследований свидетельствуют о достаточно высокой встречаемости у детей с ФН ЖКТ разных возрастных групп условно-патогенных микроорганизмов, как в монокультуре, так и в сочетании со стафилококками или с клебсиеллами.

Увеличение с возрастом у детей грибов рода Candida (табл. 2), вероятно, обусловлено увеличением контактов при посещении детского сада, школьных учреждений и изменениями в ежедневной диете. Однако следует отметить, что наличие кандид и клебсиелл у детей старшей возрастной группы, может быть связано и с канди-дозом, приобретенным во время пребывания в роддоме.

Анализ полученных результатов показал, что качественные и количественные характеристики нормальной микробиоты кишечника изменяются в различные периоды жизни детей с ФН, что согласуется с данными других исследователей (Леванова Л.А. и др., 2001, Спирюкова У.А., 2010). Исследования выявили микроэкологические сдвиги в кишечной микробиоте детей в возрастные периоды, которые соответствуют критическим периодам (табл. 4). Во всех группах наблюдалось угнетение индигенной биоты. Причем, если у детей первого года жизни дефицит бифидобактерий может быть обусловлен особенностями процессов сукцессии кишечного тракта, то сохранившийся дефицит этих микроорганизмов у детей в более старшем возрасте, свидетельствует об устойчивости данной тенденции, ведущей к нарушению микроэкологического баланса. Все это приводит к селекции оппортунистических микроорганизмов, аллергизации организма, воспалительным заболеваниям кишечника и т.д.

Таблица 4

Характеристика микробиоты кишечника у детей в критические периоды (I — V) развития иммунной системы

Микроорганизмы Частота обнаружения УПМ и характера дисбиотических проявлений в кишечном биоценозе (%. М±ш)

I < 1 мес. (п = 33) II 3-6 мес. (п = 48) III 1-2 года (п = 52) IV 4-6 лет (п = 64) V 12-15 лет (п = 19)

E.coli со слабой ферментативной активностью 45,5±8,6 39,6±7,1 23,1±5,8 17,2±4,7 15,8±8,3* (V-I)

E.coli (гем t) 9,1±5,0 12,5±4,7 21,2±5,6 6,3±3,0 5,3±5,1* (V-III)

Enterococcus spp. 63,6±8,3 81,3±5,6 67,3±6,5 65,6±5.9 57,9± 11,3

Clostridium spp. 21,2±7,1 23,0±6,1 13,5±4,7 14Д±4,3 15,8±8,3

Klebsiella spp. 48,5±8,6 64,6±6,9 36,5±6,6 17,2±4,7* (IV-,n,III) 21,1±9,3* (V-I,II)

Enterobacter spp. 6,1±4,1 14,6±5,1 9,1±3,9 11,0±3,9 5,3±5,1

Citrobacter spp. 0 6,3±3,5 7,7±3,6 3,1±2,1 10,5±7,0

Proteus spp. 3,0±2,9 0 3,8±2,6 0 5,3±5,1

Pseudomonas spp. 3,0±2,9 0 5,8±3,2 4,7±2,6 0

Staphylococcus spp. 51,5±8,6 48.0±7,2 13,5±4,7 11,0±3,9 0

Candida spp. 6,1 ±4,1 6,3±3,5 26,9±6,1* (Ш-1,11) 17,2±4,7 21,1±9,3

Характер дисбаланса индигенной микрофлоры:

Дефицит бифидобактерий 51,5 68,8 52,0 62,5 42,1

Дефицит лактобактерий 3,0 0 0 3,1 0

Дефицит Е. coli с нормальной ферментативной активностью 30,3 18,8 7,7 15,6 15,8

Примечание: * - (р < 0,05)

У детей первых двух лет жизни с высокой частотой обнаруживались потенциально патогенные микроорганизмы сем. Enterobacteriaceae: Klebsiella spp., Enterobacter spp. и др. Индикация условно-патогенной микробиоты семейства Enterobacteriaceae у детей старшего возраста свидетельствовала о длительной персистенции этих микроор-

ганизмов в условиях организма-хозяина, в результате чего возможно развитие хронической инфекции и бактерионосительство. Отмечено, что такие дисбиотические нарушения, как правило, плохо поддаются коррекции и требуют длительного лечения пробиотиками и антимикробными препаратами (Леванова Л.А., 2003).

Резюмируя эту часть исследования, можно сказать, что, наряду с широким распространением среди детей с ФН ЖКТ дефицита индигенной микрофлоры, отличительной особенностью микроэкологического статуса кишечного биоценоза является значительно большее по сравнению со здоровыми детьми распространение среди них энтерококков. Это может стать риском для появления штаммов с наличием ряда факторов патогенности, вызывающих инфекционные процессы (Бондаренко В.М. и др., 2007; Eaton T.J. et al., 2001). Кроме того, нами отмечено, что у детей с пониженной колонизационной резистентностью (дети с ФН ЖКТ), процессы установления микроэкологического гомеостаза завершаются достаточно поздно — к третьему-четвертому году жизни.

Характеристика комплекса генетических маркеров факторов патогенности в штаммах Escherichia coli, выделенных из кишечника детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта

Тестирование штаммов E.coli, выделенных у детей с ФН ЖКТ показало, что независимо от изучаемой фенотипической группы бактерий, чаще всего искомые ам-пликоны выявлялись при использовании праймеров к генам bfp, stxl, stx2 и pCVD432. Частота встречаемости данных ампликонов у кишечных палочек с нормальной ферментативной активностью составила 92,1 %, 12,9 %, 5,0 % и 5,0 % соответственно, а в группе сравнения: 100,0 %, 15,0 %, 5,0% и 30,0% (р < 0,05 для pCVD432). Редко встречаемыми генами являлись еае — 1,0 %, eltA — 0,5 %. Как правило, изучаемые гены патогенности чаще определялись на фоне высокой популяционной плотности эшерихий (107 - 108 КОЕ/г), на 2-3 порядка превышающих зарегистрированную нами их низкую концентрацию (ОСТ, 2003). В данной фенотипической группе эшерихий ампликоны, специфичные ipaH гену, отсутствовали.

В группе слабоферментативных E.coli доля генетических детерминант факторов патогенности была несколько ниже по сравнению с типичными эшерихиями. Так, маркеры гена bfp, определялись в 86,6 %, stxl - 8,3 %, stx2 и ipaH — по 5,0 %. Гены еае, pCVD432 и eltA в данной фенотипической группе отсутствовали. В группе сравнения bfp присутствовал во всех выделенных аутоштаммах (100,0 %), pCVD432 определялся в 40,0 % случаев (значительно выше по сравнению с детьми с ФН, р < 0,05), другие изучаемые генетические детерминанты патогенности не выявлялись (рис. 1, 2).

В группе гемолитических E.coli, вегетирующих только в кишечном биотопе детей с ФН, частота встречаемости генетических детерминант в ДНК данного микроорганизма была несколько ниже, чем в типичных и слабоферментативных вариантах. Анализ материала показал, что среди изолятов E.coli с гемолитической активностью доминировали аутоштаммы с наличием bfp - гена, отвечающего за формирование связывания пилей (91,6 %). Гены еае, stxl, stx2 и eltA выявлялись в геноме микроорганизмов данной фенотипической группы бактерий с равной частотой — по 4,2 %.

Гены патогенности, кодирующие способность к инвазии (ipaH), и EcoRI-PstI фрагмент плазмиды pCVD432 (pCVD432) в геноме гемолитических кишечных палочек отсутствовали (рис. 1).

Escherichia col) с гемолитической аетивностью

Escherichia сой со

слабой ферментативной активностью

Escherichia соК с нормальной

Щ4,2%

lö%

§4,2% ЯМ 2%

191,6%

0% 0%

iä 5,0% йЧ 5.0%

_] 8,3%

| 86,6%

Ц5% %

„ И 5.0% ферментативной _ 12,9%

активностью

192,1%

0% 20% 40% 60% 80% 100% частота встречаемости, %

ШекА И pCVD432 S ipaH И stx2 □ stxl ■ eae

Рисунок 1. Регистрация генов патогенности в штаммах E.coli у детей с ФН ЖКТ (п = 225)

Escherichia cob со 0%

111111111111140.0% П eltA Ш pCVD432 S3 ipaH

слабой ферментативной активностью 0% 0,0% 0%

Escherichia соК с 0% E3stx2 □ stxl

II I 1 геи 30,0%

нормальной 0% ЕШ.0% Ei eae

ферментативной 115.0% ■ bfp

активностью

0% 20% 40% 60% 80% 100% 120%

частота встречаемости, %

Рисунок 2. Регистрация генов патогенности в штаммах E.coli у здоровых детей (п = 20)

Из всех изученных генов, детерминирующих патогенность, одиночные гены обнаружены в превалирующем большинстве изолятов (80,5 %), 19,6 % - в сочетании по два и по три гена. Чаще всего ассоциации генов патогенности состояли из амплико-нов, специфичных генам — bfp, stxl, stx2 и pCVD432. Сочетания генов (ассоциации генов) были отмечены среди разных фенотипических вариантов E.coli и примерно с близкой частотой: у E.coli с нормальной ферментативной активностью - 18,8%, у E.coli со слабой ферментативной активностью - 16,7 %, у E.coli с гемолитической активностью — 16,7 %.

Из всех зарегистрированных нами сочетаний генетических детерминант патогенности в геноме E.coli с нормальной ферментативной активностью преобладали следующие: bfp+stxl (в 52,6% изолятов), bfp+stx2 (15,8%), bfp+pCVD432 (13,2%);

реже встречались: Ь^р+Их1+рСУ0432 (7,9%), Ь/р+51х2+рСУИ432 (5,3 %), Ь/р**Ъс]+е1М (2,6 %) и Ь/р+еае (2,6 %) (рис. 3).

При анализе этого блока данных обращают на себя внимание два факта. 1-й: вариант сочетания генов Ь/р+51х2+рСУБ432 в геноме типичной Е.соИ определялся нами только на фоне сбалансированного микроэкологического статуса кишечника (микробиологическом эубиозе). 2-й: сочетания Ь/р+з!х1 (52,6 %) встречались значительно чаще (р < 0,05), чем Ь/р+з1х1+рСУ0432 (7,9 %), равно как и сочетания (15,8 %) по сравнению с Ь#+я1х2+рСУП432 (5,3 %).

■ Ьф+stxl

■ bfp+stx2 В Ьф+ pCVD432 В Ьф+stxl+pCVD432 □ Ьф+5&2+ pCVD432 £3 Ьф+stxl +eltA КЬф+еае

Рисунок 3. Встречаемость сочетаний генов патогенности среди штаммов E.coli с нормальной ферментативной активностью

Последнее обстоятельство дает основание предполагать, что у детей с ФН ЖКТ генетические маркеры веротоксинов распространяются значительно быстрее, чем мобильная плазмида - EcoRI-Pstl (или часть плазмиды -pCVD432~).

Распространенность генетических маркеров факторов патогенности в кишечной микробиоте детей разных возрастных групп

Наличие ассоциаций генов в геноме E.coli с нормальной ферментативной активностью, чаще (57,9%) регистрировалось у детей старше года (от 1,4 до 6 лет) по сравнению с младшей возрастной группой (от 1 мес. до 6 мес., 42.1 %). Ассоциации генетических маркеров в наибольшей степени (р < 0,05) были зарегистрированы при дефиците бифидобактерий (47.4 %) и достаточно редко - на фоне дефицита лактоба-цилл (2,6 %) и собственного дефицита типичных E.coli (5,3 %). Преобладающей сопутствующей микробиотой являлись представители Enterococcus spp. (63,2 %), Klebsiella spp. (44,7%), Staphylococcus aureus (21,1 %), сульфитредуцирующие бактерии рода Clostridium (18,4%), Enterobacter spp. и Candida spp. (no 13,2%), атипичные формы E.coli (со слабой ферментативной активностью — 13,2 % и с гемолитической активностью — 2,6 %), далее по убывающей - Citrobacter spp. (5,3 %) и Proteus spp. (2,6 %). В условиях микроэкологического гомеостаза данные ассоциации генов патогенности выявлялись в 10,5 % случаев.

Регистрация сочетаний генов в ДНК атипичных кишечных палочек, выделенных от детей с ФН

Среди изолятов E.coli со слабой ферментативной активностью выявлялись следующие варианты: bfp+stxl (40,0 %), bfp+stx2 (30,0 %), bfp+ipaH (30,0 %) (рис. 4). В группе детей, как до года, так и старше года сочетания генов регистрировались в каждом втором изоляте, относящемся к слабоферментативной E.coli. Микроэкологиче-

ский статус при этом характеризовался дефицитом бифидобактерий (в 60,0 % случаев) и типичных E.coli (в 30,0 %), наличием Enterococcus spp. (60,0 %), гемолитических кишечных палочек (10,0 %) и вегетацией условно-патогенных микроорганизмов - Klebsiella spp. и S. aureus (по 50,0 %), Enterobacter spp. и Candida spp. (no 10,0 %).

Среди гемолитических фенотипов E.coli в ДНК этого микроорганизма выявлялись сочетания: bfp+stxl (25,0%), bjp+stx2 (25,0%), bfp+eae (25,0%), bfp+eltA (25,0 %) (рис. 4), и в преобладающем большинстве эти ассоциации генов регистрировались у детей старше года (75,0 %). Спектр микроорганизмов в кишечнике данных детей характеризовался значительной частотой вегетации Enterococcus spp. (75,0 %), Klebsiella spp. и Clostridium spp. (no 50,0 %), E.coli со слабой ферментативной активностью (25,0 %). У каждого второго ребенка из этой возрастной группы был выявлен дефицит бифидобактерий, на фоне которого вегетировали сопутствующие условно-патогенные микроорганизмы в диагностически значимом титре.

■ bfp+stxl

■ bfp+stx2 □ bfp+ipaH

Рисунок 4. Встречаемость ассоциаций генов патогенности у E.coli со слабой ферментативной активностью (а) и с гемолитической активностью (б)

У детей из группы сравнения практически каждый третий изолят (33,3 %) имел генетический маркер патогенности в моноварианте, 53,4 % - в сочетании по два и 13,3 % — по три гена. Чаще всего ассоциации данных генов состояли из ампликонов, специфичных генам — bfp, pCVD432 и stxl. Сочетания генов были отмечены в двух фенотипических вариантах E.coli (в пределах качественной и количественной нормы): в изолятах E.coli с нормальной ферментативной активностью — 80,0 %, E.coli со слабой ферментативной активностью - 40,0 %. У E.coli с нормальной ферментативной активностью преобладали сочетания: bfp+pCVD432 (50,0 %), реже - bfp+stxl (10,0%), bfp+stxl+stx2 (10,0%), bfp+stxl+pCVD432 (10,0%). В фенотипической группе Е. coli со слабой ферментативной активностью зарегистрировано одно сочетание - bfp+pCVD432 (40,0 %).

Комбинации сочетания генов у E.coli с нормальной ферментативной активностью, выделенной от детей с ФН ЖКТ, разнообразнее, чем у детей контрольной группы. Частота встречаемости как гена pCVD432, так и его ассоциаций с другими генами у здоровых детей имела более высокие процентные показатели.

Далее был проведен анализ с точки зрения присутствия генов в одном биотопе (у одного индивида), но в разных фенотипических вариантах кишечной палочки.

В 51 индивидуальном образце были зарегистрированы варианты вегетации популяций кишечной палочки с наличием разных биохимических типов E.coli в одном биотопе: 1) E.coli с нормальной ферментативной активностью + E.coli со слабой ферментативной активностью (30 образцов); 2) E.coli с нормальной ферментативной ак-

тивностью + E.coli с гемолитической активностью (13 образцов) и 3) E.coli с нормальной ферментативной активностью + E.coli со слабой ферментативной активностью + E.coli с гемолитической активностью (8 образцов).

В первом варианте ген, отвечающий за формирование связывания пилей (bfp), одновременно определялся как у E.coli с нормальной ферментативной активностью, так и у E.coli со слабой ферментативной активностью практически во всех образцах (86,7 %), тогда как присутствие stxl одновременно в двух биохимических типах было редким (3,3 %).

Во втором варианте частота встречаемости гена bfp, одновременно в двух фенотипах кишечной палочки регистрировалась с максимальной частотой (100,0 %), а stxl определялся хотя и с невысокой частотой (7,7 %), но, тем не менее, в 2 раза чаще, чем в 1 -м варианте. Ген еае зарегистрирован всего в 7,7 %.

При одновременной вегетации в кишечнике трех фенотипических вариантов (E.coli с нормальной ферментативной активностью + E.coli со слабой ферментативной активностью + E.coli с гемолитической активностью) преимущественно (62,5 % случаев) определялся только ген, отвечающий за формирование связывания пилей (bfp).

В группе сравнения были зарегистрированы варианты популяций кишечной палочки с ассоциациями из двух биохимических типов E.coli в одном биотопе: E.coli с нормальной ферментативной активностью + E.coli со слабой ферментативной активностью (10 образцов). В остальных случаях наблюдали присутствие только типичных E.coli. Данные показатели соответствуют физиологическим нормативам (ОСТ, 2003). Во всех исследуемых образцах присутствовал ген, отвечающий за формирование связывания пилей в обоих фенотипических вариантах микроорганизма, одновременно присутствующих в одном биотопе, и в 40 % случаев одновременно ген, кодирующий EcoRI-Pstl фрагмент плазмиды pCVD432. Последнее обстоятельство наблюдалось только в группе сравнения.

В связи с нечеткой определенностью различий по выявляемое™ генов патоген-ности в сравниваемых группах было решено провести сравнительную оценку данных в зависимости от микроэкологической характеристики кишечного биотопа.

В результате данного анализа было отмечено, что при эубиозе и в условиях нарушения микроэкологического равновесия в кишечном биоценозе (дефицит лакто- и бифидобактерий, вегетация условно-патогенной биоты) гены патогенности выявлялись в геноме E.coli по-разному (см. рис. 5). Так, при микроэкологической норме выявляемость bfp была в 2 раза ниже, чем при дефиците индигенной биоты и почти в 6 раз ниже, чем при вегетации условно-патогенной микробиоты (р < 0,05). Регистрация гена патогенности еае определялась только на фоне микроэкологического дисбаланса. Частота присутствия веротоксинов 1 -го и 2-го типов имела также свои особенности. Ген stxl выявлялся при микроэкологическом равновесии в кишечнике в 6,7 % случаев, что в 2 раза реже, чем stx2 (14,2 %, р < 0,05). При движении от состояния сбалансированного микроэкологического статуса к дисбиотическому частота встречаемости веротоксинов в геноме E.coli возрастала. Так, частота встречаемости гена stxl увеличилась в 3 раза в ДНК E.coli, вегетирующей в кишечнике на фоне дефицита бифидобактерий, и в 11 раз при более глубоком дисбиозе с присутствием в биотопе условно-патогенной биоты (от 6,7 % при эубиозе, р < 0,05). Выявляемость ампликонов, специфичных гену stx2, была в 2 раза выше, чем гена stxl при дефицитном состоянии индигенной биоты, но в 1,7 раз ниже частоты детекции веротоксина 1 на фоне индикации в биотопе условно-патогенной микробиоты в диагностически

значимой концентрации (> 104 КОЕ/г). Положительный сигнал при детекции генов патогенности, кодирующих способность к токсинообразованию (екА) и к инвазии (1'раН), был получен только в условиях дефицита индигенной микрофлоры с одновременным присутствием в биотопе условно-патогенной. Число штаммов, содержащих ЕсоЮ-Рб^ - фрагмент плазмиды рСУИ432 (рСУБ432), было одинаковым как при отсутствии микроэкологических нарушений (эубиозе), так и при неглубоких микроэкологических отклонениях (по 20,0 %). Однако при более серьезных нарушениях микробиоты частота их резко возрастала до 60,0 % (рис. 5).

120 -100 -80 ■] 60 -40 20 0

□ 50 <->42,9

20 14,2

—оШ-е

11,5

20 Н

▲ 100

А73»3 60Ö65J □ 50 ^ 42,9

23,4 20

эубиоз дефицит вегетация УПМ индигенной биоты

■ Ыр □ еае А stxl Ostx2

А ipaH и eltA О pCVD432

Рисунок 5. Частота детекции генов патогенности в зависимости от микроэкологического состояния кишечной биоты

Частота встречаемости генов патогенности анализировалась в зависимости от возраста детей. Так, наличие гена, отвечающего за формирование связывания пилей, у детей с ФН ЖКТ как первого года жизни, так и в старшей возрастной группе регистрировалось с высокой частотой - 90,6 % и 94,3 % соответственно. Ген еае, контролирующий синтез интимина, встречался редко (2,4 %), и при этом только у детей до года. Ген stxl у E.coli, выделенной от детей до года, определялся в 15,3 % случаев, что почти совпадает с аналогичным показателем у детей старшей возрастной группы. При этом частота детекции веротоксина 2 в ДНК E.coli, выделенной у детей старше года, была выше в 2 раза (7,9 %) по сравнению с младшей возрастной группой, первого года жизни. Частота встречаемости искомых ампликонов в геноме кишечных палочек, выделенных от детей младшей и старшей возрастных групп, при использовании прайме-ров к ipaH, pCVD432 и eltA была низкой и составляла: 2,4 % и 0,7 %, 4,7 % и 2,9 %, 1,2 % и 0,7 % соответственно по группам (табл. 5).

Таблица 5

Частота детекции генов патогенности у детей различных возрастных групп (%)

Группы детей Гены патогенности, %

Ыр еае stxl stx2 ipaH pCVD432 eltA

Дети до года (85 чел) 90,6 2,4 15,3 3,5 2,4 4,7 1,2

Дети старше года (140 чел) 94,3 0 12,1 7,9 0,7 2,9 0,7

Как известно, контакты с бактериальными антигенами определяют созревание иммунной системы, а состав микробиоты кишечника должен косвенно отражать особенности физиологического состояния как защитных, так и других систем организма в различные периоды жизни (Дубровская М.И. и др., 2006). И поэтому в процессе развития иммунной системы ребенка выделяют «критические» периоды, т.е. периоды максимального риска развития инфекционных заболеваний, связанных с недостаточностью функций иммунной системы (Леванова Л.А. и др., 2001; Хаитов P.M., 2001; Спирюкова У.А., 2010; Ахваткина Н.Б. и др., 2012). В соответствии с возрастами 5-ти критических периодов: 1 группа (п = 33) — дети от рождения до 1 месяца (I критический период); 2 группа (п = 48) - от 3 до 6 месяцев (II критический период); 3 группа (п = 52) - от 1 года до 2 лет (III критический период); 4 группа (п = 64) - от 4 до 6 лет (IV критический период); 5 группа (п = 19) - 12-15 лет (V критический период). Анализ данного материала показал, что распределение детерминант патогенности в группах было неравномерным.

Как и следовало ожидать, и при таком формате анализа (рис. 6) ген, отвечающий за формирование связывания пилей, выявлялся практически по всем группам с одинаково высокой частотой (84,9 — 93,8 %), достигнув наивысшей частоты детекции в старших группах (100,0 %).

Эти данные свидетельствуют о становлении микроэкологического гомеостаза кишечного биоценоза у детей, приближающихся к 4-летнему возрасту, когда один из главных компонентов индигенной микробиоты (нормальная кишечная палочка) получает селективное преимущество за счет экспрессии генов, способствующих колонизации слизистой кишечника.

5 критический период 4 критический период 3 критический период 2 критический период \ критический период Ш eltA И PCVD432 S ipaH Ш stx2 □ stxl Ш еае ■ bfp

шпппп

¡ш

0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% частота встречаемости, %

Рисунок 6. Частота встречаемости детерминант патогенности у детей в зависимости от критических периодов развития

Частота встречаемости определяемых генов патогенности различалась по периодам. У детей 2-го периода в геноме кишечной палочки регистрировался максимальный спектр (7 генов) определяемых нами генов патогенности. Минимальный спектр генов (4 гена) определялся у детей 4-го периода. В 1-м периоде зарегистриро-

вано 5 генов, в 3-м - 6. Первые два периода развития считаются наиболее уязвимыми (Стефани Д.В. и др., 1996) и снижение уровня популяционной плотности бифидоф-лоры является отражением данной ситуации в кишечном биоценозе детей. На этом неблагоприятном фоне у детей первых месяцев жизни в кишечном микробиоценозе преобладали представители сем. Enterobacteriaceae и рода Staphylococcus. Доминирующее место среди них занимали Klebsiella spp., S. aureus, а также E.coli с измененными биологическими свойствами, а их количественный уровень превышал допустимые физиологические нормы. Весьма характерно, что с переходом от 1-го ко 2-му периоду спектр определяемых генов возрастал, достигая максимума, а уже при переходе от 3-го к 4-му периоду снижался до 4-х генов.

В 1, 2 и 3 периодах гены bfp, stxl, stx2, pCVD432, ipaH определялись приблизительно с одинаковой частотой (рис. 6). Частоты проявления генов stx2 и гена фрагмента плазмиды (pCVD432) в геноме кишечной палочки достигают своего максимального значения (15,6 % и 6,3 % соответственно) у детей в 4-6 летнем возрасте. В этом же периоде наблюдалось снижение встречаемости гена stxl и полное отсутствие других исследуемых генов патогенности за исключением гена, отвечающего за формирование связывания пилей, выявление которого оставалось по-прежнему высоким. К 5-му периоду практически все детерминанты патогенности в ДНК индигенной E.coli отсутствовали, кроме bfp (100,0 %).

Таким образом, результаты продемонстрировали высокую частоту присутствия гена bfp в популяциях различных биохимических вариантов, в том числе E.coli с нормальной ферментативной активностью, что свидетельствует об эффективных процессах адгезии E.coli к эпителию кишечника. Что, с одной стороны, дает ей огромные преимущества в конкурентной борьбе с условно-патогенной микробиотой за сайты адгезии и занятием экологической ниши, а, с другой стороны, дает возможность типичной E.coli сохранять в кишечнике физиологически высокую популяцион-ную плотность, осуществляя выполнение полезных для хозяина функций (синтез витаминов и аминокислот, поддержание колонизационной резистентности кишечника, обеспечение антигенной стимуляции местного иммунитета и др.). Это подтверждают данные о высоком уровне детекции гена bfp в геноме кишечных палочек в группе здоровых детей. Эти данные свидетельствуют о становлении микроэкологического гомеостаза кишечного биоценоза у детей, приближающихся к 4-летнему возрасту, когда один из главных компонентов индигенной микробиоты (нормальная кишечная палочка) получил селективное преимущество за счет экспрессии генов, способствующих колонизации слизистой кишечника. Высокая частота присутствия гена bfp в геномах атипичных E.coli является фактом нежелательным, т.к. наличие данных микроорганизмов наряду с дефицитом бифидо- и лактобактерий свидетельствует о начинающихся дисбиотических нарушениях, и при наличии данного гена возможно усугубление процесса.

Сочетания генов патогенности в геноме кишечных палочек, особенно stx и bfp, свидетельствует об усилении вирулентности бактерий, обеспечивающих как прикрепление к клеткам кишечного эпителия, так и последующее эффективное воздействие выделяемого ими шига-подобного токсина. Выявляемость ассоциаций генов в E.coli с нормальной ферментативной активностью и в атипичных E.coli на фоне дефицитного состояния индигенных представителей микроорганизмов, с преобладанием Entero-coccus spp., Klebsiella spp. и S.aureus, Enterobacter spp. и Candida spp., вероятно, связано с особенностями изучаемого биотопа детей с ФН ЖКТ. И именно при таких микроэкологических состояниях частота встречаемости генов патогенности, по на-

шим данным, выше, нежели при эубиозе. Так же возможно, E.coli с ассоциацией генов патогенности имели селективное преимущество в условиях дефицита бифидо-бактерий, т.е. в условиях сниженной популяционной антагонистической активности бифидобактерий.

Зафиксированное одновременное выделение генов патогенности у разных фено-типических вариантов E.coli, выделенных от одного индивида, свидетельствует о возможности горизонтального переноса в кишечном биотопе. Как известно, гены, кодирующие выработку веротоксинов (st:с), как правило, укрываются в умеренных STX-фагах и могут интегририроваться в геномы штаммов кишечной палочки, что делает их зависимыми от горизонтального переноса генов (Moons Р. et al., 2013). Распространяясь, таким образом, Stx фаги в дополнение к повышению патогенного профиля вирулентных штаммов E.coli, могут превратить многих комменсальных членов семейства Enterobacteriaceae кишечника в токсино-производителей с дополнительными последствиями для прогрессирования разных форм заболевании (от диарейных до смертельно опасного гемолитико-уремического синдрома) (Fogg P.C. et al., 2013).

Из сказанного выше следует, что генетические маркеры веротоксинов у детей с ФН ЖКТ распространяются быстрее, чем плазмида (pCVD432) или ее фрагмент (EcoRI-Pstl), что возможно связано с большей возможностью фагов интегрироваться в геном и распространяться с помощью горизонтального переноса от условно-патогенных микроорганизмов (которые не выделяются у здоровых детей) в геном нормальной E.coli. Либо это связано с относительно простой генетической организацией плазмид (неконъюгативные плазмиды), что отличает их от конъюгативных плазмид, которые имеют более крупные размеры и наряду с генетической областью, контролирующей их репликацию, содержат также так называемую tra-область (англ. transfer — перенос). Эта область определяет способность клетки, содержащей плазми-ду, быть генетическим донором, т.е. вступать в конъюгацию с другой клеткой (реципиентом) и передавать ей свой генетический материал (плазмидную либо хромосомную ДНК). Под контролем tra-генов синтезируются поверхностные «половые» ворсинки (F-пили) клетки-донора, необходимые для её конъюгации с клеткой-реципиентом, а также ферменты, обеспечивающие метаболизм ДНК в процессе конъюгации. Неконъюгативные плазмиды обычно не содержат tra-области и поэтому не могут самостоятельно передаваться из одной клетки в другую.

Многообразие вариантов регистрации выделения генов патогенности в инди-генной микробиоте у детей до года, и повышенная частота детекции веротоксина 1 по сравнению с веротоксином 2, возможно, является следствием активных сукцесси-онных процессов, происходящих в кишечном биотопе. У детей старшего возраста, частота выделения аутоштаммов с детекцией двух маркеров шигатоксинов примерно одинаковая по всем исследуемым возрастным группам (7,9-12,1%), что, возможно, связано с более стабильной видовой структурой в биотопе.

Таким образом, выявление детерминант патогенности в индигенных штаммах E.coli, выделенных у детей с ФН ЖКТ в разные возрастные периоды, является одним из оснований для совершенствования микробиологического мониторинга острых и хронических кишечных инфекций.

ВЫВОДЫ

1. Микробиота кишечника детей с ФН ЖКТ характеризуется угнетением анаэробной бифидофлоры и высокими показателями колонизации условно-патогенными микроорганизмами: энтеробактериями (53,2 % обследованных), стафилококками

(24,5 %) и грибами рода Candida (15,1 %). В целом, микроэкологические нарушения в данном биотопе регистрируются у 88,4 % детей.

2. У детей с ФН ЖКТ энтерококки приобретают статус доминирующего вида, широко распространившись среди них (71,6 %) по сравнению со здоровыми детьми (13,0 %, р < 0,01), что свидетельствует о риске появления штаммов с наличием комплекса факторов патогенности, вызывающих инфекционные процессы.

3. Впервые у детей с ФН ЖКТ среди интестинальных штаммов E.coli, по фено-типическим признакам не относящихся к патогенной группе, а являющихся представителями «нормальной» индигенной микробиоты, выявлена циркуляция шигатоксин-позитивных клонов.

4. Аутоштаммы E.coli с наличием, как одиночных генов, так и их ассоциаций выявлялись чаще при дисбиотических нарушениях (83,9 %), нежели при эубиозе (10,8 %), проявляя селективное преимущество в условиях дефицита бифидобактерий.

5. Наличие генов патогенности (bfp, еае, stxl, stx2, eltA, ipaH, pCVD432) в разных фенотипических вариантах E.coli, вегетирующих в биотопе одного индивида, свидетельствует о возможности их горизонтального переноса как между вариантами одного вида, так и между разными видами и, следовательно, о возможности формирования штаммов с комплексом генетических детерминант, потенциально способных индуцировать токсины, вызывающие воспалительные заболевания и вспышки ОКИ.

6. Ассоциация гена six2 с фрагментом EcoRI-Pstl плазмиды (pCVD432) зарегистрирована в ДНК E.coli, вегетирующей в кишечном биотопе детей с ФН ЖКТ только в условиях микроэкологического баланса, и в группе сравнения у детей без признаков дисбиоза.

7. Впервые в популяции индигенных эшерихий у детей с ФН ЖКТ в отличие от здоровых детей, зарегистрированы интимин-позитивные (ген еае) клоны эшерихий фенотипически относящиеся к гемолитическим вариантам E.coli (4,2 % штаммов). Это обстоятельство может способствовать появлению клонов с трехкомпонентной ассоциацией генов (stx2+pCVD432+eae), характерных для шигатоксин-продуцирующих штаммов энтеропатогенных эшерихий.

8. Полученные фактические данные о вегетации индигенных популяций эшерихий с наличием комплекса генов патогенности могут служить объективным основанием для отнесения таких штаммов к потенциальным патобионтам, способствующим развитию инфекционно-воспалительных процессов в кишечнике.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ И ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. У больных с функциональными нарушениями ЖКТ, помимо стандартных исследований на дисбиоз, рекомендовать определение в популяции индигенных еше-рихий комплекса маркеров патогенности, сочетающего в себе гены slx2 и еае, ответственных за выработку шигатоксина у детей.

2. Перспективой дальнейших разработок темы может быть совершенствование молекулярно генетического мониторинга острых кишечных инфекций, включающего в себя определение комплекса генетических маркеров факторов патогенности (stx2 и еае) в индигенных штаммах E.coli у детей.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в ведущих научных рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ:

1. Изучение ассоциаций грибов рода Candida с некоторыми условно-патогенными микроорганизмами у лиц с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта / Е.И. Иванова, С.М. Попкова, Е.Б. Ракова [и др.] // Бюллетень ВСЩ СО РАМН. - 2011. - № 3 (79). - Ч. 1.-С. 196-198.

2. Микроэкологический пейзаж кишечного биоценоза у детей с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта / У.М. Немченко, С.М. Попкова, Е.Л. Горбунова, И.В. Петрова, Е.Б. Ракова, Е.И. Иванова [и др.] // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. — 2011. —№ 5 (81). — С. 136-140.

3. Микробиологическая характеристика кишечного биотопа у детей с аллергическими заболеваниями / Ж.В. Веселова, Л.С. Козлова, Ю.П. Джиоев, Е.И. Иванова [и др.] // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 3 (85). - Ч. 2. - С. 63-66.

4. Микробиологическая характеристика кишечной микрофлоры у детей с аллергическими заболеваниями / Ж.В. Веселова, Л.С. Козлова, Ю.П. Джиоев, Е.И. Иванова [и др.] // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2012. - № 2 (84). - Ч. 2. -С. 18-21.

5. Нарушения микроценоза кишечника у детей с атопическим дерматитом и атопической бронхиальной астмой г. Иркутска / Л.С. Козлова, С.М. Попкова, Е.Б. Ракова, Е.И. Иванова [и др.] // Российский аллергологический журнал. - 2012. -№ 1. — вып. 1.-С. 149-151.

6. Выявление генов патогенности, кодирующих способность к токсинообразо-ванию, у штаммов Escherichia coli, выделенных из кишечного биотопа детей / Е.И. Иванова, С.М. Попкова, Ю.П. Джиоев [и др.] // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. -2013.-№2(90).-С. 111-114.

7. Микроэкологическая характеристика региональных популяций Klebsiella spp. в кишечной микробиоте детей г. Иркутска / Е.В. Бухарова, С.М. Попкова, Е.Б. Ракова, Ю.П. Джиоев, Н.М. Шабанова, Е.И. Иванова [и др.] // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2013. -№ 2 (90). - С. 93-96.

8. Выявление генов патогенности кодирующих способность к токсинообразо-ванию у штаммов Escherichia coli, выделенных из кишечного биотопа детей г. Иркутска / Е.И. Иванова, С.М. Попкова, Ю.П. Джиоев [и др.] // Инфекция и иммунитет. — 2013. — Т. 3. — № 2. — С. 132-133.

Публикации в прочих изданиях:

9. Некоторые особенности микроэкологического статуса у детей Иркутской области / У.М. Немченко, Е.Б. Ракова, С.М. Попкова, Е.И. Иванова [и др.] // Журн. инфекционной патологии. — 2010. - Т. 17 , № 4. - С. 45-46.

10. Иванова Е.И., Попкова С.М., Савелькаева М.В. Ассоциации грибов рода Candida с условно-патогенными микроорганизмами у лиц с функциональными нарушениями желудочно-кишечного тракта // Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов Сибири: Сб. матер. IX научн.-практ. конф. мол. уч., посвящ. 35-летию У РАМН НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН. - Красноярск, 2011. — С. 114-115.

11. Микробиологическая характеристика кишечного биоценоза у детей с функциональными нарушениями кишечника / Е.И. Иванова, Н.М. Шабанова, У.М. Немченко [и др.] // Актуальные вопросы охраны здоровья населения регионов

Сибири: Матер. IX научн.-практ. конф. мол. уч., посвящ. 35-летию УРАМН НИИ медицинских проблем Севера СО РАМН. - Красноярск, 2011. - С. 115-117.

12. Характеристика генов патогенности популяций Escherichia coli выделенных от детей г. Иркутска / Е.И. Ивапова, С.М. Попкова, Ю.П. Джиоев [и др.] // Экология, здоровье, спорт: Матер. III Междунар. научн.-практ. конф. - Чита: ЗабГУ. -2011.-С. 110-111.

13. Особенности формирования микробиоценозов у детей в условиях техногенного прессинга / Е.Б. Ракова, С.М. Попкова, У.М. Немченко, JT.B. Сердюк, Е.И. Иванова // Здоровье семьи - XXI век: Матер. XVI Междунар. научн. конф. -Венгрия (Будапешт): в 2 частях / под ред. А.Я. Перевалова; Перм. гос. мед. академия; Урал, регион, центр, питания. - Ч. II. - Пермь: ИПК «ОТ и ДО». - 2012 - С. 85-86.

14. Иванова Е.И., Попкова С.М., Джиоев Ю.П. Непатогенная Escherichia coli как резервуар факторов патогенности // Актуальные вопросы современной медицины: Матер. 80-ой Юбил. Всерос. Байкал, научн.-практич. конф. мол. уч. и студ. с междунар. уч-ем. Под ред. ректора ИГМУ, проф., д.м.н. И.В. Малова, проф., д.м.н. А.Д. Ботвинкина, к.б.н. А.Г. Макеева, Л.Я, Пилявина. - Иркутск, 2013. - С. 379.

15. Определение генов, кодирующих синтез шига-подобных токсинов (1 и 2 типа), и гена связывания пилей в аутоштаммах Escherichia coli / Е.И. Иванова, С.М. Попкова, Ю.П. Джиоев [и др.] // Человек: здоровье и экология: Матер. III Межрегион. научн.-практич. конф. мол. уч. — Иркутск: НЦ РВХ СО РАМН. — 2013. -С. 80-88.

16. Детекция генов, отвечающих за формирование связывания пилей в аутоштаммах Escherichia coli, выделенных из кишечного биотопа детей [Электронный ресурс] / Е.И. Иванова, Ю.П. Джиоев, С.М. Попкова [и др.] // Электронный периодический научный журнал «SCI-ARTICLE.RU». - 2014. - №5. - с. 74-77.

17. Частота встречаемости генов патогенности, ассоциируемых с шига-подобными токсинами у аутоштаммов Escherichia coli в зависимости от микроэкологического статуса кишечного биотопа [Электронный ресурс] / Е.И. Иванова, Ю.П. Джиоев, С.М. Попкова [и др.] // Электронный периодический научный журнал «SCI-ARTICLE.RU». -2014. - №5. - С. 69-74.

18. Иванова Е.И., Джиоев Ю.П., Попкова С.М. Детекция генетических детерминант токсинообразования (stxl, stx2) у штаммов Escherichia coli, выделенных от детей разного возраста // Глобализация науки: проблемы и перспективы: Матер, междунар. научн.-практич. конф. — Уфа: РИЦ БашГУ, 2014. -Ч. 1. — С. — 136-138.

19. Иванова Е.И., Джиоев Ю.П., Попкова С.М. Распространение генетических маркеров, ассоциируемых с шига-подобными токсинами, среди штаммов Escherichia coli, выделенных у детей первого года жизни // Мир науки и молодежь: традиции и инновации: Матер, междунар. конф. мол. уч. - Казахстан (Караганда): изд-во КГМУ, 2014.-С. 124-125.

20. Обнаружение генетических маркеров патогенности, ассоциируемых с шига-подобными токсинами (stxl и stx2), среди штаммов Escherichia coli с разной фено-типической активностью / Ю.П. Джиоев, Е.И. Иванова, С.М. Попкова [и др.] // Молекулярная диагностика 2014: Матер. VIII всерос. научн.-практич. конф. с междунар. уч-ем. - М: ООО «Издательство МБА», 2014. - Т. 1. - С. 387-388.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ:

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

КОЕ - колониеобразующие единицы

ОКИ — острые кишечные инфекции

ПЦР — полимеразная цепная реакция

УПМ — условно-патогенные микроорганизмы

ФН - функциональные нарушения

ЖКТ — желудочно-кишечный тракт

Е. coli (гем+) -Е. coli с гемолитической активностью

Научное издание

Иванова Елена Иннокентьевна

АВТОРЕФЕРАТ