Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Особенности посттравматической регенерации суставного хряща при использовании водорастворимых антиоксидантов различных классов

ВАК РФ 06.02.01, Разведение, селекция, генетика и воспроизводство сельскохозяйственных животных

Автореферат диссертации по теме "Особенности посттравматической регенерации суставного хряща при использовании водорастворимых антиоксидантов различных классов"

Наградах рукописи

ПОПОВА ОКСАНА АЛЕКСАНДРОВНА

ОСОБЕННОСТИ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ СУСТАВНОГО ХРЯЩА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ВОДОРАСТВОРИМЫХ АНТИОКСИДАНТОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

17 окт т

Саранск - 2013

005534997

Работа выполнена на кафедре химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский государственный педагогический университет»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук Сахаров Андрей Валентинович

доктор биологических наук, профессор Пронин Валерий Васильевич,

зав. кафедрой нормальной, патологической анатомии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГБОУ ВПО «Ивановская ГСХА им. академика Д. К. Беляева», г. Иваново.

доктор биологических наук, профессор Соловьева Любовь Павловна, зав. кафедрой анатомии и физиологии животных ФГБОУ ВПО «Костромская ГСХА», г. Кострома.

ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов», г. Москва

Защита диссертации состоится «12» октября 2013 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.117.15 при ФГБОУ ВПО «Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарёва» по адресу: г. Саранск, ул. Большевистская, 68.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. М. М. Бахтина Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарёва.

Объявление о защите и автореферат диссертации размещены на официальном сайте Мордовского государственного университета им. Н. П. Огарёва www.mrsu.ru и интернет-сайте ВАК http://vak2.ed.gov.ru

Автореферат разослан «11» сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Романова Т. А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Сустав среди всех элементов опорно-двигательного аппарата представляет собой наиболее сложно организованную анатомическую структуру (Капанджи А. В., 2009; Павлова В. Н., 2011). Выполненный различными типами тканей, он обеспечивает распределение вектора механических нагрузок по касательной к поверхности эпифиза, а также образование устойчивых к износу поверхностей сочленяющихся элементов скелета (Слесаренко Н. А., 2006; Слуцкий Л. И., 2006). Нарушение подвижности сочленений костей скелета даже вследствие незначительного уровня травматизации сустава достаточно часто приводит к продолжительному и не всегда успешному лечению пациентов гуманной и ветеринарной медицины (Bobic V., 2000; Erggelet С., 2005). По мнению В. X. Хавинсон (2007) и В. Н. Павловой (2011), эффективность лечения травматических повреждений сустава зависит от степени повреждения хрящевой ткани, покрывающей эпифизы крупных трубчатых костей грудных и тазовых конечностей, а также мелких костей периферического скелета. Считается, что репаративный потенциал суставного хряща у всех видов млекопитающих, включая человека, во многом зависит от особенностей его структурно-функциональной организации в различные периоды онтогенеза (Афанасьев Ю. И., 2002; Белогородцев С. Н., 2006). Как известно, в эмбриональном периоде эпифизы крупных трубчатых костей выполнены гиалиновым хрящом, гистоархитектоника которого имеет типичное для суставного хряща зональное строение (Бебчук Н. В., 2003; Данилов Р. К., 2006). Развитая камбиальная зона в структуре эмбрионального суставного хряща позволяют признать наличие у ткани высокой способности к регенерации. Вместе с тем, изменение характера локомоции и биомеханики в постнатальный период онтогенеза и неравномерное распределение векторов нагрузки на латеральный и медиальный мыщелки дистального эпифиза бедренной кости (Зазирный И. М., 2004; Белогородцев С. Н., 2006; Шевцов В. И., 2007) означает, что в рамках единой суставной поверхности хрящ, выстилающий его соответствующие компартменты, будет испытывать различный уровень нагрузки и, следовательно, иметь различную структурно-функциональную организацию, а возможно, обладать дифференциальным репаративным потенциалом. Это особенно актуально при старении, когда адаптивные возможности клеток хондрогенного дифферона снижаются и возрастает риск его травматического повреждения даже в условиях совершенно адекватных нагрузок (Данилевская Н. В., 2002; Деев Р. В., 2007). В современной отечественной и зарубежной литературе особенности строения суставного хряща и характер его репаративного потенциала в данном аспекте освещены крайне недостаточно (Каземирский А. В., 2003). С точки зрения фундаментальной биологии, изучение морфофункциональных характеристик суставного хряща различной локализации расширяет известные представления о гистофизиологии гиалиновой хрящевой ткани. Исследование особенностей структурно-функциональной организации реакции клеток и межклеточного

вещества гиалиновой хрящевой ткани сустава в процессе старения позволяет оценить реакции клеток различных зон суставного хряща на травму и открывает пути решения проблемы научно обоснованного подхода к управлению посттравматической регенерацией хрящевой ткани. В этой связи поиск эффективных соединений, обладающих хондропротекторными свойствами, остается одним из приоритетных направлений прикладной биологии и практической медицины (Bassleer G., 1990; Котельников Г. П., 2008; Ларцев Ю. В., 2010). Считается, что в числе известных морфогенетических механизмов гибели клеток и межклеточного вещества хрящевой ткани является свободнорадикальный (Дубинина Е. Е., 2001; Finkel Т., 2000; Poli G., 2004). Это явилось основанием для изучения возможности управления посттравматической регенерацией хрящевой ткани с использованием известных и новых антиоксидантных соединений. Важно отметить, что для клеток гиалиновой хрящевой ткани низкий уровень экспрессии ферментов антиоксидантной защиты является тканевой особенностью (Слуцкий Л. И., 2006; Шехтер А. Б., 2006; Омельяненко Н. П., 2009). По мнению А. И. Капанджи (2009), это объясняется особенностями гистофизиологии хрящевой ткани. В связи с тем, что дефинитивная хрящевая ткань не содержит кровеносных сосудов, ее трофика и гуморальная регуляция осуществляется диффузно за счет сосудов костной ткани метафиза сустава и синовиальной жидкости. В отсутствие собственных стволовых ниш и, следовательно, низкой способности к регенерации врастание кровеносных сосудов из метафизарной зоны сустава приводит к замещению дефекта суставного хряща костной тканью (Виноградова Е. В., 2000; Reddi А. Н., 1998). По данным литературы, лишь незначительные по размерам дефекты гиалинового хряща могут восстанавливаться с образованием органотипического регенерата (Белогородцев С. Н., 2006). Установлено, что это обеспечивается за счет камбиальных клеток поверхностной зоны и способных к активной пролиферации клеток изогенных групп (Модяев В. П., 1980; Котельников Г. П., 2004). В этой связи изучение влияния антиоксидантов мексидола и синтезированных впервые ТС-13 и ПЭК-13 на активность пролиферации и синтез компонентов межклеточного вещества клетками хрящевой ткани стареющих крыс при его хирургическом повреждении определяет актуальность настоящего исследования.

1.2. Цель исследования - оценить эффективность хондропротекторных свойств фармакопейного антиоксиданта мексидол и новых антиоксидантных соединений ТС-13 и ПЭК-13 при травматическом повреждении суставного хряща.

Задачи исследования:

1. Изучить гистотопографические особенности суставного хряща стареющих крыс.

2. Выявить особенности постгравматической регенерации суставного хряща дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс.

3. Оценить эффективность использования фармакопейного антиоксидантного соединения мексидол и новых антиоксидантных соединений ТС-13 и ПЭК-13 для управления посттравматической регенерацией суставного хряща.

1.3. Научная новизна. Впервые у стареющих крыс выявлены гистотопографические особенности гиалинового хряща, покрывающего суставную поверхность дистального эпифиза бедренной кости. В рамках единой суставной поверхности впервые установлен дифференциальный уровень реакции клеток суставного хряща латерального и медиального мыщелков дистального эпифиза бедренной кости на механическое повреждение. В эксперименте на лабораторных животных впервые исследованы хондропротекторные свойства фармакопейного антиоксиданта мексидол и новых антиоксидантов ТС-13 и ПЭК-13 при механическом повреждении гиалинового хряща.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В рамках единой суставной поверхности дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс установлена структурная и функциональная асимметрия суставного хряща, обусловленная особенностями гистоархитектоники гиалинового хряща латерального и медиального мыщелков.

2. Клетки хондрогенного дифферона латерального и медиального мыщелков дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс характеризуются дифференциальным уровнем реакции на повреждение суставного хряща.

3. В условиях механического повреждения суставного хряща повышение активности свободнорадикального окисления липидов на организменном уровне ограничивает эффективность посттравматической регенерации на тканевом уровне. Использование для управления посттравматической регенерацией хрящевой ткани нового антиоксиданта ТС-13, в отличие от фармакопейного антиоксиданта мексидол, приводит к образованию полноценного органотипического регенерата, что позволяет позиционировать его в качестве перспективного хондропротектора.

1.4. Научно-практическая значимость работы. Установлена структурная и функциональная асимметрия суставного хряща у стареющих животных, что имеет важное значение для понимания закономерностей повреждения структурных элементов коленного сустава в поздние периоды онтогенеза. В рамках единой суставной поверхности дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс выявлены особенности гистоархитектоники гиалинового хряща латерального и медиального мыщелков, что позволяет прогнозировать дифференциальный уровень регенерации суставного хряща в соответствующих компартментах при травме. С точки зрения фундаментальной медицины, изучение морфофункциональных характеристик суставного хряща в его различных компартментах позволит подойти к решению проблемы научно обоснованных подходов к управлению его

посттравматической регенерацией и оценке риска уровня его повреждения при травме. Полученные результаты исследований в части изменения состояния свободнорадикальных процессов на уровне организма и тканей при повреждении суставного хряща расширяют известные представления о ключевой роли активных кислородных метаболитов в патогенезе нарушения структуры и функций клеток хондрогенного дифферона и хрящевого матрикса. Использование водорастворимых антиоксидантных соединений для управления посттравматической регенерацией суставного хряща у лабораторных животных доказывает необходимость их обязательного включения в существующие схемы лечения травм гиалиновой хрящевой ткани. Завершение реституцией посттравматической регенерации суставного хряща у крыс при использовании нового антиоксиданта ТС-13 позволяют позиционировать его в качестве перспективного хондропротектора.

1.5. Реализация результатов исследования. Результаты диссертационного исследования относительно роли свободнорадикального окисления липидов при травме суставного хряща и эффективности применения антиоксидантных соединений для управления посттравматической регенерацией хрящевой ткани используются в лекционных курсах «Биология клетки» и «Патология клетки», читаемых в ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный педагогический университет», «Патологическая физиология», преподаваемой в ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России. Сведения в отношении эффективности управления свободнорадикальными процессами на организменном и тканевом уровнях новым антиоксидантным соединением ТС-13 у стареющих животных используются в научной работе лаборатории молекулярно-клеточной патологии и генодиагностики ФГБУ «Научно-исследовательский институт кардиологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

1.6. Апробация результатов исследования. Результаты экспериментальной работы доложены и обсуждены на VIII Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы биологии и биологического образования в педагогических вузах» (Новосибирск, 2013), П Всероссийской научно-практической «Профессиональная инициатива» (Чехов, 2013), X Международной научно-практической конференции «Теория и практика современной науки» (Москва, 2013), Международной научно-практической конференции «Актуальные научные вопросы и современные образовательные технологии» (Тамбов, 2013), XXTV Международной научно-практической конференции «Наука и современность - 2013» (Новосибирск, 2013) .

1.7. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.8. Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 115 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов

собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических предложений, приложения, библиографического списка цитируемой литературы, который включает 233 источника, из них 136 российских и 97 -зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 4 таблицами.

1.9. Личный вклад. Диссертационная работа является результатом трехлетних лабораторных исследований автора на базе лаборатории морфологии Института антиоксидантов ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный педагогический университет». Весь объем работ по набору, обобщению экспериментального и теоретического материалов, а также статистическая обработка полученных результатов автором проведены самостоятельно. Соавторы опубликованных работ оказывали консультативную, техническую и методическую помощь, за что выражаю им глубокую благодарность.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальные исследования проведены на базе лаборатории морфологии НИИ химии антиоксидантов Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский государственный педагогический университет».

Для оценки эффективности антиоксидантной защиты клеток и матрикса хрящевой ткани при повреждении суставного хряща разработана модель повреждения суставного хряща, позволяющая стандартизировать параметры глубины повреждения. Самцам крыс линии Вистар массой 350-390 граммов в области межмыщелковой ямки намечали иглой, а затем специально изготовленным инструментом, имеющим форму треугольника размером 0,15 х 0,15 х 0,15 мм, производили дефект на глубину до базальной зоны суставного хряща.

Из всех оперированных крыс методом случайной выборки было создано четыре группы экспериментальных животных: основная и три группы сравнения по 10 животных в каждой. У крыс основной группы производили дефект суставного хряща и в послеоперационном периоде не использовали антиоксиданты. Крысам первой группы сравнения ежедневно внутрижелудочно вводили 1 мл водного раствора антиоксиданта мексидол (50 мг/кг), второй - 1 мл водного раствора ТС-13 (50 мг/кг). Прооперированным животным, входящим в третью группу сравнения, в качестве лекарственного препарата вводили перорально 1 мл антиоксиданта ПЭК-13 (50 мг/кг). Крысам основной группы вместо антиоксидантов аналогично вводили 1 мл дистиллированной воды. В послеоперационном периоде крысам всех групп внутримышечно в дозе 5 мг/кг один раз в сутки в течение двух недель вводили антибиотик линкомицин.

Для изучения особенностей гистоархитектоники суставного хряща стареющих крыс использовали образцы, полученные от интактных животных (л=10), которые содержались в стандартных условиях вивария, и специальных

манипуляций с ними не проводилось. Возраст животных всех пяти групп на момент эксперимента составлял 9 месяцев.

Через три недели у всех животных под эфирным наркозом из нижней полой вены забирали кровь для изучения состояния процессов свободнорадикального перекисного окисления липидов (СПОЛ) и функциональной активности системы антиоксидантной защиты на организменном уровне. Всех животных выводили из эксперимента путем передозировки ингаляционного наркоза хлороформом и забирали дистальные эпифизы правой бедренной кости для проведения морфологического анализа. Нанесение травмы осуществлялось в форме прямолинейного дефекта параллельно межмыщелковой ямке, в связи с чем используемые для изучения регенерации гистологические срезы сустава осуществляли не в сагиттальной плоскости, а во фронтальной.

Содержание малонового диальдегида (МДА) в плазме крови определяли в реакции с трихлоруксусной (ТХУ) и с 2-тиобарбитуровой кислотами (ТЫС) (Душкин М. И., 1998). Содержание диеновых конъюгатов (ДК) определяли в реакции с гептан-изопропаноловой смесью (Стальная И. Д., 1977). Активность каталазы (КАТ) определяли в реакции перекиси водорода с добавлением молибдата аммония (Королкж М. А., 1988). Активность супероксидцисмутазы (СОД) определяли по методу С. Чевари и соавт. (1993), основанному на способности СОД конкурировать с нитросиним тетразолием (НСТ) за супероксидные анионы, образующиеся в результате взаимодействия восстановленной формы никотинамидадениндинуклеотида (НАД'Н) и феназинметасульфата (ФМС).

Для проведения морфологического анализа дистальные эпифизы бедренных костей крыс фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина в течение 12 суток, промывали в проточной воде и помещали в декальцинирующий раствор. Декальцинацию костной ткани проводили в течение 14 суток в 10%-ном растворе этилендиаминтетраацетата на боратном буфере с рН 7,2. После дегидратации в растворах «Isoprep» (Россия) материал заливали в гомогенезированную парафиновую среду («Гистомикс экстра», Россия). Срезы толщиной 8-9 мкм помещали на предметные стекла со смесью белка и глицерина в пропорции 1:1. Для изучения общей морфологической картины обзорные препараты окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Содержание сульфатированных ГАГ (сГАГ) определяли в реакции с альциановым синим по Стидмену, коллаген выявляли по Маллори (Семченко В. В., 2006).

Измерение морфометрических характеристик проводили с помощью комплекса программ AxioVision (Cari Zeiss, Германия). Статистическую обработку данных проводили на основе вычисления средних арифметических (х) и их ошибок (Sx). Различия показателей оценивали методом вариационной статистики по i-критерию Стьюдента и считали достоверным при р < 0,05, р < 0,01, р < 0,001. Все расчеты проводили по общепринятым формулам с использованием пакета программ Microsoft Excel 2007.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Гнстотопографические особенности суставного хряща стареющих крыс

Исследование на светооптическом уровне гиалинового хряща стареющих крыс, покрывающего латеральный и медиальный мыщелки дистального эпифиза бедренной кости, обнаруживает различия в толщине. Результаты морфометрического анализа показали, что толщина суставного хряща, покрывающего латеральный мыщелок у животных данной группы, на 29,1% превышает аналогичный показатель медиального мыщелка (таблица

Таблица !. Толщина зон суставного хряща медиального и латерального мыщелков крыс интактной группы

Зона суставного хряща Локализация

Медиальный мыщелок Латеральный мыщелок

Общая толщина 123,93±11,04 174,78±13,16*

Поверхностная 15,20±3,71 29,18±3,93*

Промежуточная 51,32±5,87 73,54±6,04*

Базальная 57,41±11,24 72,06±8,29***

Примечание: статистически достоверные различия между показателями медиального и латерального мыщелков (*р < 0,05, ***р < 0,001).

Аначиз препаратов показал, что различия в толщине обусловлены изменением гистоархитектоники суставного хряща, выстилающего латеральную и медиальную поверхности мыщелков. Так, в области латерального мыщелка хрящевая ткань сохраняет морфологические признаки всех слоев и зон, характерные для суставного хряща в норме. В его структуре отчетливо заметны клетки поверхностной зоны, пролиферирующие клетки промежуточной зоны, которые формируют изогенные группы, а также дифференцированные клетки колонковых структур, образующих базальную зону.

Особенностью суставного хряща медиального мыщелка стареющих крыс является активное замещение клеток и межклеточного вещества зоны колонковых структур костной тканью. Это замещение происходит за счет деструкции хрящевого матрикса и на светооптическом уровне идентифицируется по снижению базофильного окрашивания матрикса, а также его толщины по сравнению с аналогичными структурами суставного хряща латерального мыщелка. Кроме того, в области медиального мыщелка

клетки поверхностной зоны имеют признаки деструктивных изменений. Для них характерно расположение в крупных лакунах не уплощенной, а овальной формы. Цитоплазма таких клеток неравномерно окрашивается основным красителем. Характерным признаком для исследуемых образцов суставов крыс данной группы является присутствие среди хрящевого матрикса клеточного детрита.

Использование гистохимической реакции на сГАГ позволяет определить, что матрикс хрящевой ткани латерального мыщелка во всех зонах хряща характеризуется более выраженной альцианпозитивной реакцией по сравнению с аналогичным показателем хрящевой ткани медиального мыщелка.

Одной из структурных особенностей суставного хряща стареющих животных является нарушение геометрии суставной поверхностности. На поверхности суставного хряща заметно формирование многочисленных узур, что связано со снижением функциональной активности клеток поверхностной зоны. На препаратах, окрашенных по Мал лори, регистрируется изменение тинкториальных свойств межклеточного вещества поверхностной зоны суставного хряща медиального мыщелка. Важно отметить, что реакция на коллаген в межклеточном веществе хряща поверхностной зоны по характеру окрашивания не имеет отличий от межклеточного вещества костной ткани. Для всех исследованных образцов характерным признаком является сохранение типичной морфологии для хряща данной локализации лишь в области межмыщелков ой ямки.

Таким образом, в рамках единой суставной поверхности дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс гиалиновый хрящ, покрывающий латеральный и медиальный мыщелки, имеет различную структурно-функциональную организацию.

3.2. Особенности посттравматической регенерации суставного хряща стареющих крыс

При повреждении гиалинового хряща эпифиза бедренной кости крыс основной группы отчетливо заметно, что реакция клеток суставного хряща, выстилающего поверхность латерального и медиального мыщелков на травму не одинакова. По данным морфометрического анализа, толщина суставного хряща на границе с раневым дефектом в области медиального мыщелка превышает аналогичные значения латерального на 27,2%.

Оценивая методами морфологии адаптивный потенциал хрящевой ткани сустава при его повреждении в различных компартментах, следует признать, что суставной хрящ латеральной локализации имеет преимущества по сравнению с медиальным. Это убедительно демонстрируется при анализе гистологических препаратов. При удалении хирургическим путем клеток поверхностной и промежуточной зон реакция хрящевой ткани на повреждение проявляется, прежде всего, в различном уровне пролиферации клеток,

граничащих с данными зонами суставного хряща. На светооптическом уровне заметно, что плоскость деления клеток изогенных групп суставного хряща, покрывающего медиальный мыщелок, проходит не параллельно продольной оси костного органа как в норме, а перпендикулярно. В структуре гиалинового хряща, покрывающего латеральный мыщелок, хондробласты изогенных групп располагаются параллельно вектору нагрузки на сустав, что характерно для морфологии суставного хряща в норме. При анализе структуры регенерата суставного хряща по направлению от торцов опилов медиального и латерального мыщелков к центру межмыщелковой ямки его морфология на периферии и в центре дефекта имеет существенные различия.

Ширина промежуточной зоны в области границы опила медиального мыщелка статистически достоверно превышает данный показатель латерального мыщелка (таблица 2).

Таблица 2. Толщина зон суставного хряща медиального и латерального мыщелков крыс основной группы

Зона суставного хряща Локализация

Медиальный мыщелок Латеральный мыщелок

Общая толщина 179,02±6,84 130,34±5,41*+*

Поверхностная 32,63±4,90 25,98±2,68

Промежуточная 86,71±4,85 54,91±3,32***

Базальная 56,64±6,93 47,29±6,47

Примечание: статистически достоверные различия между показателями медиального и латерального мыщелков (***р < 0,001).

Как отчетливо заметно на препаратах, это происходит за счет увеличения пролиферативной активности хондробластов данной зоны. Известно, что данный компартмент суставного хряща является центром фокального повреждения. При этом уровень пролиферативного ответа демонстрирует степень воздействия повреждающего фактора и потенциальную возможность ткани реагировать на повреждение. Нарушение гистоархитектоники суставного хряща отчетливо заметно в области медиального мыщелка и проявляется в активной пролиферации клеток промежуточной зоны, исчезновении колонковых структур и активной оссификации межклеточного вещества хрящевой ткани.

При анализе дефекта суставного хряща, локализованного в области латерального мыщелка, достаточно четко определяются граница его опила и расположенный рядом участок регенерата. Суставная поверхность интактных участков, расположенных на границе с опилами, имеет неровные контуры. Хондробласты промежуточной зоны, в отличие от нормы (аналогичные образцы хряща животных интактной группы), располагаются в чрезмерно расширенных лакунах овальной формы. Наличие в цитоплазме гомогенного

мелкодисперсного материала является признаком развития в клетках белковой дистрофии. Типичным признаком для исследуемых образцов является формирование в зоне изогенных групп кластеров из 8-10 клеток и более. Плоскость их деления ориентирована параллельно продольной оси костного органа. Межтерриториальный матрикс характеризуется неравномерным окрашиванием основным красителем. Цитоплазма клеток имеет признаки нарушения водно-ионного гомеостаза, что проявляется наличием многочисленных мелких и крупных прозрачных вакуолей. В 10,4% случаев, что не является закономерностью, хондробласты по краю опилов суставного хряща не имеют явных признаков повреждения. При отсутствии явно выраженных признаков морфологических повреждений хрящевой ткани латеральной локализации использование гистохимической реакции на главные компоненты межклеточного вещества хряща указывает на наличие его повреждения на уровне макромолекулярной организации, что проявляется в нарушении тинкториальных свойств матрикса.

Граница опила суставного хряща в области медиального мыщелка имеет выраженные морфологические отличия от аналогичной структуры латерального мыщелка. Достаточно часто плоскость деления клеток проходит не параллельно продольной оси, а перпендикулярно, что связано с несовершенством структурно-функциональной организации компонентов матрикса и его деформацией под влиянием статических нагрузок на сустав и действии сил компрессии. При анализе препаратов в проходящем свете в структуре межклеточного вещества медиального мыщелка отмечается чередование оксифяльных и базофильных участков матрикса, указывающих на его деструкцию и кальцификацию, что не свойственно для матрикса аналогичных зон суставного хряща в норме.

Общей закономерностью для всех исследуемых образцов раны гиалинового хряща сустава при самозаживлении является формирование в центре произведенного хирургическим инструментом дефекта не органотипического регенерата, а костной ткани. Вместе с тем интенсивность остеогенеза в центральной области регенерата у животных данной группы не одинакова. В 87,5% случаев хрящевые клетки, удаленные от центра дефекта, изменяют плоскость деления и располагаются параллельно поверхности сустава, что не является характерным признаком для гиалинового хряща, покрывающего суставные поверхности, в норме. В 12,5% случаев обширный костный регенерат под влиянием сил компрессии механически удаляется из суставного хряща. Об этом свидетельствуют глубокие трещины, занимающие по толщине практически 2/3 толщины всего суставного хряща. Данный вариант регенерации суставного хряща завершается полным исключением сустава из обеспечения требуемых функций.

3.3. Оценка эффективности использования мексидола и новых антиоксидантных соединений ТС-13 и ПЭК-13 для управления посттравматической регенерацией суставного хряща

Для дифференциальной оценки специфической активности всех трех соединений на организменном уровне в плазме крови крыс определяли показатели липопероксидации и активности системы антиоксидантной защиты (АОЗ) при травме, лечении мексидолом, ТС-13 и ПЭК-13. Для оценки эффективности действия данных препаратов на тканевом уровне использовали метод морфологического анализа.

Результаты сравнительного биохимического анализа плазмы крови крыс основной группы с аналогичными показателями интактных животных показали, что при травме суставного хряща регистрируется статистически достоверное превышение первичных (ДК) и вторичных (МДА) продуктов СПОЛ на 36,5% и 31,3% соответственно. При этом уровень СОД и КАТ в образцах крыс основной группы снижались по сравнению с соответствующими образцами интактных крыс на 25,4 и 36,8% соответственно (рисунок 1).

45

40

« 35

I ^

и 25

3 20

в

I 15

10

а ;

223 - интактные; ПШ - основная группа.

Рисунок 1. Содержание продуктов свободнорадикального перекисного окисления и активность ферментов антиоксидантной защиты в плазме крови крыс. А - содержание МДА; Б - содержание ДК; В - активность СОД; Г — активность КАТ. Примечание: достоверные различия по сравнению с показателями интактной группы (* р < 0,05).

Данные результаты свидетельствуют о повышении процессов липопероксидации в организме крыс при травме и депрессии ферментативного звена системы АОЗ. Измерение количественных показателей продуктов пероксидации и активности ключевых ферментов АОЗ в норме и при травматическом повреждении сустава явились исходным уровнем, необходимым для оценки специфической активности новых антиоксидантных соединений ТС-13, ПЭК-13 и фармакопейного антиоксиданта мексидол в сравнительном аспекте. Результаты эксперимента показали, что из трех исследуемых антиоксидантов мексидол и ТС-13 достоверно снижают в плазме крови крыс показатели окислительного стресса по сравнению с аналогичными значениями крыс основной группы (рисунок 2).

Вместе с тем, при сравнении специфической активности между собой мексидол и ТС-13, достоверных отличий не обнаружено. Отсутствие различий в антиоксидантной активности между мексидолом и ТС-13 на организменном уровне, но принадлежность их к различным классам по химической структуре, определили необходимость изучения особенностей их антирадикальной активности на тканевом уровне при моделировании дефекта суставного хряща.

- основная группа ПИИШН -1-я группа ср авненпя

- 2.-я !рVIиК1 ср а внвш !.*■[ | [ - 3-я группа сравнения

Рисунок 2. Содержание продуктов свободнорадикального перекисного окисления и активность ферментов антиоксидантной защиты в плазме крови крыс. А - содержание МДА; Б - содержание ДК; В — активность СОД; Г -активность КАТ. Примечание: достоверные различия по сравнению с показателями интактной группы (* р < 0,05).

При детальном рассмотрении морфологии поврежденной суставной поверхности дистального эпифиза бедренной кости крыс 1-ой группы сравнения обнаруживаются различия, которые касаются реакции ткани на повреждение в области латерального и медиального мыщелка, а также межмыщелковой ямки. В связи с тем, что пролиферация является стереотипной реакцией на повреждение, а хрящевая ткань в области медиального мыщелка менее устойчивая к повреждению, граница опила хряща на данном мыщелке заметна по преобладанию его толщины по сравнению с латеральным мыщелком. Это подтверждают результаты морфометрического анализа, приведенные в таблице 3.

Таблица 3. Толщина зон суставного хряща медиального и латерального мыщелков крыс первой группы сравнения

Зона суставного хряща Локализация

Медиальный мыщелок Латеральный мыщелок

Общая толщина 160,05±4,76 130,52±4,5б**

Поверхностная 33,15±3,53 20,94±2,76*

Промежуточная 72,03±3,26 55,17±3,78**

Базальная 54,87±4,9 54,41±6,58

показателями медиального и латерального мыщелкое (*р <0,05, **р <0,01).

Вместе с тем, пролиферация клеток хрящевой ткани и синтез данными клетками компонентов межклеточного вещества чрезвычайно разобщены. Как заметно на препаратах снижение синтетической активности клеток сопровождается локальной оссификацией межклеточного вещества в нехарактерной для этого процесса поверхностной зоне хряща. Это убедительно демонстрируется при постановке гистохимических реакций на коллаген по Маллори. Несовершенное в макромолекулярном отношении межклеточное вещество хряща медиального мыщелка проявляет неравномерное окрашивание за счет изменения своих тинкториальных свойств. Между опилами суставного хряща достаточно хорошо определяется область сформированного регенерата, приходящаяся на суставной хрящ межмыщелковой ямки.

Характерным признаком регенерата суставного хряща в области медиального мыщелка является изменение его гистоархитектоники. Это проявляется в чрезмерном расширении промежуточной зоны (таблица 3). Изучение образцов гиалинового хряща на светооптическом уровне выявило нехарактерную для клеток изогенных групп плоскость деления. Расположение её перпендикулярно продольной оси костного органа, вероятно, является приспособительной реакцией хрящевой ткани при удалении клеток поверхностной зоны. В данных условиях клетки изогенных групп первыми принимают действие сил компрессии в отсутствии бесклеточной пластинки и

поверхностного слоя. При анализе гистологических препаратов суставного хряща медиального мыщелка 1-ой группы сравнения выявлено, что дифференцированные клетки в зоне колонковых структур практически отсутствуют. Клетки данной зоны имеют признаки низкого уровня дифференцировки, разделены друг от друга широким слоем матрикса, проявляющим слабую альцианпозитивную реакцию на сГАГ. Нехарактерная для нормы структура суставного хряща в области медиального мыщелка отражает несовершенство макромолекулярной организации межклеточного вещества и проявляется в его мозаичном окрашивании на коллаген.

Структура суставного хряща в области опила латерального мыщелка сохраняет типичное зональное строение. Прч. анализе образцов исследуемой ткани крыс данной группы отмечается регенерация хряща на границе с опилом исключительно за счет клеток поверхностной зоны неповрежденного участка. Клетки поверхностной зоны имеют не уплощенную, а овальную форму, их ядро и цитоплазма имеют интенсивное базофильное окрашивание. Плоскость деления клеток располагается параллельно продольной оси трубчатого органа. Глубина дефекта ограничивается клетками поверхностной и промежуточной зоны, что отчетливо заметно на препаратах. Важно отметить, что по краю раны матрикс хрящевой ткани не имеет явных признаков его деструктивных изменений, о чем свидетельствует четкий контур границы дефекта. Низкий уровень пролиферативной активности клеток изогенных групп, а также незначительное изменение тинкториальных свойств матрикса хрящевой ткани, которое особенно хорошо идентифицируется при постановке реакции на коллаген по Маллори, свидетельствуют о менее выраженном повреждении латерального компартмента суставной поверхности бедренной кости по сравнению с медиальным.

Изучая особенности регенерации суставного хряща при его травматическом повреждении у животных 1-ой группы сравнения, стоить отметить, что в области межмыщелковой ямки регенерация по качественным параметрам отличается от регенерации хряща, локализованного в области латерального и медиального мыщелков. Закономерностью для регенерата в области межмыщелковой ямки является полное восстановление структуры удаленной ткани. Однако клетки всех зон характеризуются крупными размерами, имеют круглую или овальную форму и интенсивно базофильную цитоплазму. Интенсивная реакция на сГАГ и коллаген в территориальном и межтерриториальном матриксе свидетельствуют о высокой функциональной активности хондроцитов.

При исследовании гистологических препаратов дистальных эпифизов бедренной кости животных 2-ой группы сравнения, которых после нанесения травмы лечили антиоксидантом ТС-13, обнаруживается, что область дефекта выполнена гиалиновым хрящом. По данным морфометрического анализа, общая толщина зон суставного хряща латерального и медиального мыщелков не имеет достоверных различий (таблица 4).

Таблица 4. Толщина зон суставного хряща медиального и латерального

мыщелков крыс второй группы сравнения

Зона суставного хряща Локализация

Медиальный мыщелок Латеральный мыщелок

Общая толщина 130,54±б,48 126,73±4,5

Поверхностная 19,41±2,29 18,6±2,65

Промежуточная 56,28±4,19 55,14±3,81

Базальная 54,84±8,37 52,99±6,4

На малом увеличении о наличии повреждения хрящевой ткани хирургическим инструментом свидетельствуют лишь узуры на поверхности суставного хряща. Несмотря на отсутствие явного отличия суставного хряща животных данной группы от нормы (аналогичные образцы крыс интактной группы), повреждение хрящевой ткани медиального мыщелка преобладает, по сравнению с латеральным. Это отчетливо заметно по наличию фокальных участков с нарушенной гистоархитектоникой суставного хряща медиального мыщелка и по более высокой степени повреждения костного мозга в губчатом слое компактной костной ткани соответствующего мыщелка дистального эпифиза бедренной кости.

В исследуемых образцах гиалиновой хрящевой ткани животных 2-ой группы сравнения, в отличие от мексидола, границы опилов на латеральном и медиальном мыщелке не имеют признаков увеличения объема хрящевой ткани, что, как известно, отражает интенсивность реакции ткани на повреждение. На препаратах заметно, что на границе опилов суставного хряща медиального мыщелка бесклеточная пластинка расширена. Опил суставного хряща латерального мыщелка на светооптическом уровне в большинстве случаев не идентифицируется, что является закономерностью для исследуемых образцов крыс данной группы.

При детальном изучении области регенерата латерального и медиального мыщелков обнаруживается, что зональное строение гиалинового хряща обеих локализаций в целом не имеют морфологических различий. Лишь наличие фокальных участков с расширенной зоной изогенных групп в структуре суставного хряща медиального мыщелка отражают его преимущественное повреждение по сравнению с латеральным.

При постановке реакции сГАГ заметно, что клетки поверхностной зоны активно пролиферируют в плоскости, параллельной суставной поверхности, и межклеточное вещество вокруг них характеризуется слабой альцианпозитивной реакцией. Наличие узур на поверхности регенерата является следствием сохранения механической нагрузки на конечность после оперативного вмешательства и несовершенной макромолекулярной организации межклеточного вещества гиалинового хряща. На это же

указывает нарушение тинктоиальных свойств гиалинового хряща при постановке реакции на коллаген по Маллори.

Закономерностью посттравматической регенерации суставного хряща при использовании антиоксиданта ПЭК-13 является формирование на участке повреждения грубоволокнистой костной ткани. При постановке реакции на коллаген по Маллори в структуре регенерата определяются участки, не имеющие отличий по характеру окрашивания межклеточного вещества хрящевой ткани от костной.

На препаратах суставов крыс, получавших ПЭК-13, как и в аналогичных образцах животных основной группы, отчетливо заметен дифференциальный уровень реакции клеток и межклеточного вещества гиалинового хряща латерального и медиального мыщелков на повреждение. Характерной особенностью реакции суставного хряща в области медиального мыщелка является пролиферация хондрогенных клеток и последующая оссификация межклеточного вещества. О сохранении единичных хрящевых клеток в структуре образованного регенерата с признаками их функциональной активности свидетельствует положительная реакция на сГАГ в территориальном и межтерриториальном матриксах. Это отчетливо заметно лишь вокруг отдельных групп хондрогенных клеток, а также в матриксе поверхностной зоны сустава. В первом случае данная закономерность может являться компенсаторным механизмом на повреждение, и сохранившиеся хрящевые клетки осуществляют повышенный синтез специфических для хрящевой ткани компонентов основного вещества. Во втором случае положительная реакция на сГАГ может являться отражением несовершенного остеогенеза и формирования незрелой костной ткани. Следует отметить, что образование костного регенерата при использовании ПЭК-13 является закономерностью для образцов животных данной группы и составляет 72,5% случаев.

В 12,3% случаев регенерация суставного хряща заканчивалась формированием плотной волокнистой соединительной ткани. Это особенно заметно при реакции на сГАГ и коллаген. При проведении данных реакций в структуре регенерата определяются плотно расположенные параллельно суставной поверхности коллагеновые фибриллы и регистрируется низкое содержание сГАГ. При этом хондрогенные клетки суставного хряща не формируют типичное для данной структуры зональное строение, а межклеточное вещество подвергается оссификации.

У 7,5% животных дефект суставного хряща по всему периметру нанесения травмы хирургическим инструментом четко ограничен линией и не имеет признаков как деструкции межклеточного вещества на границе опилов, так и признаков регенерации. Подобная картина наблюдалась у животных при лечении мексидолом.

В 7,7% случаев регенерат имел морфологические признаки глубокого нарушения в структуре и функции хрящевой ткани. В области поверхностной зоны заметны массивные трещины, а клетки всех зон имеют признаки

сублетального и летального повреждения. Матрикс характеризуется неравномерным окрашиванием, что в совокупности с выявленными признаками является отражением развития дистрофических и некробиотических изменений клеток и межклеточного вещества гиалиновой хрящевой ткани.

Рассматривая формирование грубоволокнистой соединительной ткани в области регенерата как частный случай посттравматической регенерации при лечении ПЭК-13, удается заметить, что источником восстановления дефекта хрящевой ткани являются клетки краевой зоны опилов суставного хряща. На препаратах убедительно демонстрируется, что последние пролиферируют и наползают на поверхность дефекта. При отсутствии признаков деструкции, равно как и регенерации, у 5% животных клетки имели признаки нарушения водно-ионного гомеостаза, что проявлялось в расширении территориального матрикса и смещении делящихся клеток к одной из поверхностей лакун. Особенностью морфологии и, как считается, одним из признаков сублетального повреждения хондрогенных клеток, расположенных в лакунах, является вид «кофейное зерно». Дистрофические изменения межклеточного вещества хрящевой ткани обнаруживаются по фибрилляции матрикса и микротрещинам, локальным участкам с нарушением тинкториальных свойств матрикса при окрашивании на сГАГ.

Таким образом, результаты проведенного исследования позволили выявить асимметрию в функциональном отношении клеток гиалиновой хрящевой ткани, покрывающих латеральный и медиальный мыщелки дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс. Установленные особенности имеют важное значение для понимания закономерностей повреждения структурных элементов коленного сустава в поздние периоды онтогенеза и оценки потенциальных возможностей их репаратнвного потенциала. Полученные результаты позволяют считать, что при равной специфической активности на организменном уровне в отношении снижения уровня окислительного стресса между фармакопейным антиоксидантом мексидол и новым ТС-13, на тканевом уровне мексидол обладает слабым хондропротекторным свойством по сравнению с ТС-13. В этой связи антиоксидант ТС-13 может рассматриваться в качестве перспективного препарата антиоксидантного действия при использовании его в качестве хондропротектора в условиях травматического повреждения суставного хряща.

ВЫВОДЫ

1. Гистотопографическими особенностями гиалинового хряща дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс является его структурная и функциональная асимметрия в рамках единой суставной поверхности, обусловленная нарушением гистоархитектоники хряща, покрывающего медиальный мыщелок, по сравнению с латеральным мыщелком.

2. Особенностью посттравматической регенерации суставного хряща дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс является дифференциальный уровень реакции клеток гиалинового хряща, характеризующийся преобладанием репаративного потенциала хрящевой ткани латеральной локализации, по сравнению с медиальной.

3. Применение фармакопейного антиоксиданта мексидол и новосинтезированного антиоксиданта ТС-13 достоверно снижает показатели липопероксидации в плазме крови крыс в условиях травматического повреждения суставного хряща.

4. Использование антиоксиданта ТС-13 для управления посттравматической регенерацией суставного хряща у стареющих крыс приводит к формированию полноценного органотипического регенерата хрящевой ткани по сравнению с антиоксидантами мексидол и ПЭК-13.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. ТС-13 рекомендуется к использованию в качестве эффективного антиоксидантного средства для управления свободнорадикальными процессами на организменном уровне при травматическом повреждении суставного хряща.

2. Завершение регенерации суставного хряща формированием полноценного органотипического регенерата при использовании антиоксиданта ТС-13 позволяет позиционировать его в качестве перспективного хондропротектора.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ В журналах, рекомендованных ВАК РФ:

1. Попова, О. А. Гистотопографические особенности гиалинового хряща дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс / О. А. Попова, А. В. Сахаров, А. А. Макеев, А. Е. Просенко, Н. В. Кандалинцева // Современные проблемы науки и образования. - 2013. - № 3. - URL: http://www.science-education.ru/109-9459.

2. Попова, О. А. Сравнительная характеристика хондропротекторных свойств водорастворимых антиоксидантов мексидол и ТС-13 / О. А. Попова, А. В. Сахаров, А. А. Макеев, А. Е. Просенко, Н. В. Кандалинцева // Фундаментальные исследования.— 2013.-Кг 10 (часть 1).-С. 119-124.

В других изданиях:

3. Попова, О. А. Особенности дегенеративных изменений суставного хряща лабораторных крыс в поздние периоды онтогенеза / О. А. Попова // Актуальные вопросы и современные образовательные технологии: сб. науч. тр. по материалам международной научно-практической конференции. -Тамбов, 2013. - Ч. 4. - С. 132-133.

4. Попова, О. А. Особенности регенерации гиалинового хряща дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс / О. А. Попова // Теория и практика современной науки: материалы X Международной научно-практической конф. - Москва, 2013. - С. 361-364.

5. Попова, О. А. Формирование структурной асимметрии суставного хряща дистального эпифиза бедренной кости в процессе старения / О. А. Попова // Международный научно-исследовательский журнал. -Екатеринбург, 2013. - № 6 (13). - С. 32-33.

6. Попова, О. А. Морфофункциональная характеристика гиалинового хряща стареющих крыс / О. А. Попова // II Всероссийская научно-практическая конференция «Профессиональная инициатива». - Чехов, 2013. -С. 188-191.

7. Попова, О. А. Оценка хондропротекторных свойств антиоксидантных соединений ТС-13 и ПЭК-13 в сравнительном аспекте / О. А. Попова // XXIV Международная научно-практическая конференция «Наука и современность». — Новосибирск, 2013. — С. 34—39.

Подписано в печать 10.09.13. Формат бумаги 60x84/16. Печать RISO. Уч.-изд.л. 1,2. Усл. п.л. 1,3. Тираж 100 экз. Заказ № 47.

Педуниверситет, 630126, Новосибирск, Вилюйская, 28

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Попова, Оксана Александровна, Новосибирск

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ»

На правах рукописи

04201364356

ПОПОВА ОКСАНА АЛЕКСАНДРОВНА

ОСОБЕНОСТИ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ СУСТАВНОГО ХРЯЩА ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ВОДОРАСТВОРИМЫХ АНТИОКСИДАНТОВ РАЗЛИЧНЫХ КЛАССОВ

06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и

морфология животных

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель -д-р биол. наук А. В. Сахаров

НОВОСИБИРСК 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ........................................................................................................................3

ВВЕДЕНИЕ..................................................................................................................................................................4

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................................10

1.1. Структура и функция суставного хряща..............................................................10

1.2. Дегенеративные изменения в суставном хряще при старении..........23

1.3. Регенерация хрящевой ткани............................................................................................25

1.4. Физиологическая и патологическая роль свободнорадикальных 31 процессов в биологических системах..................................

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................38

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ..................46

3.1. Гистотопографические особенности суставного хряща 46 стареющих крыс..............................................................

3.2. Особенности посттравматической регенерации суставного хряща 52 стареющих крыс...................................................

3.3. Оценка эффективности использования мексидола и новых 59 антиоксидантных соединений ТС-13 и ПЭК-13 для управления посттравматической регенерацией суставного хряща...............

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ................................................79

ВЫВОДЫ......................................................................................................................................................................87

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК............................................................................................88

ПРИЛОЖЕНИЕ......................................................................................................................................................111

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АКМ - активные кислородные метаболиты

АОС - антиоксидантная система

АО - антиоксидант

ДК - диеновые конъюгаты

КАТ - катал аза

МДА - малоновый диальдегид

ОС - окислительный стресс

сГАГ - сульфатированные гликозаминогликаны

СОД - супероксиддисмутаза

СПОЛ - свободнорадикальное перекисное окисление липидов

СР - свободный радикал

СРО - свободнорадикальное окисление

ВВЕДЕНИЕ

Сустав среди всех элементов опорно-двигательного аппарата представляет собой наиболее сложно организованную анатомическую структуру (Капанджи А. В., 2009; Павлова В. Н., 2011). Выполненный различными типами тканей, он обеспечивает распределение вектора механических нагрузок по касательной к поверхности эпифиза, а также образование устойчивых к износу поверхностей сочленяющихся элементов скелета (Слесаренко Н. А., 2006; Слуцкий Л. И., 2006). Нарушение подвижности сочленений костей скелета даже вследствие незначительного уровня травматизации сустава достаточно часто приводит к продолжительному и не всегда успешному лечению пациентов гуманной и ветеринарной медицины (ВоЫс V., 2000; Е^е1е1 С., 2005). По мнению В. X. Хавинсон (2007) и В. Н. Павловой (2011), эффективность лечения травматических повреждений сустава зависит от степени повреждения хрящевой ткани, покрывающей эпифизы крупных трубчатых костей грудных и тазовых конечностей, а также мелких костей периферического скелета. Считается, что репаративный потенциал суставного хряща у всех видов млекопитающих, включая человека, во многом зависит от особенностей его структурно-функциональной организации в различные периоды онтогенеза (Афанасьев Ю. И., 2002; Белогородцев С. Н., 2006). Как известно, в эмбриональном периоде эпифизы крупных трубчатых костей выполнены гиалиновым хрящом, гистоархитектоника которого имеет типичное для суставного хряща зональное строение (Бебчук Н. В., 2003; Данилов Р. К., 2006). Развитая камбиальная зона в структуре эмбрионального суставного хряща позволяют признать наличие у ткани высокой способности к регенерации. Вместе с тем, изменение характера локомоции и биомеханики в постнатальный период онтогенеза и неравномерное распределение векторов нагрузки на латеральный и медиальный мыщелки дистального эпифиза бедренной кости (Зазирный И. М., 2004; Белогородцев С. Н., 2006; Шевцов В. И., 2007) означает, что в рамках единой суставной поверхности хрящ, выстилающий его соответствующие компартменты, будет испытывать различный уровень

нагрузки и, следовательно, иметь различную структурно-функциональную организацию, а возможно, обладать дифференциальным репаративным потенциалом. Это особенно актуально при старении, когда адаптивные возможности клеток хондрогенного дифферона снижаются и возрастает риск его травматического повреждения даже в условиях совершенно адекватных нагрузок (Данилевская Н. В. 2002; Деев Р. В., 2007). В современной отечественной и зарубежной литературе особенности строения суставного хряща и характер его репаративного потенциала в данном аспекте освещены крайне недостаточно (Каземирский А. В., 2003). С точки зрения фундаментальной биологии, изучение морфофункциональных характеристик суставного хряща различной локализации расширяет известные представления о гистофизиологии гиалиновой хрящевой ткани. Исследование особенностей структурно-функциональной организации реакции клеток и межклеточного вещества гиалиновой хрящевой ткани сустава в процессе старения позволяет оценить реакции клеток различных зон суставного хряща на травму и открывает пути решения проблемы научно обоснованного подхода к управлению посттравматической регенерацией хрящевой ткани. В этой связи поиск эффективных соединений, обладающих хондропротекторными свойствами, остается одним из приоритетных направлений прикладной биологии и практической медицины (Bassleer G., 1990; Котельников Г. П., 2008; Ларцев Ю. В., 2010). Считается, что в числе известных морфогенетических механизмов гибели клеток и межклеточного вещества хрящевой ткани является свободнорадикальный (Дубинина Е. Е., 2001; Finkel Т., 2000; Poli G., 2004). Это явилось основанием для изучения возможности управления посттравматической регенерацией хрящевой ткани с использованием известных и новых антиоксидантных соединений. Важно отметить, что для клеток гиалиновой хрящевой ткани низкий уровень экспрессии ферментов антиоксидантной защиты является эволюционной особенностью (Слуцкий Л. И., 2006; Шехтер А. Б., 2006; Омельяненко Н. П., 2009). По мнению А. И. Капанджи (2009), это объясняется особенностями гистофизиологии хрящевой ткани. В связи с тем, что дефинитивная хрящевая ткань не содержит кровеносных сосудов, ее трофика и

гуморальная регуляция осуществляется диффузно за счет сосудов костной ткани метафиза сустава и синовиальной жидкости. В отсутствие собственных стволовых ниш и, следовательно, низкой способности к регенерации врастание кровеносных сосудов из метафизарной зоны сустава приводит к замещению дефекта суставного хряща костной тканью (Виноградова Е. В., 2000; ЛескИ А. Н., 1998). По данным литературы, лишь незначительные по размерам дефекты гиалинового хряща могут восстанавливаться с образованием органотипического регенерата (Белогородцев С. Н., 2006). Установлено, что это обеспечивается за счет камбиальных клеток поверхностной зоны и способных к активной пролиферации клеток изогенных групп (Модяев В. П., 1980; Котельников Г. П., 2004). В этой связи изучение влияния антиоксидантов мексидол и синтезированных впервые ТС-13 и ПЭК-13 на активность пролиферации и синтез компонентов межклеточного вещества клетками хрящевой ткани стареющих крыс при его хирургическом повреждении определяет актуальность настоящего исследования.

Цель исследования - оценить эффективность хондропротекторных свойств фармакопейного антиоксиданта мексидол и новых антиоксидантных соединений ТС-13 и ПЭК-13 при травматическом повреждении суставного хряща.

Задачи исследования:

1. Изучить гистотопографические особенности суставного хряща стареющих крыс.

2. Выявить особенности посттравматической регенерации суставного хряща дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс.

3. Оценить эффективность использования фармакопейного антиоксидантного соединения мексидол и новых антиоксидантных соединений ТС-13 и ПЭК-13 для управления посттравматической регенерацией суставного хряща.

Научная новизна. Впервые у стареющих крыс выявлены гистотопографические особенности гиалинового хряща, покрывающего суставную поверхность дистального эпифиза бедренной кости. В рамках единой суставной поверхности впервые установлен дифференциальный уровень реакции

клеток суставного хряща латерального и медиального мыщелков дистального эпифиза бедренной кости на механическое повреждение. В эксперименте на лабораторных животных впервые исследованы хондропротекторные свойства фармакопейного антиоксиданта мексидол и новых антиоксидантов ТС-13 и ПЭК-13 при механическом повреждении гиалинового хряща.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Установлена структурная и функциональная асимметрия суставного хряща у стареющих животных, что имеет важное значение для понимания закономерностей повреждения структурных элементов коленного сустава в поздние периоды онтогенеза. В рамках единой суставной поверхности дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс выявлены особенности гистоархитектоники гиалинового хряща латерального и медиального мыщелков, что позволяет прогнозировать дифференциальный уровень регенерации суставного хряща в соответствующих компартментах при травме. С точки зрения фундаментальной медицины, изучение морфофункциональных характеристик суставного хряща в его различных компартментах позволит подойти к решению проблемы научно обоснованных подходов к управлению посттравматической регенерацией и оценке риска уровня его повреждения при травме. Полученные результаты исследований в части состояния свободнорадикальных процессов на уровне организма и тканей при повреждении суставного хряща расширяют известные представления о ключевой роли активных кислородных метаболитов в патогенезе нарушения структуры и функций клеток хондрогенного дифферона и хрящевого матрикса. Использование водорастворимых антиоксидантных соединений для управления посттравматической регенерацией суставного хряща у лабораторных животных доказывает необходимость их обязательного включения в существующие схемы лечения травм гиалиновой хрящевой ткани. Завершение реституцией посттравматической регенерации суставного хряща у крыс при использовании нового антиоксиданта ТС-13 позволяют позиционировать его в качестве перспективного хондропротектора.

Результаты диссертационного исследования относительно роли свободнорадикального окисления липидов при травме суставного хряща и эффективности применения антиоксидантных соединений для управления посттравматической регенерацией хрящевой ткани используются в лекционных курсах «Биология клетки» и «Патология клетки», читаемых в ФГБОУ ВПО «Новосибирский государственный педагогический университет», «Патофизиология, клиническая патофизиология», преподаваемой в ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздрава России. Сведения в отношении эффективности управления свободнорадикальными процессами на организменном и тканевом уровнях новым антиоксидантным соединением ТС-13 у стареющих животных используются в научной работе лаборатории молекулярно-клеточной патологии и генодиагностики ФГБУ «Научно-исследовательский институт кардиологии» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В рамках единой суставной поверхности дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс установлена структурная и функциональная асимметрия суставного хряща, обусловленная особенностями гистоархитектоники гиалинового хряща латерального и медиального мыщелков.

2. Клетки хондрогенного дифферона латерального и медиального мыщелков дистального эпифиза бедренной кости стареющих крыс характеризуются дифференциальным уровнем реакции на повреждение суставного хряща.

3. Повышение активности свободнорадикального окисления липидов на организменном уровне в условиях механического повреждения суставного хряща ограничивает эффективность посттравматической регенерации на тканевом уровне. Использование новосинтезированного антиоксиданта ТС-13, в отличие от фармакопейного антиоксиданта мексидол, не только снижает активность свободнорадикальных процессов, но и приводит к образованию полноценного органотипического регенерата, что позволяет позиционировать его в качестве перспективного хондропротектора.

Апробация материалов диссертации. Результаты экспериментальной работы доложены и обсуждены на VIII Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы биологии и биологического образования в педагогических вузах» (Новосибирск, 2013), II Всероссийской научно-практической «Профессиональная инициатива» (Чехов, 2013), X Международной научно-практической конференции «Теория и практика современной науки» (Москва, 2013), Международной научно-практической конференции «Актуальные научные вопросы и современные образовательные технологии» (Тамбов, 2013), XXIV Международной научно-практической конференции «Наука и современность - 2013» (Новосибирск, 2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 115 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического списка цитируемой литературы, который включает 233 источника, из них 136 российских и 97 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 27 рисунками и 4 таблицами.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и функции суставного хряща

Суставной хрящ млекопитающих, как известно, в ходе индивидуального развития образуется из хрящевой тканевой закладки конечностей, являющейся более ранней, чем костная ткань, формацией (Афанасьев Ю. И., 2001, 2002; Данилов Р. К., 2006). Анализ литературных источников, посвященных изучению структурных особенностей и основных функциональных задач суставного хряща позволяет сделать вывод о том, что главной функцией гиалинового хряща покрывающего суставные поверхности является принятие механических нагрузок и распределения их по касательной к поверхности эпифиза (Павлова В. Н., 1988, 2011; Лаврищева Г. П., 1996; Капанджи А. И., 2009). Важно отметить, что суставной хрящ участвует в образовании устойчивых к износу поверхностей сочленяющихся элементов скелета и принятии совместно с синовиальной жидкостью непосредственного участия в формировании смазочного механизма суставов (Franz J. К., 2000; Berkovitz В. К., 2002; Слесаренко Н. А., 2006; Слуцкий Л. П., 2006).

Осуществление этих функций обусловлено специфическими биомеханическими свойствами хрящевой ткани, зависящими практически полностью от структуры и функционального состояния внеклеточного матрикса. Принятая большинством авторов, двухфазная модель межклеточного вещества в целом объясняет вязкоупругие биомеханические свойства хряща (Модяев В. П., 1978, 1980; Дедух Н. В., 2001). Твердая фаза включает в себя волокнистые (14% массы нативной ткани) и неволокнистые структурные макромолекулы (6 %). Считается, что жидкая фаза при нормальном полностью гидратированном состоянии хряща составляет примерно 80 % массы ткани.

Суставной хрящ по общепринятой классификации относится к гиалиновым хрящам. Его ярко выраженную органную специфику определяет характер локализации на границе между костью и синовиальной жидкостью в условиях противоположения двух хрящевых пластов (Павлова В. Н., 1988,

2011; Модяев В. П.,1980; Лаврищева Г. И., 1996).

Согласно гистологической классификации в зрелой хрящевой ткани у взрослого человека и животных имеется одна типичная для нее клетка, именуемая хондроцитом. В соответствии с этой классификацией в хрящевой цитогенетически ткани выделяют хондрогенный дифферон, который представлен прехондробластом-хондробластом-хондроцитом (Афанасьев Ю. И., 2001; Данилов Р. К., 2006; Омельяненко О. П., 2009;). Анализ специальной литературы, посвященной изучению гистогенеза хрящевой ткани, выявил существующее несовершенство и тенденцию к развитию в терминологии клеток хондрогенного дифферона. Использование в отношении хрящевых клеток различной терминологии,