Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дегенеративно-дистрофические изменения в суставном хряще в условиях чрескостного остеосинтеза и способ их фармакологической коррекции

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Дегенеративно-дистрофические изменения в суставном хряще в условиях чрескостного остеосинтеза и способ их фармакологической коррекции"

На правах рукописи

Лунева Светлана Николаевна

ДЕГЕНЕРАТИВНО-ДИСТРОФИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ В СУСТАВНОМ ХРЯЩЕ В УСЛОВИЯХ ЧРЕСКОСТНОГО ОСТЕОСИНТЕЗА И СПОСОБ ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ

КОРРЕКЦИИ

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г. Уфа, 1998 г.

Работа выполнена в Российском научном центре «Восстановительн травматология и ортопедия» имени академика Г. А. Илизарова, r.Kyprai

Научный руководитель:

кандидат медицинских наук К.С. Десятниченко Научный консультант:

доктор медицинских наук A.A. Ларионов Официальные оппоненты:

1. доктор медицинских наук, профессор П.Н. Шараев,

2. доктор медицинских наук, профессор A.B. Осипенко. Ведущее учреждение:

Челябинская государственная медицинская академия

Защита диссертации состоится «_»_1998 года ]

заседании диссертационного ученого совета Д 084.35.01 п] Башкирском государственном медицинском университете (адрес 450000, г. Уфа-центр, ул. Ленина, 3).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке БГМУ.

Автореферат разослан «_»_1997 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, член-корр. АНРБ, профессор

Э.Г. Давлет

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ: Среди заболеваний опорно-двигательного аппарата дегенеративно-дистрофические изменения (ДЦИ) суставов занимают одно из первых мест, поражая 1% взрослого населения (Астапеко М.Г., Баятова В.К., 1984; Корж A.A., 1992). Однако, социальное значение данной патологии заключается не только в ее значительной распространенности, но и в том, что она наблюдается, в основном, у лиц трудоспособного возраста (40 - 60 лет) и нередко влечет за собой временную (в 37% случаев) и даже стойкую нетрудоспособность (Никитюк Б.А., Митрофаненко В.П., 1987; Дедух Н.В. и др. 1988; Бажанов H.H., Петухова Н.В. 1993). В последние десятилетия для лечения больных с повреждениями и заболеваниями костно-суставной системы стали широко применяться аппараты внешней фиксации. Экспериментальные исследования, выполненные в РНЦ «ВТО», показали, что при удлинении голени методами чрескостного дистракционного остеосинтеза (ЧДО) в гиалиновом хряще не только оперированной, но и контрлатеральной конечности происходят изменения его химического состава и обусловленных ими механических свойств (Грачева Л.И., Ерофеев С.А., 1993; Rajewski F. et.all.,1994; Snela S. et.all., 1994). Поэтому вопросы изучения состояния суставного хряща, а также возможностей стимуляции процессов его восстановления при использовании метода управляемого чрескостного остеосинтеза имеют первостепенное значение (Десятниченко К.С. и др., 1990; Катаев И.А. и др., 1996). Для фармакологической коррекции поражений гиалинового хряща суставов используется три группы лекарственных средств: стероидные и нестероидные противовоспалительные препараты и хондропротективные препараты. По мнению большинства исследователей наиболее приемлемыми в лечении дистрофических заболеваний суставов являются препараты-хондропротекторы.

Фармакологическое действие данных препаратов обусловлено наличием в них гликозаминогликанов (ГАГ), представленных в той или иной форме - хондроитинсульфаты, кератансульфаты, дерматансульфаты, гиалуронаты и гепарин (Гуобис Г., Талетене И., 1984; Муравьев Ю.В. и др. 1987; Матулис А.А. и др.1989; Базарный В.В. и др. 1992; Митрович Д.,1993). Изучение этих вопросов вызвало необходимость проведения комплексного исследования.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ: Оценить изменения химического состава и механических свойств суставного хряща, а также возможность их фармакологической коррекции в условиях использования метода управляемого чрескостного остеосинтеза.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Определить биохимические и биомеханические свойства гиалинового хряща коленных суставов у интактных животных и их изменения в условиях использования методик управляемого чрескостного остеосинтеза.

2. На основе использования методик управляемого чрескостного остеосинтеза разработать модель дегенеративно-дистрофических изменений суставного хряща.

3. Определить физико-химические и биологические свойства компонентов костной ткани животных, перспективных для использования их в составе хондропротектора, и на этой основе разработать препарат, оказывающий стимулирующее воздействие на процессы восстановления химического состава и механических свойств суставного хряща.

4. Определить возможности активного воздействия на восстановительные процессы в суставном хряще в условиях управляемого чрескостного остеосинтеза.

По результатам выполненного исследования на защиту выносятся следующие положения.

НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. "Оценены изменения суставного хряща в условиях использования метода управляемого чрескостного остеосинтеза; установлена взаимосвязь нарушения стереотипа движений в суставе конечности, тяжести скелетной травмы и степени выраженности дегенеративно-дистрофических изменений суставного хряща. Впервые разработаны экспериментальные модели дегенеративно-дистрофических изменений суставного хряща различной степени тяжести, позволяющие целенаправленно создавать однотипные воспроизводимые картины патологического процесса, изучать динамику и активно влиять на его течение.

Впервые выявлены компоненты костной ткани, способные активно влиять на метаболизм хряща; разработаны способы их выделения и очистки, а также биологического тестирования костных неколлагеновых белков с гипогликемическими свойствами. Разработан препарат для профилактики и лечения дегенеративно-дистрофических поражений суставного хряща, оказывающий стимулирующее хондрогенез, лубрикационное и обезболивающее влияние; разработаны методики его использования.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Полученные в ходе исследования данные о динамике развития дегенеративно-дистрофических изменений хрящевой ткани при нарушениях стереотипа движений в суставах конечностей указывают на необходимость использования щадящих методик лечения больных ортопедо-травматологического профиля, позволяют разрабатывать их новые варианты, учитывающие состояние суставного хряща

конечностей и предупреждающие развитие в нем патологических процессов.

Разработанный способ моделирования различной степени тяжести дегенеративно-дистрофических изменений суставного хряща, позволяют проводить целенаправленное изучение его биохимических и биомеханических характеристик, динамики патологических процессов и их отдельных стадий для выработки новых эффективных мер профилактики и лечения.

Разработанные методические подходы и лабораторные методы выделения коллагена, гликозаминогликанов, неколлагеновых белков костной ткани, регламент их получения и очистки может быть использован при разработке способа промышленного производства препаратов, оказывающих стимулирующее воздействие на хондрогенез, открывает возможности эффективной профилактики и лечения дегенеративно-дистрофических поражений суставов конечностей.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ:

Результаты настоящего исследования отражены в методических рекомендациях: «Выделение и биотестирование костных рострегулирующих факторов» (Курган, 1990.- 23 с.) и включены в учебные планы кафедры усовершенствования врачей РНЦ «ВТО».

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ: Материалы диссертации доложены на Международной конференции «Метод Илизарова -достижения и перспективы», посвященной памяти академика Г.А.Илизарова, Курган, 1993; Всесоюзном совещании «Актуальные вопросы клеточной биологии», Ленинград, 1989; УШ, X школах по биологии опорно-двигательного аппарата, Киев, 1990, Харьков, 1994; Научно-итоговых сессиях Казанского НИИТО, Казань, 1990, 1994;

Международной конференции «Перспективные направления чрескостного остеосинтеза в реконструктивно-восстановительной хирургии: теория и практика» и Симпозиума «Регенерация .и рост тканей в условиях дозированного растяжения», Курган, 1996; XXVI, XXVII, XXVIII, ХХУГУ научно-практических конференциях врачей Курганской области, Курган, 1994, 1995, 1996, 1997; заседаниях научного общества ортопедов-травматологов, Курган, 1992,1996.

По теме диссертации опубликовано 35 печатных работ, подано 2 заявки на выдачу патентов РФ на изобретения.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ: Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения, выводов, списка литературы. Изложена на 117 страницах машинописного текста без списка литературы; список литературы включает 265 источников, в том числе 121 иностранных. В диссертации 17 рисунков и 22 таблицы.

Диссертационная работа выполнена по плану НИР РНЦ «ВТО» имени академика Г.А.Илизарова (№ гос. регистрации 01970008150).

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Нарушение стереотипа движений в суставе в условиях управляемого чрескостного остеосинтеза вызывает усугубляемые скелетной травмой дегенеративно-дистрофические изменения хрящевой ткани, степень выраженности которых зависит от продолжительности действия указанного фактора.

2. Использование хондропротектора на основе компонентов костной ткани, включающего коллаген типа I, неколлагеновые белки, обладающие гипогликемическими свойствами, гидролизат гликозаминогликанов, а также новокаин, обеспечивает возможность активной стимуляции процессов восстановления

суставного хряща в условиях управляемого чрескостного остеосинтеза.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ: Объектом настоящего исследования послужили хрящи коленных суставов 32-х беспородных собак в возрасте от 1 года до 4-х лет с массой 10-30 кг, и мыши линии СВА (п=90). Материал исследования распределен на шесть серий.

В первой серии для изучения роли нарушения биомеханики движений в суставе на голень 6 собак накладывали аппарат Илизарова в экспериментальном варианте.

Во второй серии эксперимента у 7 собак удлиняли берцовые кости на 30% от исходной длины, что позволило исследовать влияние нарушения стереотипа движений в коленном суставе и тяжести сопутствующей скелетной травмы на состояние суставного хряща.

В третьей серии эксперимента для достижения более выраженных дегенеративно-дистрофических изменений суставного хряща через 8 месяцев после удлинения берцовых костей на 30% осуществляли аналогичное удлинение контрлатеральной конечности. Данная экспериментальная модель была выполнена на 5 животных.

В четвертой серии эксперимента 4 собакам осуществляли наложение аппарата Илизарова на голень. После 14 дней эксперимента для определения возможности инволюции суставного хряща в полость пораженного сустава дважды в неделю вводили по 3 мл разработанного препарата на протяжении 3 недель.

В пятой, контрольной, серии у 10 здоровых собак исследовали состояние интактных хрящей коленных суставов.

В шестой серии эксперимента для изучения отдельных компонентов препарата хондропротекторного действия проводили 8

биотестирование неколлагеновых белков костной ткани с относительной Мм 7-10 кД на 100 мышах линии СВА.

После эвтаназии животных и препарирования суставов измеряли податливость суставного хряща (Утенькин A.A., Грачева Л.И., 1989). Хрящевую ткань прецизионно взвешивали на электронных аналитических весах Tekator (Sartorius, ФРГ), лиофильно высушивали на установке Lyph Lock 4,5 (Labconco, США) и, повторно взвешивая, определяли в пробе содержание воды. В образцах высушенного хряща после жесткой деградации влажным озолением или относительно мягкого кислотного гидролиза (Десятниченко К.С., 1992) определяли основные компоненты минеральной фазы и внеклеточного органического матрикса: кальций, неорганический фосфат, сульфат (Berman J., Loxly R., 1963), гексозамины (Elson I., Morgan W., 1933), уроновые кислоты (Десятниченко K.C. и др., 1990), гексозы (Holt С., 1954), а также показатели клеточной активности хондроцитов - содержание нуклеиновых кислот (Збарский И.Б., Дебов С.С., 1968). Кроме того, фракционировали протеогликаны (ПГ) по величине образуемых ими супрамолекулярных агрегатов (Косягин Д.В.,1988), и определяли содержание каждой из выделенных фракций анализом на уроновые кислоты. 4-ю - нерастворимую - фракцию подвергали папаиновому протеолизу, осаждали цетавлоном и разделяли посредством анионообменной хроматографии на колонке 15 х 2 см с ДЭАЭ-сефадексом А-25 (Pharmacia, Швеция). Для идентификации выделенных хроматографий соединений во фракциях определяли содержание уроновых кислот (ГУК), гексозаминов, гексоз и сульфата. В надосадочной жидкости изучали количество и тип коллагена (Симхович Б.З., Слуцкий Л.И., 1982), используя катионообменную хроматографию на колонке 10x1 см с КМ-трисакрилом М (IBF, Франция). Концентрацию коллагена

рассчитывали, определяя концентрацию гидроксипролина в элюате (Шараев П.Н.,1981).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ результатов исследования состава и биомеханических свойств суставного хряща выявил, что уже при наложении аппарата внешней фиксации на голень, на фоне слабовыраженных макроскопических изменений суставной поверхности наблюдается значительное снижение механических свойств хряща (рис.1).

1 опер.

Рис. 1. Изменение вязкоупругих свойств хряща коленных суставов в группах экспериментальных животных

Отмечены снижение содержания ПГ в 1,5 раза и повышение содержания фосфата кальция в 2,6 раза. У собак с 30%-м удлинением голени, мы наблюдали матовый, шероховатый с фиолетовыми пятнами, истонченный хрящ толщиной 1 мм и менее. При этом обнаружили снижение вязкоупругих свойств на 43%, уменьшение содержания ПГ примерно на том же уровне, что в 1-й серии с увеличением доли высокосульфатированных ГАГ и повышением содержания минерала в 4,3 раза. В группе животных с двукратным удлинением обеих голеней состояние суставного хряща характеризовалось следующей картиной: истонченный местами до

обнажения субхондральной кости хрящ приобретал темно-фиолетовую окраску, появлялись участки прорастания субхондральной кости в виде возвышавшихся над суставной поверхностью бугров, почти полную утрату вязкоупругих свойств, дальнейшее снижение содержания ПГ и увеличение степени минерализации хряща (рис.2).

□ вязкоупругие св-ва, мм/Г

□ высокоагр. ПГ, ммоль ГУК/100 гсух.тк.

В степень сульфатирования

0 минералы, г/100 г сух. тк.

Рис. 2. Показатели свойств и состава суставного хряща оперированной конечности экспериментальных групп животных

Полученный нами результат ухудшения механических свойств хряща коленных суставов как оперированных, так и контрлатеральных конечностей, обусловленных снижением содержания в нем протеогликанов и количества удерживаемой ими воды, согласуется с литературными данными (Грачева Л.И. и др. 1986; Катаев И.А. и др. 1996). Однако, в работе впервые продемонстрировано, что степень снижения механических свойств хряща прямо пропорциональна от продолжительности действия нарушения стереотипа движений, компрессии в суставах и тяжести сопутствующей скелетной травмы.

Исследования механизма регуляции обмена ГАГ показали, что в условиях реперативного остеогенеза происходит активация гиалуронидазы, нейраминидазы и альдолазы нейраминовой кислоты (Меркулова Р.В., 1972). Мы полагаем, что действие этих ферментов на суставной хрящ в условиях удлинения конечности методом управляемого чрескостного остеосинтеза приводит не только к снижению количества, но и к качественным изменениям структуры ПГ суставного хряща. Так, распределение фракций ПГ по степени агрегирования в хряще коленных суставов экспериментальных групп животных показало увеличение доли мономеров и ПГ низкой степени агрегирования, уменьшения в 2 раза доли ПГ, входящих в состав суперагрегатов и прочно связанных с коллагеном, в группе животных с наложением аппарата на голень. При 30%-м удлинении голени от ее длины обнаружено уменьшение доли ПГ, прочно связанных с коллагеном, в 1,5 раза. В суставном хряще собак 3-й серии эксперимента (двукратное удлинение обеих голеней на 30% от их исходной длины) обнаружено еще более значительное снижение доли ПГ, связанных с коллагеном и с наибольшей степенью агрегирования, в хряще коленных суставов конечностей, прооперированных в первую очередь. Учитывая общее снижение ГАГ и, как следствие, уменьшение количества ПГ, можно предположить некоторое снижение метаболической активности хондроцитов, т.е. синтеза компонентов матрикса суставного хряща.

Хроматографическое изучение ГАГ, выделенных из фракции ПГ, прочно связанных с матриксом показали, что в хряще коленных суставов всех экспериментальных групп животных наряду с изменениями концентрации ПГ в матриксе меняется и их структура. Изменение по сравнению с контролем доли разных типов ГАГ от их общего содержания в хряще собак разных экспериментальных групп было однонаправлено в сторону снижения содержания

хондроитинсульфата и увеличения концентрации кератансульфата, с возрастанием степени сульфатирования последних. Выраженность этих изменений зависела от длительности "нарушения стереотипа движений, аутокомпрессии в суставе и тяжести сопутствующей скелетной травмы.

Как было установлено другими исследователями, хондроцит в ответ на механическое, либо химическое повреждение начинает делиться и повышать синтез ГАГ и коллагена. Эта реакция наблюдается после механического разрыва суставной поверхности, сдавления, внутрисуставных инъекций папаина и трипсина (Подрушняк Е.П., 1972; Никитин В.Н., 1977; Павлова В.Н. и др., 1988). При всех подобных воздействиях наблюдается значительная потеря ГАГ, которая вынуждает хондроцит делиться и усиленно синтезировать ДНК. При выполнении нашей работы выяснилось, что концентрация ДНК несколько снижена по сравнению с нормой в ХКС животных 1-ой серии эксперимента, а в ХКС животных 2-ой значительно. Отношение РНК/ДНК, обратно пропорционально характеризующее пролиферативный потенциал ткани, значительно снижено. У животных 3-й серии эксперимента в ХКС на фоне резкого падения концентрации ДНК, отношение РНК/ДНК статистически не отличается от нормального, что связано с процессами деструкции и гибели клеток. Эти данные свидетельствуют о срыве репаративного механизма и недостаточно продолжительном периоде (8 месяцев) между операциями по последовательному удлинению обеих голеней.

При изучении степени однородности коллагена хрящей экспериментальных животных нами получен дополнительный пик коллагена, не свойственный здоровой хрящевой ткани, и значительное увеличение пика минорных коллагенов. У дважды прооперированных собак (3-я серия эксперимента) при

13

ионообменной хроматографии наблюдалось увеличение площади пика не свойственного здоровой хрящевой ткани почти на 20% и площади пика минорных коллагенов в 5 раз (рис.3).

ЕЛ*220нм 2,5 N №аС1 Е, X. *220 им 2,5 N №С1

интактный сустав 3 серия, II удлинение

Рис. 3. Хроматографические профили коллагена хряща коленного сустава собак на катионообменнике

Нарушения двигательного стереотипа и содружественные реакции в тканях неоперированных фрагментов скелета приводят к изменениям и в структуре и в составе суставного хряща конечности, контрлатеральной оперированной. При минимальном объеме вмешательства (наложение аппарата на голень) эти изменения выражены даже больше, чем в оперированной конечности. Вместе с тем, у нас есть основания считать, что при изменениях наименьшей и средней тяжести (1-я и 2-я серии эксперимента) хрящ как оперированной, так и контрлатеральной конечности сохраняет высокую способность к реституции: мало изменяются показатели клеточной активности (нуклеиновых кислот) хондроцитов, изменения во внеклеточном матриксе - соотношения между сульфатированными и несульфатированными ГАГ - подобны тем, что наблюдаются на ранних стадиях развития хряща (Бахлыков Ю.Н. и др., 1983). Ранее на аналогичной описанным здесь моделям было показано, что в условиях иммобилизации сустава аппаратом Илизарова хондроциты 14

сохраняют способность к пролиферации (Грачева Л.И., Ерофеев С.А., 1990). На основании приведенных в настоящей работе данных мы считаем, что при выполнении ортопедических вмешательств с нарушением стереотипа движений, аутокомпрессией в суставе и с сопутствующей общей метаболической реакцией на скелетную травму необходимо учитывать возможность существенных изменений в суставном хряще как оперированной, так и контрлатеральной конечностях и применять весь существующий арсенал средств для их профилактики. Кроме того, как показывают полученные нами данные, клинико-рентгенологическая «готовность» к повторной операции на скелете не совпадает с восстановлением механохимических свойств суставного хряща, что должно учитываться при назначении следующего этапа ортопедического вмешательства.

В настоящее время для лечения остеоартроза наиболее популярны хондропротекторные препараты, такие, как румалон, артепарон, представляющие собой дериваты ГАГ в той или иной форме. (Липец А.И. и др, 1977; Ибрагимова А.Г. и др., 1985; Матулис A.A. и др., 1990; Зиненко Т.Н., 1994). Кроме того, предложены несколько видов биологических заменителей синовиальной жидкости, ряд из них - на основе медицинского желатина (Пашков А.Е., 1996). Имеются сведения о стимулирующем влиянии коллагена на образование соединительной ткани (Bruckner P., Rest М., 1994).

КРРФ могут действовать как для модуляции костеобразования и активности остеобластов, так и для стимулирования пролиферации хондроцитов (Zapf J. et. all., 1984; Syftestad G.T., 1987; Froach E.R. et. all., 1989; Mohan S., Baylink DJ.,1991). Данные наших исследований свидетельствуют, что костные клетки продуцируют существенные количества КРРФ, которые депонируются костным матриксом (Десятниченко К.С. и др. 1984; Десятниченко К.С. и др. 1997).

15

Влияние ИФР на рост и дефференцировку хондроцитов известно -они стимулируют пролиферацию хондроцитов и синтез белков матрикса хряща (Судаков К.В., 1988; Froach E.R., 1987).

Разработанная нами методика выделения неколлагеновых белков костной ткани со свойствами соматомединов заключается в последовательном использовании кислотной деминерализации, диссоциативном экстрагировании, диализе, высаливании и фракционировании с помощью гельпроникающей и ионообменной хроматографии. Изучение свойств выделенных неколлагеновых белков показало, что четыре фракции оказали выраженное гипогликемическое действие, обладавшее дозозависимым эффектом. Эксперимент, предпринятый для изучения действия ИПФР, показал, что через три недели (после подкожного введения белков в дозе 0,5 мг/кг массы тела животного) снижается величина пула пролиферирующих хондроцитов с 26% в контроле до 19% в опыте в суставной выстилке бедра и с 19% в контроле до 14% в опыте в суставной выстилке голени. Эта же тенденция наблюдалась в отношении интенсивности пролиферации хондроцитов. Вторым и главным по значению эффектом, который наблюдался в ответ на введение исследуемого белка, является прирост массы гиалинового хряща за счет усиления его продукции с 74% до 81% в суставной выстилке бедра и с 81% до 86% в суставной выстилке голени.

Для получения коллагенового золя и гидролизата ГАГ мы использовали дисссоциативно экстрагированный костный матрикс, оставшийся после выделения неколлагеновых белков. Определяли вязкость полученного раствора костного коллагена и путем интерполяции находили концентрацию, соответствующую нормальной синовиальной жидкости. Таковой оказались концентрации коллагена от 0,56% до 0,64%, имеющие относительную вязкость от 7,04 мП/с до 8,22 мП/с. Надосадочную жидкость после 16

осаждения коллагена использовали для выделения костных гликозаминогликанов: с этой целью диализировали против дистиллированной воды и лиофильно высушивали. Ионообменная хроматография диализата показала, что он содержит один тип ГАГ, выходящих одним пиком, и относящихся к хондроитинсульфату. С целью получения дериватов ГАГ продукт подвергали гидролизу.

Для приготовления препарата, обладающего

хондропротекторными, лубрикационными и анестезирующими свойствами, в 750 мл гидролизата гликозаминогликанов растворяли 50 мг белка с гипогликемическими свойствами и 100 г новокаина кристаллического. Полученный раствор смешивали со 150 мл 5% раствора коллагена.

Эффективность использования препарата (стимбон-3) исследовали на животных, которым ранее смоделировали дегенеративные изменения в суставном хряще правого коленного сустава, соответствующие начальной стадии остеоартроза. В полость пораженного сустава дважды в неделю вводили по 3 мл препарата на протяжении 3 недель. Через 1 месяц после первой инъекции животное эвтаназировали.

Выполненные исследования показали, что макроскопически ХКС леченой конечности не имел отличий от интактного: толщина слоя хряща, покрывающего эпифиз болыпеберцовой кости, не изменена, суставные поверхности гладкие, блестящие, жемчужно-серого цвета. Механические свойства и гидратированность хряща леченого сустава существенно отличаются от нелеченного, приближаясь к таковым у нормального хряща. При изучении состава хряща коленных суставов было обнаружено статистически достоверное снижение концентрации ГУК на 18,4% в хряще леченой конечности, в хряще аналогично оперированной конечности без

введения препарата снижение концентрации этого показателя составило 30,4%. В хряще коленных суставов контрлатеральных конечностей обеих серий эксперимента (1-й и 4-й) содержание ГУ К было одинаковым и составило 76,4% от нормы (рис.4).

350 300 250 200 150 100 50 0

Шв.у.с. ПГУК а РНК/ДНК □ минералы

Рис. 4. Показатели свойств и состава хряща коленных суставов животных с наложением аппарата на голень

При изучении биосинтетических и пролиферативных потенций хряща животных с введением препарата выяснилось, что достоверных отличий концентрации ДНК по сравнению с интактными животными не наблюдается, однако было обнаружено статистически достоверное увеличение содержание РНК в ХКС леченой конечности. Отношение РНК/ДНК в ХКС оперированной, леченой конечности составило 9,89±0,45 , что на 28% превышает норму. Все эти данные говорят о том, что при незначительном уменьшении пролиферативной активности хондроцитов в клетке усиливаются биосинтетические процессы.

Итак, использование препарата стимбон-3 приводит к значительной коррекции нарушений состава и свойств хряща как

1

■

— as? if Л - riiif^i ifft

—1—1

опер, нелеч. опер. леч.

конечность конечность

удлиняемой, леченой так, хотя и в меньшей мере, контрлатеральной конечности, что позволило сделать вывод о наличии хондропротекторного действия препарата. Этот вывод был подтвержден и результатами исследования степени агрегации ПГ. Так, доля ПГ, входящих в состав суперагрегатов, уменьшается в контрлатеральной конечности более чем в 1,5 раза, в тоже время как уменьшение доли ПГ данной группы в матриксе хряща оперированной конечности статистически не достоверно.

При изучении степени однородности коллагена хряща экспериментальных животных 4-й серии нами получен дополнительный пик коллагена, не свойственный здоровой хрящевой ткани, который наблюдался в хряще нелеченной конечности. Пик элюировался при 0,65 М концентрации №С1 и занимал площадь, равную 2,26% от совокупной площади коллагеновых фракций. В хряще коленных суставов оперированной и леченой конечности аналогичный пик коллагена нами не обнаружен.

Следовательно, разработанный препарат стимбон-3, включающий неколлагеновые белки с гипогликемическими свойствами, коллаген и дериваты ГАГ, представляет собой композицию биологически активных компонентов костной ткани. Экспериментальная апробация предложенного препарата и анализ полученных результатов показывают, что его применение в виде внутриартикулярных инъекций практически полностью восстанавливает механические свойства суставного хряща при его дегенеративных поражениях. Указанный эффект достигается вследствие изменения активности биосинтетических процессов (увеличение индекса РНК/ДНК) и структуры синтезируемого внеклеточного матрикса, которая определяет биомеханические свойства суставного хряща.

Таким образом, выполненное исследование, включающее разработку и экспериментальное моделирование различных стадий дегенеративно-дистрофических изменений суставного хряща, изучение динамики развития патологического процесса и анализ состояния хрящевой ткани на различных этапах эксперимента, выявление компонентов костной ткани, обладающих биологически активными свойствами, разработка на этой основе препарата и результаты его экспериментальной апробации позволили нам сделать следующие выводы.

ВЫВОДЫ

1. Нарушение стереотипа движений в коленном суставе и сопутствующая скелетная травма, наносимая в ходе оперативного вмешательства по поводу удлинения сегментов конечности методом управляемого чрескостного остеосинтеза вызывают дегенеративно-дистрофические изменения гиалинового хряща, глубина которых зависит от степени выраженности указанных факторов.

2. Разработанная на основе использования методик управляемого чрескостного остеосинтеза экспериментальная модель деформирующего остеоартроза коленного сустава обеспечивает воспроизводимую, соответствующую клиническим проявлениям, картину дегенеративно-дистрофических изменений суставного хряща различной степени тяжести, позволяет изучать динамику патологического процесса и возможность его купирования.

3. Дегенеративно-дистрофические изменения суставного хряща при нарушении стереотипа движений в суставе и сопутствующей скелетной травме в условиях использования управляемого чрескостного остеосинтеза характеризуются типичными для деградирующей ткани проявлениями: снижением

пролиферативной активности, увеличением степени кальцификации, уменьшением гидратированности хрящевой ткани; изменениями в структуре и составе протеогликанов, появлением несвойственного здоровой ткани коллагена типа I, в совокупности вызывающих частичную либо полную утрату вязкоупругих свойств.

4. Композиция биологически активных веществ костной ткани, включая дериваты гликозаминогликанов, неколлагеновые белки со стимулирующим хондрогенез действием и коллаген, обладают способностью целенаправленно воздействовать на метаболизм хрящевой ткани, стимулировать в хондроцитах биосинтетические процессы и повышать устойчивость хрящей к действию деградирующих факторов.

5. Препарат стимбон-3, разработанный на основе биологически активных веществ костной ткани, обладающий хондропротекторным, лубрикационным и обезболивающим свойствами, способствует частичному или полному восстановлению суставного хряща при его дегенеративно-дистрофическом поражении, что позволяет рекомендовать его в качестве средства профилактики и лечения остеоартроза.

Основные материалы исследования опубликованы в

следующих работах:

1. Выделение биотестирование костных рострегулирующих факторов / Метод.рекомендации, Курган. - 1990. - 27с. (В соавт.Десятниченко К.С., Балдиным Ю.П., Дьячковым А.Н., Изотовой С.П., Силаньтьевой Т.И., Карпенко О.Л.).

2. Регуляция остеогенеза и кроветворения депонируемыми в костной ткани ростовыми факторами // Мат. школы « Биология опорно-двигательного аппарата» .- Харьков, 1992.- С.81-85. (В

21

соавт.Десятниченко К.С., Балдиным Ю.П., Дьячковым А.Н., Изотовой С.П., Ширалиевой С.И., Гребневой O.JL).

3. Моделирование на животных процесса управления остеогенезом и кроветворения факторами роста, депонируемыми костной тканью: Тез.докл.1 Междунар. симп. PAJIAH «Лабораторные животные в медико-биологических и биотехнологических исследованиях».- Москва, 1992.// Ланималогия, 1993. -N 1 - С.52-53. (В соавт. Десятниченко К.С., Балдиным Ю.П., Дьячковым А.Н.).

4. О роли С1-гликопротеина костной ткани в механизме биологической кальцификации // Тез. докл. науч. конф. НИЦ «ВТО».- Ч.2.- Казань, 1993.- С. 27-28. (В соавт. Десятниченко К.С., Ирьяновым Ю.М., Гребневой О.Л.).

5. О возможности ускорения созревания дистракционного регенерата кости фарм. средствами //Ортопед, травматол., 1994.-N 4.- С. 73 (В соавт. Десятниченко К.С., Балдиным Ю.П., Дьячковым А.Н., Шрейнером A.A., Гребневой О.Л.)

6. Пути повышения информативности лабораторного контроля за течением репаративного процесса в клинике травматологии и ортопедии //Ортопед, травматол., 1994.-N 2.- С. 106-107 (В соавт. Десятниченко К.С., Балдиным Ю.П., Гребневой О.Л., Изотовой С.Н., Кузнецовой Л.С., Алиевой С.И.)

7. Получение нативного коллагена из костной хрящевой ткани //Мат. конф. врачей Кург. обл.- Курган, 1995. - С. 143-144. (В соавт. Десятниченко К.С., Ирьяновым Ю.М., Гребневой О.Л., Грачевой Л.И.)

8. Испытание в эксперименте препарата, стимулирующего регенерацию // Тез. докл. науч.-прак. конф. НИЦТ»ВТО».-

Казань, 1994.-С. 105-106 (В соавт. Десятниченко К.С., Балдиным Ю.П., Дьячковым А.И., Гребневой O.JL, Матвеевой E.JL, Изотовой С.Н., Алиевой С.И.)

9. Аутокринная и паракринная функция скелета в норме и при экстремальных состояниях // Тез. П съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока.- Новосибирск, 1995. ( В соавт. Десятниченко К.С., Балдиным Ю.П., Дьячковым А.Н.).

10. Кость как орган аутокринной и паракринной регуляции репаративного процесса: Адаптационно-компенсаторные и восстановительные процессы в тканях опорно-двигательного аппарата // Тез.докл. VIII Всесоюзн. школы по биологии оп.-двигат. аппарата. - Киев. -1990. - С.58-59 (с К.С.Десятниченко, Ю.П.Балдиным, А.Н.Дьячковым)

11. Изменения в составе макромолекулярных соединений при дегенеративно-дистрофических изменениях в суставном хряще: Актуальш питания бюлогп опорно-руховово аппарата / Матер. VIII школы стран СНГ // Киев, 1996. - С. 57. ( В соавт. Десятниченко К.С., Грачевой Л.И., Ларионовым A.A., Изотовой С.П., Фадеевой О.Н.).

12. Биохимические особенности репаративного хондрогенеза при удлинении голени собак посредством высокодробной автоматической дистракции: Актуальш питания бюлогп опорно-руховово аппарата / Матер. VIII школы стран СНГ // Киев, 1996. -С. 26. ( В соавт. Десятниченко К.С., Грачевой Л.И., Ерофеевым С.А.)

13. Изменения гиалинового хряща коленного сустава у собак при чрескостном остеосинтезе // Тез. докл. науч.-прак. конф. НИЦТ»ВТО».-Казань,1995,- С.36. (В соавт. Десятниченко К.С.,Грачевой Л.И., Ларионовым A.A.)

14. Конструирование и экспериментальная апробация фармпрепаратов из костной ткани // Гений ортопедии, 1997. - N 4.

С.6-12 (с В.И.Шевцовым, К.С.Десятниченко, О.Б. Устюжаниной, О.Л.Гребневой)

15. Chahges in compositioon, structure and mechanical properties of the articular cartilage in transosseus osteosynthesis// Bull. N.Y. Hosp. Dis., 1997 ( Shevtsov V.I., Desaytnichenco K.S., Gratcheva L.I., Larionov A.A.)

16. Конструирование фармпрепаратов из костной ткани для коррекции осложнений при вмешательствах на скелете// Тезисы докл. междунар.юбилейной научно-практич. конференции и симпозиума / «Гений ортопедии», 1976.- N 2-3 - С.130.(В соавт. Десятниченко К.С., Устюжаниной О.Б., Гребневой О.Л., Ковинька М.А.)

17. Биохимические и биомеханические изменения суставного хряща при многоэтапном удлинении конечности у собак // Тезисы докл. междунар.юбилейной научно-практич. конференции и симпозиума / «Гений ортопедии», 1976.- N 2-3 - С. 147. ( В соавт. В.И.Шевцовым, К.С.Десятниченко, Л.И.Грачевой, А.А.Ларионовым)

18. Способ количественной морфологической оценки действия биологически активных веществ на суставной хрящ: материиал. XXVIY обл. науч.-практ. конф. врачей // Курган, 1997. - С. 82-83. ( В соавт. С.Н.Асоновой, К.С.Десятниченко, М.А. Ковинька, Г.Д.Филимоновой)

19. Выделение из костной ткани и биотестирование в эксперименте низкомолекулярных полипептидов с регуляторной функцией : материиал. XXVIV обл. науч.-практ. конф. врачей // Курган, 1997.

-С. 83-84. ( В соавт. С.Н.Асоновой, К.С.Десятниченко, М.А. Ковинька, Г.Д.Филимоновой)

20. Влияние многоэтапного чрескостного дистракционного остеосинтеза на состав и вязко-упругие свойства суставного хряща// Рефераты докладов итоговой научной сессии РНЦ»ВТО»/ «Гений ортопедии» 1996. -N1. -С.91. ( В соавт. с Шевцовым В.И., Ларионовым A.A., Десятниченко К.С., Грачевой Л.И.)

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ определения готовности организма к повторному удлинению костей скелета методом дистракционногго остеосинтеза // Приоритетная справка от 03.04.96 (в соавторстве с Шевцовым В.И., Ларионовым A.A., Офицеровой Н.В.)

2. Способ получения модели деформирующего остеоартроза коленного сустава // Приоритетная справка от 12.06.96 (в соавторстве с Десятниченко К.С., Ларионовым A.A., Грачевой Л.И.)

3. Препарат, стимулирующий хондрогенез, «Стимбон-3» и способ его получения // Приоритетная справка от 06.08.97 (в соавторстве с Десятниченко К.С., Ларионовым A.A.)

Соискатель Лунева С.Н.

Тир. 100

Отпечатано РНЦ «ВТО»