Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща при биомоделировании остеоартроза и экспериментальной разработке технологий ортопедического удлинения конечности

Ступина, Татьяна Анатольевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща при биомоделировании остеоартроза и экспериментальной разработке технологий ортопедического удлинения конечности
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща при биомоделировании остеоартроза и экспериментальной разработке технологий ортопедического удлинения конечности"

На правах рукописи

СТУПИНА ТАТЬЯНА АНАТОЛЬЕВНА

СТРУКТУРНАЯ РЕОРГАНИЗАЦИЯ НАГРУЖАЕМЫХ УЧАСТКОВ СУСТАВНОГО ХРЯЩА ПРИ БИОМОДЕЛИРОВАНИИ ОСТЕОАРТРОЗА И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ РАЗРАБОТКЕ ТЕХНОЛОГИЙ ОРТОПЕДИЧЕСКОГО УДЛИНЕНИЯ КОНЕЧНОСТИ

03.03.04. Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

8 АПР 2015

005567101

Оренбург - 2015

005567101

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава России

Научный консультант:

доктор медицинских наук Щудло Михаил Моисеевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор кафедры гистологии, цитологии, эмбриологии ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет»

Минздрава России Валиуллин Виктор Владимирович

доктор медицинских наук, профессор кафедры анатомии человека ГБОУ.ВПО «Башкирский государственный медицинский университет»

Минздрава России Нигматуллин Рафик Талгатович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой гистологии, цитологии, эмбриологии ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия»

Минздрава России Соловьев Георгий Сергеевич

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита диссертации состоится «16» июня 2015 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.04 при Оренбургском государственном медицинском университете по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6, зал заседаний диссертационного совета.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ГБОУ ВПО «Оренбургский государственный медицинский университет» Минздрава России (460000, г. Оренбург, ул. Советская, 6; http://wwvv.orgma.ru/).

Автореферат разослан «.ЛУ » 15г.

Учёный секретарь диссертационного совета, д.б.н., профессор

Шевлюк Н.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Удлинение конечностей является важным разделом хирургического лечения ортопедических заболеваний [Шевцов В.И. с соавт., 2004; Каплунов O.A. с соавт., 2010]. Оно применяется при врождённых и приобретённых укорочениях и деформациях, нарушениях роста при системных заболеваниях скелета либо при «субъективно низком» росте. Из существующих на сегодняшний день методов ортопедического удлинения дистракционный остеосинтез по Г.А. Илизарову получил международное признание и широкое внедрение в практику, однако вплоть до настоящего времени при его применении остаётся нерешённой проблема функциональной реабилитации пациентов - в частности, восстановление объёма движений в суставах [Аранович A.M. с соавт., 2005; Попков A.B., Попков Д.А., 2008].

В настоящее время достижения в области морфологических и биохимических исследований [Зайдман A.M. с соавт., 2004; Волошин H.A., Григорьева Е.А., 2010; Павлова В.Н. с соавт., 2011] позволили приблизиться к пониманию особенностей морфофункциональных характеристик хряща, определяющих нормальное функционирование суставов. Морфологические изменения суставного хряща в зависимости от условий удлинения конечности изучены недостаточно. Известны единичные работы, освещающие отдельные аспекты этой проблемы [Старцева И.А., Никитенко Е.Т., 1973; Stanitski D.F. et al., 1996; Fink В. et al., 2001].

Исследование коленного сустава в эксперименте при удлинении болынеберцовой кости с суточным темпом 1 мм за 1 прием на 20% от исходной длины выявило дегенеративные изменения в суставном хряще, которые подвергались обратному развитию по мере нормализации функции конечности [Старцева И.А., Никитенко Е.Т., 1973]. С целью уменьшения травматизации тканей при дистракционном остеосинтезе академик Г.А. Илизаров предложил разделить суточное удлинение (1 мм) на несколько или несколько десятков приёмов (разовых удлинений) - принцип дробной и высокодробной дистракции [Илизаров Г.А. с соавт., 1982]. В условиях дозированной низкодробной дистракции с разовым удлинением 0,5 мм зарубежными исследователями [Stanitski D.F., 1994; Stanitski D.F. et al., 1996; Fink B. et al., 2001] были отмечены истончение, разволокнение суставного хряща, в части наблюдений выявлены некротические изменения. При применении автодистракторов, позволяющих распределить суточное удлинение на 120 приёмов, повреждения суставного хряща существенно уменьшаются [Nakamura Е. et al., 1993, 1995]. Меньшая травматизация суставного хряща в условиях высокодробной дистракции установлена также при сопоставлении автоматического удлинения с темпом 1 мм за 60 приёмов и ручной дистракции с тем же темпом, разделённым на 8 приёмов [Щудло М.М. с соавт., 2005].

Выбор оптимального режима дистракции (прежде всего её суточного темпа и дробности) с целью улучшения функциональных результатов остаётся одной из актуальных проблем разработки метода дистракционного остеосинтеза, требующих теоретического обоснования и практического решения. Недостаточно изучено состояние суставного хряща при наиболее часто применяемом в клинике режиме ручной дистракции «1 мм за 4 приёма», в том числе в зависимости от уровня удлинения (на уровне диафиза или метадиафиза). Не изучено состояние суставного хряща при повышенном темпе высокодробной дистракции, применяемой с целью сокращения периода пребывания конечности в аппарате. Оптимальное для процессов физиологической и репаративной регенерации суставного хряща распределение сеансов дистракции во времени суток (день либо ночь) также не определено.

Представления об источниках и механизмах структурного самоподдержания и самовосстановления суставного хряща противоречивы. Недостаточно выяснены вопросы о возможности, месте и типе пролиферации хондроцитов. Учитывая зональную неоднородность суставного хряща, исследователи высказывали различные мнения о наличии какой-то определенной зоны, имеющей наибольшее значение для его роста и восстановления [Мажуга П.М., 1999; Павлова В.Н. с соавт., 2011; \Vezeman Р.Н., 1998]. Отсутствуют сведения о пролиферативных возможностях хрящевых клеток суставного хряща при удлинении смежного сегмента конечности, полученные с помощью современных методов исследования (электронной микроскопии, иммуногистохимии) при разработке новых технологий удлинения.

Для уточнения представлений о рисках, механизмах и обратимости развития остеоартроза у пациентов, перенесших ортопедическое удлинение конечности, необходимо сопоставление закономерностей структурной реорганизации тканей суставов при разных методиках удлинения с биологической моделью остеоартроза, которая сочетает его основные патогенетические факторы - иммобилизацию сустава и редуцированное кровоснабжение конечности.

При изучении влияния различных факторов на состояние суставного хряща существует необходимость разработки способов объективной комплексной количественной морфологической оценки его деструктивно-репаративных и адаптационно-пластических изменений [Миронов С.П. с соавт., 2006]. Отсутствие стандартных методик (алгоритма количественного анализа) не позволяет однозначно судить о степени реактивно-деструктивных, регенеративных и адаптационно-пластических изменений гиалинового хряща суставов в разных экспериментальных условиях и в различные периоды постнатального онтогенеза. В частности, несмотря на значительные успехи в распознавании патогенеза дегенеративно-дистрофических процессов в суставе, нет единого мнения о пусковых

механизмах и степени структурных перестроек его компонентов при инволютивных изменениях и на ранних стадиях остеоартроза [Денисов-Никольский Ю.И. с соавт., 2005; Martin J.A., Duckwalter J.A., 2003; Yamamoto К. et al., 2005; Mrosek E.H. et al., 2006].

Таким образом, актуальность исследования структурной реорганизации суставного хряща при естественном удлинении конечности в периоды бурного онтогенетического роста, при инволюции онтогенеза и индуцированном остеоартрозе, а также при биомоделировании ортопедического удлинения конечностей и сопоставительного количественного анализа этих состояний по единому алгоритму определяется недостаточными знаниями об адаптивности и пластичности хрящевой ткани в обозначенных условиях и необходимостью этих знаний для оптимизации методик реконструктивной ортопедии.

Цель исследования

Выявить закономерности структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща коленного сустава при биомоделировании остеоартроза и экспериментальной разработке технологий ортопедического удлинения голени.

Задачи исследования

1. Изучить основные гистоморфометрические и метаболические характеристики суставного хряща интактных животных (собак) в различные периоды онтогенеза, уделяя особое внимание периодам интенсивного роста.

2. Изучить динамику структурной реорганизации суставного хряща при моделировании остеартроза с редуцированным кровоснабжением в период от 1 месяца до 3 лет после индуцирующей операции,

3. В экспериментах по биомоделированию ортопедического удлинения конечности провести сопоставительный анализ стереологических и цитометрических характеристик, а также элементного состава хряща при диафизарном удлинении голени ручной (1мм за 4 приема) и автоматической дистракцией (1мм за 60 приемов в ночное время и Змм за 180 приемов в сутки).

4. Выявить значение изменения дробности автодистракции с повышенным суточным темпом путём сопоставления компенсаторно-приспособительных изменений суставного хряща при удлинении с темпом 3 мм за 120 и 180 приёмов.

5. Выявить особенности структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща при метадиафизарном удлинении голени в ручном режиме «1 мм за 4 приёма».

6. Провести сопоставительный анализ реактивно-деструктивных изменений и восстановительных процессов в суставном хряще в

условиях удлинения конечности в эксперименте, в процессе естественного роста и при моделировании остеоартроза.

7. Оценить морфофункциональное состояние синовиальной оболочки при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением, при инволютивных изменениях и при ортопедическом удлинении конечности.

Научная новизна

Впервые на достаточном материале с применением современных методов световой и электронной микроскопии, компьютерной морфо- и стереометрии проведено гистологическое исследование нагружаемых участков суставного хряща коленного сустава в различные периоды онтогенеза.

Разработана новая клинически релевантная биологическая модель остеоартроза с редуцированным кровоснабжением, изучена структурная реорганизация суставного хряща, синовиальной оболочки и субхондральной кости в ближайшие и отдалённые сроки после индуцирующей операции.

Впервые изучены гистоморфометрические признаки реактивно-деструктивных, компенсаторно-приспособительных и адаптационно-пластических изменений суставного хряща в процессе ортопедического удлинения голени экспериментальных животных клинически релевантными методиками дистракционного остеосинтеза с применением ручной дистракции по Г.А.Илизарову (темп 1 мм за 4 приёма), проанализированы отличия влияния диафизарного и метадиафизарного удлинения на суставной хрящ.

Впервые выявлены особенности изменений суставного хряща при щадящем режиме автодистракции с темпом 1 мм за 60 приемов, проводимой в ночное время.

Впервые изучены характеристики изменений суставного хряща и синовиальной оболочки при автодистракции с повышенным до 3 мм суточным темпом и высокой дробностью. Установлено снижение травматичности повышенного темпа дистракции при увеличении дробности до 180 вместо 120 приёмов.

Усовершенствованы и адаптированы к объекту исследования технологии изготовления гистологических препаратов для количественной и аналитической морфологии с применением цифровой микроскопии и компьютерного анализа изображений. Разработан универсальный комплекс количественных критериев, применимый для оценки степени реактивно-деструктивных изменений и восстановительных процессов в суставном хряще в различных экспериментальных условиях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные о структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща в периодах интенсивного онтогенетического роста и старения организма животных, при биомоделировании остеоартроза, а также в условиях клинически релевантного биомоделирования удлинения . голени при применении широкого спектра ручных и автоматических режимов дистракции углубляют и уточняют представления об адаптивности и пластичности гиалинового хряща. Показано, что прогноз репаративных процессов в обозначенных условиях определяется не только выраженностью реактивно-деструктивных изменений клеток и матрикса, но и преимущественной их локализацией.

Полученные результаты могут быть использованы для научных исследований с использованием модельных систем in vivo для выявления механизмов структурно-функциональных изменений хондроцитов и межклеточного матрикса, а также их регуляции.

Разработанная методика количественного исследования суставного хряща может быть применена при изучении патологических изменений, эффектов роста, старения, влияния физических упражнений, иммобилизации, лекарственных препаратов на структуру хряща. Разработанная экспериментальная модель остеоартроза может быть использована для испытания средств профилактики и методов лечения.

Основные положения по результатам исследования, выносимые

на защиту

1. При моделировании ортопедического удлинения голени экспериментальных животных наибольшие структурные преобразования развиваются в поверхностной и глубокой зонах нагружаемых участков хряща коленного сустава, деструктивные изменения и гибель хондроцитов выражены в меньшей степени, чем при моделировании остеоартроза и возрастных инволютивных изменениях.

2. Регенерация суставного хряща в условиях удлинения конечности осуществляется за счет собственных возможностей хондроцитов, пролиферирующих преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах.

3. Применение автодистракции создаёт оптимальные условия для реализации адаптационно-пластических возможностей суставного хряща и повышает реабилитационные возможности метода дистракционного остеосинтеза.

4. При моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением наиболее выраженные деструктивные изменения хондроцитов развиваются в промежуточной зоне, существенная роль в патогенезе принадлежит функциональной и структурной денервации синовиальной оболочки.

Внедрение результатов исследования

Результаты проведённых исследований используются при выполнении плановых научно-исследовательских работ в ФГБУ «Российский научный центр "Восстановительная травматология и ортопедия" имени академика Г.А. Илизарова». Подготовлены методические рекомендации и лекции, которые включены в программу кафедры усовершенствования врачей ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова». Получено 3 патента.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и в эксперименте» (г. Тюмень, 12-14 июня, 2008г.), Всероссийской научной конференции «Нейробиологические аспекты морфогенеза и регенерации» (г.Оренбург, 18-19 ноября, 2008г), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (Цивьяновские чтения, г.Новосибирск, 2010г., 2011г.), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «ИЛИЗАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ» (г.Курган, 2011г., 2012г.), V Всероссийском симпозиуме с международным участием (г. Уфа, 2012г.), 8th International Conference of Skeletal Deformities Correction (Cairo, Egypt, 20-22 June, 2012), Международном Конгрессе AS AMI и BR (Греция, 6-9 июня, 2012г.), Всероссийской научной конференции с международным участием «Актуальные проблемы морфологии, адаптогенеза и репаративных гистогенезов», посвященная памяти чл.-корр. АМН СССР профессора Ф.М. Лазаренко (г. Оренбург, 19-20 ноября, 2013г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 62 работы, из них 27 в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ для публикаций материалов кандидатских и докторских диссертаций, 2 методических рекомендации, 3 патента на изобретения.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 274 страницах машинописного текста (без приложения). Состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов. Работа содержит 197 иллюстраций, 25 таблиц (не считая таблиц приложения). В списке литературы 282 наименования, из них отечественных авторов - 152, зарубежных - 130. Приложение включает 11 таблиц и 4 рисунка.

Связь работы с научными программами

Работа включена в план научно-исследовательской работы кафедры усовершенствования врачей ФГБУ «РНЦ «ВТО» им. акад. Г.А. Илизарова».

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материал и методы исследования. Объекты исследования -суставной хрящ мыщелков бедра с подлежащей субхондральной костью, синовиальная оболочка от 102 собак, распределённых на 7 экспериментальных серий.

В серии «Возрастные изменения» изучены морфологические особенности суставного хряща и синовиальной оболочки в периоды интенсивного физиологического роста (щенки в возрасте от 2 до 10 месяцев), скелетной зрелости (собаки в возрасте 1,5-2 года) и инволютивных изменений (собаки в возрасте 5-8 лет) - всего 25 собак.

В серии «Моделирование остеоартроза» на фоне редуцированного кровоснабжения осуществляли иммобилизацию обоих коленных суставов с пересечением и перевязкой бедренной артерии [Макушин В.Д., Степанов М.А., Ступина Т.А. Патент 2452999 РФ]. Для морфологического исследования собак выводили из опыта через 28, 40 суток после иммобилизации и через 14, 28 и 90 суток, 1 и 3 года после моделирования остеоартроза (период иммобилизации - 28 суток) - всего 20 собак.

Остальные 57 животных составили пять серий с удлинением голени на одинаковую величину - 28 мм (=15%). Серии различались уровнем удлинения (диафиз или метадиафиз), способом дистракции (ручное подкручивание гаек или с помощью автодистрактора), режимом дистракции (скорость в миллиметрах в сутки и дробность), временем её осуществления (круглые сутки, в дневное или ночное время). Конкретные характеристики серий с удлинением голени представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Характеристика опытов с удлинением голени

№ п.п. ДИСТРАКЦИЯ Кол-во опытов (П)

скорость (мм/сутки) длительность (дней) дробность шаг (мм) режим время суток

1 1,0 28 4 0,25 ручной дневное 18

2 1,0 28 60 0,016 авто ночное 10

3 3,0 10 180 0,016 авто круглосут. 9

ЗА 3,0 10 120 0,025 авто круглосут. 14

4* 1,0 28 4 0,25 ручной дневное 6

Примечание * - метадиафизарное удлинение.

В сериях 1 - ЗА через 5 суток после закрытой флексионной остеоклазии начинали дозированное удлинение правой голени на уровне диафиза. После прекращения дистракции костные фрагменты фиксировали аппаратом до формирования корковой пластинки в регенерате, затем аппарат снимали и животных наблюдали еще в течение месяца. Этапы исследования: конец дистракции, месяц фиксации и месяц без аппарата.

В серии 4 через 5 суток после поперечной остеотомии долотом большеберцовой кости на уровне проксимального метадиафиза в течение 28 суток проводили дистракцию по 1 мм в день за 4 приёма. Затем в течение 35

суток голень фиксировали в аппарате до момента консолидации костного регенерата, после чего аппарат снимали. Этапы исследования: конец дистракции и 30 суток без аппарата.

При проведении экспериментов соблюдали требования Министерства здравоохранения Российской Федерации к работе эксперимент&чьно-биологических клиник [приказ МЗ СССР №755 от 1977г., Федеральный закон принятый Государственной Думой 1 декабря 1999 г. «О защите животных от жестокого обращения», «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» согласно приказу МЗ СССР №755 от 12.08.1987г], а также «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей». Все манипуляции, проводимые на животных, были рассмотрены и одобрены этическим комитетом «РНЦ «ВТО» им. академика Г.А. Илизарова». Оперативные вмешательства выполняли под тиопенталовым внутривенным наркозом, животных выводили из опыта передозировкой барбитуратов.

Методы исследования: экспериментальный, рентгенологический, гистологический, гистохимический, иммуногистохимический,

стереологический, статистический, сканирующая электронная микроскопия, рентгеновский электронно-зондовый микроанализ, информационные технологии: гистоморфометрический компьютерный анализ транспортированных по локальной сети полноцветных цифровых изображений гистологических препаратов.

Регистрировали функциональное состояние оперированной конечности. Суставные поверхности оценивали макроскопически (форма, контур, цвет). Изображения макропрепаратов оцифровывали и анализировали на АПК «ДиаМорф» (Москва).

Для морфологического исследования на светооптическом уровне часть материала обрабатывали по общепринятым гистологическим методикам. Изготавливали целлоидиновые и парафиновые срезы. Гистологический метод включал следующие методики окраски: гематоксилин-эозин, метиленовый синий - основной фуксин, ван Гизон, трихром по Массону пропись с анилиновым синим. Гистохимические методы - альциановый синий при рН 1,0 и 2,5, толуидиновый синий, метиленовый синий (выявление сульфатированных и несульфатированных гликозаминогликанов), окраска сафранином и альциановым синим (для оценки биосинтетической активности клеток по степени конденсации хроматина). Иммуногистохимический метод - анализ топографии и интенсивности пролиферации хондроцитов с помощью маркера ¥л-61.

Исследования и оцифровку изображений гистологических препаратов проводили с помощью фотомикроскопа фирмы "Ор1оп" (Германия) с АПК "ДиаМорф" (Москва).

В процессе экспериментальных исследований суставного хряща животных разработана адаптированная к объекту методология его

количественного исследования, включающая единую технологию изготовления микропрепаратов [Ступина Т.А., Щудло М.М. Патент 2466375 РФ]. Оптимальными для определения морфометрических и стереометрических параметров структур суставного хряща (диаметр хондроцитов 10-20 мкм), являются полутонкие эпоксидные срезы толщиной 0,5-1,0 мкм; однако их малая - до 1 мм2 - стандартная площадь затрудняет получение репрезентативных выборок изображений для стереологических исследований. Чтобы преодолеть это противоречие, мы разработали и апробировали в повседневной практике ряд технических приемов, позволивших увеличить площадь полутонких срезов (0,5-1,0 мкм) до 4-8 мм2. Использование полутонких срезов увеличенной площади позволило оцифровывать достаточное количество качественных изображений для формирования репрезентативной выборки и получать достоверные количественные характеристики объекта, пренебрегая эффектом Холмса.

Стереологический анализ проводили по сериям полутонких (0,5-1,0 мкм) срезов увеличенной площади, исследовали каждый 20-ый срез. Ввод полей зрения рядами, ориентированными строго по длиннику среза, обеспечивал получение наиболее репрезентативной выборки. Выборку формировали тотально, при этом количество анализируемых структур, целиком попавших в поле зрения, оказывается максимальным.

Для количественной оценки состояния суставного хряща определяли комплекс параметров: толщина хряща (h, мкм); численная плотность хондроцитов (NAcb, N/мкм"2); рассчитывали долю пустых лакун (NNem.iac, %) и долю хондроцитов в составе изогенных групп (NNis.gr., %) от общего количества хондроцитов; определяли объемную плотность хондроцитов (Vvch, %); площадь хондроцитов (Sch, мкм2).

Для характеристики функциональной активности хондроцитов в поверхностной, промежуточной и глубокой зоне хряща анализировали в среднем 100-150 клеток. Определяли параметры: объемная плотность ядра (Vv„, в долях единицы); объемная плотность цитоплазмы (VVc> в долях единицы); ядерно-цитоплазматический индекс (NCI); минимальный и максимальный диаметры (dmin> draax, мкм) клеток и их ядер; фактор формы (Ff, в долях единицы) клетки и ядра.

В синовиальной оболочке определяли толщину покровного слоя (мкм), количество рядов синовиальных клеток, численную плотность микрососудов в 1 мм2.

Гистоморфометрические исследования выполнены с помощью программ «DiaMorph Medias» (Россия, Москва) и «ВТ-Мастер-Морфология» (фирма "ВидеоТест", Россия, Санкт-Петербург). Измерения проводили в микрометрах после предварительной геометрической калибровки по оцифрованной с тем же увеличением шкале объект-микрометра, результатом которой является таблица автоматической калибровки в программе «Medias».

Для изучения рельефа суставной поверхности разработан и

адаптирован к объекту способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе [Силантьева Т.А., Горбач Е.Н., Ирьянов Ю.М., Ступина Т.А., Варсегова Т.Н. Патент 2397472 РФ]. Фиксированные в альдегидном фиксаторе кусочки промывали в дистиллированной воде, затем материал дегидратировали в спиртах, пропитывали в камфене (3,3-диметил-2-метиленбицикло[2,2,1]гептан), высушивали на воздухе, напыляли алюминием, медью или серебром в вакуумном напылителе «JEE-4 Х/5 В» (Eiko, Япония) и ионном напылителе «IB-6» (Eiko, Япония) и изучали в сканирующем электронном микроскопе «JSM-840» (Jeol, Япония).

Для рентгеновского электронно-зондового микроанализа поверхности эпоксидных блоков после изготовления полутонких срезов увеличенной площади напыляли алюминием, медью или серебром и исследовали на рентгеновском электронно-зондовом микроанализаторе «INKA Energy 200» (Oxford Instrumets Analytical, Англия), смонтированном на сканирующем электронном микроскопе «JSM-840» (Jeol, Япония), при ускоряющем напряжении 20 кэВ. Определяли распределение и концентрацию кальция и серы в суставном хряще наружного мыщелка бедра в различные периоды чрескостного дистракционного остеосинтеза. На всех этапах работы соблюдали одинаковые условия эксперимента и обработки материала по методикам.

Анализ цифрового материала был проведен общепринятыми для медико-биологических исследований методами вариационной статистики в программе Microsoft Excel 97 (программное обеспечение Attestât, версия 1.0, Гайдышев И.П., 2003). После получения параметров описательной статистики анализировали характер распределения в вариационных рядах, относящихся к индивидуальным выборкам. Индивидуальные выборки были объединены в одну общую (генеральную) совокупность после статистической проверки нулевой гипотезы о межиндивидуальных различиях. В зависимости от характера распределения и объема выборок использовали либо критерий Вилкоксона, либо критерий Стьюдента [Автандилов Г.Г., 1990; Гайдышев И.П., 2001].

В работе использовали приемы количественной телепатологии, относящиеся к «новым информационным технологиям» [Юсупов P.M. с соавт., 1998]: для количественного исследования цифровые изображения микропрепаратов суставного хряща транспортировали по телекоммуникационным каналам — локальной учрежденческой компьютерной сети. Первичный материал и результаты его обработки архивировали в базы данных разного уровня: оперативный архив формировали на жестком диске компьютера, тактический и стратегический -на компакт-дисках (CD-RW и CD-R соответственно). По нашему опыту, такая трехуровневая система необходима и достаточна для сохранности

информации, и, в то же время, обеспечивает условия для текущего и ретроспективного анализа данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гистоморфометрическая характеристика суставного хряща и синовиальной оболочки шгтактных собак в разные возрастные периоды.

В процессе роста организма суставной хрящ претерпевал значительные морфологические преобразования. Полученные нами данные согласуются с литературными [Модяев В.П., 1983], в раннем постнатальном периоде онтогенеза популяция клеток суставного хряща представлена малодифференцированными, высокодифференцированными и

деградирующими хондроцитами. С ростом организма соотношение клеток менялось - возрастало количество высокодифференцированных форм.

В верхнем и среднем слоях хряща щенков 2-х месяцев NCI хондроцитов был больше и/или равен 1, что характерно для малодифференцированных клеток. В более глубоких слоях хряща клетки характеризовались высокой функциональной активностью: имели больший по сравнению с ядром объем цитоплазмы, в которой содержались секреторные включения, NCI составил в среднем 0,48±0,03. В последующие возрастные периоды наблюдалось увеличение в большей степени объемной доли цитоплазмы, чем ядра, наиболее выраженной в промежуточной зоне. У щенков 4-х и 10-ти месяцев выявлено снижение NCI во всех зонах (за исключением поверхностной зоны в 10 мес.), относительно предыдущего возрастного периода. В последующие возрастные периоды (в 2 года и в 8 лет) значения NCI продолжали снижаться, в поверхностной зоне до 0,75+0,03 и 0,55±0,05, в промежуточной до 0,27±0,01 и 0,23±0,03, в глубокой до 0,25+0,01 и 0,15±0,02 соответственно. С возрастом в большей степени снижались значения NCI хондроцитов в промежуточной и глубокой зонах. В возрасте 5-ти и 8-ми лет часть клеток находилась в неактивном состоянии либо в фазе дегенерации.

С ростом организма морфометрические показатели суставного хряща характеризовались тем, что увеличиваюсь количество основного вещества, при этом количество клеток и изогенных групп уменьшалось (табл. 2), снижалась способность клеток к пролиферации, сохранялась способность к синтезу компонентов межклеточного вещества. Особенностью суставного хряща мыщелков бедра собак являлось преобладание матрикса над клетками, доля клеточного компонента в исследуемом объекте в разные возрастные периоды составляла от 11,17 до 4,68% от общего объема. В 2 месяца постнатальной жизни у щенков отсутствовала цитоархитектоника, характерная для зрелого суставного хряща. Матрикс средней части хряща и более глубоких слоев содержал сосуды. Зональное строение суставного

хряща прослеживалось только с четырехмесячного возраста.

По мнению Н. Вгошшег et а1. (2005), хрящ новорожденного «биомеханически белый» и потому гистологически гомогенный, но функциональная адаптация к механическим нагрузкам имеет место уже в ранней постнатапьной жизни и результатом является всё более отчётливая гетерогенность морфофункциональных характеристик.

После четырех месяцев у щенка начинается новый период онтогенеза -ювенильный, или как его иначе называют, подростковый или предадультный, т.е. предшествующий взрослению. В этот период наблюдается интенсивный рост щенка, с 4-х до 10 месяцев происходит особенно бурный рост длинных костей (щенок растет в высоту). В возрасте 6 и 10 месяцев в суставном хряще выявлено увеличение количества пустых лакун относительно предыдущих возрастных периодов (табл.2). В возрасте 10 месяцев отмечено нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, снижалась объемная плотность хондроцитов. К 1,5-2 годам гомогенность межклеточного вещества поверхностной зоны восстанавливалась, снижалось количество пустых лакун, увеличивалась объемная плотность хондроцитов (табл. 2). Аналогичные изменения были выявлены при исследовании суставного хряща коленного сустава человека в подростковом возрасте [Ахмедов Ш.Н. с соавт., 2002].

Таблица 2. Количественные характеристики суставного хряща собаки в разные возрастные периоды

Параметры (%,М±а) (М± а) (%) NN¿¡.¡1. (%) Ь хряща (мкм, М+ш)

2 месяца 7,81+2,81 19,05±8,21 5,4 25,62 1641,29+13,91

4 месяца 1Х,17±5,17 16,08±5,18 8,09 31,58 1521,59±18,9

б месяцев 6,33*2,47 14,21+3,82 15,9 15,45 543,42+8,21

10 месяцев 5Д1±1,43 12,22+5,62 14,18 27,85 525,53±1,11

2 года 9,03±4,54 6,15±2,45 13,6 14,51 475,55±1,31

5 лет 4,68±1,36 4,37±1,62 38,8 24,65 463,87±1,61

8 лет 8,61±2,75 10,42±4,53 28,18 16,45 449,12+3,51

Примечание: жирным шрифтам выделены достоверные различия с предыдуирш возрастным периодом. Для параметров Шцр. • р<0,05, для А хряща-р<0,001.

К инволютивным изменениям можно отнести нарушение гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, изменение окраски межклеточного вещества (снижение интенсивности, очаговое окрашивание), отсутствие колончатого расположения клеток в глубокой зоне, нарушения базофильной линии (размытые контуры, фрагментация) и проникновение сосудов со стороны субхондральной зоны. Морфологическая организация хрящевой ткани суставов в возрасте 5-ти и 8-ми лет свидетельствовала о наличии деструктивно-дегенеративных процессов, выраженных во всех зонах

хряща, но интенсивнее в глубоких слоях (глубокая зона, зона кальцифицированного хряща) и субхондральной кости.

Выраженные признаки инволютивных преобразований, выявленные в 5 лет постнатальной жизни собак, включали минимальные по сравнению с другими возрастными периодами показатели содержания серы (табл. 3), численной и объёмной плотности хондроцитов суставного хряща (табл. 2), но максимальную площадь хондроцитов его поверхностной зоны. В этот период, по сравнению с двухлетним возрастом, значительно увеличены доля пустых лакун, доля изогенных групп (табл. 2), содержание кальция (табл. 4).

По данным Ш.М. Ахмедова с соавт., (2002) выявленные скачкообразные изменения морфометрических параметров суставного хряща человека в пожилом и старческом возрасте не свидетельствуют о функциональной активности, а являются показателем деструктивных изменений, что, по-видимому, не обеспечивает адаптации хряща к факторам нагрузки.

Таблица 3. Изменение содержания серы (вес. %) в суставном хряще собаки с возрастом

Возраст Концентрация серы (М*т) в вес. %

Поверхностная зона Промежуточная зона Глубокая зона Во всех зонах

2 месяца 0,21 ±0,05 0,29*0,06 0,53*0,06 1,03*0,05

4 месяца 0,27±0,03 0,34±0,04 0,53±0,02 1,14*0,02

6 месяцев 0,29*0,03 0,36±0,05 0,51±0,02 1,16±0,03

10 месяцев 0,28±0,05 0,35*0,02 0,38±0,02 1,01±0,04

1,5-2 года 0,35±0,01 0,4±0,04 0,52±0,02 1,26*0,02

5 лет 0,20*0,02 0,35*0,04 0,37*0,02 0,92*0,03

8 лет 0,33±0,03 0,52±0,01 0,63*0,04 1,43*0,03

Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные различия с предыдуирм возрастным периодом (р<0.05).

Таблица 4. Изменение содержания кальция (вес. %) в суставном хряще

Возраст Концентрация кальция (М±т) в вес. % в хряще Концентрация кальция (М*ш) в вес. % в зоне кальцифицированного хряша

1 месяца 0,08*0,02

4 месяца 0,12*0,02 5,52*2,11

6 месяцев 0,12*0,02 10,72*038

10 месяцев 0,14*0,02 14,28*2,36

1,5-2 года 0,15*0,02 20,22*0,34

5 лет 0,27*0,03 26,16*3,04

8 лет 0,41*0,08 29,51*7,52

Примечание: жирнъьм шрифтом выделены достоверные различия с предыдуирш возрастным периодом (р<0,05).

В возрасте 8 лет площадь хондроцитов промежуточной зоны достигала максимума, и по сравнению с двухлетним возрастом на 13,5% было увеличено содержание серы, но и содержание кальция увеличивалось (табл.

4). Возможно, в период от 5 до 8 лет в хряще развиваются компенсаторно-приспособительные изменения, препятствующие дальнейшему старению, зарегистрировано повышение значений доли хондроцитов в составе изогенных групп в общем объеме выборки (табл. 2).

С возрастом наиболее функционально важный участок синовиальной оболочки — покровный слой на большем протяжении истончался, лишался клеточных элементов, и практически атрофировался, отмечены участки гиперплазии, в которых повышено содержание макрофагапьных синовиоцитов и клеток с повышенной пиноцитозной активностью. Наиболее выраженные изменения сосудов и особенно нервов субсиновиального слоя обнаружены в возрасте 5 лет. Расширение капилляров и венул, фиброз и отёк субэндотелиального слоя, выраженный в артериолах и венах, сопровождались увеличением численной плотности микрососудов по сравнению с другими возрастными периодами. В это же время в некоторых нервах субсиновиального слоя обнаруживались признаки нарушений циркуляции эндоневральиой жидкости и практически полная деструкция нервных волокон.

Структурная реорганизация суставного хряща, субхондральной кости и синовиальной оболочки при моделировании остеоартроза (МОА) с редуцированным кровоснабжением.

При моделировании остеоартроза (период иммобилизации 28 суток) обнаруживались дефекты суставной поверхности с лотерей матрикса и очагами разволокнения (рис. 1), которые в отдельных наблюдениях углублялись до промежуточной зоны. Гомогенность межклеточного вещества поверхностной зоны была нарушена, а интенсивность реакции на сульфатированные гликозаминогликаны существенно снижена. Наряду с этим выявлено неравномерное окрашивание базофильной линии, её фрагментация, нарушение целостности, проникновение костномозгового паннуса.

Рис. 1. Суставная поверхность мышелка бедра собаки. Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. СЭМ. Увеличение 400.

Обнаружено снижение содержания серы по сравнению с контролем: в поверхностной зоне в 1,8 раза, промежуточной - в 1,4 раза и глубокой - в 1,7 раза. По сравнению с интактными 8-летними животными у животных в возрасте 1-2 года с моделированием остеоартроза выявлено существенное снижение толщины хряща (на 37,7%), значительно увеличивалась доля пустых лакун и снижалась доля хондроцитов в составе изогенных групп. При этом хондроциты уменьшались в размерах, и повышалась клеточная плотность в поверхностной зоне.

Необходимо отметить, что в данных условиях эксперимента наиболее уязвимым оказались хондроциты промежуточной зоны (рис.2), которые равноудалены от васкулярного и синовиального факторов питания (около 50% клеток в состоянии деструкции).

Рис. 2. Хондроциты промежуточной зоны суставного хряща собаки на разных стадиях деструкции (монтаж). Срок эксперимента 28 суток иммобилизации. Полутонкий срез, окраска метиленовым синим - основным фуксином. Об. - 100МИ; ок. -12,5х.

Известно, что физиологическое самовосстановление структуры суставного хряща осуществляется механизмами интерстициального роста -благодаря постоянно поддерживающейся репродукции хондроцитов в промежуточной зоне [Мажуга П.М., 1999]. Выявленная последовательность событий свидетельствовала о том, что в прогрессировании остеоартроза ведущая роль принадлежала нарушениям функции хондроцитов и последующей их гибели.

Установлено, что перевязка бедренной артерии и иммобилизация коленного сустава в изученной нами экспериментальной модели приводят к очаговой гиперплазии синовиальной оболочки (рис. 3), гиповаскуляризации и частичной потере иннервации субсиновиального слоя; изменения синовиальной оболочки свидетельствовали о синовите значительной степени выраженности.

Оценка выраженности синовита по шкале V. Кгепп й а1, (2006), свидетельствовала о выраженном и медленно прогрессирующем синовите в период от 28 до 40 суток иммобилизации (от 6-7 до 7-8 баллов).

дШ^^МЮД^РН?!1, тктрЯ ■ич^г-.. » м^злши

Рис.3. Выраженная гиперплазия синовиальной оболочки коленного сустава собаки при моделировании остеоартроза. А - синовиоциты покровного слоя расположены в 2-4 слоя. В субсиновиальном слое липоматоз. Об. - 16; ок. -12,5х. Б - синовиоциты макрофагального типа. Об. - 100МИ; ок. - 12,5х. Полутонкий срез. Окраска метиленовым синим - основным фуксином.

В мыщелках бедренной кости отмечен остеопороз, очаговый остеосклероз субхондральной зоны, нарушение микроциркуляции - агрегация эритроцитов и «предтромбоз» кровеносных сосудов микроциркуляторного русла.

Таким образом, вследствие нарушения кровообращения и ограничения функции в суставном хряще развивается трофическая недостаточность, обусловленная с одной стороны патологическими изменениями субхондральных отделов, осуществляющих питание глубоких слоев хряща, с другой - изменениями синовиальной оболочки, питающей его поверхностные слои.

Наблюдаемые изменения являлись следствием нарушения обменных процессов (ремоделирования) суставного хряща, синовиальной оболочки и субхондральной кости, свидетельствующих о снижении синтеза и преобладании катаболических процессов. Выявленные морфологические изменения соответствовали ранним стадиям остеоартроза - степень 1-3 (по гистологической классификации Международного общества изучения остеоартроза ОАЯ81, 2006).

Через 14 суток после МОА сохранялись очаги разволокнения суставной поверхности. Репаративная регенерация хряща выражалась увеличением количества клеток, объемной плотности хондроцитов и количества изогенных групп с функционально активными клетками,

незначительным увеличением содержания серы относительно MOA. Толщина хряща в срок 14 и 28 суток после MOA достоверно (р<0,001) превышала значения MOA и контроля (табл.5), что обусловлено более выраженной дезорганизацией межклеточного, вещества поверхностной зоны, набуханием основного вещества и коллагеновых волокон.

Через 28 и 90 суток после моделирования остеоартроза в промежуточной зоне выявлены бесклеточные поля, в глубокой зоне отсутствовало колончатое расположение клеток, снижалось содержание серы (табл. 5). В отдаленные сроки эксперимента у собак в возрасте 3-х, 5-ти лет через 1 и 3 года после моделирования остеоартроза деструктивные изменения прогрессировали, подавлена пролиферация хондроцитов, отмечено нарушение цитоархитектоники, демаскировка коллагеновых волокон во всех зонах, нарушение целостности базофильной линии, проникновение сосудов в хрящ.

Таблица 5. Количественные характеристики суставного хряща собаки при

Параметры h (мкм, M±m) NA«h (мм*", М±а) (%) NNu.g> (%) VV[h (%,М±ст) fflS (вес.%)

Контроль 475,55±1,3I 6,15±2,45 13,61 14,52 9,03+4,54 1,26±0,02

MOA 318,61±2,75 5,41±2,13 43,39 13,85 4,61±1,6S 0,70±0,02

14 «уток после MOA 563,21±13,15 * 5,74+2,62 31,35 16,24 5,52+2,49 * 0,81±0,025 *

28 суток после MOA 510,98±1,82 * 6,42±2,37 * 35,73 16,19 5,46±2,44 * 0,72+0,015

90 суток после MOA 326,67±6,37 7,61±2,22 * 40,38 8,91 6,09±2,05 * 0,56±0,037 *

Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные отличия с контролем.

* - с моделью остеоартроза, для параметров ГУЛ ЫАЛт„„ы.. Жьг. и а>5-р<0,05, для И Тр<0,001.

Если в суставном хряще интактых животных в возрасте 5-ти, 8-ми лет развивались компенсаторно-приспособительные изменения, препятствующие дальнейшему старению, то после моделирования остеоартроза у собак в возрасте 3-х, 5-ти лет влияние дополнительных факторов (иммобилизация сустава и редуцированное кровоснабжение конечности) привело к ускоренной дегенерации хряща, опережающей инволютивные изменения.

Результаты исследования структурной реорганизации суставного хряща при диафизарном удлинении конечности.

В экспериментальных сериях 1, 2, 3 исследование структурной реорганизации нагружаемых участков суставного хряща позволило выявить существенные отличия влияния режима дистракции на состояние хряща. Наиболее выраженное разволокнение коллагенового каркаса и узурирование

суставной поверхности выявлены при ручной дистракции с темпом 1 мм за 4

Рис. 4. СЭМ, суставная поверхность мыщелка бедра собаки. Конец дистракции. А — серия 1 (1 мм за 4 приема), увеличение 850, Б - серия 2 (1 мм за 60 приемов, ночь), увеличение 2000, В - серия 3 (3 мм за 180 приемов),

увеличение 900.

При микроскопии полутонких срезов во всех сериях обнаружено нарушение гомогенности межклеточного вещества, снижение интенсивности его окрашивания основными красителями, выявлены очаги разволокнения. В очагах разволокнения хондроциты аномальной формы, часть из них с пикнотичными ядрами, в состоянии гибели. Наиболее выраженные деструктивные изменения - вплоть до запустевания отдельных участков поверхностной зоны - выявлены при режиме дистракции 1 мм за 4 приема.

Сравнительный анализ долей пустых клеточных лакун (Мнеш.ыс.) в суставном хряще интактных и экспериментальных собак обнаружил существенную разницу в степени выраженности деструктивного процесса в зависимости от режима дистракции. Максимальные значения 1М№т1ас к концу дистракции выявлены в серии 1 (рис. 5). Через месяц после снятия аппарата в серии 2 значения Ы№т.[ас. снижались и были сопоставимы с контролем, в сериях 1 и 3 сохранялись повышенные значения._

• контроль 1 мм 'in 4 приема

—¿г— 1 мм ча 60 приемов (ночь) ««ф^з мм за 1S0 приемов

—i *---

< > < > -i

конец дйе1р акции ЗОдией фиксации ЗОдней без аппарата Ось абсцисс - срок эксперимента, ось ординат - доля пустых клеточных лакун в общем объеме выборки.

Рис. 5. Доля пустых клеточных лакун (Шего.|ас.,%) в суставном хряще на этапах эксперимента.

Во всех сериях, кроме серии 2, были отмечены единичные нарушения целостности базофильной линии, проникновение костномозгового сосудистого паннуса в хрящ.

Наибольшее количество деструктивно измененных хондроцитов наблюдалось в поверхностной и глубокой зонах и сопровождалось снижением стереологических параметров - толщины хряща, численной и объемной плотностей хондроцитов (рис, 6).

Ось абсцисс

Ехоятрозь

£31 .>т за 60 прлелов (ночь)

□ 1 г-ш за 4 приема ■ Зим за 1&0орягмог

контроль конец 30 дней 30 дней без

дястракош фиксации аппарата

В контроль

н 1 з» аа б? прнеяоз (ночь;

□ 1 им за 4 приема ■ 3 аса га 180 яр пемоз

конеа днстракцнн

30 дней без аппарата

- срок эксперимента, ось ординат - объемная плотность хондроцитов. * - достоверные отличия с контролем (р<0,05).

Рис. 6. Динамика объемной плотности хондроцитов в поверхностной (А) и глубокой (Б) зонах суставного хряща собаки на этапах эксперимента.

В неповрежденных участках хондроциты демонстрировали реактивные изменения адаптивного характера, проявляющиеся активизацией пролиферативных (увеличены доля хондроцитов в составе изогенных групп в общем объеме выборки, численная плотность клеток промежуточной зоны) и биосинтетических (гипертрофия клеток во всех зонах и, особенно, в неповрежденных участках поверхностной зоны, снижение ядерно-цитоплазматического индекса) процессов, за счет которых осуществлялась регенерация хряща.

Так, во всех сериях на протяжении всего эксперимента процентная доля хондроцитов в составе изогенных групп от общего количества хондроцитов была выше нормы (рис. 7А).

•контр оль 1 мм за 4 приема

-1 мм за 60 приемов (ночь) «««8»°»з мм за 180 приемов

конец дистракции ЗОдней фиксации 30дней бе? аппарата

Ось абсцисс - срок эксперимента, ось ординат - доля хондроцитов в составе изогенных групп клеток в

общем объеме выборки.

В контроль

В I ус-1 за 60 приемов (ночь)

□ 1 мм за 4 приема ■Э5Ш 150 приемов

кояеи дистракции

Ось абсцисс - срок эксперимента, ось ординат - численная плотность хондроцитов. * - достоверные отличия с контролем (р<0,05).

Рис. 7. Доля хондроцитов в составе изогенных групп клеток (А) и динамика численной плотности хондроцитов промежуточной зоны (Б) суставного хряща собаки на этапах эксперимента.

К концу периода дистракции максимальные значения Nffo.gr отмечены при 4-х кратной дистракции, что связано с увеличением числа двуядерных клеток и изогенных групп в неповрежденных участках поверхностной зоны. Через месяц фиксации в сериях с автодистракцией отмечена тенденция к дальнейшему увеличению данного параметра, максимальные значения NNis.gr отмечены при автодистракции с темпом 1 мм. При 4-х кратной дистракции данный показатель на этапах фиксации и месяц после снятия аппарата ниже сравниваемых серий, в части изогенных групп хондроциты находились в состоянии деструкции. К концу эксперимента во всех сериях сохранялись

повышенные значения NNis.gr, максимальные значения отмечены при автодистракции с темпом 3 мм за 180 приемов.

Численная плотность клеток промежуточной зоны во всех сериях превышала контроль либо была сопоставима с контролем (рис. 7Б). При автодистракции с суточным темпом 1 мм увеличение численной плотности хондроцитов относительно контроля наблюдалось только на аппаратном этапе и было выражено в меньшей степени по сравнению другими сериями.

Во всех сериях наибольшая частота встречаемости изогенных групп клеток наблюдалась в верхней части промежуточной зоны. Необходимо также отметить наличие изогенных групп клеток и в неповрежденных участках поверхностной и глубокой зоны.

Фактор пролиферации - белок Ki67 во всех сериях был выявлен в виде окрашенного в коричневый цвет ядерного субстрата хрящевых клеток преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах (рис. 8).

Рис. 8. Характер экспрессии Кл 67 хондроцитами суставного хряща сойаы при удлинении голени в режиме 1 мм за 4 приема, фиксация 30 суток. Общий вид суставного хряща (А). Ок. - 6,3; об. - 12,5х. Поверхностная и верхние слои промежуточной зоны (Б), промежуточная зона (В). Об. - 16; ок. - 12,5х.

Во всех опытах с удлинением голени на протяжении всего эксперимента в неповрежденных участках поверхностной зоны выявлено снижение (р<0,05) NCI хондроцитов в связи с более значительным ростом объемной доли цитоплазмы по сравнению с ядром, наиболее выраженным на аппаратном этапе при автодистракции. Динамика изменений NCI на этапах эксперимента при автодистракции с темпом 1 мм за 60 приемов (ночь) и 3 мм за 180 приемов имела одинаковый характер и свидетельствовала об усилении биосинтетической активности клеток поверхностной зоны. Наименьшее снижение NCI на аппаратном этапе эксперимента выявлено при ручной дистракции с темпом 1мм за 4 приема (рис. 9).

когггроаь -H^l MMia4np;I«ra.

—1 ,з50прп«юв{я&ч=/ —3 >c; я ISOnpHeMos

___________

—■—-"""""*"'

конецзнстрякцкй ЗОдней фиксации ЗОдиейбе! аппарата

Ось абсцисс - срок эксперимента, ось ординат - ядерно-цкгоплазматический индекс.

Рис. 9. Динамика ядерно-цитоплазматического индекса (NCI) хондроцитов поверхностной зоны суставного хряща собаки на этапах эксперимента.

Судя по увеличению фактора формы и минимального диаметра, клетки округлялись, что подтверждает сканирующая электронная микроскопия (рис. 10), в то время как в норме клетки поверхностной зоны узкие продолговатой

Рис. 10. Хондроциты поверхностной зоны суставного хряща собаки, СЭМ. А - контроль, увеличение 8500, Б - серия 1 (1 мм за 4 приема), 30 суток фиксации, увеличение 3000.

В промежуточной и глубокой зонах хряща максимальные количественные характеристики клеток и их ядер при автодистракции в ночное время с темпом 1 мм за 60 приемов выявлены в срок 30 суток фиксации, а при автодистракции с повышенным суточным темпом 3 мм за 180 приемов — через месяц после снятия аппарата. В этой серии этап дистракции укорочен на 18 суток, и адаптационные процессы развились на более позднем этапе. При ручном режиме дистракции с темпом 1 мм за 4 приема максимальные количественные характеристики клеток и их ядер в

промежуточной зоне выявлены в срок 30 суток фиксации, в глубокой зоне в срок 30 суток после снятия аппарата.

Известно, что увеличение размеров ядер коррелирует с усилением белкового синтеза или с повышенным содержанием ДНК [Данилов Р.К. с соавт., 2000]. Увеличение параметров, характеризующих размер и форму клеток и их ядер, свидетельствовало об усложнении структуры хондроцитов, усилении биосинтетической и пролиферативной активности.

Комплекс стереологических и цитометрических показателей свидетельствовал о более щадящем характере режима высокодробной автодистр акции с темпом 1 мм. Наиболее существенный результат проведённых исследований - установлена возможность полноценной репарации хряща коленного сустава при автодистракции, осуществляемой в течение 12 часов (с 21 часа до 9 часов) с темпом 1 мм за 60 приёмов. Через 30 суток после снятия аппарата (срок эксперимента 93 суток) микроскопическая структура суставной поверхности была сопоставима с интактной (рис.11),

Рис. 11. СЭМ, суставная поверхность мыщелка бедра собаки. 30 суток после снятия аппарата. А - серия 1 (1 мм за 4 приема), увеличение 650, Б - серия 2 (1 мм за 60 приемов, ночь), увеличение 800, В - серия 3 (3 мм за 180 приемов), увеличение 800.

■Еоатроль а 1ьш за 4 приема ■ I Mil за 60 приемов (ночь) S3 мм за ISO приемов SOO --—-----

700 ----Щ-—-

d00 - ----|§--~

контроль конец ЗОдней ЗОднепбез

дпстракппп фпксанпп аппарата

Ось абсцисс - срок эксперимента, ось ординат - толщина суставного хряща. Достоверные отличия с контролем, р<0,001 - *

Рис. 12. Динамика толщины суставного хряща собаки на этапах эксперимента.

Выявленные изменения суставного хряща при высокодробной дистракции в режиме 1 мм за 60 приёмов в ночное время наиболее приближены к процессу интенсивного естественного роста по сравнению с другими изученными режимами. В отличие от ранее изученного аналогичного режима автодистракции в дневное время, при котором к концу периода дистракции более выражены изменения межклеточного вещества [Щудло ММ. с соавт., 2005], при ночном режиме более повреждены клетки, в конце эксперимента выявлены признаки снижения пролиферативной активности, а в промежуточной и глубокой зонах - признаки постпролиферативной терминальной дифференцировки хондроцитов.

При таком же шаге высокодробной автодистракции (0,017 мм) были проведены эксперименты с увеличенным суточным темпом (3 мм в сутки за 180 включений автомата). В этой серии в конце опыта в отдельных участках суставной поверхности обнаруживались вскрытые клеточные лакуны, не восстанавливалась толщина хряща, однако динамика количественных параметров указывала на усиление и биосинтетической, и пролиферативной активности клеток, что свидетельствовало о возможности дальнейшей реституции. Наиболее вероятные причины, определяющие разницу деструктивно-пролиферативных и адаптационно-пластических изменений суставного хряща при дистракции разной дробности - различия в величине «разового удлинения». По-видимому, снижение этого параметра позволяет перевести в более щадящий режим взаимосдавление суставных поверхностей («компрессию суставов») и создать более благоприятные условия для адаптационных реакций сосудистого русла и нервных образований, от состояния которых зависит трофика хряща.

В сериях 3 и ЗА проведено сопоставительное исследование результатов высокодробной автодистракции («3 мм за 180 приёмов» и «3 мм за 120 приёмов»). По существу исследовался вопрос о том, влияет ли на состояние суставного хряща увеличение разового удлинения от 17 мкм до 25 мкм. В обеих сериях в период дистракции деструктивные изменения интенсивнее выражены в поверхностной и глубокой зонах хряща. Очаги разволокнения имели мозаичный характер, частота встречаемости и глубина разволокнения увеличены в серии «3 мм за 120 приемов».

Морфометрический анализ (табл. 6) выявил к этому сроку эксперимента в обеих сериях одинаковое снижение толщины хряща, различия между сериями не достоверны. При практически одинаковых значениях доли пустых лакун доля хондроцитов в составе изогенных групп в серии «3 мм за 120приемов» резко снижена по сравнению с контролем, а в серии «3 мм за 180 приемов» увеличена (табл.6).

Площадь хондроцитов поверхностной зоны снижена в обеих сериях, но более значительно в серии «3 мм за 120 приемов». В промежуточной зоне в серии «3 мм за 120 приемов» выявлено более сильное снижение не только площади, но и объемной плотности хондроцитов, увеличена доля

бесклеточных полей. В глубокой зоне в серии «3 мм за 180 приемов» площадь хондроцитов не отличалась от контроля, а в серии «3 мм за 120 приемов» резко снижена. По-видимому, к концу дистракции в серии «3 мм за 120 приемов» происходит более выраженное снижение биосинтетической и пролиферативной активности хондроцитов, чем в серии «3 мм за 180 приемов».

В срок 30 суток фиксации толщина хряща и размерные характеристики хондроцитов в серии «3 мм за 180 приемов» возрастали по сравнению с предыдущим сроком, а в серии «3 мм за 120 приемов» продолжали снижаться. Через 30 суток без аппарата толщина хряща в обеих сериях относительно предыдущих этапов эксперимента увеличивалась, но не достигала контроля, максимальные значения отмечены в серии «3 мм за 180 приемов», различия между сериями достоверны (табл. 6).

Таблица 6. Количественные характеристики суставного хряща собаки при

Параметры vvch (%М±а) NA«h (мкм"2М±о) SA (мкм2,М±о) h (мкм, М±т) ^"''^JTltiC (%) NNttg, (%)

Контроль

Контроль I 6,1212,43 8,21±2,19 45,34+10,51 475,5511,31 13,6 14,5

П 8,75±2,54 4,45+1,34 119,91+24,37

III 12,2613,21 5,73±2,15 129,31+28,14

3 мм за 120 приемов (серия ЗА!

10 суток I 5,45+1,17* 9,32+2,87* 14,5117,79* 379,72+3,79 25,3* 6*

дистракции II 3,5611,85* 3,81±2,19* 31,62119,91*

III 4,6511,49* 4,98±1,51* 51,15116,39*

30 суток I 3,2610,81* 12,4113,23* 13,21+2,92* 366,7512,61 21,4* 19*

фиксации II 4,6511,11* 8,7812,56* 38,13+11,23*

III 4,37+1,48* 5,67+2,36 53,26+6,59*

30 суток I 3,66Ю,59* 12,25+1,98* 24,3+2,83* 427,5512,52 17,8* 23,7*

без II 4,42±0,89* 6,63±2,05* 56,7416,72*

аппарата III 5,73±1,27* 5,64±2,76 83,46113,96*

3 мм за 180 приемов (серия 3)

10 суток I 4,1511,35*. 8,0112,04. 29,4119,05*» 375,7611,8 25,9* 18,8*

дистракции II 4,6812,26*. 5,31+2,43*. 46,95+4,05*. *

III 5,54+1,73*« 4,03±1,88*. 91,28+18,12*.

30 суток I 4,52±0,94*. 5,52±1,87*. 53,75122,73*. 439,5511,8 28,9*. 22,1*

фиксации II 5,64+1,34*. 4,55±1,77*и 83,26+22,75*. * ■

III 6,0112,15*. 4,61±1,91-» 87,36137,23*.

30 суток I 5,8411,47*. 7,88±1,54*« 37,95114,76*. 446,8211,6 22,8*. 22,5*

без И 8,38±1,68« 5,68+1,63*« 87,58+28,21*.

аппарата 111 9,8211,34*. 6,46±2,01*. 85,42123,75*

цри.'иечииие: 1 — пиварлниыппил, и — а» ------- г- >

* - достоверные различия с контролем, ■ - достоверные различия между сериями (для параметров УУс/, ДМ* Л'Ли,«. -Р'0.05, для Н-р<0,001).

При использовании автодистракции с повышенным темпом изменения суставного хряща имеют обратимый характер. Восстановление структуры суставного хряща осуществляется как за счет межклеточного матрикса, так и за счет собственных возможностей хондроцитов. Уже в период дистракции в

обеих сериях реактивная реакция хрящевой ткани выражалась в активации пролиферативных и биосинтетических процессов, наиболее выраженных серии «3 мм за 180 приемов». Максимальные количественные характеристики хондроцитов всех зон хряща в обеих сериях выявлены к концу эксперимента.

Сравнивая течение восстановительного процесса при автодистракции с повышенным темпом, можно отметить, что при режиме «3 мм за 180 приемов» восстановление протекает более интенсивно.

Структурная реорганизация суставного хряща при метадиафизарном удлинении голени.

Серия 4 отличалась от серий с диафизарным удлинением тем, что, несмотря на меры профилактики смещения проксимального костного фрагмента во время остеосинтеза, стабильность их фиксации снижалась на третьей-четвёртой неделе дистракции. Известны данные о том, что нарушения стабильности фиксации в периоде дистракции вызывают механические и гемодинамические повреждения артерий, что приводит к гиповаскуляризации и нейротрофическим нарушениям мышц [Петровская Н.В. с соавт., 2012]. Последнее вполне объясняет разницу в функциональном статусе животных в сериях с диафизарным и метадиафизарным удлинением. В последнем случае в связи с более выраженной контрактурой коленного и голеностопного суставов имело место снижение функциональной нагрузки на конечность, что объясняет лучшую, по сравнению с диафизарным удлинением, сохранность поверхностной зоны и более близкими к интактному контролю значениями количественных параметров. Однако низкий показатель доли хондроцитов в составе изогенных групп и состояние промежуточной и глубокой зон - появление бесклеточных полей, проникновение сосудов в хрящ в конце опыта (рис. 13) свидетельствовали о регрессивных изменениях суставного хряща и неблагоприятном фунциональном прогнозе.

Рис.13. Проникновение сосудов в суставной хрящ собаки. Метадиафизарное удлинение. Месяц после снятия аппарата. А - промежуточная зона, Б - глубокая зона. Полутонкие срезы, окраска метиленовым синим -основным фуксином. Об. — 40; ок. - 12,5х.

Поэтому в дальнейших экспериментальных исследованиях следует разработать эффективные способы профилактики угловых смещений костных фрагментов при удлинении и уточнить представления об оптимальном уровне нарушения целостности кости. Полученные в условиях метадиафизарного удлинения голени результаты, согласуются с литературными данными о трофическом влиянии функциональной нагрузки на суставной хрящ [Павлова В.Н., 1989; Лаврищева Г.И. с соавт., 2002; Стецула В.И., Веклич В.В., 2003; Tammi М. et al., 1983; Wayne J.S. et al., 2001] и подтверждают, что динамические нагрузки являются необходимым условием сохранения структурной организации суставного хряща.

Результаты визуальной гистологической оценки (по Mainil-Varlet Р., 2003), проведённые в сопоставимые сроки эксперимента (в серии с моделированием остеоартроза - через 90 суток после операции, в сериях с удлинением - через 30 суток после снятия аппарата, срок опыта 93 дня при удлинении с темпом 1 мм и 75 дней при удлинении с темпом 3 мм) представлены в таблице 7.

Таблица 7. Полуколичественная экспертная оценка регенерации суставного хряща в экспериментальных сериях по визуальной гистологической

Серия/ Параметр MOA 1/4М 1/4 1/60 ночь 3/180 3/120

Поверхность 0 0 0 3 0 0

Матрикс 3 3 3 3 3 3

Распределение клеток 0 2 2 2-3 2 2

Жизнеспособность клеточной популяции 0-1 1 3 3 3 3

Субхондральная кость 2-1 2 2 3 2 2

Минерализация хряща 0 0 0 3 0 0

Суммарная оценка 5-6 8 10 17-18 10 10

Примечание: 1/4М - метадиафизарное удлинение в режиме I мм за 4 приема.

Визуальная гистологическая шкала позволяет выявить неблагоприятное для функциональной реабилитации состояние суставного хряща при метадиафизарном удлинении голени, приближенное по нескольким параметрам к индуцированному остеоартрозу. Преимущества высокодробной автодистракции «1 мм за 60 приемов, ночь» согласуются с данными количественного анализа. Различия между сериями диафизарного удлинения «1 мм за 4 приема», «3 мм за 180 приемов» и «3 мм за 120 приемов» не выявляются полуколичественным методом, но, как было

показано выше, установлены по результатам гистоморфометрии и стереологического анализа.

В нашем исследовании методы количественной морфологии позволили получить комплекс нормативных показателей, характеризующих суставной хрящ экспериментальных животных в различные периоды постнатального онтогенеза, при моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением и выявить влияние различных условий ортопедического удлинения конечности на структурную реорганизацию суставного хряща. В дальнейших исследованиях эти данные могут использоваться при доклинических испытаниях лечебно-профилактических воздействий, направленных на предотвращение развития суставной патологии у ортопедо-травматологических больных.

Гистоморфометрический анализ синовиальной оболочки при метадиафизарном удлинении голени в режиме 1 мм за 4 приема и при автодистракции с темпом 3 мм за 120 приемов.

На первый взгляд, полученные описательные и количественные данные несопоставимы, поскольку модели отличались уровнем и способом нарушения целостности кости, режимом дистракции и сроками опыта (в силу разницы суточных темпов). Однако сравнение закономерностей изменений синовиальной оболочки позволило оценить диапазон деструктивно-репаративных реакций в столь разных экспериментальных условиях.

В обеих моделях выявлена гиперплазия покровного слоя синовиальной оболочки (рис. 14).

Рис. 14. Поперечные полутонкие срезы синовиальной оболочки коленного сустава собаки в конце периода дистракции. Утолщение покровного слоя за счет пролиферации синовиоцитов. Окраска метиленовым синим - основным фуксином. Об. - 40; ок. - 12,5х. А - 1 мм за 4 приема. Б - 3 мм за 120 приемов.

Активность воспалительного процесса при метадиафизарном удлинении в ручном режиме была незначительной в конце периода дистракции и выраженной на этапе после снятия аппарата. При

автодистракции в режиме 3 мм за 120 приемов динамика оценки синовита диаметрально противоположна (табл. 8).

Таблица 8. Полуколичественная экспертная оценка выраженности синовита по У.Кгепп е! а1. (2006) ___ •_

Критерии «1 мм за 4 приема» «3 мм за 120 приемов»

28 суток дистракции 30 суток без аппарата 10 суток дистракции 30 суток без аппарата

Утолщение покровного слоя 1 0-1 1-2 1

Клеточность субсиновиального слоя 1 2 1 1

Выраженность плазмоцитарно-лимфоцитарной инфильтрации 0 2 1 0

Сумма баллов 2 4-5 4 2

Перестройка сосудистого русла синовиальной оболочки при метадиафизарном удлинении «1 мм за 4 приема» отражала гипердинамическое состояние кровотока, высокую активность ангиогенеза и развитие гиперваскуляризации. При автодистракции «3 мм за 120 приемов» колебания численной плотности микрососудов не обнаруживали статистически значимых отличий от показателя интактной группы (табл. 9), но деструктивные изменения сосудистого русла, особенно состояние артерио-артериолярного его звена, указывали на редукцию кровоснабжения, которая являлась наиболее вероятной причиной более выраженных признаков нарушения циркуляции эндоневральной жидкости и деструктивных изменений нервных волокон в нервах субсиновиального слоя по сравнению с метадиафизарным удлинением «1 мм за 4 приема».

Таблица 9. Гистологические и морфометрические характеристики синовиальной оболочки интактных и экспериментальных собак

Параметр Интактные «1 мм за 4 приема» «3 мм за 120 приемов»

28 суток 30 суток без 10 суток 30 суток без

дистракции аппарата дистракции аппарата

Толщина покровного 26,08 44,81 28,17 50,06 36,45

слоя(мкм) ±2,04 ±2,94 ±0,64 ±1,63 ±2,17

Количество рядов 1-2 2-4 1-2 2-4 2-3

синовиальных

клеток

Численная плотность 335,05 381,26 439,03 369,7 300,39

микрососудов (мм~г) ±28,88 ±17,33 ±37,88 ±46,21 ±43,99

Примечание: жирным шрифтом выделены достоверные отличия с контролем (р<0,05).

Следует отметить, что признаки регенерации повреждённых нервных волокон у животных при метадиафизарном удлинении «1 мм за 4 приема» обнаружены уже к концу периода дистракции. При автодистракции «3 мм за

120 приемов» они не выявлялись вплоть до конца эксперимента (75 дней). В этот же срок опыта фиброз и липоматоз субсиновиального слоя у животных при автодистракции «3 мм за 120 приемов» был значительно более выражен, чем при метадиафизарном удлинении «1 мм за 4 приема».

Компенсаторно-приспособительные изменения субсиновиального слоя у животных при метадиафизарном удлинении «1 мм за 4 приема» -ангиогенез, гиперваскуляризация, регенерация деструктивно изменённых нервных элементов, выраженные как в конце дистракции, так и через месяц после снятия аппарата, сопровождались нарастанием активности воспалительного процесса в синовиальной оболочке, что прогностически неблагоприятно для восстановления функции суставов.

При автодистракции «3 мм за 120 приемов» была предпринята попытка снижения травматичности методики удлинения: уровень нарушения целостности кости и удлинения дистанцирован от коленного сустава, в 10 раз уменьшен шаг дистракции (разовое растяжение), на 23 дня сокращен период пребывания конечности в аппарате - не только за счёт более быстрой дистракции, но и сокращения периода фиксации в аппарате. В этих условиях происходило более раннее формирование и консолидация дистракционного костного регенерата, но в синовиальной оболочке выражены регрессивные нейрососудистые изменения, что также неблагоприятно для структурного и функционального восстановления суставов.

Известно, что при воспалительных и дегенеративных заболеваниях суставов состояние синовиальной оболочки коррелирует с деструктивно-репаративными процессами в суставном хряще и клиническими проявлениями патологического процесса [Кожанова Т.Г., 2008; 8е11аш I., ВегепЬаиш Б., 2010]. Этим определяется практическая значимость исследований гистологических изменений синовиальной оболочки не только при клинической патологии, но и в экспериментальной практике.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что период бурного роста (от 6 до 10 мес. постнатальной жизни) характеризовался очаговыми нарушениями гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны, незначительным снижением толщины хряща, увеличением объёма межклеточного вещества в расчёте на одну клетку, единичными пустыми лакунами и существенным возрастанием доли изогенных групп. Аналогичные изменения были отмечены при исследовании суставного хряща коленного сустава человека в подростковом возрасте [Ахмедов Ш.Н. с соавт., 2002]. К 1,5-2 годам гомогенность межклеточного вещества поверхностной зоны восстанавливалась, снижалось количество пустых лакун, увеличивалась объемная плотность хондроцитов. Выраженные признаки инволютивных преобразований, выявленные в 5 лет постнатальной жизни собак, включали минимальные по сравнению с другими возрастными периодами показатели содержания серы, численной и

объёмной плотности хондроцитов суставного хряща, но максимальную площадь хондроцитов его поверхностной зоны. По сравнению с двухлетним возрастом в этот период значительно увеличены доля пустых лакун и доля хондроцитов в составе изогенных групп, содержание кальция. В возрасте 8 лет площадь хондроцитов промежуточной зоны достигала максимума и по сравнению с двухлетним возрастом на 13,5% увеличено содержание серы, но содержание кальция возрастало на 173%.

В отличие от возрастных изменений, при биомоделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением деградация хряща приобретала ускоренный характер, а компенсаторно-приспособительные изменения были слабо выражены. Перевязка бедренной артерии и иммобилизация коленного сустава в разработанной нами экспериментальной модели остеоартроза приводят к гиповаскуляризации и частичной потере иннервации субсиновиального слоя; изменения синовиальной оболочки свидетельствуют о синовите значительной степени выраженности; изменения суставного хряща включают деструктивно-пролиферативную фазу и фазу глубокой деградации хряща. Необходимо отметить, что в данных условиях эксперимента наиболее уязвимым оказались хондроциты промежуточной зоны, которые равноудалены от васкулярного и синовиального факторов питания (около 50% клеток в состоянии деструкции). Полученные результаты оценки морфофункционального состояния суставного хряща и субхондральной кости показали, что разработанная экспериментальная модель позволяет получить гонартроз, патогенетически основное место в развитии которого, занимает фактор изменений режима функциональных нагрузок и кровоснабжения сустава, определяющие диффузное питание хряща. При данном патологическом процессе собственные регенераторные возможности суставного хряща подавлены и его восстановление невозможно без дальнейшего потенцирования внешних по отношению к хрящу механизмов.

Анализ качественных и количественных характеристик позволил выявить неблагоприятное для функциональной реабилитации состояние суставного хряща при метадиафизарном удлинении голени на 15% исходной длины. По нескольким параметрам это состояние было приближено к индуцированному остеоартрозу — хотя применялся оптимальный темп (1 мм в день) и дробный режим дистракции - разделение суточного удлинения на 4 приёма. Несмотря на то, что в сериях с моделированием остеоартроза и при метадиафизарном удлинении васкуляризация синовиальной оболочки менялась разнонаправлено, в обеих сериях опыта выявлен синовит, что также подтверждает риск развития остеоартроза при метадиафизарном удлинении голени.

В отличие от модели остеоартроза, при моделировании удлинения голени экспериментальных животных наибольшие структурные преобразования развиваются в поверхностной и глубокой зонах нагружаемых

участков хряща коленного сустава, деструктивные изменения и гибель хондроцитов выражены в меньшей степени. Регенерация суставного хряща в условиях удлинения конечности осуществляется за счет собственных возможностей хондроцитов, пролиферирующих преимущественно в верхних слоях промежуточной зоны, а также очагами в поверхностной и глубокой зонах.

Выраженность деструктивных изменений и полноценность регенерации при диафизарном удлинении существенно зависели от режима дистракции. При удлинении по 1 мм в день за 4 приема на этапе дистракции была выражена деструктивно-пролиферативная реакция суставного хряща. Через 30 суток после снятия аппарата гибель хондроцитов продолжалась, а пролиферативная реакция затухала. Восстановления морфометрических характеристик хряща и содержания серы не происходило к концу эксперимента.

Увеличение дробности и уменьшение величины разового удлинения при ночной автодистракции с темпом 1 мм за 60 приемов позволили снизить травматизацию суставного хряща. Режим высокодробной дистракции «1 мм за 60 приемов, ночь» создавал возможности для полноценной репарации хряща. Выявленные при этом режиме изменения суставного хряща наиболее приближены к процессу интенсивного естественного роста по сравнению с другими изученными режимами.

В конце опыта при таком же шаге (0,017 мм) высокодробной автоматической дистракции «3 мм за 180 приемов» не восстанавливалась структура суставной поверхности и толщина хряща, однако динамика количественных параметров указывала на усиление и биосинтетической, и пролиферативной активности клеток, что свидетельствовало о возможности дальнейшей реституции.

Существенно также то, что при диафизарном удлинении автодистракция «3 мм за 180 приемов» по сравнению с ручной дистракцией «1 мм за 4 приема» являлась менее травматичной для суставного хряща и обеспечивала высокую эффективность адаптационных реакций, направленных на восстановление его структуры; при этом значительно (на 18 суток) за счёт ускоренного темпа сокращался период пребывания конечности в аппарате.

Снижение дробности и увеличение шага дистракции с 0,017 до 0,025 мм при режиме 3 мм за 120 приемов оказалось значимым и неблагоприятным для восстановления суставного хряща.

Таким образом, наиболее перспективным в плане профилактики остеоартроза у пациентов, которым показано оперативное удлинение конечности, • представляется применение высокодробного режима автодистракции с темпом 1 мм. Представляется целесообразным продолжение исследований с целью поиска оптимального режима высокодробной дистракции с повышенным темпом.

В процессе проведения исследований нами была разработана методология количественного исследования суставного хряща на органном, тканевом и клеточном уровнях структурной организации. Она расширяет возможности гистоморфометрических исследований, повышает их точность, эффективность, обеспечивает воспроизводимость получаемых данных.

ВЫВОДЫ

1. Период бурного роста у собак (от 6 до 10 мес. постнатальной жизни) характеризуется очаговыми нарушениями гомогенности межклеточного вещества поверхностной зоны суставного хряща с одновременным усилением биосинтетической и пролиферативной активности хондроцитов, что доказывается как увеличением объёма межклеточного вещества в расчёте на одну клетку (на 45,4%), так и существенным возрастанием доли изогенных групп (на 80,5%).

2. В суставном хряще пятилетних собак снижены метаболические характеристики хондроцитов, хотя площадь хондроцитов поверхностной зоны максимальна. В возрасте 8 лет гипертрофированы хондроциты промежуточной зоны, по сравнению с пятилетними животными усиливается биосинтетическая активность хондроцитов, но нарастают признаки обызвествления. Деструктивные изменения сосудов и нервов синовиальной оболочки максимально выражены в возрасте пяти лет.

3. Иммобилизация коленного сустава и перевязка бедренной артерии в изученной нами экспериментальной модели остеоартроза приводят к гиповаскуляризации и частичной потере иннервации субсиновиального слоя; изменения синовиальной оболочки в этих условиях свидетельствуют о синовите значительной степени выраженности; изменения суставного хряща включают деструктивно-пролиферативную фазу и фазу глубокой деградации хряща.

4. При диафизарном удлинении конечности в ручном режиме (1 мм за 4 приема) на этапе дистракции выражена деструктивно-пролиферативная реакция суставного хряща. Через 30 суток после снятия аппарата гибель хондроцитов продолжается с одновременным прекращением их пролиферации. Восстановления морфометрических характеристик хряща и содержания сульфатированных гликозаминогликанов не происходит.

5. При увеличении дробности и уменьшении величины разового удлинения при авто дистракции в режиме «1 мм за 60 приёмов», осуществляемой в ночное время, в конце периода дистракции уменьшена выраженность очагов разволокнения, к концу эксперимента достигнута реституция суставной поверхности.

6. Автодистракция с темпом 3 мм за 180 приемов по сравнению с ручной дистракцией «1 мм за 4 приема» является менее травматичной для суставного хряща и обеспечивает высокую эффективность адаптационных реакций, направленных на восстановление его структуры; при этом

значительно (на 18 суток) сокращается период пребывания конечности в аппарате.

7. Сопоставление морфометрических параметров суставного хряща в сериях «3 мм за 120 приёмов» и «3 мм за 180 приёмов» свидетельствует о большей травматичное™ режима 3 мм за 120 приёмов: более выражено уменьшение толщины хряща и особенно доли хондроцитов в составе изогенных групп. Снижение дробности и увеличение шага дистракции с

0.017.до 0,025 мм значимо и неблагоприятно для восстановления суставного хряща в данных условиях эксперимента.

8. В отличие от модели остеоартроза, при моделировании диафизарного удлинения голени экспериментальных животных наибольшие структурные преобразования развиваются в поверхностной и глубокой зонах нагружаемых участков хряща коленного сустава, деструктивные изменения и гибель хондроцитов выражены в меньшей степени, в промежуточной зоне преобладают функционально активные хондроциты.

9. Метадиафизарное удлинение голени по сравнению с диафизарным является менее щадящим по отношению к суставному хрящу и создаёт менее благоприятные условия для восстановления его морфофункциональных характеристик: несмотря на лучшую сохранность поверхностной зоны к концу периода дистракции, в период фиксации и после снятия аппарата нарушается жизнеспособность хондроцитов промежуточной и глубокой зон, что приводит к формированию бесклеточных полей и создаёт высокий риск прогрессирования деградации хряща (развития остеоартроза).

10. Состояние синовиальной оболочки коленного сустава при удлинении голени отражает степень травматичности методики удлинения. При остеотомии на уровне метадиафиза и ручной дистракции «1 мм за 4 приёма» отмечены гиперваскуляризация, в нервах - реактивно-деструктивные изменения с тенденцией к регенерации, как и при остеоартрозе развивается выраженный синовит. При остеоклазии на уровне середины диафиза и автодистракции «3 мм за 120 приёмов» выявлен синовит умеренной и слабой степени выраженности на фоне прогрессирующих деструктивных изменений сосудов и нервов.

СПИСОК НАУЧНЫХ ТРУДОВ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ

ДИССЕРТАЦИИ

Работы, опубликованные в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ

1. Ступина, Т.А. Гистоморфометрические характеристаки интактного суставного хряща наружного мыщелка бедра собак / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Морфологические ведомости. - 2008. - № 1-2. - С. 104-107.

2. Ступина, Т.А. Гистоморфометрическая характеристика суставного хряща в разные периоды роста / Т.А. Ступина // Морфология. -2008. - Т.133. -№3. - С. 107-108.

3. Ступина, Т.А. Влияние режима удлинения смежного сегмента конечности на состояние суставного хряща / Т.А. Ступина // Морфология. - 2008. -Т.133. №3. - С. 108.

4. Ступина, Т.А. Регенерация суставного хряща при повышенных темпах удлинения конечности в эксперименте / М.М. Щудло, Т.А. Ступина // Морфология. - 2008. -Т.134. - №5. - С. 104.

5. Ступина, Т.А. Способ количественной оценки состояния суставного хряща на разных уровнях структурной организации / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Гений ортопедии. - 2009. - №1. - С. 55-57.

6. Ступина, Т.А. Экспериментальные аспекты изучения репаративной регенерации суставного хряща в условиях туннелирования субхондральной зоны с введением аутологичного костного мозга / В.И. Шевцов, В .Д. Макушин, Т.А. Ступина, М.А. Степанов // Гений ортопедии. - 2010. - №2,-С.5-10.

7. Ступина, Т.А. Оценка регенераторных возможностей суставного хряща при различных условиях удлинения смежного сегмента конечности в эксперименте / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Гений ортопедии. - 2010. -№3. - С.84-88.

8. Ступина, Т.А. Оценка регенераторных возможностей суставного хряща при удлинении конечности в условиях стимуляции остеогенеза / Т.А. Ступина // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2011. - №4(80). - 41. С. 284288.

9. Ступина, Т.А. Состояние опорных тканей при костной травме в условиях стимуляции экстрактом фетапьной костной ткани (экспериментальное исследование) / H.A. Кононович, Н.В. Петровская, E.H. Горбач, Т.А. Ступина, С.Н. Лунева, М.А. Ковинька // Гений ортопедии. - 2011. - № 4. -С. 20-25.

10. Ступина, Т.А. Структурная адаптивность и репаративные возможности суставного хряща в зависимости от условий удлинения смежного сегмента конечности / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Травматология и ортопедия России. -2011. -№4(62). - С. 62-68.

11. Ступина, Т.А. Влияние субхондральной туннелизации и костномозговой стимуляции на процессы регенерации суставного хряща / Т.А. Ступина, В.Д. Макушин, М.А.Степанов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. - Т. 153. - №2. - С. 260 -264.

12. Stupina, Т.А. Experimental morphological study of the effects of subchondral tunnelization and bone marrow stimulation on articular cartilage regeneration / T.A. Stupina, V.D. Makushin, M.A.Stepanov // Bull Exp Biol Med. - 2012. -Jun; 153(2).-P. 289-93.

13. Ступина, Т.А. К вопросу моделирования остеоартроза коленного сустава у собак для изучения патогенеза / В.И. Шевцов, В.Д. Макушин, Т.А. Ступина, М.А. Степанов //Гений ортопедии. - 2012. - №1. - С. С.38-42.

14. Ступина, Т.А. Суставной хрящ: изменения при чрескостном дистракционном остеосинтезе, физиологическая и репаративная регенерация / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Гений ортопедии. - 2012. -№4. - С.137-141.

15. Ступина, Т.А. Оценка морфофункционального состояния суставного хряща при удлинении голени в сочетании с интрамедуллярным

армированием противоизогнутыми спицами / Т.А. Ступина // Известия Оренбургского государственного аграрного университета. - 2012 - № 2 (34). - С.220-222.

16. Ступина, Т.А. Экспериментальное моделирование остеоартроза коленного сустава у собак / В.Д. Макушин, М.А. Степанов, Т.А. Ступина // Биомедицина. - 2012. - №3. - С.108-115.

17. Ступина, Т.А. Структурная реорганизация бедренной и большеберцовой артерий, малоберцового нерва и хряща коленного сустава при экспериментальных переломах костей голени у собак и их лечении методом чрескостного остеосинтеза // Н.А. Щудло, Т.А. Ступина, Т.Н. Варсегова, И.В. Борисова// Биомедицина. - 2012. - №3. - С.51-62.

18. Ступина, Т.А. Изменения синовиальной оболочки и суставного хряща коленного сустава при удлинении голени автодистрактором с повышенным суточным темпом / Т.А. Ступина, М.М. Щудло, Н.А. Щудло // Морфология. - 2013. - Т.143. - №3. - С. 66-70.

19. Ступина, Т.А. Изучение регенерации суставного хряща в экспериментах по удлинению голени автодистрактором / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Морфология.-2013.T.144. -№5.-С. 118.

20. Ступина, Т.А. Состояние синовиальной оболочки коленного сустава в экспериментах по удлинению голени по методу Г.А. Илизарова / М.М. Щудло, Т.А. Ступина, Н.А. Щудло // Морфология. - 2013. T.144. № 5. С. 135-136.

21. Ступина, Т.А. Гистоморфометрический анализ суставного хряща и синовиальной оболочки коленного сустава при метадиафизарном удлинении голени / Т.А. Ступина, Н.А. Щудло, Н.В. Петровская, М.А. Степанов // Травматология и ортопедия России. - 2013. - №1(67). - С.80-86.

22. Ступина, Т.А. Изучение динамики костеобразования, состояния суставного хряща и большеберцового нерва при повышенном темпе удлинения голени автодистрактором в эксперименте / Е.Н. Горбач, Т.А. Ступина, Т.Н. Варсегова, А.А. Еманов // Успехи современного естествознания. - 2013. - №7. - С. 42-47.

23. Ступина, Т.А. Состояние опорных тканей при удлинении голени в области проксимального метафиза (клинико-экспериментальное исследование) / Э.С. Колесникова, Н.А. Кононович, Е.Н. Горбач, Т.А. Ступина, К.И. Новиков, Н.В. Петровская // Травматология и ортопедия России. - 2013. - №2(68). - С. 152.

24. Ступина, Т.А. Способ изготовления препаратов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для многоцелевых исследований / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2014. - Т. 157. - №3. - С. 388390.

25. Stupina, Т.А. A Method for Making Préparations from Nondecalcified Articular Cartilage with Sublying Subchondral Bone for Multipurpose Studies / T.'a. Stupina, M.M. Shchudlo // Bulletin of Expérimental Biology and Medicine. - 2014. - Vol. 157. - №3. P. 401-403.

26. Ступина, Т.А. К вопросу об активизации процессов, регулирующих восстановление структуры суставного хряща (обзор литературы и

собственные данные) / В.Д. Макушин, Т.А. Ступина // Гений ортопедии. -2014.-№1,-С. 82-88.

27. Ступина, Т.А. Структурная реорганизация основных компонентов сустава при экспериментальном моделировании остеоартроза с редуцированным кровоснабжением / Т.А. Ступина, H.A. Щудло, М.А. Степанов // Морфология. - 2014. - Т. 146. - №5. - С.61-65.

Работы, опубликованные в других изданиях

28. Ступина, Т.А. Количественная оценка метахромазии в цифровых изображениях гистохимических препаратов суставного хряща / М.М. Щудло, Т.А. Ступина // Методические рекомендации. Курган. - 2011. -15с.

29. Ступина, Т.А. Количественная оценка состояния суставного хряща на органном, тканевом, клеточном уровнях структурной организации / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Методические рекомендации. Курган. - 2012. -14с.

30. Ступина, Т.А. Колориметрический анализ микропрепаратов суставного хряща наружного мыщелка бедра при удлинении голени в эксперименте / М.М. Щудло, Т.А. Ступина // Украинский журнал телемедицины и медицинской телематики. - 2008. - Т. 6. - №2. - С. 154-158.

31. Ступина, Т.А. Цифровая колориметрическая стереология и электронно-зондовый микроанализ в изучении сульфатированных гликозаминогликанов в суставном хряще при разных режимах удлинения голени в эксперименте / М.М. Щудло, Т.А. Ступина // Украинский журнал телемедицины и медицинской телематики. - 2010. - Т. 8. - №1. - С. 117.

32. Ступина, Т.А. Зависимость количественных характеристик суставного хряща от условий удлинения смежного сегмента конечности автодистрактором с повышенным темпом в эксперименте / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Украинский журнал телемедицины и медицинской телематики. - 2012. - Т. 10. - №2. С.64-68.

33. Stupina, Т.А. Histomorphometric analysis of knee synovial membrane in dogs undergoing leg lengthening by classic llizarov method and rapid automatic distraction / T.A. Stupina, M.M. Shchudlo, N.A. Shchudlo, M.A. Stepanov // International Orthopaedics. - 2013. - Vol. 37. - P. 2045-2050.

34. Ступина, Т.А. Гистоморфометрические и метаболические характеристики суставного хряща мышелков бедра собак при инволютивных изменениях / Т.А. Ступина // Успехи современного естествознания. - 2014. - № 5 (часть 1).-С. 81-85.

35. Ступина, Т.А. Удлинение голени собак с темпом 3 мм в сутки методом высокодробной автодистракции / В.И. Шевцов, A.A. Еманов, E.H. Горбач, Т.А. Ступина и др. // Материалы Всеросс. научн. конференции A.S.A.M.I. Курган, 2008. - С. 329.

36. Ступина, Т.А. Экспериментальное моделирование остеоартроза коленного сустава / М.А. Степанов, Т.А. Ступина // Материалы межд. науч.-практич. конф. «ОСТЕОПОРОЗ И ОСТЕОАРТРОЗ - ПРОБЛЕМА XXI ВЕКА: морфофункциональные аспекты диагностики, лечения и профилактики». Курган, 2009. - С. 237-239.

37. Ступина, Т.А. Изучение регенерационных возможностей суставного хряща при различных условиях удлинения смежного сегмента конечности / Т. А. Ступина, М. М. Щудло // Материалы Всероссийского конгресса А.Б.А-МЛ. Курган, 2009. - С. 132-133.

38. Ступина, Т.А. Возрастная динамика гистоморфометрических характеристик суставного хряща собак / Т.А. Ступина // Труды Московского Международного Ветеринарного Конгресса. Москва, 2009. -С. 120-121.

39. Ступина, Т.А. Гистоморфометрическая характеристика суставного хряща наружного мыщелка бедра собак в постнатальном онтогенезе / Т.А. Ступина // Материалы Первых Международных Беккеровских чтений: [сб. научн. тр. по материалам конф.]. Волгоград, 2010. - 41. - С. 523-524.

40. Ступина, Т.А. Состояние суставного хряща при костной травме в условиях стимуляции экстрактом фетальной костной ткани (экспериментальное исследование) / Т.А. Ступина, Н. А. Кононович, Н. В. Петровская, М. А. Ковинька // IX съезд травматологов-ортопедов России: сб. тез.: в 3 т. Саратов, 2010. - Т. 3. - С. 1145-1146.

41. Ступина, Т.А. Клеточно-тканевая терапия при лечении остеоартроза коленного сустава / Т.А. Ступина, М. А. Степанов // Сборник тезисов IV Всероссийского симпозиума с межд. участием «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии». Под редакцией: акад. РАН и РАМН С.П. Миронова. СПб.: Изд-во «Человек и его здоровье». - 2010. -С.122-123.

42. Ступина, Т.А. Количественная оценка суставного хряща при современных технологиях удлинения конечностей / Т.А. Ступина, М. М. Щудло // Илизаровские чтения: материалы Всерос. науч.-практ. конф. Курган, 2010. - С. 344-346.

43. Ступина, Т.А. Изучение морфологических признаков остеоартроза при экспериментальном моделировании / Т.А. Ступина, М. А. Степанов, М. М. Щудло, В. Д. Макушин // Илизаровские чтения: материалы Всерос. науч.-практ. конф. Курган, 2010. - С. 343-344.

44. Ступина, Т.А. Динамика морфологических изменений суставного хряща при клеточно-тканевой терапии гонартроза / Т.А. Ступина, М. А. Степанов, В. Д. Макушин // Илизаровские чтения: материалы Всерос. науч.-практ. конф. Курган, 2010. - С. 340-341.

45. Ступина, Т.А. Гистоморфометрическая оценка состояния суставного хряща при современных технологиях удлинения конечностей / М.М. Щудло, Т.А. Ступина // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием с элементами научной школы для молодежи, посвященной 90-летию со дня рождения заслуж. деят. науки РСФСР проф. Я. Л. Цивьяна: (Цивьяновские чтения, 25-26 ноября 2010 г.). Новосибирск, 2010. - С. 185-186.

46. Ступина, Т.А. Зависимость количественных характеристик хондроцитов суставного хряща от условий удлинения смежного сегмента конечности в эксперименте / Т.А. Ступина, М.М. Щудло // Современные повреждения и их лечение: материалы Международной юбилейной научно-практической конференции, посвященной 200-летию со дня рождения Н. И. Пирогова. М., 2010. - С. 398.

47. Ступина, Т.А. Экспериментально-морфологическое обоснование применения повышенного темпа удлинения голени автодистрактором / E.H. Горбач, Т.А. Ступина, Т.Н. Варсегова, A.A. Еманов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «ИЛИЗАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ». Курган, 2011. - С. 473.

48. Ступина, Т.А. Морфофункциональная оценка влияния субхондральной туннелизации и костномозговой стимуляции на процессы регенерации суставного хряща / Т.А. Ступина, М.А. Степанов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «ИЛИЗАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ». Курган, 2011. - С. 506-507.

49. Ступина, Т.А. Оценка суставного хряща при лечении оскольчатых переломов костей голени методом чрескостного остеосинтеза в эксперименте / Т.А. Ступина, М. А. Степанов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «ИЛИЗАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ». Курган, 2011. - С. 507-508.

50. Ступина, Т.А. Регенераторные возможности суставного хряща при современных технологиях удлинения конечностей в эксперименте / Т.А. Ступина // Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «ИЛИЗАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ». Курган, 2011. - С. 506.

51. Ступина, Т.А. Влияние субхондральной туннелизации и клеточно-тканевой терапии на процессы регенерации суставного хряща / В.Д. Макушин, Т.А. Ступина, М.А. Степанов // Хирургические технологии лечения патологии позвоночника и суставов: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием с элементами научной школы для молодежи, посвященной 65-летию Новосибирского НИИТО (Цивьяновские чтения). Новосибирск, 2011. - С. 149-152.

52. Ступина, Т.А. Гистоморфометрическая оценка суставного хряща при лечении оскольчатых переломов костей голени методом чрескостного остеосинтеза в эксперименте / Т.А. Ступина, М.А. Степанов // Материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием, посвящ. памяти проф. А.Н. Горячева. Омск, 2011. - С. 40-41.

53. Ступина, Т.А. Гистоморфометрическая характеристика тканевых компонентов коленного сустава при моделировании остеоартроза / В.Д. Макушин, Т.А. Ступина, М.А. Степанов // Материалы научно-практической конференции с международным участием «ИЛИЗАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ». Курган, 2012. - С. 174-175.

54. Ступина, Т.А. Зависимость количественных характеристик суставного хряща от условий удлинения смежного сегмента конечности автодистрактором с повышенным темпом в эксперименте / Т.А. Ступина // Материалы научно-практической конференции с международным участием «ИЛИЗАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ». Курган, 2012. - С. 268-269.

55. Ступина, Т.А. Механизм стимулирования регенерации суставного хряща при субхондральной туннелизации в сочетании с клеточно-тканевой терапией / В.Д. Макушин, Т.А. Ступина, М.А. Степанов // Сборник тезисов V Всероссийского симпозиума с межд. участием / под ред. проф. Э.Р. Мулдашева. Уфа: Из-во «Башкортостан» - 2012. - С. 174-175.

56. Stupina, T.A. Preuve expérimentale morphologique du traitement des lésions multiples de la mâchoire inférieure par l'ostéosynthèse transosseuse / T.A. Stupina, V. D. Makushin, M. A. Stepanov // Materials of the 13th congress [AOLF], Dakar, Senegal, 2012. - P. 32.

57. Stupina, T.A. L'Arthrose déformante du genou / V.D. Makushin, T.A. Stupina, M.A. Stepanov // Materials of the 13th congress [AOLF], Dakar, 2012. - P.51.

58. Stupina, T.A. Tibial lengthening by Ilizarov in different biomechanical conditions (experimental study) / N.V. Petrovskaya, Y.N. Gorbach, N.A. Kononovich, T.A. Stupina, M.A. Stepanov, A.A. Emanov, S.A. Yerofeev, E.S. Kolesnikova // Materials of the 8th International Conference of Skeletal Deformities Correction. Cairo, Egipt, 2012. - P. 55-56.

59. Ступина, T.A. Сканирующая электронная микроскопия в изучении суставной поверхности наружного мыщелка бедра при удлинении голени в эксперименте / Т.А. Ступина // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. - 2014. - №10 (часть 3). - С. 154-158.

Патенты на изобретения

60. Патент № 2397472. Способ подготовки образцов биологических тканей для исследования в сканирующем электронном микроскопе / Силантьева Т.А, Горбач E.H., Ирьянов Ю.М., Ступина Т.А., Варсегова Т.Н. Опубл. 20.08.2010. Бюл_№23.'4с.

61. Патент № 2452999. Способ моделирования остеоартроза коленного сустава / Макушин В.Д., Степанов М.А., Ступина Т.А. Опубл. 10.06.2012. Бюл.№16. 8с.

62. Патент №2466375. Способ подготовки образцов недекальцинированного суставного хряща с подлежащей субхондральной костью для многоцелевых исследований / Ступина Т.А., Щудло М.М. Опубл. 10.11.2012. Бюл.№31.7с.

Подписано в печать 18.03.2015г. Объем 1п.л. Формат 64x84. Гарнитура «Tims New Roman cyr»/ Бумага офисная. Тираж 140 экз.

«Типография Дамми» г. Курган, ул. К. Мяготина, 91а

Информация о работе

Ступина, Татьяна Анатольевна
доктора биологических наук
Оренбург, 2015
ВАК 03.03.04

Автореферат

Структурная реорганизация нагружаемых участков суставного хряща при биомоделировании остеоартроза и экспериментальной разработке технологий ортопедического удлинения конечности - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы