Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Детекция и анализ вирус - специфических ДНК и РНК при ВИЧ-инфекции

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Детекция и анализ вирус - специфических ДНК и РНК при ВИЧ-инфекции"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА, ОРДЕНА ОКТЯБРЬСКОЙ РЕВОЛЮЦИИ И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Козлова Анжелика Владимировна

ДЕТЕКЦИЯ И АНАЛИЗ ВИРУС-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ДНК И РНК ПРИ ВИЧ-ИНФЕКЦИИ

03.00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

МОСКВА -1998

Работа выполнена в лаборатории молекулярных механизмов микроэволюцни НИИ физико-химической биологии им. АНБелозёрского (МГУ) и в группе иммунохимии лаборатории физиологии вирусов НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАМН.

Научные руководители

старший научный сотрудник Э.В.Карамов

доктор биологических наук, профессор Б.М.Медников

Офицальные оппоненты

доктор химических наук Ю.Ф. Дрыгин

доктор медицинских наук, профессор Л.П.Алексеев

Ведущая организация

Институт микробиологии и эпидемиологии им. Гамалея РАМН

Защита состоится 7 апреля 1998 года в 1И часов на заседании Диссертационного совета Д 053.05.70 при Московском Государственном Университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, Институт физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского, ауд.536.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 7 марта 1998 года.

Учёный секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук

В.Н.Каграманов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вот уже более пятнадцати лет во всём мире ведутся интенсивные исследования, связанные с изучением вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), являющегося этиологическим агентом синдрома приобретённого иммунодифицита человека (СПИД), заболевания, до сих пор остающегося неизлечимым. Вместе с тем, только в последнее время были получены данные, свидетельствующие о высокой репликативной активности ВИЧ в инфицированном организме в течении всего инфекционного процесса, включая ассимпгоматическую стадию, при этом миллиарды вирусных частиц образуются и уничтожаются ежедневно. Заметим, что получение таких данных стало возможным только благодаря развитию современных высокочувствительных технологий с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР), основанной на детекции вирусного генетического материала. Изучение и оценка репликативной активности ВИЧ, определяемой количеством вирус-специфических ДНК и РНК, позволяет прогнозировать развитие инфекции и, что самое важное, получать наиболее достоверную информацию об эффективности применяемой терапии и механизме действия лекарственных препаратов. Несомненно, что мониторинг на генетическом уровне является одним из наиболее перспективных направлений как в молекулярной биологии ретровирусов, так и непосредственно в работе по профилактике и лечению СПИДа.

Цель и задачи настоящей работы - изучение репликации ВИЧ in vitro (в различных клеточных системах) и in vivo (в организме ВИЧ-инфицированных лиц) путём мониторинга инфекции на генетическом уровне. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи:

• разработать метод количественного определения вирус-специфических ДНК и РНК. Оценить применимость данного метода а) в модельных клеточных системах репродукции ВИЧ; б) на клиническом материале, полученном от ВИЧ-инфицированных лиц;

3

• изучить репликативную активность различных изолятов ВИЧ, в том числе обладающих AZT-резистентным фенотипом;

• исследовать влияние химиопрепаратов на вирусную репликацию в культуре ВИЧ-инфицированных клеток; оцешпъ перспективность использования комбинированного действия препаратов для AZT-резистентных штаммов ВИЧ;

• изучить возможность индукции провируса ВИЧ в условиях теплового шока.

Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе предложена оригинальная модификация метода количественной оценки содержания вирус-специфических ДИК и РНК. Продемонстрирована универсальность её использования как для изучения репликации ВИЧ в культуре клеток, так и дня оценки эффективности антивирусной терапии у ВИЧ-инфицированных лиц. Впервые показана амплификация провируса ВИЧ в условиях теплового шока. Практическая значимость работы определяется актуальностью задач по терапии и профилактики ВИЧ-инфекции и СПИДа.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликованы 3 статьи. Материалы работы представлены на Ш, IV, V международных конференциях «СПИД, рак, родственные проблемы» (Санкт-Петербург, 1995, 1996, 1997), на 10-м Вирусологическом Конгрессе (Иерусалим, 1996), на 11-ом Международном Конгрессе по СПИД (Ванкувер, Канада, 1996). При поддержке благотворительного Фонда «ВИЧ-Огонёк-АитиСпид» разработанный нами метод количественной оценки вирус-специфических нуклеиновых кислот был апробирован и внедрён в медицинскую практику на базе РДКБ («Покрова Божией Матери») г.Москва.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 125 стр. машинописного текста, экспериментальные данные представлены на 26 рисунках, 10 таблицах.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Разработка метода количественной оценки вирус-специфических ДНК и РНК при ВИЧ-инфекции.

Для количественных измерений ДНК (РНК) мы избрали и применили достаточно простой и эффективный метод количественной конкурентной ПЦР (К-ПЦР) с внутренним стандартом - специально сконструированной ДНК (РНК), вступающей в одну и ту же реакцию ПЦР с теми же праймерами, что и мишень (вирусная ДНК или РНК). Основной принцип метода заключается в том, что отношение исходных количеств анализируемой мишени и введенного в реакцию стандарта (при условии его минимального отличия по структуре от мишени) будет равно отношению соответствующих продуктов амплификации на любой стадии экспоненциальной фазы ПЦР. В нашей разработке метода количественного анализа мы предлагаем вводить в ПЦР обязательный внутренний стандарт на клеточный ген (помимо стандарта на геном ВИЧ). Использование дополнительного стандарта на клеточный ген (в нашем случае на маркерный однокопийный клеточный ген НЬА-БС)а) предупреждает возможность ложноотрицательного результата, так как оценивает наличие в пробе как собственно геномной ДНК, так и возможных ингибиторов реакции ПЦР. Предложенная модификация позволяет точно представить результат количественного анализа в виде числа копий вирусной ДНК на клетку, при этом неизбежные потери при выделении ДНК не влияют на результат анализа. Для детекции амплифицированных продуктов стандарта и мишени, присутствующих в исходной пробе в низкой концентрации (на ранних стадиях ВИЧ-инфекции), наиболее перспективным представляется гибридизация размноженных фрагментов с внутренним Р32-меченным зондом. Было показано, что в такой системе, амплифицированные продукты мишени и стандарта образуют хорошо различимые в геле гибриды.

1.1. Конструирование внутренних стандартов для количественной ДНК, РНК-ПЦР и изучение их свойств в модельной системе.

Оба стандарта (на вирусный и клеточный геном) для количественной ДНК-ПЦР были сконструированы методом рекомбинантной ПЦР и представляют собой модифицированные копии амплифицированного вирусного и клеточного гена соответственно. Внутренний стандарт на ВИЧ (IS) является копией фрагмента гена pol ВИЧ, в который введена 80-звенная вставка, в качестве

Р10(+) 2100

2200

ПЦР с Р10 и L1

Р10.

Р10.

. L2

АРНУ

2300

2400

5': 3"

АР4 (-) АР5 (-)

L1

U20,

pUC18

I

ПЦР с U20.M

ПЦР с L2 и Р9

lac Z фрагмент

PS

пцрсигоирэ

АРЗ

ПЦР с Р10 и РЭ

80 зв. - вставка

Р9

IS

АР4 АР5

:... вич

(pol)

Р9(.)

Рис.1. Схематичное расположение праймеров, используемых в работе, относительно генома ВИЧ-1 (RF). Схема конструирования внутреннего стандарта на ВИЧ (IS) путём введения вставки ( ) направленным

соединением фрагментов ДНК с помощью ПЦР. Положение праймеров отмечено—► , стрелка указывает направление нолимеразной достройки.

которой мы использовали образованный в реакции ПЦР фрагмент вектора pUC18 lac Z (рис.1). Методом ПЦР с праймерами P9,L2 и P10,L1 были получены фрагменты вирусного генома, в которые с помощью праймеров L1 и L2 были введены участки длиной 16 и 17 звеньев, содержащие перекрытие со

вставкой. Путем присоединения вставки U20-M к фрагменту L2-P9 и затем полученного продукта U20-P9 к P10-L1 в рекомбинашной ПЦР был сконструирован 468-звенный внутренний стандарт IS. В качестве маркера клеточной геномной ДНК мы использовали 242-звенный фрагмент гена HLA DQot, ограниченный праймерами GH26 и GH27 (рис.2).

GH2SJ+) . LZD (♦)

—* 40 зв. N—»- ген

;HLADQct

ZH(-)

ПЦР с СН26 и ZH

GH2« (*)

OHZ7I-)

ПЦР с LZDHQH27

GH28(+)

ПЦР с СН27 (-)

GH2S и GH27

т (-) ОН27 (•)

Рис.2. Схема конструирования внутреннего стандарта на клеточный маркерный ген НЬА-ЕХЗа (08) путём введяшя делещш внутреш!его участка

("".......) клеточного гена НЬА-0(2а направленным соединением фрагментов

ДНК путём ПЦР. Положения праймеров отмечены—* , стрелка указывает направление полимеразной достройки.

Для получения стандарта провели делецию его наиболее вариабельного участка. Для этого первоначально методом ПЦР были получены фрагменты, ограниченные праймерами ОП2б-7Н и ОН27-Ь/.Ю. При этом с помощью праймера ЬТО, содержащего на 5'-конце 10 дополнительных звеньев, некомплементарных матрице, во второй фрагмент было введено перекрытие с фрагментом СТШ-гН. В последующей рекомбинантной ПЦР с полученными продуктами амплификации был получен фрагмент, укороченный по сравнению с мишенью на 40 н.п. Как правило, соединение фрагментов (ОШб-7ЛГ) и (вШб-ЬЖ) путём ПЦР проходило не менее эффективно, чем копирование непрерывного фрагмента. Первичная структура полученных стандартов была

подтверждена сиквенсом ДНК по методу Сэнгера. Оба стандарта были апробированы и охарактеризованы с помощью количественной PCR в модельной системе с ДНК из культуры ВИЧ-инфицированных клеток. На рис.ЗА приведён радиоавтограф анализа амгшифицированных ДНК-проб после гибридизации с внутренним Р32-мсченным зондом в присутствйй фиксированного количества стандарта IS. При этом показано, что отношение радиоактивности соответствующих гибридов амплифицированной матрицы и стандарта прямо пропорционально количеству инфицированных клеток вводимых в реакцию (рис.ЗБ). Линейная зависимость между этими величинами прослеживается и для малых концентраций мишени, характерных для проб ДНК из крови ВИЧ-инфицированных лиц.

Рис.3 А). Радиоавтограф электрофореза реакционных смесей, образующихся в результате реакции гибридизации зонда Р32-АР4 с продуктам! количественной ПЦР с праймерами АРЗ и АР5 с ДНК из ВИЧ-инфицированных клеток CEM/BRU (1,2), ДНК из неинфицированной культуры клеток СЕМ (5) и их смеси 1:3 (3), 1:10 (4) в присутствии 3.6*105 молекул стандарта. В образец 1 стандарт не добавлен. Б). Зависимость между отношением радиоактивности полос (условия см. рис.ЗА), соответствующих ВИЧ и его стандарту (T/IS) и количеством инфицированных клеток, вводимых в реакцию, выраженном в %.

Подобная зависимость получена и для стандарта на маркерный клеточный ген. Заметим, что в этом случае для детекции амплифицированных продуктов стадию гибридизации можно опустить, так как в реакцию вводится достаточно

А)

Б)

1 2 3 4 5

T\IS

О 20 4Ü tu ьи um

содержание инфииированио! о kjmtочного ними в ofipmy>, %

большое количество геномной ДНК (1-2 мкг) и продукты ПЦР видны в прокрашенном бромистым этидием агарозном геле. При этом полученное денсигометрическим сканированием отношение интенсивностей соответствующих полос T/GS связано линейной зависимостью с количеством вводимой клеточной ДНК. Следует отметить, что при конструировании стандартов мы ввели достаточно протяжённую вставку (делецию), так что различие длин размноженных фрагментов мишени достигает 17% в случае клеточного стандарта и 62% и более - для стандарта на ВИЧ. Полученные данные свидетельствуют о том, что для работоспособности системы ПЦР со стандартом вовсе не обязательно использовать часто рекомендуемое в литературе очень малое различие длин размножаемых фрагментов. Более того, подобная разница длин мишени и стандарта позволяет чётко различать продукты их амплификации по электрофоретической подвижности, тем самым обеспечивая возможность их простой детекции в автоматическом варианте. В нашей системе при амплификации ДНК ВИЧ праймеры АРЗ и АР5 расположены внутри стандарта IS (рис.1). Тогда как при определении клеточного маркерного гена, используемые праймеры GH26 и GH27 комплементарны концам соответствующего стандарта GS (рис.2). В литературе описаны примеры использования в количественной ПЦР стандартов-амплификатов, концы которых соответствуют или не соответствуют используемым праймерам, однако случай с GS более сложный. Праймеры GH26 и GH27, содержащие на 5'-конце сайты рестриктаз, оказываются некомплементарными клеточной ДНК-мишени на 7 звеньев, при полной комплементарности с её стандартом GS. Однако отсутствие нарушений пропорциональности между соотношениями количеств продуктов амплификации стандарта\мишени и содержанием последних в исходной смеси подтверждает работоспособность и правомерность использования такого стандарта в количественной конкурентной PCR. Более того, мы не обнаружили нарушений и в случае детекции ВИЧ в ПЦР при одинаковых условиях как с праймерами Р9 и Р10, так и АРЗ и АР5. В первом случае праймеры строго

ограничивают концы стандарта IS, при этом некомплементарны ДНК ВИЧ на 2 и 3 звена соответственно, во втором случае праймеры АРЗ и АР5 образуют внутренние фрагменты мишени и стандарта, длины которых отличаются в 2 раза. Таким образом, полученные данные подтверждают универсальность такого рода количественной ПЦР. Важным преимуществом предложенного нами метода количественной оценки ДНК является возможность его простой модификации для количественного определения вирион-ассоциировшшой РНК. В этом случае также используется экзогенный стандарт, представляющий собой РНК-фрагмент гена pol ВИЧ, содержащий 80-звенную вставку, который добавляется к анализируемому РНК-образцу и вводится в последовательные реакции обратной транскрипции и ПЦР. РНК-стандарт был получен на основе

„ Ч. 80-зв вставка

Р10

5' - ■ - ■ 3" АдшпифнкатДНК-

э ' 4_ Р9 5 стандарта на ВИЧ

ПЦР с pr АР5 ^

АР9 и АР5

АР9

рг Т7 ---

Траисхрппцня РНК-шшимераза Т7

5'—-—...........3'

РНК-стададарг (RS)

Рис.4. Схема конструирования РНК-стандарта. Положение ираймеров отмечено —► , стрелка указывает направление нолимеразной достройки.

IS-стандарта, для чего с помощью ПЦР с праймерами АР5 и АР9, содержащим промотор РНК-полимеразы фага Т7, была сконструирована ДНК-матрица (рис.4). Продукт транскрипции данной матрицы in vitro представлял заданный РНК-стандарт.

1.2. Анализ развития ВИЧ-инфекции по данным количественных определений вирус-специфических ДНК и РНК.

Преимущества применения ПЦР и его количественных вариантов для мониторинга ВИЧ-инфекции очевидны. Анализы на генетическом уровне дают возможность получать объективную информацию о развитии инфекции у ВИЧ-инфицированного человека независимо от сложности клинической картины или

10

ее отсутствия. Использование ПЦР позволяет проводить такие анализы в микро- пробах крови, ткани или культуры довольно быстро и эффективно, причём этот процесс может быть автоматизирован. Это подтверждено испытаниями на автоматической установке «Шатёр» (фирма Дельта-Тех, МГУ). Количественные данные по содержанию различных геномных форм ВИЧ в клетке позволяют прогнозировать течение инфекционного процесса, а также оценить эффективность действия препаратов и других факторов, влияющих на вирусную репликацию.

1.2.1.Изучение репликации изолятов ВИЧ, обладающих А7Т-устойчипмм фенотипом.

Особое значение в оценке вирусной нагрузки количественная ПЦР приобретает, когда иммунохимические методы, связанные с определением уровня экспрессии вирусных белков, оказываются недостаточно чувствительными. В связи с этим, К-ПЦР имеет незаменимое значение для оценки репликативных свойств штаммов ВИЧ, резистентных к различным химическим препаратам, применяемым в химиотерапии СПИДа. Как правило, такие штаммы обладают сниженной решшкативной способностью (в сравнении с диким тапом вируса), в связи с этим возникают трудности в их детекции стандартными методами. Мы применили К-ПЦР для исследования репликативных свойств штаммов ВИЧ с А2Т-резистентным фенотипом, изолированных от пациентов длительное время получавших азидотимидин (А2Т) и адаптированных к клеточной линии 8ирТ1. Было показано, что такие варианты ВИЧ обладают пониженной чувствительностью к £2,1 в сравнении с референс штаммом СЕМ/ЬА1, чувствительным к А2Т, при этом образуют на порядок меньшее количество провирусных ДНК-копий (рис.5).

а СВ1-22 О LAI

Рис.5. Изучение уровня

репликации вариантов ВИЧ-1 в присутствии AZT, обладающих AZT-устойчивым (штамм СВ1-22) и AZT-чувствительным

(штамм LAI) фенотипом.

В таких случаях перспективным в подавлении репродукции вируса могло бы быть использование комбинации нескольких препаратов. Мы оценили влияние на репликацию AZT-резистеншого штамма СВ2-216 комбинированного действия гидроксимочевины (ингибитора клеточной рибонуклеотид редуктазы) и AZT (ингибитора ревертазы ВИЧ). Поскольку оба препарата влияют на синтез провирусной ДНК, используемый метод позволяет прямо оценить ингибируюпщй эффект на уровне провируса. Было показано, что данная комбинация препаратов эффективно блокирует синтез вирусной ДНК, при этом ингибируюпщй эффект носит синергичный, дозозависимый характер (рис.6). Добавление в культуру клеток AZT в концентрации 100 мкМ и гидроксимочевины в концентрации 10 мкг/мл приводило к снижению на 2 порядка количества ДНК-копий ВИЧ в сравнении контролем инфекции. Установлено также, что подобное действие комбинации данных препаратов в подавлении инфекции в клетках, но с большим эффектом наблюдается для чувствительного к AZT референс-штамма СЕМ/LAI В этом случае, при контроле инфекции 288 копий ДНК ВИЧ/клетку удаётся ингибировать синтез вирусной ДНК до 4.3 копий ДНК ВИЧ/клетку примененяя AZT в концентрации 0.1 мкМ совместно с гидроксимочевиной в концентрации 0.1 мкг/мл. Подобный уровень снижения содержания провирусной ДНК достигается лишь при монотерапии AZT лишь в концентрации на 2 порядка выше. Полученные данные свидетельствуют, что применение описанной комбинации в

химиотерапии ВИЧ может быть эффективно как для чувствительных к А2Т, так и для А7Т-резистенпгых штаммов. Немаловажной, учитывая токсичность

Гндрокснмочевина (шк^/ш!)

контроль инфекции - 431 копий ДНК ВИЧ/клетку

Рис.6. Изучение ингибирующего эффекта комбинированного действия и гидроксимочевины на репликацию АСТ-резистентного штамма СВ2-216 в лимфобластоидной клеточной линии БирИ путём количественной ДНК-ПЦР.

ЛZT, является возможность его использования в меньших концентрациях при комбинированной химиотерапии без потери эффективности шггибирования ВИЧ.

1.2.2. Взаимосвязь генетических и иммунологических параметров виремин. определяеАдлх у ВИЧ-инфицнрованных пациентов.

ВИЧ, поражая иммуиую систему организма, приводит к развитию широкого спектра заболеваний. Это определяет весьма сложную клиническую картину, во многом индивидуальную для каждого пациента. В связи с этим, для обеспечения полной информации о протекании болезни в организме ВИЧ-инфицированного человека, необходим многосторонний мониторинг вирусной репликации, связанный как с определением иммунологических, так и

13

генетических параметров, включающих содержание не только вирус-специфических ДНК, но и РНК.

По нашим данным у различных пациентов уровень суммарной вирусной ДНК в клетках периферической крови варьирует от 0.2-500 копий на 1000 клеток, при этом не наблюдается корреляции с клиническим состоянием пациента. Тем не менее, всегда отмечается снижение количества как ВИН-РНК в плазме, так и ВИЧ-ДНК в клетках в ходе противовирусной терапии. Этот эффект, однако, нестабилен, особенно после прекращения лечения. В группе пациентов, проходивших курс химиотерапии, мы исследовали взаимосвязь иммунологических и генетических параметров в премии. Молекулярно-вирусологические данные 4-х пациентов до начала химиотерапии отображены в табл.2. Пациенты находятся на различных стадиях ВИЧ-инфекции от бессимптомной А2 до ВЗ (по классификации CDC). Изоляты, полученные от пациентов Ml и М2 обладают способностью индуцировать образование сшщитиев (слияние клеток в одну многоядерную клетку - SI-изоляты), тогда как изоляты, полученные от пациентов L и Р, характеризуются несинцитийобразующим (Ы81)-фенотипом. Как известно, SI-изоляты ВИЧ-1 отличает, как правило, высокая репликативная активность и цитопатогенность, корреляция с быстрой прогрессией к СПИД.

Таблица 2.

Молекулярно-вирусологические данные ВИЧ-пациентов на время начала терапии.

Пациеты С DC стадия пациента вирусный фенотип* количество CD4\ мм3 крови количество ДНК ВИЧ\500 клеток

Ml В2 SI 115 1,5

М2 В2 SI 148 1,8

L ВЗ NSI 200 24,6

Р А2 NSI 500 15,7

* - вирусный фенотип определялся сокультивацией выделенных изолятов пациентов с клеточной линией МТ2. SI - сишдггийобразующий фенотип; NSI -несищдатийобразующий фенотип.

Заметим при этом, что у пациентов М1 и М2 достаточно низкий начальный уровень вирусной ДНК в РВМС 1.5 и 1.8 копий ДНК ВИЧ на 500 клеток (1000 копий НЬА Е>Оа) соответственно, что на порядок ниже, чем у пациентов Ь и Р. Возможно, наблюдаемые различия в содержании провирусной ДНК у пациентов определяются фенотипом изолятов, следовательно, различным механизмом распространения инфекции в организме.

Динамика изменения вирусологических и генетических маркеров репликативной активности ВИЧ в ходе терапии.

Результаты определения параметров в премии для пациентов М2 и Ь представлены на рис.7 и 8 соответственно. Для данной выборки было показано, что содержание вирион-ассоциированной РНК в плазме достигает высоких значений порядка 10б молекул/ш1 плазмы для всех пациентов на фоне сниженного числа СМ+ иммунокомпентентных Т-хелперов.

0 -1-1-1-1--

0 5 10 15 20

• СБ4+ Т кл.-счс-г\мм3 крови —■— р24 (рг\мл плазмы)

А число копий РНК ВИЧ*106 /мл плазмы х число копий ДНК ВИЧ /50000 клеток

Рис. 7. Изменение параметров виремии для пациента М2 в ходе терапии.

При этом содержание РНК, как правило, коррелирует с уровнем корового белка ВИЧ р24. Но характер изменений РНК может не совпадать с таковым для ДНК (как в случае пациента М2).

н 25

время, дни

р24 (pr/мл плазмы) 50 100 время, дни

число копий РНК ВИЧ * 106 Uli плазмы —д. число копий ДНК ВИЧ\ 5000 клеток

Рис.8. Изменение параметров вирсмии для пациента Р в ходе терапии.

На наш взгляд, именно дшимика изменения вирусной нагрузки (а не ее величина) позволяет делать выводы о развитии инфекции и эффективности лечения. Поэтому такие анализы следует проводить регулярно для ВИЧ-инфицированных лиц.

2. Анализ нуклеиновых кислот ВИЧ в ходе развития инфекции in vivo.

Вследствии высокого уровня ошибок при репликации из-за неточности обратной транскриптазы ВИЧ (RT) и отсутствия корректирующего репликативного механизма, ВИЧ мутирует с высокой скоростью. За цикл репликациипоявляется от 5-10 ошибок на дшшоидный геном ВИЧ. Благодаря такой изменчивости даже при инфицировании организма одним вариантом вируса, генетические последовательности ВИЧ представлены популяцией близкородственных вариантов, так называемых квази-видов. При этом нуклеотидная дивергенция генома ВИЧ-1 составляет 2-5%, а в районе наиболее вариабельного оболочечного гена env может достигать 9%. На межпопуляционном уровне филогенетический анализ генетических последовательностей env (также gag) различает существование двух групп ВИЧ-1 М и О. Причём внутри первой кластрируются 10 подгрупп, названных

16

субтипами, степень нуклеотидного разнообразия между которыми составляет 20-35%. (Внутри отдельного субтипа эта величина составляет 7-20%). Показано, что распределение субтипов ВИЧ-1 может быть привязано к определённым географическим районам. Обнаруженные корреляции между эффективностью трансмиссии и способом передачи вируса для разных субтипов ВИЧ, предполагают дальнейшее изучение взаимосвязи между генетическим субтипом и его биологическими свойствами.

2.2. Изучение комплексности квази-видов ВИЧ-1 in vivo.

Для быстрого определения генетического субтипа изолята и оценки комплексности квази-видов у ВИЧ-инфицированных пациентов был использован метод анализа подвижности гетеродуплексов, образующихся между сравниваемым образцом и референс-плазмидой с известной нуклеотидной последовательностью (метод НМЛ). Соответствие между подвижностью гетеродуплексов и генетической дистанцией сравниваемых фрагментов, а также возможность визуализации множества амплифицированных вариантов ДНК (РНК)-образца позволяет использовать НМЛ как быстрый метод генетического субтитрования и оценки комплексности квази-видов.

Для определения субтипа вируса и оценки вирусной популяции у ВИЧ-инфицированных пациентов были амплифицированы вариабельные фрагменты C2-V3 геш env вирион-ассоцированной РНК ВИЧ, выделенной из плазмы крови пациентов М, S, К. Пациент М наблюдался в течении 1 года 4 мес., пациент S -1 г. 7 мес., пациент К - 8 мес. Клинические и молекулярно-вирусологические данные пациентов к моменту начала эксперимента представлены в табл.3. Аликвоты продуктов ПЦР анализируемых образцов смешивались с амплифицированным продуктом от различных референс-плазмид, содержащих клонированный фрагмент гена env (gplóO) определенных султанов. После отжига (нагревания при 94°С и охлаждения был проведён анализ реакционной смеси в 5% полиакриламидном геле. Показано, что преобладающий вирусный вариант у всех пациентов относится к субтипу В.

17

Таблица 3.

Молекулярио-вирусологические данные ВИЧ-инфицированных пациентов.

Пациенты CDC стадия пациента фенотип изолята* число CD4 + Ткл.\мм3 р24 рг\мл плазмы копий ДНК ВИЧ\500кл.

\1 В2 SI 148 54 1,8

S вз NSI н 139 н

К вз SI 145 85 492,0

* - вирусный фенотип определялся сокультивацией данных изолятов с клеточной линией МТ2. SI-синцитийобразующий фенотип; NSI несинцитийобразующий фенотип, н - не определяли

На протяжении всего эксперимента для пациента M характерно присутствие полос с пониженной мобильностью (наряду с полосой гомогенного продукта), что означает одновременную амплификацию различных квази-видов ВИЧ в данной популяции (рис.9, 1\1,2\2, 3\3).

_с

» 7 3

I 7 Л Г<1 1 2 1 С 1

—--- 1 _? 3

2 3 Ь 1 ? 3

н У ^ t s t s " С» Й * aJ й | f I ^ i t j..1 4111 ' i V* I « - -:

Рис.9. Электрофорез распределения гетеродуплексов, образованных между парами амплифицированных фрагментов области С2-У3 гена епу референс-плазмид (В, В1, В2, С, Б) и вирион- ассоциированной РНК, выделенной из плазмы пациента М (в различные промежутки времени 1,2,3). НО - указана позиция гомодуплексов, НЕ - позиция гетеродуплексов, оц-ДНК - позиция одноцепочечной ДНК.

Практически нет значительных изменений в вирусной популяции в течении 1,5 лет, что, возможно, отражаетнекоторуго стабильность популяции ВИЧ. Заметим, что на начало эксперимента у этого больного, проходившего в это время курс антивирусной терапии, изолировался вирус, обладающий 81-фенотипом, характеризующегося, как известно, высокой репликативной способностью. В этом случае повышается вероятность возникновения резистентных вариантов, которые, возможно, и могли закрепиться в данных условиях. Для пациента в, находящегося в стадии ВЗ, зарегистрирована смена гомологичной популяции ВИЧ на гетерогенную (рис. 10 точка 3). Интересно заметить, что это по времени совпадает с появлением и доминированием в вирусной популяции 81-вариантов ВИЧ. Полученные данные вполне согласуются с гипотезой порогового разнообразия, предполагающей, что иммунная система может супрессировать

В1

Б2

13 11 3117 1 1 ? 1 171 12 37

ч—ттттягчг-

- - ■ „1 ■- ■ ■■ в л - ^ . 1 ~ .

Рис.10. Электрофорез распределения гетеродуплексов, образованных между парами амппифицированных фрагментов области С2-УЗ гена епу референс-плазмид (В, В1, В2, С, О) и вирион- ассоциированной РНК, выделенной из плазмы пациента Б (в различные промежутки времени 1,2,3). НО - указана позиция гомодуплексов, НЕ - позиция гетеродуплексов, оц-ДНК - позиция одноцепочечной ДНК.

вирусное разнообразие в инфицированном организме только до определённого, порогового значения. Затем иммунный контроль над вирусом ослабевает и пациент прогрессирует к СПИД, порождая широкое разнообразие вирусных

о

в

вариантов. У данного больного появляется более гетерогенная популяции ВИЧ с преобладанием 81-вариантов, являющихся одним из неблагоприятных признаков быстрой прогрессии к СПИД. Для пациент К, находящегося как и пациент Б в стадии ВЗ, характерно высокое содержание вирусной ДНК, достаточно быстрым снижением СМ+ Т- клеток и прогрессия к СПИД (терминальная стадия СЗ рнаступила уже через 9 месяцев после окончания эксперимента). Однако на всём промежутке эксперимента у пациента К регистрируется гомогенная вирусная популяция. Полагая, что иммунная система слаба у быстрых профессоров (следовательно, иммунокомпетентный период короткий, в его течение продуцируется меньшее разнообразие вариантов ВИЧ), возможно предположить, что быстрые прогрессоры могут прогрессировать к СПИД с небольшой степенью дивергенции ВИЧ. В данном случае селективное преимущество получают наиболее быстрые варианты (селекция по кинетике репликации). Высоковирулентный вариант ВИЧ, возникший в организме пациента и ставший доминирующим штаммом, приводит к быстрой прогрессии СПИДа и гибели больного.

3. Индукция провируса в условиях теплового шока.

Общее строение провируса, фланкированного длинными концевыми повторами (1ЛЕ.) с короткими инвертированными повторамии на концах, делает его сходным с мобильными генетическими элементами (про-) эукариот, что позволило ещё в 1980 г. 'Гегшп предположить, что ретровирусы возникли из подвижных генетических элементов клетки, которые эволюционировали совместно с ЛТ. В принципе, возможно и обратное предположение, что подвижные элементы генома создавались го провирусов. Правда, до сих пор не удалось обнаружить транспозиций интегрированного провируса. Мы изучили возможность амшшфикациошюй транспозиции ВИЧ в условиях ТШ, выраженной в амплификации провируса. Для проверки этой гипотезы была получена модель инфицированных клеток с фиксированным уровнем интеграции ВИЧ.

3.1. Создание клеточной модели с фиксированным уровнем интеграции вируса.

Мы изучили кинетику репликации вируса (пггамм Ш7) в лимфобластоидных клетках линии Н9. В выбранных условиях заражения профиль накопления суммарной ДНК свидетельствует о реинфекции, повторных раундах заражения клеток новообразующимся вирусом (рис.11).

| 40000 -

¡35000 -

§30000 -

25000

Й 20000 н

и 15000 §10000 -'3 5000-

I о1

О 5 10 15

время, дни после заражения

Рис.11. Кинетический анализ накопления вирусной ДНК в ВИЧ-инфицированной клеточной линии Н9.

Для предотвращения эффекта накопления вирусной ДНК за счет реинфекции, наблюдаемой наш! в нашей экспериментальной системе, мы использовали А2Т. Ожидалось, что препарат, будучи ингибитором обратной транскрипции ВИЧ, сможет предотвратить распространение инфекции в клеточной линии за счёт" реинфекции. Для оценки этой способности и подбора соответстствующей концентрации А2Т, до заражения вирусом контрольные (к-клетки) и стимулированные тепловым шоком клетки (ТШ-клетки) инкубировались в полной среде, содержащей разные концентрации А£Т. Было показано, что концентрация 1ткМ эффективно блокирует накопление провирусной ДНК за счет реинфекции как в контрольных, так и в стимулированных ТШ-клетках. Отметим, что в контрольном эксперименте (без использовашы А£Т\ содержание вирусной ДНК в сотни раз выше (табл.4).

Таблица 4.

Уровень ДНК ВИЧ в культуре инфицированных клеток с различным

содержанием А2Т*.

Концентрация [AZT],mkM время, дни эксперимента; t^O-тепловой шок

5 6 7 8 9 10

число копий ДНК ВИЧ\ 500 кл. контр.кл. ГЛ7Л>1 [AZT]=0.1 520 238 306 300 1072 1430

ТШ-клетки 114 240 238

контр.кл. 318 858 715 953 3574 4306

ТШ-клетки 71 317 1244 1970

контр.кл. [AZT]-0 35742 71484 107647

ТШ-клетки 143 1144 9531 12867 85116

В полученной системе с постоянным низким уровнем интеграции ВИЧ коровый белок р24 в культуральной среде не обнаруживается. Интересно, что сами по себе клетки, стимулированные ТШ (ТШ-клетки), в принципе повторяя профиль накопления вирусной ДНК в культуре нестамулированных контрольных клеток (к-клеток), оказываются менее чувствительными к развитию вирусной инфекции, по крайней мере по механизму реинфекции (табл.4). Отметим, что по известным данным, инфекционные свойства вирусных частиц, продуцированных ТШ-клетками и к-клетками сравнимы в обоих случаях. Однако в наших условиях интегрированный провирус стимулированных ТШ клеток продуцирует столько же вируса, как в не обработанных ТШ клетках (по данным ИФА), при этом интеграция вируса в три раза ниже. Эти данные косвенно указывают на более активное состояние провируса при тепловой стимуляции клеток.

3.2. Амплификация провируса ВИЧ в условиях теплового шока.

Впервые нами показано, что индукция ТШ при 41,5° С инфицированных лимфобластоидных клеток (H9\BRU) вызывает амплификацию провируса ВИЧ (рис.12). Наблюдаемый эффект развивается в первые часы после ТШ и в дальнейшем самоподцерживается. По сравнению с контрольными клетками, содержание вирусной ДНК в клетках, стимулированных ТШ, в 3-5 раз выше.

20 т

18 -

ъ

й 16 --

1 14 -

? 12

я 10 -

а 8

а

ч

"а 6

В о 4 -

а 2 --

-3 7 17 27 37 47 57 67 77 87 97 -Ряд1 к-клетки время, часы после ТШ

. Ряд2 ТШ-клетки

количество ДНК ВИЧ\клетку время, часы после ТШ

-3 7 10 13 19 25 37 49 73 92

к- клетей 0.2 0.2 0.1 0.2 0.3 0.2 0.5 0.8 0.8 3.6

ТШ-клетки 0.2 0.6 0.6 0.6 0.6 0.7 0.8 2.8 5.7 20

Рис. 12. Амплификация провируса в условиях теплового шока.

Полученные данные свидетельствуют, что в условиях ТШ, возможно, ВИЧ реализует другую программу жизненного цикла, проявляя ретротранспозонную активность. Механизм амплификации провируса нами точно не установлен, но неисюпочено, что амшшфикационная транспозиция интегрированного провируса осуществляется без образования РНК-интермедиата, на что косвенно указывает использование в клеточной системе в концентрации, как было показано выше, эффективно блокирующей синтез ДНК.

выводы

1. Разработан и охарактеризован высокочувствительный метод количественной оценки вирус-специфических ДНК и РНК на основе конкурентной ПЦР. Метод позволяет детектировать 1 копию ДНК ВИЧ на 105 клеток, 100 копий РНК ВИЧ\ мл плазмы.

2. Изучена репликативная способность различных штаммов ВИЧ в лимфобластоидных клеточных линиях с помощью количественных методов ДНК (РНК)-ПЦР. Показано, что штаммы ВИЧ с AZT-резистентным фенотипом образуют на порядок меньшее количество ДНК-провирусных копий в сравнении с чувствительными вариантами ВИЧ-1.

3. Обнаружено, что использование комбинации AZT и гидроксимочевины эффективно блокирует образование ДНК-провируса в инфицированных клеточных линиях.

4. С помощью гетеродуплексного анализа изучена комплексность квази-видов ВИЧ in vivo. Показано, что на поздних стадиях ВИЧ-инфекции регистрируется более гомогенная популяция вируса, что свидетельствует о селекции преобладающего квази-вида.

5. Изучено поведение провирусной ДНК ВИЧ в инфицированных клетках в условиях теплового шока. Впервые показано, что тепловой шок вызывает амплификацию вирусной ДНК.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

1)Ёлов A.A., Козлова A.B., Медников Б.М., Корнилаева Г.В., Папуашвили М.Н., Прокопенко В.Д., Карамов Э.В. Детекция ВИЧ в ДНК лимфоцитов. Мониторинг ВИЧ-инфекции на генетическом уровне. Вопросы вирусологии, 1994, т.39, №3, стр. 107-110.

2) Yolov A.A., Kozlova A.A., Yaroslavtseva N.G., Mednikov B.M., Karamov E.V. Quantitative PCR as method for monitoring retroviral infection on the gene level. Virus Genes, 1995, V.10.№l.p.45-51.

3) Ёлов A.A., Козлова A.B, Диагностика и мониторинг ВИЧ-инфекции на генетическом уровне. Успехи современной биологии. 1996. Т.116 №1.С.48-58.

Список опубликованных тезисов по теме диссертации.

1) Yolov A.A., Kozlova A.V., Papuashvili M.N., Yaroslavtseva N.G., Mednikov D.M., Karamov E.V. HIV genome detection for the estimation of the therapy efficiency. Abstract Book of 2-nd International Conference «AIDS, Cancer and Human Retroviruses», 1993, St.-Petersburg, Russia, November 29 - December 3, p. 18.

2) Yolov A.A., Kozlova A.V. and Karamov E.V. Gene-level monitoring of HTV infection by PCR with two internal standards. Abstract Book of X-th International Conference on AIDS, 1994, Yokohama, 7-12 August, PA0193.

3) Kozlova A. V., Yolov A.A., Karamov E.V. Quantitative DNA and RNA PCR for the clinical analysis of HTV infection. Joint meeting «Progress in clinical virology», 1995, Prague, Czech Republic 10-14 September, p. 118 (PA 27).

4) Yolov A.A., Kozlova A.V., Papuashvili M.N., Yaroslavtseva N.G., Bogdanov A.A., Karamov E.V. Gene level monitoring as a way for control of the efficiency of HTV infection therapy. Abstract Book of 3-nd International Conference «AIDS, Cancer and Human Retroviruses», 1995, St.-Petersburg, Russia, May 22-26, p.52.

5) Kozlova A.V., Yolov A.A., Mednikov B.M., Karamov E.V. Analysis of HTV RNA load in the course of therapy by competitive RNA PCR. Abstract Book of 3-nd International Conference «AIDS, Cancer and Human Retroviruses», 1995, St.-Petersburg, Russia, May 22-26, p.65.

6) Kozlova A.V., Pashkova T.A., Abelian A.V., Komilaeva G.V., Yolov A.A., Kozlov A.P. and Karamov E.V. Assessment of HIV-inhibitors combination upon AZT-resistant HTV-1 strains replication by quantitative PCR. Abstract Book of 4-nd International Conference «AIDS, Cancer and Human Retroviruses», 1996, St.-Petersburg, Russia, May 21-25, p.74.

7) Abelian A.V., Kozlova A.V., Kadoshnikov Yu.P., Pashkova T.A., Komilayeva G.V., Yolov A.A., and Karamov E.V. Complex nature of HTV-specific cytopathology: cytotoxicity and cytopathogenicity. Abstract Book of 4-nd International Conference «AIDS, Cancer and Human Retroviruses», 1996, St.-Petersburg, Russia, May 21-25, p. 104.

8) Kozlova A.V., Abelian A.V., and Karamov E.V. Heat shock specific amplification of HIV provirus. Xl-th International Conference on AIDS, 1996, Vancouver, July 7-12, v.2, p.438, Pub A1004

9) Abelian A.V., Kozlova A.V., and Karamov E.V. HIV-positive sera inhibits heat shock srecific amplification of HIV provirus. X-th International Congress of Virology, 1996, Jerusalem, 11-16 August, PW60-29, p.257.

Печать А.А.Данильчук Переплет Т.Д.Герасимовой Компьютерная верстка на настольной издательской системе IBM Подписано в печать 6.03.1998, формат 30*401/8, ризография, печ.л. 1,0, заказ 293, тираж 100.

ИЗДАТЕЛЬСТВО МОСКОВСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО ГОРНОГО УНИВЕРСИТЕТА

Лицензия на издательскую деятельность ЛР № 06809, код издательства 5Х(03) Телефон: (095) 236-97-80

Отпечатано в типографии Издательства Московского государственного горного университета, 117935, Москва, ГСП-], Ленинский, проспект, 6.