Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Серологическая нейтрализация вируса иммунодефицита человека первого типа

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Серологическая нейтрализация вируса иммунодефицита человека первого типа"

На правах рукописи

Абэлям Артур Врежевич

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА ПЕРВОГО

ТИПА

Специальность 03.00.06 - "Вирусология"

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва - 1997

Диссертационная работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского Российской Академии Медицинских Наук

Научные руководители: сг.и.с. КАРАМОВ Э.В.,

академик РАМП КЛИМЕНКО С.М.

Официальные оппоненты: д.м.п. ИРОКУДИНА E.II.

k.G.ii. НИКОЛАЕВА H.A.

Ведущее учреждение: НИИ вирусных препаратов РАМН.

Защита диссертации состотся 1997 г в 12 часов па

заседании Специализированного совета Д 001.20.01 при НИИ вирусолоши им. Д.И.Ивановского РАМН по присуждению ученой степени кандида!а медицинских наук (123098, Москва, ул.Гамалея, д. 16, тел. 190-3048).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института.

Автореферат разослан и<$2' ' 1997 г.

Ученый секретарь

Специализированного совет f

доктор медицинских наук OCJ^^^^' ^осякова Ч-П.

"The man of scicncc who is not seeking for expression bul for a facts to be expressed merely studies nature as a dead language." II. I> Thoreau

Введение

Актуальность проблемы

Впервые неГпрализующую активность сыворотки, хотя и не в применении к вирусам, показали Беринг (Emil von Bering) и его со грудники (Институт Р.Коха в Берлине, 1890 г). Эмиль фон Беринг был удостоен Нобелевской премии по медицине "за его исследования по сывороточной терапии ... в результате чего он открыл новый путь в области медицинской науки и дал в руки врача победоносное оружие против болезни и смерти" - цит. по [Сильверстайн A.M., 1987]. Сотрудник Рокфеллеровского института в Нью-Йорке, Макс Тейлер (Max Thcilcr), установившим филыруемость возбудителя желтой лихорадки, ввел нейтрализующие вирус сыворотки в практику исследований эпидемиологии и патогенеза инфекционной патологии. Он описал тест защиты мышей, при котором смешивание иммунной сыворотки с вирусом предотвращало инфицирование животного при внутримозговом заражении. Ею работы по получению атгенуированпых вакцинных нпаммов вируса сопровождались оценкой их способное!!! индуцирован, попрали lyioittyio активность сыворотки по отношению к дикому варианту вируса (Нобелевская премия 1951 г).

Таким образом, основные приложения серологической нейтрализации начали разрабатываться еще задолго до установления ее природы, свойств нейтрализующих антител и их мишеней. Актуальная в прошлом проблема сохранила свою важность и в настоящее время. Так, пассивная иммунотерапия, предполагающая перенос специфических антител, часто является единственным методом выбора при иммунодефицитиых состояниях (как наследственных, так и приобретенных) [Йегер М., 1989]. Продукция, в ответ на иммунизацию, нейтрализующих антител является критерием отбора эффективных иммуногенов и адыовангов в современных исследованиях по получению вакцин [Ada G L., 1988; Haynes В.F., 1993].

Изучение образования нейтрализующих антител в ходе ecTcci ценной инфекции позволяет понять характер взаимоотношений между возбуди ic.icm и иммунной системой и выбрать оптимальную исследовательскую cipaiemio [Zinkernagel R.M., 1996].

Детали патогенеза инфекции, вызываемой вирусом иммунодефицита человека, до сих пор тракгукнея неоднозначно [Fauci A. et al 1996]. Неопределенность относится и к оценке значимости тех или иных факторов естественной резистентности, включая гуморальный иммунный oibct. Несмшря на

ряд впечатляющих успехов, связанных с применением или индукцией нейтрализующих антител для предотвращения ВИЧ-1-инфекции в экспериментах на приматах [Wigzell H., 1991; Berman P.W., et al. 1990; Girard M., et al. 1991], единого мнения относительно роли нейтрализации ВИЧ-1 во время естественной инфекции у людей нет [Levy J.A. 1993, Vittecoq D., et al. 1995].

В соответствии с вышесказанным изучение роли серологической нейтрализации вируса при ВИЧ-1 инфекции требуем дополни 1слып,1х экспериментальных исследований.

Цель и задачи исследования

Целыо диссертационной работы было изучение роли серологической нейтрализации в ходе естественной ВИЧ-1-инфскции у людей.

В связи с поставленной целыо решались следующие задачи:

1. Провести сравнительную оценку различных эксперимсшальпых подходов по определению серологической нейтрализации ВИЧ-1 in vitro. Разработан, экспериментальную модель нейтрализации ВИЧ-1 in vivo.

2. Изучить способность сывороток крови, полученных OI .Mill инфицированных ВИЧ-1, нейтрализовать ВИЧ-1 in vitro. На основе экспериментальных и клинико-анамнестических данных оценить взаимосвязь нейтрализационных свойств сывороток крови с характером течения инфекции.

Оценить прогностическую значимость нейтрализующей активности для протекания ВИЧ-1-инфскции.

3. Исследовать серологическую нейтрализацию ВИЧ-1 на разных этапах цикла репродукции вируса.

4. Разработать методику получения иммуноферментной системы для обнаружения анти-ВИЧ-1 антител в составе комплексов с антигенами ВИЧ-1. Оцепить роль гуморального иммунного ответа при длительном инаппарамшом течении ВИЧ-1-инфекции.

Положения, выносимые на защиту

1. Развитие ВИЧ-1-инфекции может сопровождаться образованием сильных |руппоспецифических нейтрализующих свойств сыворотки. В таких случаях экспериментально доказанная резистентность к ВИЧ-1 равнозначна протективной иммунизации.

2. Группоспсцифичсский нейтрализующий ответ обеспечивает длительный период с минорными клиническими проявлениями ВИЧ-1-инфскции, но ВИЧ-1-

инфекция с минорными клиническими проявлениями не обязательно сопровождайся группоспсцифической нейтрализующей активностью.

3. Различные мегоды исследования нейтрализующей активности сыворогок дополняют друг друга и необходимы при оценке направлений развишя ВИЧ-1-инфекции.

4. Обнаружена корреляция между нейгрализационнмми свойавами сывороток крови ВИЧ-1-инфицированных и харак|ером течения заболевания.

5. Мишенями нейтрализующего эффекта иммунных сыворо гок Motyi служи п. вирусспецифические компоненты на различных этапах цикла репродукции ВИЧ-1.

6. Разработан лабораторный регламент получения иммуноферментной icci-системы, позволяющей обнаруживать анти-ВИЧ-1 антитела в сосгаве комплексов с антигенами ВИЧ-1. Тест-система может быть использована для изучения особенностей развития гуморального иммунного ответа при ВИЧ-1-инфекции.

Научная новизна и практическая ценность работы

Разработан комплексный по;1ход к изучению серологической нейтрализации ВИЧ-1, включающий:

1) определение гомо- и гетерологичсской нейтрализующей активности при трансмиссии ВИЧ-1 от изолированных из периферической крови инфицированных клеток к неинфицированным пермиссивным клеткам (модель нейтрализации вируса in vivo);

2) оценку нейгрализации стандартизованных гомо- и гетерологичпых первичных изолятов ВИЧ-1 (нейтрализация вируса, прошедшего пассирование в условиях отсутствия иммунного прессинга);

3) оценку нейтрализации штамма ВИЧ-1, адаптированного к лимфобласгондной линии клеюк.

Получены результаты, свидетельствующие о прогекгивной роли нейтрализующей активности сыворотки при ВИЧ-1-инфскции у людей. В 11 из 12 рассмотренных клинических случаев полученных с применением нейтрализационных тестов данных было достаточно для верного прогнозирования характера течения ВИЧ-1-инфекции.

Показано, что не всегда ранняя клиническая стадия ВИЧ-1-инфекции сопровождается образованием группоспецифичсских нейтрализующих свойств сыворотки крови, что необходимо учитывать при пассивной иммунотерапии ВИЧ-1-инфекции. Мы предлагаем для целей пассивной иммунотерапии использован, серологические образны только после оценки их нейтрализационных свойств.

Экспериментально установлена способность ВИЧ-1-позитивной сыворотки влиять на течение внутриклеточных этапов репликативного цикла вируса.

Показано, что ВИЧ-1-позитивная сыворотка способна подавлять индуцированную тепловым шоком амплификацию провируса ВИЧ-1. Данный методическим подход может бып> использован при изучении процесса hhtci рации провируса с кжчочным

гспомом.

Разработана методика получения иммунофсрмспгпой ieci-систсмы для детекции аити-ВИЧ-1 антшел в составе циркулирующих в плазме крови специфических комплексов с белками ВИЧ-1. Данный подход позволяет обнаруживать ВИЧ-специфические антитела задолго до периода их гиперпродукции. Кроме юго, этап специфического взаимодействия антител с антженными С1руктурами происходит в организме, где конформационно-зависимыс эпиюпы вирусных белков имеют свою естественную форму, невоспроизводимую in vitro. Предложенная нами иммуиоферментная система может быть использована для изучения гуморального иммунитета в период, предшес! вующий ссроконверсии.

Апробация работы

Результат работы докладывались на X международном вирусоло! ическом Конгрессе (Иерусалим, Израиль 11-16 августа 19%), на XI международной конференции по СПИД (Ванкувер, Канада, 7-12 июля 1996), на 5-й международной Конференции «СПИД, рак и родственные проблемы ) (СПб, 25-30 мая 1997), на научно-практических конференциях в Московском городском Центре СПИД (1996, 1997 гг) и научных семинарах НИИ вирусоло! ни. Заседание Coboki по предварительной экспертизе диссертационных paooi НИИ вирусоло! ни им. Д.И.Ивановского РАМН, на котором была рассмотрена настоящая диссертация, состоялось 19 июня 1997 г.

Публикации

По материалам диссертации чпыре печатных рлбоп.1 опубликованы и одна принята в печать.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 3-х глав экспериментальных исследований (каждая, в свою очередь, включает введение, материалы и методы, результаты и обсуждение), выводов и библиографическою списка лшературы

Общий объем работы - 120 страниц машинописного текст, включающего 15 таблиц и 20 рисунков (фотографий). Список литературы включает 171 источник.

Теоретическая часть.

Обзор литературы. Рассм.иривастся феномен серологической нейтрализации ВИЧ-1 в ходе естсствсниой инфекции. Описываются природа и свойства нейтрализующих антител. Приведены данные по распределению и ошостслыюму протективному значению различных эпигопов нейтрализации в составе вирусных белков. Анализируются механизмы феномена ней трализации и па теистическое значение способное! и вируса противостоять нейтрализации. В целом подчеркивается необходимость и важность получения и поддержания состояния с высоким уровнем антител, псрскрсспю-нсшрализующих различные варианты ВИЧ-1. Методами выбора могут быть вакцинирование живым апепуированным вирусом и пассивная иммунотерапия.

Экспериментальная часть

Глава 1. Изучение нейтрализующей анти-ВИЧ-1 активности сывороток, полученных от лиц инфицированных ВИЧ-1.

Материалы и методы Клетки: I. Мономорфноядерные клетки из периферической крови 12-ти ВИЧ-1-инфицированных (таблица 1) и здорового, неинфицированного ВИЧ-1, донора; 2. Клетки лимфобластоидной линии Н9 (С04+).

Таблица I.

Характеристка ВИЧ-1 инфицированных, кровь которых была использована в ходе настоящего исследования.

Код инфицированного Путь инфицирования Время после инфицирования Стадия пнфекцин1 I! »оляция нируса

274 половой несколько лет ЗВ + (1/200)

303 парентеральный несколько лет ЗВ + (1/1600)

917 половой 3 мес. 2В -

283 половой несколько лет ЗВ + (1/800)

821 половой 2 года ЗА + (1/800)

919 не установлен ? (минимум 6 мес.) ЗА + (1/1600)

883 половой 14 мес. 2Б -

927 половой 2 года ЗА -

785 половой 2 года ЗА + (1/800)

769 половой 2 года ЗА + (1/1600)

924 половой 1 год 2В + (1/200)

414 половой 6 мес. 2В + (1/1600)

Примечания: 1 - согласно классификации В.В.Покровского (1989).

: - «+» - вирус удалось изолировать, в скобках указано разведение, соответствующее одной TCID4,: «-» - изолировать вирус не удалось.

Вирус: 1. Девять первичных изолятов ВИЧ-1, полученных в ходе настоящей работы (1аблица 1). 2. Лабораторный штамм ВИЧ-1 (hilv.hi ЯР ыш 1тез), пассируемый в культуре клеток Н9.

Сыворотки (таблица 2): 1. Образцы сыворотки крови 12-ти ВИЧ-1 инфицированных с высоким анти-ВИЧ-1 титром. 2. Образцы сыворотки крови 15-ти ВИЧ-1 серонегативных доноров (Ом5). Сыворотки получали в стерильных условиях. После разделения на аликвоты по 0.5 мл подвергали тепловой обработке (+56°С - 30 мин.) для инактивации инфекционности и белков системы комплемента. Храпение --40 »С.

Таблица 2.

Характеристики использованных в работе сывороток1

Код сыворотки Кагсюрпя Титр в "СкрннВНЧ" Тигр в "Эко-ЛаО" Тигр в "Пешчскрнн-2" Сисюр aimrreii в "Блог-ПНЧ"' [р24Г гнк-нич 1 I) I'blllOpOIKC

Dm, В11Ч- 0,00

274 В11Ч + 32 000 5 000 5 000 GAO, ENVi, POL 0,00 +

303 ВИЧ + 16 000 5 000 500 GAO. ENVi. POL 0,12 +

917 ВИЧ + 64 000 2 500 5 000 GAO. ENVi. POL 0,00 +

283 ВИЧ + 64 000 2 500 5 000 GAO. ENVi, POL 0,51 +

821 ВИЧ + 16 000 1 250 2 500 GAG. ENVi, POL 0,00 +

919 ВИЧ + 16 000 2 560 2 500 GAG, ENVi. POL 0,13 +

883 ВИЧ + 64 000 1 250 2 500 GAO. ENV,. POL 0,23 +

927 ВИЧ + 16 000 5 000 5 000 GAG.ENVi, POL 0,00 +

785 В11Ч + 64 000 2 500 25 000 GAG, ENVi, POL 0,09 +

769 ВИЧ + 32 000 1 250 2 500 GAG. ENVi. POL 0.00 +

924 ВИЧ + 64 000 1 250 2 500 GAG. ENVi, POL 0,00 +

914 ВИЧ + 32 000 2 500 2 500 GAG. ENV,. POL 0.31 +

Примечания:

'Отрицательный результат обозначен как «-».

2В данной тест-системе (дот-ИФА) выявляются антитела, специфичные к рекомбинантным GAG (р24, р!7), ENV, (gp120, gp41). и POL (р51) ВИЧ-1, а также ENV2 (gpl 10, gp38) ВИЧ-2.

3[пг/(мл сыворотки)] после разрушения иммунных комплексов (НПО «Вектор», Кольцово). Без разрушения р24 не детектировался.

■"Гнездовая РНК-ПЦР на последовательность гена gag ВИЧ-1: SK39/SK146 - внешние праймеры; SK104/SK436 - внутренние праймеры .

Иммуноферментный анализ на антигены ВИЧ-1 Влияние сывороток на репликацию ВИЧ-1 in vitro оценивали сравнением содержания антигенов вируса в ростовой среде. Использовали полученную в НИИ

вирусологии поликлональпую систему сэндвич-ИФА (Жданов В.М. и др., 1986) на основе препарата иммуноглобулинов, выделенных нами из сыворотки крови инфицированного ВИЧ-1. Активность указанною препарата в качестве amurca «захвата» по отношению к стандартному антигену ВИЧ-1 (рекомбинангный р24) представлена на рисунке 1. Порог чувствительности системы составляет 0.1 нг/мл. Для расчет степени подавления инфекции проводили линейную логарифмическую интерполяцию величин титра. Подавление инфекции не менее чем на 50% относили на счет нейтрализующей активности (руководствовались работами Nara P L. et al 1987; Moore J.P., et al 19%)

Культура клеток

Фракцию мономорфчонукпеарных клеток периферической крови (МПК) получали по стандартной методике в градиенте фиколла-400 ("Pharmacia") с урографином (р= 1.077 г/см '). После отмывки и подсчета MflK из крови ВИЧ-негативного донора 106 клеток культивировали в 1 мл ростовой среды ((RPMI 1640 (Институт полиомиелита, РАМН), 15% фетальной телячьей сыворотки (ФТС) "Sigma", 1 млМ L-глутамина, 5 мкг/мл фитогсмаггшотинина (ФГА) "Sigma")). Условия культивирования: 37° С, 5% СОг. Через 48 ч клетки центрифугировали и ресуспендировали в ростовой среде дня сокулыивации (1.5 млн. клеток в мл): RPMI 1640, 1 млМ L-глутамина, 2 ед./мл интерлейкина 2 (ИЛ-2; "Lymphocult - Biotest Diagnostics"), 10% ФТС. Подготовленные таким образом клеши использовали для получения первичных вирусных изолятов и оценки опосредованной сыворотками нейтрализации ВИЧ-1.

Рисунок 1

Кривая титрования р24. Указана величина оптической плотности (OD) за вычетом cut off

р24 (нг/мл)

Серологическая нейтрализация трансмиссии ВИЧ-1 в смешанной культуре клеток

На начальном этапе исследовали нейтрализацию вирионов ВИЧ-1, продуцируемых собственными клетками инфицированного. Для эюю определяли способное п. сыворотки нейтрализовать трансмиссию вируса из MIIK инфицированных, в МПК ВИЧ-1 ссропскиивных доноров (клоки 274 - 785) или в клетки линии Н9 (клетки 769 - 914). 1.5 млн. ММК ВИЧ-ипфициронанно! о смешивали с 1 млн. незараженных клеюк в 1.5 мл росювой среды, составленной из RPMI 1640, 10% ФТС, L-глутамипа до I млМ и ИЛ-2 (2 сд./мл). Для сокулыивации использовали 24-х луночные планшеты "Costar". В ростовую среду указанной смешанной культуры клеюк вносили тестируемую сыворотку до конечной концентрации 10°о (титр 10). В контрольные лупки вносили ВИЧ-нааГивную сыворотку. Через 3-е суток клетки отмывали центрифугированием и переносили в свежую среду. Эффективность нейтрализации оценивали по содержанию антигенов ВИЧ-1 иммуноферментным анализом лизата суспензии клеток в ростовой среде па 7-й, 14-й и 21-и день культивирования. В последнем случае ростовую среду положи i е. |]>пых па ВИЧ-1 клеючных культур оцсляли цсшрифушрованисм, разделяли но 0.5 мл и хранили при -70" С для последующих исследований. Образцы ростовой срсды, инфекционные для незараженных псрмиссивных клеток были, как первичные изоляты ВИЧ-1, охарактеризованы и стандартизованы (см.табл.1 и 3).

Таблица 3.

Фенотипичсские характеристики полученных изолятов

Июлят Клетки - мишени Сшщипшеобразоеание

274 Б.таст-трансформированные лимфоциты пег

303 Бласт-трансформнрованные лимфоциты есть

283 Бласт-трансформированные лимфоциты нет

821 Бласт-трансформированные лимфоциты нет

919 Бласт-трансформнрованные лимфоциты нет

785 Б.таст-трансформированные лимфоциты нет

769 Клетки линии Н9 ест 1,

924 Клетки линии Н9 есть

914 Клетки линии Н9 есть

В условиях данной экспериментальной системы существует порог дозы заражения, превышение которою никак или слабо отразится на концсшрацин детектируемых вирусных антигенов (рисунок 2). Из шеюфаммы слсдуст, чю методом И ФА эффект нейтрализации может быть обнаружен в юм случае, ко!да доза заражения лежит в интервале от 10 до 80 ТСЮ;„

Изолят 303; 11-е сутки

° Я 5 S s я

х- со

Рисунок 2. Доза заражения и эффсктвпосн. продуктивной инфекции. В интервале от Ю до 80 ТСЮ5о уменьшение дозы заражения сопровождается снижением концентрации вирусных атигенов. Использование больших доз может искази п. интерпретацию результатов пейфализации.

КЫшчестно TCID50

Нейтрализация вирусных изолятов и лабораторного штамма

Накопление вируса в ростовой среде и cí o межклеточная трансмиссия в контрольных смешанных культурах происходят без влияния, оказываемою специфическими аш телами in vivo. В силу этого мы изучили нейтрализуемое и, полученных вирусных изолятов и сравнили пейфализациониые свойства сывороток, проявленные ими в этом опыте и в смешанной культуре клеток. Вируссодержащую жидкость (Ю TCIDад) и сыворотку (в разведениях l/IO, I/20, 1/40, I/80, 1/I60 и 1/320) вносили одновременно в культуру МПК из крови ВИЧ-негативною здоровою донора (250 тыс. кл в мл). Через 24 ч клетки отделяли центрифугированием и переносили в свежую ростовую среду того же состава (RPMI (640, I млМ L-глутамина, 15° о ФТС). Через 7 суток иммуноферментным анализом определяли титр антигенов ВИЧ-1 в культуральной жидкости. Сравнение проводили с контрольными образцами, в которых использовалась негативная к ВИЧ-1 сыворотка.

Мы также оцепили нсГпралнзующую активность иссле/^смых сывороток по отношению к адаптированному к культуре клеток Н9 штамму ВИЧ-1 (htlv-iiiRF nui i98î). Здесь, в качестве контроля эксперимента использовалась референс-сыворотка полученная в рамках NIH AIDS Research and Reference Reagent Program с нейтрализующим тигром 1/64 . Опыт проводили по вышеизложенной схеме.

В таблице 4 суммированы результаты тестирования сывороток в смешанной культуре клеток (МПК ВИЧ'Ч" и МПК ВИЧ"-"). Огмегим сыворотки 917, 883 и 924, подавляющие па 100% инфекцию во всех смешанных культурах, за редким исключением (919 и 785). Сыворотки 919, 785 и 769 существенно подавляли развито инфекции в ауюлогичсских СКК. Оцснип, нешрализуюшую активноеи> сывороюк 917, 883 и 927 в аутологических СКК не представилось возможным - в контрольной культуре не произошло развития продуктивной инфекции. Ни один образец

Результаты

1 о

сыворотки крови ог 15-ти здоровых ссропстативных доноров ис окал,шал существенного нейтрализующею дсйс1вия на ход инфекции (более 50°о подавления).

Таблица 4.

Степень подавления ВИЧ-1 инфекции в СКК сыворо1ками ВИЧ-1 инфицированных (%) относительно контроля инфекции. Разведение тестируемых

сывороток - 1/10'.

КЛЕТКИ СЫВОРОТКА

274 303 917 283 821 919 883 927 785 769 924 914

274 20 40 100 -20 -20 40 100 -20 40 20 100 -20

303 0 25 100 0 0 25 100 0 25 25 100 0

283 15 0 100 -15 0 40 100 15 30 30 100 -15

821 -15 0 100 -15 0 40 100 15 30 30 100 -15

919 0 35 50 -15 0 50 50 0 35 20 65 0

785 15 0 50 -35 0 35 65 0 65 35 65 -20

769 15 15 100 -15 0 35 100 0 35 50 100 -20

924 25 25 100 -100 -25 0 100 -50 0 -25 100 -25

914 0 40 100 25 0 40 100 0 25 15 100 15

Примечание: 1 - отрицательная величина означает, чю сьшоронса оказываем обратное (усиливающее) действие па репликацию вируса.

При анализе нейтрализационных свойств сывороток по отношению к полученным изолятам ВИЧ-1, ус!анавливался максимальный титр сыворотки, с той или иной эффективностью подавляющий развитие инфекции в культуре клеток. Результаты суммированы в таблице 5. Характерно, что при такой постановке опыта проявили нейтрализующую активность прежде совершенно инертные сыворотки.

Таблица 5.

Нейтрализация изолятов ВИЧ-1 in vitro (указан титр сыворотки, подавляющий

инфекцию на 50%; данные ИФА)

изолят СЫВОРОТКА

274 303 917 283 821 919 883 927 785 769 924 914

274 80 - 320 - - - 160 ■ - - 80 -

303 160 320 - - - 320 320 - - 160

283 - - 320 - - - 320 320 - - 80 -

821 - - 160 - - - 160 - - - 80 -

919 - - 320 - - 80 320 - - - 160 -

785 - - 320 - - - 160 - 80 - 320 -

769 - - 320 - - - 100 160 - 160 160 -

924 40 40 320 - - 80 100 - 80 40 320 40

914 - - 320 - - - 100 - - - 320 40

' - прочерк означает отсутствие 50%-й нейтрализующей активности в минимальном

титре (10).

На последнем этапе работы была оценена нейтрализующая активность сывороток по отношению к лабораторному штамму ВИЧ-1, адаптированному к

линии клеюк Н9 (luivin RF; см. табл.6). В лом опыте рсфсренс-сыворо1ка полностью подавляла развитие инфекции в разведении от 1/50 до 1/100.

Таблица 6.

Нейтрализация ВИЧ-1 im.v-ui RF (указан титр сыворотки, подавляющий инфекцию на 50%; данные ИФА).

Ci епень подавлении инфекции СЫВОРОТКА

274 303 917 283 821 919 883 92 7 785 769 924 914

50 % 80 320 320 20 20 80 20 320 40 160 320 40

100 % 20 40 40 - - - 40 , - 20 80 -

* - прочерк означает отсутствие 50%-й нейтрализующей акшвности в минимальном титре (10).

Обсуждение

Сыворотка крови инфицированного ВИЧ-1, может не иметь по отношению к этому вирусу нейтрализующей активности (283 и 821), имен, аутолог ическую нейтрализующую активность (274, 303, 919, 785, 769 и 914) или с высокой эффективностью нейтрализовать многие варианты ВИЧ-1 (917, 883 и 924) - см.табл. 4 и 5. В трех последних случаях ВИЧ-1-инфекция привела к генерации выраженной группоспецифичсской нейтрализующей активности, напоминающей состояние после эффективной вакцинации (в части гуморальной составляющей).

Исходно, все изученные нами клинические случаи, сопровождающиеся группоспецифичсской нейтрализующей активностью (917, 924 и 883), характеризовались ранней клинической стадией инфекции (см.табл.1). В остальных случаях заболевание находилось на поздних, - ЗА - ЗВ стадиях, либо, как в случае 914, - на стадии 2В. Таким образом, наличие группоспецифической нейтрализации коррелирует с ранними стадиями заболевания, но не vice versa. На поздних клинических стадиях нейтрализующая активность в СКК, по нашим оценкам, либо отсутствует (не превышает принятый нами 50%-ый порог), либо строго типоспсцифична (сыворотки 785, 769, 919; табл.4). Нейтрализующая активность по отношению к аутологичным изолятам обнаружена у большинства сывороток. Так, все сыворотки (за исключением 283, 821) подавляют аутологичные изоляты (таблица 5). Способными к перекрестной нейтрализации по-прежнему оказались только три сыворотки (917, 883 и 924). Остальные ci,(воротки нейтрализовали лишь один из восьми гстерологичных изолягов (924).

Все сыворотки с той или иной эффективностью нейтрализовали штамм ВИЧ-I Mii.v iii RF (таблица 6). Максимальный титр нейтрализации обнаружен у сывороток 303, 917 и 924. Минимальный титр имели сыворотки 283, 821 и 883. Если первые две

и в предыдущих 'iccrax были, как правило, ипертпы, ю дня сыворош! 883 подобная слабая нстрализующая активноегь установлена впервые.

На основе изучения нстрализационных свойств сывороюк нами сделаны предположения ошосигсльио характера развития инфекции в каждом из клинических случаев, отраженные в 1аблице 7.

Таблица 7.

Пронюз течения ВИЧ-1 инфекции согласно характеру нейгрализационных свойств сывороток крови.

Клинический случай Характеристика ней 1 ралнзацноппмх свойств1 Пронин именин ннфскшш

917 1 ВИЧ-инфекция бо npoipcccmi в СПИД

883 I ВИЧ-ннфекция без прогрессии в СПИД

924 I ВИЧ-ннфекцня без прогрессии в СПИД

769 II status idem

919 II status idem

785 II status idetn

303 III медленная прогрессия в СПИД

274 III медленная профессия в СПИД

914 III медленная прогрессия в СПИД

821 IV быстрая прогрессия, СПИД

283 IV быстрая про|рсссня, СГШД

927' V неопределенным

1 I - перекрестная нейтрализация;

II - нейтрализация в аутологнчсской СКК и аутологнчпо! о и ю.ша;

III - nciiipa iniamiH аую.чо|нчнечо ишлиш;

IV - отсуизвне нейтрализации;

V - недостаточно данных.

Мы сравнили наши предположения относительно течения заболевания с состоянием инфицированных спустя 8 и 15 мес после выполнения экспериментов (семинары в МГЦ СПИД; апрель и ноябрь 1997 г). Клиническое сосюянис ВИЧ-1 -инфицированных 917 - 785 за истекшие после экспсримсшов 15 мсс не ухудшилось. В случаях 917, 883 и 924 медикаментозная терапия ограничивалась специфическим антиретровирусным препаратом (азидотимидин). В случаях 769, 919 и 785, как правило, возникали показания к назначению дополнительной антибактериальной и противовирусной терапии. Клиническое течение заболевания в случаях 303 - 283 характеризовалось в этот преиод неуклонной прогрессией, нссмо1ря па проводимую терапию. Причем, если в случаях 303, 274 н 914 удавалось достичь временных ремиссий, то пациенты 283 и 821 в настоящее время находятся на терминальной стадии ВИЧ-инфекции. Показаклен характер прогрессировапия заболевания у пациента 914. В относительно короткий срок состояние пациента ухудшилось со стадии 2В до стадии ЗБ-ЗВ. Напомним, что его сыворотка, полученная в период клинического благополучия, практически не обладает нейгрализующей акшвпостыо

I л

(таблицы 4 и 5). В целом прсдставлястся, что полученных нами с использованием нейтрализациопнмх гесюв данных оказалось достаточно дня верною npoi поза течения инфекции.

Отсутствие универсальною метода для оценки нситрализационных cboíícib сыворотки крови при инфекции ВИЧ-I дсласт исследование проблемы весьма сложным. Прслложснная нами система с использованием нескольких экспериментальных подходов позволила дифференцировать и классифицирован. ВИЧ-инфекцию по xapaKicpy нсГпрализационною oibcui.

При сравнении резулыатв, полученных тем или иным мстодом, обратаст на себя внимание то, чю нейтрализация в СКК очень хорошо согласустся с нейтрализацией первичных толя тов. При эюм оба метода дополняю i дру| др\та. Так, нейтрализация в аутологичсской СКК позволила выделить случаи 769, 919 и 785 в отдельную группу. Случаи 914, 303 и 274 огличаст oí 283 и 821 пешралипщия аутологичиого изолята вируса. Отмеченное нами отсутствие корреляции между способностью сыворотки к нейтрализации лабораторного штамма ВИЧ-1 и нейтрализации клинических изолятов вируса соответствует описанному ранее |Daar E S , et al. 1990]

Чрезвычайно нижними как в 1сорсшческом. |ак н в пракшческом о [ношении представляются результаты анализа лиц на стадии первичных проявлений ВИЧ-инфекции. Свидетельство тою, что ранняя стадия инфекции сама по себе не является гарантом активных пейтрализациоипых свойств емпорожн может изменить существующий подход к подбору серологических материалов для пассивной иммунотерапии [Vitlecoq D., et al. 1995). По нашему мнению, такой подход должен включан, тестирование нситрализационных свойств сывороюк.

Способность к перекрестной нейтрализации межклеточной трансмиссии ВИЧ-1 in vitro может in vivo означать устойчивость к повторным заражениям эшм вирусом. Эти данные также свидетельствуют о том, что естественная ВИЧ-инфекция у людей может протека п> с развитием выраженной защиты по ошошеншо к разнообразным вариашам ВИЧ-1. Из опьпов в СКК следует, что такая защит может распространяться на многие варианты ВИЧ-1 (все?).

По-видимому, существует функциональное ограничение распознавания важных для нейтрализации вируса эпнюпов. Иммунный ответ на эпитопы кросс-нейтрализации ВИЧ-1, присущие ВИЧ несмотря на всю его изменчивость ((участок связывания с рецепюром CD4, эпитопы пешрализации gp4I (например, с сердцевиной из аминокислот 659 - 665)), эпитопы нейтрализации р17)) как и на любые дру] не иммуно1сны, зависш oí продуктов главною комплекса гистосовмсстимости (ГКГС). Наследуемое наличие или отсутствие тех или иных

генов ГКГ'С, равно как и активная модуляция их экспрессии вирусом, очерчивает круг мишеней иммунного ответа при ВИЧ-инфекции. Эпигопм кросс-нейтрализации в ног круг moi yi не попаси..

Если верна 3ia гнпокза, ю возрастет значение пассивной (или замссжклыюй) иммунотерапии в форме переливаний ипакжвированной иммунной плазмы (сыворотки). Наоборо!, активная иммунизация, при рестрикции иммунного ответа к эпигонам кросс-нейтрализации, окажется неэффективной.

Глава 2. Нейтрализация ВИЧ-1 на внутриклеточных стадиях цикла репликации вируса

Механизм феномена пей грализацпи не сводшся только к блокированию взаимодействия вируса с клеткой [Dimmock N.J. 1984J. Мы исследовали феномен пост адсорбционной нейтрализации, на модели индукции теплового шока в инфицированной клетке. Ранее в группе иммунохимии НИИ вирусологии и в лабораюрни вирусологии МГУ было показано, что iсиловой шок (ТШ), приводи! к амплификации провируса ВИЧ-1 [Козлова A.B., Абзлян A.B. и Карамов Э.В., 1996]. Индукция тепловою шока в клетке, содержащей маркерный ген, окаймленный парой LTR, приводи! к зпачшсльному усилению экспрессии маркерпою icua [GoudsmitJ et al., 1987]. Удалось показать, что такое усиление распространяйся и на полноразмерный геном ВИЧ-1 |Karamov E.V. et al., 1988]; сделан вывод о резкой аимуляции продукции вирноиов [Fauci A., et al. 1990]. Мы исследовали влияние иммунной сыворотки на индукцию тепловою шока при ВИЧ-инфекции.

Материалы и методы Клетки. Клетки лимфобласгоидпой линии Н9 (CD4+) Кулыивирукнся в ростовой среде следующего соскша: RPMI 1640, фекин.ная телячья сыворотка до 10°о и 1мМ L-глутамина. Вирус. ВИЧ-1, ниамм uriv iii RF, получснн1.1Й в резульiaiс острой инфекции в клетках линии Н9. Нейтрализующая сыворотка . Рефсрсис-сыворотка [NIH AIDS Research and Reference Reagent Program],

Условия индукции теплового шока (ТШ). Аликвогы 3x10'клеток в 2-х мл полной среды в полипропиленовых пробирках помещали в водяную баню с циркулирующим поюком при кмпсратурс 41,5±0,5"С в 1ечсние 60 мин. Такие же аликво1ы клеток в аналогичных пробирках были оставлены при комнатой 1смпературс (негативный контроль). Спуая указанное время клетки переносили в 24-х луночные планшеты с полной сменой культурадьной среды па свежую. В результате каждая лунка содержала Зх 10 1 клеток в 2-х мл среды.

Условия заражения клеток. К 250 ii.ic. клеток линии НУ n I мл росювой срсды вносили вируссодсржашую жидкость |ак. чюбы TCID™ сосшвляла 10. Ча два часа до заражения в росювую среду добавляли азидошмндин до 10 6 М.

Нивелирование эффекта реинфекции . Была оценена способность различных доз азидотимидина (АЗТ) полностью предотвращать накопление провирусных копий за счет рсинфекнии. За два часа до заражения в культуральную среду вносили азидошмндин до одной из следующих концентраций: I0-SM, 10 ''М и Ю'М. Каждые 24 ч в среду вносили 50"о начальной дозы АЗТ. Также, каждые 24 ч на про1яжении 7 сутк из част клеток выделяли loia.n.nyio клеточную ДНК и с помощью количественной ДНК-ПЦ1' определяли число копий провируса ВИЧ-1 на клетку. Вспомогательную информацию получали с помощью ИФА па анмисны ВИЧ-1 (см. выше) и окраской клеюк трнпановым синим.

ДНК выделяли лизированием клеюк в буфере (20мМ Трис-HCI pH 8,0, Тригон Х-100 до l°ci, Твин 20 до 10о) и очисткой фосфоцеллюлозой при 95"С в течение 20 мин.

Количественная ДНК-ПЦР. Проводили гнездовую ПЦР с праймерами как на ген pol ВИЧ-1, так и на клеточный ген HLA-DQa. Число искомых генетических последовательностей определяли по отношению к стандартам. Количество копий провируса ВИЧ-1 на клетку определяли по отношению к количеству копий указанного клеточного гена. Методика разработана в группе иммунохимии НИИ вирусоло! ип [Yolov A.A., cl al 1995].

Нейтрализация ВИЧ на модели индукции теплового шока. Через 24 ч после заражения (см. выше) клетки отмывали центрифугированием и рссуспендировали в 1 мл свежей срсды того же состава до концентрации 350 тыс. в мл. Последующие двое суток клетки культивировали в среде либо с добавлением нейтрализующей сыворотки (пир 20), либо без добавления (контроль нейтрализации). Далее проводили индукцию ТШ (см. выше). После перенесения клеюк из пробирок в планшет каждая лунка содержала 500 тыс. клеток в 2-х мл среды. Клетки лизировали, выделяли ДНК и проводили количественную ДНК-ПЦР.

Результаты

Тепловая обработка линфобластоидиых ки'ток. Снус1я 1 - 1,5 ч после выдерживания при указанных условиях (41,5"С в ючение 60 мин) клеточная кулыура приобреыс! специфические морфологические черты: харак1ерные для клеток Н9 кластеры исчезают, клегки становятся крупнее, «ошариваются». К концу первых суток приблизительно 60°о клеток noi ибаст. Морфология гибели клеток наномипас! апоптоз: в результате клазматоэа плазмолеммы в тесной связи с клеткой образуемся

небольшие везикулы; через иекоюрос время собственно клока оаиошпея НС01ЛИЧНЧ0И 01 Iакпх везикул.

Пипслирошнис рашфекцни алнЬтимш^шом : I) ни одна из испьпанных коиисшраций АЗТ не предотврашла начального заражения кле/ок; 2) Ю-'М и Ю'М прспарам на !00"о блокирую! дальнейшее накопление провирусных копий; 3)10'М и Ю'М не юкенчны; 4) 10'М А') Г и режим по;[держки коннешрании нренара1а мо|уг использования для предо!вращения рсипфекции.

Амн шфиксщия провируаюй ДНК ВИЧ. Эффск! амплификации развивается в первые часы после тепловой оГ>рабо!КИ и в дальнейшем самоподдержтшаося (рисунок 3). Представляется, чю амплификация происходи! в два опта. Во время первою (3-5 ч после !епловой обработки) происходи! гроскрамюе увеличение числа провирусп!.1х копий (300 прошв 100 в кошрольных клоках). В дальнейшем около суток такое соотношение сохраняйся (плато на ¡рафике). Второй этап заключается в повторном увеличении числа копий провируса: в последней экспериментальной точке (96 ч) разница с контролем становится 6-ти кратной.

Рисунок 3. Амплификация провируса В11Ч-1 при индукции в клсткс iсилового шока.

Нейтрализация амплификации нровируешт ДНК ВИЧ. Число копий провируса ВИЧ при индукции ТШ в клоках, кудиивирующихся в среде с нейтрализующей сывороткой достоверно ниже, чем в кошролс IUI (уровень значимости р<0.05) - рисунок 4. Вместе с icxi, кривая изменений провируса в клоках, обработанных нейтрализующей сывороткой, огшчаося oi кошролыюи. Через 12-16 ч происходит некоторое увеличение числа копии провируса. по-видимому, соответствующее вюро.му aiany амплификации провируса ВИЧ в кошролс TILI.

600

о

3 7 И 24 40

Время тюле iciltoboh обработки (чаем)

p 450

я 400

tr 350

§ 300

X 250

4 200

I 150

5 Ю0

-D-TILI+Ai

—Koiri|X).n,

Till

0

0 12 24 36 48 56 Время пех; ic u'H'ionoii обработки (чаем)

Рисунок 4. Подавление амптификации провируса ВИЧ-1

Механизм влияния сыворогки крови, содержащей специфические апппела, на провирус ВИЧ-1 не ясен. Пока, очень трудно себе предстаешь, что нейтрализация может быть вызвана взаимодействием аиппел с повсрхносшыми белками вируса в cociaec циюмембраны. Последние вряд ли в сосюянпи опосредован, внутриклеточные собышя, изменяющие экспрессию юнстческою Maicpiiaia (они не связаны с какими-либо вторичными мсссснджсрамн). Исключение может составит!, р17, коюрый содержиi NLS - учасюк внутриядерной гракцни и может находип.ся в двух формах - фосфорн.шроваиной и дсфософорилированной, обладающими различными гранспоршыми функциями. Наконец, i нпотетнчсски, можно предполагать проникновение антител в K.iciKy и внутриклс!очное связывание с мишенями. Формально, такое объяснение не лишено смысла, гак как проникновение внутрь клетки совершенно обычное событие для slgA - секреторного иммуноглобулина класса А. Во время гранешпоза аиппело может связывать внутриклеточные мишени.

Глава 3. Иммуноферментная система для обнаружения антител в составе комплексов с антигенами ВИЧ-1.

Иммуноферментное выявление анти-ВИЧ антител с применением распространенных в настоящее время диагностических icci-chcicm основано на специфическом связывании анппел с ашигенными сгрумурами (пепшды, рскомбинаншые белки, вирусные лизан.]), сорбированным» на юердую фазу. Обнаружение анги!с.1 в таких сис!смах ограничено следующими условиями: 1) актвпые цсшры анппел свободны, то ecu. не связаны с апппеном и 2) сорбиронанные анпиенные струкiypi,i воспроизводя! хо!я 6i,i часи. эпнюпов иммуногена. Э1И условия не выполияюкя в период 1ак называемого

«ссронсгашвпого окна», когда свободные антитела отсутствуют, а также в случае исключительной продукции иммунной сис1смой антител, специфических к невоспроизводимым in vitro эшпопам белков ВИЧ-I. Первое состояние прсдсктляс! особую опасность для банков препарате крови, а второе - ишсроспо ятя изучения паююнеза ВИЧ-инфекции.

Полученная нами иммунофермспгная система предполагает детекцию ашитсл в соааве циркулирующих в плазме крови специфических иммунных комплексов (ИК) с белками ВИЧ-1 (рисунок 5). Обьск! узнавания - Fc-фрагмешы антител, с которыми сисцифичсски взаимодействует белок А из Staphylococcus aureus. В основе подхода - возможность иммуноаффинно отделить 1акие комплексы от любых других при условии, что хотя бы часть антигенных детерминант свободна. Иммуносорбснт представлен Р(аЬ')2-фрагментами ВИЧ-специфических человеческих антител. Новизна подхода в том, чго здесь антитела могут быть обнаружены задолго до гипсрпродукнии Кроме того, этап взаимодействия антител с антигенными структурами происходи в opiammic, поэтому копформационно-зависимые ашитеппые детерминанты вирусных белков представлены в своей нативпой форме.

Использование Р^Ь^-фрагмешов снимает о1р;ншчепия па тесшроваипс сывороток, содержащих ревматоидный факюр, так как специфичное!!, последнею о!раничивастся доменом СН2 Fc-фрагменюв IgG [Natvig J.A. 1973J.

2а 26 2в iili

В

W4

Рис.5. Схема ИФА для детекции антител в составе ПК.

А - инкубация пробы с Р(аЬ')2-фрагменгами, сорбированными на твёрдую фазу; Б -отмывка несвязавшихся иммунных комплексов; В - инкубирование с белком А, конъюгировапным с фермешом; 1 - специфические Р(аЬ')2-фрагмсшы; 2а- ПК с антигенами ВИЧ; 26 - ИК с любыми другими антигенами; 2в - ИК с анннснами ВИЧ, в которых заняты все эпигопы: 3 - коныогаг белка А с ферментом.

1 9

В качсстс истчппка ан си-ВИЧ am тел ,гтя получения иммупосорбсща была использована смссь образцов плазмы крови ВИЧ-1-инфицированных. Удельный анси-ВИЧ пир смеси составил 4.3 па I mki белка. Препарат

иммуноглобулинов (1.2 мг/мл), полученный высаливанием 1 О М

сульфатом аммония, имел удельный пир 106.6 на I mki белка. Результат оценки эффективное in выделенных иммуноглобулинов в

качестве антител «захвата» представлен на рисунке 6. После диализа указанною препарата против 0.1 М нагрий-ацеташою буфера, pH 4.5, иммуно! лобулины были фра1 менгированы пепсином ("Sigma") на F(ab'):- и Fe-фрагменты (причем последние при тех же условиях i пдролизуютея на множественные субфрагменты): I доля пепсина (15 млАисон/мг) против 49 долей белка препарата (20 ч при 37"С).

Полученные таким образом Г(аЬ')2-фра|менты сорбировали в разведении 1:500 на планшеты "Greiner" 16 ч при комнатной температуре в 20 мМ карбона ■-бикарбонатном буфере, pH 9.6. После отмывки фосфагно-солевым раствором с Ü.I"» Твин-20 (PBST) и часовой блокировки Ioо раствором бычьего сывороточного альбумина в PBST (PBSAT), в лупки вносили по 100 мкл тестируемых сывороюк (1:100 в PBSAT). ВИЧ-специфические антитела в составе связавшихся иммунных комплексов выявляли с помошыо белка А (5. aureus), конмощрованного с псроксидазой хрена (Bio-Rad, Австрия). В качсовс субстрата псроксидазы использовали ортофениленднамин. Cutoff рассчшывали как среднее значение оптической ПЛОШОС1Н для б-ти ВИЧ-негативных сывороток плюс 2.5 стандартных отклонения.

Для подтверждения специфичности взаимодействия иммуносорбента с антигеном использовали конкурентный ИФА. Для этого тестируемую сыворо1ку (1:100) предыпкубировали с ВИЧ-1-спсцифичсскнмн Р(аЬ'):-фР;н ментами (1:100)

Материалы и методы

Титр

Рис. 6. Кривые тшрования нсхо;и1ою прспира!а и очищенных иммуно! лобулиноп в кпчееше иммуносорбенюв. Ашшсн - рскомГлшалгиын ¡>24 ВИЧ-1 (1 нг/мл; НПО «Вскгор», п. Кольцове, Новосибирская обл.). Амтшен выявляли коныогашм анти-ВИЧ-1 антител с пероксидазон хрена (тр. иммунохимии, Институт вирусологии РАМН).

Зимин при 37"С. Взаимодействие считалось специфическим, если в конкурентом ИФА рстисгрировилось не менее, чем диукрашое снижение еншала по сравнению с неконкурентным варианюм.

Результаты

Использованные в paGoic сыворотки представлены в таблице 8. 10 сывороюк от ВИЧ-нстативиых здоровых доноров (Ü,m) являлись официальными кошролями. Еще 10 сывороюк (Imnii.iu) принадлежали лицам, инфнцированым HBV. papilloma virus, Biij>ycoM [српеса, с неопределенными результатами ccpo.'ioi ичсскот о тестирования на ВИЧ-1 (любезно предоставлены д-ром Трубчаниповой Л.Г1. \Институ| иммунологии, Москва\;). Rf, s - сыворо1КИ крови, содержащие ревматоидный фактор (Инсгшут рсвматоло1 ии, Москва). 7 сывороюк ВПЧ-1 инфицированных на различных стадиях инфекции (МГЦ СГ111Д). Две сыворо!ки (PS1 и PS2) принадлежали ребенку мужского пола, рожденному от ВИЧ-1-инфицнрованной (РМ) (любезно предоставлены д-ром Ереминым В.Ф.). Через 18 мсс. после рождения, несмотря на ссропсгативпость, ребенку был поставлен диатиоз ВИЧ-инфекции на основании результатов гнездовой ДНК-ПЦР |Еремтш В.Ф., и др. 19%|. Сыворотка PS1 взята через 18 мсс., a PS2 и РМ - через 47 мсс. после рождения ребёнка. Наши исследования показали, чю в образцах PSI и PS2 содержа|ся капсидный белок р24 и вириониая РНК. Это позволило заключим, вывод, чю в ортапизме пациента происходи! репродукция и гема тот синая дисссминация вируса. Кроме тою, сыворо1Ки PSI и PS2 нейтрализуют ВИЧ-1 m varo в значи1сл|.ном разведении

Изданных, приведенных на рисунке 7, слсдуст, чю разработанный вариант ИФА позволяет обнаружить анппела в сыворотках PS1 и PS2, несмотря на отрицательные результаты в обычных тест-системах на антитела. Вместе с тем, в случаях четкой ссропозитивности, анппела в составе ИК не выявляются. Это может быть связано с полным экранированием антигенных детерминант вирусных белков апппеламп.

В сыворотках PS1 и PS2 анги-ВИЧ антитела определяются только в составе иммунных комплексов (возможно, включающих целые вирусные частицы). Часть антигенных детерминант в этих комплексах остается свободна, и их блокирование в конкурентном ИФА приводит к снижению уровня сит пала в 2.5 раза.

Таблица 8.

Характеристики использованных в работе еывороюк'.

Код Тигр н Тиф в T шр в ( 'lICKip Л1ПНГСЛ II ГПКППЧ T mp 110,111011

сыво- Kairi ория "Скрин-В!14" ")К|>-Ла5" "I leiri оскрим-2 'Плог-Ш 1Ч"2 IP")' H CMuopolve4 iK'ii ipiuiil ja-

ротки iinil ВИЧ-!»'

DI-DIS НИЧ 0.00

linm 1-10 В! 14 0.00

Rf 1-5 впч 0.00

1*274 ВИЧ' 32 ООО 5 000 5 000 ЧАИ. I.NVi. POI. 0.00 20

Р303 ВПЧ' 16 00(1 5 000 500 (¡AU. T.NVi. POL 0.12 • 40

P7S5 B1I4' 50 000 2 500 25 000 (¡AG. KNVi. POL 0,09 t

Р883 ВИЧ' 50 000 1 250 2 500 GAG, F.NVi. POL 0,23 •

Г917 ВИЧ' 50 000 2 500 5 000 GAU. l.NVi. POL. 0.00 40

Г924 ВПЧ' 50 000 1 250 2 500 GAG, ENV,. POI. 0.00 80

РМ ВИЧ' 50 000 6 400 10 000 (¡AG. l.NVi. mi. 0.14 120

PSI В11Ч'? 0.10 « 320

PS2 ВНЧ'? 0.11 4 320

'Отрицательный результат оболгачен как «-».

:В данной тест-системе (д01-ИФА) пыявчшокя анппс.та, специфичные к рскомбншшшмч GAG (р24. р17). ENV, (gpl20, рр41). и POL (р51) ВИЧ-1, а также ENV: (gpl 10. gp38) ВИЧ-2. '|ш/(мл сыворотки)! после разушенпя иммунных комплексов (НПО «Вскюр», Кольцова). Бет разушепня ИКр24 не дсикшровался

'Гнездовая РНК-ПЦР па пос.чедова тельпоси, icita ¡>ag ВИЧ-1: SK.WSKI46 - внешние пранмеры; SK104/SK436 - Biiyipenmie прпймеры

5Использовался BH4-lRt (50 ТСЮ5„) в лпмфобласюидлои клеючнои линии Н9. Отрицательный резулмаг означает, что сыворотка не приводила к полной нейтрали шиш ВИЧ-Irj: даже н минимальном разведении 1:10.

Возможно, что полученные резулыаш о<рижают период «серонегашвною окна», который при ВИЧ-инфекции может дшп.ся более полу!ода. 'Значшс.тьная продолжительность этою периода при ВИЧ-инфекции требует детальною изучения начальной стадии развишя гуморального иммунного ответа при данной патоло! им.

Представляется возможным и другое объяснение. Нешрализующая активность сывороток PSI и PS2 может свидетельствовать о наличии нейтрализующих аши-ВИЧ ашител. Такие антитела специфичны, как правило, к эпитопам димера gpl20-gp41 ВИЧ-1. Очевидно, что подобные антигенные структуры невозможно ввести в состав иммуноферментных диагностикумов и, как следствие, антитела такой специфичности не обнаруживаются существующими тест-системами. Внутриутробное заражение с развшисм толерантности на стабильные и проси,ic в структурном отношении антигенные де1срминаигы вируса, мо1'ло приведи к исключительной продукции антител к димеру. В пользу такою тна специфичпосш свидетельавует тог факт, что сыворотки PSI и PS2 не реагируют ни с одним из

псгпидов, имширующих различные варианты линейною эпиюпа ipeibcio вариабельного домена gpl2() [Raramov E.V.,I996|.

1.5

I 1

(Я

7 05

I о

-0.5

Рисунок 7. Результаты определения содержания антител в составе комплексов с ашшеиамп ВИЧ-1. По оси ор.шнат отложена оптическая плотность в ИФА (X = 492 им) за вычеюм cut off (0,407).

Описанный мегод может найти применение для исследования «ссронегативного окна» при ВИЧ-инфекции. Кроме тою, возможно изучение случаев ссромсгативмою течения ВИЧ-инфекции, чю может дан, cymcciвенную информацию о ггатот снсзе этой инфекции и СПИД.

Выводы

1. Проведен сравнительный анализ информативное! и грех экспериментальных подходов ли я оценки взаимосвязи пейтрализациоштых свойств сывороток крови ВИЧ-1 - инфицированных с характером течения инфекции, а именно: способности предотвращать трансмиссию вируса в смешанной культуре клеток (модель нейтрализации ВИЧ-1 in vivo), способности нейтрализован, инфскциониость первичных вирусных изолятов и нейтрализован) инфскционность лабораторного штамма ВИЧ-1. Опыты проводились в аутологичсской и гетсрологичсской системах. Примененные методики дополняют друг ;ipyiа и повышают достоверность получаемых данных.

2. Показано, что при ВИЧ-1-инфскции нейгрализационные свойства варьируют в широком диапазоне: в исследованной выборке представлены случаи с высокой 1руппоспецифичсской активностью, с полным отсутствием какой-либо нейтрализующей активности и различные промежуточные варианты.

3. Получены доказательства возможности использования нейгрализациопиых свойств сывороток крови ВИЧ-инфицированных для прогнозирования течения ВИЧ-1-инфскции. Показано, что iруппоспсцифичсская нейтрализующая активность может обсснечивап. шинельный бессимптомный период. При oicyiciBiin труппоспсиифической нейтрализации ВИЧ-1-инфекция быстро прогрессирует.

O'Ü O'n'O'D o a'D'D'o □ □ □'П О n'a'D'0,a'n □ Q D'O'I] О-----ЕГО'0,

Сыворотки

4. Мишенями нейтрализующего эффекта могут быть мосгадсорбционные стадии репродуктивного цикла ВИЧ-1. Показано, что ВИЧ-1-позитивная сыворотка способна подавлять амплификацию провируса ВИЧ-1 при индукции в инфицированных клетках теплового шока.

5. Разработан лабораторный регламент получения иммунофсрмситной тест-системы для обнаружения анти-ВИЧ-1 антител в составе иммунных комплексов с антигенами ВИЧ-1. Полученная тест-система может быть использована для изучения особенностей развития гуморального имму нного ответа при ВИЧ-1-ипфекции.

Список работ по теме диссертации опубликованных и принятых в печать

1. Абэлян А В. Иммунологическая нейтрализация вируса иммунодефицита человека первого типа II Успехи современной биологии 1497, Том 117, вып. 5, стр. 549-567.

2. Абэлян A.B., М.Ю.Щелканов, В.В.Бурунова, ДО.Кабдулова и Э.В Карамов Имму ноферментная система для обнаружения антител в составе комплексов с антигенами ВИЧ-1. /'Бюллетень экспериментальной биологии и медицины (принята в печать).

3. Абэлян А В., Козлова A.B., Корнилаева Г.В., Калинников Ю П.. Пашкова Т А, Карамов Э.В. Цитопатология ВИЧ-1 m vitro: цнтотоксичность и циюпатогенность // 4 Междунар.Конф. "СПИД, рак и родственные проблемы" СПб 21-25 мая 1996 г.

4. Abclian А V., Kozlova A.V., Karamov E.V.HIV-positive sera inhibits beat shock specific amplification of HIV provirus. Xth Intern. Congr. of Virol. J .Israel August 11-16,1496. A.b.p.72.

5. Kozlova A.V., Abelian A.V., Karamov E.V. Heat shock specific amplification of I IIV provirus // Xlth Intern. Conf. on AIDS, Vancouver, Canada. July 7-12, 1996. A.b.vol.2.Pub A.1004, p.438.

Участок множительной техники ОНЦ РАМН

Тираж ^ 00 JKT

Поди, к печати . Л Заказ \ 9f