Вопросы генотипирования и анализ генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита

Демина, Татьяна Васильевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вопросы генотипирования и анализ генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита
ВАК РФ 03.02.02, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Вопросы генотипирования и анализ генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита"

На правах рукописи

Демина Татьяна Васильевна

Вопросы генотипирования и анализ генетической вариабельности вируса

клещевого энцефалита

03.02.02 - вирусология

1 4 ФЕВ 2013

Автореферат на соискание ученой степени доктора биологических наук

005049568

Иркутск - 2013

005049568

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН,

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, академик РАМН, директор ФГБУ «Институт вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова» РАМН

доктор биологических наук, доцент, ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова» РАМН, зав. лабораторией

доктор биологических наук, НИИ Физико-химической медицины ФМБА, ведущий научный сотрудник

Злобин Владимир Игоревич

Зверев Виталий Васильевич

Карганова Григорьевна

Морозова Владимировна

Галина

Ольга

Ведущая организация: ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития

Защита состоится 1 марта 2013г. в10 часов на заседании диссертационного совета Д 001. 026 01 при ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова» РАМН, 142782, г. Москва, поселение Московский, пос. Институт полиомиелита

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова» РАМН

Автореферат разослан_

(дата)

Ученый секретарь диссертационного совета

О.А.Медведкина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Неблагоприятное развитие эпидемической обстановки по клещевому энцефалиту (КЭ) отмечается периодически на многих территориях в пределах ареала возбудителя - вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Необходимость изучения генетической вариабельности вируса КЭ диктуется, прежде всего, разнообразием проявлений клещевого энцефалита. Известно, что штаммы разных генотипов различаются по патогенности для людей и что разные регионы внутри обширного ареала возбудителя отличаются друг от друга по показателям риска заражения, заболеваемости, летальности и клиническим проявлениям КЭ.

Официально принятой МКТВ классификацией признано существование вида вирус КЭ и трех его представительных и эпидемически значимых подтипов: европейского, дальневосточного и сибирского (Heinz F.X. et al., 2000; Львов Д.К., Дерябин П.Г., 2008). Антигенные подтипы вируса КЭ, по мнению ряда исследователей, соответствуют трем основным генотипам вируса -дальневосточному (генотип 1 с прототипным штаммом Soßin), западному (генотип 2, Neudoerfl) и урало-сибирскому (или сибирскому - генотип 3, Lesopark-11, Vasilchenkö) (Злобин В.И. и др., 2001, 2003; Погодина В.В. и др., 2004). Постоянно пополняющиеся данные GenBank по нуклеотидным последовательностям, подтверждая концепцию трех основных генотипов ВКЭ, указывают на наличие вариаций внутри них, а также на существование еще двух генотипов вируса с неопределенным пока ареалом и эпидемическим потенциалом. Это генотип 4 с прототипным штаммом 178-79 и генотип 5 с прототипным штаммом 886-84.

Приведенные факты являются основанием для расширения исследований генетической структуры и квалификации штаммов (изолятов) из разных участков ареала.

Для получения штаммоспецифической характеристики генома применяется метод определения его полной первичной структуры, который в настоящее время не пригоден для изучения больших выборок штаммов в силу

трудоемкости и высокой затратной стоимости. Поэтому необходим не сложный и недорого стоящий скрининговый подход, альтернативный методу секвенирования полноразмерных геномов в плане получения генетической характеристики каждого из исследуемых штаммов. Скрининговая система позволяет, в частности, целенаправленно отбирать штаммы с нетипичной структурой для последующего полногеномного секвенирования, что способствует рациональному его использованию.

Ранее, при участии автора, принципиальная возможность именно такого подхода была продемонстрирована в ходе масштабных исследований генетической вариабельности коллекции штаммов с помощью молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК) (Злобин В.И. и др., 1992, 2001, 2003). Сначала тесты МГНК проводили с 12 дезоксиолигонуклеотидными зондами, из которых 10 зондов были комлементарны различным участкам генома штамма БоДт (дальневосточный генотип), а два зонда - фрагментам генома штамма Ыеис1оег/1 (европейский, он же западный генотип). Затем была использована панель, включающая по одному зонду на каждый из известных генотипов. Опыт использования этих двух панелей позволяет придти к заключению, что для адекватной генетической классификации штаммов ВКЭ, наряду с дешифровкой нуклеотидных последовательностей, целесообразно использовать МГНК с генотипспецифическими наборами зондов, комплементарных различным участкам генома.

Цель исследования. Выявление природного генетического разнообразия возбудителя клещевого энцефалита для уточнения его внутривидовой классификации и совершенствования средств идентификации.

Задачи

1. Разработать панель генотипспецифических дезоксиолигонуклеотидных зондов для дифференциации штаммов ВКЭ на основе выявления вариабельных участков всех структурных и неструктурных генов вируса.

2. Показать возможность использования результатов гибридизационных опытов с наборами генотипспецифических дезоксиолигонуклеотидных зондов для популяционного анализа и скрининга геномов возбудителя КЭ.

3. Исследовать структуры геномов штаммов ВКЭ из разных частей ареала с помощью дифференцирующей панели дезоксиолигонуклеотидных зондов методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК).

4. Осуществить анализ генетической вариабельности возбудителя КЭ.

5. Уточнить географическое распространение генотипов ВКЭ.

6. Сопоставить результаты генотипической дифференциации штаммов ВКЭ, выполненной разными способами.

7. Выявить генотипспецифические маркеры ВКЭ.

Научная новизна и теоретическая значимость

На основе выявления вариабельных участков всех структурных и неструктурных генов вируса клещевого энцефалита создана панель дезоксиолигонуклеотидных зондов для изучения генетической вариабельности и генотипирования штаммов ВКЭ методом МГНК в серийных опытах.

Использование такой дифференцирующей панели позволяет получать объемную информацию о каждом штамме и осуществлять популяционный анализ; отбирать для полногеномного секвенирования штаммы со струкгурой генома, нетипичной для трех основных генотипов; идентифицировать уникальные штаммы, выявленные ранее с помощью расшифровки нуклеотидных последовательностей (штаммы 178-79 и 886-84); выявлять политиповые штаммы (или микст-штаммы). Выявление микст-штаммов с помощью метода МГНК согласуется с представлениями о гетерогенности популяций вируса в природе и, вероятно, свидетельствует о возможности совместной репродукции вариантов вируса, относящихся к разным генотипам, в организме одного и того же животного.

Впервые показано, что в Восточной Сибири циркулируют представители генотипа 5 («группа 886»), предположение о существовании которого было сделано нами ранее на основе выявления уникального штамма 886-84.

Установлено, что генотипспецифическим признаком ВКЭ является определенное сочетание аминокислот в 22 позициях, расположенных по всему полипротеину.

Предложена гипотеза, объясняющая происхождение штаммов 178-79 и 886-84: структура их геномов - результат ряда последовательных множественных рекомбинаций между геномными молекулами трех основных генотипов ВКЭ.

Высказано предположение, что в репродукции ВКЭ важную роль играет вторичная структура геномной молекулы вируса, поскольку с определённой периодичностью третья позиция в кодоне является генотипспецифической.

Практическая значимость

Сконструированные дезоксиолигонуклеотидные зонды могут послужить основой панели микрочипа, предназначенного для диагностики КЭ, дифференциации и молекулярно-эпидемиологического мониторинга его возбудителя.

Полученные данные о распространении генотипов ВКЭ на территории Евразии указывают на необходимость использования универсальных диагностических и профилактических препаратов с учетом генетической вариабельности вируса.

Выявление штаммов генотипа 5 ВКЭ («группы 886») во всех звеньях эпидемиологической цепочки в природных очагах и у больного КЭ человека, указывает- на его эпидемическое значение. Штаммы этой группы, с учетом оригинальности их генетической структуры, представляющей собой «переплетение» из последовательностей, характерных для генотипов 1, 2 и 3, могут рассматриваться как перспективные кандидаты для приготовления эффективных диагностических и вакцинных препаратов.

Внедрение

При участии автора: 1) в международный электронный банк данных (ОепВапк) депонированы нуклеотидные последовательности геномов двух штаммов (ЕР469661, ЕР469662) и 60 фрагментов геномов 57 штаммов ВКЭ

(Ж936329-ЛЧ936375, Еи878281-Еи878283, ЕШ72444-ЕШ72453,

изолированных на территории Евразии; 2) в Государственную коллекцию вирусов при НИИ им. Д.И. Ивановского депонировано 130 штаммов ВКЭ (№№ 1037-1084, 1085-1118, 1119-1166); 3) созданы две базы данных «Биологические свойства штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на территории Восточной Сибири» (Свид-во о гос. регистрации базы данных № 2010620667) и «Генетические свойства штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на территории Восточной Сибири» (№ 2011620063).

Положения, выносимые на защиту:

показана эффективность использования разработанной панели дезоксиолигонуклеотидных зондов для изучения генетической вариабельности и генотипирования штаммов ВКЭ;

- доказано, что наряду с генотипами 1-3 ВКЭ, существуют, по меньшей мере, еще два - генотип 4 (штамм 178-79) и генотип 5 («группа 886»);

- генотип 3 вируса КЭ доминирует на территории Российской Федерации; генотип 1 циркулирует преимущественно на Дальнем Востоке, однако встречается в небольшой пропорции по всему ареалу; генотип 2 является минорным на территории РФ и не выявлен на Дальнем Востоке; генотип 4 обнаружен на юге Восточной Сибири, а генотип 5 - в Восточной Сибири и Монголии;

- определенное сочетание аминокислот в 22 позициях, расположенных по всему вирусному полипротеину, является генотипспецифическим признаком ВКЭ;

- результаты исследования (сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также исходы гибридизационных тестов) показывают, что генетические структуры штаммов 178-79 и 886-84 — прототипов генотипов 4 и 5 включают чередующиеся последовательности, характерные для генотипов 1, 2 и 3. Такую особенность структуры генома, с большой долей вероятности, можно интерпретировать как итог рекомбинационных событий между представителями трех основных генотипов

и, следовательно, рассматривать как косвенное указание на существование рекомбинации у флавивирусов млекопитающих, переносимых клещами.

Личный вклад соискателя:

- анализ данных GenBank и планирование данного исследования;

- конструирование генотипспецифических зондов (разработка критериев для расчета молекулярных зондов, подбор подходящих фрагментов генома для расчета генотипспецифических зондов, расчет зондов и формирование дифференцирующей панели);

- подготовка образцов суммарной РНК, содержащей РНК вируса КЭ из зараженных культур клеток и мозга инфицированных новорожденных белых мышей, с нанесением их на нитроцеллюлозные или капроновые фильтры;

- анализ полученных результатов и подготовка материалов для опубликования.

Апробация результатов диссертации

Материалы диссертации были представлены на Всероссийской научно-

практической конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с

клещевыми инфекциями в XXI веке» (Томск, 2006); на юбилейной

конференции, посвященной 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита

(Владивосток, 2007); на Всероссийской научной конференции «Современные

научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита» (Москва, 2007); на IV

съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов

(Новосибирск, 2008); на Всероссийской научной конференции «Теоретические

основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и

профилактические аспекты инфекционных и массовых неифекционных

заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008); на Международном форуме по

нанотехнологиям (Москква, 2008); на международной конференции "Zoonotic

infectious diseases and tourism" (Ulaanbaatar, 2009); на Всероссийской научно-

практической конференции «Современные аспекты эпидемиологического

надзора и профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней

(Иркутск, 2009); на X Междунардном симпозиуме по клещевым инфекциям

(Jena, 2009); на Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 70-летию теории академика E.H. Павловского о природной очаговости болезней (Омск, 2009 г); на П Национальной конференции с международным участием «Нейроинфекции. Современные аспекты клещевых инфекций» (Екатеринбург, 2009); на научной конференции с международным участием «Этиологические, эпидемиологические и клинические аспекты инфекционных болезней» (к 90-летию кафедры микробиологии ИГМУ) (Иркутск, 2010); на международном семинаре, посвященном проблеме клещевых инфекций (Иркутск, 2011); на международной научной конференции «Клещевой энцефалит и другие инфекции, переносимые клещами» (Иркутск, 2012).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 72 научные работы, в том числе 17 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования РФ, 2 монографии и 5 публикаций в зарубежных изданиях.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (две главы), описания использованных материалов и методов, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы (136 отечественных и 97 зарубежных источников) и приложений. Работа изложена на 248 страницах и включает 48 таблиц и 48 рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы из музейной коллекции. В работе использовано 273 штамма вируса КЭ и 1 штамм вируса омской геморрагической лихорадки из коллекции вирусов Института эпидемиологии и микробиологии ФГБУ «НЦ ПЗСРЧ СО РАМН» (г. Иркутск), выделенных за период с 1937 по 2006 гг. В составе выборки: 169 штаммов из Восточной Сибири (Читинская область - 8,

Республика Бурятия - 55, Иркутская область - 91, Красноярский край и Республика Хакасия -15) и 104 штамма с других эндемичных территорий, куда вошли Дальний Восток - 15 штамов, Западная Сибирь - 25, Урал - 23, Центральная и Северо-Западная Россия - 20, Восточная Европа - 18, Центральная Азия - 3. Штаммы изолированы из различных биологических объектов: от клещей рода Ixodes - 217, клещей рода Dermaccntor — 10, грызунов - 25, насекомоядных - 1, птиц - 1, из молока коровы - 2. 17 штаммов выделены из крови, спинномозговой жидкости больных, секционного материала людей, больных или умерших от клещевого энцефалита. Штаммы выделяли и поддерживали путем внутримозгового заражения двухдневных новорожденных белых мышей и хранили в лиофилизированном виде. Большинство штаммов высушено на уровне 3-7 пассажей.

Нуклеотидные последовательности генома ВКЭ и его фрагментов. Для предварительной оценки генетического разнообразия вируса и отбора участков генома, подходящих для разработки генотипспецифических зондов, использовали элайнменты нуклеотидных последовательностей, депонированных в GenBank к окончанию 2004 г. Данные, хранящиеся в GenBank в настоящее время, а также не опубликованные результаты ПЦР и секвенирования, полученные в данной работе, использовали для: 1) сопоставления с результатами генотипирования штаммов ВКЭ с помощью МГНК; 2) для окончательной оценки выявленной генетической вариабельности вируса.

Выбор структуры олигонуклеотидных зондов и их получение. Зонды подбирали с учетом анализа опыта предыдущих исследований флавивирусов методом МГНК (Kerschner J.H. et al, 1986.; Shamanin V.A. et al., 1990; Злобин В.И. и др., 1992, 2001) и на основе общих требований к дизайну Праймеров (Innis М.А. et al., 1990). Отбор участков генома подходящей длины, на протяжении которых имеются нуклеотидные замены, дифференцирующие один из генотипов от всех остальных, или один из трех основных генотипов от двух

остальных, производили «вручную». Сконструированные зонды синтезированы фирмой «Синтол» (г. Москва).

Метод молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот. РНК «культурального» вируса и суммарной клеточной РНК из мозговых суспензий выделяли методом фенольной экстракции (Херрингтон С., Макги Дж., 1999). Образцы РЖ наносили на нитроцеллюлозные фильтры в количестве 2 мкг/пятно суммарной РНК, выделенной из мозга мышей, или 1 нг/пятно РНК, выделенной из культуры клеток. Для тестирования полученных образцов суммарной РНК дезоксиолигонуклеотидные зонды метили с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4 и [у-32Р]АТР и использовали в МГНК (Маниатис Т., 1984) при температуре 45-47°С.

ОТ-ПЦР и секвенирование. Данный раздел исследований осуществляли в сотрудничестве с Р.В. Аделыпиным (Лимнологический институт СО РАН, г. Иркутск), С.Е. Ткачевым (Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск) и JI.C. Карань (ЦНИИ эпидемиологии, г. Москва).

Компьютерный анализ. Оценку филогенетических взаимоотношений ВКЭ на основе фрагментов генома и полноразмерных генов 23 штаммов (Sojjin (Pletnev et al,1990), Sojjin-HO (AB062064), 205 (DQ989336), 0shima5-10 (AB062063), Senzhang (AY182009), MDJ-01 (AY217093), Glubinnoe (DQ862460), Primorye-69 (EU816453), Primotye-86 (EU816455), Primorye-94 (EU816454), Primorye-212 (EU816450), Primorye-253 (EU816451), 178-79 (EF469661), 886-84 (EF469662), Primorye-270 (EU816452), Nmdoerfl (TEU27495), 263 (TEU27491), Hypr (TEU39292), K23 (AM600965), Salem (FJ572210), Vasilchenko (L40361), Zausaev (AF527415), Ек-328 (DQ486861)) и вируса омской геморрагической лихорадки (OHF (NC_005062)) осуществляли с помощью программ Mega 4.0 (Tamura К, et al., 2007) и TreeCon (Van de Peer Y. et al., 1994).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование панели специфических дезоксиолигонуклеотидных зондов

Опыт дифференциации штаммов ВКЭ в МГНК, с ранее полученными генотипспецифическими зондами (Газо М., 1999; Злобин В.И., Газо М. и др., 2001), позволил сделать следующие выводы, послужившие в качестве критериев для отбора подходящих участков генома для расчета новых генотипспецифических зондов. Во-первых, для достижения высокого уровня специфичности реагирования каждого зонда при его длине от 17 и.о., целесообразнее подбирать структуры с температурой отжига близкой к (45^47)°С. Во-вторых, при таких условиях МГНК более надежно (специфично) будет реагировать в качестве зонда структура, на протяжении которой нуклеотидные замены, дифференцирующие один из генотипов от всех других, расположены равномерно - предпочтительно с интервалом не более 7 н.о.

Большая часть структур для конструирования зондов была отобрана при сопоставлении полногеномных нуклеотидных последовательностей вируса ОГЛ (NC-005062) и 10 штаммов ВКЭ: Софьин (Pletnev A.G., Yamshikov V.F., Blinov V.M., 1990), SojJin-HO (AB062064), 205 (DQ989336), Oshima 5-10 (AB062063), Senzhang (AY182009), MDJ-01 (AY217093), Neudoerfl (TEU27495), 263 (TEU27491), Vasilchenko (L40361), Zausaev (AF527415). Последовательность, специфичная для штамма 178-79, выбрана на основе сопоставления геномных структур 90 штаммов (по данным 2004 года) на участке генома в 160 н.о. (позиции №№ 568-727 гена Е). Подобрать на этом же участке комбинацию из нуклеотидных оснований, подходящую для расчёта зонда на генотип 5 (штамм 886-84), не удалось.

Всего для формирования панели, дифференцирующей штаммы ВКЭ, было рассчитано 38 дезоксиолигонуклеотидных последовательностей, а также

использовано две последовательности, описанные ранее как зонды SH5 (Шаманин В.А. и др., 1989 г.) и N3 (Дрокин ДА., 1991).

В итоге предлагаемая панель, дифференцирующая вирус КЭ, включает 40 дезоксиолигонуклеотидных последовательностей - зондов, мишенью для которых послужили все десять генов ВКЭ (табл. 1). В составе панели: видоспецифичный зонд sh5; три субпанели по 12 генотипспецифических зондов на каждый из трех основных генотипов (по одному зонду на гены М, С, NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b и по два - на гены Е и NS5); один специфический зонд на генотип 4 (он же штаммоспецифичный для изолята 17879); два субгенотипспецифичных зонда для дифференции штаммов генотипа 3 на группы «Васильченко» и «Заусаев», обозначенные для краткости как группы За и 36 соответственно. Впервые предположение о существовании субгенотипов За и 36 было сделано при анализе гомологии участка гена белка Е длиной 160 нуклеотидных оснований (в позициях с 568 по 727) 29 штаммов ВКЭ (Демина Т.В., 1999). Среди представителей ВКЭ, обладающих аминокислотой Q234, оказался прототипный для генотипа 3 штамм Васильченко, полная структура генома которого была расшифрована первой среди штаммов данного генотипа (Gritsun T.S. et al., 1997). К моменту завершения работы над дизайном, представленных в настоящем исследовании зондов, был расшифрован геном штамма Заусаев (Gritsun T.S. et al., 2003). Он пополнил группу представителей генотипа 3 с маркером Н234 (по белку Е). Обе группы отличались друг от друга не только маркерной аминокислотой, но и нуклеотидным составом, на основании чего и были выведены консенсусы субгенотипспецифичных зондов Е-За (группа «Васильченко») и Е-Зб (группа «Заусаев») (табл. 1).

В.В. Погодина с соавторами (2004) показали, что сибирский генотип подразделяется на подгруппу H234Za (азиатский топовариант-1; Za означает прототипный штамм Заусаев), подгруппу Q234VS (азиатский топовариант-2; VS - Васильченко) и подгруппу Н234ЯР (европейский топовариант) с прототипным штаммом Ярославль-2.

Таблица 1. Дезоксиолигоцуклеотидные зонды панели, дифференцирующей штаммы вируса клещевого энцефалита

Шифр Последовательность нуклеотидов Расчетная Локализац

зонда от 5'-коица к З'-концу (количество звеньев) температура гибридизации (°С) ия на геноме*

** САСААТССТСИХТТТТССАААТААТСС 71 1156-1182

С-1 СОСТССТСАСТСССТТСТТА 57 234-253

М-1 ССАСТСТСССТССААОТС 53 341-358

Е-1 САОТСТСАТТАССА<ЗССАСС 57 1290-1309

Е-Г ССАССАОТАОАСССАААЛТС 55 2104-2123

л N81-1 ТСТТТССССТТСТТТАСС 47 2643-2660

о N82 А-1 ССТССААТСАСПТССАС 49 3939-3956

сз N828-1 АТСТТССАСССОТТСТС 47 4452-4468

«о N83-1 САСТСССССТАТССТССТА 55 4836-4854

> С) N84 А-1 АССАААССАССССААОАС 51 6521-6538

N848-1 ТСССТСТССАААТССАПЧЗ 51 7242-7260

N85-1 СТСТССТСАООАОТТСС 49 7656-7672

N85-1' ТТССАСААСССААСССААТО 55 9622-9641

С-2 ССТСАТССССААСАОАОТАА 55 323-342

М-2*** АСЮСТСТТСТССТГСАТС 49 508-525

гч Е-2 лстлтатотстсстттсс 47 1297-1314

Е-2' ТСССААПХЗААСТСАСАААСС 55 2123-2143

х, N81-2 ТАСТСАОТСООСТСАААС 49 2604-2621

¡и NS2A-2 СТСКЗАСТАССАТСААСО 47 3614-3630

я №2В-2 ТСАОАССТТССХЮАТСА 47 4456-4472

ю N83-2 ТТТТАССССАТТТСССТАТАСС 57 4920-4941

С) NS4A-2 САТСТСААССАТАОТСАО 47 6484-6501

N8413-2 АТСАОССАСААСАСШТС 49 7308-7325

N85-2 ТССТСТТСТСАОСААСТС 49 7657-7674

N85-2' ОТОСГГСССААТТаТГТО 47 9219-9236

С-3 САССААОАСАСГГСАСААС 49 316-333

м-з ССТТССССССТТЛСТОТТО 55 350-368

Е-3 САСТССССТТСТТСТТСО 51 1208-1225

<»5 Е-3' АСТСТСТСОАТССССТТСС 55 2060-2078

■ N81-3 ААСААССАСААССлССТС 47 3497-3513

ч V Я Ш2А-3 ТССССТСАТСААТСТСС 47 3941-3957

N828-3 СААССССАОСААСТААС 47 4368-4384

В N83-3 ОТЛТТССТСССАТСТТТСТСС 57 4835-4855

Ю > NS4A-l АССАААССАССССААОАС 51 6521-6538

и NS4A-3 ТСАССТССЛССЛТСОТСАС 55 6484-6502

N848-3 СТСТСААООААССССАТС 51 6783-6800

N85-3 ССТТССТТАССАССТСТ 47 7656-7672

N85-3' САССТСТТСАОТСТСТСТ 49 7572-7589

Е-4 ТАССССТТСОТСТСТСС 49 1520-1536

Е-За АСААТССССАСТСАТГСС 49 1145-1162

Е-Зб ЛАСССОССАССОАОААС 53 2158-2174

* Нумерация дана по кодирующей части генома.

** Зонд, использовавшийся ранее (ЗЬатапт У.А. й а1., 1990).

*** Зонд, использовавшийся ранее под кодом N2 (Злобин В.И. и др., 1992)

I. Со1оу1]оуа й а1. (2004, 2008) установили, что, благодаря позициям 175 и 313 в белке Е, можно различать Балтийскую и Сибирскую ветви в пределах сибирского субтипа (или генотипа 3). Аспарагин (Ы) в позиции 175 характерен для балтийских штаммов из Эстонии, Латвии, Финляндии и европейской части России, а аланин (А) в позиции 313 - для сибирских и дальневосточных штаммов.

Таким образом, генетические варианты Василъченко и Заусаев (или азиатский топовариант-2 с маркером (^234 и азиатский топовариант-1 с маркером Н234 согласно В.В. Погодиной с соавт., (2004)) находятся в составе Сибирской ветви генотипа 3. В качестве прототипа Балтийской ветви выступает штамм Эк-328, являясь первым и пока единственным ее представителем с полностью расшифрованным геномом. По схеме В.В. Погодиной с соавт. (2004) этот штамм соответствует европейскому топоварианту сибирского генотипа.

Дополняя панель олигозондов, предназначенную для скрининга геномов ВКЭ, зондами За и 36, мы не ставили перед собой задачу непременно дифференцировать штаммы генотипа 3 до субгенотипа (тем более, что в период формирования панели не было четких представлений о подразделении генотипа 3 по схеме «две ветви и три кластера» - Балтийская ветвь и группы «Васильченко» и «Заусаев» Сибирской ветви), а планировали, как максимум, осуществить такую попытку и, как минимум, собрать больше информации о каждом представителе генотипа 3.

2. Результаты апробации сконструированных олигонуклеотидных зондов для генотипировання ВКЭ

В ходе тестирования 273 штаммов ВКЭ и вируса ОГЛ с помощью панелей генотипспецифических зондов методом МГНК были получены паттерны гибридизации, согласно которым все штаммы разделились на две неравные группы: штаммы, реагирующие преимущественно с зондами одного из генотипов или «монотиповые» (268), в число которых вошли прототипные

штаммы пяти генотипов, и политиповые (5). Образцы РНК политиповых штаммов реагировали одновременно с большей частью зондов двух и более генотипов (табл. 2). Вероятно, «политиповые» штаммы представляют собой смеси вирусных частиц разных генотипов, а образцы их РНК, следовательно, -смеси геномов, соответствующих этим генотипам.

Для оценки качества полученных зондов, т.е. способности выявить именно генотипспецифическую принадлежность, нами использован термин «эффективность гибридизации». Оценка этой эффективности представлена в таблице 3.

Монотиповые штаммы генотипов 1, 2 и 3 реагировали с зондами одноименного генотипа. При этом реактивность составила от 33 до 100%, т.е. РНК таких штаммов взаимодействовала не менее чем с четырьмя (для генотипа 2 - не менее чем с шестью) из 12-ти зондов одноименного генотипа. Единственный штамм генотипа 4 (775-79) обладал уникальным паттерном гибридизации. Он реагировал с 50% зондов генотипа 1 (С-1, М-1, Е-1, NS1-1, NS2B-1 NS3-1), с зондом, сконструированным на его основе (Е-4), и одним зондом генотипа 2 (NS5-1'). Десять штаммов 5-ой группы реагировали с тремя зондами генотипа 1 - С-1, NS1-1, NS3-1. Реактивность штаммов этой группы с зондами генотипа 1 составила 25%.

Предварительно их назвали «дальневосточные с необычной картиной гибридизации», а также «группой 886», поскольку среди штаммов, гибридизующихся в 25% случаев с зондами генотипа 1, оказался штамм 886-84 (табл. 2 и 3), ранее выявленный нами как уникальный. В состав «группы 886», помимо прототипного штамма, вошли два штамма, изолированные от красно-серой полевки (Clethrionomys rufocanus) (740-84, 711-84), и семь — от клещей 1. persulcatus (418-90, 712-89, 608-90, 617-90, 636-90, 691-90 и 287-83). Годы изоляции: 1983,1984, 1989 и 1990.

Для штаммов 617-90, 740-84 и 711-84 были расшифрованы фрагменты геномов длиной 2194 и.о., кодирующие большую часть белков Е (1322 н.о.) и NS1 (872 и.о.) (EU878283, EU878282, EU878281). При сравнении этих

Таблица 2. Результаты гибридизации зондов с РНК исследуемых штаммов

Зонд Штаммы OHF

Монотиповые прототипные |Политиповые

1 5 у 262- 61887 76587 Krasnyi Yar-1 Lesop ark-10

Sofjin 886-84 256*

sh5 +++ 444 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ 444 -

С-1 +44 -I-H- +++ - - +++ +++ +++ ++ 44 444

M-I 444 +++ - - - +4+ +++ +++ ++ 4 -

Е-1 444 444 - - - +++ +++ +++ ++ 4 -

Е-Г 4 - - - - 4-4 - Ч-+4- 4-4 4 -

NS1-1 +44 444 +++ - - 444 +++ 444 . 4 -

NS2A.1 + 4 + - - - - +++ ++ 444 4+ - -

NS2B-1 +++ 4++ - - - 44+ ++ 444 44 -

NS3-1 +++ 444 +++ - - 4-4 1- 4-4 444 4 -

NS4A-I +++ - - - - + - ++ 44 - -

NS4B-1 +++ - - - - +++ + 4-44 44 4 -

NS5-1 4+4 - - - - +4+ - 4+4 . - -

NS5-1' 4++ - - - - - ++ +++ 44 4 -

С-2 - - - +*++ - - + ++ - - -

М-? - - - ■ - ' 4-++ +4 +++ _ - +44

F.-2 - - - +44- - ,+++ .4 + - - -

К-2' - - - +++ - II- - -

ISSI-2 NS2A-2 - - - - 4 - - -

- - - +++ - +1- + - - -

NS2B-2 - - 4 - +4 + + г _ -

NS3-2 - - - +++'■! +++ ' , ++ - - -

SNS4A-2 - - - - ' ' - - * -§- -

VS4R-2 - - - -++ - - -

NS5-2 - - - SH3*. ■ + ++ + - - -

NS5-2' - ; +++ - + ^ : . - 4- г »- - -

Э9Ш1 - - | _

- - - -

- - - - -

- - - - ¡¡SS _

i ' - - - - дидрЯД -

- - - -

г - - - -

- - - -

- - - - -

и - - - - -

- - - - -

тт - - - - -

f ¡¡эя - - 4-44 - - - : -

г-30 ! . - - - ■ - ir -

Ш Ян - л^гН-Ь - - 1 - -V. 5 - 1 - -

Примечания; Уровень гибридизации: +++ — высокий, ++ - средний, + - низкий,--отсутствие

гибридизации.* - Штамм описан в литературе как представитель генотипа 2 [Ecker М. et al., 1999] и использован в данной работе в качестве прототипного.

Таблица 3. Эффективность гибридизации генотипспецифических дезоксиолигонуклеотидных зондов с РНК «монотиповых» штаммов BIO

Зонд Штаммы Генотип 4 Генотип 5 üi- г чм!»;

генотипа 1 {штамм ("группа генотипа 2

(Дальневосто J7S-: 9) 886") (Еврвпейски

чный субтип) :s субтип)

P/N* %** P/N % P/N % P/N % P/N %

sh5 30/39 77 1/1 100 8/10 80 16/21 76 184/194 95

С-1 33/39 85 1/1 100 10/10 100 0/21 0 110/197 56

М-1 32/39 82 1/1 100 0/10 0 0/21 0 1/197 1

Е-1 34/39 87 1/1 100 0/10 0 0/21 0 2/197 1

Ё-Г 32/39 ,82 0/1 0 0/10 0 0/21 0 1/197 1

NS1-1 14/39 36 1/1 100 10/10 ¡00 0/21 0 9/197 5

NS2A-1 34/39 87 0/1 0 0/10 0 1/21 5 9/197 5

NS2B-I 36/39 92 1/1 100 0/10 0 0/21 0 6/197 3

NS3-1 37/39 95 1/1 100 10/10 100 0/21 0 26/197 13

NS4A-1 29/39 74 0/1 0 0/10 0 1/21 5 0/197 0

NS4B-1 34/39 87 0/1 0 0/10 0 0/21 0 4/197 2

NS5-1 18/39 46 0/1 0 0/10 0 0/21 0 1/197 1

NS5-1' 30/39 77 0/1 0 0/10 0 0/21 0 18/197 9

С-2 0/39 0 0/1 0 0/10 0 2i :i ИИрв 0/197 0

М-2 0/39 0 0/1 0 0/10 0 21/21 100 21/197 11

Е-2 0/39 0 0/1 0 0/10 0 21/21 j00 1/197 1

Е-2' 0/39 0 0/1 0 0/10 0 11/21 . 52 0/197 0

NS1-2 : 0/39 0 0/1 0 0/10 0 14/21 67 0/197 0

NS2A-2 0/39 0 0/1 0 0/10 0 17/21 8i 2/197 1

NS2B-2 0/39 0 0/1 0 0/10 0 1/21 5 11/197 6

NS3-2 0/39 0 0/1 0 0/10 0 19/21 90 0/197 0

NS4A-2 1/39 3 0/1 0 0/10 0 11.21 5.2 2/197 1

NS4B-2 ■ 1/39 3 0/1 0 0/10 0 6/21 29 2/197 1

NSS-2 0/39 0 0/1 0 0/10 0 31/21 100 0/197 0

NS5-2' . 0/39 0 II здо 0/10 0 21/21 100 9/197 5

0/39 0 0/1 0 0/10 0 0/21 0

0/39 0 0/1 0 0/10 0 0/21 0 »

0/39 0 0/1 0 0/10 0 0/21 0 шиш шшш

0/39 0 0/1 0 0/10 0 0/21 0 ЙййязЗВ (ШрШ

0/39 0 0/1 0 0/10 0 0/21 0

1/39 3 0/1 0 0/10 0 0/21 0 - :

1/39 3 0/1 0 0/10 0 0/21 0

1/39 3 0/1 0 0/10 0 0/21 0 (Sil

0/39 0 0/1 0 0/10 0 0/21 0 №

2/39 5 0/1 0 0/10 0 0/21 0 liilp

0/39 0 0/1 0 0/10 0 0/21 0

1/39 3 0/1 0 0/10 0 1/21 5 КШРУрш

0/39 0 0/1 0 0/10 0 0/21 0 ipl

0/39 0 0/1 0 0/10 0 0/21 0

Б-4 0/39 0 1/1 100 0/10 0 0/21 0 0/197 т-

* Число позитивных реакций / число тестированных образцов. ** Эффективность гибридизации в процентах.

фрагментов с соответствующим участком генома штамма 886-84 (ЕР469662) выявлен высокий уровень гомологии (99,3 - 99,8%) всех четырех последовательностей (рис. 1А). Отличия на участке гена Е в 160 н.о. в позициях №№ 568-727 между штаммами из «группы 886» и штаммами, относящимися к трем генотипам, составили не менее 12% (рис. 1 Б), что соответствует критериям генотипирования, выведенным ранее (Злобин В.И. и др., 2001).

Т.о., получены генетические доказательства циркуляции на территории Восточной Сибири штаммов генотипа 5, подтверждающие высказанную нами ранее гипотезу о существовании более чем трех генотипов ВКЭ.

Примечательно, что взаимодействия зондов генотипа 1 с РНК штаммов -представителей генотипов 4 (штамм 178-79) и 5 («группа 886»), а так же зонда генотипа 2 (N85-1') с образцом РНК штамма 178-79 (табл. 2 и 3), можно было избежать посредством отбора зондов, специфичных строго для генотипов 1 и 2. Но отсутствие в распоряжении автора полногеномных структур штаммов 886-84 и 178-79 на момент конструирования зондов привело к перекрестным реакциям МГНК между генотипами, что позволило подтвердить уникальность штамма 178-79 и выявить новых представителей генотипа 5 ВКЭ.

Общий анализ эффективности реагирования генотипспецифических зондов с РНК однозначно типированных 268 штаммов (табл. 3) показал:

- генотипспецифические зонды взаимодействуют, за редким исключением, со штаммами одноименных генотипов;

- специфичный для генотипа 1 зонд С-1, перекрестно реагируя с представителями из группы генотипа 3, дополнительно дифференцирует штаммы внутри этой группы;

- зонды, специфичные в отношении двух субгенотипов генотипа 3, реагируют только со штаммами генотипа 3. При этом все штаммы данного генотипа делятся на три подгруппы: 1) штаммы субгенотипа За (реагирующие с соответствующим зондом); 2) штаммы субгенотипа 36 (также реагирующие с

Различия между штаммами внутри групп и между группами по фрагменту генома в 2194 н.о. (в %)

Генотип 1 178-79 836» Генотип2 Генотип 3

Генотип 31 4,7

178-79 12,4 *

886» 12,8 13,0 0,85

Генотип 2 16,1 16,4 16,3 2,2

Генотип 3 14,3 14,3 13,1 15,6 6.7

OHF 19,9 20,6 19,6 19,1 20,0

Различия между штаммами внутри групп и между группами по фрагменту генома в 160 н.о. (в %)

Генотип 1 178-79 886» Генетип2 ГенотнпЭ

ОИ01ИГ! 1 6Д

178-79 14,2 *

зоб» ■.'■13.5:;:.' 15,0 0,9

Г«котип2 17,0 18,3 15,0 2,3

ГенотиоЭ 25,1 16,7 14Д 5.S

OHF 23,6 25,0 21,7 21,2 24,0

Рисунок 1. Филогенетические схемы (NJ, Kimura-2-parameter) и уровни различий между штаммами ВКЭ по участку генома, кодирующему большую часть генов Е и NS1 (А), и 160-членному фрагменту гена Е (Б) Примечания: ромбами помечены штаммы, нуклеотидные последовательности которых получены в данной работе.

одноименным зондом); 3) штаммы «пи За, ниЗб» (не реагирующие с обоими субгенотипспецифическими зондами);

- зонд, комплементарный фрагменту генома штамма 178-79 (генотипа 4), гибридизуется только с РНК этого штамма.

Опыты гибридизации предложенного набора зондов с образцами РНК политиповых штаммов выявили наличие в них смеси фрагментов (возможно, и полногеномных молекул) разных генотипов. При этом гибридизация с зондомна генотип 4 сочетается с реагированием на зонды С-1, М-1, Е-1, N81-1,

.д

N528-1, N8-3-1 и N85-2', что соответствует паттерну гибриизации, полученному для штамма 178-79 (табл. 2). Отсюда можно предположить, что в образцах РНК политиповых штаммов 267-74, 618-87 и 765-87 не исключено присутствие геномных структур аналогичных штамму 178-79 (генотип 4). К тому же штаммы 178-79, 267-74 и 618-87 изолированы из одного очага, расположенного на территории Эхирит-Булагатского района Иркутской области. На сегодня в ОепВапк депонировано более 600 расшифрованных нуклеотидных последовательностей, перекрывающих участок генома, комплементарный зонду Е-4, но штаммов, аналогичных 178-79, не выявлено.

3. Типирование штаммов вируса клещевого энцефалита с использованием панели молекулярных зондов

Несмотря на то, что большая часть штаммов прошла от 3-х до 7-ми лабораторных пассажей с момента выделения из природного очага, четко прослеживается географическая привязка к месту их изоляции. Это проявляется в сходстве паттернов гибридизации РНК штаммов, изолированных из одного и того же локального очага и в разные годы.

Исследованная выборка охватывает весь ареал, но будучи сформированной на основе региональной музейной коллекции, она оказалась в большей мере представлена восточносибирскими штаммами. Поэтому мы сопоставили данные по двум группам штаммов, обозначив их как две условные

популяции: «весь ареал» (268 монотиповых штаммов) и «Восточная Сибирь» (165). На рисунке 2 данные по этим двум условным популяциям представлены в диаграммах, заключённых в прозрачные квадраты. В черном квадрате находится диаграмма, демонстрирующая соотношение генотипов на всей территории евроазиатского ареала, исключая Восточную Сибирь. Информация в черном квадрате дает общее представление о распределении генотипов вируса на «окраинах» ареала, а в квадрате «Восточная Сибирь» - в «центральной» части ареала.

Как видно из рисунка 2, соотношения трех основных генотипов во всех трех квадратах примерно сопоставимы: генотипический состав ВКЭ всего обследуемого ареала соответствует картине, характерной для Восточной Сибири. Распределение основных генотипов ВКЭ по разным территориям согласуется с данными литературы (Злобин В.И. и др., 2003). Так, штаммы генотипа 2 выявляются преимущественно в Восточной Европе (5 из 18 в составе «европейской части ареала» на рис. 2) и на Алтае (5 из 8 в составе Западной Сибири), редко в Восточной Сибири (5 из 165) и не обнаружены на Дальнем Востоке. Генотип 1 встречается повсеместно, но преобладает на Дальнем Востоке. Т.е., доля генотипа 2 уменьшается с продвижением с запада на восток до нуля, в то время как доля генотипа 1 доходит до максимума (53,3%). При этом доминирует на большей части всего обследованного ареала генотип 3. Из диаграммы в черном квадрате также следует, что на «окраинах» ареала увеличиваются доли генотипов 1 и 2 и уменьшается доля генотипа 3.

По своеобразию генотипического состава выделяются четыре очага в Восточной Сибири. Они расположены на территориях Бичурского и Баргузинского районов Бурятии, Красночикойского района Читинской области и Эхирит-Булагатского района Иркутской области (очаги «группы 886» на рис. 2). Здесь обнаружились штаммы генотипа 5, описанного ранее на основе выявления единственного изолята - штамма 886-84. Важно отметить, что в литературе описаны тяжелые клинические случаи КЭ в Бичурском районе Бурятии (Лохов М.Г., Блинникова И.А., 1986) и Красночикойском районе

Дальний Восток

Восточная Европа, Центральная и Северо-Западная Россия

Приуралье, Урал и Западная Сибирь

Весь ареал без Восточной Сибири

БЩВЕИди

генотип 1

генотип 2

генотип 3

генотип 4

^Ц - очаги "группы 886" с годами изоляции

1984

Рисунок 2. Соотношение генотипов вируса КЭ на территориях всего обследованного ареала и Восточной Сибири по результатам типирования 268 штаммов с помощью панелей генотип-специфических дезоксиолигонуклеотидных зондов Примечание: в нижнем ряду диаграмм в анализ не включены два штамма из Монголии и один - из Киргизии.

Читинской области (Шасаитов Ш.Ш., Домаев Ю.А., 1980; Горин О.З. и др., 1992), а в северной Монголии (на территории, прилегающей к Восточной Сибири) зарегистрирован в 2008 году смертельный исход КЭ, вызванный вирусом, гомологичным по структуре генома штамму 886-84 (98,5% по участку гена Е длиной 281 н.о) (Khasnatinov М.А. et ai., 2009; Хаснатинов М.А. и др., 2010).

Результаты типирования исследованных штаммов ВКЭ демонстрируют, что изменения в соотношении генотипов наблюдаются не только в зависимости от географического положения места изоляции, но и от источника выделения. Во всей выборке, среди 268 однозначно типированных штаммов, 223 были выделены от клещей и 45 — от теплокровных. Среди штаммов от клещей -80,7% (180 из 223) и штаммов от теплокровных - 40% (18 из 45), были квалифицированы как представители генотипа 3. Поскольку основная часть штаммов от клещей изолирована в центральной части ареала (Урал, Западная Сибирь, преимущественно Восточная Сибирь), где по данным литературы генотип 3 доминирует, этот результат выглядит закономерно. Однако на обследованной территории в очагах, расположенных в Амурской области (Дальний Восток), Калининградской области (Западная Россия), в странах Восточной Европы - Украине, Боснии и Герцеговине,, также наблюдается наличие очагов с превалированием генотипа 3.

Большая часть штаммов от теплокровных представлена в нашем исследовании изолятами из Иркутской области и Республики Бурятия. В таблице 4 показано соотношение генотипов ВКЭ у клещей и разных представителей теплокровных на этих двух территориях. Как видим, среди штаммов от людей и от клещей соотношения генотипов 1 и 3 приблизительно сопоставимы, а отличие проявляется в отсутствии генотипа 2 у «клещевых» штаммов. Среди штаммов от грызунов доля генотипа 3 заметно сокращается (до 33,3%) по сравнению с выборками штаммов от людей (80%) за счет увеличения доли генотипа 1, а по сравнению со штаммами от клещей (88,4%) -за счет увеличения доли генотипа 1 и появления генотипа 2. Напомним, что

наличие фрагментов нуклеотидных последовательностей генотипа 2 выявлено у 2-х из 3-х политиповых штаммов от клещей (262-74 и 618-87 (табл. 2)).

Таблица 4. Соотношение генотипов ВКЭ среди монотиповых штаммов, изолированных от хозяев разных видов на территориях Иркутской области и Республики Бурятия

хозяин Исследовано штаммов Генотип

1 2 3 4 5

Клещи 104 (100,0) * 6 (5,8) - 92 (88,4) 1(1,0) 5 (4,8)

Человек 10(100,0) 1 (10,0) 1 (10,0) 8 (80,0) -

Грызуны 24(100,0) 9(37,5) 4(16,7) 8 (33,3) - 3(12,5)

Корова 2 (100,0) 1 (50,0) - 1 (50,0) - _

Насекомоядные 1 (100,0) 1 (100) - - - -

Рябчик 1 (100,0) 1 (100) - - - -

итого 142 (100,0) 19(13,4) 5 (3,5) 109(76,8) 1(0,7) 8(5,6)

■"Примечание: в скобках указаны проценты

По поводу циркуляции генотипа 2 вируса КЭ в очагах Восточной Сибири важно отметить следующие факты:

- ни один штамм от клещей, за исключением двух политиповых, не был типирован как представитель генотипа 2;

- 5 из 6 случаев обнаружения генотипа 2 связаны с идентификацией штаммов от грызунов и 1 - от человека;

- в Республике Бурятия единственный случай обнаружения генотипа 2 связан с идентификацией политипового штамма от грызуна (765-87 в табл.2);

- единственный случай изоляции штамма генотипа 2 от больного КЭ человека зафиксирован на территории Иркутского района Иркутской области, где штаммы от клещей стабильно регистрируются как представители генотипа 3.

Вероятно, все это указывает на весьма незначительное участие генотипа 2 в формировании местных «клещевых» популяций возбудителя КЭ и селективную роль теплокровных, послуживших источником для выделения исследуемых штаммов.

Вышеприведенные факты можно расценивать как свидетельство в пользу предположения о том, что природные популяции ВКЭ являются обычно гетерогенными, т.е. представляют собой смеси разных генетических вариантов, в том числе и генотипов. Представляется, что в организме клеща обычно доминирует один генотип, а остальные могут присутствовать в минорных количествах. Доминантный вариант определяется климатическим фактором, который опосредуется через образование определенного фаунистического комплекса. При смене хозяина меняется соотношение генотипов в силу случайности (эффект «бутылочного горлышка») или под селективным воздействием теплокровного организма.

Исходы гибридизационных тестов были использованы для сравнения региональных популяций ВКЭ различной генотипической принадлежности с помощью графического анализа. Для выявления межрегиональных особенностей ВКЭ на рис. 3 выстроены кривые частот встречаемости участков генома соответствующих генотип-специфическим зондам для следующих условных популяций вируса КЭ: 1) «Европейская часть ареала» (ЕЧА); 2) «Предуралье, Урал и Западная Сибирь» (П, У и ЗС); 3) «Восточная Сибирь» (ВС); 4) «Дальний Восток» (ДВ). Для каждой из условных популяций вируса показаны кривые, соответствующие трем основным генотипам. На каждом графике кривые имеют сходные элементы профилей и точки совпадения.

На двух верхних графиках (для генотипов 1 и 2) 12 точек, формирующих профиль каждой кривой, соответствуют показателям эффективности реагирования 12 зондов одной из трех генотипспецифических субпанелей. Кривые на. нижнем графике (для генотипа 3) проходят не через 12, а через 13 точек. Тринадцатая точка (первая по оси абсцисс) соответствует показателю эффективности реагирования зонда С-1 из набора зондов генотипа 1 (или субпанели-1). Напомним, что зонд С-1, эффективно взаимодействуя с РНК штаммов генотипа 1, не реагирует с РНК штаммов генотипа 2 и дополнительно дифференцирует штаммы внутри группы генотипа 3 (см. табл. 3).

Генотип 1

С М Е е N51 М52А N528 N53 И54А N348 N55 N55 -СЧА — ■ П.УиЗС ---—ВС .......ДВ

Геногнп 2

ЕЧА — ■ • П,УиЗС -----ВС

Генотип 3

Р1А ---П.УиЗС —---ВС .......ДВ

Рисунок. 3. Кривые частот встречаемости участков генома, комплементарных генотипспецифическим зондам для условных популяций вируса КЭ

На графике генотипа 1 кривые «П, У и ЗС» и «ВС» почти накладываются друг на друга, в отличие от кривых «ЕЧА» и «ДВ». Возможно, что в этом рисунке находит отражение относительная географическая близость (или слабая географическая изоляция) условных региональных популяций «П, У и ЗС» и «ВС».

На графике «генотип 2» все три кривые (здесь кривая «ДВ» отсутствует, поскольку на территории Дальнего Востока генотип 2 пока не выявлен) совмещаются в 5 точках, где достигнут максимально возможный показатель эффективности реагирования зонда (т.е., зонд реагирует в 100% случаев). И

этот факт согласуется с данными секвенирования, демонстрирующими, что штаммы генотипа 2 более консервативны, чем штаммы генотипов 1 и 3. Однако, кривая, соответствующая условной популяции «Восточная Сибирь», имеет резкие отклонения, что, возможно, является следствием географической изоляции из-за более дискретного характера расположения очагов западного генотипа на территории Евразии по сравнению с генотипом 1. Следует отметить, что выборка штаммов генотипа 2 здесь невелика - всего 21 изолят, а кривая «ВС» выстроена по результатам гибридизации РНК пяти штаммов из Восточной Сибири.

По количеству штаммов наиболее «солидно» представлена группа генотипа 3-194 изолята. Несмотря на большие различия в численном составе 4 условных популяций, относящихся к генотипу 3 («ЕЧА» - 23 штамма, «П, У и ЗС» - 34, «ВС» -130 и «ДВ» - 7), их профили во многом совпадают.

Т.о., нами продемонстрировано, что с помощью предложенного набора зондов можно не только дифференцировать штаммы ВКЭ, но и сравнивать любые группы изолятов различного количественного состава. Разумеется, чем больше анализируемая выборка, тем достовернее будет полученная информация. Поскольку зонды испытанной в настоящей работе дифференцирующей панели подобраны для каждого из 10 генов вируса КЭ, то данные гибридизации зондов этой панели с образцами РНК монотиповых штаммов аналогичны результатам полногеномного секвенирования. В итоге, оба метода позволяют формировать единый массив данных при проведении популяционного анализа.

Результаты настоящего исследования показывают, что в масштабах всего изученного ареала и в разное время (с 1937 по 2006 г.) наблюдается циркуляция достаточно стабильного набора генетических вариантов ВКЭ, а предложенный способ генотипирования вируса с помощью панели молекулярных зондов позволяет оценивать генетические особенности вирусных популяций на различных участках ареала. Сходство паттернов гибридизации РНК штаммов, относящихся к одному и тому же генотипу из

очагов, расположенных на территориях западной и восточной окраин евроазиатского ареала, разделенных расстоянием около 10000 км, свидетельствует о его единстве. Это означает, что мозаичное распределение природных очагов ВКЭ сочетается, по всей вероятности, с постоянным и достаточно интенсивным обменом между ними. То есть генетические варианты вируса разного географического происхождения могут относительно свободно «перекачиваться» по единой очаговой системе в любом направлении. В центральной части ареала, в частности, на территории Восточной Сибири, по всей вероятности, чаще, чем в западных и восточных его частях, «перемешиваются» вирусы, относящиеся к разным генотипам. Полученная панорамная информация о генетической гетерогенности возбудителя КЭ по всему обследованному ареалу подтверждает ранее сделанный вывод о том, что каждый из трех генотипов вируса обладает собственным ареалом, где он доминирует (Злобин В.И. и др., 2003).

4. Дифференциация штаммов вируса клещевого энцефалита на основе сравнения геномов

Сопоставлены результаты генотипирования 100 штаммов ВКЭ разными способами и с применением двух стратегий сравнения геномов -несеквенирующей полногеномной - МГНК с набором генотипспецифических зондов к каждому из 10 генов вируса и секвенирующей - с использованием фрагментов генома длиной 160 н.о. и более. Преимущество типирования вируса клещевого энцефалита с применением первой стратегии заключается в возможности генотипировать штаммы ВКЭ и отбирать среди них представителей с нетипичными генетическими структурами в серийных опытах.

В таблице 5 сравниваются результаты генотипирования 11 монотиповых и двух политиповых штаммов в тестах МГНК с предложенным в данной работе набором зондов с результатами тестирования другими способами.

Секвенирование фрагментов генома осуществлялось нами (Злобин В.И. и др., 2001; Адельшин Р.В. и др., 2005, 2006), С.Е.Ткачевым (г. Новосибрск) и Л.С. Карань (г. Москва). Типирование штаммов в ОТ-ПЦР в режиме реального времени выполнено Л.С. Карань.

Таблица 5. Результаты геногипирования штаммов ВКЭ в тестах МГНК, с помощью секвенирования фрагментов гена Е и ОТ-ПЦР в режиме реального времени с генотипспецифическими зондами

№ Штамм МГНК с Секв Real-Time

генотипспецифическими ени- ПЦР с

зондами рова генотипспсц

Второго Первого ние ифическими

поколения* поколения** праимерами

1 Томари-1 (Злобин В.И. и др., 2001)* 1 н/и 3 н/и

2 429-82** 1 н/и За н/и

3 Кр.Яр-3 (3N936365J* 36 1 36 н/и

4 Байкал-3 (3N936362;* 3 1 36 н/и

5 Луковка-3 (JN936369)* 36 1 36 н/и

6 Н. Лядь * 36 1 н/и н/и

7 Залесная* 3 1 н/и н/и

8 Н. пальники* 36 2 н/и н/и

9 Преголя-0* 1 3 н/и н/и

10 262-74 (JN936338) п н/и 2 н/и

11 765-87 (JN936358) п н/и 1 2

12 1392* За н/и За 1/3

13 3869-03 (JN936361) 36 н/и 36 3/2

Примечания: *- зонды, использованные в настоящей работе; ** - ранее полученные генотипспецифические зонды, использованные в других работах (Злобин В.И. и др., 2001; Адельшин Р.В. и др., 2005); % - результаты гешлшшрования разными способами расходятся; н/и - не исследовано; * - данные секвенирования не опубликованы и не депонированы в GenBank.

Как видим из таблицы 5, результаты типирования, полученные разными методами или посредством МГНК с разными наборами генотипспецифических зодов, не всегда совпадают. Вероятно, расхождения в результатах типирования являются следствием того, что исследуются образцы РНК политипового штамма (или микст-штамма), полученные на разных пассажах. Различия в

генотипической принадлежности между разными образцами РНК политипового штамма могут иметь место вследствие проявления «эффекта бутылочного горлышка». Т.е., образцы РНК политипового штамма при его культивировании могут оказаться «монотиповыми» в силу изменения соотношения между генотипами.

Заслуживает внимания следующая закономерность, обнаруженная нами как в публикациях некоторых авторов, так и в ходе представленного исследования. Среди изученных образцов РНК вируса, которые, по-видимому, являются смесями генетических вариантов, не обнаружено ни одного сочетания генотипов 1 и 2. Однако, у таких образцов фиксируются следующие смеси фрагментов генома (а, возможно, и полных геномных молекул): 1) сочетание генотипов 1, 2 и 3, а, возможно, еще и генотипа 4 (у штаммов 262-74, 618-87 и 765-87 в табл. 3); 2) 1 и 3 (Джиоев Ю.П. и др., 2003; Андаев Е.И. и др., 2006; Карань JI.C. и др., 2007; Погодина В.В. и др., 2007; табл. 3 (Красный Яр-1, Лесопарк-10 ), табл. 5 (Томари-1, 429-82, 1392, Красный Яр-3, Байкал-3, Луковка-3, Н. Ляды, Залесная, Преголя-6)); 3) 2 и 3 (Карань Л.С. и др., 2007; Погодина В.В. и др., 2007; Безрукова Е.Г. и др., 2008; Ковалев С.Ю. и др., 2008; табл. 5 (3869-03, Н. пальники)). Отсюда можно предположить, что при совместном заражении: 1) генотипы 1 и 2 конкурируют между собой; 2) генотип 3 способен сочетаться с каждым из них; 3) клоны генотипов 1 и 2 могут сочетаться (совместно репродуцироваться) в присутствии генотипа 3. В качестве подтверждения возможности реализации варианта три можно рассматривать результаты генотипирования разными способами штаммов 26274 и 765-87 (табл. 2 и 5).

Всего при исследовании 100 штаммов с помощью разных подходов на предмет генотипирования выявлено 9 случаев несовпадений (в табл. 5 такие штаммы помечены звездочками в сером поле), которые, возможно, являются следствием гетерогенности природных изолятов ВКЭ.

Как было представлено в разделе 1, все штаммы генотипа 3 расходятся на две ветви — Сибирскую и Балтийскую, при этом Сибирская ветвь распадается

на субгенотипы Василъченко и Заусаев. В составе предложенной нами панели, предназначенной для дифференциации ВКЭ, нет зонда для идентификации штаммов балтийской ветви сибирского (урало-сибирского) генотипа, но имеется по одному зонду на субгенотипы Сибирской ветви - Василъченко и Заусаев. Поскольку все штаммы урало-сибирского генотипа, исследованные посредством МГНК с набором из 40 зондов, разделились на 3 группы -субгенотип За («Васильченко»), субгенотип 36 («Заусаев») и «группа ни За, ни 36», следовало ожидать, что если среди них имеются штаммы Балтийской ветви, то они окажутся в последней группе. Однако, проведенные с помощью МГНК тесты показаш, что в группу «ни За, ни 36» наряду со штаммами Балтийской ветви (например, Эк-328, Кръш-2), вошли также штаммы субгенотипа Василъченко, не прореагировавшие с зондом За (например, 530-89, 757-90, 767-90, 761-90, 769-90, 92М (рис. 5) и 940М), и субгенотипа Заусаев, не прореагировавшие с зондом 36 (Байкап-3, Байкал-4, Столбы-1, Столбы-4, 241-87, Еписей-2, Ботсад-1).

Установлено, что на основе фрагментов генома или полипротеина, в отдельных случаях, в силу наличия вариаций в структуре генома урало-сибирского генотипа, также как и с помощью МГНК с предлагаемой панелью зондов, затруднительно классифицировать изоляты ВКЭ до субгенотипов согласно схеме «две ветви (балтийская и сибирская) и три кластера («Балтийская ветвь», «Васильченко», «Заусаев»)». В частности, оказалось, что глутамин ((£) в позиции 234 белка Е не является надежным маркером для представителей группы «Васильченко», а встречается только у некоторых штаммов этой группы, изолированных в очагах Восточной Сибири и юго-восточной части Западной Сибири. Такие штаммы выделены жирным шрифтом на рисунке 4. Кроме того, С.Ю. Ковалев с соавт. (Коуа1еу Б.У. е1 а1., 2009) выявили в составе Балтийской ветви сибирского генотипа 10 изолятов вирусных РНК с глугамином (0) в позиции 234 белка Е. Такая же замена (Е-234(3) обнаружена у штамма Vo¡ogda-365-75 Балтийской ветви генотипа 3 (ЕГ214136), тонированного Л.С. Карань (2008).

0212(2305)10) 214(2005) (О) 942(1994) (О) п 1128(1995)10)

" 4- 1гки&к-112-79(0) Г~ 4- \Ааз1]сЬепко(1961)(0) ' 4- А!па(1963) (О) 4- 820-90(0)

I—520-86(0) 1-«99-11711 (О)

Кемеровская обл. Кемеровская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл.

Иркутскаяобл. Новосибирская обл. Иркутскаяобл. Чит инская обл.

Кемэро вская обл.

Респ. Бурятия Ко!агоуо-2008 (О) Томскаяобл.

__. , Кемеровская обл.

100 Кетегоуо-К34-67 (О) Кемеровская обл.

Читинскаяобп. Иркутская обл.

4- 1392-04(0) гю(2005) (О)

^ 769-90(0)

К»9-2ПЗ(0) 1Я99-2шЗ (О) Ф 761-90(0)

14, 767-90(0) 4- 757-90(0) 4- 530-89(0) ■ 4- 92М(2001)(Н)

-гв(2005)(Н) -222(2005)(Н) -1937(1985) (Н)

Читинскаяобп. Иркутскаяобл. Иркутскаяобл. Читинскаяобл. Читинскаяобп. Читинскаяобп. Читинскаяобл. Монголия Кемеровская обл.

Кемеровская обл. Новосибирская обл.

■481(1989)(Н) 929(1994) (Н) 11259(1996)(Н) 311(1988)(Н) '55(1992)(Н) 1057(1935) (Н) 323-880") ■348(1988) (Н)

1467(1984)(Н) |—1284(1906) (Н) М|_|1699(2001)(Н) бв|1700(2001)(Н)

4- 5ете1га(1988)(Н) Украина

Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл-Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обп. Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл. Новосибирская обл.

Рисунок 4. Места изоляции штаммов кластера субгенотипа Васильченко (44) сформировавшегося на дереве (N1, Итига-2-рагаше1ег), построенном на основе элаймента из 91 нуклеотидной последовательности фрагмента гена Е ВКЭ длиной 415 н.о.

Примечания: ф- штаммы, реагируюи/ие с зондом За; 4- - штаммы, не реагирующие зондом За; (О), (Н), (У) - аминокислотное основание в позиции 234 белка Е; см. также

пояснение в тексте.

Среди штаммов ВКЭ, изолированных на территориях Восточной Европы, отдельного внимания заслуживает штамм Семекс из Украины (рис. 4). Это пока единственный изолят вируса КЭ, квалифицированный на территории

Восточной Европы как представитель субгенотипа Васильченко. Причем его субгенотипическая принадлежность установлена на основе анализа фрагмента генома (АР224665), а также подтверждена с помощью гибридизационного теста.

Полученное с помощью гибридизационных тестов деление случайной выборки штаммов генотипа 3 на группы выполнено с помощью двух зондов, специфичных для субгенотипов Васильченко и Заусаев. С одной стороны, проделанный опыт, также как и сравнение фрагментов полипротеина представителей разных вариантов генотипа 3 ВКЭ, демонстрирует наличие вариаций внутри его субгенотипов. С другой стороны, результаты этого опыта доказывают, что с помощью МГНК возможно осуществление более тонкой дифференциации штаммов ВКЭ, чем определение до генотипа. Для этого необходимо выяснить насколько вариабельность штаммов генотипа 3 согласуется со сложившимися представлениями о существовании трех субгенотипов, т.е., ответить на вопрос: а всякий ли изолят вируса КЭ генотипа

3 можно отнести к одному из трех известных субгенотипов? Для этого нужно иметь больше данных по нуклеотидным последовательностям генотипа 3 и, в частности, иметь больше полногеномных последовательностей, а их пока всего

4 (для штаммов Васильченко, Заусаев, 3к-328 и Коларово-2008), Во всяком случае, по результатам проведенных гибридизационных тестов, дополненных анализом известных на сегодня последовательностей фрагментов генома, можно предположить, что в исследованной нами выборке штаммов генотипа 3 оказались изоляты вируса с необычной структурой генома. К таким штаммам мы относим, прежде всего, 9 представителей ВКЭ, изолированных на территории Калининградской области (Преголя-10), Украины (Крым-], Крът-4, Крым-6, Крым-7, 2288), Боснии и Герцеговины (Баня Лука-3, Баня Лука-9, Баня Лука-12). Необычность их геномов проявляется либо в том, что они не вписываются в схему едве ветви и три кластера», или, что вероятнее всего, соответствуя этой схеме, они не имеют аналогов среди нуклеотидных последовательностей, депонированных на сегодня в ОепВапк. Пока не ясно: то

ли эти штаммы относятся к Балтийской, то ли к Сибирской ветви. Для штаммов Баня Лука-3, Баня Лука-9, Баня Лука-12 расшифрованы последовательности короткого фрагмента гена Е (160 н.о.) (ЕШ72448-ЕШ72450). Однако длина такого фрагмента является недостаточной для идентификации изолята генотипа 3 ВКЭ до субгенотипа.

Разумеется, только дальнейшие исследования с помощью расшифровки фрагментов генома достаточной длины помогут классифицировать указанные штаммы. Также очевидно, что на основе новых данных секвенирования можно совершенствовать дифференцирующую панель дезоксиолигонуклеотидных зондов.

5. Генотипы вируса клещевого энцефалита

Результаты генотипирования 273 музейных штаммов ВКЭ, полученные в тестах МГНК с набором зондов, включающим три генотипспецифические панели, и анализ нуклеотидных последовательностей 643 штаммов и изолятов РНК ВКЭ подтверждают существование 5 генотипов вируса и уникальность единственного представителя генотипа 4 (штамм 178-79). Также они согласуются с представлениями о широком распространении генотипов 1, 2 и 3 и указывают на ограниченный ареал генотипа 5 («группы 886»).

Как представители генотипов ВКЭ, отличных от трех основных, штаммы 178-79 и 886-84, изолированные из одного очага в Восточной Сибири, заслуживают особого внимания. Впервые их необычность выявлена А.Г. Трухиной (1988, 1989) при изучении серологических свойств.

При сравнении структур 160-звенного фрагмента гена белка Е 34 штаммов ВКЭ оба этих штамма не вошли ни в одну из групп, соответствующих трем основным генотипам, а при анализе аминокислотных последовательностей изученного фрагмента оказалось, что штамм 886-84 примыкает к генотипу 3, а штамм 178-79 - к генотипу 1 (Злобин В.И. и др., 2001). В последовательности из 53 аминокислот, выведенных из данной нуклеотидной последовательности,

для дифференциации ВКЭ являются значимыми позиции Е-206, Е-232 и Е-234. Аминокислотные основания в двух последних позициях входят в состав пентапептида EGAQN (230-234), который был описан ранее как консервативный для всех штаммов ВКЭ (Shiu S.Y.W, et al., 1991; Venugopal К. et al., 1991). В позиции Е-232 у штамма 178-79 аланин (А) замещен на валин (V). В позиции Е-234 все исследованные на сегодня штаммы генотипа 1 и все штаммы генотипа 2, кроме двух - Ljubl и OW-Alpnach, а также штаммы 178-79 и 886-84, имеют аспарагин (N), наибольшая часть изученных штаммов урало-сибирского генотипа - гистидин (Н), а наименьшая - глутамин (Q) или тирозин (Y). У штаммов генотипа 2 - Ljubl (AF091012), изолированного из крови человека в 1993 г, и OW-Alpnach (НМ468146), изолированного от клеща I. ricinus в 2009, - аспарагин (N) замещен на треонин (Т).

Как известно, в позиции 206 находятся специфические для каждого из трех основных генотипов аминокислоты (Демина Т.В., 1999; Ecker М. et al., 1999): серии (S) характерен для генотипа 1; валин (V) - для генотипа 2; лейцин (L) - для генотипа 3. Поэтому многие исследователи, при секвенировании небольшого фрагмента генома ВКЭ, отдают предпочтение той области гена Е, которая перекрывает триплет, соответствующий аминокислоте № 206. Известно также, что единственный представитель генотипа 4 - штамм 178-79, как и штаммы генотипа 1, имеет в данной позиции серин (S), а штаммы генотипа 5, как и штаммы генотипа 3 - лейцин (L). Среди депонированных во всемирной базе данных 643 расшифрованных нуклеотидных последовательностей ВКЭ, перекрывающих триплет, кодирующий аминокислоту в позиции 206 белка Е (включая фрагменты генома штаммов из «группы 886» (EU878281, EU878282, EU878281, НМ133639)), известно 5 исключений. Они представлены в таблице 6. Как видно из этой таблицы, нетипичные аминокислоты обнаружены у представителей генотипов 2 и 3, причем, у наиболее консервативного генотипа 2 в разные годы - в Прибалтике и в Центральной Европе.

JI.C. Карань с соавторами (2007) упоминает еще о двух исключениях для дальневосточного генотипа с заменой серина на пролин (S—>Р).

К настоящему времени полностью расшифрованы нуклеотидные последовательности геномов обоих восточносибирских изолятов 178-79 и 88684 (Карань Л.С. и др., 2007). В таблице 7 сопоставлены все известные на сегодня полногеномные структуры штаммов ВКЭ из ОепВапк.

Таблица 6. Исключительные замены в позиции 206 белка Е ВКЭ

штамм замена Генотип Год, место и источник Изоляции Инв. №

Lithuania-262 V—>A 2 2001, Литва, кровь человека AJ414703

SZ Freienbach 1 V—+A 2 2009, Швейцария, I. ricinus НМ468153

SZ Freienbach2 V—А 2 2009, Швейцария, I. ricinus НМ468154

ZH RuetiZH V—А 2 2009, Швейцария, I. ricinus НМ468191

Pregolya-1 L—>P 3 1986, Калининград, D.pictus AF224664

Таблица 7. Уровни различий геномных и аминокислотных

последовательностей среди 32-х шаммов ВКЭ (%)

Различия по коди рующей области генома (10242 и.о.)

Генотип 1 Генотип 2 Генотип 3 178-79

Генотип 1 4,2

Генотип 2 16,5

Генотип 3 14,2 15,5 6,2'/:

178-79 11,2 16,1 14,4

886-84 12,6 15,5 13,8 11,8

Различия по полной последовательности полипротеина (3414 а.о.)

Генотип 1 1,2

Генотип 2 6,8 1,1

Генотип 3 5,4 6,3 ' 2,6

178-79 3,1 6,2 5Д

886-84 3,7 6,1 4,8 3,2

Примечание: В анализе использовано 19 штаммов генотипа 1, 7 штаммов генотипа 2 и 4 штамма генотипа 3. В сером поле указаны уровни замен внутри генотипов.

Установлено, что при построении филогенетических схем своеобразие штаммов 886-84 и 178-79 выражается в следующем. Во-первых, вне зависимости от местоположения анализируемого фрагмента генома и его

длины (от нескольких десятков и.о.), каждый из них, располагается на отдельной ветви (либо, крайне редко, они образуют общий кластер), в то время как остальные штаммы генотипов 1, 2 и 3 четко делятся на три соответствующие группы. Во-вторых, в зависимости от локализации сопоставляемых фрагментов генома, эти ветви примыкают то к кластеру генотипа 2, то к кластеру генотипа 3, но чаще группируются со штаммами генотипа 1.

Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей 32 штаммов вируса, относящихся к разным генотипам, показал, что на всем протяжении полипротеина наблюдается чередование аминокислот, как уникальных для каждого из пяти генотипов, так и характерных одновременно для двух, трех или четырех генотипов. Следует отметить, что замены, отобранные нами как уникальные для генотипов 4 и 5, только условно можно считать таковыми, поскольку эти генотипы представлены одиночными штаммами. Оказалось, что расположение генотипспецифических нуклеотидных последовательностей не всегда совпадает с местоположением аминокислотных горячих точек и, что генотипические отличия часто проявляются на уровне мутаций в положении 3 кодона.

Позиции мутаций, дифференцирующих основные генотипы и штаммы 178-79 и 886-84 (являющиеся типовыми представителями генотипов 4 и 5 соответственно) отобраны и сведены в таблицы. По общему количеству уникальных генотипспецифических аминокислотных замен «лидирует» генотип 2 (87), а наименьшее их число обнаружено у штамма 178-79 (21). Причем, вероятнее всего, не все из них являются специфическими для генотипа 4. Также можно предположить, что не все уникальные замены, обнаруженные у штамма 886-84 (28), являются специфическими для генотипа 5. Так, каждый из сравниваемых штаммов генотипов 1, 2 и 3 имеет некоторое количество уникальных (штаммоспецифических) замен - от 1 у штаммов Ргтогуе-86, Рптогуе-90 и Рптогуе-212 до 81 у штамма Ко1агоуо-2008. К

штаммоспецифической замене, мы относили такую замену, которая обнаруживалась только у одного из 32 штаммов.

В таблице 8 показаны аминокислотные замены в 22 позициях, которые были отобраны ранее (при сопоставлении первых десяти расшифрованных полногеномных последовательностей ВКЭ) как пригодные для дифференциации трех основных генотипов ВКЭ, т.е. как уникальные для каждого из них. Как видим, при увеличении числа сравниваемых полипротеинов (с 10 до 32) в отношении генотипов 1, 2 и 3 аминокислоты в 8-ми позициях (С-108, Е-317, N81-141, N83-126, N83-258, Ш4В-21, N85-297 и N85-832) не всегда оказываются надежными генотипспецифическими маркерами. Вероятно, при дальнейшем увеличении выборки анализируемых аминокислотных последовательностей в числе «не совсем надежных» для генотипирования позиций могли бы оказаться и другие из остальных 14. Однако не подлежит сомнению тот факт, что определенное сочетание аминокислот в этих 22 позициях является генотипспецифическим признаком. Так, в указанных позициях сочетания аминокислот для штаммов 178-79 и 88684, относящихся к генотипам 4 и 5, отличаются от наборов, характерных для трех основных генотипов. В наборе для генотипа 4 чередуются аминокислоты генотипов 1 и 3, а для генотипа 5, наряду с уникальными заменами (С-108А, ^2А-1278 и N83-2580), отмечается чередование аминокислот, характерных для трех основных генотипов.

Можно заключить, что штамм 178-79 относится к генотипу 4, который, по сравнению с остальными известными генотипами характеризуется наименьшим количеством уникальных аминокислотных замен и по уровню гомологии нуклеотидной и аминокислотной последовательностей близко примыкает к генотипу 1; представители «группы 886» относятся к генотипу 5, который в меньшей степени, чем генотип 4, примыкает к генотипу 1 и имеет больше общего с генотипами 2 и 3, чем штамм 178-79, но тесней всего связан с последним (табл. 2, 3; рис.1; табл. 7, 8).

Таблица 8. Отличия между генотипами ВКЭ, выявленные при сравнении 32 полипротеиновых структур

белок С Е N51 №2А N53 N546 N55

№ а.о. по полипротеину 3 108 486 597 830 917 1081 1228 1255 1302 1303 1353 1615 1747 1865 2280 2287 2355 2529 2808 3182 3343

№ а.о. по С«лку 3 108 206 317 54 141 285 100 127 174 175 225 126 258 376 21 28 96 18 297 671 832

50/у/л 3 V $ 1 Т 5 1? N А М 1 V 1 V 1 Н Е Я б Я V А

ВоПт-НО б V $ 1 т 5 Я N А м 1. 1 1 V 1 Н Е А б Я V А

ОаЫта5-Ю 3 V 5 1 т 5 Я N А м 1 V 1 V 1 Н Е А б Я V V

205 г V 5 т 5 Я N А м ь 1 1 V ( Н Е А 3 Я V V

5етЬапд з 1. 1 т 5 Я N А м 1 1 V 1 Н Е А б Я V V

М01-01 3 1 в 1 т 5 Я N А м 1 1 1 V Н Е А б Я V V

С1иЫппое 3 1 $ 1 т 5 Я N А м 1 1 1 V 1 Н Е А б Я V V

Р-18 3 V $ 1 т Б Я N А м 1. 1 1 V 1 Н Е А б Я V А

Р-69 3 V $ т 3 Я N А м 1. 1 1 V 1 Н Е А б Я V V

Р-86 3 V 5 1 т 3 Я N А м 1 1 V 1 Н Е А б Я V т

Р-89 0 V 5 1 т Б Я N А м 1. 1 V 1 Н Е А б Я V А

Р-90 3 V 1 т С Я N А м 1 1 1 V 1 Н Е А б Я V Т

Р-94 3 V 5 1 т 5 я N А м 1. 1 1 V 1 Н Е А 3 Я V А

Р-212 3 V 5 1 т 5 я N А м 1 1 1 V 1 Н Е А б Я V А

Р-253 3 V $ 1 т б я N А м 1 1 1 V 1 Н Е А 3 Я V А

Р-270 а V 5 1 7 б я N А м 1 1 1 V 1 Н Е А б К V Г

р-ззг 3 V 1 т 3 я N А м 1 1 1 V 1 Н Е А 6 Я V А

Kavalerovo 3 1 $ 1 т $ я N А м 1 1 V 1 Н Е А 3 Я V V

Оа1педопк 3 V 5 1 т 5 я N А м 1 1 1 V 1 Н Е А б Я V А

ЫеиЬоеф к 1 V А $ а т $ Е V с А 1 А А Я в Т N Е 1 М

263 к 1 V А 5 а т $ 0 V с А 1 А А Я 5 Т N Е 1 М

Нург к 1 V А $ а т % 0 V с А А А Я Б т N Е 1 М

ЮЗ к 1 V А ч т Б 0 V с А 1 А А Ч % т N Е 1 М

5а1ет к 1 V А 5 с» т Б р V с А 1 А А % т N Е 1. М

Того-2003 к 1 V А $ а т 5 0 V с А 1 А А Ч % т N А 1 М

А533 к 1 V А 5 а т 5 Б V с А 1 А А а г т N Е 1 М

УазИсЬепко я т 1 Т N б к б 3 1 1 Т М М V а б 5 5 б 1 т

Хамаеч л т 1 т N 3 к 3 3 1 г Т М V V б 5 5 Я 1 т

Ек-328 я т 1 т N 3 к 3 3 1 т т М V V ч б $ 5 б 1 т

Ко1агою я т 1 т N 3 к б 3 1 1 т Т М V ч б 5 5 б 1 т

173-79 я V В т Т 5 к N б м 1 т 1 V V ч б А в б V А

836-84 к А 1 1 N 5 к 5 5 м 1 А 1 3 V ч б А 5 б V А

Примечание. Цвет ячейки указывает на соответствие штамма или аминокислотного остатка одному из пяти генотипов ВКЭ.

Весьма важным представляется вопрос о происхождении штаммов 178-79 и 886-84. Результаты исследований филогенетических отношений на основании различных фрагментов генома, сравнительного анализа полногеномных и полипротеиновых последовательностей, а также данные гибридизационных тестов позволяют сделать предположение о том, что геномы штаммов генотипов 4 и 5 представляют собой два варианта «переплетений» из последовательностей, характерных для генотипов 1, 2 и 3.

Естественно также предположить, что «переплетение» или «мозаичность» из последовательностей, характерных для трех общепризнанных генотипов, является следствием рекомбинационных событий. Представляется, что в данном случае мы имеем дело с рядом последовательных множественных рекомбинаций между геномными молекулами трех генотипов ВКЭ. Вероятно, рекомбинанты проходят жесткий многоуровневый отбор, первым этапом которого является соответствие определенной вторичной структуре геномной молекулы. На это указывает достаточно частое наличие для каждого из генотипов определенного нуклеотидного основания в третьей позиции кодона.

Рекомбинационный механизм преобразования генома выглядит достаточно вероятным, если принять во внимание наличие двух обстоятельств (предпосылок):

- длительного совместного пребывания (перемешивания) трех генотипов вируса на определенной территории (в данном случае на территории Восточной Сибири);

- возможности совместной репродукции вирусов, относящихся к разным генотипам, в организме одного и того же животного (обнаружение политиповых штаммов).

В литературе также имеются генетические доказательства существования политиповых штаммов (или микст-штаммов). Так, В.В. Погодина с соавт. (2007) сообщают о пяти случаях заболевания людей КЭ, связанных с микст-штаммами возбудителя, а С.Ю. Ковалев и др. (2008) с помощью

генотипспецифической ОТ-ПЦР обнаружили геномные последовательности двух генотипов вируса в одном клеще.

Таким образом, полученные результаты показывают, что: 1) в масштабах всего обследованного ареала циркулирует стабильный набор генетических вариантов ВКЭ; 2) возможно, в эволюции вируса важную роль играет множественная гомологичная рекомбинация, и, при условии высокой частоты встречаемости, она же служит стабилизирующим фактором; 3) возможно, рекомбинационные события являются причиной противоречивости классификационных схем флавивирусов млекопитающих, переносимых клещами.

ВЫВОДЫ

1. Разработана панель дезоксиолигонуклеотидных зондов пригодная для генотипирования и изучения генетической вариабельности ВКЭ.

2. Метод МГНК с предложенным набором зондов позволяет получать специфическую характеристику (паттерн гибридизации) каждого образца вирусной РНК и пригоден для целенаправленного скрининга геномов ВКЭ. Гибридизация с зондами, комплементарными специфическим участкам всех 10 генов вируса КЭ, дает информацию, соответствующую результатам полногеномного секвенирования, что позволяет формировать единый массив данных для популяционного анализа на основе использования обоих методов.

3. Метод МГНК с дифференцирующей панелью зондов позволил: а) установить генотипспецифическую принадлежность каждого из 273 исследованных коллекционных штаммов; б) подтвердить уникальность строения генетической структуры штамма 178-79 - единственного известного представителя генотипа 4; в) впервые выявить изоляты вируса, гомологичные штамму 886-84 (генотип 5); г) обнаружить политиповые штаммы.

4. В очагах евроазиатского ареала циркулируют, по меньшей мере, 5 генотипов ВКЭ. Представители генотипов 1, 2 и 3, в отличие от штаммов

генотипов 4 и 5, соответствуют трем официально признанным субтипам вируса КЭ (дальневосточному, западному и сибирскому). При сопоставлении нуклеотидной (кодирующей) и аминокислотной последовательностей 32 штаммов ВКЭ между генотипами выявлены сложные филогенетические отношения. Штамм 178-79 - прототип генотипа 5 - по уровню гомологии нуклеотидного состава наиболее близок генотипу 1 (11,2% различий). Штамм 886-84 - представитель генотипа 5 - в меньшей степени, чем генотип 4 родствен генотипу 1 (12,6%) и имеет больше общего с генотипами 3 (13,8%) и 2 (15,5%), чем штамм 178-79 (14,4% и 16,1 соответственно). При этом тесней всего штаммы 178-79 (генотип 4) и 886-84 (генотип 5) связаны между собой (11,8%).

5. С помощью метода МГНК установлено географическое распространение генотипов возбудителя КЭ. Генотип 1 преобладает на Дальнем Востоке. Представители генотипа 2 выявляются преимущественно в Восточной Европе, встречаются на Алтае, редко - в Восточной Сибири и не обнаружены на Дальнем Востоке. Генотип 3 доминирует повсюду, исключая Дальний Восток и некоторые территории Восточной Европы. Генотип 4 представлен единственным изолятом из Восточной Сибири (штамм 178-79). Генотип 5 обнаруживается на территории Восточной Сибири.

6. Результаты генотипирования 100 штаммов с применением разных подходов (МГНК с зондами разных поколений, секвенирования и ПЦР в режиме реального времени) в основном совпадают. Несовпадения в 9 случаях, возможно, являются следствием гетерогенности исходных изолятов ВКЭ и использованием для анализа образцов РНК, полученных на разных пассажах.

7. При сравнении полных аминокислотных последовательностей 32

штаммов ВКЭ для каждого из 5 генотипов выявлены специфические маркеры,

расположенные по всему полипротеину. Наибольшее количество

генотипспецифических замен обнаружено у генотипа 2 (87), а наименьшее у

штамма 178-79 (21) — единственного представителя генотипа 4.

Генотипспецифическим признаком ВКЭ является определенное сочетание

аминокислот в следующих 22 позициях: С-3, С-108, Е-206, Е-317, NS1-54, NS1-141, NS1-285, NS2A-100, NS2A-127, NS2A-174, NS2A-175, NS2A-225, NS3-126, NS3-258, NS3-376, NS4B-21, NS4B-28, NS4B-96, NS5-18, NS5-297, NS5-671, NS5-832.

8. Сравнительный анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей, а также исходы гибридизационных тестов, позволяют предложить гипотезу, объясняющую происхождение штаммов 178-79 и 886-84: структура их геномов - результат ряда последовательных множественных рекомбинаций между геномными молекулами трех основных генотипов ВКЭ.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Злобин В.И., Демина Т.В., Мамаев JI.B., Бутина Т.В., Беликов С.И., Горин О.З., Джиоев Ю.П., Верхозина М.М., Козлова И.В., Воронко И.В., Аделынин Р.В., Грачев М.А. Анализ генетической вариабельности штаммов вируса клещевого энцефалита по первичной структуре фрагмента гена белка оболочки Е // Вопр. вирусол. - 2001. - № 1. - С. 12-16.

2. Злобин В.И., Демина Т.В., Беликов С.И., Бутина Т.В., Горин О.З., Адельшин Р.В., Грачев М.А. Генетическое типирование штаммов вируса клещевого энцефалита на основе анализа гомологии фрагмента гена белка оболочки // Вопр. вирусол. - 2001. - № 1. - С. 17-21.

3. Злобин В.И., Газо М.Х., Беликов С.И., Джиоев Ю.П., Демина Т.В., Верхозина М.М., Козлова И.В., Адельшин Р.В., Дорощенко Е.К. Молекулярные зонды для генетического типирования вируса клещевого энцефалита//Вопр. вирусол. - 2001. - №4. - С. 43-47.

4. Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П., Демина Т.В., Козлова И.В., Верхозина М.М., Данчинова Г.А., Адельшин Р.В., Дорощенко Е.К., Кулакова Н.В. Новая концепция природной генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита // Тихоокеанск. мед. журн. - 2001. - № 2. - С. 75-78.

5. Злобин В.И., Погодина В.В., Дрокин Д.А., Газо М.Х., Бочкова Н.Г., Джиоев Ю.П., Демина Т.В., Беликов С.И., Козлова И.В., Верхозина М.М. Специфическое определение флавивирусов методом молекулярной гибридизации с синтетическими дезоксиолиго-нуклеотидными зондами // Вопр. вирусол. - 2003. - Т. 48, № 3. - С. 23-27.

6. Адельшин Р.В., Злобин В.И., Беликов С.И., Джиоев Ю.П., Демина Т.В., Газо М.Х., Козлова И.В., Верхозина М.М., Вотяков В.И., Титов Л.П., Самойлова Т.Н., Данчинова Г.А., Хаснатинов М.А., Воронко И.В., Голубович С., Тешанович М., Приймяги Л.С., Василенко В.А. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита в Европейской России и некоторых

странах Балтии, Восточной и Юго-Восточной Европы // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. - 2006. - № 2 (27). - С. 27-34.

7. Карань JI.C., Маленко Г.В., Бочкова Н.Г., Левина Л.С., Ливанова Г.П., Колясникова Н.М., Гамова Е.Г., Трухина А.Г., Злобин В.И., Верхозина М.М., Козлова И.В., Джиоев Ю.П., Демина Т.В,, Погодина В.В. Применение молекулярно-генетических методик для изучения структуры штаммов вируса клещевого энцефалита // Бюлл. СО РАМН. - 2007. - № 4 (126). - С. 34-40.

8. Верхозина М.М., Злобин В.И., Козлова И.В., Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Беликов С.И., Борисов В.А., Данчинова ГА., Арбатская Е.В., Лисак О.В., Дорощенко Е.К., Протасова Е.Г. Эколого-генетический анализ региональной популяции вируса клещевого энцефалита в Восточной Сибири // Бюлл. СО РАМН. - 2007. - № 4 (126). - С. 53-60.

9. Злобин В.И., Верхозина М.М., Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Аделынин Р.В., Козлова И.В., Беликов С.И., Хаснатинов М.А., Данчинова Г.А., Исаева Е.И., Гришечкин А.Е. Молекулярная эпидемиология клещевого энцефалита // Вопр. вирусол. - 2007. - № 6. - С. 4-13.

10. Верхозина М.М., Злобин В.И., Козлова И.В., Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Лисак О.В., Дорощенко Е.К., Протасова Е.Г. Эколого-эпидемиологический и молекулярно-генетический анализ популяции вируса клещевого энцефалита на терригории Иркутской области // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. —2008. - №1 (38). - 12-18.

11. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Верхозина М.М., Козлова И.В., Ткачев С.Е., Дорощенко Е.К., Лисак О.В., Злобин В.И. Генетическая вариабельность и генотипирование вируса клещевого энцефалита с помощью дезоксинуклеотидных зондов // Вопр. вирусол. - 2009. - № 3. - С. 33-42.

12. Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Верхозина М.М., Козлова И.В., Ткачев С.Е., Дорощенко Е.К., Лисак О.В., Злобин В.И. Молекулярная эпидемиология вируса клещевого энцефалита: географическая вариабельность, определяемая методами молекулярной гибридизации // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. -2009.-№3(46).-С. 27-39.

13. Démina T.V., Dzhioev Yu.P., Verkhozina M.M., Kozlova I.V., Tkachev S.E., Plyusnin A., Doroshchenko E.K., Lisak O.V., Zlobin V.l. Genotyping and characterization of the geographical distribution of tick-borne encephalitis virus variants with a set of molecular probes // J. Med. Virol. - 2010. - Vol. 82(6). - P. 965-976.

14. Козлова И.В., Верхозина M.M., Демина T.B., Джиоев Ю.П., Дорощенко Е.К., Лисак О.В., Карань Л.С., Колясникова Н.М., Pap В.А., Фоменко Н.В., Ткачев С.Е., Богомазова О.Л., Борисов В.А., Туваков М.К., Злобин В.И. Сочетанные очаги трансмиссивных клещевых инфекций на территории Прибайкалья // Эпидемиол. и вакцинопрофилактика. - 2010. - № 4 (53). - С. 4046.

15. Парамонов А.И. Джиоев Ю.П., Демина Т.В., Букин Ю.С., Козлова И.В., Приставка A.A., Саловарова В.П. Выявление потенциальных событий рекомбинации в нуклеотидных последовательностях вируса клещевого

энцефалита II Известия Иркутского государственного университета. Серия биология. Экология. - 2010. - Т. 3, № 4. - С. 40-43.

16. Джиоев Ю.П., Парамонов А.И., Демина Т.В., Козлова И.В., Верхозина М.М., Ткачев С.Е., Приставка A.A., Саловарова В.П., Злобин В.И. Обнаружение рекомбинаций у вируса клещевого энцефалита с помощью компьютерного анализа вирусных геномов // Вопр. вирусол. - 2011. - № 2. - С. 14-18.

17. Козлова И.В., Верхозина М.М., Демина Т.В., Джиоев Ю.П., Ткачев С.Е., Карань JI.C., Дорощенко Е.К., Лисак О.В., Сунцова О.В., Парамонов А.И., Черноиванова О.О., Ревизор А.О., Злобин В.И. Комплексная характеристика оригинальной группы штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных на территории Восточной Сибири // Сиб. Мед. журнал. - 2012. - № 4. - С.80-85.

Подписано в печать 26.12.2012 г. Формат 60x84 1/16

Бумага офсетная/мелованная. Печать Офсетная. Усл. печ. л. 2,8. Уч.-изд. л. 3. Тираж 100 экз. Заказ 816.

Отпечатано в типографии Института земной коры СО РАН 664033, Иркутск, ул. Лермонтова, 128

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Демина, Татьяна Васильевна, Иркутск

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр проблем здоровья семьи и репродукции человека» Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Вопросы генотипирования и анализ генетической вариабельности

вируса клещевого энцефалита 03.02.02 - вирусология

На правах рукописи

05201350474

Демина Татьяна Васильевна

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: академик РАМН, д.м.н. профессор В.И. Злобин

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ............................................................. 4

ВВЕДЕНИЕ................................................................................. 5

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Таксономия и классификация вируса клещевого энцефалита....... 9

Глава 2. Характеристика различий штаммов вируса клещевого энцефалита на уровне геномов.........................................................23

2.1. Структура генома вируса клещевого энцефалита..................... 23

2.2. Выявление внутривидовых различий вируса КЭ и других флавивирусов на основании анализа первичных структур геномов ... 25

2.3. Молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот (МГНК)

с плазмидными и дезоксиолигонуклеотидными зондами................. 38

III. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 3. Материалы и методы........................................................ 45

Глава 4. Конструирование панели специфических дезоксиолигонуклеотидных зондов, предназначенной для анализа структуры геномов и генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита............................................................... 51

4.1. Разработка дизайна дезоксиолигонуклеотидных зондов для формирования панели, дифференцирующей штаммы ВКЭ.............. 51

4.2. Отбор фрагментов генома для расчета специфических дезоксиолигонуклеотидных зондов............................................ 52

4.3. Формирование дифференцирующей панели зондов для скрининга геномов ВКЭ.......................................................... 74

Глава 5. Результаты апробации сконструированных олигонуклеотидных зондов для генотипирования ВКЭ................................................... 78

5.1. Апробация панелей генотипспецифических зондов в опытах гибридизации с РНК прототипных штаммов ВКЭ......................... 78

5.2. Тестирование коллекционных штаммов ВКЭ с помощью

дифференцирующей панели олигонуклеотидных зондов

вМГНК.............................................................................. 82

5.3. Оценка эффективности гибридизации полученных зондов......... 85

Глава 6. Типирование штаммов вируса клещевого энцефалита с использованием панели молекулярных зондов................................. 96

6.1. Географическое распространение генотипов ВКЭ на Территории Евроазиатского ареала.............................................96

6.2. Некоторые региональные эколого-географические особенности особенности ВКЭ..................................................................101

6.3. Сравнение региональных популяций ВКЭ с помощью графического анализа............................................................ 124

Глава 7. Дифференциация штаммов вируса клещевого энцефалита на основе сравнения геномов........................................................ 129

7.1. Сравнение данных генотипирования штаммов с использованием панели специфических зондов и

секвенирования фрагментов вирусных геномов........................... 129

7.2. Субгенотипическая идентификация штаммов урало-сибирского урало-сибирского генотипа с помощью двух подходов.................. 135

7.3. Возможности применения метода МГНК с наборами генотипспецифических зондов для изучения генетической вариабельности ВКЭ............................................................. 149

Глава 8. Генотипы вируса клещевого энцефалита

8.1. Генотипы вируса клещевого энцефалита в свете данных типирования штаммов с помощью панели специфических зондов... 151

8.2. Своеобразие штаммов 178-79 и 886-84 и сопоставление полногеномных структур и фрагментов генома вируса КЭ.............. 152

8.3. О выявлении штаммов «группы 886».................................. 156

8.4. Своеобразие штаммов 178-79 и 886-84 и анализ

полипротеиновых структур штаммов ВКЭ.................................. 158

8.5. Предположения о происхождении штаммов 178-79 и 886-84 ......166

ЗАКЛЮЧЕНИЕ........................................................................ 172

ВЫВОДЫ............................................................................... 175

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................ 178

ПРИЛОЖЕНИЕ I ......................................................................205

ПРИЛОЖЕНИЕ II ..................................................................... 217

ПРИЛОЖЕНИЕ III..................................................................... 228

ПРИЛОЖЕНИЕ IV..................................................................... 240

ПРИЛОЖЕНИЕ V..................................................................... 241

РНК - рибонуклеиновая кислота

СПИСОК ОСНОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

ВКЭ - вирус клещевого энцефалита

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КЭ - клещевой энцефалит

ККЭ - комплекс клещевого энцфалита

МГНК - молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот

н.о. - нуклеотидное основание

ОГЛ - омская геморрагическая лихорадка

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований Неблагоприятное развитие эпидемической обстановки по клещевому энцефалиту (КЭ) отмечается периодически на многих территориях в пределах ареала возбудителя - вируса клещевого энцефалита (ВКЭ). Заболеваемость КЭ регистрируется более чем в 25 европейских и 7 азиатских странах (Charrel R.N. at al., 2004) [146]. Заболеваемость КЭ в Российской Федерации и странах Европы в последнюю четверть XX века имела тенденцию увеличения случаев заболевания и на рубеже веков достигла своего исторического максимума (Злобна В.И. и др., 2003; Злобны В.И., Львов Д.К., 2008; Локтев В.Б. и др., 2007 и др.) [50, 58, 83]. Первое десятилетие XXI века ознаменовалось спадом заболеваемости с колебаниями по годам, связанными с известной цикличностью данного процесса.

Необходимость изучения генетической вариабельности вируса КЭ диктуется, прежде всего, разнообразием проявлений клещевого энцефалита. Известно, что штаммы разных генотипов различаются по патогенности для людей и что разные регионы внутри обширного ареала возбудителя отличаются друг от друга по показателям риска заражения, заболеваемости, летальности и клинической манифестации КЭ. Изучение генетической вариабельности необходимо и для понимания эволюционных взаимоотношений между вирусами и эволюции собственно ВКЭ.

Вирус КЭ является типовым представителем группы флавивирусов млекопитающих, переносимых клещами, куда входят несколько видов, распространенных в географически удалённых друг от друга районах Европы, Азии и Америки. Однако эволюционные и генетические взаимоотношения, как между этими вирусами, так и между штаммами собственно ВКЭ, остаются недостаточно ясными. По-видимому, причина противоречий - в недостатке знаний о фундаментальных свойствах

изучаемого объекта - о геноме вируса и его изменчивости.

После установления полной структуры геномов трех штаммов ВКЭ {Плетнев А.Г. и др., 1989; Mandl С. at al., 1989; Сафронов П.Ф. и др., 1991) [91, 95, 193, 113] для анализа генетической вариабельности вируса разработаны различные модификации молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот (МГНК). Цикл работ по изучению возможности применения дезоксиолигонуклеотидных зондов в МГНК для характеристики различных аспектов изменчивости ВКЭ как в природных, так и в лабораторных условиях, показал перспективность метода для решения проблем таксоиомии и классификации вирусов, а также изучения их эволюционных взаимоотношений.

В результате изучения генетической вариабельности штаммов ВКЭ на основе анализа гомологии небольшого участка гена Е (160 и.о.) 34 штаммов в 2001 г. сделано предположение о существовании шести генотипов вируса {Злобил В.И. и др., 2001) [56] . Три из них определены как основные: генотип 1 - дальневосточный (штамм SoJjin), генотип 2 - западный (штамм Neudoerß) и генотип 3 - урало-сибирский (штаммы Lesopark-11, Vasilchenko) {Злобны В.И. и др., 2003) [50]. В литературе также принято упомянутые генотипы обозначать как дальневосточный, европейский и сибирский субтипы (Ecker М. at al., 1999) [156]. Штамм Turkish, описанный ранее как штамм вируса КЭ {Whitby J.Е., et al. 1993) [228] и включенный нами вместе со штаммом Vergina (описан Погодиной В.В. и др., 1993) [98] в состав генотипа 6, зарубежными исследователями классифицирован как вариант вируса шотландского энцефаломиелита овец (LI) {Heinz F.X. et al., 2000) [174]. Генотипы 4 и 5 представлены не группами, а одиночными штаммами - 17879 и 886-84. Оба изолированы на территории Иркутской области и отвечают критериям выделения в самостоятельные генотипы, установленным на основании степени геномных отличий. Было высказано предположение, что другие представители этих двух генотипов пока не найдены.

В составе исследованного фрагмента гена Е определен вариабельный

штаммов, относящихся к разным генотипам (Газо М.Х., 1999; Злобин В.И. и др., 2001) [25, 53]. На основе этой вариабельной последовательности получены синтетические дезоксиолигонуклеотидные зонды, пригодные для генетического типирования ВКЭ методом МГНК. Однако дифференциация штаммов ВКЭ с помощью панели, содержащей по одному зонду на каждый генотип, не позволяет типировать штаммы, в геноме которых имеются «случайные» нуклеотидные замены на участке, гомологичном зонду. И, разумеется, такая панель не предназначена для выявления конкретных особенностей каждого из исследуемых штаммов, что совершенно необходимо для изучения генетической вариабельности.

Между тем, постоянно пополняющиеся данные вепВапк по нуклеотидным последовательностям, подтверждая концепцию трех основных генотипов ВКЭ, указывают на наличие вариаций внутри них, а также на существование еще, как минимум, двух генотипов вируса с неопределенным пока ареалом и эпидемическим потенциалом (генотип 4 с прототипным штаммом 178-79 и генотип 5 с прототипным штаммом 886-84). Ситуация требует расширения исследований генетической структуры и квалификации штаммов (изолятов) из разных участков ареала.

Описанные обстоятельства в деле изучения вируса КЭ позволяют прийти к заключению о том, что для исследования его генетической вариабельности, наряду с дешифровкой нуклеотидных последовательностей, целесообразно использовать МГНК с наборами генотипспецифических зондов, комплементарных различным участкам генома.

Цель исследования - выявление природного генетического разнообразия возбудителя клещевого энцефалита для уточнения его внутривидовой классификации и совершенствования средств идентификации.

Для достижения этой цели поставлены следующие задачи:

4. Осуществить анализ генетической вариабельности возбудителя КЭ.

5. Уточнить географическое распространение генотипов ВКЭ.

6. Сопоставить результаты генотипической дифференциации штаммов ВКЭ, выполненной разными способами.

7. Выявить генотипспецифические маркеры ВКЭ.

Глава 1. Таксономия и классификация вируса клещевого энцефалита

Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) относится к семейству Flaviviridae, роду Flavivirus. По последним данным Международного Комитета по Таксономии Вирусов семейство Flaviviridae включает три рода: Flavivirus (от лат. flavus - желтый, поскольку к нему относится вирус желтой лихорадки), Pestivirus (от лат. pestis - в состав рода входит вирус классической чумы свиней), Hepacivirus (от лат. hepar - печень, т.к. к этому роду относятся

вирусы гепатитов С и G) (Thiel HJ. et al., 2005; Львов Д.К., Дерябин П.Г.,

2008) [218, 85]. Род Flavivirus включает не менее 67 вирусов из 15 антигенных групп, передающихся позвоночным хозяевам путем биологической трансмиссии членистоногими переносчиками (комарами, клещами) и относящихся на этом основании к экологической группе арбовирусов. ВКЭ является представителем группы флавивирусов млекопитающих, передающихся клещами, и делится на три подтипа: европейский, дальневосточный и сибирский.

Представления о таксономическом положении вируса КЭ меняются по мере углубления знаний о нем и, главным образом, по мере накопления данных по первичной структуре генома.

1. 1. Историческая справка

Первоначально вирус КЭ был отнесен к семейству Togaviridae, которое включало 4 рода: Alphavirus, Flavivirus, Rubivirus и Pestivirus. В основу этой классификации были положены принципы, основанные на изучении фундаментальных свойств вируса, таких как: содержание в составе вириона одноцепочечной инфекционной РНК от ЗхЮ8 до 4x106 Д, наличие изометрического нуклеокапсида, липопротеиновой оболочки, одного или более оболочечных пептидов [157, 212]. В 1984 году род Flavivirus был выделен из семейства Togaviridao, в качестве самостоятельного семейства

Flaviviridae [226]. Основанием тому явились различия в стратегии репликационного цикла, организаций и экспрессии геномов, а также отличия в морфологии и морфогенезе вирионов [227, 180, 225, 213]. Согласно новым принципам классификации в род Flavivirus вошло около 70 вирусов [181, 26].

По мнению Ч.Х. Калишер (1988) [66] деление вирусов по подгруппам внутри рода на такие единицы, как комплекс, тип, подтип необходимы из практических соображений; члены одного комплекса - это близкородственные, но отличающиеся между собой вирусы одной серологической группы. Серологическую группу этот автор определяет как группу из двух и более вирусов, различающихся по количественным серологическим критериям в одном или нескольких тестах, но в то же время обладающих родством при оценке каким-либо серологическим методом. Вирусы, принадлежащие к одному антигенному комплексу - антигенно родственные, но легко различимые с помощью одного или нескольких стандартных серологических тестов (РТГА, РСК, иммунофлюоресценция, нейтрализация, ИФА, и т.д.), считаются вирусами или типами. Подтипами называют изоляты вируса, отличающиеся друг от друга как минимум 4-кратной разницей между гомологичным и гетерологичным титрами одной из двух (но не обеих) тестируемых сывороток. Вариантами называют такие изоляты, которые можно различить только с помощью специфических тестов или реагентов, включая исследования с моноклональными антителами к специфическим эпитопам, или специализированные тесты (кинетическая РТГА или абсорбционная ингибиция гемагглютинации).

Вирусы, входящие в состав разных комплексов, имеют общие гемагглютинины с другими сочленами группы. На этом основании флавивирусы и были первоначально отнесены к арбовирусам группы В. В результате исследований с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) флавивирусы были объединены в четыре антигенных комплекса [27]: 1) комплекс вируса КЭ; 2) комплекс вируса японского энцефалита; 3)

комплекс вируса желтой лихорадки; 4) комплекс вирусов денге.

A.T. De Madrid и J.S. Porterfield (1974) [154], используя высокочувствительную методику нейтрализации бляшек, по сходству антигенных свойств разделили 42 известных в то время флавивируса на 7 подгрупп. При этом шесть вирусов оказались не классифицированными (в рамках семейства), в том числе вирус желтой лихорадки и вирус Повассан, исключенный из подгруппы вируса КЭ.

Классификация представителей рода Flavivirus на основе антигенных взаимоотношений между ними, установленных в реакциях перекрестной нейтрализации с применением моноклональных сывороток, была построена Ч.Х. Калишером ( 1989) [144]. По результатам реакции нейтрализации 49 из 66 флавивирусов были сгруппированы в 8 антигенных комплексов: 1) клещевого энцефалита (12 вирусов); 2) Рио Браво (6); 3) японского энцефалита (10); 4) Тюлений (3); 5) Нтайя (5); 6)Уганда С (4); 7) денге (4); 8) Модок (5). Остальные 17 вирусов, в том числе вирус желтой лихорадки, не участвовали в перекрестных реакциях ни с одним вирусом из этих комплексов.

М.А. Brinton (1986) [142] предложена классификация, учитывающая как

серологические свойства, так и тип переносчика. К флавивирусам, переносимым комарами, были отнесены: группа вирусов японского энцефалита, группа вирусов лихорадки денге и вирус желтой лихорадки, не имеющий серологического родства с другими «комариными» вирусами. К флавивирусам, переносимым клещами, отнесена группа вирусов КЭ, состоящая из 14 членов: вирус КЭ, вирус ОГЛ, вирус Лангат, вирус Повассан, вирус Негиши, вирус КЛБ, вирус ШЭО, вирус Тюлений, вирус Ройял Фарм, вирус Кадам, вирус Карши, вирус Сумарез Риф, вирус Карей Айленд и вирус летучих мышей Пном-Пеня. Отмечается, что для вирусов Карей Айленд и летучих мышей Пном-Пеня не установлено серологического родства с другими вирусами этой группы, а для вируса Тюлений не изв

Информация о работе

Демина, Татьяна Васильевна
доктора биологических наук
Иркутск, 2012
ВАК 03.02.02

Диссертация

Вопросы генотипирования и анализ генетической вариабельности вируса клещевого энцефалита - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы