Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Вирусы калифорнийской серогруппы (Bunyaviridae и Bunyavirus): антигенная классификация, идентификация малоизученных штаммов

ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Вирусы калифорнийской серогруппы (Bunyaviridae и Bunyavirus): антигенная классификация, идентификация малоизученных штаммов"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НИИ ВИРУСОЛОГИИ им. Д. И. ИВАНОВСКОГО

На правах рукописи

ЛЕБЕДЕВА Светлана Дмитриевна

ВИРУСЫ КАЛИФОРНИЙСКОЙ СЕРОГРУППЫ (ВШУАУЩтАЕ И Ви^АУЩив): АНТИГЕННАЯ КЛАССИФИКАЦИЯ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ МАЛОИЗУЧЕННЫХ ШТАММОВ

03.00.06 — Вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва — 1994

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор А. М. Бутенко кандидат биологических наук В. Г. Помелова

Официальные оппоненты: почетный академик АЕН РФ,

заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор С. Я. Гайдамович член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор И. В. Тарасевич

Ведущая организация — Государственный институт стандартизации и контроля биологических и медицинских препаратов им. Тарасовича МЗ РФ.

Защита состоится « I1 » ию/>-? 1994 г. в час. на заседании Специализированного Ученого Совета (Д.001.20.02) при Институте вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН по адресу: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского.

Автореферат разослан « » иЮк^ 1994 г.

Ученый секретарь

специализированного ученого совета кандидат медицинских наук,

старший научный сотрудник А. М. Жуковский

Актуальность проблемы. В настоящее вреия известно не менее 14 вирусов калифорнийской серогруппы (КСГ) (род Bunyavirus, сей. Bunyaviridae). Они распространены в Северной и Южной Америке, Европе, Азии и Африке, йирокое распространение вирдсов КСГ определяется их выраженной экологической плас-тичностьп, которая в свои очередь связана с эффективности феномена трансовариальной передачи вирдсов д комаров переносчиков.

Восемь вирдсов группы известны как возбудители заболеваний человека. Наибольаее эпидемиологическое значение имепт энцефалит Ла Кросс, энцефалит Джеймстаун Каньон, лихорадки Инко и Тягиня.

На территории Российской Федерации и стран СНГ установлена активная, а в некоторых районах одновременная циркуляция вирдсов Тягиня, Инко и зайца беляка, а также своеобразных в антигеннои отновении вариантов. На протяжении последних 10 лет в отделе экологии Института вирусологии им.Д.И.Ивановского было выделено 155 нтааиов вирдсов КСГ, главным образом из комаров, собранных в различных ландяафтно-клииатических зонах Российской Федерации. Иногочисяеннна нтакнн были выделены также в лабораториях Казахстана, Тадяикистана, Ариении, Азербайджана и других стран СНГ, Восточной и Западной.Европы, CIA и Канады.

Существующая классификация вирусов КСГ, основанная на изучении их взаимоотношении в различных серологических реакциях, была предложена Ч.Калинерон в 1983 году. В течение после-дувцих лет были получены новые данные по антигенной характеристике типов,' подтипов вариантов и втаммов, установлена выраженная вариабельность вирдсов и птамыов вирусов КСГ. В

этой связи актуальность темы диссертационной работы определяется: аироким распространением вирусов КСГ, их вахной ролью в патологии человека, антигенной вариабельностью вирусов и необходимость» модификации существующей классификации, значением таксономии вирусов для реиения вопросов этиологии, специфической диагностики и эпидемиологии вызываемых ими инфекций.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы заключалась в соверяенствовании антигенной классификации вирусов КСГ и детальной серологической идентификации малоизученных втаимов этой группы, выделенных в течение 30 лет в разных странах Европы и Азии.

Конкретные задачи исследований вклвчали:

- подбор представительной коллекции прототипных и малоизученных итаыиов вирусов КСГ;

- получение специфических антигенов и кьауноасцптннх пид-костей;

- выбор оптикгл&шх серологических методов исследования;

1 - определение антигенных связей непду известный:! вирусами КСГ несколькими серологическими кетодаии СРСК, КФЙ, реакция нейтрализации, лантанидназ ийиукофлзаресценфга);

- серологическая идентификация иалризученнах втаицов;

- определение чувствительности и специфичности истода лантанидной ииаунофлпюресценции, возиогности использования этого метода для антигенной классификации, идентификации вирусов КСГ. их индикации в комарах;

- анализ полученных результатов, их интерпретация в сравнении с данными литературы.

Научная новизна работы.

На основании изучения антигенных взаимоотношений незду 9 известными вирусами КСГ с помощьа комплекса методов, установлен факт наибольиего антигенного родства вируса Инко вируса« Даеймстадн Каньон и Кейстон (тип Мелао). Лантанидная имыцноф-лиоресценция С ЛИФА) и метод флюоресцирующих антител (МФЙ) были впервые применены для изучения вирдсов КСГ. Показано, что НФА выявляет грдппоспецифические реакции,а метод ЛИФА - вирусспе-цифические; метод ЛИФА характеризуется высокой чувствитель-ностьи, сравнимой с методом выделения вирдсов КСГ в культуре клеток СПЗВ. По данным ЛИФА выявлены четкие отличия между вирусами Тягиня и Лумбо, Ла Кросс и зайца беляка, которые ранее рас'йатривались как антигенные варианты. Нстановлено, что наи-лучвими возыоаностями для дифференциации и идентификации птам-ыов и вирдсов КСГ обладавт реакция нейтрализации и лантанидная имиднофлворесценциа.

Произведена серологическая идентификация 26 малоизученных нтааиов вирусов КСГ, выделенных в различных регионах Евразии. 15 изолятов (из Финляндии, Чехословакии, Армении, Азербайдза-на, Таджикистана и Казахстана) являются птамнами вируса Тягиня, хотя и обладают выраяенной вариабельностьш по отнопениа к другим вирусам КСГ. йтакмы ЬЕ1и-8545, ЬЕ1и~12812 (из Карелии и Тверской области соответственно). 1.ЕПЫ8677 Як и ЬЕ1и-18726 Зк (из Якутии) представляют собой варианты вируса зайца беляка, Втаымы Ши-21303 (из Красноярского края), ЬЕ1и23268 и ЬЕ1и-22Э81 (иг Тюмени) идентичны прототипному атамму вируса Инко. Своеобразными антигенными характеристиками обладают атааиа иЕ1и-20243. ЬЕ1и-20245. 1ЕШ-20255 и Ши~202Э4 (из ильановской области), близкородственные или идентичные друг

другу. Очевидно они представляют новый, ранее неизвестный вирус КСГ.

При индикации вирусспецифических антигенов в инфицированных комарах было установлено, что метод ЛИФА приближается по чувствительности к методу выделения вирусов КСГ в культуре клеток СПЭВ и значительно превосходит чувствительность иммуно-ферыентного теста; в случае обследования комаров, зараженных родственными вирусами КСГ (при моно-инфекции) этим методой, возможна одновременная индикация и идентификация инфицирувцих агентов: при "смеванной" инфекции идентификация возиоенэ только на уровне серокоыплекса.

Практическая ценность работы.

Коллекция лаборатории биологии н индикации арбовпрусов пополнена 32 штаыканк вирусов КСГ, выделенными рядом авторов в различных странах Европы, Лиерики, Азии и Африки.

На уровне лабораторных разработок впервые получены новые сасойочдсствитолыио тест-скстека ала си явления антигенов и быстрой идентификации хлак-ев и вирусов КСГ нетор.ог, лаптаюзд-ной иныунофлаоресценции.

На основании полученных данных ыетод ЛПОй, как еггеохо-чувствительный, специфичный :: знспгссны^, рекомендуется так:;о для индикации и идентификации вирусов КСГ с коиара::.

Основные половения, выносимые на зацитц

1. С поиоцью комплекса методов СРСК, 1!ФА, РН, ИФА и ЛИФА) подтверздено существование в пределах серогруппы Калифорнийского энцефалита трех основных типов (вирусов): калифорнийского энцефалита, Иелао и Тривиттатус. Зстановлен Факт наибольвего

антигенного родства вируса Инко (тип калифорнийского энцефалита) вирусан Дзеймстаун Каньон и Кейстон (тип Иелао).

2. Наилучиини возиояностями для дифференциации вирусов и идентификации атаиаов вирусов КСГ обладают реакция нейтрализации и лантанидная икыунофлпоресцснция, а реакция связывания коиплеаента и нетод ©лворесцирувщих антител выавлявт группос-пецифические связи иеаду зтини вирусами.

3. При серологической идентификации 25 малоизученных зтаммов вирусов КСГ установлено» что 13 изолятов (из Финляндии, Чехословакии, Армении, Азербайдгана, Тадзикистана и Казахстана) являптся итаимзми вируса Тягкня, 4 изолята (из Карелии, Якутии, Тверской области Российской Федерации) - атаы-иани вируса зайца беляка, 3 изолята (из Тиыени и Красноярского края Российской Федерации) - птаниани вируса Инко. Своеобразными антигенными характеристиками обладаит 4 изолята из Ульяновской области, которые очевидно представлявт не известный ранее вирус КСГ.

4. 1'етод ЯЙФА является перспективнцц з плане усовершенствования лабораторной диагностики вирусов КСГ.ШШ тест-систе-ии на основе поликлональннх антител для знявления антигенов вирусов КСГ более чей на порядок превннаэт чувствительность аналогичных "ОА тест-систем. Этод иетод аоает успезно использоваться для индикации вирусов КСГ в зарагенных комарах с одновременной идентификацией иифицируюцего агента.

Апробация работы.

Апробация работы состоялась на заседании Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ по медицинской вирусология при Институте вирусологии ии.Д.И.Ивановского РАИН

30 мая 1994 года. Материалы работы долоаены на конференции молодых ученых в НИИ вирусологии им.Л.И.Ивановского РАНН в 1993 годд, представлены на научной конференции, посвященной 70-летии Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии им, Пастера в 1993 году.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 3 печатные работы.

Объем и структура диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения» обзора литературы, 4 глав собственных исследований, обсундения результатов, выводов и списка литературы, включающего 325 работ' , из которых 34 - отечественных автора и 231 - зарубежных. Диссертация изложена на W страницах машинописного текста, включает ЪЧ таблиц и N рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы.

В работе было использовано девять известных вирусов КСГ: Тягиня (втами - 92), Яуыбо (SflAr 1881), Ла Кросс (оригинальный штамм), зайца беляка (оригинальный втамм), калифорнийского энцефалита (BFS - 283). Инко С КМ - 3641), Джеймстаун Каньон (61U - 2235), Кейстон (В-В4-55-87.05). Тривиттатус (?341). Все они были лвбезно предоставлены старшим научный сотрудником лаборатории экологии вирусов НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского В.Л. Громавевским.

Втаммы из Чехословакии (POb, Т-16. СТ-39, La-65, 129НЗ, 181МЗ, 251Н2, 2014НЗ, 7643H3) были любезно предоставлены док-

юром З.Губалеком и доктором Я.Капецким. Штамм 2008 из Финляндии получен От В.А.Василенко (Таллин); итамм "Ереван" из Армении - от С.А.Еахназаряна; втамм Ф-567-АЗ из Азербайджана - от В.А.Закаряна. Итамм Каз-5957 из Казахстана - от С.К.Каримова; итамы 525 из Таджикистана - от Булычева В.П.

йтакан LEIU-90 Аз (из Азербайджана) и птаммы LEIU-8545 Ка. LEIU -12812 Тв. LEIU-18677 Як. LEIU-18726 Як. LEIU-20243 Зль, LEIU—20245 Иль. LEIÜ-20255 Уяь. IEIU-20294 Зль. LE1U-21303 Кра. LEIU-22981 Td, LEIÜ-23258 Ти, выделенные на территории Российской Федерации были лпбезно предоставлены В.Л.Громавевскии. Всего было использовано 26 малоизученных атамиов вирусов КСГ.

Лабораторная линия комаров Ae.aegypti была либезно предоставлена старзиа научным сотрудником Института медицинской паразитологии и тропической медицины ии.Н.Ф.Йарциновского 113 РФ С.П. Расницинкм.

Перевиваемые клеточные культуры ВНК-21 (почки эмбриона хомяка), СПЭВ (почки эмбриона свиньи) и Uero (почки зеленой аартазки) били получены из лаборатории Культур тканей НИИ вирусологии им.Д.И.Ивановского РАШ1.

Суспензионные антигены ятаммов и вирусов КСГ готовили из мозговой ткани инфицированных нби на физиологическом растворе; сахароза-ацетоновые антигены получали методом сахарозо-ацето-новой зкстракциии (Clarke, Calas, 1953), в качестве кнльту-ральных антигенов использовали культуральнуа аидкость инфицированной клеточной культуры ВНК-21. Все использованные в работе ИА1 были приготовлены в лаборатории биологии и индикации арбовирусов в соответствии с описанием С.Я.Гайдамович с соавт (1969).

Комаров Ae.aegypti инфицировали кормлением через биологи-

- в -

ческуп мембрану (икурка белой ныии) вируссодергацей суспензией мозга нбм в смеси (1:1) с подогретой до 33-35 С фибринизиро-ванной мыпиной кровьп. Для эксперимента отбирали полностью напитав пихся самок. Вирусологическое обследование проводили на 11 день после кормления.

Выделение иммуноглобулинов класса С из Ий! проводили методом афинной очистки на протеине й сахарозе фирмы Forsacia СНвеция). Иммуноглобулины использовали для сенсибилизации планшетов и получения конъюгатов для ИФЙ и ЛИФА.

Конъигаты иммуноглобулинов к вируeau Тягиня, Инко и зайца беляка, меченные пероксидазой хрена, для ИФЙ были лвбезно предоставлены H.fl.Лавровой.

Конъигаты иммуноглобулинов с ионами европия для ЛИФЙ получали по методу Hetmila 1.(1985).

Для изучения антигенных взаииоотиовений атаиаов и вирусов КСГ использовали реакции связывания комплемента (РСК), метод флаоресцируичих антител (МФЙ), реакции нейтрализации (РН), им-иунофермнтный анализ (ИФЙ) и лантаниднуя иимунофлворесценции (ЛИФЙ).

РСК ставили на 36 луночных панелях по стандартной методк-ке (С.Я.Гайдамович, 1972); ИФй в соответствии с описанием Н.й. Свевниковой (1986); РН выполняли иикроаетодои (Sullivan Е'. îi.Rozeiabaun Н.Э.) в перевиваемой культуре клеток СП38.

Для постановки ИФй и ЛИФЙ применяли схему двойных антител "сэндвич" (Лаврова Н.Й., Наволокин О.В., 1986; Помелова В.Г. с соавт., 1992). В качестве твердой Фазы использовали отечественные полистероловые планиеты с плоским дноц или 12-луночнне стрипы. Лантанидная иииунофлворесцекция выполнялась по одностадийному (одновременная инкубация антигенов и ыечешшх анти-

тел) и двухстадийному (2 последовательные инкубации антигенов и асчепнах антител) вариантам. Для дифференциации и идентификации зтаамов и вирусов КСГ было сформировано 7 тест-систем на основе антител к вирусам КСГ. Применялась модифицированная методика определения величины относительной реактивности вирусов (Понелова В.Г.„ 1992).

На основании данных РСК» НФА, РН и ЛИФА были построены антнтелънне профили вирусов» а по результатам РСК, '¿ФА и РН -дендрограмин, полученные при обработке данных с поаоцьа кластерного анализа (В.Дерзи и П.Оделл,1977). Результаты, полученные с поаопьп 1ШФА были обработана статистически.

Результата а их обсуждение.

Антигенная классификация вирусов КСГ и идентификация малоизученных зтаамов.

По данным перекрестных опытов РСК в составе комплекса Калифорнийского энцефалита удалось выделить две группы вирусов: первуп образует вирусы Тяпгаа, Лумбо, зайца беляка, Ла Кросс, калифорнийского энцефалита, Инко, Кейстон и Дгейистадн Каньон; вторуз - вирус Трлзиттатус. По уровни среднего показателя свази (результата кластерного анализа) иез»ц зирусаии, входявдган в порвут группу не биле зкязлэно суцестзешяас различий по вза-иаодействно коаплзмгитсвязшзапцих антигенов и соответствуоцнх ии антител (ряс.!). ПакЗзлее близкими сказались группы вирусов Тягкня и Луабо; зайца беляка, Ла Кросс и калифорнийского энцефалита; Инко, Кейстон и Дпсйастаун Каньон. • .

Все 17 кздчгпаих Тггпня-подобшгх вирусов в РСК проявили одинзкооуп реакпягазсть в отнопении известных вирусов КСГ и оказались бякзиородствешшаи друг другу и прототипноау атамау

вируса Тягиня. Антигенное отличие по нуклеокапсидноыу белкд наблодалось д штатов 525 из Тадвикистаиа, ЬЕ1У-8545 (нз Карелии ) н 1.ЕШ2812 (нэ Тверской области).

По данный опытов МФй в составе серокомплекса выделяются те же самые две группы вирусов (как и в РСК), с четырьмя подгруппами антигенно родственных вирусов в первой группа. Первуи образуют вирусы Тягиня, Лукбо, зайца беляка, Ла Кросс и калифорнийского энцефалита. Вторая, третья и четвертая представлены. соответственно вирусами Инко, Даейастаун Каньон и Кейстон (рис.2).

с пояккяокаяьниш антителами с у ¡г нар но выявляет антигена всех специфаческнх вирусных белков, образуацихся в иифв-цнрованиой клетке. С поиощьп етого иэтояа яаи из удалось вклеить каких-либо отличий кепду 57 иа-ноизученныии Тагкня-подобншш нтайыаан, что вароатко связано с преобладая-ога присутствием в из^ацироваикЕХ клсткгж грБПвосвг^^чгсксго куклоокапсидного белка.

Реакция нейтрализации оказалась вэсъет. специфичной к позволила дифференцировать практически есс дезгть взрзсзг КСГ (га цсклачоииен' пар сзгрдсоз Тягкгш - /¡у«йо, зайца бе«яп& - йа Кросс, где набладал;;сь четырехкратные знразаки^з отли-

чия в титрах гоаологмчгшх и гетерояогнчаык антител (рлс.З).

Кзцчаеаао • Тагшш-подобике ит&иих, проявяся с реакцвд нейтрализации выраженное Слизкое родство к прстотвлаозд хташад вируса Тягиня, отличались друг от друга в незначительной степени.

Зтаиаы кз ивановской облает;: (1Е1Я-20243 Зль, Ши-20245 Эль, ЬЕ1и-20255 Иль и 1Е1У-23294 Зяь) активно взаимодействовали в реакции нейтрализации с вирусами Тягиня, зайца беляка, Ла

- It -

g 5 4 3 - ? (

тан i-UlM |-

MJ ТЖ1 SED-

ЗЖИ' 25Z3

ш ' 7

Рт:с. i Д91!ДР0ГРЕ1.2Д1 СЕЛЕН BJîpyCOS EOT В CESEbJBSina

!x:sïro;:2!rra.

i.

t

'глн i-

IHEZ3-1-

3D-

Раз. 2 Яенкраграгги сеяек кдлуссз ПСГ в пэпргягзй 1жкугкф-ЛгорЗСЦМЩКИ.

-S_

iL

OTT

La M j-

Ж5П-JT1-Ш

□м:

JG [-

кеа

TU1 (-

Рис. 3 Двядаггрябзгы еззагг гздуооа Ш* s реакции шйгравг-

Кросс и калифорнийского энцефалита, что согласуется с результатами предварительной идентификации этих вирусов. Применение кластерного анализа позволило отнести эти изоляты в группу вируса зайца беляка. Штаммы 20294 Зль, 20255 Иль и 20245 9ль несколько отличались друг от друга при взаимодействии с вирусами Лумбо, йнко и Дсеймстаун Каньон. Штамм Эль20243 оказался идентичным по белку El втамму 9ль20245.

Для дальнейнего анализа антигенной структуры исследуемых атаммов и вирусов КСГ был использован метод лантанидной имму-нофлворесценции, который хороао зарекомендовал себя при изучении вирусов клещевого энцефалита, Венесуэльского энцефаломиелита лошадей. Крымской геморрагической лихорадки и москитных лихорадок (Гайдаиович С.9. с соавт.,1991; Понелова В.Г. с со-авт., 1991; Харитоненков К.Г. с соавт., 1990; Выееиирский 0.Í5. 1993; Белан Э.Б. 1993).

В серии опытов были подобраны оптимальные концентрации первичных и индикаторных антител и сформирована тест-системы на основе антител к семи вирусам КСГ. Анализ результатов применения различных видов антигенов (культурального к двух мозговых), привел к выводу о той, что наибольвей дифференцирувцей способностьи обяадазт кудьтуралыше антигены. Количество стадий анализа не влияло на специфичность .н чувствительность метода ЛИФА.

С помоцьа. этого метода при использовании G тест-систем нам удалось разделить девять исследуемых вирусов на несть групп: 1) Тягиня; 2) Лумбо; 3) зайца беляка; 4) калифорнийского энцефалита; 5)Инко (йнко, Даеймстаун Каньон, Кейстон и fía Кросс); 6) Тривиттатус.

Таким образом, данные ЛИФА подтвердили результаты, полу-

чешше нами ранее в РСК, ИФА и в РН, о близости вируса Инко вирусам Даеймстаун Каньон и Кейстон из комплекса Нелао. С по-иоцьш этого метода удалось четко различить вирусы Тягиня и Луыбо, Ла Кросс и зайца беляка.

Результаты ЛИФП в отношении вируса Ла Кросс оказались неожиданными тем, что было продемонстрировано близкое родство вируса Ла Кросс (в отличии от вируса зайца беляка) вирусу Инко. По имепщимся литературным данный вирус Ла Кросс входит в комплекс вирусов калифорнийского энцефалита, а вирус зайца беляка является его антигенным вариантом, что подтвердили и результаты наяих опытов РСК, НФА и РН, в которых эти вирусы быЛи трудно отличимы друг от друга.

Такое несоответствие результатов разных серологических методов в отновении вируса Ла Кросс вероятно иозно объяснить особенностями взаимодействия "связанных" антигенов с иеченишш антителами в ЛИФЙ, так как дане при связывании с гомологичным антителами, иммобилизованными на планяете, антигены претерпе-запт информационные изменения, которые вырааавтея в изменении родства к меченный антителам. Антигены такзе могут иметь ограниченное количество сайтов связывания с гетерологичныни антителами, которые блокируются при взаимодействии с адсорбированными антителами.

Вапшм достоинством ЛЙФА является вознозность получения достаточно полной информации об антигенных связях между вирусами по относительной реактивности антигенов при испол зовании ограниченного числа гомологичных антисывороток. Применяя только две тест-системы на основе антител к вирусам Тягиня и Инко), нам удалось выявить в составе сероконплекса пятьч групп вирусов. Не отличались друг от друга вирусы зайца беляка и

Лумбо. При включении в исследования дополнительной тест-системы к вирусу зайца беляка, в составе серогруппы выделялось весть подгрупп. Дифференцировались вирусы Лумбо и зайца беляка, а вирус Ла Кросс - отличался от вирусов комплекса Иелао - Инко.

Результаты классификации вирусов КСГ по величине относительной реактивности антигенов (ОРЙ) определили подходи использования ЛИФА для идентификации малоизученных нтаииов. Нами была разработана модифицированная методика ЛИФЛ, вклзчазчая оценку ОРА в нескольких тест-системах, кз которых тест-системы к вирусам: Инко и Тягиня являются обязательными, а остальные определяится спектром вирусов КСГ, циркуляция которых возиогна на данной территории.

С помощью такого подхода была проведена идентификация 26 малоизвестных втамиов, выделенных разными авторами в различных регионах Европы и Азии (таблица 1). Характер антигеннах взаимосвязей оценивали в четырех тест-системах, основанных на использовании антител к вирусам Тягиня, Инко, зайца беляка и ЬЕ1и—12812 Тв. Последний предположительно является реассортап-том неяду вирусами Тягиня и зайца беляка, : ■ '

Данными эксперииентов^подтвергдеца принадлежность к вирусу Тягиня 15 Тягшш-подобных итакиов, выделенных в Финляндии, Чехословакии, Прмонии, Азербайджане, Тадшскстане и Казахстане.

Етамкы ЬЕ1и-8545 и 1ЕИМ2812 вовли в группу зайца беляка. Но в отличии от прототипного нтаима (проявлявшего одинаковое .родство к антителам вируса зайца беляка и птаииа ЬЕ1и—12812). ати вирусы-были более активны в тест-ситеме с антителами к птамму ЬЕИМ2812. Таким образом, нами ппдтвергденц полученные ранее данные об антигенном своеобразии наймов ЬЕИ!

Таблица 1.

Идентификация нтанаов вирусов КСГиетодоы ЛИФЙ по величине относительнойреактивности.

0РЙ в тест -системах

Гпиппл Пмпнгы и

вирусов зта иш Янко Тягиия зайца беляка 1.Е1и-12812

Тягшш Бардош-92 1 5.2*1.1 1.1 3.2

1.3-05 4.5 1.0 2.8

. 181 33 5.9 1.0 2.9

251 ¡12 5.2 1.0 2.5

525 5.7 1.1 3.0

7043 аз 3.0 1.1 3.1

2014 ИЗ 5.5 1.1 2.6

5957 5.0 1.1 2.8

Р-бЬ 6.3 . 1.0' 3.0

СТ-39 0.0 1.0 3.1

Пз-0 5.2 1.1 2.7

Т-16 4.5 1.0 2.3

2003 5.3 1.0 2.3

йз-90 5.8 1,0 2.6

Ереван 4.8 1.0 2.5

529 НЗ 5.4 0.9 2.2

зайца зайца 1 3.010.8 '3.3 3.6

беляка беляка

{.ЕИМ2812 2.0 1.4 3.3

Ши-8545 2.1 1.2 3.2

. ЬЕ1и-13й7? 1.3 1.0 1.5

Ш1Ы8725 1.8 1.0 2.4

1!л::о , Инко 1 1 0.2*0.04 0:09. 0.2

ШИ-21303 0.3 0.07 0.2

0.3 0.08 0.2

1.Е1У—22931 "0.3 0.09 0.2

ПСКЛАС— 1ЕШ-20255 1 0.7 2.1 5.2

СИфИЦИ- Ш (/-20294 0.3 2.4 5.8

р01>аШШС 11:111-20243 0.9 2,2 3.7

ШУ-20245 0.5 1.3 4.8

Примечание: ОРЯ - относительная реактивность антигенов, гш-ч:!сл£зи как отис^ошю велкчгога лтжтсцсптшпе сягиаяпа п рс-следуеаой тест-системе к величине лпмииисцснтного сигнала о тест-системе Инко.

-6545 из Карелии и втамиа LEIU-12812 из Тверской области.

В группу зайца беляка воили два якутских птаима: 186?7Як, 18?26Як, наиболее близких втаиау LEIU-12812 .

Втамии из Ульяновской области (LEIU-20243, LEIU-20245, LEIU-20255 и LEIV-20294) характеризовались одинаковой реактив-ностьи во всех тест-системах, проявляя наибольпув близость к штамму LEIU-12812, хотя отчетливо отличались от него. По данным наиих опытов ульяновские иташш дифференцировались от вирусов Тягиня, Луыбо, зайца беляка, калифорнийского энцефалита, Инко и Тр^виттатус. Изучение в четырех тест-снстемах ЛИФА и в трех тест-системах ИФА подтвердило их уникальный характер.

Результаты настоящей работы показали, что для антигенной дифференциации вирусов серогруппы калифорнийского энцефалита наиболее,информативными является РН и ЛИФЙ (по сравнении с РСК и ИФА). В этих реакциях учавствуит антигены поверхностных вирусных структур, которые наиболее часто претерпеваат изменения и ответственны за прикрепление к клеточным аембранак, проникновение вирусов в клетку и продукции нейтралкзущих. антител.

Hunt и Calisber (1981) преклонили схсиу классификации вирусов супегруппы Буньяивера, основаннуи на даиннк РН. Она вклзчала такие градации, как комплекс, тип, субткп, вариант. Этот принцип был испаяьзован в дальнейшей при построения су-цествувцей классификации вирусов КСГ (Калинер,1983). Используя данный подход, на оснований получениях собственных результатов мы предлагаем классификации вирусов КСГ, которая в основной совпадает с классификацией Ч.Кашшера (таблица 2). Отличие заклвчается в. полоаении вируса Инко, который включен нами в группу Нелао вместе с вирусами Дгейнстаун Каньон и Кейстон. По данный ЛИФЙ вирусы Луибо и зайца беляка иаеит

основания рассматриваться в качестве самостоятельных вирусов, а не вариантов соответственно вирусов Тягиня и Ла Кросс.

Таблица 2.

Антигенная классификация вирусов КСГ.

серогруппа комплекс тип подтип

Калифорний- Калифорнийского Калифорнийского калифорнийского

ского энцефалита энцефалита энцефалита

энцефалита Ла Кросс

(зайца беляка)

Тягиня

(Лунбо)

Йелао

С Инко) Ннко

Кейстон

Даейнстаун

Каньон

Тривиттатус Тривиттатус Тривиттатус

Индикация и идентификация вирусов калифорнийского энцефалита в экспериментально зараненных комарах. Б серии экспериментов проводилась оценка эффективности

метода ЛИФй (в сопоставлении с иммуноферментным анализом и методом биологической пробы) для индикации вирусов КСГ в Ае. aegypti.

С этой целью самок комаров fte.aegyprti заравали вирусами Тягиня (Аз-90), Лцмбо, зайца беляка, калифорнийского энцефалита, Инко и нтаимами LEIU-8545 и LEIU-12812.

Оба метода ЛИФА и ИФЙ оказались высоко эффективными для индикации и дифференциации вирусов КСГ в переносчиках. Они четко дифференцировали вирусы Тягиня, Инко, Лумбо и зайца беляка, и позволяли идентифицировать LEIU-8545 и LEIU-12812 как штаммы вируса зайца беляка. В случае смеванной инфекции кока-ров двумя разными близкородственными вирусами КСГ идентификация агентов была возио8ной только на уровне серокомплекса.

Не удалось обнаружить прямой корреляции кевду инфекционными титрами вирусов по данным биопробы (титрование в культуре клеток СПЭВ) и титрами антигенов КСГ выявляемыми в ЛИФА и ИФЙ. О подобном несоответствии уяе сообщали другие авторы, исполь-зоваввие ИФА для индикации вирусов в переносчиках. .

Имкунофериентный анализ оказался наинеиее чувствительный, так как положительные реакции выявлялись при инфекционной активности проб (О.ОЗал) равной 2.8 log ЦПД/50 в пробе (или 4.1 log ЦПД/50/мл), что согласуется с результатами других авторов. ЛИФА обеспечивала половительный ответ при 1.0 log ЦПД/50 в пробе (или 2.3 loe ЦПД/50/ил соответственно), что на два порядка пре восходило чувствительность ИФЙ.

По данным биопробы титр суспензий, вкличаищих одного инфицированного комара, составлял около. 3 log ЦПД/50/мл. На оснсвании этих данных перспективность использования методики ЛИФА при обследовании переносчиков является очевидной.

вывода

1. С помоцьи комплекса серологических методов (реакции связывания комплемента (РСК), метода флворесцируищих антител (МФОУ, реакции нейтрализации (РН), иммуноферментного анализа (ЙФА) и лантанидной иыиунофлноресценции (ЛИФА)) подтверадено существование в пределах серогруппы Калифорнийского энцефалита трех основных типов вирусов: калифорнийского энцефалита, Мелао и Тривиттатус.

2. Установлено, что реакция связывания комплемента и метод флворесцируищих антител выявляв? группоспецифические связи иезду вирусами КСГ, а реакция нейтрализации и лантанидная им-иунофлиоресценция - вирусспецифические. Дифференциация вирусов КСГ методом ЛИОН возиогна при использовании ограниченного количества тест-систем.

3. 3 результате проведенного исследования в суцествуаздо гнтигеннуа классификации вирусов КСГ предлагается внести сле-дуЕЗие коррективы: вирус Инко из комплекса калифорнийского энцефалита переходит в комплекс йелао (вклшчавдий-ранее вирусы Нелао, Дкейистаун Каньон и Кейсток); вирус Ла Кросс , по-види-коау, аозет рассматриваться в качестве переходного меиду вирусами типов калифорнийского энцефалита и Мелао. С помощьп ЛИФА установлены существенные различия иезду вирусами Тягиня и Лум-бо, Ла Кросс и зайца беляка.

4. При серологической идентификации 26 малоизученных птаиаов вирусов КСГ, выделенных в различных регионах Евразии, 15 изолятов (из Финляндии, Чехословакии, Армении, Азербайдва-

на. Таджикистана и Казахстана) оказались итаммами вируса Тяги-ня, обладавщими определенной антигенной вариабельностью. Штаммы ЬЕ1и-8545. ЬЕ1и-12812 Сиз Карелии и Тверской области), ЬЕ1и -18677 Як и ЬЕИД—18726 Як Сиз Якутии) идентифицированы как варианты вируса зайца беляка. Штаммы 1.Е1и-21303 Сиз Красноярского края), ЬЕШЗгбб и ЬЕ1и-22Э81 Сиз Тшмени) идентичны прото-типному итамыу вируса Инко.

5. Своеобразные по антигенным характеристикам итаашы ЬЕ1и -20243. [,Е1и-20245, ЬЕ1и-20235 и Ши~20294 из Зльяновской области, близкородственные или идентичные друг другу, очевидно представляют новый, ранее неизвестный вирус КСГ.

6. При индикации вирусспецифических антигенов в инфицированных комарах метод ЛИФА прибливается по чувствительности к методу выделения вирусов КСГ в культуре клеток СПЗВ и значительно превосходит чувствительность иммунофернентного теста. В случае обследования комаров, зарааенных родственными вирусами КСГ (при моно-инфекции), методом ЛИФА возиовна одновременная индикация и идентификация инфицирувцих агентов; прл "стесанной" инфекции идентификация возыоана только па уровне серо-коыплекса,

Сч..тав своим приятныи долгой выразить глубокуа благодарность моим научным руководителям - доктору биологических наук, профессору А.Н.Бутенко и кандидату биологических наук В.Г.По-меловой за постоянное внимание и всестороннва помочь при проведении исследований и при оформлении работы.

От всей дуви благодари . кандидата биологических наук Н.В.Хуторецкую за оказание всесторонней методической и консультативной поыоци в выполнении научных исследований.

йскреннвш признательность внраяаа всем лаборантам лаборатории биологии и индикации арбовирусов, особенно В.Д.Семенко-вой, Л.П.Каптелкиной, Г.И.Старых, Р.Н.Черниковой, за добросо-вестнуп и квалифицированнуа помочь в проведении экспериментов.

Благодари В.Б.Локтева, Д.С.Лебедева, А.Оуковского, Т.П. Биченкову, О.Й.Вквгекирекого, Й.С.Недялкову, З.В.Халецкув и Е.М, Игнатьеву за оказанную помочь и советы в работе.

Список работ, опубликованных по теме диссертации .

1.Лебедева С.Д., Поиелова В.Г., Бнченкова Т.А., Хуторец-кая й.Б./Идентификация вирусов серогруппы калифорнийского энцефалита (СКЗ) методом лантанидного иамднофлшоресцентного анализа. //Сб. Актуальные проблем» инфекционной патология, С.Петербург.- 1393 - ч,2 - с.33. '

2. Лебедева С.Д., Бутонко Л.И., Помелова В.Г., Бачснкова Т.Л,, л2то?о!?:-?я Н.Я. /Зирусп калифорнийской серогрупаа CSuaysviridac, üunjavlrns): апткгсииая кяассадкацял, гдоптп-Озягпия nosax атэ?пяз.//Д8П. в ВШКГП!.- '¿оехэа - 1994г.- Чс.

3. Poselova U.S., Lebedeva C.D., Blchenkova Т.А.. Hutoreskaia li.'J., Butsnko A.!5. /Detactian of California Зогоггсар virases in infectcd. aosqaitoes by tise-resolvcd flaoroiEsancassay. P.rthropod-born virusinfornahion oxchance, June,1994 (принято в печать).