Вирус Хатанга - новый представитель серогруппы Калифорнийского энцефалита

Лаврентьев, Михаил Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Вирус Хатанга - новый представитель серогруппы Калифорнийского энцефалита
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Вирус Хатанга - новый представитель серогруппы Калифорнийского энцефалита"

На правах рукописи

ЛАВРЕНТЬЕВ МИХАИЛ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

ВИРУС ХАТАНГА - НОВЫЙ ПРЕДСТАВИТЕЛЬ СЕРОГРУППЫ КАЛИФОРНИЙСКОГО ЭНЦЕФАЛИТА

03.01.03 - Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 8 ДЕК 2011

Москва 2011

005006453

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «НИИ Вирусологии имени Д.И. Ивановского» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Алексей Геннадьевич Прилипов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Татьяна Владимировна Гребенникова

доктор биологических наук

Владимир Глебович Лунин

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук

институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится «26» декабря 2011 г. в 12-00 часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.131.01. при ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минзравсоцразвития России (адрес: 123098, г. Москва, ул. Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор медицинских наук

Е.И. Бурцева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Вирусы Калифорнийской серогруппы (КСГ) относятся к роду Orthobunyavirus, семейству Bunyaviridae. К настоящему времени известно не менее 14 вирусов КСГ. Одиннадцать из них широко распространены в Северной и Южной Америке (вирусы Ла-Кросс, зайца-беляка, Калифорнийского энцефалита, Сан-Анжело, Кейстон, Сьерра-до-Навио, Джеймстаун-Каньон, Саус-Ривер, Мелао, Тривиттатус, Гуароа), три в Евразии (вирусы Инко, Тягиня и зайца-беляка) и один в Африке (вирус Лумбо). Передача вирусов восприимчивым позвоночным осуществляется путем биологической трансмиссии кровососущими комарами. Основные переносчики - комары рода Aedes, реже Anopheles, Culiseta, Culex и Mansonia. Резервуаром для вирусов в природных очагах являются мелкие позвоночные: кролики, зайцы-беляки, бурундуки, хомяки, мыши. Восемь представителей КСГ вызывают заболевание у человека, которое может протекать в 3-х основных формах: 1) гриппоподобной; 2) с поражением бронхолегочной системы и 3) нейроинфекционной - с синдромом серозного менингита и менингоэнцефалита.

Свидетельством широкой циркуляции вирусов КСГ в России являются многолетние данные, полученные в процессе эколого-эпидемиологического, вирусологического и серологического мониторинга Центром экологии и индикации инфекционных заболеваний при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. По результатам этих исследований, проведенных с 1982 по 1990 годы на территории нашей страны, был выделен 251 штамм, отнесенный к КСГ. Идентификация выявленных штаммов серологическими методами показала, что на территории России циркулирует, по крайней мере, 3 вируса серокомплекса: Инко, Тягиня и ВЗБ. Причем большая часть этих штаммов была идентифицирована как вирусы зайца-беляка (ВЗБ). Все 3 вируса серокомплекса (Инко, Тягиня и ВЗБ) имеют значение в патологии человека.

Согласно данным мониторинга на территории России штаммы ВЗБ доминируют во всех ландшафтных поясах на территориях к востоку от реки Енисей (Средняя, Северо-Восточная Сибирь, Северо-Притихоокеанская физико-географическая страна). Штаммы вируса Инко преобладают в тундре и лесотундре Западной Сибири, а ВЗБ - в остальных ландшафтах, расположенных южнее. В восточной части Фенноскандии и на севере Русской равнины штаммы ВЗБ и Инко выделяются одинаково часто. Штаммы вируса Тягиня изолированы в южных и центральных областях Европейской части России.

Заболевания, связанные с вирусами КСГ, имеют сезонный характер и чаще всего регистрируются в ландшафтно-географических зонах тайги и смешанных лесов Европейской части России и Западной Сибири. Переносчиками вирусов КСГ служат кровососущие комары преимущественно рода Aedes. Первые случаи заболеваний появляются в мае, основной пик приходится на июль-август, а единичные случаи

регистрируются в сентябре и начале октября. Большинство больных были в возрасте от 15 до 40 лет, причем лица до 30 лет составили 52,5% от всех заболевших. Клинические симптомы инфекций, вызываемых вирусами КСГ, в большинстве случаев похожи. Вирусы Инко и Тягиня вызывают заболевания у людей, протекающие как без поражения ЦНС, так и с синдромом острой нейроинфекции, при которой ведущая роль принадлежит вирусу Инко. ВЗБ вызывает заболевание без симптомов поражения ЦНС.

Интерес к исследованию вирусов КСГ на территории России связан с тем, что эти вирусы обладают возможностью реассортации (то есть обмена сегментами генома между близкородственными вирусами, входящими в одну серогруппу). В результате реассортации могут появляться вирусы с различным генетическим материалом и новыми инфекционными свойствами за короткий промежуток времени. Это, в свою очередь, может способствовать возникновению эпидемических вспышек в очагах и нести потенциальную угрозу для здоровья людей.

На сегодняшний день имеется очень мало работ, посвященных генетическому разнообразию вирусов КСГ, циркулирующих в различных регионах России. Ранее изучение генома вирусов КСГ проводилось зарубежными исследователями на штаммах (изолированных в США и Европе) в основном по последовательностям Б и М сегментов. Полные нуклеотидные последовательности по всем трем сегментам генома (Б, М и Ь) у вирусов КСГ известны только у вируса Ла Кросс, циркулирующего на территории США. Частичные последовательности Ь сегмента данной группы вирусов опубликованы в базе данных ОепВапк только у вирусов: Тягиня, зайца-беляка, Мелао, Джемстаун-Каньон, Инкоо и Саус-Ривер. У остальных представителей КСГ последовательности Ь сегмента не определены. Генетическое исследование ВЗБ, как наиболее распространенного вируса КСГ, циркулирующего на территории нашей страны, позволило бы получить достоверную информацию о систематическом положении этого вируса, определить степень гомологии и дивергенции среди других представителей серогруппы, выяснить какова гетерогенность ВЗБ в пределах вида. К тому же, все созданные ОТ-ПЦР системы, позволяющие детектировать вирусы КСГ адаптированы к штаммам, выделенным в США и Европе. Проведение молекулярно-генетического анализа штаммов ВЗБ, изолированных на территории России позволило бы разработать отечественный вариант ОТ-ПЦР системы, который был бы ориентирован на варианты вируса, циркулирующего на территории нашей страны.

Цель и задачи исследования.

Целыонастоящегоисследования явилась генетическая характеристика штаммов КСГ (идентифицированных серологическими методами как ВЗБ) циркулирующих на территории РФ, и определение их сигматического положения в существующей системе классификации вирусов КСГ Лля

реализации этого были поставлены следующие задачи- '

1 Провести определение первичной структуры полной нуклеотидной последовательности S сегмента, а также участков последовательностей М и L сегментов (по 980 и 410 нуклеотидов, соответственно) у 15-ти "культура^ь-ных штаммов, выделенных на территории России и одного штамма изолированного на территории США.

2. Провести филогенетический анализ исследуемых штаммов вируса по полной нуклеотидной последовательности S сешента и участкам последовательностей М и L сегментов (по 980 и 410 нуклеотидов соответственно) и сравнить их с ранее охарактеризованными"Штаммами ALI, представленными в базе данных GenBank.

территории СШАПеРВИЧ11У1° С1РУКТУРУ ПОЛНОГО генома ВЗБ> выделенного на

4. Установить первичную структуру полного генома у 1-го штамма вируса -K.U, изолированного на территории России.

5. Разработать на основе анализа нуклеотвдных последовательностей исследуемых штаммов КСГ детекционный вариант ОТ-ПЦР системы

Научная новизна и практическая значимость.

1. Впервые установлено, на основании филогенетического анализа полной нуклеотидной последовательности Б сегмента, а также по последовательностям участков М и I сегментов генома (по 980 и 410 нуклеотидов, соответственно), что все исследуемые российские штаммы (ранее серологически идентифицированные как ВЗБ) являются самостоятельным вирусом КСГ и генетически близки к ВЗБ и вирусу ЛаКросс. Новый вирус назван Хатанга, по месту выделения штамма ЬЕГУ-

2. Впервые показано, что на территории РФ в Европейской части, а также в Западной, Средней и Северо-Восточной Сибири циркулирует, по меньшей мере, 2 генетические линии вируса Хатанга.

т ™ЛП®рВЫе определена пеРвичная структура генома, российского штамма ЬЪх\-\11Ъб вируса Хатанга.

4. Впервые определена первичная структура Ь сегмента ВЗБ изолированного в США.

5. Создан вариант ОТ-ПЦР системы, позволяющий детектировать геномную РНК вирусов ВЗБ и Хатанга.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. На основе сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей S сегмента, а также участков М и L сегментов генома (по 980 и 410 нуклеотидов, соответственно) установлено, что все штаммы, выделенные на территории России к исследуемые в данной работе, представляют собой отдельный, самостоятельный вирус КСГ. Новый вирус КСГ назван Хатанга, по месту выделения одного из штаммов.

2. Результаты филогенетического анализа по полной нуклеотидной последовательности S сегмента, а также участков М и L сегментов генома позволяют утверждать, что вирус Хатанга, изолированный на территории России, относится к субтипу вируса Ла-Кросс, входящего в серотип Калифорнийского энцефалита. В генетическом отношении вирус Хатанга наиболее близок к ВЗБ и вирусу Jla-Kpocc.

3. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей всех сегментов генома установлено, что вирус Хатанга, как генетическая линия гетерогенен и имеет, как минимум, 2 генетические группы, которые хорошо делятся по территориальному признаку.

4. Впервые определены полные нуклеотидные последовательности генома российского штамма LEIV-17756 вируса Хатанга, а также полная нуклеотидная последовательность L сегмента штамма ВЗБ, выделенного на территории США.

5. Создан вариант ОТ-ПЦР системы, позволяющий детектировать геномную РНК вирусов ВЗБ и Хатанга.

Публикации и апробация работы.

По материалам диссертации в журналах, рекомендованных ВАК, опубликовано 2 научных статьи. Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на заседании совета по предварительной экспертизе диссертационных работ по проблеме «молекулярная биология» ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России (16.12.2010).

Объем и структура диссертации.

Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, содержит 10 таблиц и 22 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В качестве исследуемого материала были использованы 16 штаммов КСГ. Из них 15 штаммов (серологически идентифицированных как ВЗБ) изолированы от комаров рода Aedes в различных регионах Российской Федерации (табл.1) в 1982-1990 гг., а один штамм вируса зайца-беляка выделен от Lepus americanus в США (штат Монтана) в 1959 г. Пробы

штаммов, изолированных в России, предоставлены лабораторией экологии вирусов ФГБУ «НИИ Вирусологии им Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. Штамм вируса Зайца-беляка был получен из лаборатории «Биологии и индикации арбовирусов» этого же института.

Все штаммы прошли серию пассажей на мозге новорожденных белых мышей-сосунков.

Подбор праймеров для проведения реакций обратной транскрипции полимеразной цепной реакции и секвенирования выполняли с помощью программы Primer Premier 5.00 {Premier Biosoft International, США) с использованием нуклеотидных последовательностей вирусов КСГ из базы данных GenBank. Определение нуклеотидных последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI Prism 3100 (,Applied Biosystems, США). Для построения алайментов использовали алгоритмы Clustral V и Clustral W из пакета программ DNASTAR 7 "Lasergene Inc " (США).

Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программы MEGA 4.1 по принципу ближней связи (NJ) в рамках 2-лараметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом, невзвешенной парногрупповой кластеризации (UPGMA) и максимальной экономии (MP).

Таблица 1.

Штаммы КСГ, исследуемые в оаботе.

Географическое положение Ландшафтная зона Региоп Штамм Источник изоляции Год

Восточная Фенноскандия Северная Тайга Мурманская обл. LEIV-9843 Ае. in sp. 1983

Средняя Тайга Карелия LEIV-8545 Ае. in sp. 1982

Север Русской равнины Северная Тайга Коми LEIV-15804 Aedes nigripes 1987

Средняя Тайга Архангельская обл. LEIV-12718 Anopheles raaculipennis 1986

Коми LEIV-15525 Aedes communis 1987

•• и LEIV-15844 Ae.communis, excrucian, can tans 1987

Я_ || LEIV-15852 Ae.cinereus 1987

Южная Тайга И__II LEIV-15816 Ae.communis,p unctor, intradens 1987

LEIV-15833 Ae.communis, punctor, can-tans, cinerus, excrucians 1987

Западно- Тюменская область LEIV-23158 Ae. in sp. 1990

Сийирская 1 Средняя Тайга И__II LEIV-23310 Ae. in sp. 1990

равнина ..__.. LEIV-23314 Aedes in cantans 1990

Средняя Сибирь Тундра Красноярский край п.о.Таймыр LEIV-11552 Aedes cataphylla 1985

Северо-Восточная Сибирь Северная Тайга Якутия LEIV-17756 Ае. in sp. 1988

м__" LE1V-17774 Ae in sp. 1988

Примечание: Ае. - комары рода Aedes, Ае. in sp. - комары рода Aedes не

определены до вида.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Определение первичных нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов КСГ

Все биологические пробы, содержащие инфекционный материал предоставлены для исследования из коллекции НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского в виде мозговой суспензии мышей-сосунков. Более подробная информация об исследуемых штаммах представлена в таблице 1 (см. Материалы и методы).

Данные о первичных нуклеотидных последовательностях 8, М и Ь сегментов генома исследуемых штаммов были депонированы в международную базу данных ОепВапк (таблица 2).

Таблица 2. Нуклеотидные последовательности, вирусов КСГ исследуемые в __работе._

Штамм Идентификационный номер в базе данных GenBank

S сегмент М сегмент L сегмент

Snowshoe hare v. EU294510 EU262553 EU203678

LEIV-9843 EU479706 EU541235 EU616893

LE1V-8545 EU486164 HQ3 89542 HQ3 89541

LEIV-12718 EU541224 EU541237 EU621833

LEIV-15804 EU486163 EU541234 EU616894

LE1V-15525 EU541217 EU541242 EU616892

LEIV-15844 EU541219 EU541239 EU616895

LE1V-15852 EU541220 EU541240 EU616891

LEIV-15816 EU541218 EU541233 EU616896

LE1V-15833 EU486165 EU541236 EU616897

LEIV-23158 EU541222 EU541241 EU616900

LEIV-23310 EU479705 EU541238 EU616898

LEIV-23314 EU 541223 EU541243 EU616899

LEIV-11552 EU479702 EU541226 EU616902

LE1V-17756 EU479697 EU541227 EU616903

LEIV-17774 EU479696 EU541225 EU616901

Примечание: Snowshoe hare v. - вирус зайца-беляка (ВЗБ) изолированный в США; штаммы КСГ имеющие аббревиатуру LEIV выделены в различных регионах Российской Федерации.

2. Филогенетический анализ исследуемых штаммов КСГ

Проведенный филогенетический анализ по полным нуклеотидным последовательностям Б сегмента показал, что максимальный процент нуклеотидного сходства у ВСех штаммов, изолированных в Еоссии наблюдался с ВЗБ и вирусом Ла-Кросс. Нуклеотидное сходство у российских штаммов варьировало: с ВЗБ - от 88,3% до 89,6%; а с вирусом Ла-Кросс - от 85,6/о до 88 0/о Минимальное нуклеотидное сходство было с вирусом Гуароа - от 25,3% до 29,5% и вирусом Тривиттатус - от 65,5% до 67 4% Анализ а сегмента исследуемого штамма ВЗБ, выделенного в США показат практическую идентичность (99,9%) этого сегмента с последовательностями ВЗБ из базы данных СепВапк (102390).

Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей по участку

СетеН,Т^ 980 "У1™0™08) от начала открытой рамки считывания до позиции 1044 у штаммов, выделенных в России с последовательностями вирусов КСГ из базы данных СепВапк также выявил высокий процент нуклеотидного сходства с ВЗБ и вирусом Ла-Кросс. У российских штаммов нуклеотидное сходство с ВЗБ находилось в пределах от 78,9% до 80 ТА- с вирусом Ла-Кросс от 77,6% до 79,5%. Минимальный процент нуклеотидного сходства наблюдался с вирусом Гуароа от 41,6% до 44,0% и вирусом Тривиттатус от 62,4% до 65,0%. Сравнение М сегмента исследуемого штамма ВЗБ, с последовательностями данной серогруппы показало практическую идентичность (99,9% нуклеотидного сходства) с' последовательностями ВЗБ из СепВапк (К02539).

Последовательности I сегмента у вирусов КСГ в базе данных СепВапк опубликованы не у всех представителей серогруппы, поэтому сравнение проводили по доступным нуклеотидным последовательностям этого сегмента. Филогенетический анализ частичных нуклеотидных последовательностей I сегмента (410 нуклеотидов) от начала открытой рамки считывания в позиции 136-540 показал, что максимальный процент сходства у исследуемых штаммов изолированных в России также оказался с ВЗБ и вирусом Ла-Кросс. Нуклеотидное сходство у российских штаммов варьировало: с ВЗБ от 77,3% до 79,1%, вирусом Ла-Кросс от 73,8% до 78,3% Минимальное нуклеотидное сходство было с вирусом Инко: от 66,3% до 68,5%. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей Ь сегмента исследуемого штамма ВЗБ показал 100% сходство с ВЗБ из базы данных СепВапк (АР393325).

Исходя из полученных результатов можно утверждать, что исследуемый в данной работе штамм ВЗБ, изолированный в США, по всем трем сегментам генома принадлежит одноименному вирусу (рис.2, 3, 4). Практически 100% нуклеотидная идентичность этого штамма с последовательностями Б, М и Ь сегментов опубликованными в базе данных СепВапк (ГО2390, К02539, АБ393325) говорит о том, что, по-видимому, во всех случаях для исследования брали один и тот же прототипный штамм ВЗБ, который был выделен из одного источника. Исследуемые штаммы КСГ, выделенные в России, оказались наиболее близки к ВЗБ и вирусу Ла-Кросс^

но в то же время они генетически удалены от них так же, как ВЗБ удален от вируса Ла-Кросс и представляют собой отдельную генетическую линию (рис. 2, 3, 4). Нуклеотидное сходство между ВЗБ и вирусом Ла-Кросс по последовательностям Б, М и Ь сегментов составляет: 88,0, 77,7 и 76,1%, соответственно. Нуклеотидное сходство между штаммами, изолированными в России и ВЗБ, находится в интервале 88,3-89,6% (Б сегмент), 78,9-80,7% (М сегмент), 77,3-79,1% (Ь сегмент), а между российскими изолятами и вирусом Ла-Кросс 85,6-88,0% (8 сегмент), 77,6-79,5% (М сегмент), 73,8-78,3% (Ь сегмент). Согласно антигенной классификации вирусов КСГ, ВЗБ и вирус Ла-Кросс являются самостоятельными вирусами, входящими в субтип вируса Ла-Кросс, относящегося к серотипу Калифорнийского энцефалита (рис.1). По результатам иммунологических исследований ВЗБ определен как антигенный вариант вируса Ла-Кросс. Исходя из результатов генетического анализа вирус, которому принадлежат исследуемые штаммы КСГ, изолированные в России, можно также рассматривать как антигенный вариант вируса Ла-Кросс или ВЗБ на правах самостоятельного вируса.

Таким образом, на основании проведенного анализа было определено систематическое положение 16-ти исследуемых штаммов КСГ по всем сегментам генома в пределах Калифорнийской серогруппы. Исследуемый штамм ВЗБ принадлежит одноименному вирусу, а штаммы, изолированные в России, представляют собой самостоятельный вирус. Вирус, циркулирующий на территории России, назван Хатанга - по месту выделения (вблизи поймы реки Хатанга), штамма ЬЕ1У-11552.

СЕРОГТ1Т1ПА

СЕРОКОГ.ГШ1ЕКС

ВИРУС (СЕРОТНП)

Калифорнийского »ниефал

( ТЯГИНЯ )

¡ш

( лакросс")

. К4ЛИФОГНИЯ

( САУСРШЕР ]

(_ЛУТОО ) ( ЗлаЦ»8ШШ ]

ТрИВ1ГГТДТуС I

Ггароа

Рис.1. Антигенная классификация вирусов КСГ.

La Crosse i

San Angelo v.

Snowshoe haré v.

Snowshoe \ haré v. \ V

LEIV-9843

LEIV-8545

LEIV-15804

LEIV-12718

LEIV-15525

LEIV-15844

LEIV-15852

LEIV-15816

LEIV-15833

LEIV-23158

LEIV-23310

LEIV-23314

LEIV-11552

LEIV-17756

LEIV-17774

серокомплекс

Калифорнийского

энцефалита

Guaroa v.

серокомплекс Гуароа

Рис. 2. Радиальная филограмма полных нуклеотидных последовательностей 8 сегмента с открытой рамки считывания до стоп-кодона у вирусов КСГ (род ОгйюЬипуауп-из). Все исследуемые штаммы выделены жирным шрифтом. Российские изоляты обозначены пунктирным овалом и заключены в прямоугольную рамку.

Ьа СгоББе V

Snowshoe Ьаге V.

0.05

серокомплекс

Калифорнийского

энцефалита

} серокомплекс Гуароа

Рис. 3. Радиальная филограмма нуклеотидных последовательностей участка М сегмента от начала открытой рамки считывания до позиции 1044 у вирусов КСГ (род ОйюЬипуауииз). Все исследуемые штаммы выделены жирным шрифтом. Российские изоляты обозначены пунктирным овалом и заключены в прямоугольную рамку.

Рис. 4. Радиальная филограмма нуклеотидных последовательностей участка Ь сегмента с открытой рамки считывания в позиции 136-540 у вирусов КСГ (род ОгЙюЬипуауццз). Все исследуемые штаммы выделены жирным шрифтом. Российские изоляты обозначены пунктирным овалом и заключены в прямоугольную рамку.

3.3. Генетическое разнообразие штаммов вируса Хатанга - нового представителя серокомилекса Калифорнийского энцефалита, изолированных в различных регионах Российской Федерации

В данной работе мы также проводили сравнение нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов вируса Хатанга,

циркулирующих в России, только между собой по всем сегментам генома с целью изучения их генетического разнообразия. В качестве обозначения внешних границ вируса Хатанга были использованы последовательности ближайших "родственных" в генетическом отношении вирусов ВЗБ и ЛаКросс. Анализ полных нуклеотидных последовательностей S сегмента открытой рамки считывания и участков М и L сегментов (по 980 и 410 н.о. соответственно) показал, что штаммы вируса Хатанга можно разделить на 2 группы (см. рис. 5-7). В 1-ю группу вошли 11 штаммов, из которых 8 (LEIV-9843, LEIV-12718, LEIV-15804, LEIV-15525, LEIV-15844, LEIV-15852, LEIV-15816, LEIV-15833) выделены на северо-западе европейской части нашей страны и 3 штамма (LEIV-23158, LEIV-23310, LEIV-23314) из Западной Сибири изолированы в Тюменской области. 2-я группа представлена штаммами, выделенными в Средней и Северо-Восточной Сибири (LEIV-11552, LEIV-17756, LEIV-17774).

Внутри 2 выделенных генетических групп вируса Хатанга нуклеотидное сходство между штаммами по последовательностям S сегмента находилось в интервале от 97,1% до 99,7% - 1-ая группа, 98,6%-99,6% - 2-ая группа; по последовательностям участка М сегмента (980 н.о.) - от 94,9% до 99,8% - 1-ая группа, 96,9%-99,6% - 2-ая группа и по последовательностям участка L сегмента (410 н.о.) - от 93,4% до 99,8% -1-ая группа, 95,6%-97,5% - 2-ая группа. В то же время нуклеотидное сходство между штаммами, образующими 1-ю и 2-ю группы, по последовательностям S сегмента варьировало в пределах от 92,9% до 94,4%, по последовательностям участка М сегмента (980 н.о.) - от 83,9% до 86,9% и по последовательностям участка L сегмента (410 н.о.), от 82,5% до 87,8%.

Из приведенных выше данных видно, что вирус Хатанга как генетическая линия гетерогенен, и в его пределах можно четко выделить, как минимум, 2 генетические группы, которые также хорошо делятся по территориальному признаку. Наиболее наглядно генетические группы вируса Хатанга представлены на рисунке 8. Из литературных данных известно, что вирусы КСГ экологически связаны с комарами рода Aedes, которые по сути служат основными переносчиками вируса. По-видимому, генетические различия 1 группы вируса Хатанга от 2-ой, обусловлены, прежде всего, влиянием комплекса эколого-климатических факторов, оказывающих воздействие на репродуктивные циклы переносчиков. Также, возможно, отличия между группами вируса Хатанга, вероятно, связаны с видами комаров и позвоночных животных, которые обитают в пределах природного очага где циркулирует вирус. Основными эколого-климатичесьсими факторами, оказывающими существенное воздействие на комаров в природном очаге являются: температура, влажность, фотопериод и наличие открытых водоемов, необходимых для выплода личинок комаров. Поскольку на большие расстояния комары перелетать не могут, а штаммы изолированные от них, образующие вирус Хатанга были выделены на достаточно протяженной территории (см. материалы и методы таблица 2) то, вероятно, каждая из этих генетических групп, возможно, состоит из

нескольких обособленных субпопуляций вируса, находящихся в сходных экологических условиях.

Необходимо отметить, что в ходе генетического исследования вируса Хатанга, циркулирующего в различных регионах Российской Федерации, штаммов с реассортантным геномом обнаружено не было. Из 15-ти "российских" штаммов ни один не принадлежал к ВЗБ. Это говорит о том, что, скорее всего, на территории нашей страны (в северо-западной ее части, а также в Западной, Средней и Северо-Восточной Сибири) распространен вирус Хатанга.

0.01

La Crosse v.

Рис. 5. Радиальная филограмма полных нуклеотидных последовательностей S сегмента с открытой рамки считывания до стоп-кодона вируса Хатанга (род Orthobunyavirus). I и Ii-генетические группы. Последовательности вирусов Snowshoe hare v. (вирус зайца-беляка) и La Crosse v. (Ла-Кросс вирус) были использованы для обозначения внешних границ вируса Хатанга.

La Crosse v.

Рис. 6. Радиальная филограмма нуклеотидных последовательностей участка М сегмента с открытой рамки считывания до позиции 1044 вируса Хатанга (род Orthobunyavirus). I и И-генетические группы. Последовательности вирусов Snowshoe hare v. (вирус зайца-беляка) и La Crosse v. (Ла-Кросс вирус) были использованы для обозначения внешних границ вируса Хатанга.

Ьа Сгоэзе V.

Рис. 7. Радиальная филограмма нуклеотидных последовательностей Ь сегмента с открытой рамки считывания до позиции 1044 у вирусов КСГ (род ОгЙюЬшуауотэ). Все исследуемые штаммы выделены жирным шрифтом. Российские изоляты обозначены пунктирным овалом и заключены в прямоугольную рамку. I и И-генетические группы.

V-- йрУЧ*' "''¡■■^ЩЩт&Ш:ЩШ/ЯшШВШШШШЫь • I »• -/V. ' —«г-------------------- к и т- - л и •. ■■чадигиг--1. ■■■. в™™!-.

Рис. 8. Генетическое разнообразие вируса Хатанга - нового представителя Калифорнийской серогруппы (род ОлЬоЬипуау^из), циркулирующего в различных регионах Российской Федерации.

Условные обозначения: • - штаммы Г группы (ЬЕ1У-9843, ЬЕ1У-12718, ЬЕ1У-8545, ЬЕ1У-15804, ЕЕ1У-15525, ЬЕ1У-15844, ЬЕ1У-15852, ЬЕ1У-15816, ЕЕ1У-15833, ЬЕ1У-23158, ЬЕ1У-23314, ЬЕ1У-23310), штаммы II группы (ЬЕ1У-П552, ЬЕ1У-17756, ЕЕ1У-17774).

4. Создание варианта ОТ-ПЦР системы для детекции геномной РНК вирусов ВЗБ и вируса Хатанга в билогических образцах

Одной из задач данной работы было создание детекционной ОТ-ПЦР системы РНК вирусов КСГ (ВЗБ и вируса Хатанга), одновременно позволяющей как детектировать ПЦР-положительные образцы этих 2-х вирусов, так и определять групповую принадлежность штаммов вируса Хатанга на основе нуклеотидных последовательностей амплифицируемых фрагментов РНК. В первую очередь для создания такой системы необходимо было выбрать подходящие участки генома для дизайна олигонуклеотидных праймеров. С этой целью нами был проведен анализ полноразмерных нуклеотидных последовательностей генома ВЗБ и его антигенного варианта вируса Ла-Кросс, опубликованных в базе данных GenBank, с использованием пакета компьютерных программ DNASTAR. Следует отметить, что к началу настоящей работы у ВЗБ были опубликованы только полноразмерные последовательности для S и M сегментов и одна короткая частичная последовательность для L сегмента, а у вируса Ла-Кросс - 5-ть полноразмерных последовательностей для всех сегментов генома (S, M и L). Также необходимо добавить, что к началу исследования в базе данных GenBank не было опубликовано ни одной полной нуклеотидной последовательности генома вируса Хатанга, изолированного в России, а присутствовали лишь короткие последовательности, не позволявшие сделать достоверный вывод о видовой принадлежности этого вируса.

Выбор олигонуклеотидных праймеров для детекции вирусов КСГ осуществляли по наиболее консервативным участкам вирусного генома. В качестве таких участков-мишеней были взяты те, которые совпадают по нуклеотидной последовательности с ВЗБ, вирусом Ла-Кросс и штаммами вируса Хатанга, принадлежащим к различным генетическим группам. Наиболее часто используемыми участками генома для выяснения родственных взаимоотношений среди представителей КСГ являются последовательности генов поверхностных гликопротеинов Gn и Gc (M сегмент. Однако, генетическое сравнение только по последовательностям генов Gn и Gc (M сегмента) может не представлять объективной картины о систематическом положении исследуемого вируса КСГ и его филогенетических связях внутри серогруппы. Это связано с тем, что вирусы КСГ обладают возможностью к реассортации среди близкородственных вирусов, входящих в одну серогруппу. Поэтому для более полного определения систематического положения вируса и установления филогенетических связей внутри серогруппы используются все три сегмента в комплексе: последовательности S сегмента (ген N), L сегмента (ген L) и указанный выше M сегмент (гены Gn и Gc).

Последовательности праймеров подбирали с помощью программы Primer Premier 5.00 (Premier Biosoft International, США). Для синтеза комплементарной ДНК из вирусной РНК были предложены следующие праймера: S сегмент - BunStail, M сегмент - BunMtail, L сегмент - BunLtail (см. Материалы и методы). Место посадки этих праймеров расположено в

самом начале 3'-конца каждого из сегментов генома (в строго специфичной области для всех вирусов КСГ), при этом в реакции обратной транскрипции синтезируются кДНК соответствующего размера: Б сегмент (около 1000 и.о.), М сегмент (4600 н.о), Ь сегмент (около 7000 и.о.).

Для амплификации фрагментов генома штаммов ВЗБ и Хатанга, пассированных на мозге мышей-сосунков, с целью их дальнейшего генотипирования применялся однораундовый вариант ПЦР с участием следующих пар праймеров: Б сегмент - 11Р/982К, М сегмент - 6Б/127011, Ь сегмент - 8Р/109711. Буквами Р и II обозначаются праймеры прямой и обратной, соответственно, комплементарности.

Для детекции исследуемых штаммов КСГ с очень низким содержанием вирусной РНК применялся "гнездовой вариант" ПЦР. В первом раунде участвовали те же пары праймеров, что и для однораундового варианта. Во втором раунде: Б сегмент - 76Р/902Я, М сегмент - 105Р/110011, Ь сегмент -65Р/500Я.

Прежде всего эффективность разработанной детекционной ОТ-ПЦР системы была протестирована на штаммах КСГ (ВЗБ и Хатанга), пассированных на мозге мышей-сосунков, из коллекции ФГБУ «НИИ Вирусологии им. Д. И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. В нашем распоряжении было 15 штаммов вируса Хатанга, изолированных в различных регионах Российской Федерации и 1 штамм ВЗБ, выделенный в США (штат Монтана) (см. Материалы и методы). Важно при этом отметить, что у нас не было штаммов, выделенных в южных областях нашей страны, Северо-Тихоокеанском регионе, Камчатке, Сахалине, а также штаммов ВЗБ, выделенных в различных регионах Северной Америки, ввиду чего, мы не имели возможности проверить универсальность и специфичность настоящей ОТ-ПЦР системы. Однако, использование в данной ОТ-ПЦР системе праймеров, подобранных по строго консервативным участкам генома вирусов КСГ предполагает достаточную универсальность и специфичность настоящей системы.

4.2. Определение чувствительности ОТ-ПЦР системы

Оценку чувствительности системы при детекции Б, М и Ь сегментов генома у вирусов КСГ (ВЗБ и Хатанга) проводили с использованием подобранных пар праймеров на препарате штамма ЬЕ1У-17756. Для этого препарат вируса титровали на культуре клеток ВНК-21 и определяли БОЕ препарата и одновременно идентифицировали вирус методом ПЦР.

Для выделения РНК из инфекционного материала мы применяли стандартную методику с использованием гуанидинизотиоцианата с последующей фенол-хлороформной экстракцией. В качестве инфекционного материала использовали вирусосодержащую мозговую суспензию мышей-сосунков.

200 мкл суспензии обрабатывали лизирующим буфером, затем производили выделение РНК фенольным методом. Полученную РНК

[ использовали для постановки реакции синтез кДНК. Затем кДНК использовали для постановки для постановки первого раунда ПЦР. Анализ ампликонов проводили как после первого, так и после второго раунда ПЦР (рис. 9). После первого раунда ПЦР чувствительность системы составила 204 БОЕ/мл в исходной вирусной суспензии или 4-103 БОЕ в ПЦР пробирке. После второго раунда амплификации чувствительность ПЦР повысилась на два порядка и составила 200 БОЕ/мл в исходной вирусной суспензии или 40 БОЕ в ПЦР пробирке. Таким образом, чувствительность системы составила 200 БОЕ/мл.

БОЕ/МЛ М 206 205 204 20 3 200 20

400 н.о.

Рис. 9. Определение чувствительности разработанной детекционной ОТ-ПЦР системы (гнездовой вариант). А- результаты тестирования в ОТ-ПЦР разведения штамма LEIV-17756 после I раунда ПЦР. Б- результаты тестирования в ОТ-ПЦР разведений штамма LEIV-17756 после II раунда ПЦР. Над лунками указан соответствующий титр вируса. М - маркер (lkb DNA - Ladder, Gibco).

ВЫВОДЫ

1. На основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 8 сегмента, а также участков М и Ь сегментов генома (980 и 410 и.о., соответственно) установлено, что все штаммы, выделенные на территории России и исследуемые в данной работе, представляют собой новый, самостоятельный вирус Калифорнийской серогруппы (КСГ). Новый вирус КСГ назван Хатанга по месту выделения одного из изолятов.

2. В результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов показана принадлежность вируса Хатанга к субтипу вируса Ла-Кросс. Наиболее близкими в генетическом отношении к вирусу Хатанга являются ВЗБ и вирус ЛаКросс. Нуклеотидное сходство между вирусом Хатанга и ВЗБ по последовательностям Б сегмента (704 н.о.) находится в пределах от 88,3 % до 89,6%, с вирусом Ла-Кросс от 85,6% до 88,0%; М сегмента (980 н.о.) - от 78,9% до 80,7%, с вирусом Ла-Кросс от 77,6% до 79,5%; Ь сегмента (410 н.о.) - от 77,3% до 79,1%, с вирусом Ла-Кросс от 73,8% до 78,3%.

3. Установлена циркуляция на территории Российской Федерации, как минимум, двух генетических групп вируса Хатанга. Нуклеотидное сходство между группами I и II по последовательностям 8 сегмента (704 н.о.) находится в пределах от 92,9% до 94,4%; М сегмента (980 н.о.) - от 83,9% до 86,9%; Ь сегмента (410 н.о.) - от 82,5% до 87,8%.

4. Показано, что генетические группы вируса Хатанга имеют четкую привязанность к определенной территории. I генетическая группа вируса Хатанга распространена в Европейской части России и Западной Сибири, II - в Средней и Северо-Восточной Сибири.

5. Разработан вариант ОТ-ПЦР системы, позволяющий эффективно детектировать геномную РНК ВЗБ и вируса Хатанга в биологических образцах.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Лаврентьев М.В., Прилипов А.Г., Хуторецкая Н.В., Бутенко A.M., Львов Д.К. Филогенетический анализ полной нуклеотидной последовательности генома вируса зайца-беляка // Вопр. вирусол -2008.- №5. -С. 31-36.

2. Лаврентьев М.В.. Прилипов А.Г., Львов С.Д., Львов Д.К. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей штаммов вируса Хатанга - нового представителя серокомплекса Калифорнийского энцефалита, изолированных в различных регионах Российской Федерации // Вопр. вирусол. - 2008. - JV»6 -С. 25-29.

3- Лаврентьев_М.В., Прилипов А.Г. Полная нуклеотидная

последовательность генома штамма вируса зайца-беляка, депонированная в GenBank. www.ncbi.nlm.nih.gov. Accession Number: EU203678, EU262553, EU294510 (08.10.2010).

4- Лаврентьев М.В.. Прилипов А.Г. Полная нуклеотидная последовательность генома штамма LEIV-17756 вируса Хатанга, депонированная в GenBank. www.ncbi.nlm.nih.gov. Accession Number: EU479697 (05.10.2010), EU621834, EU616903 (06.10.2010).

Благодарности.

Считаю своим долгом выразить глубочайшую признательность директору Института вирусологии им. Д.И. Ивановского Минздравсоцразвития России академику Д.К. Львову, предоставившему возможность для выполнения данной работы и помощь в ее проведении. Хочу выразить глубокую благодарность и признательность своему научному руководителю к. б. н. А. Г. Прилипову за постоянную помощь и внимание к работе, критическую оценку и ценную помощь при оформлении диссертации.

Отдельно хочу поблагодарить д. б. н., профессора А. М. Бутенко, д.м.н. С.Д. Львова, к.б.н. Е. И. Самохвалова, к.б.н. C.B. Альховского, к.б.н. Н.В. Хуторецкую, д. б. н. М. Ю. Щелканова и весь коллектив лаборатории молекулярной генетики, за неоценимую помощь в выполнении работы и доброжелательное отношение. Отдельно, хочу вспомнить и выразить глубокую признательность В.Л. Громашевскому за неоценимую помощь в проведение данной работы. Хотелось бы также поблагодарить всех сотрудников Института вирусологии им. Д. И. Ивановского Минздравсоцразвития России, с кем мне приходилось общаться в ходе выполнения работы.

Заказ № 560. Объем 1 п.л. Тираж 100 экз.

Отпечатано в ООО «Петроруш». г.Москва, ул.Палиха 2а.тел.(499)250-92-06 www.postator.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лаврентьев, Михаил Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Классификация возбудителя и характеристика семейства Випуаутс1ае.

1.2. Морфология и структура вириона.

1.3. Физико-химические свойства вириона.

1.4. Организация генома буньявирусов.

1.4.1. Б сегмент и его белковые продукты.

1.4.2. М сегмент и его белковые продукты.

1.4.3. Ь сегмент и его белковые продукты.

1.5. Репликация буньявирусов.

1.5.1. Основные стадии репликационного процесса.

1.5.2. Адсорбция вируса.

1.5.3. Проникновение и декапсидация вируса.

1.5.4. Репликация буньявирусов.

1.5.5. Морфогенез.

1.5.6. Сборка и почкование вируса.

1.6. Биологические свойства буньявирусов.

1.6.1. Эффекты, оказываемые буньявирусами на клетки позвоночных.

1.6.2. Эффекты, оказываемые буньявирусами на клетки беспозвоночных.

1.7. Инфекция, вызываемая вирусами Калифорнийской серогруппы у позвоночных.

1.7.1. Патогенез и клинические проявления у людей.

1.7.2. Экспериментальная инфекция у мышей.

1.8. Буньявирусная инфекция у комаров.

1.9. Возможные взаимодействия вирусов при условии суперинфекции и потенциальные пути эволюции буньявирусов.

1.10. Идентификация вирусов КСГ.

1.11. Антигенные и филогенетические отношения вирусов КСГ (род Orthobunyavirus).

1.12. Экология и эпидемиология вирусов Калифорнийской серогруп-пы.

1.12.1. Экологические факторы, влияющие на формирование природно-очаговых заболеваний.

1.12.2. Экология и эпидемиология вирусов Калифорнийской серогруппы.

1.13. Надзор за инфекциями серогруппы Калифорнийского энцефалита.

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Анализ нуклеотидных последовательностей штаммов КСГ из базы данных GenBank.

2.2. Исследуемые штаммы.

2.3. Места сбора и объем полевого материала.

2.4. Олигонуклеотиды, использованные в экспериментах.

2.5. Выделение РНК.

2.6. Реакция обратной транскрипции (ОТ).

2.7. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.8. Электрофорез ДНК.

2.9. Приготовления ДНК для секвенирования.

2.10. Секвенирование ДНК.

2.11. Построение алайментов и филогенетический анализ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Определение первичных нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов КСГ.

3.2. Филогенетический анализ исследуемых штаммов КСГ.

3.3. Генетическое разнообразие штаммов вируса Хатанга - нового представителя серокомплекса Калифорнийского энцефалита, изолированных в различных регионах Российской Федерации.

3.4. Аминокислотный анализ функционально значимых участков Ь-белка исследуемого штамма ЬЕ1У-17756 вируса Хатанга.

3.5.1. Создание варианта ОТ-ПЦР системы для детекции РНК вирусов ВЗБ и Хатанга в биологических образцах.

3.5.2. Определение чувствительности ОТ-ПЦР системы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Вирус Хатанга - новый представитель серогруппы Калифорнийского энцефалита"

Свидетельством широкой циркуляции вирусов КСГ в России являются многолетние данные, полученные в процессе эколого-эпидемиологического, вирусологического и серологического мониторинга Центром экологии и индикации инфекционных заболеваний при ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Минздравсоцразвития России. По результатам этих исследований, проведенных с 1982 по 1990 годы на территории нашей страны, был выделен 251 штамм, отнесенный к КСГ [6]. Идентификация выявленных штаммов серологическими методами показала, что на территории России циркулирует, по крайней мере, 3 вируса серокомплекса: Инко, Тягиня и ВЗБ. Причем большая часть этих штаммов была идентифицирована как вирусы зайца-беляка (ВЗБ) [4, 5]. Все 3 вируса серокомплекса (Инко, Тягиня и ВЗБ) имеют значение в патологии человека.

Согласно данным мониторинга на территории России штаммы ВЗБ доминируют во всех ландшафтных поясах на территориях к востоку от реки Енисей (Средняя, Северо-Восточная Сибирь, Северо-Притихоокеанская физико-географическая страна). Штаммы вируса Инко преобладают в тундре и лесотундре Западной Сибири, а ВЗБ — в остальных ландшафтах, расположенных южнее. В восточной части Фенноскандии и на севере Русской равнины штаммы ВЗБ и Инко выделяются одинаково часто. Штаммы вируса Тягиня изолированы в южных и центральных областях Европейской части России [6].

Заболевания, связанные с вирусами КСГ, имеют сезонный характер и чаще всего регистрируются в ландшафтно-г'еографических зонах тайги и смешанных лесов Европейской части России и Западной Сибири. Переносчиками вирусов КСГ служат кровососущие комары преимущественно рода Aedes. Первые случаи заболеваний появляются в мае, основной пик приходится на июль-август, а единичные случаи регистрируются в сентябре и начале октября. Большинство больных были в возрасте от 15 до 40 лет, причем лица до 30 лет составили 52,5% от всех заболевших. Клинические симптомы инфекций, вызываемых вирусами КСГ, в большинстве случаев похожи. Вирусы Инко и Тягиня вызывают заболевания у людей, 'протекающие как без поражения ЦНС, так и с синдромом острой нейроинфекции, при которой ведущая роль принадлежит вирусу Инко. ВЗБ вызывает заболевание без симптомов поражения ЦНС [3].

Гриппоподобная форма болезни встречается чаще других (до 80% всех случаев заболеваний, вызванных вирусами КСГ). Заболевание протекает в виде острого лихорадочного состояния. Основные симптомы: высокая температура (39,0 — 40,0°С), интенсивная головная боль, тошнота, рвота. Позднее у больных отмечается гиперемия слизистой оболочки ротоглотки, явления фарингита. Возможны кратковременные диспептические проявления. Выздоровление наступает спустя 7-10 дней.

Бронхо-легочная форма характеризуется тем, что ведущим в клинической картине является синдром бронхита или пневмонии. При развитии пневмонии симптомы интоксикации выражены более значительно, так же могут определяться менингеальные знаки. Пневмония в большинстве случаев носит очаговый характер с полной регрессией воспалительных изменений через 14 дней.

Заболевание, протекающее с признаками поражения ЦНС, характеризуются вариабельностью клинической картины, течение и симптоматика которой определяется степенью поражения ЦНС: от синдрома менингизма до воспаления мозговых оболочек и вещества головного мозга. Несмотря на затяжной характер болезни, течение и исходы благоприятные.

На сегодняшний день имеется очень мало работ, посвященных генетическому разнообразию вирусов КСГ, циркулирующих в различных регионах России. Ранее изучение генома вирусов КСГ проводилось зарубежными исследователями на штаммах (изолированных в США и Европе) в основном по последовательностям Б и М сегментов [76, 37]. Полные нуклеотидные последовательности по всем трем сегментам генома (Б, М и Ь) у вирусов КСГ известны только у вируса Ла Кросс, циркулирующего на территории США. Частичные последовательности Ь сегмента данной группы вирусов опубликованы в базе данных ОепВапк только у вирусов: Тягиня, зайца-беляка, Мелао, Джемстаун-Каньон, Инкоо и Саус-Ривер. У остальных представителей КСГ последовательности Ь сегмента не определены. Генетическое исследование ВЗБ, как наиболее распространенного вируса КСГ, циркулирующего на территории нашей страны, позволило бы получить достоверную информацию о систематическом положении этого вируса, определить степень гомологии и дивергенции среди других представителей серогруппы, выяснить какова гетерогенность ВЗБ в пределах вида. К тому же, все созданные ОТ-ПЦР системы, позволяющие детектировать вирусы КСГ адаптированы к штаммам, выделенным в США и Европе. Проведение молекулярно-генетического анализа штаммов ВЗБ, изолированных на территории России позволило бы разработать отечественный вариант ОТ-ПЦР системы, который был бы ориентирован на варианты вируса, циркулирующего на территории нашей страны.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования явилась генетическая характеристика штаммов КСГ, циркулирующих на территории РФ (идентифицированных серологическими методами как ВЗБ), и определение их систематического положения в существующей системе классификации вирусов КСГ. Для реализации этого были поставлены следующие задачи:

1. Провести определение первичной структуры полной' нуклеотидной последовательности Б сегмента, а также участков последовательностей МиЬ сегментов (по 980 и 410 нуклеотидов, соответственно) у 15-ти "культураль-ных" штаммов, выделенных на территории России и одного штамма, изолированного на территории США.

2. Провести филогенетический анализ исследуемых штаммов вируса по полной нуклеотидной последовательности Э сегмента и участкам последовательностей МиЬ сегментов (по 980 и 410 нуклеотидов, соответственно) и сравнить их с ранее охарактеризованными штаммами КСГ, представленными в базе данных ОепВапк.

3. Установить первичную структуру полного генома ВЗБ, выделенного на территории США.

4. Установить первичную структуру полного генома у 1-го штамма вируса КСГ, изолированного на территории России.

5. Разработать на основе анализа нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов КСГ детекционный вариант ОТ-ПЦР системы.

Научная новизна и практическая значимость

1. Впервые установлено, на основании филогенетического анализа полной нуклеотидной последовательности 8 сегмента, а также по последовательностям участков М и Ь сегментов генома (по 980 и 410 нуклеотидов, соответственно), что все исследуемые российские штаммы (ранее серологически идентифицированные как ВЗБ) являются самостоятельным вирусом КСГ и генетически близки к ВЗБ и вирусу ЛаКросс. Новый вирус назван Хатанга, по месту выделения штамма ЬЕ1У-11552.

2. Впервые показано, что на территории РФ в Европейской части, а таюке в Западной, Средней и Северо-Восточной Сибири циркулирует, по меньшей мере, 2 генетические линии вируса Хатанга.

3. Впервые определена первичная структура генома, российского штамма ЬЕ1У-17756 вируса Хатанга.

4. Впервые определена первичная структура Ь сегмента ВЗБ, изолированного в США.

5. Создан вариант ОТ-ПЦР системы, позволяющий детектировать геномную РНК вирусов ВЗБ и Хатанга.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основе сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей 8 сегмента, а также участков М и Ъ сегментов генома (по 980 и 410 нуклеотидов, соответственно) установлено, что все штаммы, выделенные на территории России и исследуемые в данной работе, представляют собой отдельный, самостоятельный вирус КСГ. Новый вирус КСГ назван Хатанга, по месту выделения одного из штаммов.

2. Результаты филогенетического анализа по полной нуклеотидной последовательности Э сегмента, а также участков М и Ь сегментов генома позволяют утверждать, что вирус Хатанга, изолированный на территории России, относится к субтипу вируса Ла-Кросс, входящего в серотип Калифорнийского энцефалита. В генетическом отношении вирус Хатанга наиболее близок к ВЗБ и вирусу Ла-Кросс.

3. На основе сравнительного анализа по нуклеотидным последовательностям всех сегментов генома установлено, что вирус Хатанга, как генетическая линия гетерогенен и имеет как минимум 2 генетические группы, которые хорошо делятся по территориальному признаку.

4. Впервые определены полные нуклеотидные последовательности генома у российского штамма ЬЕ1У-17756 вируса Хатанга, а также полные нуклеотидные последовательности Ь сегмента штамма ВЗБ, выделенного на территории США.

5. Создан вариант ОТ-ПЦР системы, позволяющий детектировать геномную РНК вирусов ВЗБ и Хатанга.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лаврентьев, Михаил Вячеславович

ВЫВОДЫ

1. На основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей Б сегмента, а также участков МиЬ сегментов генома (980 и 410 и.о., соответственно) установлено, что все штаммы, выделенные на территории России и исследуемые в данной работе, представляют собой новый, самостоятельный вирус Калифорнийской серогруппы (КСГ), Новый вирус КСГ назван Хатанга по месту выделения одного из изолятов.

2. В результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов показана принадлежность вируса Хатанга к серотипу Калифорнийского энцефалита. Наиболее близкими в генетическом отношении к вирусу Хатанга являются ВЗБ и вирус ЛаКросс. Нуклеотидное сходство между вирусом Хатанга и ВЗБ по последовательностям Б сегмента (704 н.о.) находится в пределах от 88,3 % до 89,6%, с вирусом Ла-Кросс от 85,6% до 88,0%; М сегмента (980 н.о.) - от 78,9% до 80,7%, с вирусом Ла-Кросс от 77,6% до 79,5%; Ь сегмента (410 н.о.) — от 77,3% до 79,1%, с вирусом Ла-Кросс от 73,8% до 78,3%.

3. Установлена циркуляция на территории Российской Федерации как минимум двух генетических групп вируса Хатанга. Нуклеотидное сходство между группами I и II по последовательностям 8 сегмента (704 н.о.) находится в пределах от 92,9% до 94,4%; М сегмента (980 н.о.) - от 83,9% до 86,9%; Ь сегмента (410 н.о.) - от 82,5% до 87,8%.

5. Разработан вариант ОТ-ПЦР системы, позволяющий эффективно детектировать геномную РНК вирусов ВЗБ и вируса Хатанга в биологических образцах.

Благодарности

Считаю своим долгом выразить глубочайшую признательность директору Института вирусологии им. Д.И. Ивановского академику РАМН Д.К. Львову, предоставившему возможность для выполнения данной работы. Хочу выразить глубокую благодарность и признательность своему научному руководителю к.б.н. А. Г. Прилипову за постоянную помощь и внимание к работе, критическую оценку и ценную помощь при оформлении диссертации.

Отдельно хочу поблагодарить д.б.н., профессора А. М. Бутенко, д.м.н. С.Д. Львова, к.б.н. Е. И. Самохвалова, к.б.н. C.B. Альховского, к.б.н. Н.В. Хуторецкую, д.б.н. М. Ю. Щелканова и весь коллектив лаборатории "Молекулярной генетики", за неоценимую помощь в выполнении работы и доброжелательное отношение. Отдельно, хочу вспомнить и выразить глубокую признательность В.Л. Громашевскому за неоценимую помощь в проведение данной работы. Хотелось также поблагодарить всех сотрудников Института вирусологии им. Д. И. Ивановского с кем мне приходилось общаться в ходе выполнения работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе настоящей работы определена полноразмерная первичная структура Б сегме нта геномной РНК, а также участков М и Ь сегментов генома (по 980 и 410 н.о., соответственно) у 15-ти штаммов КСГ, изолированных в различных регионах Российской Федерации, а также определена первичная структура штамма ВЗБ, выделенного на территории США (штат Монтана). Генетический анализ российских изолятов, принадлежащих к Калифорнийской серогруппе (КСГ) рода ОгЙюЬипуау^э позволил определить их систематическое положение и установить родственные взаимоотношения в пределах данной серогруппы. До этого эти штаммы с помощью иммунологических методов исследования были определены как вирус зайца-беляка (ВЗБ) [4].

Филогенетический анализ полученных последовательностей по всем сегментам генома с основными представителями КСГ из международной базы данных СепВапк показал, что все штаммы, изолированные в России образуют отдельную генетическую линию и представляют собой новый, самостоятельный вирус в пределах серогруппы. Новый вирус, циркулирующий на территории России, назван Хатанга — по месту выделения (вблизи поймы реки Хатанга; полуостров Таймыр), штамма ЬЕ1У-11552. Наиболее близкими к вирусу Хатанга внутри серогруппы являются ВЗБ и вирус Ла-Кросс. Нуклеотидное сходство между ВЗБ и исследуемыми российскими штаммами варьировало: от 88,3% до 89,6% (Б сегмент), 78,9% — 80,7% (М сегмент), 77,3% — 79,1% (Ь сегмент). Нуклеотидное сходство между вирусом Ла-Кросс и штаммами изолированными в России находилось в пределах от 85,6% до 88,0% (8 сегмент), 77,6% - 79,5% (М сегмент), 73,8% - 78,3% (Ь сегмент). Самое минимальное нуклеотидное сходство по последовательностям 8 и М - сегментов наблюдалось с вирусами Гуароа и Тривиттатус. Нуклеотидное сходство с вирусом Гуароа составило интервал от 25,3% до 29,5% (8 сегмент) и 41,6% - 44,0% (М сегмент), а с вирусом Тривиттатус от 65,5% до 67,4% (8 сегмент) и 62,4%» - 65,0% (М сегмент). У большинства представителей КСГ последовательности Ь сегмента не опубликованы поэтому сравнение проводилось по доступным последовательностям этого сегмента. Минимальное нуклеотидное сходство по последовательностям Ь сегмента между российскими штаммами и вирусами КСГ из базы данных ОепВапк было с вирусом Инко, от 66,3% до 68,5%. Анализ последовательностей вируса Хатанга определил систематическое положение исследуемого вируса в пределах серогруппы и позволил утверждать, что данный вирус относится к серокомплексу Калифорнийского энцефалита (СКЭ), входит в серотип Калифорнийского энцефалита и принадлежит к субтипу вируса Ла-Кросс. Внутри субтипа вируса Ла-Кросс принято различать 2 отдельных вируса: собственно вирус Ла-Кросс и его антигенный вариант ВЗБ [36]. Новый вирус Хатанга удален от обоих вирусов приблизительно на такое же расстояние, как ВЗБ удален от вируса Ла-Кросс, поэтому, вероятно, вирус Хатанга можно также рассматривать как антигенный вариант вируса Ла-Кросс или ВЗБ на правах самостоятельного вируса.

При изучении генетического разнообразия штаммов, выделенных в России оказалось, что вирус Хатанга гетерогенен и в его пределах можно четко выделить 2 генетические группы, которые хорошо делятся по территориальному признаку. I группа состоит из штаммов, изолированных на северо-западе Европейской части нашей страны и Западной Сибири. II группа представлена штаммами, выделенными в Средней и СевероВосточной Сибири. Нуклеотидное сходство между I и II группами по последовательностям Б сегмента (704 н.о.) находилось в пределах от 92,9% до 94,4%, участка М сегмента (980 н.о.) - от 83,9% до 86,9%, участка Ь сегмента (410 н.о.) — от 82,5% до 87,8%. Из 15-ти исследуемых штаммов, выделенных в различных регионах Российской Федерации, ни один не принадлежал к ВЗБ. Это говорит о том, что, скорее всего, на территории нашей страны (в северо-западной ее части, а также в Западной, Средней и Северо-Восточной Сибири) распространен вирус Хатанга, а не ВЗБ.

В данной работе, помимо российских изолятов, исследовали штамм ВЗБ, выделенный в США. Анализ этого штамма показал, что он относится к ВЗБ.

Так же в результате работы были впервые определены полные нуклеотидные последовательности штамма LEIV-17756, относящегося ко II генетической группе вируса Хатанга, циркулирующего на территории России (Северо-Восточная Сибирь, республика Якутия) и штамма ВЗБ, изолированного в США (штат Монтана), принадлежащему к одноименному вирусу. Нуклеотидные и аминокислотные последовательности исследованных штаммов опубликованы в международной базе данных GenBank (Accession Numbers: EU479697, EU621834, EU616903, EU203678, EU262553, EU294510) и могут быть использованы в качестве эталонных. Полные нуклеотидные последовательности штамма LEIV-17756 вируса Хатанга и ВЗБ позволили проанализировать аминокислотные последовательности функционально значимых участков у вирусной полимеразы белка-L.

На заключительном этапе данной работы была разработана детекционная ОТ-ПЦР система для обнаружения геномной РНК вирусов КСГ (ВЗБ и вируса Хатанга) в биологических образцах. Особый упор при создании ОТ-ПЦР системы делался на отработку и подбор максимально эффективных температурных режимов в реакции ПЦР и выбора универсальных пар праймеров, позволяющих с высокой вероятностью детектировать вирусную РНК в инфекционном материале. Для амплификации исследуемых фрагментов ДНК, пассированных на мозге мышей-сосунков, применялся как однораундовый так и двухраундовый (для проб с низким содержание вирусной РНК) "гнездовой" вариант ПЦР. Чувствительность "гнездового" варианта системы составила приблизительно 200 БОЕ/мл или 40 БОЕ в ПЦР пробирке. Таким образом, разработанный вариант ОТ-ПЦР системы для детекции геномной РНК вирусов КСГ (ВЗБ и Хатанга) является эффективным и чувствительным при исследовании инфекционного материала.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лаврентьев, Михаил Вячеславович, Москва

1. Ахматова Н.К., Юсупова Р.Ш., Хайбуллина С.Ф., Сибиряк С.В. Апоптоз лимфоцитов при геморрагической лихорадке с почечным синдромом. // Russ J 1.munol - 2003. - Vol. 8(1). - P. 37-46.

2. Львов Д.К., Клименко C.M., Гайдамович С .Я. и др. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. М.: Медицина. — 1989. — 336 с.

3. Львов С.Д. Эколого-эпидемиологические закономерности циркуляции арбовирусов на севере Евразии: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. М., 1994.

4. Львов С.Д., Громашевский В.Л., Львов Д.К. и др. Распространение вирусов серогруппы Калифорнийского энцефалита (Bunyaviridae, Bunyavirus) в северных широтах России. // Вопр вирусол. — 1997. — №5. — Р. 229-235.

5. Медицинская вирусология. Руководство / под ред. акад. РАМН Д.К. Львова М.: ООО "Медицинское информационное агентство", 2008. -656 с.

6. Новикова Н.А., Новиков В.В., Добротина Н.А., Мазепа В.Н. Вирусология. Учебное пособие. Нижний Новгород: издат. ННГУ им Н.И. Лобачевского. 2002. - С. 131-133.

7. Akashi Н., Gay М., Ihara Т., Bishop D.H.L. Localized conserved region of the S RNA gene products of bunyaviruses are revealed by sequence analyses of the Simbu serogroup Aino viruses. // J Virus Res. 1984. - Vol. 1. - P. 5163.

8. Alfadhli A., Love Z., Arvidson B. et al. Hantavirus nucleocapsid protein oligomerization. // J Virology. 2001. - Vol. 75(4). - P. 2019-2023.

9. Alminaite A., Backstrom V., Vaheri A. and Plyusnin A. Oligomerization of hantaviral nucleocapsid protein: charged residues in the N-terminal coiled-coil domain contribute to intermolecular interactions. // J Gen Virol. — 2008. — Vol. 89.-P. 2167-2174.

10. Anderson G., Smith J. Immunoelectron microscopy of Rift Valley morphogenesis in primary rat hepatocytes. // J Virology. 1987. - Vol. 161. -P. 91-100.

11. Andersson A.M., Petterson R.F. Targeting of a short peptide derived from the cytoplasmic tail of the G1 membrane glycoprotein of Uukuniemi virus (Bunyaviridae) to the Golgi complex. // J Virology. 1998. - Vol. 72(12). -P. 9585-9596.

12. Arikawa J., Schmaljohn A.L., Dalrymple J.M. et al. Characterization of Hantaan virus envelope glycoprotein antigenic determinants defined by monoclonal antibodies. // Gen Virol. 1989. - Vol. 70(3). - P. 615-624.

13. Artsob H., Spence L.P., Surgeoner G. A focus of California group virus activiti in Southern Ontario (Canada). // Mosq News. 1983. - Vol. 43. - P. 449-455.

14. Barr J.N. Bunyavirus mRNA synthesis is coupled to translation to prevent premature transcription termination. // RNA. 2007. — Vol. 13. — P. 731-736.

15. Barr J.N., Elliott R.M., Dunn E.F. and Wertz G.W. Segment-specific terminal sequences of Bunyamwera bunyavirus regulate genome replication. // J Virology. 2003. - Vol. 311. - P. 326-338.

16. Barr J.N., Rodgers J.W., Wertz G.W. Identification of the Bunyamwera bunyavirus transcription termination signal. // J Gen Virol. — 2006. Vol. 87(Pt 1). — P. 189-198.

17. Barr J.N., Wertz G.W. Role of the conserved nucleotide mismatch within 3-and 5'-terminal regions of Bunyamwera virus in signaling transcription. // J Virology. 2005. - Vol. 79(6). - P. 3586-3594.

18. Beaty B.J., Bishop D.H.L. Bunyavirus vector interactions. // J Virus Res. — 1988. Vol. 10. - P. 289-302.

19. Beaty B.J., Bishop D.H.L., Gay M."; Fuller F. Interference between bunyaviruses in Aedes triseriatus mosquitoes. // J Virology. 1983. - Vol. 127.-P. 83-90.

20. Belboncik S., Aubin A., Maire A. et al. Arbovirus studies in the Trois-Riveieres area province of Quebek, Canada. // Mosq New. 1983. - Vol. 43. -P. 426-431.

21. Bertolotli-Ciarlet A., Smith J., Strecker K. et al. Cellular, localization and antigenic characterization of Crimean-congo > hemorrhagic fever virus glycoproteins. // J Virology. 2005. - Vol. 79(10). - P. 6152-6161.

22. Bishop D.H.L. Biology and molecular biology of bunyaviruses. In the Bunyaviridae 1996. - Edited by R.M. Elliott New York Plenum Press. - P. 19-61.

23. Bishop D.H.L., Gould K.G., Akashi H., Clerx-van Haaster C.M. The complete sequence and coding content of snowshoe hare bunyavirus small (S) viral RNA species. // J Nucleic Acids Res. 1982. - Vol.10. - P. 37033713.

24. Bishop D.H.L., Shope R.E. Bunyaviridae. // Comprehensive Virology Ed. H. Fracnkel-Conrat R.R. Wagner New York, London: Plenum Press. - 1979. -Vol. 14(1).-P. 1-16.

25. Blakqori G., Delhaye S., Habjan M. Et al. La Crosse Bunyavirus nonstructural protein Nss serves to suppress the type I interferon system of mammalian hosts. // J Virology. 2007. - Vol. 81(10). - P. 4991-4999.

26. Blakqori G., Kochs G., Haller O. et al. Functional L polymerase of La Crosse virus allows in vivo reconstitution of recombinant nucleocapsids. // J Gen Virol.-2003.-Vol. 84(Pt 5). — P. 1207-1214.

27. Borucki M.K., Chandler L.J., Parker B.M., Blair C.D. and Beaty B.J. Bunyavirus superinfection and segment reassortment in transovarially infected mosquitoes. // J Gen Virol. 1999. - Vol. 80. - P. 3173-3179.

28. Borucki M.K., Kempf B.J., Blitvich B J., Blair C.D., Beaty B.J. La Crosse virus: replication in vertebrate and invertebrate hosts. // J Microb and Infect. -2002.-Vol. 4.-P. 341-350.

29. Bouloy M., Hannoun C. Studies on Lumbo virus replication. RNA — dependent RNA polymerase associated with virions. // J Virology. 1976. — Vol. 69. - P. 258-264.

30. Bucher E., Sijen T., De Haan P. et al. Negative-strand tospoviruses and . tenuiviruses carry a gene for a suppressor of gene silencing at analogousgenomic positions. // J Virology. 2003. - Vol. 77(2). - P. 1329-1336.

31. By I.C., Frugulhetti P.P., Rebello M.A. Na+ K+ concentration and regulation of protein synthesis in L-A9 and Aedes albopictus cells infected with Marituba virus (Bunyaviridae). // J Gen Virol. 1989 - Vol. 70. - P. 34933499.

32. Calisher C.H. Taxonomy, classification and geographic distribution of California serogroup Bunyaviruses. California serogroup viruses. // New York: Publ AR Liss inc, 1983. P. 1-16.

33. Campbell W.P., Huang C. Sequence comparisons of medium RNA segment among 15 California serogroup viruses. // Virus Res. — 1999. Vol. 61. - P. 137-144.

34. Chandler L.J., Hogge G., Endres M., Jacoby D.R., Nathanson N., Beaty B.J. Reassortment of La Crosse and Tahyna bunyaviruses in Aedes triseriatus mosquitoes. // J Virus Res. 1991. - Vol. 20. - P. 181-191.

35. Chen S., Compans R. Oligomerization, transport and Golgi retention of Punta Toro virus glycoproteins. // J Virology. 1991. - Vol. 65(11). - P. 59025909.

36. Chomzcynski P., Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Anal Biochem. -1987.-Vol. 162.-P. 156-159.

37. Colon-Ramos D.A., Irusta P.M., Gan E.C. et al. Inhibition of translation and induction of apoptosis by Bunyaviral nonstructural proteins bearing sequence similarity to reaper. // J Mol Biol Cell. 2003. - Vol. 14(10). - P. 4162-4172.

38. Eldridge B.J., Calisher C.H., Fryer J.L. et al. Serological evidence of California serogroup virus activity in Oregon. // J Wildl Dis. 1987. — Vol. 23.-P. 199-204.

39. Elliott R.M. Molecular biology of the Bunyaviridae. // J Gen Virol. 1990. -Vol. 71.-P. 501-522.

40. Elliott R.M. Emerging viruses: the Bunyaviridae. // J Mol Med. -1997. Vol. 3 №9. - P. 572-577.

41. Fauquet C.M., Mayo M.A., Maniloff J., Desselberger V. and Ball L.A. Virus taxonomy. Part II. (Eds) Elsevier, San Diego. 2005. - P. 697-698.

42. Fazakerley J.K., Ross A.M. Computer analysis suggests a role for signal sequences in processing polyproteins of enveloped RNA viruses and as a mechanism of viral fusion. // J Virus Genes. 1989. - Vol. 2(3). - P. 223-239.

43. Feltz E.T., List-Young B., Ritter C.D., Holden P., Noble G.R., Clark P.S. California encephalitis virus: serological evidence of human infections in Alaska. // Can J Microbiol. 1972. - Vol. 18(6). - P. 757-762.

44. Fields B.M., Knipe D.M., Howley P.M. Virology. Volume II. 2007. - P. 1743-1744.

45. Fields B.M., Knipe D.M., Howley P.M. Virology. Volume II. 2007. - P. 1748-1750.

46. Fields B.M., Knipe D.M., Howley P.M. Virology. Volume II. 2007. - P. 1758-1759.

47. Flick K., Hooper J.W., Schmaljohn C.S. et al. Rescue of Hantaan virus minigenomes. // J Virology. 2003. - Vol. 306(2). - P. 219-224.

48. Flick K., Katz A., Overby A. et al. Functional analysis of the noncoding regions of the Uukuniemi virus (Bunyaviridae) RNA segments. // J Virology. 2004. -Vol. 78(21). - P. 11726-11738.

49. Flick R., Elgh F., Pettersson R.F. Mutational analysis of the Uukuniemi vims (Bunyaviridae family) promoter reveals two elements of functional importance.// J Virology. 2002. - Vol. 76(21).-P. 10849-10860.

50. Flick R., Flick K., Feldmann H. et al. Reverse genetics for crimean-congo hemorrhagic fever virus. // J Virology. 2003. - Vol. 77(10). - P. 5997-6006.

51. Garcia S., Billecocq A., Crance J.M. et al. Nairovirus RNA sequences expressed by a Semliki Forest virus replicon induce RNA interference in tick cells. // J Virology. 2005. - Vol. 79(14). - P. 8942-8947.

52. Garcin D., Lezzi M., Dobbs M. et al. The 5' ends of Hantaan virus (Bunyaviridae) RNA suggest aprime and — realign mechanism for the initiation of RNA synthesis. // J Virology. - 1995. - Vol. 69(9). - P. 57545762.

53. Garry C.E., Garry R.F. Proteomics computational analyses suggest that the carboxyl terminal glycoproteins of Bunyaviruses are class II viral fusion protein (beta-penetrenes). // Theor Biol Med Model. 2004. - Vol. 1(1). - P. 1-16.

54. Gavrilovskaya I.N., Brown E.J., Ginsberg M.H., Mackow E.R. Cellular entry of Hantaviruses which cause hemorrhagic fever wich renal syndrome is mediated by J33 integrins. // Virol. 1999. - Vol. 73 №5. - P. 3951-3958.

55. Geimonen E., Fernandez I., Gavrilovskaya I.N. et al. Tyrosine residues direct the ubiguitination and degradation of the NY-1 hantavirus G1 cytoplasmic tail. // JVirology. — 2003 Vol. 77(20).-P. 10760-10768.

56. Gentsch J.R., Robeson G., Bishop D.H.L. Recombination between Snowshoe hare virus and La Crosse bunyaviruses. // J Virology. 1979. - Vol. 31. - P. 707-717.

57. Gentsch J.R., Wynne L.R., Clewley J.P., Shope R.E., Bishop D.H.L. Formation of recombinants between snowshoe hare and La Crosse bunyaviruses. // J Virology. 1977. -"Vol. 24. - P. 893-902.

58. Gerhardt R.R., Gottfried K.L., Apperson C.S. et al. Fist isolation of La Crosse virus from naturally infected Aedes albopictus. // Emerg Infect Dis. — 2001.-Vol. 7 №5.-P. 807-811.

59. Gerrard S.R., Nichol S.T. Characterization of the Golgi retention motif of Rift Valley fever virus G(n) glycoprotein. // J Virology. 2002. - Vol. 76(23). -P. 12200-12210.

60. Gonzalez-Scarano F., Janssen R.S., Najjar J.A. et al. An avirulent G1 glycoprotein variant of La Crosse bunyavirus with defective fusion function. // J Virology. 1985. - Vol. 54(3). - P. 757-763.

61. Gonzalez-Scarano F., Pobjecky N., Nathanson N. La Crosse bunyavirus can mediate pH dependent fusion from without. // J Virology. - 1984 - Vol. 132.-P. 222-225.

62. Griot C., Gonzalez-Scarano F., Nathanson N. Molecular determinants of the virulence and infectivity of California serogroup Bunyaviruses. // J Annu Rev Microiol. 1993. - Vol. 47. - P. 117-138.

63. Hacker J.K., Hardy J.L. Adsorptive endocytosis of California encephalitis virus into mosquito and mammalian cells: a role for Gl. // J Virology. 1997. -Vol. 235(1).-P. 40-47.

64. Haferkamp S., Fernando L., Schwarz T. et al. Intracellular localization of Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF) virus glycoproteins. // J Virology. 2005. - Vol. 25 №2 (1). - P. 42.

65. Hewlett M.J., Pettersson R.F., Baltimore D. Circular forms of Uukuniemi virion RNA: an electron microscopic study. // J Virology. 1977. - Vol. 21(3).-P. 1085-1093.

66. Huang C., Shope R.E., Spargo B. and Campbell W.P. The S RNA genomic sequence of Inkoo, San Angelo, Serra do Navio, South River and Tahyna bunyaviruses. // J Gen Virol. 1996. - Vol. 77. - P. 1761-1768.

67. Hutchinson K.I., Peters C J., Nichol S.T. Sin Nombre virus mRNA synthesis. // J Virology. 1996. - Vol. 224(1). - P. 139-149.

68. Hutchinson K.I., Rollin P.E., Shieh W.J. et al. Transmission of Black Creek Canal virus between cotton rats. // J Med Virol. 2000. - Vol. 60(1). - P. 7076.

69. Ikegami T., Won S., Peters C.J., Makino S. Rift Valley fever virus Nss mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense SRNA segment. // J Virology.-2005.-Vol. 79. P. 12106-12111.

70. Jacoby D., Cooke C., Prabakaran I: et al. Expression of the La' Crosse M segment proteins in a recombinant vaccinia expression system mediates pH — dependent cellular fusion. // Virology. 1993. - Vol. 193. - P. 993-936.

71. Jin H., Elliott R.M. Mutagenesis of the L protein encoded by Bunyamwera virus and production of monospecific antibodies. // J Gen Virol. 1992. -Vol. 73(Pt 9). - P. 2235-2244.

72. Jin H., Elliott R.M. Characterization of Bunyamwera virus SRNA that is transcribed and replicatted by the L protein expressed from recombinant vaccinia virus. // Virol. 1993. - Vol. 67(3). - P. 1396-1404.

73. Jin M., Park J., Lee S. et al. Hantaan virus enters cell by clathrin dependent receptor - mediated endocytosis. // J Virology. - 2002. - Vol. 294(1). - P. 6069.

74. Johnson R.T. Pathogenesis of La Crosse virus in mice. // J Prog Clin Biol Res.-1983.-Vol. 123.-P. 139-144.

75. Kainz M., Hilson P., Sweeney L. et al. Interaction between tomato spotted wilt virus N protein monomers involves nonelectrostatic forces governed by multiple distinct regions in the primary structure. // J Phytopathology. — 2004. -Vol. 94.-P. 759-765.

76. Kascsak R.J., Lyons M.J. Bunyamwera virus. Part II. The generation and nature of defective interfering particles. // J Virology. 1978. — Vol. 89. — P. 539-546.

77. Kaukinen P., Koistinen V., Vapalahti O. et al. Interaction between molecules of hantavirus nucleocapsid protein. // J Gen Virol. 2001. - Vol. 82(Pt 8). -P. 1845-1853.

78. Kaukinen P., Vaheri A., Plyusnin A. Hantavirus nucleocapsid protein: a multifunctional molecule with both housekeeping and ambassadorial duties. // J Arch Virol.-2005.-Vol. 150.-P. 1693-1713.

79. Keegan K., Collett M.S. Use of bacterial expression cloning to define the amino acid sequencins of antigenic determinants on the G2 glycoprotein of Rift Vallery fever virus. // Virol. 1986. - Vol. 58. - P. 263-270.

80. Kinsella E., Martin S., Grolla A. et al. Sequence determination of the Crimean-Congo hemorrhagic fever virus L segment. // Virol. 2004. - Vol. 321(2).-P. 23-28.

81. Kohl A., di Bartolo V., Bouloy M. The Rift Valley fever virus nonstructural protein Nss is phosphorylated at serine residues located in casein kinase II consensus motifs in the carboxyterminus. // J Virology. 1999. - Vol. 263(2). -P. 517-525.

82. Kohl A., Lowen A., Leonard V. et al. Genetic elements regulating packaging of the Bunyamwera orthobunyavirus genome. // J Gen Virol. 2006. - Vol. 87(Pt 1). — P. 177-187.

83. Kramer L.D., Thompson W.H. Quantitation of La Crosse virus in venereally infected Aedes triseriatus. // Am J Trop Med Hyg. 1983. - Vol. 32. - P. 1140-1146.

84. Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. // Brief Bioinform. -2004.-Vol. 5(2).-P. 150-163.

85. Lappin D.F., Nakitare G.W., Palfreyman J.W. et al. Localization of Bunyamwera bunyavirus G1 glycoprotein to the Golgi requires association with G2 but not with Nsm. // J Gen Virol. 1994. - Vol. 75(Pt 12). - P. 34413451.

86. Le Due J.W. Epidemiology and ecology of the California serogroup viruses. // Am J Trop Med Hyg. 1987. - Vol. 37. - P. 60S-68S.

87. Le May N., Gauliard N., Billecocq A. et al. The N terminus of Rift Valley fever virus nucleoprotein is essential for dimerization. // J Virology. 2005. -Vol. 79(18). — P. 11974-11980.

88. Lee H.W., French G.R., Lee P.W. et al. Observation on natural and laboratory infection of rodents with the etiologic agent of Korean hemorrhagic fever. // Am J Trop Med Hyg. 1981. - Vol. 30(2). - P. 477-482.

89. Leonard V.H., Kohl A., Osborne J.C. et al. Homotypic interaction of Bunyamwera virus nucleocapsid protein. // J Virology. 2005. - Vol. 79(20). -P. 13166-13172.

90. Li X., Kukkonen S., Vapalahti O. et al. Tula hantavirus infection of Vero-E6 cells induces apoptosis involving caspase 8 activation. // J Gen Virol. -2004. Vol. 85 (Pt 11). - P. 3261-3268.

91. Markotic A., Hensley L., Geisbert T. et al. Hantaviruses induce cytopathic effects and apoptosis in continuous human embryonic kidney cells. // J Gen Viroll 2003. - Vol. 84(Pt 8). - P. 2197-2202.

92. Matsuoka Y., Chen S.Y., Compans R.W. A signal for Golgi retention in the bunyavirus G1 glycoprotein. // J Biol Chem. 1994. - Vol. 269(36). - P. 22565-22573.

93. McLean D.M. Bunyaviruses throughout the western Canadian Arctic. Circumpolar Health, Seattle -London: University of Washington Press, 1985. -Vol. 84.-P. 209-212.

94. McLean D.M. Yukon isolates of Snowshoe hare virus, 1972-1983. // Prog Clin Biol Res. 1983. - Vol. 123. - P. 247-256.

95. Mir M.A., Panganiban A.T. The hantavirus nucleocapsid protein recognizes specific features of the viral RNA panhandle and is altered in conformation upon RNA binding.//J Virology.-2005.-Vol. 79(3).-P. 1824-1835.

96. Mir M.A., Panganiban A.T. The bunyavirus nucleocapsid protein is a RNA chaperone: Possible roles in viral RNA panhandle formation and genome replication. // RNA. 2006. - Vol. 12. - P. 272-282.

97. Mohl B.P., Barr J.N. Investigating the specificity and stoichiometry of RNA binding by the nucleocapsid protein of Bunyamwera virus. // RNA. 2009. -Vol. 15(3).-P. 391-399.

98. Nakitare G.W., Elliott R.M. Expression of the Bunyamwera virus M genome segment and intracellular localization of Nsm. // J Virology. 1993. — Vol. 195.-P. 511-520.

99. Newton S.E., Short N.J., Dalgarno L. Bunyamwera virus replication in cultured Aedes albopictus (mosquito) cells: establishment of a persistent viral infection. // J Virology. 1981. - Vol. 38(3). - P. 1015-10124.

100. Novoa R., Calderita G., Arranz R. et al. Virus factories: associations of the cell organelles for viral replication and morphogenesis. // J Biol Cell. — 2005. -Vol. 97(2).-P. 147-172.

101. Novoa R., Calderita G., Cabezas P. et al. Key Golgi factors for structural and functional maturation of bunyamwera virus. // J Vilology. — 2005. — Vol. 79(17).-P. 10852-10863.

102. Obijeski J.F., Bishop D.H.L., Murphy F.A., Palmer E.L. Structural proteins of La Crosse virus. // J Virology. 1976. - Vol. 19(3). - P. 985-997.

103. Obijeski J.F., Murphy F.A. Bunyaviridae: recent biochemical developments. // J Gen Virol. 1977. - Vol. 37. - P. 1-14.

104. Ogino M., Yochimatsu K., Ebihara H. et al. Cell fusion activities of Hantaan virus envelope glycoproteins . // J Virology. — 2004. Vol. 78. - P. 10776-10782.

105. Parker M.D., Smith J.R., Dalrymple J.M. Rift Valley fever virus intracellular RNA: a functional analysis . In: Compans R., Bishop D. et al. Segmented negative strand viruses. Orlando E.L.: Academic Press. — 1984. — P. 21-28.

106. Parsonson I.M., McPhee D.A. Bunyavirus pathogenesis. // J Ad Virus Res. 1985. - Vol. 30. - P. 279-316.

107. Patel A.H., Elliott R.M. Characterization of Bunyamwera virus defective interfering particles. // J Gen Virol. 1992. - Vol. 73. - P. 389-396.

108. Patterson J.L., Kolakofsky D. Characterization of La Crosse virus small-genome segment transcripts. // J Virology. 1984. - Vol. 49. - P. 680-685.

109. Pekosz A., Phillips J., Pleasure D. et al. Induction of apoptosis by La Crosse virus infection and role of neuronal differentiation and human bcl-2 expression in its prevention. // J Virology. — 1996. Vol. 70(8). - P. 53295335.

110. Pennington T.H., Pringle C.R., McCrae M.A. Bunyamwera virus induced polypeptide synthesis. // J Virology. 1977. - Vol. 24. - P. 397-400.

111. Pesonen M., Ronnholm R., Kuismanen E. and Pettersson R.F. Characterization of the oligosaccharides of Inkoo virus envelope glycoproteins. // J Gen Virol. 1982. - Vol. 63. - P. 425-434.

112. Peters C.J., Lui C.T., Anderson Jr. C.W. et al. Pathogenesis of viral hemorrhagic fever: Rift Valley fever and Lassa fever contrasted. // J Rev Infect Dis. 1989. - Vol. 11(1 suppl 4). - P. 743-749.

113. Plassmeyer M.L., Soldan S.S., Stachelek K.M. et al. California serogroup Gc (Gl) glycoprotein is the principal determinant of pH-dependent cell fusion and entry. // Virol. 2005. - Vol. 338(1). - P. 121-132.

114. Porterfield J.C., Casals J., Chumakov M.P. et al. Bunyavirusea and Bunyaviridae. // Intervirology. 1975/1976. - P. 13-24.

115. Prehaud C., Lopez N., Blok M.J. et al. Analysis of the 3' terminal sequence recognized by the Rift Valley fever virus transcription complex in its ambisense S segment. // J Virology. 1997. - Vol. 227(1). - P. 189-197.

116. Puthenveedu M.A., Linstedt A.D. Subcompartmentalizing the Golgi apparatus. // J Curr Opin Cell Biol. 2005. - Vol. 17(4). - P. 369-375.

117. Raftery M.J., Kraus A.A., Ulrich R. et al. Hantavirus infection of dendritic cells. // J Virology. 2002. - Vol. 76(21). - P. 10724-10733.

118. Raju R., Kolakofsky D. The ends of La Crosse virus genome and antigenome RNAs within nucleocapsids are base paired. // J Virology. 1989. -Vol. 63(1).-P. 122-128.

119. Ravkov E.V., Compans R.W. Hantavirus nucleocapsid protein is expressed as a membrane-associated protein in the perinuclear region. // J Virology. — 2001.-Vol. 75.-P. 1808-1815.

120. Ravkov E.V., Nichol S.T., Compans R.W. Polarized entry and release in epithelial cell of Black Creek Canal. // J Virology. 1997. - Vol. 71(2). - P. 1147-1154.

121. Renkonen O., Kaariainen L., Pettersson R., Oker-Blom N. The phospholipid composition of Uukuniemi virus, a noncubical tick-borne arbovirus. // J Virology. 1972. - Vol. 50. - P. 899-901." 114 ;

122. Resende Rde O., de Haan P., Van de Vossen E. et al. Defective interfering LRNA segments of tomato spotted wilt virus retain both virus genome termini and have extensive internal deletions. // J Gen Virol. 1992. - Vol1. 73. - P. 2509-2516.

123. Rozhon E.J;, Gensemer P., Shope R.E., Bishops D.H.L. Attenuation; of virulence of a bunyavirus involving an L RNA defect and isolation of Lac/SSH/Lac and Lac/SSH/SSH reassortants. // J Virology. 1981. - Vol. 111.-P. 125-138.

124. Ruusala A., Persson R., Schmalijohn C.S. et al. Coexpression of the membrane glycoproteins G1 and G2 of Hantaan virus is required for targeting to the Golgi complex. // J Virology. 1992. - Vol. 186(1). - P. 53-64.

125. Sail A.A., Zanotto P.M., Zeller H;G. et ali Variability of the NS(s) protein among Rift Valley fever virus isolates. // J Gen Virol. 1997. - Vol. 78(Ptl 1). -P. 2853-2858.

126. Schmaljohn C.S., Hasty S.E., RasmussenL. et al. Hantaan virus replication: effects, of monensin, tunicamycin and endoglycosidases on the structural glycoproteins. // J Gen Virol. 1986. -Vol. 67. -P. 707-717.

127. Shi X., Elliott R.M. Analysis of N-linked glycosylation of hantaan virus glycoproteins and the role of oligosaccharide side chains in protein folding and intracellular trafficking. // J Vilology. 2004. - Vol. 78(10). P. 54145422.

128. Shi X., Elliott R.M. Golgi localization of Hantaan virus glycoproteins requires coexpression of G1 and G2. // J Virology. — 2002. — Vol. 300(1). P. 31-38.

129. Shi X., Lappin D.F., Elliott R.M. Mapping the Golgi targeting and retention signal of Bunyamwera virus glycoproteins. // J Virology. 2004. -Vol. 78(19).-P. 10793-10802.

130. Shope R.E., Rozhon E.J., Bishop D.H.L. Role of the middle-sized bunyavirus RNA segment in mouse virulence. // J Virology. 1981. - Vol. 114.-P. 273-276.

131. Simons J.F., Pettersson R.F. Host-derived 5' ends and overlapping complementary 3' ends of the two mRNAs transcribed from the ambisense S segment of Uukuniemi virus. // J Virology. 1991. - Vol. 65(9). - P. 47414748.

132. Smith J.F., Pifat D.Y. Morphogenesis of sandfly viruses (Bunyaviridae family). // J Virology. 1982. - Vol. 121(1). - P. 61-81.

133. Soldan S.S., Plassmeyer M.L., Matukonis M.K. et al. La Crosse virus nonstructural protein Nss counteracts the effects of short interfering RNA. // J Virology. 2005. - Vol. 79(1). - P. 234-244.

134. Spiropoulou C.F., Goldsmith C.S., Shoemaker T.R. et al. Sin Nombre virus glycoprotein trafficking. // J Virology. 2003. - Vol. 308(1). - P. 48-63.

135. Sundin D.R., Beaty B.J. Interference to oral superinfection of Aedes triseriatus infected with La Crosse virus. // Am J Trop Med Hyg. 1988. -Vol. 38. -P. 428-432.

136. Tischler N.D., Gonzalez A., Perez-Acle T. et al. Hantavirus Gc glycoprotein: evidence for a class II fusion protein. // J Gen Virol. 2005. -Vol. 86.-P. 2937-2947.

137. Turell M.J., Saluzzo J.F., Tammariello R.F., Smith J.F. Generation and transmission of Rift Valley fever viral reassortants by the mosquito Culex pipiens. // J Gen Virol. 1990. - Vol. 71. - P. 2307-2312.

138. Ulmanen I., Seppala P., Pettersson R.F. In vitro translation of Uukuniemi virus specific RNA: identification of a nonstructural protein and a precursor to the membrane glycoproteins. // J Virology. — 1981. — Vol. 37. — P. 72-79.

139. Ushijima H., Clerx-van Haaster C.M., Bishop D.H.L. Analyses of Patois group bunyaviruses and existence of viral coded nonstructural proteins induced in bunyavirus infected cells. // J Virology. — 1981. — Vol. 110. — P. 318-332.

140. Van Poelwijk F., Prins M. and Goldbach R. Completion of the impatiens necrotic spot virus genome sequence and genetic comparison of the L proteins within the family Bunyaviridae. // J Gen Virol. 1997. -Vol. 78. - P. 543546.

141. Von Bonsdorff C.H., Pettersson R.F. Surface structure of Uukuniemi virus. //J Virology.-1975.-Vol. 16(5). — P. 1296-1307.

142. Wagner R.J., de Jong C., Leung M.K., McLintock J., Iversen J.O. Isolation of California encephalitis virus from tundra mosquitoes. // Can J Microbiol. — 1975. Vol. 21(4). -P. 574-576.

143. Weber F., Dunn E., Bridgen A. and Elliott R.M. The Bunyamwera virus nonstructural protein Nss inhibits viral RNA synthesis in a minireplicon system. // J Virology. 2001. - Vol. 281. - P. 67-74.

144. Whitfield A.E., Ullman D.E., German T.L. Expression and characterization of a soluble form of tomato spotted wilt virus glycoprotein Gn. // Virol. — 2004. Vol. 78(23). - P. 13197-13206.

145. Yurikova Z., Hubalek Z., Holouzka J. et al. Hemagglutinationinhibiting anibodes against arboviruses of the families Togaviridae and Bunyaviridae in birds caught in southern Moravia, Czechoslovakia. // Folia Parasitol. 1987. -Vol. 34.-P. 281-284.

Информация о работе

Лаврентьев, Михаил Вячеславович
кандидата биологических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.03

Диссертация

Вирус Хатанга - новый представитель серогруппы Калифорнийского энцефалита - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы