Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вируса Батаи и создание тест-систем для диагностики этой инфекции

Терехин, Сергей Анатольевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вируса Батаи и создание тест-систем для диагностики этой инфекции
ВАК РФ 03.00.06, Вирусология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вируса Батаи и создание тест-систем для диагностики этой инфекции"

На правах рукописи

Терехин Сергей Анатольевич

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСА БАТАИ И СОЗДАНИЕ ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭТОЙ ИНФЕКЦИИ

03.00.06. - вирусология 03.00.03. - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

1 о ДЕК 2009

Москва, 2009 г.

003488823

Работа выполнена в НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Бутенко Александр Михайлович доктор биологических наук Гребенникова Татьяна Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Погодина Ванда Вацлавовна доктор биологических наук Забережный Алексей Дмитриевич

Ведущая организация:

ФГУН стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича

Защита состоится «21» декабря 2009 г. в 12.00 часов на заседании диссертационного Совета Д.001.020.01 при НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН (адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН

Автореферат разослан «_» ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, Доктор медицинских наук

Е.И.Бурцева

Актуальность проблемы

Арбовирусы - это экологическая группа вирусов, передающихся восприимчивым позвоночным через укусы кровососущих членистоногих: комаров, клещей, москитов, мошек и мокрецов. К этой группе тесно примыкают зоонозные вирусы, циркулирующие среди позвоночных животных, без участия кровососущих членистоногих. К ним относятся, в частности, возбудители ряда геморрагических лихорадок (Ласса, Марбург, Эбола, аргентинская, боливийская, венесуэльская, бразильская, ККГЛ, с почечным и лёгочным синдромом). Общее число вирусов, относящихся к этим категориям, составляет примерно 550. По крайней мере для 100 из них выявлена способность вызывать заболевания людей [Д.К. Львов , 2008].

Такие арбовирусные инфекции, как лихорадка денге, геморрагическая лихорадка денге, желтая лихорадка, восточный, западный, венесуэльский энцефаломиелита лошадей, энцефалиты - японский, клещевой, Сент-Луис, долины Муррея, Росло, Западного Нила, калифорнийский, лихорадки долины Рифт, москитные лихорадки, карельская лихорадка и другие - далеко не полный перечень опасных для человека арбовирусных инфекций, представляющих огромное значение для здравоохранения в эндемичных регионах мира.

Борьба, а часто и этнологическая расшифровка вспышек арбовирусных инфекций затрудняются огромным антигенным разнообразием возбудителей, массивностью эпидемических вспышек с охватом в короткий срок значительных групп населения, необходимостью лабораторного подтверждения диагноза, отсутствием специфических средств лечения, а нередко и профилактики.

На территории бывшего СССР выявлено 58 арбовирусов, относящихся к семействам Togaviridae, Flaviviridae, Bumaviridae, Reoviridae, Iridaviridae, Picornaviridae, Orthomyxoviridae. Многие из них известны как возбудители заболевания человека. Для других - патогенность для человека пока не выявлена, что отнюдь не означает отсутствия их потенциальной опасности.

Значительная часть из известных арбовирусных инфекций (включая лихорадку Батан) относится к категории малоизученных.

Вирус Батаи принадлежит к семейству Bunyaviridae, роду Orthobunyavints (который насчитывает более 140 вирусов) и антигенному комплексу Буньямвера, включающего не менее 20 представителей. Ареал вируса Батаи охватывает южные, юго-восточные и восточные регионы Азии, Западную, Центральную и Восточную Европу, Африку (Судан, Уганда) [Д.К. Львов , С.М. Клименко , С.Я. Гайдамович , 1989; N.W. Nashed , 1993]. Установлена циркуляция этого вируса в разных ландшафтных зонах Европейской и Азиатской территорий России [Д.К. Львов, 2008].

Актуальность настоящих исследований определяется: широким географическим распространением и высокой активностью циркуляции вируса Батаи на эндемичных территориях; выраженной патогенностью для человека; ограниченностью данных о его роли в патологии человека и животных; отсутствием диагностических тест-систем, доступных для использования в практических лабораториях и этиотропных средств лечения лихорадки Батаи; отсутствием достаточной информации по молекулярно-генетической и антигенной идентификации штаммов вируса Батаи и близкородственных вирусов, которая имеет прямое отношение к пониманию процессов эволюции рода Orthobunyavirus.

Цели и задачи исследования

Цели настоящего исследования:

молекулярно-биологическая и вирусологическая характеристика и генотипирование малоизученных штаммов вируса Батаи, создание комплексной системы специфической диагностики лихорадки Батаи, определение активности ряда коммерческих и экспериментальных химических соединений в отношении этого патогенного агента.

Для достижения поставленных целей были поставлены следующие задачи:

• определение частичных нуклеотидных последовательностей генов Gn (М-сегмент) и РНК-полимеразы (L-сегмент) штаммов вируса Батаи, циркулирующих в Юго-Восточной Азии (Малайзия), Чешской Республике, на Украине и в России;

• проведение филогенетического анализа штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов Orthobunyavirus\

• определение аминокислотных замен в антигенных эпитопах гликопротеина Gn и РНК-полимеразы у штаммов вируса Батаи различного происхождения;

• создание и характеристика оригинальных ОТ-ПЦР и ИФА тест-систем для диагностики лихорадки Батаи;

• определение чувствительности и специфичности ИФА-IgM и ИФА-IgG тест-систем при обследовании сывороток крови больных людей, доноров и домашних животных; использование этих тест-систем для серодиагностики лихорадки Батаи и проведения сероэпидемиологических исследований;

• изучение действия рибавирина, его производных (dRsata, Rsata) и ряда экспериментальных химических соединений (467, 452, Cl-Ara-A, dR-SK-452, DetAra-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A) на репродукцию вируса Батаи в опытах in vitro.

Научная новизна работы

1. Впервые определена нуклеотидная последовательность фрагментов сегмента M (513 и.о.) и сегмента L (501 н.о.) малоизученных штаммов вируса Батаи, выделенных в разные годы в России (Волгоградская область), на Западной Украине, в Чехословакии и Малайзии. На основании данных филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка сегмента M установлено, что исследованные штаммы группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры.

2. Установлены различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов гликопротеина Gn и протеина L у изученных штаммов.

3. Проведён сравнительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей сегментов M и L РНК штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов антигенного комплекса Буньямвера.

4. Впервые в России создана и охарактеризована специфическая тест-система ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи.

5. Разработаны и охарактеризованы экспериментальные ИФА тест-системы для выявления специфических антител классов IgM и IgG в сыворотках крови людей, IgG в сыворотках крови овец, а также антигенов вируса Батаи.

6. В опытах in vitro на модели вируса Батаи впервые проведено изучение противовирусной активности рибавирина, его производных и других экспериментальных химических соединений, синтезированных в Институте биоорганической химии РАН. Установлено, что рибавирин обладает высокой противовирусной активностью.

Практическая значимость работы

1. Созданная и охарактеризованная в процессе исследования специфическая тест-система ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи обладает достаточно высокой чувствительностью, позволяющей выявлять 12 БОЕ/мл. Она может быть рекомендована для использования в практических диагностических лабораториях.

2. Разработаны и охарактеризованы экспериментальные ИФА тест-систем для выявления специфических антител класса IgM и IgG в сыворотках крови людей, IgG в сыворотках крови овец, а также антигенов вируса Батаи. Техническая документация на данные тест-системы утверждена Учёным Советом НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН 11 мая 2009 г.

3. ИФА-IgM и ИФА-IgG системы были успешно использованы для специфической диагностики лихорадки Батан при совместной работе с вирусологической лабораторией Центра гигиены и эпидемиологии в Астраханской области, где в 2007 г. серологически было верифицировано 5 случаев этой малоизученной инфекции.

4. Установлена выраженная противовирусная активность рибавирииа в отношении вируса Батаи в опытах in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основании изучения нуклеотидной последовательности участка гена Gn (сегмента М РНК) штаммов вируса Батаи, выделенных в России, на Западной Украине, в Чехии и Малайзии и сравнения полученных результатов с информацией GenBank, установлено, что штаммы вируса Батан группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры. Сходная картина наблюдается при филогенетическом анализе данных по сегменту L. Однако в этом случае в пределах гомогенной европейской генетической группы у одного из западно-украинских штаммов (штамм 1548) выявлялось определённое отличие от другого украинского штамма (499), российского штамма 42 (из Волгоградской области) и чешского штамма Чалово.

2. Филогенетический анализ участка гена Gn различных штаммов вируса Батаи и других представителей рода Orthobunyavirus (серокомплекс Буньямвера) выявляет наиболее близкими к вирусу Батаи североамериканские штаммы Northway и Tensaw (гомология 77% и 79% соответственно). Другие представители рода Ortobunyavirus (серокомплекс Буньямвера) филогенетически достаточно удалены от вируса Батаи (гомологичность нуклеотидной последовательности составляет 25-56%).

3. Установлены различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов гликопротеина Gn и протеина L у изученных штаммов. Гомогенная европейская генетическая группа имеет существенные замены в аминокислотных последовательностях эпитопов I и IV в участке гена гликопротеина Gn.

4. Разработка чувствительной и специфической тест-системы ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи. Чувствительность диагностикума составила 12 БОЕ/мл.

5. Разработка и характеристика тест-систем ИФА для выявления антигена вируса Батаи и специфических антител классов М и G к вирусу Батан в сыворотках крови люден и класса G у овец. Чувствительность тест-системы для определения антигена вируса Батаи составила 100 БОЕ/мл.

6. В результате использования разработанных ИФА-IgM и ИФА-IgG систем проведено обследование сывороток крови больных лихорадочными заболеваниями и здоровых жителей Южного региона России и сывороток овец на антитела к вирусу Батаи. Серологически верифицировано 5 случаев лихорадки Батаи в Астраханской области. Специфические антитела у овец обнаружены в Астраханской области (12,5%) и Ставропольском крае (5,2%).

7. Исследование противовирусной активности швейцарского препарата «рибавирин». Данный препарат эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса Батаи в культуре клеток Vero Es. Индекс противовирусной активности рибавирииа составил 2,8-3,0 lg ЦПД50 при концентрации 500 мкг/мл. Производные рибавирииа (dRsata, Rsata) и ряд экспериментальных химических соединений (467, 452, С1-Ага-А, dR-SK-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A) не обладают противовирусной активностью в отношении вируса Батаи.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены и рассмотрены на совместном заседании Отдела арбовирусов и апробационного совета НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН 30 сентября 2009г., и представлены на Международной конференции молодых учёных и

специалистов «Биотехнология: разработка и контроль препаратов - 2009», Киев, 23-26 сентября 2009 г., на IX международной конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке, Москва, 27-30 ноября, 2008 г. и на Международной конференции EUROMEDLAB, Innsbruck (Austria), 7-11 июня 2009 г.

Публикации

По результатам диссертации опубликовано 2 статьи в реферируемых научных журналах и 3 тезисов в сборниках конференции.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из Введения, Обзора литературы, 4 глав Собственных исследований, Обсуждения результатов, Выводов и Списка литературы (19 отечественных, 97 зарубежных авторов). Объем работы составляет 97 страницу машинописного текста, иллюстрированного 11 таблицами и 14 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Материалы исследования. Вирусы. В работе использовано пять штаммов вируса Батаи из коллекции биологии и индикации арбовирусов Института вирусологии им. Д.И.Ивановского: прототипный штамм ММ 2222, Олыка 1548, Олыка 499, Чалово, 42, а также гетерологичные вирусы: Синдбис, Гета (Togaviridae), Западного Нила, жёлтой лихорадки, Денге II (Flaviviridae), Тягиня, Тоскана, Сицилийской и Неаполитанской лихорадок, Бужару (Bunyaviridae), Исфаган (Rhabdoviridae), Кемерово (Reoviridae).

Сыворотки крови больных лихорадочными заболеваниями, здоровых людей и домашних животных, ИАЖ и нормальные АЖ.

В вирусологических исследованиях использовали перевиваемые клеточные культуры Vero Е6. Для получения антигенов, иммуноглобулинов и наработки вируссодержашего материала проводили заражение беспородных новорожденных и взрослых белых мышей.

Препараты «рибавирин» (производства ICN Switzerland AG (Швейцария)), отечественный рибавирин и его производные и другие новые химические соединения, синтезированные в Институте биоорганической химии им. М.М. Шемякина и IO.A. Овчинникова РАН (И.Д. Константинова и др., 2008г.) были любезно предоставлены профессором Г.А. Галеговым (лаборатория химиотерапии вирусных инфекций НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН).

Непрямой метод флуоресцирующих антител (МФА). На фиксированные в ацетоне зараженные клетки (Vero Е6) наносили ИАЖ (специфическую или гетерологичные) и нормальную асцитную жидкость (АЖ) (в качестве контроля), и инкубировали при 37°С в течение 30 мин. После отмывки препараты обрабатывали антимышиными антителами, меченными изотиоционатфлюоресцином. Интенсивность флюоресценции оценивали, просматривая препараты под люминисцентным микроскопом ("Axioskop", США) с водно-иммерсионным объективом.

Метод бляшкообразования. Опыт проводили в 6-луночных планшетах ("Corning", США). В лунку вносили 100 мкл вируссодержащей суспензии, инкубировали в термостате в течение часа при 37°С и 5% содержании COi, периодически покачивая планшету. Затем в лунки добавляли 3 мл 1% агарового покрытия. Для приготовления 50 мл агарового покрытия брали 3 мл раствора Эрла, 1,6 мл 8,5% раствора ШгСОз, 18 мл раствора Игла, 1,6 мл эмбриональной телячьей сыворотки, 1,5 мл нейтрального красного и смешивали с 25 мл агара (0,7 г. агара на 25 мл НгО). В качестве контроля клеток использовали незараженную культуру под тем же покрытием. Число бляшек подсчитывали, начиная с третьего дня после заражения в течение 10 дней.

Выделение специфических IgG на протеин А-еефарозе. Иммуноглобулины выделяли по методу, предложенному фирмой Sigma. На хроматографическую колонку 7x1 см, содержащую сефарозу Ch-4B (Pharmacia, США), ковалентно связанную с

протеином А, наносили профильтрованные ИАЖ при pH 7,4. Изменяя pH элюирующего буфера до 3,0, собирали глобулиновую фракцию. Для длительного хранения IgG доводили pH раствора с глобулинами до 8,0.

Конъюгирование специфических IgG с пероксидазой хрена. Раствор, содержащий пероксидазу хрена R/Z-3,0 (Sigma, США) в концентрации 4 мг/мл и 0,02 М NalO^, диализовали против 0,001М натрий-ацетатного буфера pH 4,4 в течение 12-14 часов, затем добавляли натрий-карбонатный буфер pH 9,5 до конечной концентрации 0,004 М и IgG в концентрации 2 мг/мл. Реакционную смесь инкубировали 2 часа при комнатной температуре, непрерывно перемешивая. После этого в реакционную смесь добавляли свежеприготовленный раствор NaBH4 до концентрации 0,4 мг/мл, инкубировали 2 часа при 4°С, непрерывно перемешивая. Полученный конъюгат очищали на колонке 1,635 см с сефадексом G-200, собирая наиболее высокомолекулярную фракцию. Для стабилизации конъюгата добавляли бычий сывороточный альбумин до концентрации 1%, мертиолят (0,02%) или глицерин (50%).

Иммуноферментный анализ для выявления специфического антигена вируса Батаи, Лунки 96-луночных панелей («Биомедикап», Россия) сорбировали мышиными поликлональными антителами против вируса Батаи, разведенными карбонатным-бикарбонатным буфером (из расчета 1 мкг белка на лунку). Затем вносили мозговой антиген, разведенный в фосфатном буфере (pH 7,2), а после инкуба дни - мышиные поликлональные антитела против вируса Батаи, меченные пероксидазой хрена (Anderson et al., 1980, Olsson and Kaplan, 1980). Проявление реакции осуществляли добавлением в каждую лунку 0,1 мл субстрат-индикаторного раствора: 0,4 мг/мл тетраметилбензидина в 0,IM цитратно-фосфатном буфере рН=5,0 с добавлением 0,002 мкл/мл 3% перекиси водорода. Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП), измеряемой на фотометре (Flow, США) при длине волны 450 нм. В каждом опыте использовали нормальные контрольные антигены. Положительной считали реакцию, когда значение ОП450 исследуемого образца составляло не менее 0,300, при ОП450 в контрольных лунках не более 0,1.

Иммуноферментный анализ для выявления антител класса М и G. Выявление антител класса М. Лунки 96-луночных панелей («Биомедикал», Россия) сорбировали козьими анти-IgM антителами (Sigma, США), разведёнными карбонатным-бикарбонатным буфером. Затем вносили обследуемые сыворотки лихорадящих больных, после инкубации вносили мозговой антиген, затем - мышиные поликлональные антитела против вируса Батаи, меченные пероксидазой хрена.

Выявление антител класса G. Лунки 96-луночных панелей ((«Биомедикал», Россия) сорбировали мышиными поликлональными антителами (иммуноглобулинами) против вируса Батаи, разведёнными карбонатным-бикарбонатным буфером. Затем вносили мозговой антиген, разведённый в фосфатном буфере (pH 7,2), после инкубации вносили сыворотки людей, затем - мышиные анти-Ig G антитела, меченные пероксидазой хрена.

Выявление антител класса G в сыворотках овец. Лунки 96-луночных панелей («Биомедикал», Россия) сорбировали мышиными поликлональными антителами (иммуноглобулины) против вируса Батаи, разведёнными карбонатным-бикарбонатным буфером. Затем вносили мозговой антиген, разведённый в фосфатном буфере (pH 7,2), после инкубации - сыворотки овец. В реакции использовали конъюгат фирмы Sigma (США): ослиные антитела против иммуноглобулинов овец класса G, меченные пероксидазой хрена производства Sigma (США), кат. № А 3415. Рабочее разведение 1:2000.

Проявление реакции осуществляли добавлением в каждую лунку 0,1 мл субстрат-индикаторного раствора: 0,4 мг/мл тетраметилбензидина в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере pH 5,0 с добавлением 0,002 мкл/мл 3% перекиси водорода. Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП), измеряемой на фотометре (Flow, США) при длине волны 450 нм. В каждом опыте использовали нормальные (контрольные)

антигены. Положительной считали реакцию, когда значение ОП450 исследуемого образца составляло не менее 0,300, при ОП450 в контрольных лунках не более 0,1.

Реакция связывания комплемента. РСК ставили микрометодом на холоду по общепринятой методике [Е.Э.Мельникова, 1986 г.]. Тестируемые ИАЖ в разведении 1:10 прогревали при 56°С в течение 30 минут. Рабочее разведение антигена определяли по предварительному шахматному титрованию с ИАЖ к вирусу Батаи. Ингредиенты разливали в лунки в следующих объемах и последовательности: 0,025 мл АЖ, 0,025мл антигена в рабочем разведении, содержащим 4-8 антигенных единиц, 0,05мл комплемента (2 ед.). Панели встряхивали для перемешивания компонентов и оставляли при 4°С на 18 часов. Затем во все лунки добавляли по 0,05 мл гемолитической системы. После встряхивания панели инкубировали при 37°С. Учет реакции проводили после полного гемолиза в контрольных лунках с 2 единицами комплемента по 4-х крестовой системе.

Проведение ОТ-ПЦР. Выделение РНК вируса Батаи из вируссодержащих субстратов (культуральная жидкость или мозг инфицированных мышей) проводили с использованием «Тризола» (Trizol Reagent, Life Technology, США) по методике производителя, а также по методу с использованием неорганического сорбента [Гребенникова, 1997].

ОТ-ПЦР на матрице РНК вируса Батаи проводили в конечном объеме 25 мкл в тонкостенных пробирках объемом 1,5 мкл («Eppendorf», США). Реакционная смесь содержала 5 мкл нуклеиновых кислот, по 10 пмоль каждого праймера, 10 пмоль зонда, 0,25 мМ каждого dNTP, 1,25 ед. Taq-полимеразы, 25 ед. MMLV-ревертазы, 20 ед. ингибитора РНКаз, 10 мМ Tris-HCl (pH 9,0), 50 мМ KCl, 0,1% Triton Х-100, 1,5 мМ MgCl2.

ОТ-ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия).

Специфические олигонуклеотиды для обнаружения РНК вируса Батаи были комплементарны консенсусной последовательности гена, кодирующего белок Gn и гена РНК-иолимеразы. Консенсусная последовательность была построена на основе анализа последовательностей генов референтных штаммов, представленных в базе данных GenBank, с помощью программы Oligo 4,0

Таблица 1

Праймеры для обнаружения РНК вируса Батаи

Название праймера Последовательность олигонуклеотидов (5' - 3')

Для обнаружения РНК вируса Батаи методом ОТ-ПЦР (М-сегмент)

M1UP ATT GGA ITA TAA AGG ACT G

Ml LOW TAG AAG TAT GCG ATT GGC

Для обнаружения РНК вируса Батаи методом ОТ-ПЦР (L-сегмент)

L1UP GGA TGA TCA GAT GTA TG

LI LOW CAT С TT ACG TAA CTC AA

Для проведения ОТ-ПЦР (амплификация М-сегмента) использовали следующие температурные режимы: 50°С - 50 минут, 94 С - 5 минут (стадия обратной транскрипции) и 30 циклов амплификации: 94°С - 30 сек, 47°С - 30 сек, 72°С - 30 сек.

Для проведения ОТ-ПЦР (амплификация Ь-сегмента) использовали следующие температурные режимы: 50°С - 50 минут, 94°С - 5 минут (стадия обратной транскрипции) и 30 циклов амплификации: 94°С - 30 сек, 45°С - 30 сек, 72°С - 30 сек.

Анализ фрагментов ДНК после ПЦР проводили методом электрофореза в агарозном геле. Гели фотографировали и анализировали, используя трансиллюминатор, в ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм.

Филогенетический анализ. Последовательности олигонуклеотидных праймеров для секвенирования подбирали с помощью программы О^о 4,0 (США) с использованием нуклеотидных последовательностей различных штаммов вируса Батаи, размещенных в

базе данных GenBank. Определение первичной нуклеотидной последовательности осуществляли на автоматическом секвенаторе ABI PRISM 3130 (Applied Biosystems, США). Для выраыннвания последовательностей использовали пакет программ DNASTAR V.3.12 (Lasergene, США). Построение филогенетического дерева осуществляли па основе алгоритма «ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным ресэмплингом в программе MEGA 3.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Филогенетический анализ штаммов вируса Батан, выделенных в России, на Украине и в Чехословакии

Для определения частичной первичной нуклеотидной последовательности M и L-сегментов штаммов вируса Батан, выделенных в России, на Украине л в Чехословакии, были подобраны пары олигонуклеотидных праймеров, с помощью которых амплнфицировалн фрагменты генов Gn и РНК-полимеразы, размером 513 и 501 нуклеотидных оснований.

После секвенирования были определены частичные нуклеотидные последовательности.

На основании изучения нуклеотидной последовательности участка сегмента M РНК (ген Gn) штаммов вируса Батаи, выделенных в России, на Западной Украине, в Чехословакии, Малайзии и сравнения полученных результатов с информацией GenBank, установлено, что штаммы вируса Батаи группируются по географическому признаку в азиатский и европейский кластеры (рис. 1).

Результаты филогенетического анализа показали, что штамм 42 (изолирован из комаров в Волгоградской области в 2003 г.) наиболее близок к штаммам Олыка 1548, Олыка 499 (изолированы из комаров на территории Западной Украины в 1971 г.) и Чалоао (изолирован на территории Чехии в 1984 г.). Несмотря на географическое различие и на дистанцию во времени изоляции, нуклеотидные последовательности выбранного участка гена Gn этих штаммов оказались гомологичными на 98%.

Chitoor (Индия) ON7BQ1 (Япония)

2222 (Малайзия) ON1E94(Япония) Ngarí (Судан) UgMP-6830 (Уганда) 499(Украина) Calovo (Чехия) 1548 (Украина 42(Россия) Tensaw (США) Northway (США) llesha (Нигерия) Anhembl (Бразилия) Laeo (нет данных) Bozo (нетданных)

15 10

NudeoHe Suis Huions (ri 00)

Рис. 1. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основании анализа нуклеотидных последовательностей участка гена йп сегмента М РНК штаммов вируса Батаи, выделенных в России, на Западной Украине, Чехословакии и Малайзии и других представителей рода ОпкЬипут'ти.

Филогенетический анализ участка гена Gn различных штаммов Батаи и других представителей рода Orthobunvavirus (серокомплекс Буньямвера) выявил, что наиболее близкими к вирусу Батаи являются североамериканские штаммы Northway и Tensaw. Это доказывает эволюционные и географические связи между этими вирусами. Суданский штамм KV-141 вируса Нгари, выделенный от больного человека, является реассортантом между вирусами Буньямвера (по сегментам S и L) и вирусом Батаи (по сегменту М), что было установлено ранее другими исследователями [S.R. Gerrard, L. Li, A.D. Barret, S.T. Nichol, 2004]. Вирус Ilesha является самостоятельным вирусом, но очень близким к вирусу Батаи.

Сходная картина наблюдается при филогенетическом анализе данных по сегменту L. Однако в этом случае в пределах гомогенной европейской генетической группы у одного из западно-украинских штаммов (штамм 1548) выявлялось определённое отличие (71% гомологии) от другого украинского штамма (499), российского штамма 42 (из Волгоградской области) и чешского штамма Чалово (рис. 2). Штаммы Олыка 499, Чалово и 42 оказались гомологичными на 97%. Процент гомологии между штаммами вируса Батаи из Японии и прототипным ММ2222 из Малайзии составил 96%.

J— 499 (Украина)

_'— Calovo (Чехия)

--— 42 (Россия)

- 1548(Украина)

I- 2222 (Малайаия)

_"I- ON1E94 (Япония)

- ON7BD1 (Япония)

__Bunyamwera (Уганда)

-Ilesha (Нигерия)

- Kalri (Тринидад)

38 25 28 15 10 5 О Nudeofede Substibfions (xlOO)

Рис. 2. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основании анализа нуклеотидных последовательностей участка сегмента L РНК штаммов вируса Батаи, выделенных в России, на Западной Украине, Чехословакии и Малайзии и других представителей рода Orthbunyavirits.

Определение различий в антнгениых детерминантах гликопротеина Gn и РНК-полимеразы у штаммов вируса Батаи

Проведено определение различий в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов поверхностного гликопротеина Gn у близких штаммов вируса Батаи. В пределах гликопротеина Gn находятся 4 антигенных детерминанты. Эпитопы I, II и IV являются мишенью для вируснейтрализующих антител, а с эпитопом III взаимодействуют антитела, обладающие антигемагглютинирующей активностью. Эпитопы I, II и III являются

линейными, а эпитоп IV - конформационный. Эпитопы 1 и IV частично перекрываются [Keegan and Collett, 1986].

Аминокислотная последовательность поверхностного гликопротеина Gn европейских штаммов вируса Батаи является достаточно консервативной (рис. 3).

IFPWYHSPRNNGNFNLSKYRAYNYNKFDTAHFYLD -1-1-1-

110

120

130

140

IFPWYHSPRNNGNFDLSKYRAYNYNKFDTAYFYLD Штамм 42 IFPWYHSPRNNGNi^SKYRAYNYNKFDTAHFY^) Штамм 499 IFPWYHANNGNFNLSKYRAYNYNKFDTAHFYLD Штамм 1548 IFPWYHqS^NNGNFNLSKYRAYNYNKFDTAHFYLD Штамм CalOTO

Рис. 3. Аминокислотные последовательности поверхностного гликопротеина Gn штаммов вируса Батаи.

У штамма Чалово в эпитопе I в положении 114 пролин заменён на серии. У российского штамма 42 в эпитопе I в положении 121 вместо аспарагина находится аспарагиновая кислота, а в положении 137 тирозин вместо гистидина. Некоторое отличие имеется у штамма Олыка 499: в положении 140 лейцин заменён на гистидин. Данные замены являются существенными, так как замещающие аминокислоты обладают разными зарядами и имеют разные по полярности радикалы. Это может изменять конформацию эпитопов и влиять на свойства штамма.

Несмотря на некоторое различие в нуклеотидной последовательности европейских штаммов вируса Батаи по гену гликопротеина Gn, аминокислотные последовательности секвенированного участка L сегмента штаммов вируса Батаи оказалась очень гомогенной (рис. 4).

ТЫЬР1МЕЗЬС1РТША11ЕАЫРЬТУ0ЬТ11СЕЫРКЕКУРЫ1РЬ01ЛЗРТКР -1-1-1-1-1—

100 110 120 130 140

ТГДЬР1МЕЗЬС1РТЕНА1ШАЫРЬТУдьТПСЕЫЕКЕКУРЫ1РЬ0ЬОгТКР Штамм 42

ТЫЬР1МЕ5Ш1РТША1тА№ЬТУ0ЬТПСЕЫЕКЕКУРЫ1РЬ0ШРГКЕ Штамм 499

ТЫЬР1МЕ5Ь61Р^^АГОгАдаЬТУдьТ11</Акш?ЕКУРЩРЬОШЕТКЕ Штамм Са1оуо

ТЬ1ЬР1МЕ5ЬС1Р,те|?А11КАЫРЬТУ0ЬТ11^К]:Ь'ЕЕКУРЫГРЪ0ЬОЕТКР Штамм 1548

Рис. 4. Аминокислотные последовательности участка гена РНК-полимеразы (Ь сегмент) штаммов вируса Батаи.

У штамма Олыка 1548 в положении 105 глутаминовая кислота заменена на лизин. Позиция 123 у данных штаммов является достаточно гетерогенной: у двух штаммов (42 и

Олыка 499) в этой позиции находится глутаминовая кислота; у штамма Чалово в позиции 123 находится аланин, а у штамма Олыка 1548 - лизин.

Представляется, что указанные замены являются также существенными, поскольку радикалы аминокислот имеют разный заряд и полярность. Однако малочисленность замен, по-видимому, не изменяет свойств и функций белка.

Разработка тест-систем ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи

Подбор праймеров, оптимизация условий проведения ПЦР

Тест-система на основе ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи была разработана на базе лаборатории молекулярной диагностики ГУ НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН.

Олигонуклеотидные праймеры для проведения ОТ-ПЦР были подобраны на основе сравнительного анализа последовательностей генома следующих штаммов вируса Батаи: ММ 2222, ON-7/B/Ol, ON-l/E/94, UgMP 6830, Chittor Ю 20217. Праймеры были комплементарны последовательности гена гликопротеина Gn вируса Батаи и амплифицировали фрагмент ДНК длиной 513 пар нуклеотидов (п.н.).

Подбор олигонуклеотидных праймеров для тест-системы ОТ-ПЦР не представлял трудностей, так как последовательности генов гликопротеина Gn представленных штаммов отличались высокой консервативностью.

В результате были подобраны олигонуклеотиды со сходными температурами плавления. Температура плавления праймеров различалась не более чем на 1°С. Температуру отжига праймеров вычисляли по упрощенной формуле: (4GC+2AT)-5°C, где АТ - суммарное содержание нуклеотидов А и Т, GC - суммарное содержание нуклеотидов G и С в праймере. Расчетная температура отжига составила 47 С. При подборе пар праймеров особое внимание обращали на то, чтобы последние 3-4 нуклеотида на З'-конце праймера были комплементарны консервативной области генома вируса.

Определение специфичности разработанной тест-системы ОТ-ПЦР с использованием

гетерологичных вирусов Подобранная пара праймеров обеспечивает синтез фрагмента G-гена (513 п.н.) всех изученных нами штаммов вируса Батаи. Специфичность выбранных праймеров была проверена при использовании в ОТ-ПЦР гетерологичных вирусов: Синдбис, Гета (Togaviridaé), Западного Нила, жёлтой лихорадки, Денге II (Ftaviviridae), Тягиня, Тоскана, сицилийской и неаполитанской лихорадок, Бужару (Bunyaviridae), Исфаган (Rhabdoviridae), Кемерово (Reoviridae).

Для выделения РНК этих вирусов использовали мозг инфицированных н.б.м. Все пробы, содержащие гетерологичные вирусы, а также отрицательный контроль (мозговая суспензия незараженной мыши) оказались отрицательными. При обследовании проб мозга мышей, инфицированных разными штамамми вируса Батаи (42, Олыка 499, Олыка 1548, Чалово, ММ 2222), был получен положительный сигнал. Эти данные указывают на выраженную специфичность разработанной тест-системы.

Определение чувствительности разработанной тест-системы ОТ-ПЦР

Чувствительность ОТ-ПЦР тест-системы определяли в сравнении с данными титрования исходной вируссодержащей суспензии по феномену бляшкообразования, регистрируемому в инфицированных клетках Vero Е6 под агаровым покрытием.

Опыт проводили в четырех повторностях, титруя вирус Батаи по феномену бляшкообразования в десятикратных разведениях. Появление первых мелкоточечных бляшек (размером 0,5-1мм) в лунках с минимальным разведением вируса (10'3, 10"4, 10"5) наблюдали через 72 часа после заражения, а полная дегенерация клеток Vero Е6, зараженных разведением вируса 10"3, произошло на шестой день после инфицирования.

В лунках с разведениями вируса 10'3 и 10"4 из-за наличия большого количества бляшек и частичного слияния осуществить их подсчет было невозможно. При разведении вируса 10 5 наблюдали 12 бляшек. В лунках с разведением вируса 10"6 была обнаружена одна бляшка. В лунках с разведениями вируса Батаи 10'7 - 10'13 бляшки отсутствовали.

На анализ методом ОТ-ПЦР была взята проба культуральной жидкости с заранее установленным количеством бляшкообразующих единиц (БОЕ) в мл. Было показано, что нижний предел чувствительности ОТ-ПЦР составляет 12 БОЕ/мл, что соответствует разведению вируссодержащей мозговой суспензии 10"5.

Разработка и характеристика тест-систем ИФА для выявления антигена вируса Батаи. Ig М и IgG антител в сыворотках людей и lg G в сыворотках овен к вирусу

Батаи

Принципы использованных модификаций метода ИФА.

Использовали классические принципы постановки твердофазного ИФА [Т.Т.Нго, Г.Ленхофф, 1988].

ИФА для определения антигенов вируса Батаи.

Для обнаружения антигена применяли "сэндвич"-ИФА в соответствии с описанием E.A.Tkachenko et al (1989). Лунки планшетов сенсибилизировали в объёме 0,1 мл на лунку специфическим и нормальным иммуноглобулинами (0,5 мкг на лунку), разведенным в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) с рН 9,6. Планшеты инкубировали во влажной камере в течение 2 часов при 37° С или 18 часов при 4° С. Не адсорбированный иммуноглобулин удаляли встряхиванием. После этого лунки обрабатывали 1% раствором бычьего сывороточного альбумина (БСА) для блокирования "активных, свободных центров" на твердофазном носителе. Раствор БСА удаляли вытряхиванием.

Обследуемые сыворотки крови вносили параллельно в 2 лунки (каждая проба тестировалась с нормальным и специфическим иммуноглобулинами) в объеме 0,1 мл в разведениях 1:100-1:2560 на 1%растворе БСА и инкубировали в термостате в течении 1,52 часов при температуре 37° С. Затем планшеты отмывались трижды фосфатно-буферным раствором (ФСБ). На следующем этапе очищенные мышиные противовирусные IgG-антитела, меченные пероксидазой хрена (конъюгат), добавляли в рабочем разведении по 0,1 мл в каждую лунку с последующей инкубацией при температуре 37° С в течение часа. Затем планшеты отмывали 3 раза фосфатно-буферным раствором (ФСБ). После заключительного промывания устанавливали наличие в системе пероксидазной метки по изменению окраски внесенного в объеме 0,1 мл субстрат-индикаторного раствора.

Результаты реакции учитывали по величине оптической плотности (ОП), измеряемой на фотометре фирмы Flow при длине волны 450 нм. Положительными считали пробы, если значение ОП450 были не ниже 0,3, при значении ОП450В контрольных лунках не выше 0,1.

Положительными контролями служили сахарозо-ацетоновые антигены вируса Батаи, а отрицательными - нормальные антигены, приготовленные аналогичным методом.

Непрямой метод "сэндвич"-ИФА для определения специфических Ig G.

Для обнаружения антител класса G применяли "сэндвич"-ИФА в соответствии с описанием Meegan and LeDuc (1989). После выполнения этапов, включающих сенсибилизацию твердофазного носителя специфическими иммуноглобулинами и блокировку "свободных, активных центров", нормальные и специфические вирусные антигены разводили в 1% растворе БСА на ФСБ в соответствии с рабочими разведениями и вносили в лунки планшетов по 0,1 мл. После инкубации и промывки лунок добавляли по 0,1 мл обследуемых сывороток в разведениях 1:100-1:32000. Каждая сыворотка тестировалась параллельно со специфическим и нормальным антигенами.

На следующем этапе наслаивали пероксидазный конъюгат мышиных моноклонапьных антител против Ig G человека по 0,1 мл в рабочем разведении. Дальнейшие поцедуры, связанные с регистрацией реакции, рассмотрены выше.

Для обнаружения специфических антител класса G в сыворотках овец применяли описанную выше методику с использованием в качестве конъюгата ослиных антител против иммуноглобулинов овец класса G, меченные пероксидазой хрена производства Sigma (США), с рабочим разведением 1:2000.

Метод "захвата" иммуноглобулинов класса М (MAC-ELISA).

ИФА для выявления lg М антител в сыворотках людей проводили в соответствии с описанием Calisher et al (1986) и Meegan and LeDuc (1989). Лунки полистироловых планшетов сенсибилизировали в течение 18 часов при 4° С козьими антителами против ц-цепи иммуноглобулина (производство Sigma, США; рабочее разведение 1:600) человека в объеме 0,1 мл, разведенными в карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ). Этап блокирования "свободных, активных центров" проводили по стандартной схеме. Затем каждую пробу вносили в две лунки по 0,1 мл и инкубировали в течение 2 часов при температуре 37° С. После трёхкратной промывки в одну лунку из двух вносили нормальный антиген, в другую - антиген вируса Батаи, т.е. каждая сыворотка тестировалась параллельно со специфическим и нормальным антигенами. Инкубация происходила в течение часа при 37° С.

Далее вносили пероксидазный конъюгат мышиных антител против вируса Батаи в рабочем разведении, по 0,1 мл в лунку. Дальнейшие процедуры, связанные с регистрацией реакции, рассмотрены выше.

Получение антигенов

Антигены вируса Батаи (штамм ММ 2222) готовили из мозга н.б.м. методом сахарозо-ацетоновой экстракции с последующей инактивацией вируса 0,01% растворов -пропиолактона по методу Clark, Casals (1958). После обработки вируссодержащей мозговой суспензии ацетоном инфекционная активность вируса Батаи сохранялась.

После добавленияр -пропиолактона и проверки суспензий путём заражения н.б.м. через 7 дней экспозиции антигены оказались инактивированными.

Получение иммуноглобулинов и конъюгатов

Специфические к вирусу Батаи IgG получали из иммунных асцитных жидкостей мышей методом аффинной хроматографии при помощи протеин А-сефарозы. Для работы использовали ИАЖ с титрами специфических антител в РСК не ниже 1:320. Иммуноглобулины IgG к вирусу Батаи конъюгировали с пероксидазой хрена.

В реакции MAC-ELISA (выявление иммуноглобулинов класса М) использовали козьи антитела против иммуноглобулинов человека класса М производства фирмы Sigma (США), кат. номер 1.0759. Рабочее разведение 1:600 (рекомендация производителя).

Мышиные антитела против иммуноглобулинов человека класса G, меченные пероксидазой хрена (НИИ иммунологии, г.Москва) использовали при постановке реакции ИФА для выявления специфических антител класса G. Рабочее разведение 1:100.

В реакции ИФА для определения специфических антител класса Ig G к вирусу Батаи в сыворотках овец использовали конъюгат фирмы Sigma (США): ослиные антитела против иммуноглобулинов овец класса G, меченные пероксидазой хрена производства Sigma (США), кат. номер А 3415. Рабочее разведение 1:2000 (рекомендация производителя).

Выбор оптимальных рабочих разведений компонентов ИФА

На следующем этапе проводили определение оптимальных рабочих разведений полученных компонентов. Иммуноглобулины титровали, начиная с концентрации 8

мкг/лунку. Положительный сигнал регистрировался до концентрации иммуноглобулина 0,25 мкг/лунку. Исходя из этого, в дальнейшем для сорбирования на планшеты использовали иммуноглобулины в концентрации 0,5 мкг/лунку.

В результате титрования в ИФА специфического мозгового антигена было установлено, что он имеет специфическую активность в титре 1:102400 (Рис. 5).

Для контроля реакции использовали нормальные глобулины, полученные из асцитных жидкостей неиммунизнрованных мышей, а также нормальные антигены, приготовленные из мозга незаряженных мышей. В лунках планшеты с контрольными глобулинами и антигенами положительные сигналы не отмечались, что свидетельствовало о специфичности выявляемых результатов ИФА.

# //

обратные величины титра антигена

Рис. 5. Титрование антигена вируса Батаи методом ИФА.

Для дальнейшей работы в качестве рабочего разведения контрольного антигена использовали разведение 1:3200.

Для определения активности перокендазного конъюгата его титровали в разведениях от 1:100 до 1:12800 (Рис. 6).

« о

Н О

О В

и о

£ X рэ

12000 6400 3200 1600 000 400 200

Обратные величины титра конъюгата

100

Рис. 6. Титрование пероксидазного конъюгата иммуноглобулина к вирусу Батаи в ИФА.

Выбранное рабочее разведение конъюгата при этом составило 1:1600. При больших разведениях значения оптической плотности в лунках с другими специфическими реагентами снижались.

Определение специфичности и чувствительности метода ИФА для выявления антигенов вируса Батаи

Для исследования специфичности метода использовали мозговые суспензии и сахарозо-ацетоновые антигены вирусов рода ОмЬоЫтутти из группы Буньямвера (Буньямвера, Илеша, Анхемби), а также сахарозо-ацетоновые антигены вирусов клещевого энцефалита, Западного Нила (семейство F/йv/v/r/í/ae) и нормальный антиген, полученный из мозга незараженных мышей, а также положительный контроль в виде мозгового антигена вируса Батаи.

Было показано, что иммуноглобулины к вирусу Батаи не взаимодействовали с антигенами вирусов серокомплекса Буньямвера, вирусов клещевого энцефалита, Западного Нила и нормальным антигеном, что свидетельствует о специфичности метода и специфичности компонентов, используемых в реакции.

Для определения чувствительности метода ИФА для выявления антигенов вируса Батаи проводили тестирование той же вируссодержащей мозговой суспензии, которая была использована при титровании вируса методом бляшек. Реакцию проводили параллельно на планшетах с сорбированным специфическим иммуноглобулином и контрольным глобулином, полученным из асцитных жидкостей нормальных, неиммунизированных мышей. В качестве положительного контроля использовали мозговой антиген вируса Батаи, в качестве отрицательного - антиген из мозга незараженных мышей. Антиген и «нормальную» мозговую суспензию титровали в десятикратных разведениях.

Наличие положительного сигнала было зарегистрировано в тех лунках, которые содержали вируссодержашие мозговые суспензии в разведениях 10'2 - 10"3. При более высоких разведениях антиген вируса Батаи не выявлялся. В планшете с сорбированным контрольным глобулином не было обнаружено ни одной положительной пробы.

Из результатов реакции бляшкообразования следует, что в мозговой суспензии в разведении 10"3 содержится 103 БОЕ/мл. Исходя из того, что в реакции было использовано 100 мкл суспензии, минимальное количество вирусных частиц, которое может быть определено с помошью данного метода в исследуемых образцах составляет 100 БОЕ/мл.

Определение специфичности н чувствительности метода ИФА для выявления антител ^М и ^С к вирусу Батаи

Специфичность и чувствительность методов ИФА для определения антител оценивали тестированием 1274 образцов сывороток крови жителей Астраханской, Ростовской областей и Краснодарского края на присутствие специфических иммуноглобулинов ^М и а также тестирование 303 сывороток овец на присутствие специфических антител класса О к вирусу Батаи.

С помощью созданной ИФА-^М системы к вирусу Батаи удалось обнаружить специфические антитела класса М в титре 1:32000 в сыворотке крови лихорадящей больной из Астраханской области, а в системе ИФА-^й - антитела класса в в титре 1:12800. С использованием ИФА-^й для детекции антител в сыворотках овец были выявлены 4 положительные сыворотки в Астраханской области с титрами от 1:400 до 1:1600 и 12 положительных сывороток в Ставропольском крае с титрами от 1:200 до 1:800.

Малочисленность находок наличия М и ^ й антител к вирусу Батаи среди обследованных сывороток больных и доноров, а также ^ в антител к вирусу Батаи у овец косвенно указывает на специфичность данных тест-систем.

Более полная характеристика чувствительности разработанных нами ИФА-^М и ИФЛ-^С тест-систем для диагностики лихорадки Батаи могут быть получены в дальнейшей работе с использованием значительного количества ^ М и ^ б позитивных сывороток.

Серологическое обследование больных лихорадочными заболеваниями неясной этиологии и здоровых жителей Южного региона России на антитела к вирусу Батаи.

Сыворотки людей, больных острыми лихорадочными заболеваниями неясной этиологии, и здоровых жителей Астраханской, Ростовской областей и Краснодарского края были собраны в 2005-2008 гг. и любезно предоставлены Астраханским Центром гигиены и эпидемиологии, Астраханской областной инфекционной клинической больницей, Астраханской противочумной станцией, Причерноморской противочумной станцией и Ростовским Центром гигиены и эпидемиологии.

В тест-системах ИФА-^М и ИФА-^О на антитела к вирусу Батаи были обследованы сыворотки крови 134 здоровых жителей (доноров) и 1140 сывороток, взятых у 1133 больных острыми лихорадочными заболеваниями (сыворотки нескольких больных были парными).

Результаты обследования 80 сывороток крови больных и здоровых людей из Ростовской области оказались отрицательными.

Все обследованные сыворотки крови доноров (109 проб) из Краснодарского края и сыворотки больных людей из Краснодарского края (333 проб) и Астраханской области (739 проб) оказались отрицательными.

С использованием предоставленных нами ИФА-^М тест-систем в вирусологической лаборатории ЦГиЭ в Астраханской области было верифицировано 5 случаев лихорадки Батаи (Табл. 2).

Таблица 2

Данные о больных лихорадкой Батаи в Астраханской области в 2007 г .

Больные Дата Территории Дата взятия Титр Ig М исход

(возраст) заболевания крови антител

С.Р.(75 лет) 17.07. Харабалинский район 27.07. 1:32 000 выписан 13.08.

К.М. (30 7.08. г. Астрахань 23.08. >1:800 выписан

лет) 24.08.

М.У. (59 лет) 28.07. Харабалинский район 28.07. 1:1600 выписан 13.08.

Т.Д. (32 11.08. г. Астрахань 21.08. 1:1600 выписан

года) 29.08.

Т.М. (18 23.07. г. Астрахань 16.08. >1:800 Скончался

лет) 1.09.

- Выражаем глубокую благодарность зам. главного врача Областной инфекционной больницы г.Астрахани Т.Е.Аршба и заведующей вирусологической лабораторией ЦГиЭ А.Р.Азарян за предоставление материалов по этим случаям.

Больная С.Р., 75 лет, заболела остро - 17.07.2007 г. Поступила в Харабалинскую ЦРБ, где находилась в течение 6 дней. Затем была переведена в областную инфекционную больницу. Симптоматика: слабость, сухость во рту, тошнота, кашель, головная боль, ригидность мышц затылка, температура 38,6° С. Выписана из стационара 13.08.2007 г.

Больной K.M., 30 лет, дата заболевания - 7.08.2007 г. 10 августа каретой СП доставлен в областную инфекционную больницу г. Астрахани. Первоначальный диагноз - ОРВИ. Диагноз от 15.08. - ККГЛ. Состояние средней тяжести, озноб, температура 38°С, слабость,

головная боль, умеренная гиперемия нёбных дужек, задней стенки глотки, дыхание ослабленное, сухие хрипы. 14.08. - обильное носовое кровотечение. Выписан 24 августа 2007 г.

Больная М.У., 59 лет, дата заболевания - 28.07.2007 г. 31 августа обратилась к участковому врачу. 4.08. доставлена в областную инфекционную больницу. Состояние средней тяжести, слабость, боли в мышцах, температура 37,5°С, головная боль. Выписана 15.08.

Больной Т.Д., 32 года, дата заболевания - 11.08.2007 г. 16 августа поступил в городскую клиническую больницу №3. 16 августа переведён в областную инфекционную больницу в реанимационное отделение. Состояние тяжелое, головная боль, головокружение, шаткость походки, температура 39°С. Симптом Кернинга положительный. Выписан 29.08.

Больной Т.М., 18 лет, дата заболевания - 23.07.2007 г. 26 августа поступил в ЦРБ. 31.07.2007 г. переведён в областную инфекционную больницу. Предварительный диагноз - вирусный менингит. Состояние тяжёлое, заболел остро, слабость, боли в мышцах, температура 39°С. 1 августа состояние ухудшилось, на вопросы отвечает не по существу, дезориентирован во времени и пространстве. Скончался 1.09.

Из Астрахани нами была получена сыворотка крови больной лихорадкой Батаи (С.Р.). Титр специфических антител класса М на 10 день заболевания в этой пробе составил 1:32 000. Антитела класса в отсутствовали. Результат обследования этой же пробы методом МФА оказался также положительным (рис. 7). Её титр в РСК титр составил 1:80. Сыворотка больной С.Р. была взята повторно в декабре 2007 г. через 5 месяцев после начала заболевания. Антитела класса М к вирусу Батаи в данной пробе отсутствовали, а титр антител класса в составил 1:12800.

Клетки, зараженные вирусом Батаи + сыворотка крови больного крымской геморрагической лихорадкой (контроль)

Рис. 7. Выявление антител к вирусу Батаи

Клетки, зараженные вирусом Батаи + сыворотка крови больной лихорадкой Батаи (С.Р.)

методом МФА

Обследование сывороток крови овец из Астраханской области и Ставропольского края на 1%С антитела к вирусу Батаи.

Число обследованных сывороток овец составило 303 (140 из Астраханской области и 163 из Ставропольского края). Сыворотки овец были получены из 6 районов Астраханской области (Харабалинский, Красноярский, Володарский, Приволжский, Наримановский, Камызякский) и 5 районов Ставропольского края (Нефтекумский, Курский, Благодарненский, Александровский, Степновский).

Были обнаружены 4 положительные сыворотки овец из Астраханской области (2,9%) -все из Харабалинского района, где процент положительных находок составил 12,5 % (4 положительные из 32 обследованных).

В Ставропольском крае специфические Ig G антитела к вирусу Батаи были выявлены у 12 из 163 обследованных овец с вариабельностью распределения положительных находок в разных районах от 0 до 57%.

Таким образом, были получены дополнительные доказательства подтверждающие циркуляцию вируса Батаи в Астраханской области и Ставропольском крае.

Изучение противовирусной активности рибавирина, его производных п других химических соединений на репродукцию вируса Батаи в опытах in vitro

Рибавирин — нуклеозидное производное - 1-|3-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид

В работе использовали рибавирин производства ICN Switzerland AG (Швейцария) и отечественный рибавирин, полученный группой исследователей в НИИ биоорганической химии РАН с использованием нового биотехнологического метода.

Для оценки противовирусного действия рибавирина использовали его концентрации, равные 500, 250, 125 и 62,5 мкг/мл. Разведения рибавирина, приготовленные на поддерживающей среде Игла, добавляли к клеткам Vero Еб, которые до и после заражения вирусом Батаи инкубировали в СО^-инкубаторе при 37°С. Заражение проводили вируссодержащей мозговой суспензией в разведениях от 10"5 до Ю'10.

В культуре клеток Vera Еб, инфицированных вирусом Батаи, рибавирин (ICN Switzerland AG) в концентрации 500 мкг/мл подавлял развитие ЦПД на 2,8 lg ЦПД50, снижая цитопатогенную активность с 7,8 до 5,0 lg ЦПД5о/0,1 мл. При концентрации препарата 250, 125 мкг/мл цитопатогенная активность вируса снижалась с 7,8 до 7,0 lg ЦПД50/0,1 мл. При концентрации рибавирина 62,5 мкг/мл снижения цитопатогенной активности вируса не происходило.

Отечественный рибавирин также оказывал выраженное противовирусное действие. В концентрации 500 мкг/мл подавлял развитие ЦПД на 3,0 lg ЦПД50, снижая цитопатогенную активность с 8,0 до 5,0 lg ЦПД50/О,I мл.

Снижение инфекционного титра вируса Батаи в присутствии гомологичной ИАЖ (индекс нейтрализации) равнялся 3,0 lg ЦПД50.

Отсутствие ЦПД в незараженной клеточной культуре (контроль), к которой был добавлен рибавирин во всех четырёх концентрациях, свидетельствует о том, что этот препарат не токсичен для клеток.

В следующем опыте было установлено, что рибавирин, внесённый за час до контакта клеток с вирусом Батаи, также как через 18 часов после инфицирования монослоя не оказывал защитного действия. Хотя оказывал выраженный противовирусный эффект спустя 2, 4 и 6 часов после заражения, снижая цитопатогенную активность, соответственно, на 2,0; 2,5 и 2,5 lg ЦПД5()(Табл. 3).

Таким образом, было показано, что препарат «рибавирин», активно подавляет развитие ЦПД в культуре клеток Vero Еб.

Для исследования противовирусного действия профессором Г.А. Галеговым были предоставлены девять препаратов - производные рибавирина (dRsata, Rsata) и новые экспериментальные химические соединения (467, 452, Cl-Ara-A, dR-SK.-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A). В опыте использовали такие же, как и в опыте с рибавирином, разведения препаратов (500, 250, 125 и 62,5 мкг/мл). Для контроля часть лунок планшеты с зараженным монослоем клеток Vero Еб инкубировали с рибавирином. Точно так же, как и в предыдущем опыте, оставляли контроль клеток (незараженные клетки) и зараженные клетки без добавления препаратов.

Таблица 3.

Определение активности рибавирина в динамике внесения препарата в опытах in vitro на

модели вируса Батаи

Время внесения препарата до и после заражения клеток Vero Ег, Титр вируса (в lg ЦПД5о/0,1 мл) в присутствии рибавирина Контрольное титрование вируса Батаи

За час 7,5

Через 2 часа 6,0

Через 4 часа 5,5 8,0

Через 6 часов 5,5

Через 18 часов 8,0

Результаты опыта показали, что производные рибавирина (dRSata, RSata,) и экспериментальные химические соединения (467, 452) не проявляют противовирусной активности даже при максимальной концентрации (Табл. 4). Химические соединения С1-Ага-А, dR-SK-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A оказались токсичными для клеток Vero Ее,, поэтому оценить их возможную активность в отношении вируса Батан не представилось возможным.

Таблица 4.

Определение активности производных рибавирина и новых экспериментальных химиопрепаратов в опытах in vitro на модели вируса Батаи.

Вирус

Препарат

Титр вируса (в ^ ЦПД50/0,1 мл) в

присутствии препарата в соответствующих концентрациях (в м кг/мл)

Контрольное титрование вируса

Индекс нейтрализации

вирусов с гомологичной ИАЖ

IS ЦПДя.

Батаи

467

500/8.5 250/8.0 125/8.0

62.5/8.5

dRsata

500/8.0 250/7.5 125/8.0 62.5/7.5

Rsata

500/7.5 250/8.0 125/7,5 62,5/7,5

452

500/8.0 250/8.5 125/7.5 62.5/7.5

Cl-Ara-A

dR-SK-452

Det-Ara-A

OH-Ara-A

Ome-Ara-A

3,0

ВЫВОДЫ

1. На основании филогенетического анализа участка гена Оп сегмента М РНК штаммов вируса Батаи, выделенных в России, на Западной Украине, в Чехии и Малайзии установлено, что штаммы вируса Батаи группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры.

2. При филогенетическом анализе данных по сегменту Ь в пределах гомогенной европейской генетической группы штаммы вируса Батаи у одного из западно-украинских штаммов (штамм 1548) обнаружено определённое отличие от другого украинского штамма (штамм 499), российского (42) и чешского (Чалово) штаммов.

3. Обнаружены аминокислотные замены в участках генов Gn и L-полимеразы у исследуемых штаммов вируса Батан. Участок гена РНК-полимеразы оказался достаточно консервативным; ген Gn является вариабельным.

4. С использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров создана высокоспецифнчная тест-система на основе ОТ-ПЦР для детекции РНК вируса Батаи. Её специфическая чувствительность составляет 12 БОЕ/мл.

5. Разработаны и охарактеризованы специфичные и чувствительные тест-системы ИФА для обнаружения антигенов вируса Батаи, антител класса М и G в сыворотках людей и антител класса G в сыворотках овец. Чувствительность ИФА тест-системы для обнаружения антигенов вируса Батан составила 100 БОЕ/мл.

6. В результате проведения серодиагностическнх и сероэпидемиологических исследований с использованием ИФА-IgM и ИФА-IgG тест-систем верифицировано 5 случаев лихорадки Батаи у жителей Астраханской области. Специфические IgG антитела обнаружены у овец в Астраханской области (2,9%) и Ставропольском крае (5,2%)

7. В опытах in viíro на модели вируса Батаи установлена выраженная противовирусная активность швейцарского препарата «рибавирин» и отечественного рибавириана. Индексы противовирусной активности варьируют от 0,8 ^ЦЩЬо (при концентрациях препарата 250-125 мкг/мл) до 3,0 1§ЦПДзи (при концентрации 500 мкг/мл). Другие тестированные экспериментальные химиопрепараты (467, dRsata, Rsata, 452) не обладают противовирусной активностью в отношении вируса Батаи даже при максимальной концентрации.

Список работ по теме диссертации

1) С.А.Терехнн, Т.В.Гребенникова, Н.В.Хуторецкая, А.М. Бутенко Филогенетический анализ штаммов вируса Батаи, выделенных из комаров в Волгоградской области, на Западной Украине и Чешской Республике, // Молекулярная генетика, микробиология, вирусология - 2010 г. - №1. - в печати.

2) С.А.Терехин, А.М.Бутенко, Т.В.Гребенникова Молекулярно-генетический анализ вирусов Батаи, изолированных от комаров в Волгоградской области и на территории Западной Украины // IX международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке». - Москва. - 27-30 ноября 2008г. - с. 268.

3) И.С.Клименко, А.М.Бутенко, В.Ф.Ларичев, С.А.Терехин Результаты обследования здоровых жителей южного региона России и лихорадящих больных на антитела к вирусам москитных лихорадок // Медицинская паразитология и паразитарные болезни-№4,2009-с. 11-14.

4) S.A.Terekhin, T.V.Grebennikova, A.M.Butenko The molecular-genetic analysis of the Batai virus strains, isolated from mosquitos in the Volgograd región, in the West Ukraine and in Czech Republik. - EUROMEDLAB, 2009 - Innsbruck-Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, June 2009, Vol. 47.No.Sl,p.S304-S310.

5) С.А.Терехин, И.С.Клименко, А.М.Бутенко, Г.А.Галегов, В.Ф.Ларичев Определение активности рибавирина в опытах in vitro на моделях вирусов Батан и Тоскана (семейство Bunyaviridae) - Материалы первой международной конференции молодых учёных и специалистов "Биотехнология: разработка и контроль препаратов -2009", Киев, 23-26 сентября 2009

Заказ № 99-а/11/09 Подписано в печать 17.11.2009 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; е-таИ:info@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Терехин, Сергей Анатольевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.~.б

Актуальность проблемы.

Цели и задачи исследования.

Научная новизна работы.

Практическая значимость работы.

Основные положения, выносимые на защиту.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Состав рода Orthobunya virus. Антигенная классификация. Таксономическое положение вируса Батаи в пределах супергруппы Буньямвера.

1.2. Морфология и морфогенез ортобуньявирусов.

1.3. молеьсулярно-биологическая характеристика вирусов

Orthobunya virus.

1.4. Эпидемиология лихорадки Батаи. Экология вируса-возбудителя.

1.4.1. История выделения вируса. Распространение.

1.4.2. Переносчики и позвоночные хозяева.

1.5. Взаимоотношение вируса Батаи с другими представителями рода Orthobunya virus.

1.6. Патогенность вируса для лабораторных животных.

1.7. Роль вируса Батаи в патологии человека.

1.8. Специфическая диагностика лихорадки Батаи.

1.8.1. Вирусологическая диагностика.

1.8.2. Серологическая диагностика.

1.8.3. Молекулярная диагностика.

1.9. Лечение и профилактика.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вируса Батаи и создание тест-систем для диагностики этой инфекции"

Арбовирусы - это экологическая группа вирусов, передающихся восприимчивым позвоночным через укусы кровососущих членистоногих: комаров, клещей, москитов, мошек и мокрецов. К этой группе тесно примыкают зоонозные вирусы, циркулирующие среди позвоночных животных, без участия кровососущих членистоногих. К ним относятся, в частности, возбудители ряда геморрагических лихорадок (Jlacca, Марбург, Эбола, аргентинская, боливийская, венесуэльская, бразильская, ККГЛ, с почечным и лёгочным синдромом). Общее число вирусов, относящихся к этим категориям, составляет примерно 550. Ио крайней мере для 100 из них выявлена способность вызывать заболевания людей

ЪЛП

Такие арбовирусные инфекции, как лихорадка денге, геморрагическая лихорадка денге, жёлтая, лихорадка, восточный, западный, венесуэльский энцефаломиелиты лошадей, энцефалиты - японский, клещевой, Сент-Луис, долины Муррея, Росио, Западного Нила, калифорнийский, лихорадки долины Рифт, москитные лихорадки, карельская лихорадка и-другие — далеко не полный перечень опасных для человека арбовирусных инфекций, представляющих огромное значение для здравоохранения в эндемичных регионах мира.

Борьба, а часто и этиологическая расшифровка вспышек арбовирусных инфекций затрудняются огромным антигенным разнообразием возбудителей, массивностью эпидемических вспышек с охватом в короткий срок значительных групп населения, необходимостью лабораторного подтверждения диагноза, отсутствием специфических средств лечения, а нередко и профилактики.

На территории бывшего СССР выявлено 58 арбовирусов, относящихся к семействам Togaviridae, Flaviviridae, Bunyaviridae, Reoviridae, Iridaviridae, Picornaviridae, Orthomyxoviridae. Многие из них известны как возбудители заболеваний человека. Для других - патогенность для человека пока не выявлена, что отнюдь не означает отсутствия их потенциальной опасности.

Значительная часть из известных арбовирусных инфекций (включая лихорадку Батаи) относится к категории малоизученных.

Вирус Батаи принадлежит к семейству Випуачт<1ае, роду ОнкоЪипусыгтх (который насчитывает более 140 вирусов) и антигенному комплексу Буньямвера, включающего не менее 20 представителей. Ареал вируса Батаи охватывает южные, юго-восточные и восточные регионы Азии, Западную, Центральную и Восточную Европу, Африку (Судан, Уганда) [2]. Установлена циркуляция этого вируса в разных ландшафтных зонах Европейской и Азиатской территорий России [2,12].

Цели и задачи исследования

Цели настоящего исследования: молекулярно-биологическая и вирусологическая характеристика и генотипирование малоизученных штаммов вируса Батаи, создание комплексной системы специфической диагностики лихорадки Батаи, определение активности ряда коммерческих и экспериментальных химических соединений в отношении этого патогенного агента.

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи: • определение частичных нуклеотидных последовательностей генов вп (М-сегмент) и РНК-полимеразы (Ь-сегмент) штаммов вируса Батаи, циркулирующих в Юго-Восточной Азии (Малайзия), Чешской Республике, на Украине и в России;

• проведение филогенетического анализа штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов Orthobimyavirus;

• определение аминокислотных замен в антигенных эпитопах гликопротеина Gn и L-полимеразы у штаммов вируса Батаи различного происхождения;

• создание и характеристика оригинальных ОТ-ПЦР и ИФА тест-систем для диагностики лихорадки Батаи;

• определение чувствительности и специфичности ИФА-IgM и ИФА-IgG тест-систем при обследовании сывороток крови больных людей, доноров и домашних животных; использование этих систем для серодиагностики лихорадки Батаи и проведения сероэпидемиологических исследований;

• изучение действия рибавирина, его производных (dRsata, Rsata) и ряда экспериментальных химических соединений (467, 452, Cl-Ara-A, dR-SK-452, Det-Ara-A, OH-Ara-A, Ome-Ara-A) на репродукцию вируса Батаи в опытах in vitro.

Научная новизна работы

1. Впервые определена нуклеотидная последовательность фрагментов сегмента M (513 н.о.) и сегмента L (501 н.о.) малоизученных штаммов вируса Батаи, выделенных в разные годы в России (Волгоградская область), на Западной Украине, в Чехословакии и Малайзии. На основании данных филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей участка сегмента M установлено, что исследованные штаммы группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры.

3. Проведён сравнительный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей сегментов М и L РНК штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов антигенного комплекса Буньямвера.

5. Разработаны и охарактеризованы экспериментальные ИФА тест-системы для выявления специфических антител классов IgM и IgG в сыворотках крови людей, Ig G в сыворотках крови овец, а также антигенов вируса Батаи.

6. В опытах in vitro на модели вируса Батаи впервые проведено изучение противовирусной активности рибавирина, его производных и других препаратов, синтезированных в Институте биоорганической химии РАН. Установлено, что рибавирин обладает высокой противовирусной активностью.

Практическая значимость работы

1. Созданная и охарактеризованная в процессе исследования специфическая тест-система ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи обладает достаточно высокой чувствительностью, что позволяющей выявлять 12 БОЕ/мл. Она может быть рекомендована для использования в практических диагностических лабораториях.

2. Разработаны и охарактеризованы экспериментальные ИФА тест-систем для выявления специфических антител класса IgM и IgG в сыворотках крови людей, Ig G в сыворотках крови овец, а также антигенов вируса Батаи. Техническая документация на данные тест-системы утверждена

Учёным Советом НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН 11 мая 2009 г.

3. ИФА-IgM и ИФА-IgG системы были успешно использованы для специфической диагностики лихорадки Батаи при совместной работе с вирусологической лабораторией Центра гигиены и эпидемиологии в Астраханской области, где в 2007 г. серологически было верифицировано 5 случаев этой малоизученной инфекции;

4. Установлена выраженная противовирусная активность рибавирина в отношении вируса Батаи в опытах in vitro.

Основные положения, выносимые на защиту

1. На основании изучения нуклеотидной последовательности участка гена Gn (сегмента М РЕК) штаммов вируса Батаи, выделенных в России, на Западной Украине, в Чехии и Малайзии и сравнения полученных результатов с информацией GenBank, установлено, что штаммы вируса Батаи группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры. Сходная картина наблюдается при филогенетическом анализе данных по сегменту L. Однако в этом случае в пределах гомогенной европейской генетической группы у одного из западно-украинских штаммов (штамм 1548) выявлялось определённое отличие от другого украинского штамма (499), российского штамма 42 (из Волгоградской области) и чешского штамма Чалово.

4. Разработка чувствительной и специфической тест-системы ОТ-ПЦР для выявления РЕК вируса Батаи. Чувствительность диагностикума составила 12 БОЕ/мл.

5. Разработка и характеристика тест-систем ИФА для выявления антигена вируса Батаи и специфических антител классов М и G к вирусу Батаи в сыворотках крови людей и класса G у овец. Чувствительность тест-системы для определения антигена вируса Батаи составила 100 БОЕ/мл.

7. Исследование противовирусной активности швейцарского препарата «рибавирин». Данный препарат эффективно подавляет цитопатогенную активность вируса Батаи в культуре клеток Vero Ев. Индекс противовирусной активности рибавирина составил 2,0 lg ЦПД50 при концентрации 500 мкг/мл. Производные рибавирина (dRsata, Rsata) и ряд экспериментальных химических соединений (467, 452, С1-Ага-А, dR-SK-452, Det-Ara-A, ОН-Ara-A, Оше-Ага-А) не обладают противовирусной активностью в отношении вируса Батаи.

Заключение Диссертация по теме "Вирусология", Терехин, Сергей Анатольевич

выводы

1. На основании филогенетического анализа участка гена Gn сегмента М РНК штаммов вируса Батаи, выделенных в России, на Западной Украине, в Чехии и Малайзии установлено, что штаммы вируса Батаи группируются по географическому признаку в европейский и азиатский кластеры.

2. При филогенетическом анализе данных по сегменту L в пределах гомогенной европейской генетической группы штаммы вируса Батаи у одного из западно-украинских штаммов (штамм 1548) обнаружено определённое отличие от другого украинского штамма (штамм 499), российского (42) и чешского (Чалово) штаммов.

3. Обнаружены аминокислотные замены в участках генов Gn и L-полимеразы у исследованных штаммов вируса Батаи. Участок гена РНК-полимеразы оказался достаточно консервативным; ген Gn является вариабельным.

4. С использованием оригинальных олигонуклеотидных праймеров создана высокоспецифичная тест-система на основе ОТ-ПЦР для детекции РНК вируса Батаи. Её специфическая чувствительность составляет 12 БОЕ/мл.

6. В результате проведения серодиагностических и сероэпидемиологических исследований с использованием ИФА-IgM и ИФА-IgG тест-систем верифицировано 5 случаев лихорадки Батаи у жителей Астраханской области. Специфические IgG антитела обнаружены у овец в Астраханской области (2,9%) и Ставропольском крае (5,2%)

7. В опытах in vitro на модели вируса Батаи установлена выраженная противовирусная активность швейцарского препарата «рибавирин» и отечественного рибавирина. Индексы противовирусной активности варьируют от 0,8 1§ДПД50 (при концентрациях препарата 250-125 мкг/мл) до 3,0 ВДПДзо (при концентрации 500 мкг/мл). Другие тестированные экспериментальные химиопрепараты (467, 452) не обладают противовирусной активностью в отношении вируса Батаи даже при максимальной концентрации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ И ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ Вирус Батаи широко распространён в странах Азии и Европы, встречается на африканском континенте.

Он является патогенным для человека и вызывает острые лихорадочные заболевания человека, иногда с явлениями менингоэнцефалита, и вызывает заболевания сельскохозяйственных животных. Серологические данные показали связь вируса Батаи с гриппоподобным заболеванием, сопровождаемым лихорадкой, миалгией и анорексией. Чехословацкие исследователи доказали роль вируса Батаи в этиологии лихорадочных заболеваний и бронхопневмоний, наблюдающихся в период активности кровососущих переносчиков [24].

В связи с этим, разработка и совершенствование методов специфической диагностики и средств лечения лихорадки Батаи представляются актуальными направлениями для науки и практики, учитывая отсутствия отечественных диагностических и лечебных препаратов. Цели данного исследования заключались:

• в проведении филогенетического анализа штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов Orthobunyavirns;

• в создании и характеристике оригинальных ОТ-ПЦР и ИФА тест-систем для диагностики лихорадки Батаи; в изучении действия ряда коммерческих и экспериментальных химиопрепаратов на репродукцию вируса Батаи в опытах in vitro.

Проведение филогенетического анализа штаммов вируса Батаи и других близкородственных вирусов Orthobunyavirus, а также определение аминокислотных различий в последовательностях антигенных детерминант поверхностного гликопротеина Gn у европейских изолятов вируса Батаи (штаммы Батаи 42, Олыка 499, Олыка 1548, Чалово) являлось одной из задач данного исследования.

По данным филогенетических исследований частичных нуклеотидных последовательностей исследованные штаммы вируса Батаи чётко разделились на 3 группы по географическому признаку.

Первую группу составили азиатские штаммы, ММ 2222, ОМ 1Е/94, ОЫ 7В/01, СЬйоог, выделенные в Юго-Восточной Азии (Малайзия, Япония, Индия). Во вторую группу вошли африканские штаммы UgMP6830 и ^ап (из Уганды и Судана), в третью - штаммы Олыка 1548, Олыка 499, ВЛГ 42, и Чалово, выделенные на Западной Украине, в Волгоградской области и Чешской Республике.

Вирус Илеша (Нигерия) при анализе сегмента М оказался генетически родственным вирусу Батаи, но самостоятельным вирусом. Суданский штамм КУ-141 вируса Нгари, выделенный от больного человека, является реассортантом между вирусами Буньямвера (по Б и Ь сегментам) и вирусом Батаи (по М сегменту). Гомология между вирусом Нгари и штаммами вируса Батаи из Уганды, Японии и Малайзии по М сегменту достигает 95%. Эти данные совпадают с данными зарубежной литературы [61, 89,120].

В сравнении с другими представителями рода ОгАгоЪипуауггш (рис. 5), штаммы вируса Батаи формируют отдельную группу. Гомологичность нуклеотидной последовательности различных географических вариантов вируса Батаи составляет 85-98%, а аминокислотной — 92-95%.

Достаточно близкими к вирусу Батаи оказались северо-американские вирусы Тетсгм и ИоМкмау. Процент гомологии по М-сегменту прототипного штамма вируса Батаи с вирусом Тешем составил 79%, а с вирусом №оП1гмау - 77%. Эти данные согласуются с данными зарубежной литературы [69].

Результаты множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей М-сегмента исследованных нами штаммов вируса Батаи показали высокую степень гомологии (98%) российского штамма 42, украинских штаммов 1548, 499 и чешского штамма Чалово. По нашим данным, эти штаммы, формируют отдельную европейскую генетическую группу, которая по нуклеотидной последовательности М сегмента существенно отличается от таковой у других штаммов вируса Батаи.

Сходная картина наблюдается при филогенетическом анализе данных по Ь сегменту. Однако в этом случае в пределах гомогенной европейской генетической группы у одного из западно-украинских штаммов (штамм 1548) выявлялось определённое отличие от другого украинского штамма, российского (из Волгоградской области) и чешского (Чалово) штаммов. Возможно это связано с тем, что штамм 1548 вируса Батаи является реассортантом по Ь-сегменту или с наличием мутаций в геноме данного вируса.

В результате настоящего исследования были обнаружены различия в аминокислотных последовательностях антигенных эпитопов поверхностного гликопротеина вп у близких штаммов Батаи, а также различия в аминокислотных последовательностях Ь-протеина.

У штамма Чалово в эпитопе I в положении 114 пролин заменён на серин. У российского штамма Батаи 42 в эпитопе I в положении 121 вместо аспарагина находится аспарагиновая кислота, а в положении 137 тирозин вместо гистидина. Некоторое отличие имеет штамм Олыка 499, у которого в положении 140 лейцин заменён на гистидин. Данные замены являются существенными, так как замещающие аминокислоты обладают разными зарядами и имеют разные по полярности радикалы. Это может изменять конформацию эпитопов и влиять на свойства штамма.

Несмотря на некоторое различие в нуклеотидной последовательности европейской группы штаммов вируса Батаи, аминокислотная последовательность секвенированного нами участка Ь сегмента штаммов вируса Батаи оказалась очень консервативной. Это объясняется вырожденностью генетического кода, а также функциональной значимостью Ь-протеина. Как известно, чем меньше функциональная важность отдельных участков генов, тем больше они имеют тенденцию к эволюционной изменчивости.

У штамма Олыка 1548 в положении 105 глутаминовая кислота заменена на лизин. Позиция 123 у данных штаммов является достаточно гетерогенной: у двух штаммов (Батаи 42 и Олыка 499) в этой позиции находится глутаминовая кислота; у штамма Чалово в позиции 123 находится аланин, а у штамма Олыка 1548 — лизин.

Особая роль в настоящем исследовании была отведена разработке тест-системы на основе ОТ-ПЦР для детекции РНК вируса Батаи. Преимуществом метода ПНР является высокая скорость проведения анализа, отсутствие необходимости использования клеточных культур и дорогостоящих лабораторных животных. Данный метод обладает высокими чувствительностью и специфичностью.

Описанная в работе тест-система характеризуется использованием оригинальных праймеров, которые комплементарны участку гена поверхностного гликопротеина вп.

При подборе праймеров был проведён анализ последовательностей геномов нескольких штаммов вируса Батаи (ММ 2222, 0>1-7/В/01, ОМ-1/Е/94, ЩМР 6830, СЫйог Ю 20217). Праймеры были комплементарны последовательности гена гликопротеина вп вируса Батаи и амплифицировали фрагмент ДНК длиной 513 пар нуклеотидов (п.н.). Особое внимание уделялось тому, чтобы 3' концы праймеров не были комплементарны вариабельным областям генома.

Разработанная нами тест-система ОТ-ПЦР позволяет выявить 12 БОЕ/мл. Чувствительность метода зависит от многих факторов: чистоты и источника матрицы для ПЦР, метода экстракции нуклеиновых кислот, температурного режима реакции. Нами было проведено сравнение двух методов выделения нуклеиновых кислот: экстракция с помощью реагента «Тризол» и сорбирования на неорганическом носителе. Метод экстракции тризолом позволяет выделять РНК/ДНК с более высокой степенью частоты. Несмотря на высокую чувствительность разработанной тест-системы, выделение РНК вируса сорбированием на неорганическом носителе не дало положительных результатов. Это можно объяснить наличием в составе мозговой суспензии балластных веществ (липиды, белки), которые экранируют и закрывают частицы неорганического сорбента, не давая РНК связываться с ним.

Подобранная пара праймеров обеспечивает синтез фрагмента в-гена (513 п.н.) всех изучаемых нами штаммов вируса Батаи. Специфичность выбранных праймеров была проверена при использовании в ОТ-ПЦР гетерологичных вирусов: Синдбис, Гета, Западного Нила, жёлтой лихорадки, Денге П, Тягиня, Тоскана, Сицилийской и Неаполитанской лихорадок, Бужару, Исфаган, Кемерово.

Все пробы, содержащие гетерологичные вирусы, а также отрицательный контроль (мозговая суспензия незараженной мыши) оказались отрицательными. Наряду с этим, при обследовании пробы мозга мышей, инфицированных вирусом Батаи, был получен положительный сигнал. Эти данные указывают на выраженную специфичность разработанной тест-системы.

В лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского нами разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления специфических вирусных антигенов, и антител к вирусу Батаи в сыворотке крови людей, а также обнаружения специфических антител ^О в сыворотке крови овец, что позволяет впервые в нашей стране проводить специфическую диагностику лихорадки Батаи у больных с острыми сезонными лихорадочными заболеваниями неясной этиологии и проводить сероэпидемиологические исследования. Техническая документация на эти тест-системы утверждена Ученым советом института 11 мая 2009 г.

Разработка ОТ-ПЦР для выявления РНК вируса Батаи, а также тест-систем ИФА для обнаружения антигена вируса Батаи, а также антител класса М и О в сыворотке крови людей, и антител класса О в сыворотке крови овец была обусловлена необходимостью диагностики лихорадки Батаи и проведения сероэпидемиологических исследований.

Чувствительность метода ИФА для определения антигенов вируса Батаи, определенная по сравнительным результатам реакции бляшкообразования, составила 100 БОЕ/мл. Сравнив этот показатель с чувствительностью молекулярно-биологических методов, можно сделать вывод, что он оказался в 10 раз ниже чувствительности ОТ-ПЦР. Такой результат является закономерным, учитывая то, что в процессе амплификации первоначальное количество молекул нуклеиновой кислоты увеличивается в тысячи раз.

Специфичность ИФА оказалась высокой: было показано отсутствие перекрестной реактивности для родственных Буньявирусов.

Реагенты, приготовленные в процессе разработки ИФА тест-системы для индикации антигена вируса Батаи (специфические иммуноглобулин, антигены, пероксидазный конъюгат, нормальный глобулин и антиген), явились достаточной основой для конструирования ИФА-диагностикумов, предназначенных для выявления IgM и IgG антител в сыворотках крови людей и животных. Наличие положительных контролей, высокие специфичность и чувствительность данного метода позволяет рекомендовать данную тест-систему к использованию в диагностических лабораториях эндемичных областей.

Лихорадка Батаи относится к малоизученным и довольно редким заболеваниям. В зарубежной литературе имеются малочисленный сведения о выявлении больных лихорадкой Батаи. В частности, в 1988 г. в Судане (Африка) среди 195 серологически обследованных больных острыми лихорадочными заболеваниями неясной этиологии, у 13 человек (7%) были обнаружены антитела класса М к вирусу Батаи, и у 59 человек из 96 -антитела класса G (61%) [89]. Чехословацкие исследователи доказали роль вируса Батаи в этиологии лихорадочных заболеваний и бронхопневмоний, наблюдающихся в период активности кровососущих переносчиков [24].

В отечественной литературе также имеется описания нескольких случаев лихорадки Батаи. Три случая лихорадки Батаи имели место в сентябре и октябре 1991 г., два случая - в апреле и мае 1993 г. в Краснодарском крае (г. Сочи) [20]. В 2001 г. на территории Астраханской области был зарегистрирован один случай заболевания лихорадкой Батаи [1].

При нашем участии в 2007 г. в Астраханской области в вирусологической лаборатории ЦГиЭ серологически было верифицировано 5 случаев лихорадки Батаи. Один случай закончился летально. У больных наблюдались слабость, недомогание, головокружение, тошнота, кашель, боль в мышцах, лихорадка до 38-39° С. У одного пациента отмечалось однократное обильное носовое кровотечение, у другого - ригидность мышц затылка. Возраст больных составил от 18 до 60 лет. Трое из пяти больных проживали в городе Астрахани, двое являлись сельскими жителями. В сыворотке крови, полученной от одной из больных на 10 сутки после начала заболевания, были обнаружены антитела класса М к вирусу Батаи в титре 1:32000.

При серологическом обследовании овец в Астраханской области и Ставропольском крае методом ИФА были выявлены положительные сыворотки, в среднем в 2,9 и 12,5% случаев соответственно.

Эти данные подтверждают результаты предшествующих исследований ряда авторов, свидетельствующие о циркуляции вируса Батаи в южном регионе России, что определяет целесообразность проведения дальнейших исследований.

Одна из задач настоящего исследования заключалась в изучении эффективности рибавирина на модели вируса Батаи в опытах in vitro. Кроме того, были протестированы также новые производные рибавирина и другие химические соединения, синтезированные в Институте биоорганической химии, РАН.

Результаты исследований показали, что рибавирин (как отечественного, так и швейцарского производства) эффективно предотвращает развитие цитопатического действия (ЦПД) вируса Батаи в клетках Vero Е6. Эффективность препарата возрастает пропорционально его концентрации, и он не обладает цитотоксическим действием.

Результаты опыта показали, что тестированные производные рибавирина и другие новые химические соединения, синтезированные в Институте биоорганической химии РАН, не проявляют противовирусной активности в отношении вируса Батаи даже при максимальной концентрации. Пять из девяти химических соединений оказались токсичными для культуры Vero Еб, вызывая неспецифическую деструкцию клеток, поэтому оценить их противовирусное действие не представилось возможным.

Нами выявлено, что рибавирин, внесённый в поддерживающую среду за час до контакта клеток с вирусом и через 18 часов после заражения монослоя не оказывает защитного действия. В тоже время, заметный противовирусный эффект наблюдается при добавлении рибавирина спустя 2, 4 и 6 часов после инфицирования клеток Vero Е6.

Таким образом, использованная модель in vitro позволила впервые продемонстрировать выраженное противовирусное действия рибавирина в отношении вируса Батаи.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Терехин, Сергей Анатольевич, Москва

1. Арбовирусы и арбовирусные инфекции. Д.К.Львов, С.М.Клименко, С.Я.Гайдамович и др. -М.: Медицина, 1989.

2. Арбовирусные инфекции. (Методическое письмо). / Под ред. Т.П.Пак // Душанбе, 1974. 16 с.

3. Букринская А.Г. Вирусология. М.: Медицина, 1986. - 336 с.

4. Гребенникова Т.В. Метод ПЦР в диагностике и мониторировании лечения инфекционных заболеваний // Методические указания для студентов медицинского факультета РУДН. М., 2005. - С.21-23.

5. Жданов В.М. Эволюция вирусов. М.: Медицина, 1990. - 374 с.

6. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Т.Нго, Г.Ленхофф. М., 1988. -с. 172-242.

7. Константинова И.Д., Есипов P.C., Муравьева Т.И., Таран С.А., Веревкина К.Н., Гуревич А.И., Феофанов С.А., Мирошников А.И. Способ получения 1-Р-0-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамида (Рибавирина). // Патент РФ № 2230118 от 21.08.2002.

8. Ю.Константинова И.Д., Леонтьева H.A., Галегов Г.А., Рыжова О.И., Чувиковский Д.В., Антонов К.В., Есипов P.C., Таран С.А., Веревкина

9. К.Н., Феофанов С.А., Мнрошннков А.И. Биотехнологический способ получения рибавирина. Действие рибавирина и некоторых его комбинаций на репродукцию вируса осповакцины (Vaccinia Virus) // Биоорганическая химия. — 2004. — Т.ЗО, № 6. — С.613-620.

10. П.Львов Д.К., Лебедев А.Д. Экология арбовирусов. М.: Медицина, 1974 -210 с.

11. Львов Д.К., Дерябин П.Г., Аристова В.А. и др. Атлас распространения возбудителей природно очаговых вирусных инфекций на территории Российской Федерации. М.: Изд-во НПЦ ТМГ МЗ РФ. - 2001.

12. Медицинская вирусология: Руководство / Под ред. Д.К.Львова. М.: ООО «Медицинское информационное агенство», 2008.

13. М.Мельникова Е.Э. Реакция связывания комплемента в диагностике арбовирусных инфекций. // В сб.: Арбовирусы М - 1986 - с.140-146.

14. Шубладзе А.К., Гайдамович С.Я. Краткий курс практической вирусологии. / Медгиз 1954 - Москва.

15. Рис Э., Стернберг М. Введение в молекулярную биологию. М.: Мир, 2002.-с. 19-24.

16. Ройзман Б. Размножение вирусов: общие представления. В кн.: Вирусология / Под ред. Б. Филдс, Д. Найп. М.: Мир, 1989. - с. 124137.

17. Рубахова Ю.В. Распространение арбовирусов в субтропической зоне Краснодарского края и их роль в патологии человека // Дисс. канд. мед. наук., Москва 1994 - 114 с.

18. Яскович Г.А., Яковлева Е.П. Микробиологический синтез виразола иммобилизованными клетками // Прикладная биохимия и микробиология. 1999. - Т. 35, №27, С.146-149.

19. Akashi Н., Gay М., Ihara Т., Bishop D.H.L. Localised conserved regions of the S RNA gene products of bunyaviruses are revealed by sequence analyses of the Simbu serogroup Aino virus. // Virus research, 1984. Vol. 1. - p. 51-63.

20. Beaty В J., Sundin D.R., Chandler L.J. et al. Evolution of Bunyaviruses by genome reassortment in dually infected mosquitoes // Science. 1985 - Vol. 230.-p. 548-550.

21. Bardos. V. On the ecology of arboviruses in Czechoslovakia. // Vydav. SAV Bratislava, 1965-p.l98.

22. Barr J.N., Rodgers J.W., Wertz G.W. The Bunyamwera virus mRNA transcription signal resides within both the 3' and the 5' terminal regions and allows ambisense transcription from a model RNA segment. // J. Virol., 2005. Vol. 79. - p. 12602-12607.

23. Barr J.N., Wertz G.W. Bunyamwera bunyavirus RNA synthesis requires cooperation of 3'- and 5' terminal sequences. // J. Virol., 2004. Vol. 78. -p. 1129-1138.

24. Barr J.N., Elliott R.M., Dunn E.F., Wertz G.W. Segment- specific terminal sequences of Bunyamwera bunyavirus regulate genome replication. // Virology., 2003., Vol. 311. - p. 326-328.

25. Bishop D.H.L. Bunyaviridae and their replication. I. Bunyaviridae. In: Virology, 2nd edn, pp. 1155-1173. 1990.

26. Bishop D.H.L., Shope R.E. Bunyaviridae // Comprehensive virology/ Ed.H.Fraenkel-Conrat, R.R. Wagner. New York; London: Plenum press, 1979.-Vol. 14, ch. l.-p. 1-156.

27. Bishop D.H.L., Calisher C.H., Casals J. et al. Bunyaviridae // Intervirology. -1980.-Vol. 14.-p. 125-143.

28. Blakqori G., Van Knippenberg I., Elliott R.M. Bunyamwera orthobunyavirus S-segment untranslated regions mediate poly(A) tail independent translation. // J.Virol., 2009. Vol. 83(8). - p. 3637-3646.

29. Bridgen A., Weber F., Fazakerley J.K., Elliott R.M. Bunyamwera bunyavirus nonstructural protein NSs is a nonessential gene product that contributes to viral pathogenesis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 2001. -Vol. 98.-p. 664-669.

30. Briese T., Bird B., Kapoor V. et al. Batai and Ngari viruses: M segment reassortment and association with severe febrile disease outbreaks in East Africa//J. Virol.-2006.-Vol. 80.-No. 11.- p. 5627-5630.

31. Brown F. The classification and nomenclature of viruses: summary of results of meetings of the international commetee on taxonomy of viruses in Sendai, September, 1984 // Intervirology. 1986. - Vol. 25. - p. 141-143.

32. Brummer-Korvenkontio M. Batai (Calovo) arbovirus neutralizing antibodies in Finland // Ann. Med. Exp. Biol. Fenn. 1973. - Vol. 51. - No. 4. -p. 158161.

33. Butenko A.M., Lvov D.K., Kolobukhina L. Arboviruses of the genus Bunyavirus (family Bunyaviridae) and caused illnesses in the former USSR. // Sov. Med. Rev. E.: Virology reviews, 1993. Vol. 5. - p. 77-135.

34. Calisher C.H. Bunyaviridae. // Archives of Virology, 1991. suppl. 2. - p. 273-283.

35. Calisher C.H., Francy, D.B., Smith G.C. et al. Distribution of Bunyamvera serogroup viruses in North America // Amer. J. Trop. Med. Hyg. — 1986. -Vol. 35.-p. 429-443.

36. Calisher C.H., Petzman C.I., Muyh D J., Parsons M.A. Serodiagnosis of La Cross virus infection in humans by detections of immunoglobulin M class antibodies. //J. Clin. Microbiol. 1986. - Vol.23. - p. 667-671.

37. Casals J., Whitman L. A new group of arthropod-borne viruses. The Bunyamwera group // Am.J.Trop.Med.Hyg. 1960. Vol. 9. - p. 73-77.

38. Casals J., Brown L.V. Hemagglutination with arthropod-borne viruses. // J. Exp. Med., 1954. Vol. 99. - p. 429-499.

39. Casals J. Viruses: The versatile parasites. I. The arthropod-borne group of animal viruses. // Trans. N.Y. Acad. Sci., 1957. Vol. 19. - p. 219-235.

40. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. // Analytical Biochemestry, 1987. Vol. 162. - p. 156-159.

41. Cherry W.B. Immunofluorescence techniques. In: Manual of clinical microbiology, 3rd ed. / E.H.Lennette, A.Balows. Washington, D.C.: Am. Soc. Microbiol. - 1980. - p. 501-508.

42. Clarke D.U., Casals J. Techniques for hemagglutination and hemagglutination-inhibition with arthropod-borne viruses // Ann. J. Trop. Med. Hyg. 1958. - N.7. - P.562-573.

43. Dunn E.F., Pritlove D.C., Elliot R.M. The S RNA genome segments of Batai, Cache Valley, Guaroa, Kairi, Lumbo, Main Drain and Northway bunyaviruses: sequence determination and analysis // Journal of General Virology, 1994. Vol. 75. - p. 597-608.

44. Elliott R.M. The Bunyaviridae: concluding remarks and future prospects. In: The Bunyaviridae. N.Y.: Plenum Press, 1996. - p. 295-332.

45. Elliott R.M. Nucleotide sequence analysis of the S RNA segment of Bunyamwera virus, the prototype of the family Bunyaviridae. // J. Gen. Virol., 1989/- Vol. 70. p. 1281-1285.

46. Elliott R.M. Nucleotide sequence analysis of the large (L) genomic RNA segment of Bunyamwera virus, the prototype of the family Bunyaviridae. // Virology, 1989. Vol. 173. - p. 426-436.

47. Elliott R.M., Molecular biology of the Bunyaviridae. // J. Gen. Virol., 1990. -Vol. 71.-p. 501-522.

48. Elliot R.M., McGregor A. Nucleotide sequence and expression of the small (S) RNA segment of Maguari bunyavirus. // Virology, 1989. Vol. 171. - p. 516-524.

49. Elliot R.M., Lees J.F., Watret G.E., Clark W., Pringle C.R. Genetic diversity of bunyaviruses and mechanisms of genetic variation. In: Mechanisms of Viral Pathogenesis: from Gene to Pathogen, 1984. p. 61-76.

50. Elliott R.M., Schmaljohn C.S., Collett M.S. Bunyaviridae genome structure and gene expression. // Current Topics in microbiology and immunology, 1991.-Vol. 169.- p. 91-141.

51. Fontana J., Lopez-Montero N., Elliott R.M., Fernandez J.J., Risco C. The unique architecture of Bunyamwera virus factories around the Golgi complex. // Cell Microbiol., 2008. Vol. 10. - p. 2012-2018.

52. Fu S.H., Sun X.H., Wang H.Y., Cao Y.X., Wang H.Q., Liu W.B., Tao S.J., Liang G.D. Molecular biological identification of Batai virus isolated in China. // Zhoghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi, 2005. -Vol. 19.-p. 331-334.

53. Gaidamovich S. Ya., Obukhova V.R., Vinograd A.I., Klisenko G.A., Melnikova E.E. Olyka an arbovirus of the Bunyamwera group in the USSR. // Acta. Virol., 1973. - Vol. 17. - p. 444.

54. Geevarghese G., Prasanna N.Y., Jacob P.G., Hanumaiah, Bhat H.R. Isolation of Batai virus from sentinel domestic pig Kolar district in Karnataka State, India. // Acta. Virol., 1994. Vol. 38. - p. 239-240.

55. Glukhov A.I., Trofimova M.E., Gordeev S.A. PCR amplification of phage lambda DNA sequences using thermostable DNA polymerase // Mol.Biol. -1991.-Vol. 25.-p. 1602-1610.

56. Hart T.J., Kohl M., Elliott R.M. Role of the NSs protein in the zoonotic capacity of Orthobunyaviruses. // Zoonoses Public Health, 2008.

57. Huang C., Slater B., Campbell W., Howard J., White D. Detection of arboviral RNA directly from mosquito homogenates by reverse-transcription-polymerase chain reaction. // J. Virol. Methods., 2001. Vol. 94.-p. 121-128.

58. Hubalek Z. Mosquito-borne viruses in Europe. // Parasitol Res., 2008. -Suppl. l.-p. 29-43.

59. Hubalek Z., Zeman P., Halouzka J., Juricova Z., Stovickova E., Balkova H., Sikutova S., Rudolf I. Mosquitoborne viruses, Czech Republic, 2002. // Emerg. Infect. Dis., 2005. Vol. 11. - p. 116-118.

60. Hunt A.R., Calisher Ch. Relationships of Bunyamwera group viruses by neutralisation // Am. J. Trop. Med. Hyg., 1979. Vol. 28. - p. 740-749.

61. Jin H., Elliott R.M. Characterization of Bunyamwera virus S RNA that is transcribed and replicated by the L protein expressed from recombinant vaccinia virus. // J. Virology, 1993. Vol. 67. - p. 1396-1404.

62. Juricova Z., Mitterpak J., Prokopic J., Hubalek Z. Circulation of mosquito-borne viruses in large-scale sheep farms in eastern Slovakia. // Folia Parasitol. (Praha)., 1986. Vol. 33. - p. 285-288.

63. Kaledin A.S., Slusarenko A.G., Gorodetskii S.I. Isolation and properties of DNA polymerase from extremely thermophilic bacterium Thermus rubber // Biokhimiya. 1981. - Vol. 47. - p. 1785-1791.

64. Karabatsos N. International Catalogue of arboviruses including certain other viruses of vertebrates. San Antonio: Amer. Soc. Trop. Med. Hyg., 1985. -1146 p.

65. Keegan K. and Collett M.S. Use of bacterial expression cloning to define the amino acid sequences of antigenic determinants on the G2 glycoprotein of Rift Valley fever virus // J. of Virology. 1986. - V.58, N2. - P.263-270.

66. Kemp DJ., Smith D.B., Foot S.J. Colorimetric detection of specific DNA segment amplified by polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1989. - Vol. 86. - p. 2423-2427.

67. Kohl A., Hart T.J., Noonan C., Royall E., Roberts L.O., Elliott R.M. A Bunyamwera virus minireplicon system in mosquito cells. // J. Virol., 2004. -Vol. 78.,-p. 5679-5685.

68. Kohl A., Clayton R.F., Weber F., Bridgen A., Randall R.E., Elloitt R.M. Bunyamwera virus nonstructural protein NSs counteracts interferonregulatory factor 3-madiated induction of early cell death. // J. Virol., 2003., Vol. 77., - p. 7999-8008.

69. Lees J.F., Pringle C.R., Elliott R.M. Nucleotide sequence of the Bunyamwera virus M RNA segment: conservation of structural features in the bunyavirus glycoprotein gene product. // Virology, 1986. Vol. 148. - p. 1-14.

70. Leonard V.H., Kohl A., Hart T.J., Elliott R.M. Interaction of Bunyamwera Orthobunyavirus NSs protein with mediator protein MED8: a mechanism for inhibiting the interferon response. // J. Virol., 2006. — Vol. 80, № 19. — p. 9667-9675.

71. Leonard V.H., Kohl A., Osborne J.C., McLees A., Elliott R.M. Homotypic interaction of Bunyamwera virus nucleocapsid protein. // J. Virol., 2005. -Vol. 79.-p. 13166-13172.

72. Lowen A.C., Elliott R.M. Mutational analyses of the nonconserved sequences in the Bunyamwera Orthobunyavirus S segment untranslated regions // Virology. 2005. - Vol. 79. - No. 20. - p. 12861-12870.

73. Lundstrom J.O. Mosquito-borne viruses in Western Europe: a review. // J. Vector. EcoL, 1999. Vol. 24. - p. 1-39.

74. Maxam A.M., Gilbert W. A new method of sequencing DNA // Proc. Natl. Acad. Dei. USA. 1977. - Vol. 74. No. 2. - p. 560-564.

75. Mohl B.P., Barr J.N. Investigation the specificity and stoichiometry of RNA binding by the nucleocapsid protein of Bunyamwera virus. // RNA, 2009. -Vol. 15(3).-p. 391-399.

76. Moreli M.L., Aquino V.H., Figueiredo L.T. Identification of Simbu, California and Bunyamvera serogroup bunyaviruses by nested RT-PCR. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., 2001. Vol. 95. - p. 108-113.

77. Mullis K.B., Falloona F.A. Specific synthesis of DNA in vitro a polymerase-catalysed chain reaction // Meth. Ensymol. 1987. - Vol. 155. - p. 335-349.

78. Nashed N.W., Olson J.G., el-Tigani A. Isolation of Batai virus (Bunyaviridae: Bunyavirus) from the blood of suspected malaria patients in Sudan. // Am. J. Trop. Med. Hyg., 1993. Vol. 48. - p. 676-681.

79. Nichol S.T., Beaty B.J., Elliott R.M. et al. Family Bunyaviridae. In: Virus Taxonomy. Eight Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses / Elsevier Academic Press, 2005. - p. 695-716.

80. Novoa R.R., Calderita G., Cabezas P., Elliott R.M., Risco C. Key Golgi factors for structural and functional maturation of bunyamwera virus. // J. Virol., 2005.-p. 10852-10863.

81. Osborne J.C., Elliott R.M. RNA binding properties of bunyamwera virus nucleocapsid protein and selective binding to an element in the 5' terminus of the negative-sense S segment. // J. Virol., 2000. Vol. 74. - p. 99469952.

82. Pavri K.M., Singh K.R.P. Activity of Chitoor virus in India. // Arboviruses of the California Complex and the Bunyamwera Serogroup. Publ .House SAS, Bratislava 1969 - 191-197.

83. Peiris J.S., Amerashinghe P.H., Amerashingle F.P., Calisher C.H., Perera L.P., Arunagiri C.K., Munasingha N.B., Karunaratne S.H. Viruses isolated from mosquitoes collected in Sri Lanka. // Am. J. Trop. Med. Hyg., 1994. -Vol. 51.-p. 154-161.

84. Pringle S.R. The universal system of virus taxonomy of the International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), including new proposals ratified since publication on the sixth report in 1995 // Arch. Virol. 1998. -Vol. 143.-p. 203-210.

85. Rossi C., Ksiazek T.G. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). In: Manual of hemorrhagic fever with renal syndrome and hantavirus pulmonary syndrome / H.W.Lee, C.Calisher, C.Schaljohn. Seoul, 1998. -p. 87-91.

86. Saiki R.K., Glcand D.N., Staffer S. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with thermostable DNA polymerase // Sciene. 1988. - Vol. 293. -p. 487-491.

87. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Dei. USA. 1977. - Vol. 74. No. 12.-p. 5463-5467.

88. Schmaljohn C.S., Patterson J.L. Bunyaviridae and their replication. II. Replication of Bunyaviridae. In: Virology, 2nd edn, 1990. p. 1175-1194.

89. Shi X., Kohl A., Li P., Elliott R.M. Role of the cytoplasmic tail domains of Bunyamwera orthobunyavirus glycoproteins Gn and Gc in virus assembly and morphogenesis. // J. Virol., 2007. Vol. 81, № 18., - p. 10151-10160.

90. Shi X., Kohl A., Leonard V.H., McLess A., Elliott R.M. Requirement of the N-terminal region of orthobunyavirus nonstructural protein NSm forvirus assembly and morphogenesis. I I J/ Virol., 2006. Vol. 80, № 16. - p. 8089-8099.

91. Shi X., Elliott R.M. Analysis of glycoproteins of viruses in the family Bunyaviridae. // Methods Mol. Biol., 2007. Vol. 379. - p. 137-148.

92. Shi X., Brauburger K., Elliott R.M. Role of N-linked glycans on Bunyamwera virus glycoproteins in intracellular trafficking, protein folding and virus infectivity. // J. Virol., 2005. Vol. 79. - p. 19725-13734.

93. Shi X., Lappin D.F., Elliott R.M. Mapping the Golgi targeting and retention signal of Bunyamwera virus glycoproteins. // J. Virol., 2004. -Vol. 78.-p. 10793-10802.

94. Shope R.E. Arboviral zoonoses in Western Europe. In: Handbook of zoonoses. Section B: Viral / G.W.Beran, J.H.Steel Boca Raton: CRC Press, 1994.-p. 227-235.

95. Thomas D., Blakgori G., Wagner V., Banholzer M., Kessler N., Elliott R.M., Haller O., Weber F. Inhibition of the RNA polymerase II phosphorylation by a viral interferon antagonist. // J. Biol. Chem., 2004., -Vol. 279.-p. 31471-31477.

96. Turkovic B., Brudnjak Z. Natural foci of some viral zoonoses in Croatia. //Acta. Med. Croatica., 1999. Vol. 53. - p. 195-198.

97. Villarreal L.P. Viruses and the evolution of life. Washington: ASM Press,2005.-p. 89-115.

98. Viljoen G.J., Nel L.H., Crowther J.R. Molecular diagnostic PCR handbook. -IAEA, 2005.

99. Virus Taxonomy. Eight Report of the International Commetee on Taxonomy of Viruses / C.M.Fauquet, M.A.Mayo Elsevier Academic Press, 2005. -1259 p.

100. Weber F., Bridgen A., Fazakerley J.K., Streiterfeld H., Kessler N., randall R.E., Elliott R.M. Bunyamwera bunyavirus nonstructural protein NSs counteracts the induction of alpha/beta interferon. // J.Virol., 2002. Vol. 76.-p. 7949-7955.

101. Yadav P.D., Mishra A.C., Mourya D.T. Molecular characterization of Umbre virus (Bunyaviridae) // Virology Journal, 2008. Vol. 5. - p. 115.

102. Yanase T., Kato T., Yamakawa, Takayoshi K., Nakamura K., Kokuba T., Tsuda T.M. Genetic characterization of Batai virus indicates a genomic reassortment between ortobunyaviruses in nature // Arch. Virol., 2006. -Vol. 151.-p. 2253-2260.

Информация о работе

Терехин, Сергей Анатольевич
кандидата медицинских наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.06

Диссертация

Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вируса Батаи и создание тест-систем для диагностики этой инфекции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Молекулярно-генетическая и биологическая характеристика вируса Батаи и создание тест-систем для диагностики этой инфекции - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы